WO2011103610A2 - Pflanzenschutzmittel - Google Patents

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WO2011103610A2
WO2011103610A2 PCT/AT2011/000092 AT2011000092W WO2011103610A2 WO 2011103610 A2 WO2011103610 A2 WO 2011103610A2 AT 2011000092 W AT2011000092 W AT 2011000092W WO 2011103610 A2 WO2011103610 A2 WO 2011103610A2
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juglans
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pterocarya
plant
juglone
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Karl Stich
Thilo Fischer
Christian Gosch
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Technische Universität Wien
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    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]

Definitions

  • the present invention relates to a crop protection agent for controlling bacterial and / or fungal infections in plants.
  • Copper-based preparations are also active, but are increasingly restricted to prevent copper accumulation in the soil.
  • nanoscale silver can also be used to combat Erwinia amylovora, which can potentially be accumulated in the soil as an element comparable to copper.
  • antagonistic bacteria are used in the flowering against fire blight, but do not achieve the efficiency of streptomycin.
  • Arbutin hydroquinone glucoside
  • GB 2 159 056 discloses naphthoquinones which are suitable for use in biocides.
  • compositions which can be used to inhibit nematode damage in plants. These compositions include extracts of juglone-producing plants.
  • the compositions described in WO 2006/060582 include juglone at a minimum concentration of 1000 ppm (1 g / L). At these concentrations, phytotoxic effects may occur in plants, especially in crops.
  • CN 1 781 376 relates to plant extracts which are suitable to be used as pesticides. These extracts are obtained from plants comprising juglone.
  • compositions disclosed in this document include naphthalenedione.
  • EP 1 051 909 relates to naphthoquinones which are suitable for combating pests.
  • WO 2000/56140 discloses methods and compositions for combating pests which occur in the water. These agents include, in particular, juglone and juglone analogs.
  • JP 4 295 402 discloses jugglucose glucosides.
  • the agents described in the prior art for controlling bacterial and fungal infections, in particular for combating Erwinia amylovora, or Erwinia infections, has a number of disadvantages. Many of the substances used can be harmful to animals and humans. On the other hand, other substances have a too low activity against fungi or bacteria, such as Erwinia, so that the economy is no longer given by an increased use of active ingredients and the environment is more heavily polluted.
  • the present invention relates to the use of a compound according to the formula (A)
  • R 1, R 4 and R 5 are independently H, a glycoside or an ester, as a pesticide, wherein the pesticide comprises the compound dissolved in a solvent at a concentration of 0.1 ⁇ M to 2 mM.
  • the compound is 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 1,4,5-trihydroxynaphthalene and / or glycosides or esters thereof.
  • the present invention also relates to a crop protection agent comprising at least one compound of the general formula (I) or formula (I I):
  • R 1, R 4 and R 5 independently of one another are a glycoside radical, an added aldehyde, an added ketone, an organic acid radical, an inorganic acid radical or an aliphatic radical, and R 2, R 3, R 6, R7 and R8 are independent of each other which is a halogen or hydrogen, and addition products of S- and N-containing compounds to compounds of general formula II and polymers of both formulas and their respective derivatives in a concentration of 0.1 ⁇ to 2 or 5 mM.
  • Juglone is a substance that has been extensively studied for its phytotoxic ("allelo-pathic") effect, especially on seedlings.
  • the native walnut tree (Juglans regia) and other Juglandaceae prevent in a natural process the emergence of competing plant growth at their location.
  • the precursor 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene-glucoside is formed. This is washed out of the leaves by precipitation and released via the roots and hydrolyzed in the soil by microbial glucosidases to 1,4,5-trihydroxynaphthalene. This is then oxidized to the active substance juglone (Weiler and Nover 2008). However, juglone can damage or kill even neighboring woody plants by their cumulative effect.
  • Juglon proves to be active (more effective than other quinones, including 1, 4-naphthoquinones such as plumbagin) against Erwinia, especially Erwinia amylovora.
  • the combination of low application concentrations with a time-limited application period represents the potential of juglone and its derivatives as plant protection products according to the invention against Erwinia amylovora.
  • the plant protection agent may also comprise interme ⁇ diary oxidation states of the compounds according to the invention, such as eg Juglon as semiquinone radical.
  • the glycoside residue is a glucosyl, mannosyl, galactosyl, fructosyl, ribosyl, arabinosyl, rhamnosyl or xylosyl residue.
  • the added aldehyde or ketone of the compound of the invention preferably contains 1 to 6 carbon atoms.
  • the remainder of the organic acid is selected from the group consisting of a formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, malonyl, pyruvoyl, succinyl, 2-oxo-glutaroyl , Oxaloacetic, fumaric, tartaric and citric acid groups.
  • the remainder of the inorganic acid is preferably a phosphoric acid or sulfuric acid radical.
  • the remainder of the ethers is preferably a methyl or ethyl radical.
  • the halogen is preferably iodine, bromine, chlorine or fluorine.
  • the compound of the invention may also be present as a 1,2- or 1,4-addition product of the quinone form (formula II).
  • the compound of the invention can also be used as a polymer present and develop a corresponding antimicrobial activity.
  • the polymer is preferably 3,3 'bijuglon or cyclobutrolone.
  • the plant protection agent according to the invention may comprise the compounds in synthetic form but also in the form of a plant extract.
  • These extracts are preferably selected from the foliage or nuts of the walnut Juglans regia (or other Juglandaceae, Juglans ailanthifolia (syn. J. sieboldiana), J. cathayensis (syn. J. draconis), J. cinerea, J. hindsii, J. microcarpa (syn.
  • the compounds according to the invention additionally have the advantage that they are also useful for insects, e.g. Bees, harmless, i. not eating and contact poison, are. Many crop protection agents used to date against Erwinia infections do not have this benefit and are detrimental to beneficial insects.
  • the compounds of the invention in a concentration of 0.5 ⁇ M to 4 m or 0.5 ⁇ M to 1.5 mM, preferably from 1 ⁇ M to 1 or 2 mM, more preferably from 5 ⁇ M to 0.5 or 1 mM.
  • the compounds according to the invention are preferably dissolved in an aqueous and / or organic solvent in order to achieve the concentration required according to the invention in the crop protection agent.
  • the solvents used may include, but are not limited to, water or other organic solvents such as alcohols such as ethanol.
  • the compounds according to the invention can be dissolved, for example, first in an alcohol such as ethanol and then diluted in water or another aqueous medium for the production of pesticides to the concentration according to the invention.
  • buffer substances and the same may be present, which are usually added to crop protection agents.
  • the crop protection agent according to the invention can be used particularly well for controlling Erwinia amylovora in crop plants.
  • Exemplary crops, which are frequently attacked by Erwinia amylovora come mainly from the family Rosaceae. Particularly vulnerable is the subfamily of pome fruit (Maloideae). In the wood of pome fruits Erwinia amylovora is also able to overwinter.
  • the plant protection agent according to the invention in rose plants, preferably in pome fruit plants, in particular in apples of the cultivars Berlepsch, Braeburn, Cox Orange, Granny Smith, Elstar, Fuji, Gala, Gloster, Gravensteiner, Idared, James Grieve, Jonagold Group, Jonathan , White Clematis, Topaz and Vista Bella, and pears of the varieties Abbate Fetel, Conference, Williams Christ,instadechants, Gellerts Butterbirne, Harrow Sweet, Clapp's Darling, Comice, Concorde, Early of Trevoux, Gute Luise, Bosc's swipenbirne (Kaiser Alexander) To use Pastoren pear and Passa Crassana the.
  • ornamental shrubs such as quince, medlar, vetchling, wild berry, rowanberry / rowanberry, apple berry, ornamental quince, hawthorn like hawthorn and hawthorn, loquat, dwarf medlar and stingwort may also be treated with the plant protection product according to the invention to produce Erwinia amylovora to fight on these plants.
  • Erwinia amylovora can be combated particularly well with the plant protection agent according to the invention.
  • the plant protection product is also useful for controlling other Erwinia species which are effective as plant pathogens. These include Erwinia carotovora (causing blackleg in potato plants and wet rot in potato tubers), Erwinia billingia and Erwinia cypripedii.
  • the substances 5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone (juglone) or 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene can be obtained in various ways.
  • both substances can be produced synthetically by known chemical methods
  • both substances can be prepared from e.g. Leaves or nuts of Walnut Juglans regia (or other Juglandaceae) are extracted (e.g., with ethanol or an azeotropic water-ethanol mixture in a Soxhlet apparatus).
  • the synthesis of the derivatives according to the invention can also be carried out by known processes (for example by chromate oxidation of 1,5-dihydroxynaphthalene).
  • the “derivatives" of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone and 1,4,5-trihydroxynaphthalene are "selected from the group consisting of glycosides, hemiacetals, full acetals, esters, ethers, polymers and 1,2- or 1,4 Addition products and halogen-ring-substituted derivatives ".
  • the term "derivative" in the context of the present invention exclusively includes substances derived from 5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone and 1,4,5-trihydroxynaphthalene and their hydroxy or keto groups glycosidated, esterified , etherified, acetalated, polymerized, added to other molecules or their ring systems are halogenated.
  • a particularly preferred derivative is the 1,4,5-trihydroxynaphthalene-4-glucoside incorporated in leaves and fruits of the walnut tree.
  • 4,5-trihydroxynaphthalene-4-glucoside is enzymatically or chemically cleaved off its glucose residue and the cleavage results in the chemical compound 1,4,5- Trihydroxynaphthalene ("Hydrojuglon"). From this, after an oxidation reaction, the substance forms juglone (5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone).
