WO2011122127A1 - 骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドおよびその利用 - Google Patents

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WO2011122127A1
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amino acid
peptide
acid sequence
seq
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PCT/JP2011/052820
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美玉 宋
和哉 渡部
勇亮 佐内
崇燮 尹
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株式会社ファーマフーズ
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having osteoblast proliferation promoting activity, a bone formation promoting drug containing the peptide, and use thereof.
  • Osteoporosis is a systemic disease in which the microstructure of bone is broken due to a decrease in bone mass or bone mineral mass, bone strength is reduced, and the risk of fracture is increased.
  • Japan it is said that there are about 11 million osteoporosis patients, 80% of whom are women.
  • osteoporosis is a common disease after middle age, it is estimated that the number of patients will increase with the recent aging.
  • the fracture rate of elementary and junior high school students has increased, and from the standpoint of preventing osteoporosis, it is very important to increase bone mineral content firmly in younger years and obtain a higher maximum bone mass.
  • maintaining bone health is now a social concern regardless of gender or age.
  • dietary calcium supplementation, light exercise, sunbathing, drug treatment, and the like have been performed as methods for preventing or treating bone diseases.
  • calcium supplementation by dietary therapy calcium salts such as calcium carbonate and calcium phosphate, and natural calcium preparations such as beef bone meal, eggshell and fish bone meal are used, but they are not necessarily in terms of solubility, absorbability, and taste. It is not a material suitable for oral intake.
  • Moderate exercise increases bone mass and strengthens the bones, so walking and walking are considered good for bone health, but light exercise is also troublesome if the body is weak.
  • elderly people who are bedridden can hardly exercise.
  • Sunbathing is considered good in terms of supplementing activated vitamin D3, but this alone is not sufficient.
  • An object of the present invention is to provide a novel peptide having osteoblast proliferation promoting activity and a drug for promoting osteogenesis containing the peptide, and to provide an excellent use of the peptide.
  • the monosaccharide that binds to the side chain of the asparagine residue or the sugar at the reducing end of the sugar chain that binds to the side chain of the asparagine residue is N-acetylglucosamine
  • the described peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is N-acetylglucosamine
  • a monosaccharide that binds to the side chain of a serine residue or threonine residue, or the sugar at the reducing end of a sugar chain that binds to the side chain of a serine residue or threonine residue is N-acetylgalactosamine, mannose, fucose
  • a method for promoting osteogenesis comprising administering an effective amount of the peptide according to any one of [1] to [6] or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a mammal.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of fractionating each peak present in a 20-40 minute fraction in which strong osteoblast proliferation activity was observed in FIG. 8 and measuring the osteoblast proliferation activity of each peak.
  • fraction No. in which strong osteoblast proliferation activity was observed.
  • No. It is a figure which shows the ESI-MS analysis result of the peptide contained in 9-0. No.
  • FIG. 9 is a diagram showing the ESI-MS analysis results of peptides included in FIG. No. 9-0 and no. 9 is a diagram showing the results of CE and MS analysis of peptides included in FIG. It is a figure which shows the structure of the peptide clarified as a result of the analysis. It is a figure which shows the result of having measured the osteoblast proliferation activity about 12 types of chemically synthesized peptides. It is a figure which shows the result of having measured the osteoblast proliferation activity about the chemically synthesized peptide (No. 13). It is a figure which shows the result of having measured the osteoblast proliferation activity about the chemically synthesized peptide (No. 14). It is a figure which shows the result of having measured the osteoblast proliferation activity about the chemically synthesized tripeptide (AES) and dipeptide (AE).
  • the peptide of the present invention is a tripeptide having an amino acid sequence represented by Ala-Glu-Ser and having osteoblast proliferation promoting activity. Further, the peptide of the present invention may contain any of the following amino acid sequences (a) to (i) and have osteoblast proliferation promoting activity.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (c) an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (d) an amino acid represented by SEQ ID NO: 2 Sequence (e) Amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (f) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (g) represented by SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence in which 1 to 6 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (h) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (i) 1 to 9 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Deletion, substitution or addition of amino acid sequence
  • “peptide” refers to two or more amino acids linked by peptide bonds. Any number of amino acids may be bound. That is, the “peptide” in the present invention includes
  • the present inventors tried to identify a peptide having strong osteoblast proliferation activity from a peptide mixture obtained by hydrolyzing egg yolk protein, and the target peptide was “Val-Asp-Gly-Ala-Glu-Ser-Pro-Thr”. It was identified as a glycopeptide having an amino acid sequence of “-Ala-Asn-Ile-Ser” (SEQ ID NO: 4) and having a sugar chain bound to asparagine at position 10. In addition, it was confirmed that even if sugar chains are not bound, it has osteoblast proliferation activity.
  • the present inventors have osteoblast proliferation activity even when several amino acids are deleted from the N-terminal side and the C-terminal side in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It was confirmed that osteoblast proliferation activity was lost when the alanine at the position was deleted.
  • the amino acid sequence essential for osteoblast proliferation promoting activity is a sequence composed of Ala-Glu-Ser3 amino acids. Therefore, a peptide having 1 to 3 amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide having 1 to 5 amino acids deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and represented by SEQ ID NO: 3 A peptide having 1 to 6 amino acids deleted in the amino acid sequence and a peptide including a peptide having 1 to 9 amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 can easily have osteoblast proliferation activity Understandable.
  • SEQ ID NO: 4 the present inventors have confirmed that even when the 7th proline in SEQ ID NO: 4 is substituted with valine, it has osteoblast proliferation activity. Therefore, in the peptide of “Val-Asp-Gly-Ala-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-Asn-Ile-Ser” (SEQ ID NO: 4), alanine at position 4, glutamic acid at position 5 and Even if an amino acid other than serine is substituted with another amino acid, it is considered to have osteoblast proliferation activity. Since SEQ ID NOs: 1 to 3 are a part of SEQ ID NO: 4, it is considered that the same applies to peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • Preferred amino acid substitutions include substitution in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, Pro and Ile, substitution of Ser with a hydroxyl residue with Thr, substitution of Asp with an acidic residue and Glu, basicity Examples include substitution of Lys having a residue with Arg, substitution of Phe having an aromatic residue with Tyr, and the like, but are not limited thereto. Any amino acid substitution can be used as long as osteoblast proliferation activity can be maintained. There may be.
  • the peptide of the present invention may be any peptide containing the amino acid sequence of any of the above (a) to (i) and having osteoblast proliferation promoting activity, and any of the amino acid sequences of (a) to (i) It may have other amino acid sequences.
  • the amino acid sequence other than the amino acid sequence of any one of (a) to (i) is not particularly limited.
