WO2011117552A1 - Utilisation d'un produit de fermentation fongique comme complement alimentaire - Google Patents

Utilisation d'un produit de fermentation fongique comme complement alimentaire Download PDF

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WO2011117552A1
WO2011117552A1 PCT/FR2011/050642 FR2011050642W WO2011117552A1 WO 2011117552 A1 WO2011117552 A1 WO 2011117552A1 FR 2011050642 W FR2011050642 W FR 2011050642W WO 2011117552 A1 WO2011117552 A1 WO 2011117552A1
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monascus
substrate
fermentation
cereals
ruminants
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PCT/FR2011/050642
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Diego P. Morgavi
Hamid Boudra
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Institut National De La Recherche Agronomique - Inra
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    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/22—Methane [CH4], e.g. from rice paddies

Definitions

  • the invention relates to the field of food supplements for livestock, in particular for ruminants.
  • the invention relates more specifically to the field of food supplements intended to reduce the production of methane by ruminants.
  • methane (CH 4 ) and carbon dioxide (C0 2 ) by the animals results from the digestion of the food that these animals ingest.
  • the production of methane and carbon dioxide by animals is the result of anaerobic degradation, by microorganisms present in the digestive tract, of plant biomass that has been ingested. Ruminants, especially cattle, sheep and goats, as well as buffaloes, deer and camels, excrete much larger quantities of these gases than monogastric animals.
  • Ruminants especially cattle, sheep and goats, as well as buffaloes, deer and camels, excrete much larger quantities of these gases than monogastric animals.
  • a dairy cow produces on average about 90 kg of methane per year, whereas a pig produces only about 1 kg per year.
  • the methane produced is released into the atmosphere mainly by the oral route (95% of methane produced) during regular belching and by the lungs after passage through the blood. A small part of the methane produced (5% of methane produced) is released by flatulence.
  • Methane released to the atmosphere by ruminants was considered to represent a loss of about 6 to 15 percent of the gross energy intake. Methane production by ruminants has also been found to contribute measurably to increasing the concentration of this gas in the atmosphere. It is recalled that methane is currently considered as one of the gases contributing to the generation of a greenhouse effect likely to cause global warming. From the point of view of the productivity of the farms as well as from the point of view of the ecology of the planet, it has therefore appeared advantageous to look for ways to reduce the production of methane by farmed ruminants.
  • HMG-CoA reductase inhibitors such as mevastatin and lovastatin
  • mevastatin and lovastatin have also been described to reduce the production of methane in the rumen.
  • US Pat. No. 5,985,907 shows the inhibitory effect of mevastatin on the growth of methanogenic archaea.
  • Miller et al. show the inhibitory effect of lovastatin on the growth of methanogenic bacteria (Miller et al., 2001, J. Dairy Sci., Vol 84: 1445-1448).
  • Feed supplements for animals prepared from microbial cultures have also been described.
  • the application US20030194394 describes the preparation of food supplements for animals from microbial cultures comprising cholesterol-lowering compounds. Administration of these dietary supplements to livestock would allow the production of meat and other food products with reduced cholesterol content.
  • Application US20030194394 describes, inter alia, the use of cultures of Monascus purpureus and Monascus ruber obtained from (i) a substrate consisting of glucose, agar and potato or (ii) a substrate consisting of of glucose, peptone and agar in the preparation of a cholesterol-lowering food supplement. US20030194394 does not address the problem of decreasing methane production by animals.
  • the present invention relates to the use of a product resulting from the fermentation of a substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus for the manufacture of a food supplement composition intended to reduce the production of methane in animals. ruminants.
  • the fungal microorganism belonging to the genus belongs to the genus
  • Monascus is a fungal microorganism belonging to the species Monascus ruber.
  • the invention also relates to a method for reducing methane production in ruminants, characterized in that said ruminants are provided with an appropriate amount of a food supplement composition as defined above.
  • Figure 1 illustrates a curve of in vivo methane production by sheep that received a feed comprising a food supplement of the invention for two weeks. The results are expressed as an average of the values obtained for a batch of six sheep.
  • Ordinate In vivo methane production, expressed in liters per day and per animal. On the abscissa: the time, expressed in days. A: period preceding the supply of food including the dietary supplement; B: period during which the food supplement is provided; C: period following the supply of the food supplement.
  • the vertical bars represent the standard deviation values.
  • a product of the fermentation of a substrate by a microorganism of the genus Monascus is capable, when added as a supplement to the feed ration of an animal, ruminant, to cause a substantial reduction in the production of methane by this animal, in particular by this ruminant.
  • a product of the fermentation of an organic substrate by a microorganism of the genus Monascus when it is administered to an animal, in particular to a ruminant, as a supplement to its feed ration usually reduces the production of methane by this animal, without affecting the ability of this animal to normally metabolize the food it ingests.
  • the present invention relates to the use of a product resulting from the fermentation of a substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus for the manufacture of a food supplement composition intended to reduce the production of methane in animals. ruminants and other herbivores with pre-gastric fermentation, p. ex. the camelidae.
  • the present invention relates to the use of a product resulting from the fermentation of a substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus, in a food supplement or as a food supplement, for reduce methane production in ruminants.
  • “Ruminants” include: Addax, Alcelaphus, Alcelaphus buselaphus, Alcelaphus caama, Antilocapra americana, Antelope, Heck's aurochs, Muskox, Goat, Ibex, Capra, Capra aegagrus, Capra caucasica, Capra cylindricornis, Capra nubiana, Capra sibirica, Capra Walie, Cervoidea, Goat, Peacock goat, Appenzell goat, Toggenburg goat, Valais black-necked goat, Dwarf dagger, Red dagger, Grant's gazelle, Thomson's gazelle, Waller's gazelle, Wildebeest, Black hippotragus, Hippotragus, Hippotragus equinus, Hippotragus leucophaeus, Markhor, Gray Dwarf Mazame, Bighorn Sheep, Canadian Bighorn Sheep, Dali Sheep, Mediterranean Sheep, Sheep, Okapi, Scimitar
  • Preferred cattle include calves, beef cattle, beef cows and dairy cows.
  • Preferred sheep include sheep and sheep for slaughter as well as sheep raised for their milk.
  • Preferred goats include goats and goats as well as goats raised for their milk.
  • the fungal microorganism of the genus Monascus is selected from the species Monascus albidulus, Monascus argentinensis, Monascus aurantiacus, Monascus barkeri, Monascus bisporus, Monascus eremophilus, Monascus floridanus, Monascus fuliginosus, Monascus fumeus, Monascus kaoliang, Monascus lunisporas, Monascus mucoroides, Monascus olei, Monascus pallens, Monascus paxii, Monascus pilosus, Monascus pubigerus, Monascus purpureus, Monascus ruber, Monascus rubropunctatus, Monascus rutilus, Monascus sanguineus, Monascus serorubescens and
  • Monascus belonging to the species Monascus ruber is used.
  • a strain of Monascus selected from the group consisting of AHU strains WDCM635 (AHU Culture Collection, graduate School of Agriculture, Hokkaido University), CCFC WDCM150 (Canadian Collection of Fungal Cultures, Agriculture and Agri-Food) is preferably used.
  • DSMZ WDCM274 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ
  • IAM WDCM190 IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo
  • JCM WDCM567 Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center
  • MAFF WDCM637 MAFF Genebank Project, Ministry of Agriculture, National Forestry and Fisheries, National Institute of Agrobiological Sciences (NIAS)
  • UBCH WDCM1 Universality of Alberta Microfungus Collection and Herbarium, University of Alberta
  • ATCC WDCM1 American Type Culture Collection
  • CECT WDCM412 Espanola Coleccion de Cultivos Tipo, University of Valencia
  • DUM WDCM40 Delhi University Mycological Herbarium) Department of Botany, University of Delhi
  • IFO WDCM191 Institutee for Fermentation, Osaka
  • KCTC WDCM597 KCTC Korean Collection
  • Monascus selected from the species Monascus ruber and Monascus purpureus are used, as described in particular in the examples.
  • Monascus ruber strain referenced DSM 62748 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany).
  • a substrate comprising mainly, essentially or even exclusively, organic substances is used.
  • the product resulting from the fermentation of a substrate by Monascus can be obtained by culturing Monascus in a liquid nutrient medium, for example by submerged culture techniques in a liquid medium well known to those skilled in the art.
  • the product resulting from the fermentation of a substrate by Monascus can be obtained by culturing Monascus in a solid nutrient medium, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the product resulting from the fermentation of a substrate by Monascus can be obtained by culturing Monascus in a solid / liquid system, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • Monascus is obtained by growing Monascus on previously steamed rice, bread, bran, cereals or cereal-based substances, including cereal-based foods.