  • the plant protection composition comprises 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene or 1, ( 5-trihydroxynaphthalene-4-glucoside, both 1,4,5-trihydroxynaphthalene and 1,4,5-trihydroxynaphthalene-4 glucosides are converted to 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone over time after application to the plant, this has the advantage that the plant's effect on Erwinia, for example, lasts longer, since 5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone is released gradually.
  • active ingredients can be dissolved directly in water, or in a Pre-dissolved in organic solvent (preferably ethanol) and diluted in water before use, or, in a particularly preferred embodiment, are 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene-4-glucoside, 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene, 5-hydroxy-l , 4-Naphthoquinone or mixtures thereof (influenced by the nature of the isolation) from Juglandacea plant material, especially foliage of Juglans or Carya species, isolated and used as a dilute plant preparations.
  • Another possible source of juglone is Penicillium diversum or related organisms.
  • the crop protection agent of the present invention may comprise surfactants which do not undergo bactericidal chemical reactions with quinones (e.g., Tween 20 (0.005-0.1% by volume), but also surfactant natural substances).
  • the plant protection agent according to the invention particularly preferably comprises Na and K soaps, or commercial wetting agents, e.g. Agrowax 010, Break thru, Citro ⁇ n, Excellent CS 7, Neo-Bet, Agronetz, Ajutol, Silwet top, Zellx CS.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 1,4,5-trihydroxynaphthalene and / or derivatives or esters thereof selected from the group consisting of glycosides, hemiacetals, acetals, esters, ethers, Polymers, 1,2- or 1,4-addition products as well as halogen-ring-substituted derivatives as pesticides.
  • the plant protection agent according to the invention is particularly preferably used for combating Erwinia, preferably Erwinia amylovora.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for controlling bacterial and / or fungal infections, preferably Erwinia infections, in particular Erwinia amylovora infections, in plants comprising the step of applying a plant protection agent as defined herein to flower and / or foliage the plants.
  • the plant protection agent disclosed herein can be applied to the flower and foliage of the plants to be treated by methods known in the art. Usually, the application of pesticides by spraying, spraying or dusts.
  • the plant protection agent As the primary infection in pome fruit is usually due to the flowering of bees, especially when humid weather conditions conditions prevail, it is particularly preferred at this time to use the plant protection agent according to the invention. Due to the short-term application during the flowering of the flowers, cumulative phytotoxic effects on the fruit trees are avoided in this embodiment.
  • the crop protection agent 5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone (juglone) according to the invention has proved to be non-edible or contact-poisonous for bees in investigations carried out on behalf of the company.
  • the plant protection agent according to the invention is preferably applied to the plant in the twilight, ie reduced UV irradiation, or in the dark.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a process for the preparation of a crop protection composition
  • a crop protection composition comprising a compound of the formula (A)
  • R 1, R 4 and R 5 are independently H, a glycoside or an ester comprising the step of dissolving the substantially crystalline compound of the general formula (A) or (B) in a solvent in a concentration of 0.1 ⁇ M 2 mM or adjusting or diluting a plant extract comprising the compound of the general formula (A) or (B) such that the plant protection agent comprises the compound in a concentration of 0.1 ⁇ to 2 mM.
  • the compounds of the invention may be formulated inter alia by dissolving in a solvent to a crop protection agent.
  • the plant protection agent according to the invention can be prepared in a simple manner in the required concentration range in which the weighed amount of the compounds according to the invention is mixed with an appropriate amount of solvent. If compounds according to the invention are part of a plant extract, the amount of the compounds according to the invention present in this extract is first determined in order subsequently to dilute the extract with a solvent or to add it to further compounds of the invention in solid or liquid form.
  • the compound is 5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone, 1, 4, 5-trihydroxynaphthalene and / or glycosides or esters thereof.
  • Another aspect of the present invention relates to a crop protection agent obtainable by a process of the present invention.
  • Fig. 1A to 1D shows growth inhibition (cell density measured as optical density at 600 nm) by juglone and comparative plumbagin on suspension cultures of Erwinia amylovora: Top: the 1, 4-naphthoquinone juglone 0.01 / 0.05 / 0.1 mM, Control with equal volume of the solvent ethanol, and control with pure KB medium. Second graph: repetition with 0.01 mM juglone and lower concentrations (0.005 / 0.001 mM). Third graph: 0.1 and 1 mM plumbagin (the initial change in absorbance at 1 mM plumbagin is caused by a reaction with the medium). Fourth chart: Positive control with the conventional herbicide streptomycin (antibiotic) used against Erwinia amylovora.
  • Figure 2 shows the growth inhibitory effect of 0.05 and 0.1 mM juglone on Erwinia carotovora.
  • E Control with equal volume of the solvent ethanol
  • K Control with pure KB medium.
  • Fig. 3 shows pear inoculation assays by preincubation with various concentrations of juglone (and streptomycin as control) and subsequent (15 min) inoculation with Erwinia amylovora. Image after 6 days incubation at 25 ° C. Culture plate as a control for the vitality of Erwinia amylovora cells used.
  • Fig. 4 shows the results of a study comparing the effect of representatives of three classes of quinones against Erwinia amylovora.
  • 1,4-naphthoquinones were evaluated to assess their potential as crop protection agents.
  • the 1,4-naphthoquinones juglone (5-hydroxy-1,4-naphthoquinone) and plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1-naphthoquinone) were tested for their activity against Erwinia amylovora and Erwinia carotovora.
  • the growth curves of the suspension cultures in the presence of various juglone concentrations demonstrate an inhibition of the growth of Erwinia amylovora.
  • these experiments give no information about the nature of the underlying effect, which could be bacteriostatic (inhibition of growth, no direct killing of cells) or bactericidal (killing of cells).
  • this can be ascertained by plating out aliquots of the suspension cultures with active ingredient on active substance-free solid media. On such solid media, the drug is diluted from the small volume aliquot by diffusion below a threshold such that, if cells were only inhibited but not killed, colonies form after incubation.
  • Such plating tests were performed with 0.1 mM juglone in the suspension culture by taking aliquots in a time series.
  • the control was a culture containing a corresponding volume of the solvent for the Glon (ethanol) had been added.
  • a repeat of the experiment with only 0.01 mM juglone was also performed, with serial dilutions for the respective aliquots for accurate titer determination. Only for the time points immediately after addition of juglone colony formation could be observed in both test series, after each longer incubation (after 30 min) no colony formation from surviving cells took place.
  • Juglone has a strong bactericidal effect on Erwinia amylovora.
  • Erwinia carotovora was selected as an example of another Erwinia species.
  • the effect of 1, 4-naphthoquinone juglone on the growth of Erwinia carotovora in suspension culture was tested by the same methodology as in the case of Erwinia amylovora.
  • Juglone also has a growth-inhibiting effect on other Erwinia species in suspension culture, but at least for Erwinia carotovora this effect is weaker than for Erwinia amylovora.
  • Juglone was tested in in vitro infection tests with apple blossoms, as well as comparing the 1,4-naphthoquinone plumbagin and 1,4-benzoquinone. Streptomycin was used as a positive control.
  • Table 1 In vitro infection tests on apple blossoms (Malus x domestica) with juglone as well as plumbagin and 1, 4-benzoquinone. Streptomycin as a positive control.
  • Juglone has good potential as an agent to control primary fire blight (flower infections).
  • necrotic lesions of the plant tissue and the formation of white bacterial mucus were used as criteria for assessing the extent of Used infection. Necrotic lesions were observed in the experiment on both varieties (Williams Christ and Bosc's swipenbirne), while exudate formation was observed only in the Williams Christ variety. Although necrotic lesions were observed in both strains for the 0.01 mM low concentration of streptomycin in the positive control, these were somewhat reduced compared to inoculation with Erwinia amylovora without the antibiotic, and there was no exudate formation.
  • 0.1 mM juglone showed approximately the same effect as 0.01 mM streptomycin in this system.
  • juglone and comparative plumbagin were tested on flowers of two apple varieties (Smoothy, a Golden Delicious offspring, and Idared) as well as a pear variety (Williams Christ) under growing conditions in a trellis tree planting for flowering. In each case, the concentrations were used, which had been found in the in vitro suspension cultures as fully effective (no bacterial growth). Various concentrations were tested (0.005-0.05 mM juglone and 0.1-0.5 mM plumbagin) (Table 2). Control treatments with water and with the ethanol concentrations used in the drug solutions (0.5 and 5%, to pre-dissolve the active ingredients) were performed and showed, as expected, no effects.
  • Table 2 Overview of phytotoxicity to flowers rsp. Fruit development of apple and pear varieties tested concentrations of juglone and plumbagin.
  • Juglone is a well-known walnut biotactic compound (Juglans regia) (and other Juglandaceae), while plumbagin is from North American Drosera species (Drosera rotundifolia, Drosaceae), Plumbago species (Plumbaginaceae) and Diospyros species (Ebenaceae). comes. As such, both compounds are released from living (Juglans regia, Weiler Nover 2008) or, in any case, from degrading plant tissues and thereafter degraded microbially.
  • juglone Both substances, juglone and plumbagin are classified as pure substances as toxic (R phrases), but juglone has a high LD50 value (rat). This is contrasted with the presence of juglone in walnut as a crop for the diet. Especially when removing the exocarps of nuts, the human is exposed to the juglone strongly over the skin (recognizable as blackening of the fingers (oxidation, polymerization)). It is also used as a component of wool dyes and for the treatment of venous diseases. Furthermore, even alcoholic beverages based on immature walnuts are traditionally and commercially produced and consumed ("nut schnapps"). Subject to a required accurate assessment as a plant protection product according to the invention, therefore, juglone is initially considered to be rather harmless.
  • Exemplary representatives of three classes of quinones were compared in their effect on their effects on the growth of suspension cultures of Erwinia amylovora.
