WO2012139146A1 - Verfahren zur bekämpfung von bakteriellen infektionen bei einer pflanze unter verwendung von flavonoiden - Google Patents
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
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- A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
Definitions
- the present invention relates to methods and agents for controlling bacterial infections in plants.
- Copper-based preparations are also active, but are increasingly restricted to prevent copper accumulation in the soil.
- nanoscale silver can also be used to combat Erwinia amylovora, which can potentially be accumulated in the soil as an element comparable to copper.
- antagonistic bacteria are used in the flowering against fire blight, but do not reach the efficiency of streptomycin.
- the agents described in the prior art for controlling bacterial infections in plants such as Erwinia, in particular the fire blast pathogen Erwinia amylovora, have a number of disadvantages. Many of the substances used can be harmful to animals and humans. On the other hand, other substances have too low activity against Erwinia, so that the increased Economy no longer exists and the environment is more heavily polluted.
- the present invention relates to a method for controlling bacterial infections in a plant comprising the step of contacting the plant or parts thereof with a flavonoid compound of the general formula (I)
- R3 and R6 are hydrogen
- R4 is a hydroxy, methoxy, malonoyl, oxo or succinoyl group
- R5 is a hydroxy, methoxy, malonoyl or succinoyl group
- R7 is a glycosyl radical
- R3 ' , R ' and R5 ' are each independently a hydrogen, hydroxy or methoxy group.
- glycosyl radical is removed from the compound according to formula (I) immediately before, during or after the contacting step.
- Flavonoid compounds having the general formulas (I) are suitable for actively inhibiting growth and killing plant pests such as Erwinia amylovora. Since flavonoid compounds of this type are chemically labile, according to the invention only those flavonoid compounds are used which have been stabilized with a protective group, such as the glycosyl radical, preferably at R7. By attaching a protective group to the compounds of the formula (I) according to the invention, a stabilization occurs, so that the action against bacteria can be prolonged. In addition, compounds provided with protective groups show a reduced or no action against bacteria.
- these compounds are activated before, during or after contacting the plants or parts thereof with the compounds according to the invention by removal of the protective group and can develop their antibacterial activity.
- the cleavage of the protecting group can thereby immediately before the application of the compounds to the plants, during which or else. done afterwards.
- the time of deprotection may be influenced by the addition of agents which catalyze the cleavage.
- “Activation” is understood here to mean that the cleavage of the protective group brings the compound according to the invention into the active, ie bactericidal, form.
- the protective group is max. 1 hour, preferably max. 50 min., Even more preferred max. 40 min., Or 30 min., Or 15 min., Or 5 min., Before contacting is removed, ie, the reaction is started, in the course of which the protective group is removed.
- the protective group preferably the glycosyl is, preferably ⁇ be removed chemically or enzymatically.
- the compound of the invention can in a corresponding ⁇ , preferably aqueous, pesticides mixture include surfactants for better wetting of the plant which do not undergo the bak ⁇ teriziden effect detrimental chemical reactions with the he ⁇ inventive agents (eg Tween 20 (0.005-0.1 vol %), but also natural substances with surfactant effect).
- a plant protection agent comprises Na and Bran, or commercial wetting agents, such as Agrowax 010, Breakthru, Citowett, Excellent CS 7, Neo-Wett, Agronetz,
- the glycosyl radical is a mono-, di- or triglycoside.
- Flavonoid compound of the type described above are common in nature in plants.
- the flavonoid compounds occurring in plants often have glycosides as a protective group.
- the advantage of such compounds is that in nature, that is to say in the plants in which these compounds occur, agents are or can be present with the aid of which the protective groups can be eliminated.
- the glycoside is selected from the group consisting of glucosyl, mannosyl, galactosyl, fructosyl, ribosyl, arabinosyl, rhamnosyl or xylosyl residues.
- the flavonoid compound is preferably one with a
- Flavan-4-ol-protected protecting group preferably selected from the group consisting of apiforol and luteoforol.