  • Examples of the additional amino acid sequence include a tag sequence (for example, polyhistidine tag, Myc tag, FLAG tag, etc.), a marker peptide (for example, GFP, etc.) and the like.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is a part of the amino acid sequence of ⁇ -libetin (SEQ ID NO: 15), which is a kind of egg yolk protein. Therefore, as a peptide containing the amino acid sequence represented by Ala-Glu-Ser or any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, the full-length ⁇ -libetin or the amino acid sequence of ⁇ -libetin (SEQ ID NO: 15) from position 93 to position A fragment containing Ala-Glu-Ser at position 95 is preferred.
  • the 96th proline may be substituted with valine, or the 96th proline of SEQ ID NO: 15 may be substituted with valine.
  • fragments comprising the full length of or a 93-95 Ala-Glu-Ser.
  • the number of amino acid residues in the fragment is not particularly limited, but is preferably 3 to 50 residues, more preferably 3 to 30 residues, still more preferably 3 to 20 residues, and particularly preferably 3 to 12 residues.
  • the peptide of the present invention can be produced by a solid phase synthesis method (Fmoc method, Boc method) or a liquid phase synthesis method according to a known general peptide synthesis protocol. Moreover, it can manufacture using the transformant which introduce
  • the obtained peptide has osteoblast proliferation promoting activity because osteoblasts are used in a test system appropriately selected from known methods for measuring cell proliferation, and when the peptide is added and when the peptide is not added. Compared with the case, it is sufficient to confirm that the level of osteoblast proliferation is higher when the peptide is added.
  • a method using an MTT assay or a cell count method can be mentioned.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, for example, phenyl, ⁇ - C 6-12 aryl group such as naphthyl, for example, benzyl, C 7 - 14 aralkyl such as ⁇ - naphthyl -C 1-2 alkyl group such as a phenyl -C 1-2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl
  • a pivaloyloxy a C 1-6 alkyl group such as
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group or acetyl).
  • a protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group or acetyl.
  • N-terminal side cleaved in vivo glutamyl group produced by pyroglutamine oxidation, substituent on amino acid side chain in molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group) And a guanidino group) are protected with an appropriate protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group or acetyl).
  • an appropriate protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group or acetyl.
  • the peptide of the present invention may form a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt include hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, oxalic acid, malic acid, Salts with acids such as citric acid, oleic acid and palmitic acid; salts with alkali metals or alkaline earth metals such as sodium, potassium and calcium; or salts with aluminum hydroxides or carbonates; triethylamine, benzylamine , Salts with diethanolamine, t-butylamine, dicyclohexylamine, arginine and the like.
  • the peptide of the present invention is at least one selected from a threonine residue, an asparagine residue and a serine residue in a peptide comprising Ala-Glu-Ser and a peptide comprising any one of the amino acid sequences (a) to (i) above. It is preferable that a monosaccharide or a sugar chain is bonded to the side chain of one amino acid residue. By binding the sugar chain, the resistance to enzymatic degradation is improved, and for example, the blood half-life can be increased in the living body, and the action can be sustained.
  • Monosaccharides or sugar chains can be bound to the side chain functional groups of amino acids directly or via a linker.
  • Monosaccharides include glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, sialic acid, glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, glucosamine, galactosamine and their sulfates, phosphates, Examples thereof include nitrate.
  • the sugar chain is not limited as long as two or more of the above-exemplified monosaccharides are glycosidic bonded, and the number of monosaccharides bonded is not limited.
  • the monosaccharide that binds to the side chain of the asparagine residue or the sugar at the reducing end of the sugar chain that binds to the side chain of the asparagine residue is preferably N-acetylglucosamine.
  • a monosaccharide that binds to the side chain of a serine residue or threonine residue, or the sugar at the reducing end of a sugar chain that binds to the side chain of a serine residue or threonine residue includes N-acetylgalactosamine, mannose, fucose, It is preferably one selected from glucose, N-acetylglucosamine and xylose.
  • sugar chain N-linked sugar chain
  • asparagine residue of the peptide of the present invention examples include the following (1) to (32).
  • sugar chain O-linked sugar chain
  • sugar chain that binds to the side chain of the serine residue or threonine residue of the peptide of the present invention
  • saccharides on the non-reducing terminal side of the sugar chain (core structure) shown in (1) to (8) below are further added to galactose (Gal), fucose (Fuc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), sialic acid (NeuAc). ) Etc. may be added.
  • a peptide to which a monosaccharide or a sugar chain is bound can be produced by a known method such as (1) stepwise method, (2) convergent method, (3) enzyme-chemical synthesis method. It can be confirmed by the above-mentioned method that the obtained glycopeptide has osteoblast proliferation promoting activity.
  • the stepwise method is a method in which a sugar amino acid is used as a synthesis unit, and a glycopeptide is synthesized by binding an amino acid to the sugar amino acid and extending it.
  • the peptide chain can be extended by a solid phase synthesis method (Fmoc method, Boc method) according to a general peptide synthesis protocol.
  • N-linked sugar amino acids can be synthesized by condensation of a sugar amine with the ⁇ -carboxyl group of an aspartic acid derivative.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ 2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline-1-carboxylate
  • O-linked sugar amino acids are halogen sugars (Luning, B., Norberg, T., River-Baeza, C., and Tejbrant, J. (1991) Glycoconjugate J. 8, 450-455, Kunz, H., Birnbach, S., and Wernig, P. (1990) Carbohydr. Res. 202, 207-213, Ciommer, M., and Kunz, H. (1991) Synlett., 593-594, Paulsen, H., and Paal , M. (1984) Carbohydr. Res.
  • glycosyl trichloroacetimidate Fukase, aseK., Hase, S., Ikenaka, T., and Kusumoto, S. (1992) usBull. Chem. Soc. Jpn. 65, 436-445, Kinzy, W., and Schmidt, R. R. (1989) Carbohydr. Res. 193, 33-47, Barchi, J. J., Russ, P., Johnson, B ., Otaka, A., Nomizu, M., and Yamada, Y. (1995) Bioorg. Med. Chem. Lett.
  • the convergent method is a method of synthesizing a sugar chain part and a peptide part, and condensing them to synthesize a glycopeptide.
  • a condensation example of a ⁇ -carboxyl group of an asparagine residue in a peptide chain and a sugar chain amine consisting of 7 sugars Man 5 GlcNAc 2 ) (Cohen-Abisfeld, ST, and Lansbury, PT (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 1053-10537).
  • the enzyme-chemical synthesis method synthesizes a glycopeptide having a GlcNAc residue, which is used as a sugar chain acceptor, and as a sugar chain donor, a natural glycoprotein (eg egg white, egg yolk, serum transferrin, ribonuclease B, etc. ) And a glycosyl transfer reaction using endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-M, Endo- ⁇ , etc.) using a sugar amino acid or a glycopeptide prepared from (1).
  • Endo-M is an N-linked sugar chain transfer (K. Yamamoto, J. Biosci. Bioeng.
  • Endo- ⁇ is an O-linked sugar chain (core 1) transfer (H1). .
  • core 1 O-linked sugar chain (core 1) transfer (H1). .