  • Fig. 4 shows the progressions of the growth curves in the presence of the various members of the classes as a function of the concentration (50/25/125/10/5/2.5 ⁇ M). It is clear (it should be noted the courses for 10 ⁇ M to 25 ⁇ M) that in this concentration range no representative of other quinone classes has an effect that is approximately comparable to the juglone. Only at the low concentration of 5 ⁇ M juglone does growth reappear after a long incubation period. 10 ⁇ M of juglone, corresponding to 1.74 mg / l, was still completely bactericidal.
  • Juglon has against Erwinia amylovora against other representatives tern of quinones, in each case described effect against various microorganisms, a beyond, special (bactericidal) effect.
  • the experiment was performed for growth inhibition curves with 0.1 or 0.01 mM juglone (20 ⁇ 10 mM and 1 mM juglone in ethanol to 2 ml of suspension cultures). 10 ⁇ aliquots of the cultures were taken immediately after addition of the juglone solution and mixing, as well as at regular time intervals and plated on juglone-free solid medium KB. As a control aliquots were taken from the suspension culture with an equivalent concentration of ethanol and also plated out. After two days incubation of the plates at 25 ° C, the respective colony formation was documented. Phytotoxizi did in flowers and for the subsequent fruit development
  • juglone and plumbagin were pre-dissolved in ethanol (65 ° C) and then diluted to the respective test concentrations in water. Maximum final concentration for the solvent ethanol in the treatment solutions was 5%, corresponding control treatments with 0.5 or 5% ethanol in water were performed. For each variant (active ingredient, concentration, variety) two larger branches were treated. The tests took place in the experimental fruit plant of the University of Natural Resources and Life Sciences in Jedlersdorf). All trees in a series were of the same age, developmental and observable physiological state. The treatments were in the morning from 8:00 to 9:30 at a rel.
  • Humidity of 68-75% and temperatures of 12-13 ° C performed. On all treatment days, the sprayed flowers were then exposed to direct sunlight. On the days following the treatment, phytotoxic effects were assessed. In the following months, fruit set and development were observed and compared with those of the control plants. Special attention was paid to visible changes in the fruit pidermis.
  • the in vitro infection tests with apple blossoms reflecting the natural route of infection were carried out as follows: Separated blooming apple blossoms were further cultured in sterile sugar solution standing in transparent plastic boxes. The stigmas of the flowers were inoculated with 10 4 cfu Erwinia amylovora cells and incubated for 2 hours at room temperature. Thereafter, the drug solutions to be tested were sprayed on. After a further 35 hours of incubation, it was moistened by spraying water. The infection rate was determined after 8-10 days of incubation at 22 ° C and 70% relative humidity.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel (A) oder der Formel (B) wobei R1, R4 und R5 unabhängig voneinander H, ein Glykosid oder ein Ester ist, als Pflanzenschutzmittel, wobei das Pflanzenschutzmittel die Verbindung in einem Lösungsmittel gelöst in einer Konzentration von 0,1 μM bis 2 mM umfasst.

Description

- ι -
Pflanzenschutzmittel
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von bakteriellen und/oder Pilz-Infektionen bei Pflanzen .
In vielen Ländern wird der Kernobstanbau existentiell durch bakterielle und Pilz-Infektionen, wie beispielsweise die von dem Bakterium Erwinia a ylovora verursachte Feuerbranderkrankung, bedroht. Als langfristige Perspektive sind die vielfältigen züchterischen Bemühungen um Feuerbrand-resistentere Sorten von Apfel und Birne zu betrachten. Dagegen wird in kürzerer Perspektive an der Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen den bakteriellen Erreger gearbeitet.
Gegenwärtig wird Feuerbrand in erster Linie durch die Anwendung des Antibiotikums Streptomycin bekämpft, bei dem es sich um eine hierfür hochwirksame Substanz handelt. Es wurden jedoch bereits Resistenzen gegen das Antibiotikum beobachtet. Darüber hinaus führten ökologische und toxikologische Betrachtungen zu einer strengen Regulierung der Streptomycin-AnWendung gegen Feuerbrand. Bedenken bestehen auch hinsichtlich der Entwicklung An- tibiotika-resistenter humanpathogener Bakterien durch breiten Antibiotika-Einsatz. Streptomycin wurde z.B. wiederholt in Honig aus Anwendungsgebieten nachgewiesen (und dieser dann kostenintensiv vernichtet) .
Kupfer-basierte Präparate sind ebenfalls aktiv, werden aber zunehmend eingeschränkt, um Kupfer-Akkumulation im Boden zu verhindern.
Gemäß der EP 2 012 589 Bl kann zur Bekämpfung von Erwinia amylovora auch nanoskaliges Silber verwendet werden, das potentiell als Element vergleichbar mit Kupfer im Boden akkumuliert werden kann.
In einem anderen Ansatz werden antagonistische Bakterien bei der Obstblüte gegen Feuerbrand verwendet, erreichen aber nicht den Wirkungsgrad von Streptomycin.
Arbutin (Hydrochinon-glukosid) wurde als natürlicher Sekun- därmetabolit der Birne (Pyrus spp.) hinsichtlich seiner möglichen Rolle in der Pathogenabwehr der Birne gegen Erwinia amylovora wissenschaftlich untersucht (Hildebrand and Schroth, Nature 197 (1963) :513) .
Für das hydrolysierte und oxidierte Produkt 1 , 4-Benzochinon, das aus Arbutin freigesetzt werden kann, wurde eine Aktivität gegen Erwinia amylovora gefunden (Powell and Hildebrand, Phyto- pathology 60 ( 1970 ): 337-340 ; Jin and Sato, Phytochemistry 62 (2003) : 101-107) .
In der GB 2 159 056 werden Naphthochinone geoffenbart, die geeignet sind in Bioziden eingesetzt zu werden.
In der EP 0 134 198 werden Chinonderivate geoffenbart, die in der Lage sind, Kulturpflanzen vor der phytotoxischen Wirkung von Herbiziden zu schützen.
Duroux et al . (Biochem. J., 333 (1998): 275-283) befassen sich mit 1 , 5-Dihydroxy-4-Naphthalenyl-ß-D-Glucopyranosid und der entsprechenden Glucosidase.
In der WO 2006/060582 werden Zusammensetzungen geoffenbart, die zur Inhibierung von nematoden Schäden in Pflanzen verwendet werden können. Diese Zusammensetzungen umfassen Extrakte von Juglon produzierenden Pflanzen. Die in der WO 2006/060582 beschriebenen Zusammensetzungen umfassen Juglon in einer Mindestkonzentration von 1000 ppm (1 g/L) . Bei diesen Konzentrationen können bei Pflanzen, insbesondere bei Kulturpflanzen, phytotoxi- sche Effekte auftreten.
CN 1 781 376 betrifft Pflanzenextrakte, welche geeignet sind als Pestizide eingesetzt zu werden. Diese Extrakte werden von Pflanzen gewonnen, die Juglon umfassen.
In der US 2006/003894 werden verschiedenste Substanzen geoffenbart, die geeignet sind, das Wachstum von Pflanzenschädlingen im Wasser zu kontrollieren. Die in dieser US-Schrift geoffenbarten Zusammensetzungen umfassen Naphthalendion .
In der WO 2000/08495 werden verschiedenste Naphthochinone und deren Derivate geoffenbart.
EP 1 051 909 betrifft Naphthochinone, die geeignet sind Schädlinge zu bekämpfen.
In der WO 2000/56140 werden Verfahren und Mittel zur Bekämpfung von Schädlingen geoffenbart, welche im Wasser vorkommen. Diese Mittel umfassen insbesondere Juglon und Juglonanaloga.
In der JP 4 295 402 werden Juglonglukoside geoffenbart.
Brockmann et al . (Liebigs Annalen der Chemie, 1983 (1983): 433-447) beschäftigen sich mit der regioselektiven Synthese verschiedenster Chinone.
Die im Stand der Technik beschriebenen Mittel zur Bekämpfung von bakteriellen und Pilz- Infektionen, insbesondere zur Bekämp- fung von Erwinia-Infektionen bzw. zur Bekämpfung des Feuerbranderregers Erwinia amylovora, weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Viele der verwendeten Substanzen können für Tiere und Menschen gesundheitsschädlich sein. Andere Substanzen weisen hingegen eine zu geringe Wirksamkeit gegenüber Pilzen bzw. Bakterien, wie Erwinia, auf, so dass durch einen erhöhten Wirkstoffeinsatz die Wirtschaftlichkeit nicht mehr gegeben ist und die Umwelt höher belastet wird.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen mit deren Hilfe Erwinia und insbesondere der Feuerbranderreger Erwinia amylovora effizient bekämpft werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel (A)
Figure imgf000004_0001
oder der Formel (B)
Figure imgf000004_0002
wobei Rl, R4 und R5 unabhängig voneinander H, ein Glykosid ode ein Ester ist, als Pflanzenschutzmittel, wobei das Pflanzenschutzmittel die Verbindung in einem Lösungsmittel gelöst in e ner Konzentration von 0,1 μΜ bis 2 mM umfasst.
Figure imgf000005_0001
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon, 1,4,5- Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside oder Ester davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Pflanzenschutzmittel umfassend mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel ( I ) oder Formel ( I I ) :
Figure imgf000005_0002
Formel I Formel I I wobei Rl , R4 und R5 unabhängig voneinander ein Glykosid-Rest , ein addiertes Aldehyd, ein addiertes Keton, ein Rest einer organischen Säure, ein Rest einer anorganischen Säure oder ein ali- pathischer Rest, und R2 , R3 , R6 , R7 und R8 unabhängig voneinan- der ein Halogen oder Wasserstoff ist, sowie Addi ionsprodukte von S- und N-haltigen Verbindungen an Verbindungen der allgemeinen Formel II und Polymere beider Formeln und ihrer jeweiligen Derivate in einer Konzentration von 0,1 μΜ bis 2 oder 5 mM.