- the flavonoid compound of the general formula (I) is in a concentration of 0.1 mM to 10 mM, preferably from 0.1 mM to 5 mM, more preferably from 0.1 mM to 4 mM, applied to the plant or parts thereof.
- the compound according to the invention is applied to the plant in a concentration of 0.5 mM to 2 mM, more preferably from 1 mM to 2 mM. These amounts of active ingredient are sufficient for the desired effect when applying the plant protection product to plants, in particular to the flowers.
- the flavonoid compounds of the invention may be particularly good for controlling Erwinia amylovora in crops.
- Exemplary crops, which are frequently attacked by Erwinia amylovora come mainly from the family Rosaceae. Particularly vulnerable is the subfamily of pome fruit (Maloideae). In the wood of pome fruit plants Erwinia amylovora is also able to overwinter.
- erfindungsge ⁇ Permitted crop protection in rose plants, preferably in pome fruit plants, especially in apples of the varieties Berlepsch, Braeburn, Cox Orange, Granny Smith, Elstar, Fuji, Gala, Gloster, Golden Delicious, Graven Steiner, Idared, James Grieve , Jonagold Group, Jonathan, White Clark, Topaz and Vista Bella, and pears of the varieties Abbate Fetel, Conference, Williams Christ,instadechants, Gellerts Butterbirne, Harrow Sweet, Clapp's Darling, Comice, Concorde, Early Trevoux, Gute Luise,
- Bosc's bottle bulb (Emperor Alexander), Pastoren pear and Passa Crassana use.
- ornamental shrubs or wild fruits such as quinces, medlars, vetchling, wild berries, rowanberries such as rowanberry and rowanberry, apple berries, ornamental quinces, hawthorns such as hawthorn and hawthorn, loquat, dwarf medlar and lavender / Stranvaesia can also be treated with the compound according to the invention Erwinia amylovora to fight on these plants.
- Erwinia amylovora can be combated particularly well with the compound according to the invention.
- the compound is also useful for controlling other Erwinia species which are effective as plant pathogens. These include Erwinia carotovora (causing blackleg in potato plants and wet rot in potato tubers), Erwinia billingia, Erwinia cypripedii and Erwinia papayae.
- the compound of the invention is preferably applied to those sites of the plant which are the known sites of infection. Therefore, the parts of the plant, which will be ⁇ vorzugt brought into contact with the compound of the invention, preferably flowers and / or leaves.
- the protective group, ie the glycoside residue, of the flavonoid compound can be removed by a wide variety of methods. So it is possible to carry out the removal chemically. However, in order to carry out the reaction as far as possible under physiological and thus plant-sparing conditions, the protective preferably enzymatically removed from the flavonoid compound of general formula (I).
- Suitable enzymes for this reaction are glycosidases, preferably naringinase, ⁇ -glycosidase, tannase or other glycosidases corresponding to the respective glycosyl radical.
- the flavonoid compounds according to the invention or their oxidized precursors are present in plants. Therefore, it is particularly preferable to contact the plant or parts thereof with a plant extract comprising a flavonoid compound of the general formula (I).
- the compounds of the invention occur relatively frequently. It is particularly advantageous in this case that these compounds present in plant extracts usually have a
- the extract itself is already relatively stable.
- the inactivation of the glycosidases can be carried out, for example, by suitable inhibitors or by chemical or thermal denaturation.
- citrus fruit seed extracts can be prepared by pressure digestion for about 12-72 hours, preferably about 48 hours, in glycerol at temperatures of about 50-150 ° C followed by centrifugation and filtration.
- the plant extracts are prepared or used in quantities of 0.001 to 20% by weight, preferably 0.005 to 10, particularly preferably 0.01 to 5% by weight, of the flavonoid compounds according to the invention.
- the plant extract is reduced prior to contact with the plant or parts thereof and before removal of the protecting group.
- the plant extract is preferably chemically reduced with NaBH4, or electrolytically.
- Corresponding methods are sufficiently known to the person skilled in the art. It is therefore particularly preferred to use flavonoid compounds of the general formula (I) whose R 4 radical has a hydroxy group.