  • said substrate may consist of any type of nutrient medium suitable for the cultivation of fungal microorganisms, which are well known to the human being. job.
  • the product resulting from the fermentation of an organic substrate by Monascus is obtained by culturing Monascus in a nutrient medium containing maltitol, as described in French patent application No. FR 2,505,856.
  • the culture of Monascus in a nutrient medium containing maltitol can be carried out (i) in submerged culture in liquid medium or (ii) in culture in solid medium.
  • the product resulting from the fermentation of an organic substrate by Monascus is obtained by culturing Monascus on cellulose, including cellulose of bacterial origin, as described, for example, by Sheu et al. (2000, Journal of Food Science, Vol 65 (2): 342-345).
  • the product resulting from the fermentation of an organic substrate by Monascus can be obtained according to any of the Monascus culture methods described in Yuan-Kun et al. (1995, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 79 (5): 516-518), Pastrana et al. (1996, Acta Biotechnologica, Vol.16 (4): 315-319), Ahn et al. (2008, Biotechnology Progress, Vol 22 (1): 338-340) or Zhou et al. (2009, Vol 228 (6): 895-901).
  • a suitable substrate for the preparation of the fermentation product derived from Monascus can be obtained from cereals, in particular cereals belonging to the genus Triticum and genus Oriza. Substrates prepared from these plant sources provide both compounds required for Monascus culture and those required for Monascus production of metabolites that limit methane production by methanogenic ruminal fluid bacteria.
  • the product resulting from the fermentation is obtained by culturing Monascus on a solid substrate prepared from one or more products selected from the group consisting of cereals belonging to the genus Triticum, cereals belonging to the genus Oriza, and products derived from said cereals.
  • Triticum secale Cereals belonging to the genus Triticum include, but are not limited to, durum wheat (Triticum turgidum), wheat (Triticum estrumum), spelled or engrain (Triticum monococcum), spelled (Triticum spelta) and triticale ( Triticum secale).
  • Cereals belonging to the genus Oriza include the different species of rice.
  • the seeds and grains may be whole seeds, that is to say unshelled, or seeds whose bran and possibly the seed have been removed.
  • Cereal seeds used for the preparation of the fermentation substrate may come from a single plant species or be a mixture of seeds from several plant species.
  • the preparation of the fermentation substrate generally comprises a step of sterilizing grains and grains of cereals. This sterilization step eliminates microbial species present on cereals that could hinder the development of Monascus.
  • the fermentation substrate is a solid, sterilized substrate prepared from cereal seeds.
  • the preparation of the fermentation substrate may comprise several steps preferably taking place before the possible sterilization step.
  • cereal seeds can be crushed or crushed summarily, macerated in a suitable liquid such as water and / or precooked. These possible steps are intended to make the nutrient reserves of seeds accessible and in a form suitable for fermentation by Monascus.
  • the process for preparing the fermentation substrate depends on the cereal seeds used. For example, if the substrate is prepared from whole seeds such as whole wheat, it is preferable to crush the seeds in a summary way. By his general knowledge, the skilled person is able to determine the suitable processes for the preparation of the fermentation substrate.
  • the process for preparing the fermentation substrate from cereals generally comprises a maceration step in a suitable liquid, preferably water for several hours before the sterilization step.
  • This maceration step makes it possible to adjust the solids content to approximately 50% to 60% by weight of the total weight of the substrate.
  • the Applicant has shown that the addition of cereal bran such as wheat bran to the fermentation substrate can promote the growth of Monascus.
  • the product resulting from the fermentation of a substrate by Monascus is obtained by culturing Monascus on a substrate prepared from cereal seeds and bran, preferably wheat bran.
  • the wheat bran can be added to the substrate before or after the sterilization step, and even simultaneously with the inoculation of the substrate by Monascus.
  • the fermentation substrate is prepared from cereal seeds, optionally supplemented with bran, in the absence of any additional nutrient compound.
  • a solid fermentation substrate for the preparation of the food supplement according to the invention does not include nutritive compounds extrinsic to cereal seeds and bran.
  • nutritive compounds compounds known to constitute sources of carbon or nitrogen and generally used for the cultivation of yeasts and molds.
  • nutrient compounds are sugars such as sucrose, glucose, maltose, maltitol, sorbitol and mannitol and nitrogenous organic molecules such as amino acids, peptides and peptones.
  • the fermentation substrate consists of a solid substrate obtained by crushing, macerating and then sterilizing cereal grains belonging to the genus Triticum.
  • the fermentation product of Monascus can be incorporated in various forms into the dietary supplement intended to reduce the production of methane in ruminants.
  • the product of the Monascus culture on a substrate is used as such as a dietary supplement composition for reducing methane production in ruminants.
  • the Monascus culture product on a substrate is used as such, in combination with one or more other food-acceptable compounds, as a component included in a dietary supplement composition or a food ration. intended to reduce methane production in ruminants.
  • the product of the Monascus culture on an organic substrate undergoes one or more extraction or refining steps, and the extracted or refined product is used alone or in combination with one or more other compounds.
  • the product of the Monascus culture on an organic substrate is subjected to one or more extraction steps by solvents, preferably organic solvents, and then the extract is dried to provide a composition.
  • solvents preferably organic solvents
  • dry extract which is usable as such as a food supplement, or said extract composition is combined with one or more food-acceptable compounds to obtain said food supplement.
  • the product of the Monascus culture on an organic substrate is subjected to one or more extraction steps with ethanol, and the ethanolic extract is dried to provide a dry extract composition.
  • a dry extract composition which is usable as such as a dietary supplement, or said dry ethanolic extract is combined with one or more food-acceptable compounds to obtain said dietary supplement.
  • the above use is characterized in that the product resulting from the fermentation of an organic substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus consists of an extract of a product of fermentation of Monascus by one or more organic solvents.
  • said extract consists of an ethanolic extract.
  • An ethanolic extract can be obtained from the organic substrate fermented by a Monascus according to ethanolic extraction techniques well known to those skilled in the art. For example, it is possible to use an ethanol solution having from 50% to 100% by weight of ethanol, relative to the total weight of the extraction solution.
  • an extraction solution having at less 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67 % 68% 69% 70% 71% 72% 73% 74% 75% 76% 77% 78% 79% 80% 81% 82% 83% 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% by weight of ethanol, relative to the total weight of the extraction solution.
  • a suitable volume of ethanolic extraction solution is added to the product fermented by Monascus and the solid / liquid mixture is homogenized, for example by a step of exposure to a source of ultrasound of appropriate power for a duration of from 15 minutes to 2 hours, preferably for a period of two hours.
  • the extraction liquid is separated from the solid particles, for example by centrifugation, and the extraction liquid is stored.
  • the ethanolic extraction can be repeated on the solid material resulting from this separation.
  • the liquid extraction fractions are combined, and preferably filtered in order to remove the particles. solids that are still in suspension.
  • the ethanolic extracts are then stored, for example at 4 ⁇ C protected from light, or the ethanol is evaporated, for example using a Rotavapor device type.
  • the liquid ethanolic extract is lyophilized.
  • Monascus species are of great safety for humans and animals. Fungi of the genus Monascus have been used in China for two thousand years in human food and human medicine.
  • Monascus species are referred to as "QPS” (ie “Qualified Presumption of Safety") by the European Food Safety Authority (EFSA).
  • EFSA European Food Safety Authority
  • GRAS that is, “Generally Recognized as Safe” by the US Food and Drug Administration
  • FDA US Food and Drug Administration
  • a dietary supplement according to the invention makes it possible to reduce the production of methane in animals, including ruminants, and at the same time increase the ruminal fermentation of the food supplied to these animals.
  • a food supplement composition used according to the invention the product resulting from the fermentation of an organic substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus, for example a dry ethanolic extract, is present in a proportion of 0, 1% to 100% by weight, based on the dry weight of said composition.
  • a dietary supplement composition used according to the invention comprises from 0% to 99.9% by weight of one or more food-acceptable compounds, based on the dry weight of said composition.
  • Food-acceptable compound means any type of compound that is permitted by the administrative regulations relating to animal feed, in particular feed intended for farmed ruminants, including cattle, sheep and goats.
  • Food-acceptable compounds include food preservatives, food colorants, sweetening agents, taste, pH-regulating agents including acidifying agents, antioxidants, texture agents.
  • Food-acceptable compounds include compounds that can be metabolized by the body, including vitamins or vitamin precursor compounds, hydrocarbon compounds such as sugars, lipids, and mineral salts.