Es hat sich überraschender Weise herausgestellt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und die Verbindungen mit den allgemeinen Formeln (I) und (II) und insbesondere 5-Hydroxy-l , 4- Naphthochinon (Juglon) , sowie 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin
und/oder Derivate bzw. Glykoside oder Ester davon, die solches freisetzen können, geeignet sind, insbesondere bakterielle und/oder pilzliche Pflanzenschädlinge wie Erwinia amylovora aktiv im Wachstum zu hemmen und abzutöten. Über die unerwartet hohe und spezifische Wirkung hinaus, war die Verwendung von derartigen Verbindungen als Pflanzenschutzmittel nicht naheliegend, da z.B. 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon (Juglon) in der Literatur vielfältig als phytotoxisch beschrieben ist ( " Allelopathie" ) (Weiler, Nover 2008) . Jedoch stellte sich überraschend heraus, dass es durch die hohe Aktivität gegen unter anderem Erwinia amylovora bei entsprechenden Konzentrationen einen Konzentrati - onsbereich gibt, in dem der phytotoxische Effekt nicht oder kaum zum Tragen kommt und mit dem unter anderem Erwinia und insbesondere Erwinia amylovora effizient bekämpft werden kann. Für die praktische Anwendung von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon (Juglon) gegen Erwinia amylovora ist die höchste Konzentration mit noch akzeptabler Phytotoxizität (hier vor allem als Fruchtberostung) bei ein- oder mehrmaliger Anwendung während der Blüteperiode anzustreben .
Juglon ist eine bezüglich ihrer phytotoxischen ("allelo- pathischen") Wirkung besonders auf Keimlinge vielfach untersuchte Substanz. Der heimische Walnussbaum (Juglans regia) und auch andere Juglandaceae verhindern in einem natürlichen Prozess das Aufkommen von konkurrierendem Pflanzenbewuchs an ihrem Standort. Es wird der Vorläufer 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin-glucosid gebildet. Dieser wird über Niederschläge aus dem Laub ausgewaschen sowie über die Wurzeln freigesetzt und im Boden durch mikrobiel- le Glucosidasen zu 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin hydrolysiert . Dieses wird dann zur aktiven Substanz Juglon oxidiert (Weiler und Nover 2008) . Juglon kann aber sogar benachbarte Holzpflanzen durch kumulative Wirkung schädigen oder zum Absterben bringen. Für Apfelbäume wurde dies als Feldbeobachtung bereits früh be- schrieben (Schneiderhan 1927). Nach diesem Kenntnisstand scheint die Verwendung von Juglon trotz des Vorliegens von Publikationen zur allgemeinen oder speziellen antimikrobiellen Wirkung von Chinonen (z.B. Didry et al . 1998 für 1 , 4-Naphthochinone , Jin and Sato 2003 für Benzochinon / Erwinia amylovora) von vornherein ausgeschlossen. Angesichts der speziellen Feuerbrand-Obstanbau- Problematik mit nur sehr kurzen Primärinfektionszeiten und einem dadurch zeitlich ohnehin nur sehr beschränkten Applikationszeitraum für entsprechende Pflanzenschutzmittel, kommt auch die kurzfristige Anwendung von Substanzen mit phytotoxischen Effekten in Frage. Dies gilt im Besonderen, als sich Juglon als aktiv (wirksamer als andere Chinone, auch 1 , 4-Naphthochinone wie Plum- bagin) gegen Erwinia, insbesondere Erwinia amylovora, erweist. Die Kombination niedriger Applikationskonzentrationen mit einem zeitlich engen Applikationszeitraum stellt das Potential von Juglon und seinen Derivaten als erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel gegen Erwinia amylovora dar.
Erfindungsgemäß können im Pflanzenschutzmittel auch interme¬ diäre Oxidationsstufen der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie z.B. Juglon als Semichinonradikal , umfasst sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Glykosid-Rest ein Glucosyl-, Mannosyl-, Galacto- syl-, Fructosyl-, Ribosyl-, Arabinosyl-, Rhamnosyl- oder Xylo- syl-Rest .
Das addierte Aldehyd oder Keton der erfindungsgemäßen Verbindung enthält vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome .
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rest der organischen Säure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Malonyl-, Pyruvoyl-, Succinyl-, 2-Oxo- glutaroyl-, Oxalessigsäure- , Fumarsäure-, Weinsäure- und Citro- nensäure-Gruppe .
Der Rest der anorganischen Säure ist vorzugsweise ein Phosphorsäure- oder Schwefelsäurerest.
Der Rest der Ether ist vorzugsweise ein Methyl- oder Ethylrest.
Das Halogen ist vorzugsweise Iod, Brom, Chlor oder Fluor ist .
Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch als 1,2- oder 1,4- Additionsprodukt der Chinonform (Formel II) vorliegen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann ebenfalls als Polymer vorliegen und ein entsprechende antimikrobielle Aktivität entfalten. Das Polymer ist vorzugsweise 3,3' Bijuglon oder Cyc- lotri uglon .
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere 5-Hydroxy- 1 , 4 -Naphthochinon, dessen reduzierte Form 1,4,5- Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside und Ester davon, sind Substanzen, die in der Natur, insbesondere in Pflanzen, natürlich vorkommen. Daher kann das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel die Verbindungen in synthetischer Form aber auch in Form eines Pflanzenextrakts umfassen. Diese Extrakte werden vorzugsweise aus dem Laub oder den Nüssen der Walnuss Juglans regia (o- der anderen Juglandaceen bevorzugt Juglans ailanthifolia (syn. J. sieboldiana) , J. cathayensis (syn. J. draconis) , J. cinerea, J. hindsii, J. microcarpa (syn. j. rupestris), J. nigra, J. ste- nocarpa; Carya lacinosa, C. pecan (syn. C. olivaeformis ) , C. to- mentosa; Pterocarya caucasica, P. fraxinifolia , P. hupehensis, P. rhoifolia, P. stenoptera (siehe Hegnauer R, Chemotaxonomie der Pflanzen, Band IV (1966) : 281, Hegnauer R, Chemotaxonomie der Pflanzen, Band VIII (1989) : 575) gewonnen. Diese Verbindungen können jedoch auch aus anderen Quellen isoliert werden (z.B. Penicillium diversum; Balsaminaceae (Hegnauer R, Chemotaxonomie der Pflanzen, Band VIII (1989) : 101; Proteaceae: Hegnauer R, Chemotaxonomie der Pflanzen, Band IX (1990) : 297) . Um die gewünschte Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen im Extrakt zu erhalten, wird dieser entsprechend verdünnt oder aufkonzentriert. Selbstverständlich ist es auch möglich, synthetisch hergestellte Verbindungen der vorliegenden Erfindung in den Extrakt zu geben, um die gewünschte Konzentration zu erzielen. Juglon oder deren Derivate können über LC-MS (liquid chro- matography-mass spectrometry) bestimmt werden, oder über Chinon- reaktionen, z.B. Farbreaktion mit Leucomethylenblau (Abbul-Hajj 1978) .
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben zusätzlich den Vorteil, dass diese auch für Insekten, wie z.B. Bienen, unschädlich, d.h. nicht fraß- und kontakt-giftig, sind. Viele bisher verwendete Pflanzenschutzmittel, die gegen Erwinia Infektionen eingesetzt werden, weisen diesen Vorteil nicht auf und sind gegenüber nützlichen Insekten schädlich.
Vorzugsweise sind im erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 0,5 uM bis 4 m oder 0,5 uM bis 1,5 mM, vorzugsweise von 1 uM bis 1 oder 2 mM, noch mehr bevorzugt von 5 uM bis 0,5 oder 1 mM, umfasst. Diese Mengen an Wirkstoff sind für die gewünschte Wirkung beim Aufbringen des Pflanzenschutzmittels auf Pflanzen, insbesondere auf die Blüten, ausreichend. Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Konzentrationen von maximal 2 oder 5 mM, vorzugsweise von maximal 2 oder 3 mM, noch mehr bevorzugt von maximal 1 oder 2 mM, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise in einem wässrigen und/oder organischen Lösungsmittel gelöst, um die erfindungsgemäß geforderte Konzentration im Pflanzenschutzmittel zu erreichen. Die dabei verwendeten Lösungsmittel können unter anderem Wasser oder sonstige organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Alkohole, wie Ethanol umfassen. Beim Herstellen des erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittels können die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise zunächst in einem Alkohol wie Ethanol gelöst und anschließend in Wasser oder einem sonstigen wässrigen Medium zur Herstellung von Pflanzenschutzmittel auf die erfindungsgemäße Konzentration verdünnt werden. Zusätzlich können im erfindungsgemäßen wässrigen Lösungsmittel Puffersubstanzen und der gleichen vorhanden sein, welche üblicherweise Pflanzenschutzmitteln zugesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel kann besonders gut zur Bekämpfung von Erwinia amylovora bei Kulturpflanzen eingesetzt werden. Beispielhafte Kulturpflanzen, welche häufig von Erwinia amylovora befallen werden, entstammen vorwiegend aus der Familie der Rosengewächse (Rosaceae) . Besonders anfällig ist dabei die Unterfamilie der Kernobstgewächse (Maloideae) . Im Holz von Kernobstgewächsen ist Erwinia amylovora zudem in der Lage zu überwintern. Daher ist es besonders bevorzugt das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel bei Rosengewächsen, vorzugsweise bei Kernobstgewächsen, insbesondere bei Äpfeln der Sorten Berlepsch, Braeburn, Cox Orange, Granny Smith, Elstar, Fuji, Gala, Gloster, Gravensteiner , Idared, James Grieve, Jonagold-Gruppe, Jonathan, Weißer Klarapfel, Topaz und Vista Bella, und bei Birnen der Sorten Abbate Fetel, Conference, Williams Christ, Vereinsdechants , Gellerts Butterbirne, Harrow Sweet, Clapps Liebling, Comice, Concorde, Frühe von Trevoux, Gute Luise, Bosc's Flaschenbirne (Kaiser Alexander) , Pastorenbirne und Passa Crassana zu verwen- den. Neben Kulturpflanzen können auch Ziergehölze wie Quitten, Mispeln, Speierling, Eisbeere, Mehlbeeren wie Vogelbeere/Eberesche und Echte Mehlbeere, Apfelbeeren, Zierquitten, Weißdorne wie Rotdorn und Feuerdorn, Wollmispeln, Zwergmispeln und Glanzmispeln/Stranvaesia mit dem erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel behandelt werden, um Erwinia amylovora auf diesen Pflanzen zu bekämpfen.