  • Ashida K. Yamamoto, T. Murata, T. Usui, H. Kumagai, Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, 394, T. Katayama, K. fujita, K. Yamamoto, J.Biosci. Bioeng. 2005 , 99, 457).
  • the peptide of this invention is 1 type chosen from the group which consists of a peptide as described in the following (A), (B) and (C).
  • A a peptide comprising Ala-Glu-Ser at positions 93 to 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 ( ⁇ -libetin) and having 3 to 12 amino acid residues
  • B represented by SEQ ID NO: 15
  • R 1 is the following (i), (ii), (iii) or (iv)
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the peptide comprising the above-mentioned Ala-Glu-Ser or the amino acid sequence of any one of (a) to (i) and having osteoblast proliferation promoting activity Good.
  • the polynucleotide can be present in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA).
  • the polynucleotide may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid of DNA and RNA.
  • a single strand it may be either a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
  • the polynucleotide of the present invention may be fused to a polynucleotide encoding a tag label (tag sequence or marker sequence) on the 5 ′ side or 3 ′ side thereof. Furthermore, it may contain sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences).
  • UTR untranslated region
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can be arbitrarily designed based on the amino acid sequence of the peptide of the present invention by appropriately selecting and combining the codons of each amino acid.
  • the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 is a part of the amino acid sequence of ⁇ -libetin (SEQ ID NO: 15), which is a kind of egg yolk protein as described above, it encodes ⁇ -libetin. It can design based on the base sequence of the gene to do.
  • ⁇ -libetin is known to be produced by cleavage of vitellogenin, which is a precursor of egg yolk protein.
  • vitellogenin is synthesized in the liver, then secreted into the bloodstream, transported to the ovary, taken into the oocyte, and aspartic protease (cathepsin D) localized in the lysosome in the oocyte.
  • Aspartic protease cathepsin D
  • Lipoviterin-1, phosvitin, lipoviterin-2, ⁇ -libetin (Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avianit precursor of the eg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10; 250 (23): 9060-6.).
  • the amino acid sequence of ⁇ -libetin corresponds to positions 1567 to 1850 of the entire amino acid sequence of vitellogenin (accession number: CAA31942) (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-115761). Therefore, the base sequence of the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can be designed based on the base sequence of the gene encoding vitellogenin (accession number: X13607).
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by a known DNA synthesis method, PCR method or the like. Specifically, for example, based on the amino acid sequence of the peptide of the present invention, a codon for each amino acid may be appropriately selected to design a base sequence, and then chemically synthesized using a commercially available DNA synthesizer. In addition, a primer for amplifying a region encoding the peptide of the present invention in the base sequence of the gene encoding vitellogenin (accession number: X13607) is designed, and chicken genomic DNA or cDNA is used as a template using these primers. By performing PCR or the like, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention can be obtained.
  • the present invention provides an expression vector used for producing the peptide of the present invention.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide encoding the peptide of the present invention, but a plasmid vector (pSP64, pBluescript, etc.) having an RNA polymerase recognition sequence is preferred.
  • Examples of the method for producing an expression vector include, but are not limited to, a method using a plasmid, phage, or cosmid.
  • the specific type of vector is not limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected.
  • a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector.
  • a host transformed with the expression vector of the present invention is cultured, cultivated or raised, and then subjected to conventional techniques (eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange) from the culture.
  • conventional techniques eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance genes for eukaryotic cell cultures, and tetracycline resistance genes or ampicillin resistance genes for cultures in Escherichia coli and other bacteria.
  • the peptide of the present invention may be expressed as a fusion peptide.
  • the green fluorescent protein GFP Green Fluorescent Protein
  • the peptide of the present invention may be expressed as a GFP fusion peptide.
  • the host is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used.
  • bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematode (Caenorhabditis elegans), Xenopus laevis oocyte, for example, oocyte, O cell, , COS cells, and Bowes melanoma cells).
  • a method for introducing the expression vector into a host cell that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .
  • the present invention provides a transformant introduced with the expression vector of the present invention.
  • the transformant of the present invention includes not only cells, tissues or organs but also organisms. Further, the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified as the host cell.
  • the transformant of the present invention is characterized in that the peptide of the present invention is expressed.
  • the transformant of the present invention preferably expresses the peptide of the present invention stably, but may be expressed transiently.
  • antibody means an immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY (hen egg antibody) and fragments thereof (Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fc fragment, etc.)). Examples include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, and the like.
  • Antibodies can be obtained by various known methods (for example, HarLow et al., “Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridoma and ELISA, Kodansha (1991)”, “Makoto S. et al, Biosci. Biotech. Biochem., 56 (2): 270-274, 1992”).
  • a carrier protein for example, KLH (Keyhole limpet hemocyanin), BSA (Bovine Serum Albumin), OVA (Ovalbumin) And the like
  • MAPs Multiple Antigenic Peptides
  • the peptide of the present invention or a salt thereof can be used as a medicament for promoting bone formation. Since the medicament of the present invention has an osteogenesis promoting action, it can be suitably used for prevention or treatment of, for example, fractures, osteoporosis, dysplasia of bone formation, growth inhibition during development.
  • the medicament of the present invention can be formulated by appropriately blending a pharmaceutically acceptable carrier or additive with the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • oral preparations such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches, etc. can do.
  • What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80 TM , HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • Buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage You may mix
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
  • the dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, for example, generally about 0.1 to 100 mg per day for a human body weight of about 60 kg, preferably About 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. For example, in the case of an injection, it is usually about 0 per day for a human having a body weight of about 60 kg.
  • the present invention also includes the use of the peptide of the present invention for producing an osteogenesis promoter and the peptide of the present invention for use in promoting bone formation.
  • Example 1 Identification of osteoblast proliferation-promoting active ingredient in egg yolk protein hydrolyzate
  • (1) Preparation of egg yolk protein hydrolyzate After adding 500 parts by weight of water to 100 parts by weight of defatted egg yolk powder (manufactured by Kewpie Co., Ltd.), the product name "Alcalase” (protease derived from Bacillus licheniformis, Novozymes) (Made by Japan Co., Ltd.) 5 parts by mass was added, and the mixture was reacted at 55 to 60 ° C. for 3 hours at pH 7. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by heat treatment at 90 ° C. for 10 minutes, and then filtration was performed to collect the filtrate.
  • Alcalase protease derived from Bacillus licheniformis, Novozymes
  • the filtrate was spray-dried to obtain an egg yolk protein hydrolysate.
  • the defatted egg yolk powder can also be prepared from commercially available egg yolk powder (for example, manufactured by QP Corporation). Specifically, 5 to 10 parts by mass of ethanol (or n-hexane) is added to 1 part by mass of commercially available egg yolk powder, stirred for about 30 minutes with a blender, and then filtered to recover a solid matter. This operation is repeated about 3 times to degrease egg yolk.
