WO2011118891A1 - 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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pharmaceutically acceptable
treatment
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nervous system
prevention
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장춘곤
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성균관대학교 산학협력단
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    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of neurological diseases, including sulfuretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a method for preventing or treating neurological diseases using the same.
  • the present invention relates to a functional food composition for the improvement of neurological diseases, including sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to sulfetretin (3 ', 4', 6-Trihydroxyaurone) and pharmaceutically acceptable salts thereof having dementia, antioxidant and neuroprotective effects, and more specifically, the present invention relates to sulfetretin or pharmaceutical
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions and functional food compositions for preventing and treating degenerative brain diseases and stress, oxidative damage, aging, depression, and anxiety due to various brain nervous system abnormalities, including acceptable salts thereof.
  • Neurons are constantly apoptotic in the process of development and reconstruction of synapses. Stress and apoptosis caused by cytotoxic drugs are the main causes of degenerative brain diseases.
  • the oxidative stress is known to have many correlations with the causes of degenerative brain diseases such as Alzheimer's, Parkinson's disease and stroke (Markesbery, Oxidative Stress Hypothesis in Alzheimer's Disease, Free radical biology & medicine, 1997, v. 23, 134-147), recent studies have shown that chronic and oxidative stress are associated with hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, hippocampus, striatum, and subtantia nigra.
  • Oxygen radicals related to neurotoxicity include hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and hydrogen peroxide anion (O 2 ⁇ ). And hydrogen peroxide (OH).
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • O 2 ⁇ hydrogen peroxide
  • OH hydrogen peroxide
  • hydrogen peroxide is known to be the most important precursor of highly reactive free radicals and is likely to induce apoptosis of the central nervous system (McCord, 1985, Free radicals and myocardial ischemia: Overview and outlook, 1988, Free radical biology & medicine, v. 4, pp. 9-14; Rantan et al., Ascorbic acid and focal cerebral ischaemia in a primate model, 1994, Acta neurochirurgica, v.123, pp. 87- 91).
  • ROS reactive oxygen species
  • Apoptosis due to cerebral ischemic injury is known to occur due to excitatory neurotoxicity due to destruction of Ca 2+ ion homeostasis, dysfunction of endogenous semantic and mitochondria, and DNA damage due to oxidative stress (Wei et al., The antioxidant EPC-K1 attenuates NO-induced mitochondrial dysfunction, lipid peroxidation and apoptosis in cerebellar granule cells, 1999, Toxicology, v.134, pp.117-126).
  • antioxidants that eliminate human harmful substances have been successfully used to protect synthetic materials and foods from oxidation. Recently, research and development have been conducted as neuroprotective drugs against degenerative brain diseases caused by oxidative stress.
  • Sulfurretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof used in the present invention is the main ingredient of the combined blood, anti-cancer effect, anti-rheumatic arthritis, anti-inflammatory, anti-platelet aggregation and anti-allergic disease have been reported (Jeon et al. ., Anti-platelet effects of bioactive compounds isolated from the bark of Rhus verniciflua Stokes, 2006, Journal of ethnopharmacology, v.105, pp.
  • the present inventors have completed the present invention by identifying the neuroprotective effect against dementia, Alzheimer's, Parkinson's disease, stroke, depression and anxiety using sulfuric retinate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases of the nervous system, including sulferretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a functional food composition for improving neurological diseases, including sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Sulfurretin or pharmaceutically acceptable salts thereof of the present invention can be used as pharmaceuticals and functional foods having the effect of preventing and treating degenerative brain diseases, depression and anxiety in modern people due to various cerebral nervous system abnormalities.
  • 1 is a diagram showing the chemical structural formula of sulfur retin.
  • Figure 2 is a diagram showing the free radical scavenging ability of the sulfuric retreat in the free radical scavenging activity (antioxidant effect) experiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing the neuroprotective effect of sulferetrein in apoptosis through hydrogen peroxide induction, beta amyloid, 6-hydroxydopamine, corticosterone and SNP induction on SH-SY5Y and PC12 cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of inhibiting the LDH secretion of sulfur retintin in LDH secretion through hydrogen peroxide and beta amyloid induction on SH-SY5Y cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the effect of inhibiting the ROS production of sulfur retin in ROS production through hydrogen peroxide induction on SH-SY5Y cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing a [Ca 2+] inhibit excess influx of sulfur retinoic effect in intracellular [Ca 2+] Excess hydrogen peroxide flowing through the induction of the SH-SY5Y cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect of repairing mitochondrial membrane potential on the mitochondrial membrane potential damage by mitochondrial membrane potential through hydrogen peroxide induction of SH-SY5Y cells.
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression effect of apoptosis-related proteins of sulfur retin in apoptosis through hydrogen peroxide induction on SH-SY5Y cells.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases of the nervous system, including sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a neurological disease by administering a pharmaceutical composition comprising a sulfetretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient who develops or is likely to develop a neurological disease.
  • Sulfur retin in the present invention refers to a compound of formula (1).
  • Sulfur retin can be obtained naturally from plants such as haphwanpi, sumac, or artificially synthesized by methods known in the art.
  • salts refers to salts prepared by conventional methods and known to those skilled in the art.
  • “Pharmaceutically acceptable salts” include, but are not limited to, salts derived from the following pharmacologically or physiologically acceptable inorganic and organic acids and bases.
  • suitable acids include hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , Benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, alkaline earth metals such as magnesium, ammonium and the like.