Mit dem erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel kann besonders gut Erwinia amylovora bekämpft werden. Jedoch eignet sich das Pflanzenschutzmittel auch zur Bekämpfung anderer Erwinia- Arten, die als Pflanzenpathogene wirksam sind. Hierbei seien Erwinia carotovora (verursachen die Schwarzbeinigkeit bei Kartoffelpflanzen und die Nassfäule bei Kartoffelknollen) , Erwinia billingia und Erwinia cypripedii genannt.
Die Substanzen 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon (Juglon) bzw. 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin können auf verschiedenste Weise gewonnen werden. Einerseits können beide Substanzen synthetisch nach bekannten chemischen Verfahren hergestellt, andererseits können beide Substanzen aus z.B. Laub oder Nüssen der Walnuss Juglans regia (oder anderen Juglandaceen) extrahiert werden (z.B. mit Ethanol oder einem azeotropen Wasser-Ethanolgemisch in einer Soxhlet-Apparatur ) . Auch die Synthese der erfindungsgemäßen Derivate kann nach bekannten Verfahren erfolgen (z.B. durch Chromat-Oxidation von 1 , 5-Dihydroxynaphthalin) .
Die „Derivate" von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon und 1,4,5- Trihydroxynaphthalin sind „ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glykosiden, Halbacetalen, Vollacetalen, Estern, Ethern, Polymeren und 1,2- oder 1 , 4-Additionsprodukten sowie halogen- ringsubstituierte Derivaten" . Daher umfasst der Begriff „Derivat" im Sinne der vorliegenden Erfindung ausschließlich Substanzen, die von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon und 1,4,5- Trihydroxynaphthalin abgeleitet sind und deren Hydroxy- bzw. Ke- to-Gruppen glykosidiert , verestert, verethert, acetalisiert , po- lymerisiert, an andere Moleküle addiert oder deren Ringsysteme halogeniert sind. Ein besonders bevorzugtes Derivat ist das in Blättern und Früchten des Walnussbaums eingelagerte 1,4,5- Trihydroxynaphthalin-4-glucosid. Nach dem Aufbringen von 1,4,5- Trihydroxynaphthalin-4-glucosid auf die Pflanzen wird dessen Glucose-Rest enzymatisch oder chemisch abgespalten und es entsteht durch die Spaltung die chemische Verbindung 1,4,5- Trihydroxynaphthalin ( "Hydrojuglon" ) . Aus diesem bildet sich nach einer Oxidationsreaktion der Stoff Juglon (5-Hydroxy-l, 4- Naphthochinon) .
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um- fasst das Pflanzenschutzmittel 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin bzw. 1 , ( 5-Trihydroxynaphthalin-4-glucosid. Sowohl 1,4,5- Trihydroxynaphthalin als auch 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin-4- glucosid werden nach dem Aufbringen auf die Pflanze über die Zeit in 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon umgewandelt. Dies hat den Vorteil, dass die Wirkung auf der Pflanze gegenüber Erwinia, z.B., länger anhält, da 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon nach und nach freigesetzt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Derivat von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon und
1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin ausgewählt aus der Gruppe
1,4, 5-Trihydroxynaphthalin-4-glucosid,
diverser 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin-glykoside (Zahl der Reste, 1 , 4 , 5-Position und Glykosylrest ( e) variabel),
5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon-5-glucosid (aber Glykosylrest variabel) ,
1,4, 5-Trihydroxynaphthalin-mono- /-di-/-tri-essigsäureester (aber
Acyl-Rest(e) variabel),
1,4, 5-Trihydroxynaphthalin-mono-/-di-/-tri-phosphorsäureester, 1,4, 5-Trihydroxynaphthalin-mono-/-di-/-tri-schwefelsäureester, 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon-5-essigsäureester (aber Acyl-Rest variabel) ,
5-Hydroxy-1 , 4-Naphthochinon-5-phosphorsäureester,
5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon-5-schwefelsäureester ,
5-Halb- und 5-Vollacetale von 5-Hydroxy-l, 4-Naphthochinon, Halb- und Vollacetale von 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin (Zahl der Reste und Position(en) variabel),
5-Methyl- und 5-Ethyl-ether von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon
(aber Alkyl-Rest variabel) ,
Methyl- und Ethyl-ether von 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin (Zahl der Reste und Position(en) variabel, aber auch Alkyl-Rest variabel), definierbare oder unspezifische Polymere von 5-Hydroxy-l , 4- Naphthochinon oder 1 , 4 , -Trihydroxynaphthalin,
diverser reversibler 1,2- oder 1 , 4-Additionsprodukte von 5- Hydroxy-1 , 4-Naphthochinon mit S- oder N-haltigen Verbindungen, am Ringsystem halogenierter Derivate aller oben genannten Ver- bindungen .
In der folgenden Tabelle sind die bevorzugten Substituenten der allgemeinen Verbindung mit der Formel (I) und (II) bzw. (A) und (B) aufgelistet.
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Diese Wirkstoffe können direkt in Wasser gelöst, oder in ei- nem organischen Lösungsmittel (bevorzugt Ethanol) vorgelöst und vor der Anwendung in Wasser verdünnt, oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, werden 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin- 4-glucosid, 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin, 5-Hydroxy-l , 4- Naphthochinon oder Gemische dieser (durch die Art der Isolation beeinflussbar) aus Juglandaceen-Pflanzenmaterial , besonders Laub von Juglans- oder Carya-Arten, isoliert und als verdünnte Pflanzenpräparate zur Anwendung gebracht. Eine andere mögliche Quelle für Juglon ist Penicillium diversum oder verwandte Organismen.
Das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel kann Tenside umfassen, die keine der bakteriziden Wirkung abträglichen chemischen Reaktionen mit Chinonen eingehen (z.B. Tween 20 (0,005-0,1 Vol%) , aber auch natürliche Stoffe mit Tensidwirkung) . Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel Na- und K-Seifen, oder handelsübliche Netzmittel, wie z.B. Agrowax 010, Break thru, Citowett, Exzellent CS 7, Neo-Wett, Agronetz, Ajutol, Silwet top, Zellex CS.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon, 1,4,5- Trihydroxynaphthalin und/oder Derivate oder Ester davon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glykosiden, Halbacetalen, Vollacetalen, Estern, Ethern, Polymeren, 1,2- oder 1,4- Additionsprodukten sowie halogen-ringsubstituierte Derivaten als Pflanzenschutzmittel .
Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von Erwinia, vorzugsweise Erwinia amylovora, verwendet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen und/oder Pilz- Infektionen, vorzugsweise Erwinia-Infektionen, insbesondere Erwinia amylovora-Infektionen, bei Pflanzen umfassend den Schritt des Aufbringens eines Pflanzenschutzmittels wie hierin definiert auf Blüten- und/oder Blattwerk der Pflanzen.
Erfindungsgemäß kann das hierin geoffenbarte Pflanzenschutzmittel mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren auf das Blüten- und Blattwerk der zu behandelnden Pflanzen aufgebracht werden. Üblicherweise erfolgt das Aufbringen von Pflanzenschutzmittel durch Spritzen, Sprühen oder Stäuben.
Da die Primärinfektion bei Kernobst in der Regel über die Blüte durch Bienen, insbesondere wenn feuchtwarme Wetterbedin- gungen herrschen, stattfindet, ist es besonders bevorzugt zu diesem Zeitpunkt das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel einzusetzen. Durch die nur kurzzeitige Anwendung während der Obstblüte werden bei dieser Ausführungsform kumulative phytotoxische Effekte auf die Obstbäume vermieden. Das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel 5-Hydroxy-l , 4-naphthochinon (Juglon) hat sich bei im Auftrag durchgeführten Untersuchungen als nicht fraß- o- der kontakt-giftig für Bienen herausgestellt.
Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass es von Vorteil ist, die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere 5-Hydroxy- 1 , 4-Naphthochinon, 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside oder Ester davon, bei reduzierter UV-Strahlung auf die Pflanzen aufzubringen, da diese Verbindungen vor allem in Anwesenheit von UV-Strahlen verhältnismäßig rasch an antimikrobieller Aktivität verlieren. Daher wird das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel vorzugsweise in der Dämmerung, sprich reduzierter UV- Einstrahlung, oder bei Dunkelheit auf die Pflanze aufgebracht.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Pflanzenschutzmittels umfassend eine Verbindung gemäß der Formel (A)
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R5
oder der Formel
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wobei Rl, R4 und R5 unabhängig voneinander H, ein Glycosid oder ein Ester ist, umfassend den Schritt des Lösens von der im Wesentlichen kristallinen Verbindung der allgemeinen Formel (A) oder (B) in einem Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1 uM bis 2 mM oder des Einstellens oder Verdünnens eines Pflanzenextrakts umfassend die Verbindung der allgemeinen Formel (A) oder (B) so dass das Pflanzenschutzmittel die Verbindung in einer Konzentration von 0,1 μΜ bis 2 mM umfasst.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, welche in kristalliner Form bereitgestellt werden können, können unter anderem durch Lösen in einem Lösungsmittel zu einem Pflanzenschutzmittel formuliert werden. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in fester Form lässt sich das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel in einfacher Weise im geforderten Konzentrationsbereich herstellen, in dem die eingewogene Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer entsprechenden Menge an Lösungsmittel vermengt wird. Sind erfindungsgemäße Verbindungen Teil eines Pflanzenextrakts, so wird zunächst die Menge der in diesem Extrakt vorhandenen erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmt, um im Anschluss daran den Extrakt entsprechend mit einem Lösungsmittel zu verdünnen bzw. mit weiteren in fester oder flüssiger Form vorhandenen erfindungsgemäßen Verbindungen zu versetzen .