- the flavonoid compounds according to the invention or their advantages Runners are more prevalent in certain plants. Therefore, it is advantageous to extract these from such plants by methods known in the art.
- the plant extract is an extract from citrus fruits, especially from citrus paradisi and Citrus sinensis.
- the bacterial infection is preferably an Erwinia amyl lovora infection, preferably on pome fruit such as apple, pear, quince.
- the plant protection agent disclosed herein can be applied to the flower and foliage of the plants to be treated by means of the methods mentioned in the prior art.
- the application of pesticides by spraying, spraying or dusts.
- the plant protection agent Since the primary infection of many bacterial diseases in pome fruit usually on the flowering of bees, especially when humid weather conditions prevail takes place, it is particularly preferred to use at this time, the plant protection agent according to the invention. Due to the short-term application during the flowering of the flowers, cumulative phytotoxic effects on the fruit trees are avoided in this embodiment.
- 3-deoxyflavonoids e.g. Luteoforol chemically with a protective group or glycosyl to provide.
- This is preferably carried out with glycosyltransferases (for example flavonoid 7-O-glycosyltransferases).
- kits for controlling bacterial infections in a plant comprising:
- the deprotecting agent is an enzyme, preferably selected from the group consisting of glycosidases such as naringinase, ⁇ -glycosidase, tannase or other glycosidases corresponding to the respective glycosyl residue.
- glycosidases such as naringinase, ⁇ -glycosidase, tannase or other glycosidases corresponding to the respective glycosyl residue.
- Fig. 1 shows the absorbance at 600 nm of variants 1-6 and controls 1-3 of the cuvette test for determining the minimum inhibitory concentration of apiforol on the growth of E. amyl lovora.
- Figure 2 shows the absorbance at 600 nm of variants 1-6 and the control of the cuvette assay to determine the minimal inhibitory concentration of reduced naringin on the growth of E. amylovora.
- Naringin the 7-ß-neohesperidoside of naringenin, is a citrus 3-deoxyflavonoid.
- grapefruit (Citrus paradisi)
- naringin account for up to 70% of the dry weight of green fruits. Naringin gives grapefruit its characteristic bitter taste.
- Example 1 Preparation of reduced naringin and release of the active ingredients from reduced naringin:
- Amylovora suspension contained nominally 2 mM reduced deglycosylated naringin (apiforol).
- the plates were incubated at 28 ° C for 1-2 days to count subsequently grown colonies.
- Example 3 Determination of Minimum Inhibitory Concentration of Reduced Naringin on In Vitro Suspension Cultures of Erwinia amylovora
- the minimal inhibitory concentration of apiforol (reduced naringin / naringinase) was determined. Concentrations of 2mM, 1m, 0.5m, 0.2mM, 0.1mM and 0.02mM were tested.
- the preparation of the 2 mM active substance solution was carried out as described above (see reduction of naringin). After incubation of the solution at 40 ° C., 1280 ⁇ E. amylovora suspension in KB medium pH 6.0 were added. The volume difference produced in the solutions with lower levels of reduced naringin was compensated for by the addition of Mc Illvaine buffer.
- the preparations were prepared in sterile cuvettes, which were then sealed with parafilm and incubated at 28 ° C and 180 rpm.
- the optical density was measured at 600 nm at 0 and after 2, 4 and 6 hours.
- optical density of the control without reduced naringin and without naringinase increases by 450%.
- the minimum inhibitory concentration of reduced naringin was determined. Concentrations of 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.2mM, 0.1mM and 0.02mM were tested.
- Reduced naringin has a complete growth-inhibiting effect on E. amylovora up to a concentration of 1 mM. At lower concentrations, the growth curve gradually approaches the growth of the control ( Figure 2).
- the E. amylovora suspension will not contain any living cells or less living cells after incubation with the active substance than at the beginning of the experiment.
- the plating test was carried out with four different variants (Table 2).
- the preparation of reduced, deglycosylated naringin (apiforol) was carried out as in the cuvette test. After incubation at 40 ° C., 1280 ⁇ M E. amylovora suspension was added.