  • a dry powder can be prepared by air-drying the defatted egg yolk.
  • the peaks detected by HPLC and the range of fractions collected are shown in FIG.
  • the results of measuring osteoblast proliferation activity are shown in FIG.
  • the egg yolk protein hydrolyzate (1 mg / mL) which was not fractionated was used as a positive control.
  • the strongest osteoblast proliferation activity was observed in the 20-40 minute fraction. Therefore, 6-10 peaks present in the 20-40 minute fraction were collected (see FIG. 7), and osteoblast proliferation activity of each peak was measured.
  • the egg yolk protein hydrolyzate (1 mg / mL) which was not fractionated was used as a positive control.
  • the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 9, the strongest osteoblast proliferation activity was observed at peak 9 (fraction No. 9).
  • the ESI-MS analysis result of 9-0 is shown in FIG.
  • the ESI-MS analysis results of 9 are shown in FIG. 14, and the CE and MS analysis results of both are shown in FIG. From these analysis results, no. 9-0 and no. 9 was found to be the glycopeptides shown in FIGS. 16 (A) and (B). Further, the amino acid sequence of the obtained peptide was a partial sequence corresponding to the 90th to 101st positions of the amino acid sequence of ⁇ -ribetin, which is an egg yolk protein (SEQ ID NO: 15).
  • Example 2 Analysis of peptide essential for osteoblast proliferation promoting activity
  • a peptide to which no sugar chain is bound and various peptides from which the amino acid at the N-terminal side or C-terminal side has been deleted are chemically synthesized. Then, osteoblast proliferation promoting activity was measured.
  • an automatic peptide synthesizer Syro II manufactured by Biotage Japan Ltd. was used. The synthesized peptides are shown in Table 1.
  • the results of measuring the osteoblast proliferation promoting activity of each peptide are shown in FIG.
  • the concentration of each peptide was 1 ⁇ M, and an unfractionated egg yolk protein hydrolyzate (1 mg / mL) was used as a positive control.
  • Peptides other than 12 had osteoblast proliferation promoting activity. From this result, at least no. It was suggested that the 4th-position alanine of 1 peptide (SEQ ID NO: 4) is essential for osteoblast proliferation promoting activity.
  • tripeptide (AES) and dipeptide (AE) were synthesized, respectively, and osteoblast proliferation promoting activity was measured.
  • an unfractionated egg yolk protein hydrolyzate (1 mg / ml) was used.
  • the results are shown in FIG.
  • the tripeptide (AES) had a strong osteoblast proliferation promoting activity.
  • dipeptide (AE) has almost no osteoblast proliferation activity. From this result, it was revealed that a sequence consisting of 3 amino acids of “AES” is essential for osteoblast proliferation promoting activity.
  • the sequence consisting of 3 amino acids “AES” corresponds to positions 93 to 95 of the amino acid sequence of ⁇ -libetin (SEQ ID NO: 15).

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Abstract

　本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供するとともに、当該ペプチドを利用する優れた用途を提供する。

Description

骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドおよびその利用
　本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドおよび当該ペプチドを含有する骨形成促進用医薬、並びにこれらの利用に関するものである。
　骨粗鬆症は、骨量または骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折のリスクが高まった全身性疾患である。日本では骨粗鬆症の患者は約１，１００万人と言われており、その８割は女性である。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の高齢化に伴い今後患者数が増加すると推測される。また、近年、小中学生の骨折率が増加しており、骨粗鬆症を予防するという見地からも若年期にしっかりと骨塩量を高めて、より高い最大骨量を得ることは非常に重要である。このように、今や骨の健康を保つことは性別や年齢に関係なく全社会的な関心事である。
　従来、骨の疾患を予防あるいは治療する方法として、食餌療法によるカルシウム補給、軽い運動、日光浴、薬物治療等が行われている。食餌療法によるカルシウム補給としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や、牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、溶解性や吸収性、呈味性の点で必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。適度な運動は骨量を増やし、骨を強化するので、散歩やウオーキングは骨の健康によいとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものである。まして寝たきりの老人ではほとんど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３の補給と言う点ではよいとされているが、これだけでは不十分である。
　本発明者らの過去の研究により、卵黄水溶性画分および卵黄タンパク質加水分解物に骨強化作用があることが知られている（特許文献１，２参照）。しかしながら、卵黄水溶性画分や卵黄タンパク質加水分解物に含有される骨強化活性を有する成分は特定されていなかった。
特開２００５－２１０８７号公報 国際公開ＷＯ２００６／０７５５５８号
　本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供するとともに、当該ペプチドを利用する優れた用途を提供することを目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［２］以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（ａ）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１～６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１～９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
［３］スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［４］アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ－アセチルグルコサミンであることを特徴とする前記［３］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［５］セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることを特徴とする前記［３］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［６］　以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種である前記［２］～［５］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
（Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
（Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を表す。）
［７］前記［１］または［２］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［８］前記［７］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［９］前記［８］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
［１０］前記［１］～［６］のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
［１１］前記［１］～［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
［１２］骨形成促進剤である前記［１１］に記載の医薬。
［１３］骨形成促進剤を製造するための前記［１］～［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
［１４］哺乳動物に対して前記［１］～［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
［１５］骨形成促進に使用するための前記［１］～［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
　本発明によれば、骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供することができる。