Gemäß einer besonders bevorzugten Aus führungs form der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung 5-Hydroxy-l , 4- Naphthochinon, 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside oder Ester davon.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Pflanzenschutzmittel, welches nach einem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung wird weiters anhand der folgenden Figuren und Beispiele eingehender erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1A bis 1D zeigt Wachstumshemmungen (Zelldichte gemessen als optische Dichte bei 600 nm) durch Juglon und vergleichend Plumbagin auf Suspensionkulturen von Erwinia amylovora: Oben: das 1 , 4-Naphthochinon Juglon 0,01 / 0,05 / 0,1 mM, Kontrolle mit gleichem Volumen des Lösungsmittels Ethanol, und Kontrolle mit reinem KB-Medium. Zweite Grafik: Wiederholung mit 0,01 mM Juglon und niedrigeren Konzentrationen (0,005 / 0,001 mM) . Dritte Grafik: 0,1 und 1 mM Plumbagin (die initiale Absorptionsänderung bei 1 mM Plumbagin wird durch eine Reaktion mit dem Medium verursacht) . Vierte Grafik: Positiv-Kontrolle mit dem konventionellen gegen Erwinia amylovora eingesetzten Pflanzenschutzmittel Streptomycin (Antibiotikum) .
Fig. 2 zeigt den wachstumshemmenden Effekt von 0,05 and 0,1 mM Juglon auf Erwinia carotovora. E: Kontrolle mit gleichem Volumen des Lösungsmittels Ethanol, K: Kontrolle mit reinem KB- Medium .
Fig. 3 zeigt Birnen-Inokulationstests durch Präinkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Juglon (und Streptomycin als Kontrolle) und nachfolgender (15 min) Inokulation mit Erwinia amylovora. Bild nach 6 Tagen Inkubation bei 25°C. Kulturplatte als Kontrolle für die Vitalität der eingesetzten Erwinia amylovora Zellen.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Studie zum Vergleich der Wirkung von Vertretern dreier Klassen von Chinonen gegen Erwinia amylovora .
In den folgenden Beispielen wurde der Effekt von 1,4- Naphthochinonen auf Pflanzen-pathogene Spezies von Erwinia eva- luiert um ihr Potential als Pflanzenschutzmittel zu bewerten. Die 1 , 4-Naphthochinone Juglon ( 5-Hydroxy-1 , 4-Naphthochinon) und Plumbagin ( 5-Hydroxy-2-methyl-l , -naphthochinon) wurden auf ihre Wirkung gegen Erwinia amylovora und Erwinia carotovora getestet.
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Juglon Plumbagin
Beispiel 1:
Inhibitorischer Effekt von 1 , 4-Naphthochinonen auf das Erwi- nia amylovora Wachstum in in-vitro-Suspensionskulturen
Die 1 , 4-Naphthochinone Juglon und Plumbagin wurden auf einen wachstumshemmenden Effekt in in-vitro-Suspensionskulturen von Erwinia amylovora getestet. Streptomycin als konventioneller Wirkstoff gegen Erwinia amylovora wurde als Positivkontrolle benutzt (vgl. Fig. 1A bis 1D) .
Schlussfolgerung
Aus dieser Serie von Experimenten kann geschlossen werden, dass 1 , 4-Naphthochinone aktiv und besonders Juglon aktiv gegen Erwinia amylovora ist. Letzteres wirkt wie Streptomycin im sub- millimolaren Konzentrationsbereich .
Bakteriostatischer versus bakterizider Effekt
Die Wachstumskurven der Suspensionskulturen in Gegenwart verschiedener Juglon-Konzentrationen belegen eine Hemmung des Wachstums von Erwinia amylovora. Diese Experimente geben aber keine Information über die Natur des zugrunde liegenden Effektes, der lediglich bakteriostatisch (nur Wachstumshemmung, kein direktes Abtöten von Zellen) oder auch bakterizid (Abtöten von Zellen) sein könnte. Dies kann aber durch Ausplattieren von Ali- quots der Suspensionskulturen mit Wirkstoff auf Wirkstofffreie Festmedien festgestellt werden. Auf solchen Festmedien wird der Wirkstoff aus dem kleinvolumigen Aliquot durch Diffusion unter einen Schwellenwert verdünnt, so dass sich, falls Zellen lediglich gehemmt aber nicht abgetötet waren, nach Inkubation Kolonien bilden. Solche Ausplattierungstests wurden mit 0,1 mM Juglon in der Suspensionskul ur durch Entnahme von Aliquots in einer Zeitreihe durchgeführt. Als Kontrolle diente eine Kultur die mit einem entsprechenden Volumen des Lösungsmittels für das Ju- glon (Ethanol) versetzt worden war. Eine Wiederholung des Experiments mit nur 0,01 mM Juglon wurde ebenfalls durchgeführt, mit Verdünnungsreihen für die jeweiligen Aliquots zur genauen Titerbestimmung. Nur für die Zeitpunkte unmittelbar nach Zugabe von Juglon konnte in beiden Testreihen noch Koloniebildung beobachtet werden, nach jeder längeren Inkubation (schon nach 30 min) fand keine Kolonienbildung aus überlebenden Zellen mehr statt.
Sehl ussfolgerung
Juglon hat einen starken bakteriziden Effekt auf Erwinia amylovora .
Effekt auf andere Spezies von Erwinia
Verschiedene andere Spezies von Erwinia sind ebenfalls bedeutsame Phytopathogene . Das Bakterium Erwinia carotovora wurde als Beispiel für eine andere Erwinia Spezies ausgewählt. Der Effekt des 1 , 4-Naphthochinons Juglon auf das Wachstum von Erwinia carotovora in Suspensionskultur wurde mit der gleichen Methodik wie im Fall von Erwinia amylovora getestet.
Es stellte sich heraus, dass das Wachstum von Erwinia carotovora in Suspensionskultur durch 0 , 1 mM Juglon vollständig inhibiert wird, aber, anders als bei Erwinia amylovora, nicht durch niedrigere Konzentrationen (vgl. Fig. 2).
Schlussfolgerung
Juglon besitzt auch für andere Erwinia Spezies einen wachstumshemmenden Effekt in Suspensionskultur, zumindest für Erwinia carotovora ist dieser Effekt aber schwächer als für Erwinia amylovora .
In-vitro Infektionstests mit Blüten des Apfels (M. x dorn. )
In in-vitro Infektionstests mit Apfelblüten wurden Juglon sowie vergleichend das 1 , 4-Naphthochinon Plumbagin und 1,4- Benzochinon getestet. Streptomycin wurde dabei als Positivkontrolle verwendet.
Tabelle 1: In-vitro Infektionstests an Apfelblüten (Malus x do- mestica) mit Juglon sowie Plumbagin und 1 , 4-Benzochinon. Streptomycin als Positivkontrolle.
Figure imgf000019_0001
Besonders die Anwendung von 0,01 mM Juglon in den in-vitro Infektionstests zeigt einen hohen Wirkungsgrad von 67%, im direkten Vergleich zu 75% für das konventionelle Pflanzenschutzmittel Streptomycin . Für die Chinone wurde dabei noch keine Formulierung (v.a. Tenside zur Benetzung) verwendet, die eine Erhöhung des Wirkungsgrades bewirken dürften.
Sehl ussfolgerung
Juglon besitzt ein gutes Potential als Wirkstoff zur Kontrolle von primärem Feuerbrand (Blüteninfektionen) .
Inokulationstests mit Birnenfrüchten (Pyrus communis)
Inokulation von unreifen Birnenfrüchten mit Erwinia amylovo- ra (ein Testsystem das auch nach der Obstblüte zur Verfügung steht) wurde benutzt, um die Wirkung von Juglon gegen Erwinia amylovora auszutesten. Anders als im Blütensystem muss hierbei aber mit Verwundungen des Pflanzengewebes gearbeitet werden. Ergebnisse die mit diesem System erzielt werden sind bekanntermaßen schwieriger zu reproduzieren und zu bewerten. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 fotografisch dokumentiert. Es wurden zwei verschiedene Birnensorten eingesetzt.
Die Entwicklung von schwarzen nekrotischen Läsionen des Pflanzengewebes und die Bildung von weißem bakteriellem Schleim (Exsudat) wurden als Kriterien zur Beurteilung des Ausmaßes der Infektion benutzt. Nekrotischen Läsionen wurden im Experiment bei beiden Sorten (Williams Christ und Bosc ' s Flaschenbirne) beobachtet, während Exsudat-Bildung nur bei der Sorte Williams Christ beobachtet werden konnte. Für die eingesetzte niedrige Streptomycin-Konzentration von 0,01 mM in der Positivkontrolle wurden zwar nekrotische Läsionen bei beiden Sorten beobachtet, diese waren aber gegenüber der Inokulation mit Erwinia amylovora ohne das Antibiotikum etwas vermindert, es gab auch keine Exsudat-Bildung .