  • neurological disorder includes dementia, Alzheimer's, Parkinson's disease, stress, oxidative symptoms, aging, stroke, depression and anxiety.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of the disease by administration of a composition comprising a sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the invention.
  • treatment refers to any action that improves or beneficially alters the symptoms of the disease by administration of a composition comprising a sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the invention.
  • the inventors confirmed that the sulfuric retintin is effective in the prevention and treatment of diseases of the nervous system. More specifically, it was found that the free radical scavenging ability of the sulfuric retintin has an antioxidant effect (FIG. 2), and hydrogen peroxide, beta through MTT experiment (cell survival effect) on SH-SY5Y and PC12 cells. Sulfur retinin showed neuroprotective effects in apoptosis through amyloid, 6-hydroxydopamine, corticosterone, and SNP induction (FIG. 3), and hydrogen peroxide and beta amyloid induction of SH-SY5Y cells.
  • sulferetine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is useful for the prevention and treatment of diseases of the nervous system through antioxidant and neuronal cell protective action.
  • Sulfurretines or salts thereof of the present invention may further comprise a suitable carrier, excipient or diluent according to conventional methods.
  • carrier refers to a carrier, excipient, or diluent that does not significantly irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition comprising the sulfetretin or salt thereof according to the present invention may be in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. Can be formulated and used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the extract. ), Lactose, gelatin and the like can be mixed.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the throughput of the pharmaceutical composition for preventing and treating neurological diseases used in the present invention should be a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, with an effective dose level of the subject's type and severity, age, sex, drug Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the sulferetetin or salt thereof of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but generally in an amount of 0.01 to 500 mg / kg, preferably 0.1 to 100 mg / kg, once or several times a day.
  • the dose of the extract may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, skin, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention provides a dietary supplement for preventing nervous system related mental disorders comprising a composition comprising a sulfur retinin or a salt thereof, and a food acceptable additive.
  • composition comprising the sulferretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention may be used in various applications, such as drugs, foods and beverages for the prevention of neurological disorders.
  • Foods to which the extract of the present invention may be added include various foods, for example, beverages, gums, teas, vitamin complexes, dietary supplements, and the like, which are pills, powders, granules, acupuncture tablets, capsules or beverages. Available in form.
  • the amount of the extract in the food or beverage in general, may be added to 0.01 to 15% by weight of the total food weight in the case of the health food composition of the present invention, 0.02 to 10g, preferably based on 100ml for the health beverage composition It may be added at a ratio of 0.3 to 1g.
  • the health beverage composition of the present invention has no particular limitation on the liquid component except for containing the extract as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Conventional sugars such as and the like and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof. , Organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the functional food composition of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules or liquids, and the like to which the composition of the present invention can be added, for example, various foods, for example , Drinks, gum, tea, vitamin complexes, and dietary supplements.
  • the other ingredients other than the composition having an effect on the nervous system diseases including the sulfetretin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as essential ingredients that may be included in the functional food composition of the present invention, and various kinds of foods such as conventional foods.
  • Herbal extracts, food supplements or natural carbohydrates and the like may be included as additional ingredients.
  • the functional food composition is one or more herbal extracts selected from the group consisting of plum, Cheonma, Schisandra chinensis, licorice, missing, Seokchangpo, Ohjigol, Wonji, Astragalus, Sanjoin, Shiho, Creation, Donkey, Jija, Anji, Bokyeong, etc. It can be included as.
  • the food supplement additive may further include food supplement additives, including food supplement additives conventional in the art, such as flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, and the like. .
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. .
  • the functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid And salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • Others may contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • Sulfurretin was purchased from Extrasynthese, France and used amyloid beta 25-35 fragment, Corticosterone, DCFH-DA (2 ', 7'-dichlorofluoroscein diacetate), DPPH (2) , 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), dimethylsulfo xide (DMSO), 6-hydroxydopamine (6-hydroxydopamine), 30% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), Fura-2-AM, rhodamine-123 (Rhodamine- 123), MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide], SNP (Sodium nitroprusside), and anti- ⁇ -actin at Sigma-Aldrich Chemistry Co.
  • Anti-PARP poly ADP ribosepolymerase
  • anti-caspase-3 anti-phospho-p38
  • anti-phospho-JNK antibodies were purchased from Cellsignaling, USA
  • LDH cytotoxicity assay kit was purchased from Takara (Japan).
  • the reagents used in the experiment were purchased from the best product.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were cultured under DMEM (dulbecco's modified eagle's medium) (Hyclone, Thermo, USA) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (Gibco-BRL, USA). The incubator was maintained at 37 ° C. temperature and gas was mixed with 95% air and 5% CO 2 to provide adequate conditions for cell culture. Cells were incubated 24 h prior to experiment with 1 ⁇ 10 6 and 2 ⁇ 10 4 cells / well in 6-well plates or 96-well plates, respectively.
  • DMEM disulbecco's modified eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Gibco-BRL antibiotics
  • the concentrations of hydrogen peroxide, beta amyloid and 6-hydroxydopamine were determined to be 400 ⁇ M, 20 ⁇ M and 200 ⁇ M, respectively, after assessing cell viability.
  • Sulfurretin was dissolved in ethanol and used at a final concentration of less than 0.1%.
  • PC12 cells were cultured under DMEM (Hyclone, Thermo, USA) medium containing 10% FBS, 5% Horse serum and antibiotics (Gibco-BRL, USA). The incubator was maintained at a temperature of 37 ° C., and gas was mixed with 95% air and 5% CO 2 to provide adequate conditions for cell culture. Cells were incubated 24 hours prior to experiment with 2 ⁇ 10 4 cells / well in 96-well plates, respectively. The concentration of corticosterone was determined to be 400 ⁇ M after evaluating cell viability. Sulfurretin was dissolved in ethanol and used at a final concentration of less than 0.1%.
  • DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) was dissolved in 99.5% ethanol to 0.1 mM. Sulfurretin was dissolved in ethanol and diluted to concentrations of 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml, respectively. 90 ⁇ l of DPPH was added to 10 ⁇ l of the sample, mixed with a pipette several times, and reacted at room temperature for 30 minutes. The mixture was measured at 517 nm.
  • Inhibition capacity was calculated by substituting the measured absorbance value into the following equation.
  • Inhibitory Capacity (%) [(Control O.D.- Test Group O.D.) / Control O.D.] ⁇ 100
  • the free radical scavenging ability of sulferetine increased dose-dependently, with at least 10, 18, 58, 70, 71, 73 and 75% free at doses of 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 and 100 ⁇ g / ml, respectively. Radial scavenging activity was shown.
  • MTT reduction assays were used to measure cell viability.
  • the MTT solution was placed in each well to a final concentration of 0.5 mg / ml. After incubation for 2 hours, the medium and the MTT solution were removed, followed by stirring with DMSO. When completely dissolved, the UV absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader (Molecular device, USA).
  • the cell absorbance was calculated by substituting the measured absorbance values into the following equation.
  • Cell viability by hydrogen peroxide treatment showed a survival rate of 55% or higher, and cell survival rates of 74%, 97%, 119%, and 103%, respectively, at doses of 0.1, 0.5, 1, and 5 ⁇ g / ml of sulfuric retinate.
  • the cell survival rate by beta amyloid treatment showed a survival rate of 58% or more, and the cell survival rates of 58%, 64%, 80%, and 97% respectively at the doses of 0.1, 0.5, 1, and 5 ⁇ g / ml of sulferetine, respectively. Indicated.
  • Cell viability by corticosteroid treatment showed a survival rate of at least 55%, with cell survival rates of at least 52%, 55%, 72%, and 90% at doses of 0.1, 0.5, 1 and 5 ⁇ g / ml, respectively, Indicated.
  • Cell viability by 6-hydroxydopamine treatment showed a survival rate of at least 69%, and at least 87%, 97%, 112%, and 140% cells at doses of 0.1, 0.5, 1 and 5 ⁇ g / ml, respectively, Survival rate was shown.
  • Cell viability by SNP treatment showed a survival rate of at least 63% and cell survival rates of at least 44%, 56%, 64%, and 163%, respectively, at doses of 0.1, 0.5, 1, and 5 ⁇ g / ml of sulferetine, respectively.
  • LDH Cytotoxicity Assay Kits were used to perform LDH secretion assay (cytotoxicity) experiments. 50 ⁇ l of the medium of the 96-well plate, which was carried out with the experiment, was dispensed into a new 96-well plate, 50 ⁇ l of the reaction reagent was added thereto, and then exposed to light. The reaction was incubated for 30 minutes and the UV absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader (Molecular device, USA).
  • LDH secretion (%) (LDH secretion O.D. in medium / total LDH secretion O.D. in medium) ⁇ 100
  • Normal control group showed less than 11% LDH secretion, LDH secretion by hydrogen peroxide treatment showed more than 80% LDH secretion, 77% at the doses of 0.1, 0.5, 1 and 5 ⁇ g / ml, respectively, LDH secretion of up to 56%, 33% and 39% was shown.
  • Normal control group showed LDH secretion of less than 12%, LDH secretion by beta amyloid treatment showed LDH secretion above 15%, and 12% at doses of 0.1, 0.5, 1 and 5 ⁇ g / ml respectively of sulphurtin LDH secretion below 11%, 11%, and 9%.
  • DCFH-DA fluorescence was labeled and quantitative experiments were performed using a fluorescence meter.
  • the washed cells were gently stirred with 1 ml of PBS, 100 ⁇ l each of the 96-well plates, aliquoted into a new 96-well plate, and then treated with a fluorometer at 488 nm excitation wavelength and 515 nm emission wavelength. USA).
  • ROS generation was calculated by substituting the measured values into the following equation.
  • ROS generation (%) [(control O.D.-test group O.D.) / Control O.D.] ⁇ 100
  • ROS production of 102% or less The normal control group showed ROS production of 102% or less, ROS production by hydrogen peroxide treatment showed ROS production of 148% or more, and 147%, respectively, at doses of 0.1, 0.5, 1, and 5 ⁇ g / ml of sulferetine, respectively. ROS production of 126%, 123% and 103% was shown.
  • Fura-2-AM fluorescence was labeled and quantitative experiment was performed using a fluorimeter. 6 ⁇ l of Fura-2-AM was added to 10 ⁇ l of final concentration of Fura-2-AM, followed by reaction for 30 minutes. At this time, Fura-2-AM was reacted in the incubator covered with a silver foil not exposed to light. After the reaction was completed, the pretreatment with sulfur pertin for 30 minutes, and then reacted with hydrogen peroxide for 30 minutes to induce excessive influx of [Ca 2+ ] into the cells.
  • Intracellular [Ca 2+ ] nM was calculated by substituting the measured values into the following equations.