- Tab. 2 Pipetting scheme for preparing the different approaches of the plating test for determining the bacteriostatic or bactericidal effect of reduced naringin
- Variants 1 and 2 were the controls. They contained neither naringinase nor reduced naringin (variant 1) or only naringinase (variant 2). The final volume of 2 ml was achieved in these formulations by the addition of Mc Illvaine buffer.
- Variant 4 (Table 2) contained 2 mM apiforol (reduced naringin / naringinase).
- Approach lb showed at a 1: 10,000 dilution in 1488 gewachse ⁇ ne colonies approach la 4686. Since approach lb in the refrigerator storage bo was ⁇ maintains that colonies counted correspond to the arrival fangstiter to E. amylovora in the suspension. The number of colonies grown at 28 ° C of the approach lb correspond to the number of hours at the end of Versu and undisturbed growth before ⁇ lying. Cells E. amylovora. In 15 hours, a bacterial ⁇ growth has taken place to 214.9%.
- naringinase approximately 2
- Tab. 4 Number of grown E. amylovora colonies after 15 hours incubation of the individual variants of the plating test to determine the bacteriostatic or bactericidal effect of reduced naringin.
- Naringin reduced accordingly has both the glycosylated and deglycosylated state in a bactericidal effect on E. amylovora, wherein Apiforol (reduced Naringin / Na ⁇ ringinase) has a somewhat stronger bactericidal effect.
- Example 5 In vitro £ inzelj Luten-Inr "eitionstests with blossoms of the apple (M. x thorn.)
- Single-flower infection tests simulate a natural infection of apple blossoms with E. amylovora in order to subsequently test various potential active ingredients directly on the flowers.
- Apple blossoms of the varieties Gala and Opal came from potted trees. 1.50 m potted trees were stored at 4 ° C for flowering delay and propelled about two weeks before the flowers were used.
- the flowers were sprayed with an appropriate drug solution two hours after the artificial infection.
- Spraying agents were filled into hand pump sprayers and sprayed 2 strokes on each flower (150 ⁇ / stroke). After drug treatment, the boxes were allowed to stand open for about 10 minutes. After drug administration, 30 ml each of 32.6% glycerol was added to the plastic boxes. If the active ingredient was administered with E. amylovora prior to inoculation, glycerol was added after administration of the inoculation suspension. The 32.6% glycerin is said to result in a relative humidity of 70% in the plastic boxes, which are stored at 22 ° C and illuminated daily from 7:00 to 18:00.
- a wet event was simulated. For this purpose, 2 strokes of autoclaved tap water with Cantus® (0.5 g / l) were sprayed onto each flower using a hand spray bottle. The bacteria should, if not killed by the drug, similar to a natural infection, be washed in the flower soil. Cantus® is a fungicide that protects the flowers from excessive fungal attack during incubation. The evaluation was carried out 8-10 days later by scoring the individual flowers for infestation with E. amylovora. In infested flowers, the flower plate turned brown. In part, emergent, red-brown bacteria droplets on the flower floor and stalk were observed.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei einer Pflanze umfassend den Schritt des Inkontaktbringens der Pflanze oder Teilen davon mit einer Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) wobei R3 und R6 Wasserstoff, R4 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl-, Oxo- oder Succinoyl-Gruppe, R5 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl- oder Succinoyl-Gruppe, R7 ein Glykosylrest, R3 ', R4 ' und R5 ' jeweils unabhängig voneinander eine Wasserstoff-, Hydroxy- oder Methoxy-Gruppe sind.
Description
VERFAHREN ZUR BEKÄMPFUNG VON BAKTERIELLEN INFEKTIONEN BEI EINER PFLANZE
UNTER VERWENDUNG VON FLAVONOIDEN
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Pflanzen.
In vielen Ländern wird der Kernobstanbau existentiell durch die von dem Bakterium Erwinia amylovora verursachte Feuerbranderkrankung bedroht. Als langfristige Perspektive sind die vielfältigen züchterischen Bemühungen um Feuerbrand-resistentere Sorten von Apfel und Birne zu betrachten. Dagegen wird in kürzerer Perspektive an der Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen den bakteriellen Erreger gearbeitet.