卵黄タンパク加水分解物を分画分子量１０ｋＤａのＵＦ膜で分画し、それぞれの画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 卵黄タンパク加水分解物の分子量１０ｋＤａ以下の画分を分画分子量３ｋＤａのＵＦ膜で分画し、それぞれの画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 卵黄タンパク加水分解物の分子量３ｋＤａ－１０ｋＤａの画分をＯＤＳカラムに供し、各メタノール濃度（２０、４０、６０、８０％）で溶出して得られた画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 図３において強い骨芽細胞増殖活性が認められたメタノール２０％溶出画分についてゲルろ過を行って分取した画分を示す図である。 図４に示した７画分についてＧＰＣ分析を行った結果を示す図である。 図４に示した７画分のうち６画分について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 図６において強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクション１についてＨＰＬＣを行い、検出されたピーク、分取したフラクションの範囲を示した図である。 図７に示した範囲で分取したフラクションについて骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 図８において強い骨芽細胞増殖活性が認められた２０－４０分のフラクションに存在する各ピークを分取し、各ピークの骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 図９において強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクションＮｏ．９をさらにＨＰＬＣで分画した結果を示す図である。 図１０に示された２つのピークを分取し、それぞれの骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 骨芽細胞増殖活性を有するフラクション（Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９）に含まれるペプチドのアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。 Ｎｏ．９－０に含まれるペプチドのＥＳＩ－ＭＳ解析結果を示す図である。 Ｎｏ．９に含まれるペプチドのＥＳＩ－ＭＳ解析結果を示す図である。 Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９に含まれるペプチドのＣＥおよびＭＳ解析結果を示す図である。 解析の結果明らかとなったペプチドの構造を示す図である。 化学合成した１２種類のペプチドについて骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 化学合成したペプチド（Ｎｏ．１３）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 化学合成したペプチド（Ｎｏ．１４）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。 化学合成したトリペプチド（ＡＥＳ）およびジペプチド（ＡＥ）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
〔ペプチド〕
　本発明のペプチドは、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有するトリペプチドである。
　また、本発明のペプチドは、以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するものでもよい。
（ａ）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１～６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１～９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
　なお、本発明における「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、結合するアミノ酸の数は問わない。すなわち、本発明における「ペプチド」にはポリペプチドが含まれる。
　本発明者らは、卵黄タンパク質を加水分解したペプチド混合物から、強い骨芽細胞増殖活性を有するペプチドの同定を試み、目的のペプチドが「Val－Asp－Gly－Ala－Glu－Ser－Pro－Thr－Ala－Asn－Ile－Ser」（配列番号４）のアミノ酸配列を有し、第１０位のアスパラギンに糖鎖が結合した糖ペプチドであることを特定した。また、糖鎖が結合していなくても骨芽細胞増殖活性を有することを確認した。
　また、本発明者らは、配列番号４のアミノ酸配列において、Ｎ末端側およびＣ末端側からそれぞれ数個のアミノ酸を欠失させても骨芽細胞増殖活性を有するが、配列番号４の第４位のアラニンを欠失させると骨芽細胞増殖活性が失われることを確認した。具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列（Val－Asp－Gly－Ala－Glu－Ser）からなるペプチド、配列番号２で表わされるアミノ酸配列（Asp－Gly－Ala－Glu－Ser－Pro－Thr－Ala）からなるペプチド、および配列番号３で表わされるアミノ酸配列（Ala－Glu－Ser－Pro－Thr－Ala－Asn－Ile－Ser）からなるペプチドは、骨芽細胞増殖活性を有していることを確認した。
　さらに、本発明者らは、配列番号４のアミノ酸配列において、骨芽細胞増殖活性を発現する最小ペプチドの特定を試みた結果、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなるトリペプチドが骨芽細胞増殖活性を有していることを見出した。
　すなわち、骨芽細胞増殖促進活性に必須のアミノ酸配列は、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ３アミノ酸からなる配列であることが明らかとなった。したがって、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１～５個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１～６個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１～９個のアミノ酸が欠失したペプチドを含むペプチドも骨芽細胞増殖活性を有することが容易に理解できる。
　また、本発明者らは、配列番号４の第７位のプロリンがバリンに置換されても骨芽細胞増殖活性を有することを確認した。したがって、「Val－Asp－Gly－Ala－Glu－Ser－Pro－Thr－Ala－Asn－Ile－Ser」（配列番号４）のペプチドにおいて、第４位のアラニン、第５位のグルタミン酸および第６位のセリン以外のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しても、骨芽細胞増殖活性を有すると考えられる。なお、配列番号１～３は配列番号４の一部であるので、配列番号１～３のアミノ酸配列のペプチドについても同様であると考えられる。好ましいアミノ酸置換としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＰｒｏおよびＩｌｅの中での置換、ヒドロキシル残基を有するＳｅｒとＴｈｒとの置換、酸性残基を有するＡｓｐとＧｌｕとの置換、塩基性残基を有するＬｙｓとＡｒｇとの置換、芳香族残基を有するＰｈｅとＴｙｒとの置換などが挙げられるが、これらに限定されず、骨芽細胞増殖活性を維持できる限りどのようなアミノ酸置換であってもよい。
　本発明のペプチドは、上記（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドであればよく、（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有していてもよい。（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は特に限定されない。付加的なアミノ酸配列としては、タグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなど）、マーカーペプチド（例えば、ＧＦＰなど）等が挙げられる。
　配列番号４のアミノ酸配列は、卵黄タンパク質の一種であるβ－リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の一部であることが明らかとなった。したがって、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒまたは配列番号１～４のいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、β－リベチンの全長またはβ－リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含むフラグメントであることが好ましい。また、配列番号１５で表わされるβ－リベチンのアミノ酸配列において、第９６位のプロリンがバリンに置換された配列であってもよく、配列番号１５の第９６位のプロリンがバリンに置換された配列の全長または第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含むフラグメントも好適である。フラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、好ましくは３～５０残基、より好ましくは３～３０残基、さらに好ましくは３～２０残基、特に好ましくは３～１２残基である。
　本発明のペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、本発明のペプチドを一部に含むペプチド（例えば、β－リベチン）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
　得られたペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有することは、細胞増殖を測定する公知の方法から適宜選択した試験系において骨芽細胞を使用し、ペプチドを添加した場合とペプチドを添加していない場合とを比較して、ペプチドを添加した場合の方が骨芽細胞の増殖レベルが高いことを確認すればよい。例えば、骨芽細胞由来の細胞株を用いる細胞培養系において、ＭＴＴアッセイやセルカウント法を用いる方法が挙げられる。
　本発明のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(－ＣＯＯ－)、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピルもしくはｎ－ブチルなどのＣ１－６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３－８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α－ナフチルなどのＣ６－１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－Ｃ１－２アルキル基もしくはα－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基などのＣ７－１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
　さらに、本発明のペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
　本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属との塩、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ－ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
　本発明のペプチドは、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒからなるペプチドおよび上記（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることが好ましい。糖鎖が結合していることにより、酵素分解に対する抵抗性が向上し、例えば、生体において血中半減期を長くすることができ、作用の持続性を図ることができる。
　単糖または糖鎖は、アミノ酸の側鎖官能基に直接またはリンカーを介して結合することができる。単糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、シアル酸、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコサミン、ガラクトサミンおよびこれらの硫酸化物、リン酸化物、硝酸化物等が挙げられる。糖鎖は、上記例示した単糖が２個以上グリコシド結合したものであれば限定されず、結合している単糖の個数は問わない。
　アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖は、Ｎ－アセチルグルコサミンであることが好ましい。また、セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることが好ましい。
　本発明のペプチドのアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖（Ｎ結合型糖鎖）としては、例えば、以下の（１）～（３２）などが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本発明のペプチドのセリン残基またはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖（Ｏ結合型糖鎖）としては、例えば、以下の（１）～（１１）などが挙げられる。なお、下記（１）～（８）に示す糖鎖（コア構造）の非還元末端側の糖に、さらにガラクトース（Ｇａｌ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（ＮｅｕＡｃ）などが付加されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　単糖または糖鎖が結合したペプチドは、例えば、（１）ｓｔｅｐｗｉｓｅ法、（２）ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法、（３）酵素－化学合成法などの公知の方法により製造することができる。得られた糖ペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有することは、上述の方法で確認することができる。
　（１）ｓｔｅｐｗｉｓｅ法は、糖アミノ酸を合成単位として用いる方法であり、糖アミノ酸にアミノ酸を結合させて伸長させ糖ペプチドを合成する。ペプチド鎖の伸長は、一般的なペプチド合成のプロトコールに従って固相合成法（Fmoc法、Boc法）により行うことができる。
　Ｎ－結合型糖アミノ酸は、糖アミンとアスパラギン酸誘導体のβ－カルボキシル基との縮合により合成することができる。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（Kunz, H. (1987) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 294-308）、２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン－１－カルボキシレイト（EEDQ）（Kunz, H., and Unverzagt, C. (1988) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 27, 1697-1699、Kisch, P., Kusunose, N., Aikawa, J., Kitagawa, T., Yokoyama, S., and Ogawa, T. (1995) Bioorg. Med. Chem. 3, 1631-1636）、１－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロポキシル）カルボジイミド（EDC）（Teshima, T., Nakajima, K., and Shiba, T. (1996) in Peptide Chemistry 1995 (Nishi, N. ed.) pp.141-144, Protein Research Foundation, Osaka）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト（TBTU）（Zang,H., Wang Y., Thurmer, R., Meisenbach, M., and Voelter, W. (1997) Liebig Ann., 9, 1871-1877、Arsequell, G., Krippner, L., Dwek, R. A., and Wong, S.Y.C. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 2383-2384）、ペンタフルオロフェニルエステル（Urgge, L., Otvos, L. Jr., Lang, E., Wroblewski, K., Laczko, I., and Hollosi, M. (1992) Carbohydr. Res. 235, 83-93、Otvos, L. Jr., Urgge, L., Hollisi, M., Wroblewski, K., Graczyk, G., Lang, E., Fasman, G.D., and Thurin, J (1990) Tetrahedron Lett. 31, 5889-5892、Urgge, L., Kollat, E., Hollosi, M., Laczko, I., Wroblewski, K., Thurin, J. Otvos, L. Jr. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 3445-3448）などが挙げられる。
　糖アミンは、パラジウムブラック（Thiem, J., and Wiemann, T. (1990) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 29, 80-82）、リンドラー触媒（Nakabayashi, S., Warren, C.D., and Jeanloz, R.W. (1988) Carbohydr. Res. 174, 279-289）、酸化白金（Marks, G.S., Marshall, R.D., and Neuberger, A. (1963)　Biochem. J. 87, 274-281）、ラネーニッケル（Mcdonald, F. E., and Danishefsky, S.J. (1992) J. Org. Chem. 57, 7001-7002）などの触媒を用いた糖アジドの接触還元、またはプロパンジチオールによる還元（Unverzagt, C. (1996) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 35, 2350-2353）により合成できる。また、トリアルキルホスフィン存在下、糖アジドとアスパラギン酸誘導体から糖アスパラギンを得る方法（Mizuno, M., Muramoto, I., Kobayashi, K., Yaginuma, H., and Inazu, T. (1999) Synthesis, 162-165、Inazu, T., and Kobayashi, K. (1993) Synlett., 869-870）、糖イソチオシアネート（Kholrlin, A.Y., Zurabyan, S. E., and Macharadze, R.G. (1980) Carbohydr. Res. 85, 201-208、Gunther, G., and Kunz, H. (1990) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 29, 1050-1051）、ペンテニルグリコシド（Handlon, A. L., and Fraser-Reid, B. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 3796-3797、Radcliffe, A. J., Konradsson, P., and Fraser-Reid, B. (1991) Carbohydr. Res. 216, 323-335）を用いる方法が知られている。
　Ｏ－結合型糖アミノ酸は、ハロゲン糖（Luning, B., Norberg, T., River-Baeza, C., and Tejbrant, J. (1991) Glycoconjugate J. 8, 450-455、Kunz, H., Birnbach, S., and Wernig, P. (1990) Carbohydr. Res. 202, 207-213、Ciommer, M., and Kunz, H. (1991) Synlett., 593-594、Paulsen, H., and Paal, M. (1984) Carbohydr. Res. 135, 71-84）、グリコシルトリクロロアセトイミデート（Fukase, K., Hase, S., Ikenaka, T., and Kusumoto, S. (1992) Bull. Chem. Soc. Jpn. 65, 436-445、Kinzy, W., and Schmidt, R. R. (1989) Carbohydr. Res. 193, 33-47、Barchi, J. J., Russ, P., Johnson, B., Otaka, A., Nomizu, M., and Yamada, Y. (1995) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 711-714）、チオグリコシド（Halander, A., Kenne, L., Oscarson, S., Peters, T., and Brisson, J. R. (1992) Carbohydr. Res. 230, 299-318、Elofsson, M., and Kihlberg, J. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 7499-7502、Paulsen, H., Merz, G., Weichert, U. (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1364-1365）、アセチル化糖（Seitz, O., and Wong, C-H. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119, 8766-8776、Elofsson, M., Roy, S., Salvador, L. A., and Kihlberg, J. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 7645-7648）などを糖供与体としたグリコシル化反応により合成することができる。特にＦｍｏｃ－セリンやＦｍｏｃ－スレオニンのペンタフルオロフェニルエステルを糖受容体として用いる方法は、そのまま糖ペプチド合成に用いることができる有用な方法である（Jansson, A. M., Meldal, M., and Bock, K. (1992) J. Chem. Soc. Perkins Trans I, 1699-1707）。
　（２）ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法は、糖鎖部分とペプチド部分をそれぞれ合成しておき、それらを縮合させて糖ペプチドを合成する方法である。ペプチド鎖中のアスパラギン残基のβカルボキシル基と、７糖（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）からなる糖鎖アミンとの縮合例がある（Cohen-Abisfeld, S. T., and Lansbury, P. T. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 1053-10537）。
　（３）酵素－化学合成法は、ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖ペプチドを合成し、これを糖鎖受容体とし、糖鎖供与体として、天然の糖タンパク質（卵白、卵黄、血清トランスフェリン、リボヌクレアーゼＢなど）から調製される糖アミノ酸や糖ペプチドを用い、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－αなど）を用いて、糖鎖転移反応を行う方法である。Ｅｎｄｏ－Ｍは、Ｎ－結合型糖鎖の転移（K. Yamamoto, J. Biosci. Bioeng. 2001, 92, 493）、Ｅｎｄｏ－αは、Ｏ－結合型糖鎖（コア１）の転移（H. Ashida, K. Yamamoto, T. Murata, T. Usui, H. Kumagai, Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, 394、T. Katayama, K. fujita, K. Yamamoto, J.Biosci. Bioeng. 2005, 99, 457）に利用できる。
　本発明のペプチドは、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種であることが好ましい。
（Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列（β－リベチン）の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
（Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列（β－リベチン）において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
（Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を表す。）
〔ポリヌクレオチド〕
　本発明のポリヌクレオチドは、上記Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒからなるペプチドまたは（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡと ＲＮＡとのハイブリッドのいずれであってもよい。一本鎖の場合は、コード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
　本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して組み合わせることにより任意にデザインすることができる。また、配列番号１～４のいずれかで表わされるアミノ酸配列は、上述のように卵黄タンパク質の一種であるβ－リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の一部であるので、β－リベチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。ここで、β－リベチンは、卵黄タンパク質の前駆体であるビテロゲニンの切断により生成することが知られている。すなわち、ビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送されて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン－１、ホスビチン、リポビテリン－２、β－リベチンに切断される（Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10;250(23):9060-6.）。β－リベチンのアミノ酸配列は、ビテロゲニンの全アミノ酸配列（アクセッション番号：ＣＡＡ３１９４２）の１５６７位から１８５０位に該当する（特開２００６－１１５７６１号公報）。したがって、ビテロゲニンをコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｘ１３６０７）に基づいて、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列をデザインすることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法やＰＣＲ法等によって取得することができる。具体的には、例えば、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して塩基配列をデザインし、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すればよい。また、ビテロゲニンをコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｘ１３６０７）中の本発明のペプチドをコードする領域を増幅するためのプライマーを設計し、これらプライマーを用いてニワトリゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことにより、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
〔発現ベクター〕
　本発明は、上記本発明のペプチドを製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のペプチドを回収、精製することができる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明のペプチドを融合ペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明のペプチドをＧＦＰ融合ペプチドとして発現させてもよい。
　宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
〔形質転換体〕
　本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。
〔抗体〕
　本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のペプチドの検出や分離に使用することができる。
　本明細書において「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ（鶏卵抗体）およびこれらのフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメントなど））を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1988）」、岩崎ら、「単クローン抗体　ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（1991）」、「Makoto S．et al，Biosci. Biotech. Biochem.，56(2): 270-274， 1992」）に従えば作製することができる。
　少数のアミノ酸（例えば、約２０残基以下）からなるペプチドに特異的に結合する抗体を作製する場合は、キャリアタンパク質（例えば、KLH(Keyhole limpet hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA（Ovalbumin）等）に抗原ペプチドを結合させて免疫する方法、ＭＡＰｓ（Multiple Antigenic Peptides）法などの公知の方法を好適に用いることができる。
〔医薬〕
　本発明のペプチドまたはその塩は、骨形成促進用の医薬として使用することができる。本発明の医薬は骨形成促進作用を有しているので、例えば、骨折、骨粗鬆症、骨形成不全、発達期における成長阻害などの予防または治療に好適に使用することができる。
　本発明の医薬は、本発明のペプチドを有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ－５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
　このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
　投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０.１～１００ｍｇ、好ましくは約１．０～５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤では、通常例えば体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０．０１～３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１～２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１～１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
　また、本発明は、骨形成促進剤を製造するための本発明のペプチドの使用、骨形成促進に使用するための本発明のペプチドも包含する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：卵黄タンパク加水分解物中の骨芽細胞増殖促進活性成分の同定〕
（１）卵黄タンパク加水分解物の調製
　脱脂卵黄粉末（キユーピー株式会社製）１００質量部に、水５００質量部を加えて均一に撹拌した後、商品名「アルカラーゼ」（Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼ、ノボザイムズ・ジャパン株式会社製）５質量部を加え、ｐＨ７で５５～６０℃にて３時間反応させた。反応終了後、９０℃で１０分間の熱処理により酵素を失活させてから、濾過を行い、濾液を回収した。濾液をスプレー乾燥して、卵黄タンパク加水分解物を得た。
　なお、脱脂卵黄粉末は、市販の卵黄粉末（例えば、キユーピー株式会社製）から調製することもできる。具体的には、市販の卵黄粉末１質量部に、エタノール（またはｎ－ヘキサン）５～１０質量部を加え、ブレンダーで３０分間程度撹拌した後、濾過して固形物を回収する。この操作を３回ほど繰り返して卵黄から脱脂を行う。脱脂した卵黄を風乾することにより乾燥粉末を調製することができる。
（２）骨芽細胞増殖活性の測定方法
　マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ Ｓｕｂｃｌｏｎｅ－４（ATCC No.CRL-2593）を、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２－９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を、上記α－ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（1×104個／mL）を調製した。この細胞懸濁液を２４穴プレートに１ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２－９５％ａｉｒの下で前培養した。翌日、Ｃａ濃度が５００μｇ／ｍＬになるようにＣａＣｌ２を添加したα－ＭＥＭ培養液９５０μＬにサンプルまたはＰＢＳ（－）を５０μＬ加えてよく混和した培養液に交換し、更に７２時間培養した。骨芽細胞の増殖活性は、ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl) -2,5- Diphenyltetrazolium Bromide）アッセイ法および／またはセルカウント法にて測定した。サンプルの骨芽細胞の増殖促進活性は、ＰＢＳ（－）の増殖値を１００とした時の相対値で表した。
（３）ＵＦ膜による分画（１回目）
　卵黄タンパク加水分解物１ｋｇを水１０Ｌに溶解し、ＵＦ膜（分画分子量：１０ｋＤａ、日本ミリポア株式会社製）を用いて分画し、分子量１０ｋＤａ以下の画分と分子量１０ｋＤａ以上の画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。分子量１０ｋＤａ以下の画分と分子量１０ｋＤａ以上の画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物相当量）を添加した。また、それぞれの画分を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。
　結果を図１に示した。図１から明らかなように、分子量１０ｋＤａ以下の画分に骨芽細胞増殖活性が認められた。
（４）ＵＦ膜による分画（２回目）
　上記（３）で骨芽細胞増殖活性が認められた分子量１０ｋＤａ以下の画分を、さらにＵＦ膜（分画分子量：３ｋＤａ、日本ミリポア株式会社製）を用いて分画し、分子量３ｋＤａ－１０ｋＤａの画分と分子量３ｋＤａ以下の画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。また、上記（３）で得られた分子量１０Ｋ以下の画分についても測定した。
　結果を図２に示した。図２から明らかなように、分子量３ｋＤａ－１０ｋＤａの画分に骨芽細胞増殖活性が認められた。
（５）ＯＤＳカラムによる分画
　上記（４）で骨芽細胞増殖活性が認められた分子量３ｋＤａ－１０ｋＤａの画分をＯＤＳカラム（樹脂：商品名「ODS-A」、株式会社ワイエムシィ製、オープンカラムサイズ：φ35mm×200mm）に供し、各メタノール濃度（２０、４０、６０、８０％）で溶出して、分画した。得られた各画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
　結果を図３に示した。図３から明らかなように、メタノール２０％溶出画分に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
（６）ゲルろ過による分画
　上記（５）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたメタノール２０％溶出画分についてゲルろ過（樹脂：商品名「Superdex30 prep grade」、ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製、オープンカラムサイズ：35mm×410mm、移動相：30％アセトニトリル、流速：0.6mL/min）を行い、７画分を分取した。