  • rhodamine-123 fluorescence was labeled and quantitatively performed using a fluorimeter. After 30 minutes of pretreatment with Sulfurretin on the 6-well plate, the hydrogen peroxide was reacted for 30 minutes to induce MMP damage, and Rhodamine-123 added 10 ⁇ M of the final concentration, followed by 30 minutes of reaction. . At this time, Rhodamine-123 was reacted in the incubator covered with silver foil not to be exposed to light. The cells reacted with the rhodamine-123 fluorescent material were separated by cold PBS, the cells were stirred at 400 g for 3 minutes using a centrifuge, and the fluorescent material was washed twice.
  • the washed cells were gently stirred with 0.5 ml of PBS, 100 ⁇ l each of the 96-well plates, and then aliquoted into a new 96-well plate. Fluorescence (Perkinelmer, USA) at excitation wavelength 480 nm and emission wavelength 530 nm ) was measured.
  • ⁇ m (%) [(Control O.D.-Test Group O.D.) / Control O.D.] ⁇ 100
  • the normal control group had an MMP of 99% or less, and the MMP by hydrogen peroxide treatment showed an MMP of 55% or less, and 56%, 62%, respectively, at doses of 0.1, 0.5, 1, and 5 ⁇ g / ml of sulfuric retinate, respectively. 91% and 98% or more MMPs were shown.
  • the 6-well plate in which the experiment was carried out was pretreated with sulfuric for 2 hours, treated with hydrogen peroxide, and reacted in an incubator for 24 hours. After 24 hours, the supernatants of the wells treated at the respective concentrations were collected and precipitated by using a centrifuge for 400 g for 3 minutes, and the cells were washed with cold PBS, and then 100 ⁇ l of Tper lysis buffer (Thermo, USA) was added. And dissolved for 30 minutes. The lysates were centrifuged at 10000 g, 4 ° C. for 15 minutes using a centrifuge, and after centrifugation the supernatant was stored at 70 ° C. until use as a sample for the experiment.
  • Proteins were quantitated using the BCA Quantification Kit (Thermo, USA), eluted with 8.5% -12% SDS gel and transferred to PVDF membrane. In order to confirm the expression of the protein, it is confirmed by fluorescence coloration with enhanced chmilumenescence (ECL).
  • ECL enhanced chmilumenescence
  • the membrane is reacted with 5% nonfat dry milk for 1 hour, and the primary antibodies PARP, caspase-3, phospho-p38, and phosphate Labeled with Po-JNK, ⁇ -actin overnight at 4 ° C., washed three times with TTBS and then labeled with a secondary antibody, horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-rabbit and anti-mouse antibody at room temperature for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the plate was washed 5 times with TTBS for 10 minutes, and the washed membrane was developed using ECL and x-ray film, and the concentration was analyzed using a quantitative analysis program (Fujifilm, Japan). It was.
  • Normal control group showed over 100% expression in PARP protein expression, and PARP expression by hydrogen peroxide treatment showed up to 38% expression and 70% at doses of 0.1, 0.5 and 1 ⁇ g / ml, respectively, At least 92% and 99% of PARP expression.
  • caspase-3 protein expression the normal control showed over 100% expression, and the caspase-3 expression by hydrogen peroxide treatment showed up to 40% expression, and 0.1, 0.5 and 1 ⁇ g / ml of sulferetine, respectively.
  • phospho-JNK protein expression In phospho-JNK protein expression, the normal control showed more than 100% expression, and the expression of phospho-JNK by hydrogen peroxide treatment was over 173%, and the doses of 0.1, 0.5 and 1 ⁇ g / ml of sulferetine, respectively Showed up to 261%, 204% and 120% of phospho-JNK expression, respectively.

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Abstract

본 발명은 설퍼레틴(Sulfuretin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 이를 사용하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로 다양한 신경계 이상으로 인한 현대인들의 퇴행성 뇌질환, 우울증 및 불안증을 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물
본 발명은 설퍼레틴(Sulfuretin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 이를 사용하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 치매, 항산화 및 신경보호효과를 가지는 설퍼레틴(3',4',6-Trihydroxyaurone) 그리고 약학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 다양한 뇌신경계 이상으로 인한 현대인들의 퇴행성 뇌질환 그리고 스트레스, 산화적 손상, 노화, 우울증, 불안증을 예방 및 치료하는 약학 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 알츠하이머, 파킨슨 병 및 뇌졸중 등과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며(Markesbery, Oxidative Stress Hypothesis in Alzheimer's Disease, Free radical biology & medicine, 1997, v. 23, pp. 134-147), 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계(hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis), 해마(hippocampus), 선조체(striatum), 흑질(subtantia nigra) 그리고 전뇌피질(frontal cortex) 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 뇌졸증, 불안증 및 우울증을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Yu et al., Alzheimer's Disease and Oxidative Stress, 2006, v.23, pp.1142-1148; Mirescu et al., Stress and adult neurogenesis, Hippocampus, 2006, v.16, pp.233-238; Lotharius and Brundin, Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein, Neuroscience, 2002, v.3, pp.932-942; Lee et al., Repression of phospho-JNK and infarct volume in ischemic brain of JIP1-deficient mice, Journal of neuroscience research, 2001, v.74, pp.326-332; Graham, Hostility and pain are related to inflammation in older adults, Brain, behavior, and immunity, 2006 v.20, pp 389-400).
특히, 산소에서 유리되는 자유라디칼(Free radical)은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼(oxygen radical)의 종류에는 과산화수소(H2O2), 과산화수소 음이온(O2 -), 수산화기(OH) 등이 있고, 이중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다(McCord, 1985, Free radicals and myocardial ischemia: Overview and outlook, 1988, Free radical biology & medicine, v.4, pp.9-14; Rantan et al., Ascorbic acid and focal cerebral ischaemia in a primate model, 1994, Acta neurochirurgica, v.123, pp.87-91).