Gegenwärtig wird Feuerbrand in erster Linie durch die Anwendung des Antibiotikums Streptomyzin bekämpft, bei dem es sich um eine hierfür hochwirksame Substanz handelt. Es wurden jedoch bereits Resistenzen gegen das Antibiotikum beobachtet. Darüber hinaus führten ökologische und toxikologische Betrachtungen zu einer strengen Regulierung der Streptomyzin-Anwendung gegen Feuerbrand. Bedenken bestehen auch hinsichtlich der Entwicklung An- tibiotika-resistenter humanpathogener Bakterien durch breiten Antibiotika-Einsatz. Streptomyzin wurde z.B. wiederholt in Honig aus Anwendungsgebieten nachgewiesen (und dieser dann kostenintensiv vernichtet) .
Kupfer-basierte Präparate sind ebenfalls aktiv, werden aber zunehmend eingeschränkt, um Kupfer-Akkumulation im Boden zu verhindern .
Gemäß der EP 2 012 589 Bl kann zur Bekämpfung^ von Erwinia amylovora auch nanoskaliges Silber verwendet werden, das potentiell als Element vergleichbar mit Kupfer im Boden akkumuliert werden kann.
In einem anderen Ansatz werden antagonistische Bakterien bei der Obstblüte gegen Feuerbrand verwendet, erreichen aber nicht den Wirkungsgrad von Streptomyzin.
Die im Stand der Technik beschriebenen Mittel zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Pflanzen, wie von Erwinia, insbesondere des Feuerbranderregers Erwinia amylovora , weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Viele der verwendeten Substanzen können für Tiere und Menschen gesundheitsschädlich sein. Andere Substanzen weisen hingegen eine zu geringe Wirksamkeit gegenüber Erwinia auf, so dass durch einen erhöhten Wirkstoffeinsät z die
Wirtschaftlichkeit nicht mehr gegeben ist und die Umwelt höher belastet wird.
Andere Verbindungen wie z.B. das 3-Deoxyflavonoid Luteoforol zeigen in vitro einen stark wachstumshemmenden Effekt gegenüber Bakterien wie Erwinia amylovora. Jedoch ist diese Verbindung, wie auch vergleichbare Verbindungen derselben Gruppe, chemisch äußerst labil, so dass die Wirkung gegenüber Bakterien entweder nicht oder nur für eine äußerst kurze Zeitspanne eintritt.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen mit deren Hilfe bakterielle Infektionen bei Pflanzen, insbesondere Infektionen durch Erwinia und insbesondere den Feuerbranderreger Erwinia amylovora , effizient bekämpft werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei einer Pflanze umfassend den Schritt des Inkontaktbringens der Pflanze oder Teilen davon mit einer Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I)
Formel wobei
R3 und R6 Wasserstoff,
R4 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl-, Oxo- oder Succinoyl- Gruppe,
R5 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl- oder Succinoyl-Gruppe ,
R7 ein Glykosylrest ,
R3 ' , R ' und R5 ' jeweils unabhängig voneinander eine Wasserstoff-, Hydroxy- oder Methoxy-Gruppe sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er-
findung wird der Glykosylrest unmittelbar vor, während oder nach dem Schritt des Inkontaktbringens von der Verbindung gemäß Formel (I) entfernt.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass
Flavonoidverbindungen mit der allgemeinen Formeln (I) geeignet sind, Pflanzenschädlinge wie Erwinia amylovora aktiv im Wachstum zu hemmen und abzutöten. Da Flavonoidverbindungen dieser Art chemisch labil sind, werden erfindungsgemäß nur solche Flavonoidverbindungen eingesetzt, die mit einer Schutzgruppe, wie dem Glykosylrest, vorzugsweise an R7 , stabilisiert wurden. Durch das Anbringen einer Schutzgruppe an den erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I) kommt es zu einer Stabilisierung, so dass die Wirkung gegenüber Bakterien verlängert werden kann. Zudem zeigen mit Schutzgruppen versehene Verbindungen eine reduzierte bzw. keine Wirkung gegenüber Bakterien.