　ゲルろ過により分取した画分を図４に示した。また、得られた７画分について、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography：ゲル浸透クロマトグラフィー）分析を行った結果を図５に示した。ＧＰＣの条件は以下のとおりである。
　カラム：商品名「YMC-Pack Diol-60(500×8.0mmI.D.)」（株式会社ワイエムシィ製）
　移動相：0.1M KH2PO4-K2HPO4 containing 0.2M NaCl/Acetonitrile=70/30
　流速：0.7mL/min
　温度:室温
　検出:UV215nm
　サンプル濃度：2mg/ml
　インジェクション量:10μL
　ゲルろ過分画により得られた７画分のうち、フラクション１、３～７の６画分について、骨芽細胞増殖活性を測定した（フラクション２は回収量が少なすぎたこととフラクション１とパターンが同じだったためアッセイを行わず）。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図６に示した。図６から明らかなように、フラクション１に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
（７）ＨＰＬＣよる分画（１回目）
　上記（６）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクション１についてＨＰＬＣで分画し、２０分ごとにフラクションを分取した。得られた４フラクションについて骨芽細胞増殖活性を測定した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
　カラム：商品名「5C18-AR-300（50×4.6mmI.D.）」（ナカライテスク株式会社製）
　移動相：（A）5％Acetonitrile/0.5% TFA
　　　　　（B）10％Acetonitrile/0.5% TFA
　　　　　　　　B 0%→100％（0-60min）Gradient
　温度：40℃
　検出：UV220nm
　サンプル濃度：2mg/ml
　インジェクション量：10μL
　ＨＰＬＣにより検出されたピークおよび分取したフラクションの範囲を図７に示した。
　骨芽細胞増殖活性を測定した結果を図８に示した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。図８から明らかなように、２０－４０分のフラクションに最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
　そこで、２０－４０分のフラクションに存在する６～１０の各ピークを分取し（図７参照）、各ピークの骨芽細胞増殖活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図９に示した。図９から明らかなように、ピーク９（フラクションＮｏ．９）に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
（８）ＨＰＬＣよる分画（２回目）
　上記（７）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクションＮｏ．９をさらにＨＰＬＣで分画した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
　ＯＤＳカラム：商品名「YMC-Pack ODS-A（250×4.6mm I.D.）」
　　　　　　　　株式会社ワイエムシィ製
　移動相：7％Acetonitrile/0.5％TFA
　流速：0.8mL/min
　温度：40℃
　検出：UV220nm
　ＨＰＬＣの結果を図１０に示した。フラクションＮｏ．９から、さらに２つのピーク（Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９）が得られた。この２つのピーク（Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９）を分取し、それぞれについて骨芽細胞増殖活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、いずれのピークにも骨芽細胞増殖活性が認められた。
（９）ペプチドの同定
　Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９に含まれるペプチドのアミノ酸配列を、プロテインシークエンサを用いて解析した。その結果、Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９には、いずれも１２アミノ酸からなる同一の配列を有するペプチドが検出された。また、第１０位のアミノ酸に糖鎖が結合している可能性が示唆された（図１２参照）。
　そこで、Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９に含まれるペプチドをノイラミニダーゼおよびペプチドＮ－グリカナーゼ（PNGase F、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン製）で処理し、ＥＳＩ－ＭＳ（ナノ－エレクトロスプレイ質量分析計）、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）およびＭＳ（質量分析計）を用いて糖鎖構造を解析した。
　Ｎｏ．９－０のＥＳＩ－ＭＳ解析結果を図１３に、Ｎｏ．９のＥＳＩ－ＭＳ解析結果を図１４に、両者のＣＥおよびＭＳ解析結果を図１５にそれぞれ示した。これらの解析結果から、Ｎｏ．９－０およびＮｏ．９に含まれるペプチドは、図１６（Ａ）および（Ｂ）に示す糖ペプチドであることが明らかとなった。また、得られたペプチドのアミノ酸配列は、卵黄タンパク質であるβ－リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９０位－第１０１位に該当する部分配列であった。
〔実施例２：骨芽細胞増殖促進活性に必須のペプチドの解析〕
　実施例１で同定された骨芽細胞増殖促進活性を有する糖ペプチドにおいて、糖鎖が結合していないペプチド、およびそのＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸を欠失させた各種ペプチドを化学合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。ペプチドの合成には、ペプチド自動合成装置Ｓｙｒｏ ＩＩ（バイオタージ・ジャパン株式会社製）を使用した。合成したペプチドを表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　各ペプチドの骨芽細胞増殖促進活性を測定した結果を図１７に示した。なお、各ペプチドの濃度は１μＭ、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。図１７から明らかなように、Ｎｏ．１１およびＮｏ．１２以外のペプチドは、骨芽細胞増殖促進活性を有していた。この結果から、少なくともＮｏ．１のペプチド（配列番号４）の第４位のアラニンは骨芽細胞増殖促進活性に必須であることが示唆された。
　さらに、表２に示す２種類のペプチドを合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　Ｎｏ．１３の結果を図１８に、Ｎｏ．１４の結果を図１９にそれぞれ示した。図１８および図１９から明らかなように、いずれのペプチドも骨芽細胞増殖促進活性を有していた。この結果から、Ｎｏ．１３のペプチドにおいてプロリンをバリンに置換しても骨芽細胞増殖促進活性に影響を及ぼさないことが確認された。
　以上の結果を踏まえて、トリペプチド（ＡＥＳ）およびジペプチド（ＡＥ）をそれぞれ合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
　結果を図２０に示した。図２０から明らかなように、トリペプチド（ＡＥＳ）は、強い骨芽細胞増殖促進活性を有していた。一方、ジペプチド（ＡＥ）は骨芽細胞増殖活性をほとんど有していないことが分かる。この結果から、「ＡＥＳ」の３アミノ酸からなる配列が骨芽細胞増殖促進活性に必須であることが明らかとなった。なお、「ＡＥＳ」の３アミノ酸からなる配列は、β－リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９３位－第９５位に該当する。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (15)

  1. 　Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
  2. 　以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
    （ａ）Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ
    （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
    （ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
    （ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
    （ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
    （ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
    （ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１～６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
    （ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
    （ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１～９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
  3. 　スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
  4. 　アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ－アセチルグルコサミンであることを特徴とする請求項３に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
  5. 　セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることを特徴とする請求項３に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
  6. 　以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種である請求項２～５のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
    （Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
    （Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位－第９５位のＡｌａ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３～１２のペプチド
    （Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を表す。）
  7. 　請求項１または２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  8. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
  9. 　請求項８に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
  10. 　請求項１～６のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
  11. 　請求項１～６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
  12. 　骨形成促進剤である請求項１１に記載の医薬。
  13. 　骨形成促進剤を製造するための請求項１～６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
  14. 　哺乳動物に対して請求項１～６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
  15. 　骨形成促進に使用するための請求項１～６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
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