뇌신경세포에 산화적 스트레스(oxidative stress)를 주게 되면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트(glutamate), 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca2+ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca2+의 증가는 또한 카스파제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다(Annunziato et al., Apoptosis induced in neuronal cells by oxidative stress: role played by caspases and intracellular calcium ions, 2003, Toxicology letter, v.139, pp.125-133). 뇌 허혈 손상에 의한 세포사멸은 Ca2+ 이온 항상성의 파괴로 인한 흥분성 신경독성, 내형질 세망과 미토콘드리아의 기능불능, 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 등으로 인해 일어나게 된다고 알려져 있다(Wei et al., The antioxidant EPC-K1 attenuates NO-induced mitochondrial dysfunction, lipid peroxidation and apoptosis in cerebellar granule cells, 1999, Toxicology, v.134, pp.117-126).
이러한 퇴행성 뇌질환들과 만성적 스트레스에 따른 우울증 및 불안증으로 인한 사망률은 국내뿐만 아니라 세계적으로 매년 증가하고 있는 추세이며, 오늘날 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 뇌졸중 등 퇴행성 뇌질환 및 불안증과 우울증 치료 약물 개발에 많은 관심이 모이고 있다. 그러나 임상적으로 유효한 상기 질환들의 약물들은 다양한 부작용들 때문에 사용에 신중을 기해야 하는 단점이 있으며, 다양한 질환을 복합적으로 치료 및 예방할 수 있는 약물은 현재까지 전무한 실정이다.
한편, 인체 유해 물질을 소거하는 항산화제는 합성물질이나 식품 등을 산화작용으로부터 보호하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 최근에는 산화적 스트레스로 인한 퇴행성 뇌질환에 대한 신경 보호성 약물로 연구, 개발이 되고 있는 상황이다.
본 발명에 사용한 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 합환피의 주요성분 물질로서 항암효과, 항류마티스 관절염, 항염증, 항혈소판 응집 그리고 항알러지 질환에 대한 효과는 보고가 되어 있으나(Jeon et al., Anti-platelet effects of bioactive compounds isolated from the bark of Rhus verniciflua Stokes, 2006, Journal of ethnopharmacology, v.105, pp.62-69; Choi et al., Sulfuretin, an Antinociceptive and Antiinflammatory Flavonoid from Rhus verniciflua, 2003, Natural product sciences, v.9, pp.97-101; Jang et al., Flavonoids purified from Rhus verniciflua Stokes actively inhibit cell growth and induce apoptosis in human osteosarcoma cells, 2005, Biochimica et biophysica acta, General subjects, v.1726, pp.309-316; Jung et al, Antioxidant Activity from the Stem Bark of Albizzia julibrissin, 2003, Archives of pharmacal research, v.26, pp.458-462) 신경계 질환에 효과가 있다는 사실을 기재하거나 암시하는 문헌은 현재까지 보고된 바 없다.
이러한 배경하에서 본 발명자들은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 이용하여 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 뇌졸중, 우울증 및 불안증에 대한 신경세포 보호효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 신경계 질환이 발병한 또는 발병 가능성 있는 환자에게 투여하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 다양한 뇌신경계 이상으로 인한 현대인들의 퇴행성 뇌질환, 우울증 및 불안증을 예방 및 치료하는 효과를 갖는 의약품 및 기능성 식품으로서 이용될 수 있다.
도 1은 설퍼레틴의 화학구조식을 나타낸 도이다.
도 2는 자유라디칼 소거능(항산화효과) 실험에서 설퍼레틴의 자유라디칼 소거능에 대해 나타낸 도이다.
도 3은 SH-SY5Y 및 PC12 세포들에 대한 과산화수소 유도, 베타아밀로이드, 6-하이드록시도파민, 콜티코스테론 및 SNP 유도를 통한 세포사멸에서 설퍼레틴의 신경세포 보호 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 및 베타아밀로이드 유도를 통한 LDH 분비에서 설퍼레틴의 LDH 분비 억제효과를 나타낸 도이다.
도 5는 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 ROS 생성에서 설퍼레틴의 ROS 생성 억제효과를 나타낸 도이다.
도 6은 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 세포 내 [Ca2+] 과량 유입에서 설퍼레틴의 [Ca2+] 과량 유입 억제효과를 나타낸 도이다.
도 7은 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 미토콘드리아 막 전위(mitocondria membrane potential) 손상에 있어서 설퍼레틴의 미토콘드리아 막 전위 복구 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 세포사멸에 있어서 설퍼레틴의 세포사멸 관련 단백질들의 발현 효과를 나타낸 도이다.
하나의 양태로서 본 발명은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 신경계 질환이 발병한 또는 발병 가능성 있는 환자에게 투여하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 설퍼레틴이란 하기의 화학식 1의 화합물을 말한다.
화학식 1
Figure PCTKR2010006519-appb-C000001
설퍼레틴은 합환피, 옻나무 등의 식물로부터 천연적으로 얻거나 또는 당업계에 알려진 방법에 의해 인공적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 은 통상적인 방법으로 제조한 염을 의미하며, 당업자에게 공지되어 있다. "약학적으로 허용되는 염" 은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 다음 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예를 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "신경계 질환"이란 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 스트레스, 산화적 증상, 노화, 뇌졸중, 우울증 및 불안증 등을 포함한다.