Sehlussfolgerung:
0,1 mM Juglon zeigte in diesem System einen etwa vergleichbaren Effekt wie 0,01 mM Streptomycin .
Phytotoxizität bei Apfel- und Birnenblüten und für die nach folgende Fruchtentwicklung
Die Phytotoxizität von Juglon und vergleichend von Plumbagin wurde an Blüten von zwei Apfelsorten (Smoothy, einem Golden De- licious Abkömmling, und Idared) als auch einer Birnensorte (Williams Christ) unter Anbaubedingungen in einer Spalierbaumpflanzung zur Obstblüte getestet. Dabei wurden jeweils die Konzentrationen eingesetzt, die sich in den in-vitro-Suspensionskulturen als vollständig wirksam (kein Bakterienwachstum) herausgestellt hatten. Verschiedene Konzentrationen wurden getestet (0,005 - 0,05 mM Juglon und 0,1 - 0,5 mM Plumbagin) (Tabelle 2) . Kontrollbehandlungen mit Wasser und mit den bei den Wirkstoff lösungen eingesetzten Ethanolkonzentration (0,5 and 5%, zum Vorlösen der Wirkstoffe) wurden durchgeführt und zeigten wie zu erwarten keine Effekte.
Tabelle 2: Überblick der bezüglich Phytotoxizität an Blüten rsp. Fruchtentwicklung von Apfel- und Birnensorten getesteten Konzentrationen von Juglon und Plumbagin.
Birne Apfel
cv. Williams cv. Smoothy cv. Idared Christ
Juglon [mM] 0,005 / 0,01 0,005 / 0,01 / 0,005 / 0,01 /
0,025 / 0,05 0, 05
Plumbagin [mM] 0,1 / 0,5 0,1 / 0,5 Phytotoxizität als Verbräunungsreaktion auf den Petalen
Für Juglon wurden leicht braune Flecken auf den Petalen von Apfelblüten (Smoothy und Idared) für 0,025 mM Juglon beobachtet, deutlichere Flecken für 0,05 mM. Kein Effekt konnte auf den Petalen von Birnenblüten (Williams Christ) beobachtet werden.
Im Vergleich wurden für Plumbagin (0,1 und 0,5 mM) braune Flecken sowohl auf den Petalen von Birne (Williams Christ) als auch Apfels (Smoothy und Idared) beobachtet. Diese Verbräunungs- reaktionen waren für die höhere Konzentration (0,5 mM) deutlicher als für die niedrigere (0,1 mM) .
Phytotoxizität bezüglich Fruchtansatz
Es konnten im beschriebenen Rahmen der Versuche keine Effekte auf den Fruchtansatz festgestellt werden.
Phytotoxizität bezüglich Fruchtberostung
Es konnte weder durch die Juglon- noch durch die Plumbagin- Behandlungen Fruchtberostung festgestellt werden.
Schlussfolgerung
Es konnten im beschriebenen Rahmen der Versuche keine für die Fruchtproduktion relevanten phytotoxischen Effekte festgestellt werden. Die Verbräunungen der kurzlebigen Petalen waren nicht von Veränderungen bezüglich Fruchtquantität oder -qualität begleitet .
Diskussion der Toxizität und Abbaubarkeit von Juglon
Beide 1 , 4-Naphthochinone, Juglon und Plumbagin, sind natürliche pflanzliche Sekundärmetabolite . Beim Juglon handelt es sich um eine wohl bekannte bioaktive Verbindung aus der Walnuss (Juglans regia) (und anderen Juglandaceae) , während Plumbagin aus nordamerikanischen Drosera Spezies (Drosera rotundifolia, Drose- raceae) , Plumbago Spezies (Plumbaginaceae) und Diospyros Spezies (Ebenaceae) stammt. Als solche werden beide Verbindungen aus lebenden (Juglans regia, Weiler Nover 2008) oder in jedem Fall aus sich zersetzenden Pflanzengeweben freigesetzt und danach mikro- biell abgebaut. Phytotoxische ( "allelopathische" ) Wirkung von Juglon auf andere Pflanzen durch Freisetzung der Vorläufersubstanz 1 , 4 , 5-Trihydroxynaphthalin-glucosid sind für die Walnuss (Juglans regia) (vgl. Zusammenfassung in Weiler and Nover 2008) und andere Juglandaceae beschrieben. Im Hinblick auf eine Anwendung als erfindungsgemäßes Pflanzenschutzmittel sind solche phytotoxischen Wirkungen auf die Obstbäume angesichts der submilli- molaren Konzentrationen und des extrem kurzen Anwendungszeitraumes gegen primären Feuerbrand nur während der Obstblüte nicht zu erwarten .
Beide Substanzen, Juglon und Plumbagin sind als Reinsubstanzen als giftig eingestuft (R-Sätze) , Juglon weist aber einen hohen LD50-Wert (Ratte) auf. Dem steht das Vorkommen von Juglon in der Walnuss als einer Nutzpflanze für die Ernährung gegenüber. Der Mensch ist speziell beim Entfernen des Exokarps der Nüsse dem Juglon stark über die Haut exponiert (als Schwarzfärbung der Finger erkennbar (Oxidation, Polymerisation) ) . Es ist auch als Bestandteil von Wollfärbemitteln und zur Behandlung von Venenerkrankungen im Gebrauch. Des Weiteren werden sogar alkoholische Getränke auf der Basis unreifer Walnüsse traditionell und kommerziell erzeugt und konsumiert ( "Nuss-Schnaps ") . Vorbehaltlich einer erforderlichen genauen Bewertung als erfindungsgemäßes Pflanzenschutzmittel wird Juglon daher zunächst als eher unbedenklich angesehen.
Vergleichend kann über Plumbagin gesagt werden, dass entsprechende Pflanzenextrakte zur Behandlung oraler Infektionen vorgeschlagen wurde (Didry et al . 1998) .
Beispiel 2:
Studie zum Vergleich der Wirkung von Vertretern dreier
Klassen von Chinonen gegen Erwinia amylovora
Exemplarische Vertreter von drei Klassen von Chinonen wurden in ihrer Wirkung anhand ihrer Effekte auf das Wachstum von Suspensionskulturen von Erwinia amylovora vergleichend untersucht.
Grundstrukturen von 3 Klassen von Chinonen
Figure imgf000022_0001
1 , 4-Benzochinone 1 , 4-Naphthochinone Anthrachinone
Im Vordergrund steht dabei die jeweilige Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung. Durchführung
Die speziellen Vertreter der drei Klassen von Chinonen wurden einheitlich als 1 mM Lösung in Ethanol vorgelöst und dann auf die jeweiligen Endkonzentrationen im Kulturmedium verdünnt. Entsprechende Kontrollen mit gleichen Volumina Ethanol ohne Wirkstoff wurden durchgeführt (Fig. 4, "KE"). Es wurde dabei speziell ein niedriger Konzentrationsbereich unter 100 uM genau betrachtet, bei dem unspezifische, schwache antibakterielle Effekte nicht mehr zum Tragen kommen.
Verwendete Vertreter der 3 Klassen von Chinonen
Figure imgf000023_0001
1 , 4-Benzochinon 1 , 4-Naphthochinone : Anthrachinone :
Juglon Anthrachinon
Alizarin
Fig. 4 zeigt die Verläufe der Wachstumskurven in Gegenwart der verschiedenen Vertreter der Klassen in Abhängigkeit von der Konzentration (50 / 25 / 12,5 / 10 / 5 / 2,5 uM) . Es wird deutlich (hervorzuheben sind die Verläufe für 10 uM bis 25 uM) , dass in diesem Konzentrationsbereich kein Vertreter anderer Chinon- Klassen eine dem Juglon annähernd vergleichbare Wirkung besitzt. Erst bei der niedrigen Konzentration von 5 uM Juglon tritt nach langer Inkubationszeit erneut Wachstum auf. 10 uM Juglon, entsprechend 1,74 mg/1, wirkten noch vollständig bakterizid.
(Die Deutung der Wachstumsverläufe für 50 μΜ wird durch 2 überlagernde Effekte erschwert: zum einen kommt bei dieser höheren Konzentration die Eigenabsorption der gefärbten Wirkstoffe Alizarin und Anthrachinon zum Tragen (vgl. Zeitpunkt 0, Kurven verschoben) ; zum anderen zeigt bei 5% Ethanol im Medium dieses einen hemmenden Effekt auf die Bakterien, der aber (vermutlich nach Abbau des Ethanols) von der Kultur überwunden werden kann) . Unter Berücksichtigung dieser Effekte zeigt auch für 50 μΜ Juglon als einzige Testsubstanz eine deutliche Wirkung.)
Schlussfolgerung
Juglon besitzt gegen Erwinia amylovora gegenüber anderen Vertre- tern von Chinonen mit jeweils beschriebener Wirkung gegen diverse Mikroorganismen eine darüber hinausgehende, besondere (bakterizide) Wirkung.
Material und Methoden
Erwinia amylovora Stamm
Für die Versuche wurde der österreichische Standard-Stamm Erwina amylovora strain 295/ 93 (AGES) eingesetzt.
In vitro Suspensionskulturen und Plattierungsmedium
Erwinia amylovora wurde in 5 ml KB Medium inokuliert und über Nacht bei 28°C und 200 rpm kultiviert. Diese Kultur wurde auf ODgoo = 0 , 3 mit KB-Medium verdünnt und 2 ml davon wurden direkt in verschlossenen Küvetten in Gegenwart verschiedener Wirkstoffkonzentrationen weiterkultiviert. Juglon und Plumbagin wurden in Ethanol vorgelöst und dann entsprechend der zu erzielenden Endkonzentration im Medium zugegeben. Zwei Kontrollen wurden durchgeführt: unverändertes Medium, sowie Medium mit jeweils gleicher Ethanol-Konzentration wie in den Testansätzen. Die optischen Dichten der Kulturen OD£oo wurden im Zeitverlauf nach festen Intervallen gemessen.