  • Food-acceptable compounds also include compounds that are not metabolized by the body, such as fillers, e.g., natural or synthetic edible polymers, including xanthan gum, seaweed extracts.
  • fillers e.g., natural or synthetic edible polymers, including xanthan gum, seaweed extracts.
  • Food-acceptable compounds include food additives as defined by (i) European Union Directive 89/107 / EEC of 18 September 1989 laying down categories in its Annex and (ii) Directive 95/2 / EC on food additives other than colors and sweeteners.
  • the different categories of food additives include the following categories: Acidifier, Firming agent, Coating agent, Bulking agent, Flour treatment agent, Modified starch, Foaming agent, Anti-caking agent, Anti-foaming agent, Antioxygen, Colorant, Preservative, Acidity Corrector, Sweetener, Emulsifier, Enzyme, Thickener, Flavor Enhancer, Gelling Agent, Humectant, Baking Powder (or Yeasting Agent), Melt Salt, Sequestering Agent, Stabilizer, Support.
  • the present invention also relates to a method for reducing methane production in ruminants, characterized in that said ruminants are provided with an appropriate amount of a food supplement composition as defined above.
  • the present invention also relates to a dietary supplement composition for reducing methane production in ruminants, comprising a product derived from the fermentation of a substrate by at least one fungal microorganism belonging to the genus Monascus.
  • the above dietary supplement composition is provided to the ruminant in the form of successive and time-based catches, for example in daily, bi-weekly, weekly or bi-monthly rhythms.
  • ruminants are provided with the appropriate amount of dietary supplement composition above in a daily dose.
  • the dietary supplement composition is provided separately from their main diet.
  • the dietary supplement composition of the invention may be be provided (i) in a mixture with the said foods, or (ii) in a form separate from those foods.
  • the daily quantity provided to ruminants is from about 1 to 100 grams of dietary supplement composition, per kilogram of food consumed (or donated) by the animal.
  • a daily amount of at least 1 gram of said food supplement composition includes an amount of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, or 20 grams of said dietary supplement composition.
  • a quantity of not more than 100 grams of said dietary supplement composition includes not more than 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86 , 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 , 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 grams of said dietary supplement composition.
  • unbeatable rice eg unbeatable rice marketed under the trademarks or Uncle Ben's® Lustucru®
  • unbeatable rice eg unbeatable rice marketed under the trademarks or Uncle Ben's® Lustucru®
  • the excess Water is removed, for example by passing the solid / liquid macerated composition through a sieve of appropriate mesh size.
  • the macerated rice is sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes. After cooling to room temperature (20 ° C to 25 ° C), the macerated and sterilized rice is inoculated with a piece of agar from a culture of Monascus ruber and the whole is homogenized in order to distribute the spores well. Monascus ruber throughout the mass of macerated and sterilized rice.
  • the mixture of rice and Monascus ruber riz is then incubated under aerobic conditions at the temperature of 30 ° C and in the dark for a period of 2 to 3 weeks.
  • the mixture during aerobic fermentation in vitro is shaken daily during the first 3 days of incubation.
  • the mixture obtained at the end of the period of two to three weeks of aerobic fermentation can be used as such as a dietary supplement, or be dried prior to its use.
  • Example 2 In vitro effects of a dietary supplement composition on the production of metabolites by archaea methanoqenes.
  • the final concentration of monacolin K in the fermentation tubes is 20 ⁇ g I ml
  • the tubes are then added with 100 ⁇ l of the various treatments (see Table 1 above), and the tubes were again incubated at 39 ° C. with shaking for an additional period of 48 hours. This procedure was repeated a second time.
  • a food composition according to the invention is prepared from a fermentation product of Monascus wheat crushed, sieved and sterilized at 120 ° C for 30 min according to a protocol similar to that of Example 1.
  • the sterilization step eliminates microbial strains initially present in the substrate that could hinder the development of Monascus.
  • the sterilized wheat is inoculated with bran previously fermented (30 ° C for 4 days) with the same Monascus species.
  • the whole is homogenized in order to distribute Monascus spores evenly throughout the sterilized wheat mass.
  • the resulting mixture is then incubated under partial anaerobic conditions at 30 ° C and in the dark for 2 to 3 weeks.
  • the fermentation medium is shaken daily during the first 3 days of incubation.
  • the mixture obtained at the end of the period of two to three weeks of fermentation can be used as such as a dietary supplement, or be dried prior to its use.
  • Example 4 In Vivo Effects of a Food Supplement Composition on the Production of Metabolites by Ruminants
  • Methane production was measured daily before and during treatment, but also 2 weeks after treatment.
  • concentration of volatile fatty acids in the ruminal content was also analyzed by gas chromatography.
  • the monitoring of methanogenic archaea and total bacteria was measured by quantitative PCR methods.
  • the protozoa were debrided by microscopy.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Utilisation d'un produit de fermentation fongique comme complément alimentaire
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte au domaine des compléments alimentaires pour le bétail, en particulier pour les ruminants. L'invention se rapporte plus spécifiquement au domaine des compléments alimentaires destinés à réduire la production de méthane par les ruminants.
ART ANTERIEUR
La production de méthane (CH4) et de dioxyde de carbone (C02) par les animaux résulte de la digestion des aliments que ces animaux ingèrent. La production de méthane et de dioxyde de carbone par les animaux est le résultat de la dégradation anaérobie, par les microorganismes présents dans le tube digestif, de la biomasse végétale qui a été ingérée. Les ruminants, en particulier les bovins, les ovins et les caprins et aussi les buffles, les cerfs et les chameaux, excrètent des quantités beaucoup plus grandes de ces gaz que les animaux monogastriques. A titre illustratif, il est estimé qu'une vache laitière produit en moyenne environ 90 kg de méthane par an, alors qu'un porc n'en produit qu'environ 1 kg par an. Chez les ruminants, le méthane produit est rejeté dans l'atmosphère essentiellement par la voie orale (95% du méthane produit) au cours d'éructations régulières et par les poumons après passage dans le sang. Une petite partie du méthane produit (5% du méthane produit) est rejetée par les flatulences.
Il a été considéré que le méthane qui est libéré dans l'atmosphère par les ruminants représente une perte d'environ 6 à 15 pour cents de l'énergie brute ingérée. Il a aussi été considéré que la production de méthane par les ruminants contribue de manière mesurable à accroître la concentration de ce gaz dans l'atmosphère. On rappelle que le méthane est actuellement considéré comme l'un des gaz contribuant à la génération d'un effet de serre susceptible de provoquer un réchauffement de la planète Terre. Du point de vue de la productivité des élevages aussi bien que du point de vue de l'écologie de la planète, il est donc apparu comme avantageux de rechercher des moyens de réduire la production de méthane par les ruminants d'élevage.
Certaines études avaient montré que l'augmentation du niveau de prise alimentaire et de la quantité d'aliments concentrés (p.ex. concentrés énergétiques) ajoutés à la ration alimentaire des ruminants avait pour effet de réduire la proportion d'énergie perdue sous forme de méthane. Toutefois, l'augmentation de la quantité d'aliments consommés entraîne nécessairement une élévation de l'émission totale de méthane par les animaux.
On a montré dans l'état de la technique que l'ajout aux aliments de certains antibiotiques ionophores, comme la monensine, provoquait une inhibition significative de la production de méthane dans le rumen (Sauer et al., 1998, J. Anim. Sci., Vol. 76 : 906-914). Toutefois, les micro-organismes méthanogènes ne sont pas directement affectés et il s'est avéré que la communauté microbienne présente dans le rumen était capable de développer une résistance aux antibiotiques ionophores, ce qui conduit, avec le temps, à une absence d'activité de ces antibiotiques sur la production de méthane par les ruminants ainsi traités (Rumpler et al., 1986, J. Anim. Sci., Vol. 62 : 1737-1741 ).
On a décrit également l'utilisation de composés de type anthraquinone afin d'inhiber la production de méthane, d'accroître la production d'acides gras volatils et d'augmenter l'efficacité d'utilisation des aliments (voir brevet n ° US 5,648,258).
On a aussi proposé d'utiliser des composés ionophores en combinaison avec des composés de quinones polycycliques (voir brevet n ° US 6,743,440).
On a aussi décrit l'utilisation de composés phthalides qui induisent un accroissement de la production de propionate et inhibent la production de méthane dans le rumen (voir brevet n ° US 4,333,923). On a aussi décrit l'utilisation de dérivés hétérocycliques du trichlorométhyle afin de réduire la production de méthane durant le métabolisme du rumen et accroître la production de propionate aux dépends de l'acétate, et ainsi améliorer la vitesse de croissance de l'animal (voir brevet n ° US 4,268,510).