본원에서의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본원에서의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 설퍼레틴이 신경계 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로, 설퍼레틴의 자유라디칼 소거능이 용량의존적으로 증가하므로 항산화 효과가 있음을 알 수 있었으며(도 2), SH-SY5Y 및 PC12 세포들에 대한 MTT 실험(세포생존효과)을 통해 과산화수소, 베타아밀로이드, 6-하이드록시도파민, 콜티코스테론, SNP 유도를 통한 세포사멸에서 설퍼레틴이 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었고(도 3), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 및 베타아밀로이드 유도를 통한 LDH 분비 측정 실험에서 설퍼레틴이 LDH 분비를 억제하므로 세포독성이 없음을 알 수 있었으며(도 4), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 ROS 생성 억제 효과 실험에서 설퍼레틴이 ROS 생성을 억제함을 알 수 있었고(도 5), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 세포내 [Ca2+] 과량 유입 억제 효과 실험에서 설퍼레틴이 [Ca2+] 과량 유입을 억제함을 알 수 있었으며(도 6), SH-SY5Y 세포들에 대한 과산화수소 유도를 통한 미토콘드리아 막 전위 손상 억제 효과 실험에서 설퍼레틴이 미토콘드리아 막 전위에 복구 효과가 있음을 알 수 있었다(도 7).
따라서 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 항산화 및 신경세포 보호작용을 통해 신경계 질환의 예방 및 치료에 유용함을 알 수 있다.
본 발명의 설퍼레틴 또는 그의 염은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 말한다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 설퍼레틴 또는 그의 염을 포함한 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 신경계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본원에서의 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 설퍼레틴 또는 그의 염은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 설퍼레틴 또는 그의 염을 포함한 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 신경계 관련 정신질환 예방을 위한 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한 조성물은 신경계 관련 정신질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카 라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용 할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물에 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환에 효과를 갖는 조성물 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 기능성 식품 조성물은 매실, 천마, 오미자, 감초, 결명자, 석창포, 오적골, 원지, 황기, 산조인, 시호, 창출, 당귀, 지자, 안육, 복령 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 생약 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 언급한 바와 같이 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 약물 및 시약
설퍼레틴은 엑스트라신테이즈사(Extrasynthese, France)로부터 구매하여 사용하였으고, 아밀로이드 베타 25-35 단편, 콜티코스테론(Corticosterone), DCFH-DA(2',7'-dichlorofluoroscein diacetate), DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), DMSO(dimethylsulfo xide), 6-하이드록시도파민(6-hydroxydopamine), 30% 과산화수소(H2O2), Fura-2-AM, 로다민-123(Rhodamine-123), MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], SNP(Sodium nitroprusside), 항-β-액틴은 시그마사(Sigma-Aldrich Chemistry Co.)에서 구입하여 사용하였으며, 항-PARP (poly ADP ribosepolymerase), 항-카스파제-3, 항-포스포-p38, 항-포스포-JNK 항체들은 셀시그널링사(Cellsignaling, USA)로부터 구매하여 사용하였고, LDH 세포독성 어세이 키트(LDH cytotoxicity assay kit)는 타카라사(Takara, Japan)로부터 구매하여 사용하였다. 그 밖에 실험에 사용된 시약들은 최상의 제품의 것을 구매하여 사용하였다.
실시예 2. SH-SY5Y 신경세포주의 준비
인간신경아세포종 SH-SY5Y 세포는 10％ FBS(fetal bovine serum) 및 항생물질(Gibco-BRL, USA)이 함유된 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)(Hyclone, Thermo, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기를 37℃ 온도로 유지했고, 95％ 공기와 5％ CO2가 혼합된 기체를 계속 공급하여 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포는 6-웰 플레이트 혹은 96-웰 플레이트에 각각 1x106 및 2x104 세포/웰로 실험 24시간 전에 배양하였다. 과산화수소, 베타아밀로이드 및 6-하이드록시도파민의 농도는 세포 생존율을 평가한 후 각각 400μM, 20μM 및 200μM로 결정하였다. 설퍼레틴은 에탄올에 녹였으며, 최종농도 0.1% 이하로 사용하였다.
실시예 3. PC12 신경세포주의 준비
PC12 세포는 10％ FBS, 5% 말 혈청(Horse serum) 및 항생물질(Gibco-BRL, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone, Thermo, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기를 37℃ 온도로 유지하였고, 95 ％ 공기와 5 ％ CO2가 혼합된 기체를 계속 공급하여 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포는 96-웰 플레이트에 각각 2x104 세포/웰로 실험 24시간 전에 배양하였다. 콜티코스테론의 농도는 세포 생존율을 평가한 후 400μM로 결정하였다. 설퍼레틴은 에탄올에 녹였으며, 최종농도 0.1% 이하로 사용하였다.
실시예 4. 설퍼레틴의 자유라디컬 소거능(항산화효과) 실험
DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 99.5% 에탄올에 용해시켜 0.1mM로 만들었다. 설퍼레틴을 에탄올에 용해시켜 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 및 100μg/ml의 농도로 각각 희석하였다. 시료 10㎕에 DPPH 90㎕를 넣고 여러번 파이펫으로 섞어준 뒤 상온에서 30분간 반응시켰으며, 혼합물을 517nm에서 측정하였다.
측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 억제능을 산출하였다.
억제능(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
실험 결과는 도 2와 같다.
설퍼레틴의 자유라디컬 소거능은 용량의존적으로 증가하였으며, 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 및 100㎍/㎖의 용량에서 각각 10, 18, 58, 70, 71, 73 및 75% 이상의 자유라디컬 소거능을 나타냈다.