KB Medium:
20 g Pepton
1,5 g K2HP04
1,5 g MgS04 x 7 H20
10 ml Glycerol
pH : 7,2
auf 1 1 mit Wasser
für das Festmedium mit zusätzlich 14 g Agar/1 versetzt
Bakteriostatischer versus bakterizider Effekt
Das Experiment wurde für Wachstumshemmkurven mit 0,1 oder 0, 01 mM Juglon (20 μΐ 10 mM und 1 mM Juglon in Ethanol zu 2 ml der Suspensionskulturen) durchgeführt. Jeweils 10 μΐ Aliquots der Kulturen wurden unmittelbar nach Zugabe der Juglonlösung und Mischen, sowie nach regelmäßigen Zeitintervallen entnommen und auf Juglon-freies Festmedium KB plattiert. Als Kontrolle wurden Aliquots aus der Suspensionskultur mit einer äquivalenten Konzentration von Ethanol entnommen und ebenfalls ausplattiert. Nach zwei Tagen Inkubation der Platten bei 25°C wurde die jeweilige Koloniebildung dokumentiert. Phytotoxizi tat bei Blüten und für die nachfolgende Frucht- entwicklung
Für die Anwendungen wurden Juglon und Plumbagin in Ethanol vorgelöst (65°C) und dann auf die jeweiligen Testkonzentrationen in Wasser verdünnt. Maximale Endkonzentration für das Lösungsmittel Ethanol in den Behandlungslösungen waren 5%, entsprechende Kontrollbehandlungen mit 0,5 oder 5% Ethanol in Wasser wurden durchgeführt. Für jede Variante (Wirkstoff, Konzentration, Sorte) wurden zwei größere Zweige behandelt. Die Tests fanden in der Versuchsobstanlage der Universität für Bodenkultur in Jed- lersdorf) statt. Alle Bäume einer Serie waren gleichen Alters, Entwicklungs- und beobachtbaren physiologischen Zustandes. Die Behandlungen wurden morgens von 8:00 bis 9:30 bei einer rel .
Luftfeuchtigkeit von 68-75% und Temperaturen von 12-13°C durchgeführt. An allen Behandlungstagen waren die besprühten Blüten danach direktem Sonnenlicht ausgesetzt. An den Tagen nach der Behandlung wurde auf phytotoxische Effekte bonitiert. In den darauf folgenden Monaten wurden Fruchtansatz und -entwicklung beobachtet und mit denen der Kontrollpflanzen verglichen. Besonders wurde auf sichtbare Veränderungen der Fruchtepidermis bonitiert.
In-vitro Infektionstests mit Blüten des Apfels (M. x dorn.)
Die den natürlichen Infektionsweg widerspiegelnden in-vitro- Infektionstests mit Apfelblüten wurden wie folgt durchgeführt: Abgetrennte aufblühende Apfelblüten wurden in steriler Zuckerlösung stehend in transparenten Plastikboxen weiter kultiviert. Die Stigmen der Blüten wurden mit 104 cfu Erwinia amylovora Zellen inokuliert und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die zu testenden Wirkstofflösungen aufgesprüht. Nach weiteren 35 Stunden Inkubation wurde durch Aufsprühen von Wasser befeuchtet. Die Infektionsrate wurde nach 8-10 Tagen Inkubation bei 22°C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit bestimmt.
Inokulationstests mit Birnenfrüchten (Pyrus communis)
Erwinia amylovora wurde in 5 ml KB Medium inokuliert und über Nacht bei 28°C und 200 rpm kultiviert. Nach Erreichen einer Zelldichte entsprechend OD6oo(1:l° verdünnt) = 0,17-0,20 wurde 1 ml der unverdünnten Kultur zentrifugiert und das Bakterienpellet in PBS (phosphate buffered saline) resuspendiert. Unreife Birnenfrüchte (Juli) aus dem Versuchsanbau (Jedlersdorf , BOKU) wurden geerntet, mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Inokulation (EPPO protocol 2004) verwendet. Für die Inokulation wurden mit der Spitze einer Pipette in jede Frucht zwei Löcher von jeweils etwa 10 μΐ Volumen gebohrt, in die Hohlräume wurden jeweils 10 μΐ der Testlösung pipettiert und die Früchte dann für 15 Minuten inkubiert. Nach Absorption der Testlösungen in das Gewebe wurde jede Verwundung mit 10 μΐ Erwinia amylovora Suspension in PBS inokuliert. Als Pos ivkontrolle wurden Früchte ohne vorherige Wirkstoffzugäbe direkt inokuliert. Zur Negativkontrolle wurde statt Wirkstofflösung steriles Wasser verwendet. Als Positivkontrolle wurde eine 0,01 mM Streptomycin-Lösung benutzt. Die inokulierten Früchte wurden bei 25 °C und 100% Luftfeuchte für 3-7 Tage inkubiert.
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Claims

Patentansprüche :
1. Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel (A)
Figure imgf000027_0001
oder der Formel (B)
Figure imgf000027_0002
wobei Rl, R4 und R5 unabhängig voneinander H, ein Glykosid oder ein Ester ist, als Pflanzenschutzmittel, wobei das Pflanzenschutzmittel die Verbindung in einem Lösungsmittel gelöst in einer Konzentration von 0,1 uM bis 2 mM umfasst.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung 5-Hydroxy-l , 4-Naphthochinon, 1,4,5- Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside oder Ester davon ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung 5 in einer Konzentration von 0,5 uM bis 1,5 mM, vorzugsweise von 1 uM bis 1 oder 2 mM, noch mehr bevorzugt von 5 μΜ bis 0,5 mM, im Pflanzenschutzmittel vorhanden ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Glykosid-Rest des Glykosids ein Glucosyl-, Mannosyl-, Galactosyl-, Fructosyl-, Ribosyl-, Arabinosyl-, Rham- nosyl- oder Xylosyl-Rest ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel einen Pflanzenextrakt umfassend eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert umfasst .
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Pflanzenextrakt gewonnen wird aus Juglandaceen, vorzugsweise Ju- glans ailanthifolia (syn. sieboldiana) , Juglans cathayensis (syn. draconis) , Juglans cinerea, Juglans hindsii, Juglans mic- rocarpa (syn. rupestris), Juglans nigra, Juglans regia und/oder Juglans stenocarpa, Carya lacinosa, Carya pecan (syn. olivaefor- mis), Carya tomentosa, Pterocarya caucasica, Pterocarya fraxini- folia, Pterocarya hupehensis, Pterocarya rhoifolia und Pterocarya stenoptera.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von bakteriellen und/oder Pilz-Infektionen bei Pflanzen eingesetzt wird .
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Infektion eine Erwinia-Infektion, vorzugsweise eine Erwinia amylovora Infektion, ist.
9. Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen und/oder Pilz- Infektionen, vorzugsweise Erwinia-Infektionen, insbesondere Erwinia amylovora- Infektionen, bei Pflanzen umfassend den Schritt des Aufbringens eines Pflanzenschutzmittels wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert auf Blüten- und/oder Blattwerk der Pflanzen .
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel in der Dämmerung oder bei Dunkelheit auf die Pflanze aufgebracht wird.
11. Verfahren zur Herstellung eines Pflanzenschutzmittels umfassend eine Verbindung gemäß der Formel (A)
Figure imgf000029_0001
oder der Formel (B)
Figure imgf000029_0002
wobei Rl, R4 und R5 unabhängig voneinander H, ein Glycosid oder ein Ester ist, umfassend den Schritt des Lösens von der im Wesentlichen kristallinen Verbindung der allgemeinen Formel (A) oder (B) in einem Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1 uM bis 2 mM oder des Einstellens oder Verdünnens eines Pflanzenextrakts umfassend die Verbindung der allgemeinen Formel (A) oder (B) so dass das Pflanzenschutzmittel die Verbindung in einer Konzentration von 0,1 uM bis 2 mM umfasst .
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung 5-Hydroxy- 1 , 4-Naphthochinon, 1 , 4 , 5- Trihydroxynaphthalin und/oder Glykoside oder Ester davon ist.
13 . Verfahren nach Anspruch 11 oder 12 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungin einer Konzentration von 0 , 5 uM bis 1 , 5 mM, vorzugsweise von 1 uM bis 1 oder 2 mM, noch mehr bevorzugt von 5 uM bis 0 , 5 mM, gelöst wird.
14 . Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der Glykosid-Rest des Glykosids ein
Glucosyl-, Mannosyl-, Galactosyl-, Fructosyl-, Ribosyl-,
Arabinosyl-, Rhamnosyl- oder Xylosyl-Rest ist.
15 . Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14 , dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel einen Pflanzenextrakt umfassend eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 11 bis 14 definiert umfasst.
16 . Verfahren nach Anspruch 15 , dadurch gekennzeichnet, dass der Pflanzenextrakt gewonnen wird aus Juglandaceen, vorzugsweise Ju- glans ailanthifolia (syn. sieboldiana) , Juglans cathayensis (syn. draconis), Juglans cinerea, Juglans hindsii, Juglans mic- rocarpa (syn. rupestris) , Juglans nigra, Juglans regia und/oder Juglans stenocarpa, Carya lacinosa, Carya pecan (syn. olivaefor- mis) , Carya tomentosa, Pterocarya caucasica, Pterocarya fraxini- folia, Pterocarya hupehensis, Pterocarya rhoifolia und Pterocarya stenoptera.
17 . Pflanzenschutzmittel erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16 .
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