On a aussi décrit l'utilisation d'inhibiteurs de la HMG-CoA réductase, telles que la mévastatine et la lovastatine, pour réduire la production de méthane dans le rumen. Ainsi, le brevet US 5,985,907 montre l'effet inhibiteur de la mévastatine sur la croissance des archaea méthanogènes. Egalement, les travaux de Miller et al. montrent l'effet inhibiteur de la lovastatine sur la croissance des bactéries méthanogènes (Miller et al., 2001 , J . Dairy Sci., Vol. 84 : 1445-1448). Ces auteurs estiment que ces inhibiteurs de la HMG-CoA réductase sont potentiellement utilisables comme additifs alimentaires pour accroître la productivité des animaux et pour réduire la production de méthane dans d'autres écosystèmes méthanogènes.
On a aussi proposé l'utilisation d'une bactériocine résistante aux protéases, qui a été isolée à partir de bactéries acido-lactiques (voir demande de brevet européen n ° EP 1 673 983).
On a également décrit l'utilisation d'acides organiques encapsulés, en particulier l'acide fumarique, afin de réduire la production de méthane chez les ruminants (voir demande PCT n ° WO 2006/040537).
On a aussi montré l'effet de l'ajout de matières grasses à la ration alimentaire des ruminants, qui provoque une réduction de la production de méthane. On a notamment montré que les acides gras alimentaires empêchent l'attachement des bactéries cellulolytiques, y compris les archaea méthanogènes, sur les particules d'aliment. Selon certaines études, les acides gras polyinsaturés pourraient également exercer un effet toxique directement sur les populations bactériennes et des archaea. Cette inhibition des populations bactériennes sont accompagnées d'un accroissement du pourcentage d'acide propionique dans le contenu du rumen et d'une réduction des émissions de méthane (Bauchart, 1981 , Bull. Tech. CRZV Theix, INRA, Vol. 46 : 45-55).
On a aussi exploré la possibilité de réaliser des prétraitements chimiques ou biologiques des aliments pour réduire la production de méthane lors de leur digestion par les ruminants. On a par exemple testé l'utilisation d'analogues halogénés du méthane pour le prétraitement chimique des aliments. On a aussi testé, comme prétraitement biologique des aliments, l'implantation de bactéries capables de réaliser l'acétogénèse réductrice aux dépens de la méthanogénèse. Toutefois, ces méthodes de prétraitement par implantation de bactéries engendrent des effets secondaires indésirables, tels qu'une réduction de la dégradation des fibres végétales, un risque d'adaptation des micro-organismes exogènes implantés, et la possibilité d'accumulation de résidus indésirables dans la viande, dans le lait ou dans l'environnement (Demeyer et al., 2000, Ann. Zootech., Vol. 41 : 37-38).
Il a été également décrit des compléments alimentaires destinés aux animaux et préparés à partir de cultures microbiennes.
La demande US20030194394 décrit la préparation de compléments alimentaires destinés aux animaux à partir de cultures microbiennes comprenant des composés hypocholestérolémiants. L'administration de ces compléments alimentaires au bétail permettrait la production de viandes et autres produits alimentaires présentant une teneur réduite en cholestérol. La demande US20030194394 décrit, entre autres, l'utilisation de cultures de Monascus purpureus et Monascus ruber obtenues à partir (i) d'un substrat constitué de glucose, d'agar et de pomme de terre ou (ii) d'un substrat constitué de glucose, de peptone et d'agar dans la préparation d'un complément alimentaire hypocholestérolémiant. La demande US20030194394 ne traite pas du problème relatif à la diminution de la production de méthane par les animaux.
La description qui précède illustre que des solutions très variées au problème de réduction de la production de méthane par les ruminants sont proposées dans l'état de la technique.
Toutefois, il existe toujours un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux moyens destinés à réduire la production de méthane par les ruminants. RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.
Dans certains modes de réalisation, le micro-organisme fongique appartenant au genre
Monascus est un micro-organisme fongique appartenant à l'espèce Monascus ruber.
L'invention est également relative à un procédé pour réduire la production de méthane chez les ruminants, caractérisé en ce que l'on fournit auxdits ruminants une quantité appropriée d'une composition de complément alimentaire telle que définie ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre une courbe de la production de méthane in vivo par des moutons qui ont reçu une alimentation comprenant un complément alimentaire de l'invention pendant deux semaines. Les résultats sont exprimés en moyenne des valeurs obtenue pour un lot de six moutons. En ordonnées : production de méthane in vivo, exprimée en litres par jour et par animal. En abscisses : le temps, exprimé en jours. A : période précédant la fourniture de l'alimentation comprenant le complément alimentaire ; B : période pendant laquelle on fournit le complément alimentaire ; C : période suivant la fourniture du complément alimentaire. Les barres verticales représentent les valeurs d'écart-types.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'un produit de la fermentation d'un substrat par un micro-organisme du genre Monascus est capable, lorsqu'il est ajouté comme complément à la ration alimentaire d'un animal, en particulier d'un ruminant, de provoquer une réduction substantielle de la production de méthane par cet animal, en particulier par ce ruminant.
De manière tout aussi surprenante, on a montré selon l'invention qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus n'induit pas de changement significatif dans la production d'acétate, de propionate ni de butyrate par ledit animal, en particulier par ledit ruminant. On a aussi montré qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus n'induit pas de changement significatif dans la production d'acides gras volatils (AGVs).
Ainsi, le demandeur a montré qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus, lorsqu'il est administré à un animal, en particulier à un ruminant, en tant que supplément à sa ration alimentaire habituelle, permet de réduire la production de méthane par cet animal, sans affecter la capacité de cet animal à métaboliser normalement les aliments qu'il ingère.
La présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants et autres herbivores avec une fermentation pré-gastrique, p. ex. les camelidae.
En d'autres termes, la présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus, dans un complément alimentaire ou en tant que complément alimentaire, pour réduire la production de méthane chez les ruminants.
Les « ruminants » englobent: Addax, Alcelaphus, Alcelaphus buselaphus, Alcelaphus caama, Antilocapra americana, Antilope, Aurochs de Heck, Bœuf musqué, Bouc, Bouquetin, Capra, Capra aegagrus, Capra caucasica, Capra cylindricornis, Capra nubiana, Capra sibirica, Capra walie, Cervoidea, Chèvre, Chèvre Paon, Chèvre d'Appenzell, Chèvre du Toggenbourg, Chèvre à col noir du Valais, Daguet nain, Daguet rouge, Gazelle de Grant, Gazelle de Thomson, Gazelle de Waller, Gnou, Hippotrague noir, Hippotragus, Hippotragus equinus, Hippotragus leucophaeus, Markhor, Mazame nain gris Mouflon, Mouflon canadien, Mouflon de Dali, Mouflon méditerranéen, Mouton, Okapi, Oryx algazelle, Oryx d'Arabie, Oryx gazelle, Ovina, Ovis ammon, Ovis orientalis, Pecora, et Urial. Des ruminants préférés englobent les bovins, les ovins et les caprins.
Des bovins préférés englobent les veaux, les bœufs, les vaches de boucherie ainsi que les vaches laitières.
Des ovins préférés englobent les moutons et les brebis de boucherie ainsi que les brebis élevées pour leur lait.
Des caprins préférés englobent les boucs et les chèvres de boucherie ainsi que les chèvres élevées pour leur lait.
De manière générale, le micro-organisme fongique du genre Monascus est choisi parmi les espèces Monascus albidulus, Monascus argentinensis, Monascus aurantiacus, Monascus barkeri, Monascus bisporus, Monascus eremophilus, Monascus floridanus, Monascus fuliginosus, Monascus fumeus, Monascus kaoliang, Monascus lunisporas, Monascus mucoroides, Monascus olei, Monascus pallens, Monascus paxii, Monascus pilosus, Monascus pubigerus, Monascus purpureus, Monascus ruber, Monascus rubropunctatus, Monascus rutilus, Monascus sanguineus, Monascus serorubescens et Monascus vitreus.
De manière générale, le micro-organisme fongique du genre Monascus est choisi parmi les espèces Monascus bisporus, Monascus pilosus, Monascus ruber (=Monascus purpureus) (Samson, RA et al., Introduction to food and airborne fungi. 2004).