실시예 5. 설퍼레틴의 MTT(세포생존효과) 실험
세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 환원 어세이를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트에 MTT 용액을 최종농도 0.5㎎/㎖가 되도록 각 웰에 넣었다. 배양기에서 2시간 동안 반응시키고 배지와 MTT 용액을 제거한 후 DMSO를 넣어 교반하였다. 완전히 용해되었을 때 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 540㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다.
측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 세포 생존율을 계산하였다.
세포 생존율(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
실험 결과는 도 3과 같다.
과산화수소 처리에 의한 세포생존율은 55% 이상의 생존율을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 74%, 97%, 119%, 및 103% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
베타아밀로이드 처리에 의한 세포생존율은 58% 이상의 생존율을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 그리고 5㎍/㎖의 용량에서 각각 58%, 64%, 80%, 그리고 97% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
콜티코스테론 처리에 의한 세포생존율은 55% 이상의 생존율을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 52%, 55%, 72%, 및 90% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
6-하이드록시도파민 처리에 의한 세포생존율은 69% 이상의 생존율을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 87%, 97%, 112%, 및 140% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
SNP 처리에 의한 세포생존율은 63% 이상의 생존율을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 44%, 56%, 64%, 및 163% 이상의 세포 생존율을 나타냈다.
실시예 6. 설퍼레틴의 LDH 분비 측정(세포독성) 실험
LDH 분비 측정(세포독성) 실험을 수행하기 위해 LDH 세포독성 어세이 키트를 사용하였다. 실험을 수행한 96-웰 플레이트의 배지를 50㎕씩 취하여 새로운 96-웰 플레이트에 분주하고, 반응시약을 50㎕ 넣은 뒤, 빛에 노출되지 않게 하였다. 배양기에서 30분 동안 반응시키고 마이크로플레이트 판독기(Molecular device, USA)를 이용하여 490㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다.
측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 LDH 분비량를 계산하였다.
LDH분비(％) = (배지 내 LDH 분비 O.D. / 배지 내 총 LDH 분비 O.D.)×100
실험 결과는 도 4와 같다.
정상대조군은 11% 이하의 LDH 분비를 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 LDH 분비는 80% 이상의 LDH 분비를 나타냈고, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 77%, 56%, 33% 및 39% 이하의 LDH 분비를 나타냈다.
정상대조군은 12% 이하의 LDH 분비를 나타냈으며, 베타아밀로이드 처리에 의한 LDH 분비는 15% 이상의 LDH 분비를 나타냈고, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 12%, 11%, 11%, 및 9% 이하의 LDH 분비를 나타냈다.
실시예 7. 설퍼레틴의 ROS 생성 억제 효과 실험
ROS 소거 활성 측정하기 위해 DCFH-DA 형광을 표지 시켜 형광량계(fluorescence meter)를 이용하여 정량 실험을 실시하였다.
실험을 수행한 6-웰 플레이트에 설퍼레틴을 2시간 동안 전처치를 한 뒤, 과산화수소를 30분간 반응시켜 ROS를 유도시킨 후 DCFH-DA 10mM의 용량을 10㎕ 넣어 30분간 반응시켰다. 이때 DCFH-DA는 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. DCFH-DA 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 이를 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 1ml의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 취한 후, 새로운 96-웰 플레이트에 분주한 뒤, 여기파장 488nm 그리고 방출파장 515nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다.
측정된 값을 다음 수학식에 대입하여 ROS 생성을 계산하였다.
ROS 생성(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
실험 결과는 도 5와 같다.
정상 대조군은 102% 이하의 ROS 생성을 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 ROS 생성은 148% 이상의 ROS 생성을 나타냈고, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 147%, 126%, 123% 및 103% 이하의 ROS 생성을 나타냈다.
실시예 8. 설퍼레틴의 세포 내 [Ca 2+ ] 과량 유입 억제 효과 실험
산화적 스트레스에 의한 세포 내 [Ca2+] 과량 유입 억제효과를 측정하기 위해 Fura-2-AM 형광을 표지시켜 형광량계를 이용하여 정량실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 Fura-2-AM을 최종농도 5μM를 10㎕ 넣어준 뒤, 30분간 반응시켰다. 이때 Fura-2-AM은 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 설퍼레틴을 30분 동안 전처치 한 뒤, 과산화수소를 30분간 반응시켜 세포 내 [Ca2+]의 과량유입을 유도시킨 후 Fura-2-AM 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 HEPES 버퍼로 세포 내 2회 세척한 뒤, HEPES 버퍼로 세포를 떼어낸 뒤, 원심분리기를 이용하여 400g로 3분간 세포를 교반시켰다. 상측액은 조심스럽게 제거를 한 후, HEPES 버퍼 0.5ml로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 150 ㎕씩 분주하였다. 새로운 96-웰 플레이트에 분주한 샘플은, 각각 여기파장 540nm 또는 580nm, 방출파장 520nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다.
측정된 값을 다음 수학식에 대입하여 세포 내 [Ca2+]nM을 계산하였다.
세포 내 [Ca2+]nM = 224nM × excitation 540/580
실험 결과는 도6과 같다.
정상대조군은 281nM 이하의 세포 내 [Ca2+] 유입을 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 세포 내 [Ca2+]은 600nM 이상의 [Ca2+] 유입을 나타냈고, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 566nM, 395nM, 371nM 및 243nM 이하의 [Ca2+] 유입을 나타냈다.