Dans certains modes de réalisation préférés, on utilise des Monascus appartenant à l'espèce Monascus ruber. Dans ces modes de réalisation, on utilise préférentiellement une souche de Monascus choisie dans le groupe constitué des souches AHU WDCM635 (AHU Culture Collection, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University), CCFC WDCM150 (Canadian Collection of Fungal Cultures, Agriculture and Agri-Food Canada), DSMZ WDCM274 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), IAM WDCM190 (IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo), JCM WDCM567 (Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center), MAFF WDCM637 (MAFF Genebank Project, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, National Institute of Agrobiological Sciences (NIAS)), UAMH WDCM73 (University of Alberta Microfungus Collection and Herbarium, University of Alberta), ATCC WDCM1 (American Type Culture Collection), CECT WDCM412 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia), DUM WDCM40 (Delhi University Mycological Herbarium, Department of Botany, University of Delhi), IFO WDCM191 (Institute for Fermentation, Osaka), KCTC WDCM597 (KCTC Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), MUCL WDCM308 (Mycotheque de l'Université catholique de Louvain, Laboratoire de Mycologie Systématique et Appliquée, Université catholique de Louvain), UPSC WDCM603 (Uppsala University Culture Collection of Fungi, Botanical Muséum University of Uppsala), CBS WDCM133 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Collection), CGMCC WDCM550 (China General Microbiological Culture Collectio Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences), FRR WDCM18 (Food Science Australia, Ryde, CSIRO, Food Science Australia), IMI WDCM214 (CABI Genetic Resource Collection, CABI Bioscience UK Centre (Egham)), KUFC WDCM677 (Kasetsart University Fungus Collection, Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kasetsart University), NCPF WDCM184 (National Collection of Pathogenic Fungi, PHLS Mycological Référence Laboratory, Central Pulbic Health Laboratories), URM WDCM604 (Universidade Fédéral de Pernambuco, Micoteca do Departmento de Micologia), CCF WDCM182 (Culture Collection of Fungi, Department of Botany, Faculty of Science, Charles University, Prague), DAR WDCM365 (Plant Pathology Herbarium, Orange Agricultural Institute), HUT WDCM195 (HUT Culture Collection, Department of Molecular Biotechnology, Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University), IOC WDCM720 (Colecao de Culturas de Fungos do Instituto Oswaldo Cruz, Fundacao Oswaldo Cruz), LCP WDCM659 (Fungal Strain Collection, Laboratory of Cryptogamy, Muséum National d'Histoire Naturelle), OUT WDCM748 (Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University), ou VTT WDCM139 (VTT Culture Collection, VTT Technical Research Centre of Finland).
Dans certains modes de réalisation préférés, on utilise des Monascus choisies parmi les espèces Monascus ruber et Monascus purpureus, comme décrit notamment dans les exemples. On peut par exemple utiliser la souche de Monascus ruber référencée DSM 62748 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Allemagne).
L'homme du métier connaît des méthodes variées d'obtention d'un produit de fermentation d'un micro-organisme fongique du genre Monascus. Notamment, de nombreuses méthodes de fermentation de substrats organiques, y compris des substrats organiques solides et des substrats liquides, par des Monascus sont décrites depuis longtemps, y compris des méthodes de fermentation de Monascus qui ont été utilisées pour la fabrication de composés d'intérêt, y compris des pigments produits par Monascus.
Préférentiellement, on utilise un substrat comprenant principalement, essentiellement ou même exclusivement, des substances organiques.
Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus en milieu nutritif liquide, par exemple selon les techniques de culture submergée en milieu liquide bien connues de l'homme du métier.
Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus en milieu nutritif solide, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus dans un système solide/liquide, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat par
Monascus est obtenu par culture de Monascus sur du riz préalablement cuit à la vapeur, sur du pain, sur du son, sur des céréales ou sur des substances à base de céréales, y compris des aliments à base de céréales.
Dans certains modes de réalisation, ledit substrat peut consister en tout type de milieu nutritif adapté pour la culture de micro-organismes fongiques, bien connus de l'homme du métier. Dans d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus est obtenu par culture de Monascus dans un milieu nutritif contenant du maltitol, comme décrit dans la demande de brevet français n ° FR 2 505 856. La culture de Monascus dans un milieu nutritif contenant du maltitol peut être réalisée (i) en culture submergée en milieu liquide ou (ii) en culture en milieu solide.
Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus est obtenu par culture de Monascus sur de la cellulose, y compris de la cellulose d'origine bactérienne, comme cela est décrit par exemple par Sheu et al. (2000, Journal of Food Science, Vol. 65(2) : 342-345).
Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus peut être obtenu selon l'une quelconque des méthodes de culture de Monascus décrites dans les publications de Yuan-Kun et al. (1995, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 79(5) : 516-518), Pastrana et al. (1996, Acta Biotechnologica, Vol. 16(4) : 315-319), Ahn et al. (2008, Biotechnology Progress, Vol. 22(1 ) : 338-340) ou encore Zhou et al. (2009, Vol. 228(6) : 895-901 ).
Comme indiqué ci-dessus, le Demandeur a montré qu'un substrat adapté à la préparation du produit de fermentation issu de Monascus peut être obtenu à partir de céréales, en particulier, de céréales appartenant au genre Triticum et au genre Oriza. Les substrats préparés à partir de ces sources végétales fournissent à la fois les composés nécessaires à la culture de Monascus et ceux nécessaires à la production par Monascus des métabolites permettant de limiter la production de méthane par les bactéries méthanogènes du liquide ruminai.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation est obtenu par culture de Monascus sur un substrat solide préparé à partir d'un ou plusieurs produits choisis parmi le groupe constitué par les céréales appartenant au genre Triticum, les céréales appartenant au genre Oriza, et les produits dérivés desdites céréales.
Les céréales appartenant au genre Triticum, comprennent sans y être limitées, le blé dur (Triticum turgidum), le froment ( Triticum œstivum), le petit-épeautre ou engrain ( Triticum monococcum), l'épeautre (Triticum spelta) et le triticale (Triticum secale).
Les céréales appartenant au genre Oriza comprennent les différentes espèces de riz.
Toute partie de la plante céréalière peut être utilisée. Néanmoins on utilise de préférence les grains et les graines de céréales. Les graines et les grains peuvent être des graines entières, c'est-à-dire non décortiquées, ou des graines dont le son et éventuellement le germe ont été retirés. Les graines de céréales utilisées pour la préparation du substrat de fermentation peuvent provenir d'une seule espèce végétale ou constituer un mélange de graines provenant de plusieurs espèces végétales.
La préparation du substrat de fermentation comprend généralement une étape de stérilisation des grains et graines de céréales. Cette étape de stérilisation permet d'éliminer les espèces microbiennes présentes sur les céréales qui pourraient entraver le développement de Monascus. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le substrat de fermentation est un substrat solide, stérilisé, préparé à partir de graines de céréales.
La préparation du substrat de fermentation peut comprendre plusieurs étapes se déroulant de préférence avant l'éventuelle étape de stérilisation.
Ainsi les graines de céréales peuvent être broyées ou concassées sommairement, macérées dans un liquide adapté tel que de l'eau et/ou précuites. Ces éventuelles étapes ont pour but de rendre les réserves nutritives des graines accessibles et sous une forme adaptée pour la fermentation par Monascus.
Le procédé de préparation du substrat de fermentation dépend des graines de céréales utilisées. A titre d'exemple, si le substrat est préparé à partir de graines entières telles que du blé complet, il est préférable de concasser de façon sommaire les graines. De par ses connaissances générales, l'homme du métier est capable de déterminer les procédés adaptés pour la préparation du substrat de fermentation.
Comme illustré dans les exemples de la présente description, le procédé de préparation du substrat de fermentation à partir de céréales comprend généralement une étape de macération dans un liquide adapté, de préférence de l'eau pendant plusieurs heures avant l'étape de stérilisation. Cette étape de macération permet d'ajuster la teneur en matière sèche à environ 50% à 60% en poids du poids total du substrat.
Le Demandeur a montré que l'ajout de son de céréales tel que le son de blé au substrat de fermentation peut favoriser la croissance de Monascus. Ainsi dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus est obtenu par culture de Monascus sur un substrat préparé à partir de graines de céréales et de son, de préférence, de son de blé.
Dans ce mode de réalisation, le son de blé peut être rajouté au substrat avant ou après l'étape de stérilisation, et même simultanément à l'inoculation du substrat par Monascus.
De manière générale, lors de la préparation du substrat de fermentation, il est possible d'ajouter aux graines de céréales des composés nutritifs connus pour favoriser le développement de Monascus. Néanmoins, le Demandeur a montré que cet ajout de composés nutritifs n'est pas une condition nécessaire au développement de Monascus ni à la production de métabolites de fermentation capables d'agir sur la production de méthane par les bactéries méthanogènes du liquide ruminai.
Ainsi dans certains modes de réalisation, le substrat de fermentation est préparé à partir de graines de céréales, éventuellement additionnées de son, en l'absence de tout composé nutritif supplémentaire.
En d'autres termes, un substrat solide de fermentation pour la préparation du complément alimentaire selon l'invention ne comprend pas de composés nutritifs extrinsèques aux graines de céréales et au son.
On entend par composés nutritifs des composés connus pour constituer des sources de carbone ou d'azote et utilisés généralement pour la culture des levures et des moisissures. On peut citer à titre d'exemples de composés nutritifs les sucres tels que le sucrose, le glucose, le maltose, le maltitol, le sorbitol et le mannitol et les molécules organiques azotées tels que les acides aminés, les peptides et les peptones.
Dans certains modes de réalisation, le substrat de fermentation consiste en un substrat solide obtenu par concassage, macération puis stérilisation de grains de céréales appartenant au genre Triticum.
Le produit de fermentation de Monascus peut être incorporé sous différentes formes dans le complément alimentaire destiné à réduire la production de méthane chez les ruminants.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat est utilisé tel quel comme composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.
Dans d'autres modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat est utilisé tel quel, en combinaison avec un ou plusieurs autres composés alimentairement acceptables, comme un constituant inclus dans une composition de complément alimentaire ou d'une ration alimentaire destiné(e) à réduire la production de méthane chez les ruminants.
Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique subit une ou plusieurs étapes d'extraction ou de raffinage, puis le produit extrait ou raffiné est utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres composés alimentairement acceptables, comme composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.
Ainsi dans certains modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique est soumis à une ou plusieurs étapes d'extraction par des solvants, de préférence par des solvants organiques, puis l'extrait est séché afin de fournir une composition d'extrait sec qui est utilisable telle quelle en tant que complément alimentaire, ou bien ladite composition d'extrait est combinée à un ou plusieurs composés alimentairement acceptables pour obtenir ledit complément alimentaire.
Dans des modes de réalisation préférés, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique est soumis à une ou plusieurs étapes d'extraction par de l'éthanol, puis l'extrait éthanolique est séché afin de fournir une composition d'extrait sec qui est utilisable telle quelle en tant que complément alimentaire, ou bien ledit extrait éthanolique sec est combiné à un ou plusieurs composés alimentairement acceptables pour obtenir ledit complément alimentaire.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus consiste en un extrait d'un produit de fermentation de Monascus par un ou plusieurs solvants organiques.
Dans certains modes de réalisation, ledit extrait consiste en un extrait éthanolique. Un extrait éthanolique peut être obtenu à partir du substrat organique fermenté par un Monascus selon des techniques d'extraction éthanolique bien connues de l'homme du métier. On peut par exemple utiliser une solution d'éthanol ayant de 50% à 100% en poids d'éthanol, par rapport au poids total de la solution d'extraction. Ainsi, on peut utiliser une solution d'extraction ayant au moins 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% en poids d'éthanol, par rapport au poids total de la solution d'extraction.
Dans la pratique, un volume approprié de solution éthanolique d'extraction est ajouté au produit fermenté par Monascus et on homogénéise le mélange solide/liquide, par exemple par une étape d'exposition à une source d'ultrasons de puissance appropriée pendant une durée allant de 15 minutes à 2 heures, de préférence pendant une durée de deux heures. Puis, on sépare le liquide d'extraction des particules solides, par exemple par centrifugation, et on conserve le liquide d'extraction. On peut répéter l'extraction éthanolique sur le matériau solide issu de cette séparation. Ainsi, on réalise par exemple de 1 à 5 étape d'extraction éthanolique telle décrite ci-dessus, de préférence deux étapes d'extraction éthanolique, puis les fractions liquides d'extraction sont réunies, et de préférence filtrées afin d'éliminer les particules solides qui sont encore en suspension. Les extraits éthanoliques sont ensuite conservés, par exemple à 4<C à l'abri de la lumière, ou bien l'éthanol est évaporé, par exemple à l'aide d'un dispositif de type Rotavapor®. Dans d'autres modes de réalisation, l'extrait éthanolique liquide est lyophilisé.
A titre illustratif, pour l'extraction éthanolique de riz fermenté par Monascus, 20 g de riz fermenté sont additionnés de 50 ml d'éthanol à 75% (v/v) fraîchement préparé. Après dilacération de la culture, l'extraction est réalisée aux ultrasons pendant 60 min. L'extraction est répétée une deuxième fois. Les 2 extraits sont ensuite filtrés et conservés à +4 <C à l'abri de la lumière en attente de son analyse.
De manière surprenante, on a montré dans les exemples qu'un produit de fermentation in vitro d'un substrat organique par au moins une souche de Monascus permettait de réduire significativement la production de méthane, par exemple de plus de 90 pour cents, alors que, dans les mêmes conditions, la monacoline K, qui a été décrite dans l'état de la technique comme inhibiteur de la production de méthane, n'induisait aucun effet de réduction de la production de méthane. Il en résulte que, dans un complément alimentaire utilisé selon l'invention, les effets du produit résultant de la fermentation de Monascus ne peuvent pas être attribués à la seule présence éventuelle de la monacoline K dans la composition.
Selon un aspect avantageux, on précise que les espèces de Monascus sont d'une grande innocuité pour l'homme et l'animal. Les champignons du genre Monascus sont utilisés en Chine depuis deux mille ans dans l'alimentation humaine et en médecine humaine. En particulier, les espèces de Monascus sont qualifiées « QPS » (c'est-à-dire « Qualified Presumption of Safety ») par l'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA). Egalement, les espèces de Monascus sont qualifiées « GRAS » (c'est-à-dire « Generally Recognized as Safe ») par l'Administration pour les Aliments et les Médicaments américaine (« FDA »).
On a montré dans les exemples qu'une réduction importante de la production de méthane est obtenue avec des produits de fermentation obtenus avec des souches de Monascus. On a montré dans les exemples qu'une réduction importante de la production de méthane est obtenue à la fois (i) avec des extraits obtenus à partir des produits de fermentation de Monascus et (ii) avec le produit de fermentation brut n'ayant subi aucun traitement ultérieur, par exemple un produit de fermentation de riz cuit à la vapeur n'ayant subi aucune opération ultérieure d'extraction.
On a aussi montré qu'une réduction générale de la production de gaz in vitro ainsi qu'une réduction de la production d'acides gras volatils (AGV) à la fois in vitro et in vivo sont obtenues avec un produit de fermentation d'un substrat par Monascus spp.
De plus, on a montré dans les exemples que la fourniture à des ruminants d'un complément alimentaire de l'invention à base d'un produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus provoque une réduction d'environ 30 pour cents de la production de méthane par ces ruminants. Cet effet de réduction significative de la production de méthane a été montré notamment en utilisant, comme complément alimentaire, le produit brut de fermentation de Monascus sur un substrat constitué de riz cuit à la vapeur.
Chez les ruminants ayant reçu un complément alimentaire conforme à l'invention, on a observé un accroissement de la production fermentaire de propionate dans le rumen, aux dépends de la production d'acétate.
On a aussi montré que, chez les animaux ayant reçu un complément alimentaire selon l'invention, on provoque une réduction importante du nombre d'Archaebactéries méthanogènes, sans observer simultanément de modification dans le nombre des autres organismes bactériens et des organismes protozoaires.
Il résulte donc des résultats des exemples qu'un complément alimentaire conforme à l'invention permet de réduire la production de méthane chez les animaux, y compris les ruminants, et de simultanément accroître la fermentation ruminale des aliments fournis à ces animaux.
Dans une composition de complément alimentaire utilisée selon l'invention, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus, par exemple un extrait éthanolique sec, est présent à raison de 0,1 % à 100% en poids, par rapport au poids de matière sèche de ladite composition. En conséquence, une composition de complément alimentaire utilisée selon l'invention comprend de 0% à 99,9% en poids d'un ou plusieurs composés alimentairement acceptables, par rapport au poids de matière sèche de ladite composition.
Par composé « alimentairement acceptable », on entend tout type de composé qui est admis par les réglementations administratives relatives aux aliments pour animaux, en particulier aux aliments destinés aux ruminants d'élevage, y compris les bovins, les ovins et les caprins.
Les composés alimentairement acceptables englobent les agents conservateurs alimentaires, les colorants alimentaires, les agents édulcorants, les agents exhausteurs de goût, les agents régulateurs de pH y compris les agents acidifiants, les agents anti-oxydants, les agents de texture.