실시예 9. 설퍼레틴의 미토콘드리아 막 전위(MMP, △Ψm) 손상 억제 효과 실험
MMP 손상 억제 효과를 측정하기 위해 로다민-123 형광을 표지 시켜 형광량계를 이용하여 정량실험을 실시하였다. 실험을 수행한 6-웰 플레이트에 설퍼레틴을 30분간 전처치 한 뒤, 과산화수소를 30분간 반응시켜 MMP손상을 유도시킨 후 로다민-123이 최종농도 10μM를 10㎕ 넣어준 뒤, 30분간 반응시켰다. 이때 로다민-123은 빛에 노출되지 않게 은박지로 덮어서 배양기에서 반응시켰다. 로다민-123 형광물질에 반응된 세포들은 차가운 PBS로 세포를 떼어내어 원심분리기를 이용하여 400g로 3분간 세포를 교반시켰으며, 2회 반복하여 형광물질을 세척하였다. 세척된 세포는 0.5ml의 PBS로 가볍게 교반시킨 후, 96-웰 플레이트에 각각 100㎕씩 취한 뒤 새로운 96-웰 플레이트에 분주하였으며, 여기파장 480nm 및 방출파장 530nm 값에서 형광량계(Perkinelmer, USA)를 이용하여 측정하였다.
측정된 흡광도 값을 다음 식에 대입하여 △Ψm 값을 산출하였다.
△Ψm(％) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
실험 결과는 도 7과 같다.
정상대조군은 99% 이하의 MMP을 나타냈으며, 과산화수소 처리에 의한 MMP는 55% 이하의 MMP를 나타냈고, 설퍼레틴 각각 0.1, 0.5, 1 및 5㎍/㎖의 용량에서 각각 56%, 62%, 91% 및 98% 이상의 MMP를 나타냈다.
실시예 10. 설퍼레틴의 뇌질환과 관련된 단백질 발현 실험
설퍼레틴의 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 뇌졸중과 관련된 단백질 발현의 동정실험을 위해서 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다.
실험을 수행한 6-웰 플레이트에 설퍼레틴을 2시간 동안 전처리를 한 뒤, 과산화 수소로 처리한 뒤, 24시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 24시간 뒤, 각각의 농도로 처리된 웰의 상층액을 수집하여 원심분리기를 이용하여 400g, 3분간 침전시키고, 세포는 차가운 PBS로 세척한 뒤, Tper 용해 버퍼(Thermo, USA) 100㎕를 첨가하여 30분간 용해시켰다. 용해물들은 원심분리기를 이용하여, 10000g, 4℃로 15분간 원심분리시켰으며, 원심분리 후 상층액은 실험을 위한 샘플로서 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질은 BCA 정량분석 키트(Thermo, USA)를 이용하여 정량분석하였으며, 8.5% - 12%의 SDS 겔로 용출한 후 PVDF 막에 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하기 위해, ECL(enhanced chmilumenescence)로 형광 발색시켜 확인하는데, 먼저 5% 무지방분유로 막을 1시간 동안 반응시키며, 일차항체인 PARP, 카스파제-3, 포스포-p38, 포스포-JNK, β-액틴으로 밤새 4℃에서 표지 시켰으며, TTBS로 3회 세척한 다음 이차항체인 HRP(horseradish peroxidase)-접합된 항-래빗 그리고 항-마우스 항체를 상온에서 1시간 동안 표지 시켰다. 표지 후 10분간 TTBS를 이용하여 5회 세척하였고, 세척된 막은 ECL를 이용하여, x-ray 필름을 이용하여 발색시켰으며, 농도는 정량분석법에 따라 정량분석프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석하였다.
실험결과는 도 8과 같다.
PARP 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 PARP의 발현은 38% 이하의 발현을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5 및 1㎍/㎖의 용량에서 각각 70%, 92% 및 99% 이상의 PARP 발현을 나타냈다.
카스파제-3 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 카스파제-3의 발현은 40% 이하의 발현을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5 및 1㎍/㎖의 용량에서 각각 24%, 51% 및 127% 이상의 카스파제-3 발현을 나타냈다.
포스포-p38 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 포스포-p38의 발현은 133% 이상의 발현을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각의 0.1, 0.5 및 1㎍/㎖의 용량에서 각각 157%, 133% 및 53% 이하의 포스포-p38 발현을 나타냈다.
포스포-JNK 단백질 발현에서 정상대조군은 100% 이상의 발현을 보여줬으며, 과산화수소 처리에 의한 포스포-JNK의 발현은 173% 이상의 발현을 나타냈으며, 설퍼레틴 각각 0.1, 0.5 및 1㎍/㎖의 용량에서 각각 261%, 204% 및 120% 이하의 포스포-JNK 발현을 나타냈다.
실시예 11. 통계처리
모든 실험 결과는 ANOVA(one way analysis of variance)를 이용하여 통계처리하였고, 유의성이 검증될 경우 뉴만 쿨스 검증(Newman-Keuls test)을 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

Claims (7)

  1. 설퍼레틴(Sulfuretin) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경계 질환은 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 스트레스, 산화적 증상, 노화, 뇌졸중, 우울증 또는 불안증인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 설퍼레틴 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 신경계 질환의 개선용 기능성 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 식품 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 신경계 질환이 발병한 또는 발병 가능성 있는 환자에게 투여하여 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신경계 질환은 치매, 알츠하이머, 파킨슨 병, 스트레스, 산화적 증상, 노화, 뇌졸중, 우울증 또는 불안증인 방법.
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