Les composés alimentairement acceptables englobent les composés susceptibles d'être métabolisés par l'organisme, y compris des vitamines ou des composés précurseurs des vitamines, des composés hydrocarbonés tels que des sucres, des lipides, ainsi que des sels minéraux.
Les composés alimentairement acceptables englobent aussi des composés qui ne sont pas métabolisés par l'organisme, tels que des agents de charge, par exemple des polymères comestibles naturels ou synthétiques, y compris la gomme xanthane, des extraits d'algues.
Les composés alimentairement acceptables englobent les additifs alimentaires définis (i) par la directive 89/107/CEE de l'Union Européenne, du 18 septembre 1989 établissant les catégories dans son annexe et (ii) par la directive 95/2/CE concernant les additifs alimentaires autres que les colorants et les édulcorants. Les différentes catégories d'additifs alimentaires englobent les catégories suivantes : Acidifiant, Affermissant, Agent d'enrobage, Agent de charge, Agent de traitement de la farine, Amidon modifié, Agent moussant, Anti-agglomérant, Antimoussant , Antioxygène, Colorant, Conservateur, Correcteur d'acidité, Édulcorant, Émulsifiant, Enzyme, Épaississant, Exhausteur de goût, Gélifiant, Humectant, Poudre à lever (ou agent de levuration), Sel de fonte, Séquestrant, Stabilisant, Support.
La présente invention concerne aussi un procédé pour réduire la production de méthane chez les ruminants, caractérisé en ce que l'on fournit auxdits ruminants une quantité appropriée d'une composition de complément alimentaire telle que définie ci-dessus.
La présente invention est également relative à une composition de complément alimentaire pour réduire la production de méthane chez les ruminants, comprenant un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus.
De manière générale, la composition de complément alimentaire ci-dessus est fournie au ruminant, sous la forme de prises successives et étalées dans le temps, par exemple selon des rythmes quotidiens, bi-hebdomadaires, hebdomadaires ou bien bi-mensuels.
De manière préférée, on fournit aux ruminants la quantité appropriée de composition de complément alimentaire ci-dessus selon une dose quotidienne.
Pour les ruminants qui sont nourris exclusivement au pâturage, on comprend que la composition de complément alimentaire est fournie séparément de leur alimentation principale.
Pour les ruminants qui sont nourris avec du fourrage frais ou du fourrage conservé (p. ex. du foin), ou bien avec des compositions d'aliments industrielles, y compris avec des concentrés alimentaires, la composition de complément alimentaire de l'invention peut être fournie (i) soit en mélange avec lesdits aliments, (ii) soit sous une forme séparée desdits aliments.
De manière générale, lorsque la composition de complément alimentaire telle que définie dans la présente description se présente sous la forme d'un extrait sec, par exemple sous la forme d'un extrait éthanolique sec, la quantité quotidienne apportée aux ruminants est d'environ 1 à 100 grammes de composition de complément alimentaire, par kilogramme d'aliment consommé (ou donné) par l'animal. Une quantité quotidienne d'au moins 1 gramme de ladite composition de complément alimentaire englobe une quantité d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 grammes de ladite composition de complément alimentaire. Une quantité d'au plus 100 grammes de ladite composition de complément alimentaire englobe une quantité d'au plus 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 , 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 , 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 , 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 , 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 grammes de ladite composition de complément alimentaire.
La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Protocole de fabrication d'une composition de complément alimentaire (produit brut de fermentation de Monascus sur riz cuit à la vapeur)
Du riz incollable (par exemple du riz incollable commercialisé sous les marques Uncle Ben's® ou Lustucru®) est additionné d'eau de robinet, et laissé à macérer pendant une nuit à la température de +4qC. Puis, l'excès d'eau est éliminé, par exemple par passage de la composition macérée solide/liquide à travers un tamis de taille de maille adaptée.
Le riz macéré est stérilisé, par passage dans une autoclavage à 121 °C pendant 15 min. Après refroidissement, jusqu'à température ambiante (20°C à 25°C), le riz macéré et stérilisé est inoculé avec un morceau de gélose d'une culture de Monascus ruber et l'ensemble est homogénéisé afin de bien répartir les spores de Monascus ruber dans l'ensemble de la masse du riz macéré et stérilisé.
Le mélange de riz et de Monascus ruber riz est ensuite incubé dans des conditions en aérobie à la température de 30 ^ et à l'obscurité pendant une durée de 2 à 3 semaines. Le mélange en cours de fermentation aérobie in vitro est agité quotidiennement durant les 3 premiers jours d'incubation.
Le mélange obtenu à la fin de la période de deux à trois semaines de fermentation aérobie peut être utilisé tel quel comme complément alimentaire, ou bien être séché préalablement à son utilisation.
Exemple 2 : Effets in vitro d'une composition de complément alimentaire sur la production de métabolites par des archaea méthanoqènes. A. Matériel et Méthodes
L'effet d'un extrait de riz fermenté par une souche sélectionnée de Monascus sp., préparé conformément à l'exemple 1 , sur la fermentation ruminale, en particulier sur la production de méthane, a été étudié in vitro en utilisant un système de fermentation séquentiel par lots. Trois moutons munis de canules du rumen, recevant une alimentation à base de foin deux fois par jour, ont été utilisés comme donneurs de contenu ruminai. Le contenu ruminai des trois animaux a été prélevé le matin avant le repas, filtré à travers un tissu avec une taille de maille de 400 μηι de diamètre pour obtenir la phase liquide, et mélangés en quantité égale. Soixante-quinze millilitres de ce liquide ruminai de mélange a été additionné de 300 ml de solution tampon anaérobique (Weller & Pilgrim, Br. J. Nutr. 32:341 -51 . 1974). Une fraction aliquote (5 ml) de cette solution liquide ruminai-tampon a été ensuite transféré dans des tubes de Hungate sous atmosphère de C02 contenant 100 ± 2 mg de foin de luzerne. Chaque tube a été additionné avec, respectivement : (i) 100 μΙ de l'extrait de Monascus, ou (ii) monacoline K pure, (iii) une solution d'éthanol à 25% (v/v) ou (iv) de l'eau (voir tableau 1 ci-dessous). Les tubes ont été incubés à 39 0 C sous agitation pour 48 h. Chaque traitement a été faite en triple.
Tableau 1
Traitements Solutions
(100 μΙ/tube)
1 Extrait Monascus 1 mg/ml monacolin éq.
2 Monacoline K 1 mg/ml monacoline11
3 Témoin éthanol 25% d'éthanol
4 Témoin eau ddH 2 O
^La concentration finale en monacoline K dans les tubes de fermentation est de 20 μg I ml
Après 48 h d'incubation, 2 ml de chacun des triplicat de chaque traitement ont été mélangés, et 1 ,5 ml de ce mélange utilisés pour inoculer 3 nouveaux tubes de Hungate contenant 3,5 ml de tampon, 100 mg de foin de luzerne.
Les tubes sont ensuite additionnés de 100 μΙ des différents traitements (Cf tableau 1 ci- dessus), et les tubes ont été à nouveau incubés à 39 °C sous agitation pendant une durée additionnelle de 48 h. Cette procédure a été répétée une seconde fois.
À la fin de chaque période de 48 h, la production de gaz, les concentrations en méthane et en acides gras volatiles issues de la fermentation ont été mesurées.
B. Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2
Gaz Méthane totaux Acétate Propionate Butyrate
(ml) μπιοΙ (mmol.l"1) (mmol.l"1) (mmol.r1)
1 ° transfert
Extrait Monascus 7 21 .5 ± 1.6 162.0+ 7.7 106.5+ 8.6 76.6+ 5.7 19.3+ 2.6 7.5+ 0.4*
Monacoline K à 2C^g/ml 21.9+ 0.3 162.5+ 22.9 96.3+ 2.1 69.9+ 1 .5 16.7+ 0.4 6.1 + 0.1
Témoin éthanol 22.0+ 0.2 155.9+ 4.5 98.3+ 1.4 71.0+ 0.5 17.0+ 0.5 6.6+ 0.3
Témoin eau 27.1 + 0.1 132.0+ 23.3 90.0+ 1.2 60.3+ 0.8 18.5+ 0.3 6.6+ 0.1
2 " transfert
Extrait Monascus 7 16.8+ 0.4* 24.6+ 37.0 77.8+ 5.5 48.3+ 3.6 23.3+ 1.1 5.0+ 0.7
Monacoline K à 2C^g/ml 17.8+ 0.5 16.2+ 17.0 76.5+ 7.4 49.1 + 3.8 19.7+ 2.8 5.9+ 0.7
Témoin éthanol 18.8+ 1 .7 57.8+ 48.6 86.3+ 17.2 58.9+ 12.3 19.1 + 3.3 6.1 + 1 .0
Témoin eau 19.9+ 0.0 79.3+ 4.0 95.0+ 1.1 60.8+ 1 .1 23.5+ 0.2 6.5+ 0.2
3 " transfert
10.4
Extrait Monascus 7 18.2+ 0.1 * 12.8+ 90.6+ 1.6 50.8+ 1 .0* 32.1 + 0.5* 5.4+ 0.2*
Monacoline K à 2C^g/ml 19.2+ 0.4 59.1 + 9.4 95.1 + 1 1.5 57.3+ 6.9 28.5+ 3.5 6.6+ 1 .0
Témoin éthanol 20.3+ 0.3 90.2+ 3.1 101.1 + 2.9 64.9+ 2.4 25.7+ 0.5 6.9+ 0.1
Témoin eau 30.1 + 0.2 83.1 + 17.7 100.1 + 4.5 61.7+ 2.4 26.9+ 1.7 6.6+ 0.5
Exemple 3 : Evaluation in vitro d'un complément alimentaire selon l'invention préparé à partir d'un produit brut de fermentation de Monascus sur blé stérilisé
1. Préparation du complément alimentaire
Une composition alimentaire selon l'invention est préparée à partir d'un produit de fermentation de Monascus sur blé concassé, tamisé puis stérilisé à 120 °C pendant 30 min selon un protocole analogue à celui de l'exemple 1 .
L'étape de stérilisation permet d'éliminer les souches microbiennes présentes initialement dans le substrat qui pourraient entraver le développement de Monascus.
Après refroidissement, le blé stérilisé est inoculé avec du son de blé préalablement fermenté (30 °C durant 4 j) avec la même espèce de Monascus.
L'ensemble est homogénéisé afin de bien répartir les spores de Monascus dans l'ensemble de la masse du blé stérilisé.
Le mélange obtenu est ensuite incubé dans des conditions partielles d'anaérobie à la température de 30 ^ et à l'obscurité pendant une durée de 2 à 3 semaines. Le milieu de fermentation est agité quotidiennement durant les 3 premiers jours d'incubation.
Le mélange obtenu à la fin de la période de deux à trois semaines de fermentation peut être utilisé tel quel comme complément alimentaire, ou bien être séché préalablement à son utilisation.
2. Evaluation du complément alimentaire
L'effet in vitro du complément alimentaire obtenu par culture de Monascus sur la production de métabolites par les archaea méthanogènes a été évalué selon un protocole analogue à celui décrit dans l'exemple 2 (ajout de 10ΟμΙ d'extrait du milieu de fermentation de Monascus) à part que le temps d'incubation entre deux transferts est de 24 h et non 48 h. A titre de comparaison, deux expériences témoin ont été mises en œuvre : ■ Expérience témoin 1 : ajout de 100 μΙ d'eau à la place de l'extrait du milieu de fermentation de Monascus
■ Expérience témoin 2 : ajout de 100 μΙ d'un extrait d'un substrat « blé » qui n'a pas été en contact avec Monascus à la place de l'extrait du milieu de fermentation de Monascus
À la fin de chacune des périodes d'incubation de 24 h, la production de gaz et les concentrations en méthane ont été mesurées.
De manière remarquable, on observe aux temps +48h et +72h une diminution significative des quantités de méthane produites par incubation du liquide ruminai en présence du complément alimentaire selon l'invention par rapport aux expériences témoins. Plus précisément, les quantités de méthane produites en présence du complément alimentaire selon l'invention sont réduites d'un facteur 2 et d'un facteur 4, à +48 h et à +72h respectivement, par rapport aux expériences témoins. De manière remarquable, on n'observe pas de différence significative dans la production de méthane entre les deux expériences témoins ce qui confirme que la diminution des quantités de méthane observées pour le liquide ruminai incubé en présence du complément alimentaire résulte des métabolites formés par Monascus à partir du substrat à base de blé.
Exemple 4 : Effets in vivo d'une composition de complément alimentaire sur la production de métabolites par des ruminants.
A. Matériel et Méthodes
Un essai in vivo sur moutons a été réalisé pour valider l'intérêt de ce concept. Six moutons maies adultes de race Texel ont été adaptés pendant plusieurs semaines à un régime d'entretien composé de foin et de riz (1 :1 ). Les animaux, d'un poids corporel moyen de 63,5 ± 4 kg ont reçu 1 .2 kg d'aliment en matière sèche une fois par jour le matin. Chaque animal a reçu pendant 1 1 jours du riz fermenté produit dans notre laboratoire, avec un retour au régime initial pendant deux semaines.
La production de méthane a été mesurée quotidiennement avant et pendant le traitement, mais aussi 2 semaines après le traitement. La concentration des acides gras volatiles du contenu ruminai a été également analysée par chromatographie en phase gazeuse. Le suivi des archaea méthanogènes et des bactéries totales a été mesuré par les méthodes de PCR quantitative. Les protozoaires ont été dénombres par microscopie. B. Résultats
Les résultats sont présentés dans la Figure 1 et dans le Tableau 3 ci-dessous.
Les émissions journalières de méthane ont diminué en moyenne de 30% durant le traitement (P < 0.05) (Tableau 3 et Figure 1 ). Les fermentations ont été réorientées vers une proportion accrue du propionate aux dépens de l'acétate. Chez ces animaux, le traitement a entraîné une diminution significative du nombre des Archaea méthanogènes sans modification du nombre de bactéries et de protozoaires dans le rumen.
Tableau 3
Before Treatment Treatment Post-Treatment
w1 w2 w1 W2 SEM
Méthane (L/day) 59.3 a 41.8 c 43.4 c 56.3 ab 48.0 bc 3.85
Total VFA (μηΊθΙ/L) 73.4 b 61.8 c 75.3 b 94.4 a 89.6 a 3.84
Acétate (A, %) 70.7 b 59.8 c 63.6 b 66.0 a 67.4 a 3.84
Propionate (P, %) 12.6 b 17.9 ab 16.5 ab 15.7 a 15.6 ab 2.26
Butyrate (%) 13.1 16.5 15.7 13.8 12.9 1.32
Iso-acids (%) 2.5 b 3.1 b 2.0 b 3.0 a 2.5 b 0.27
A:P 5.8 a 3.5 b 4.0 b 4.6 ab 4.3 ab 0.38

Claims

REVENDICATIONS
1 . Utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un microorganisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le micro-organisme fongique est choisi parmi Monascus albidulus, Monascus argentinensis, Monascus aurantiacus,
Monascus barkeri, Monascus bisporus, Monascus eremophilus, Monascus floridanus, Monascus fuliginosus, Monascus fumeus, Monascus kaoliang, Monascus lunisporas, Monascus mucoroides, Monascus olei, Monascus pallens, Monascus paxii, Monascus pilosus, Monascus pubigerus, Monascus purpureus, Monascus ruber, Monascus rubropunctatus, Monascus rutilus, Monascus sanguineus, Monascus serorubescens et Monascus vitreus.
3. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le micro-organisme fongique consiste en une souche appartenant à l'espèce Monascus ruber.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le substrat est choisi parmi du riz, du pain, du son, des céréales, des co-produits des céréales, des substances à base de céréales, des fourrages, un milieu nutritif pour micro-organismes fongiques, de la cellulose.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le substrat est un substrat solide préparé à partir d'un ou plusieurs produits choisis parmi le groupe constitué par les céréales appartenant au genre Triticum, les céréales appartenant au genre Oriza, et les produits dérivés desdites céréales.
6. Utilisation selon la revendication 5 caractérisé en ce que le substrat solide est préparé à partir de graines de céréales, éventuellement additionnées de son de blé, en l'absence de tout composé nutritif supplémentaire.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le substrat organique consiste en un substrat obtenu par cuisson de riz à la vapeur.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit produit consiste en un extrait d'un produit de fermentation par Monascus.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit extrait consiste en un extrait éthanolique.
10. Procédé pour réduire la production de méthane chez les ruminants, caractérisé en ce que l'on fournit auxdits ruminants une quantité appropriée d'une composition de complément alimentaire telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9.
1 1 . Composition de complément alimentaire pour réduire la production de méthane chez les ruminants, comprenant un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus.
12. Composition selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que le substrat est un substrat solide préparé à partir de céréales sélectionnées parmi le groupe constitué par les céréales appartenant au genre Triticum, les céréales appartenant au genre Oriza, les mélanges desdites céréales et les produits dérivés desdites céréales
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que le substrat solide est préparé à partir de graines de céréales, éventuellement additionnées de son de blé, en l'absence de tout composé nutritif supplémentaire.
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