Vorzugsweise werden diese Verbindungen vor, während oder nach dem Inkontaktbringen der Pflanzen oder Teilen davon mit den erfindungsgemäßen Verbindungen durch Abspaltung der Schutzgruppe aktiviert und können ihre antibakterielle Wirkung entfalten. Die Abspaltung der Schutzgruppe kann dabei unmittelbar vor dem Aufbringen der Verbindungen auf die Pflanzen, während dessen oder aber auch. danach erfolgen. Der Zeitpunkt der Abspaltung der Schutzgruppe kann durch die Zugabe von Mitteln beeinflusst werden, die die Abspaltung katalysieren. Zudem ist es auch möglich, zunächst die erfindungsgemäßen Verbindungen und im Anschluss daran die Mittel, die zur Aktivierung der Verbindungen beitragen, auf die Pflanze aufzubringen. Unter „Aktivierung" wird hierbei verstanden, dass durch die Abspaltung der Schutzgruppe die erfindungsgemäße Verbindung in die aktive, sprich bakterizide, Form gebracht wird.
„Unmittelbar vor" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeu¬ tet, dass die Schutzgruppe an der erfindungsgemäßen Flavonoid- verbindung kurz vor dem Inkontaktbringen derselbigen mit der Pflanze entfernt wird. Dadurch wird gewährleistet, dass die Verbindung eine ausreichende Wirkung gegenüber den an der Pflanze befindlichen Bakterien entfaltet. „Unmittelbar vor" bedeutet, dass die Schutzgruppe max. 1 Stunde, vorzugsweise max . 50 Min., noch mehr bevorzugt max. 40 Min. oder 30 Min. oder 15 Min. oder 5 Min., vor dem Inkontaktbringen entfernt wird, d.h. die Reaktion gestartet wird, in deren Zuge die Schutzgruppe entfernt wird .
Die Schutzgruppe, vorzugsweise die Glykosylgruppe , wird vorzugs¬ weise chemisch oder enzymatisch abgespalten.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in einem entsprechen¬ den, vorzugsweise wässrigen, Pflanzenschutzmittelgemisch Tenside zur besseren Benetzung der Pflanze umfassen, die keine der bak¬ teriziden Wirkung abträglichen chemischen Reaktionen mit den er¬ findungsgemäßen Wirkstoffen eingehen (z.B. Tween 20 (0,005-0,1 Vol%), aber auch natürliche Stoffe mit Tensidwirkung) . Besonders bevorzugt umfasst ein derartiges Pflanzenschutzmittel Na- und Beseiten, oder handelsübliche Netzmittel, wie z.B. Agrowax 010, Break thru, Citowett, Exzellent CS 7, Neo-Wett, Agronetz,
Ajutol, Silwet top, Zellex CS, Mc Illvaine-Puffer und dgl ..
Erfindungsgemäß ist der Glykosylrest ein Mono-, Di- oder Triglykosid .
Flavonoidverbindung der eingangs beschriebenen Art kommen in der Natur häufig in Pflanzen vor. Die in Pflanzen vorkommenden Flavonoidverbindungen weisen als Schutzgruppe häufig Glykoside auf. Der Vorteil solcher Verbindungen liegt darin, dass in der Natur, sprich in den Pflanzen in denen diese Verbindungen vorkommen, auch Mittel vorhanden sind bzw. sein können, mit deren Hilfe die Schutzgruppen abgespaltet werden können.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Glykosid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucosyl-, Mannosyl-, Galactosyl-, Fructosyl-, Ribo- syl-, Arabinosyl-, Rhamnosyl- oder Xylosyl-Resten .
Die Flavonoidverbindung ist vorzugsweise ein mit einer
Schutzgruppe versehenes Flavan-4-ol, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Apiforol und Luteoforol.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Konzentration von 0,1 mM bis 10 mM, vorzugsweise von 0,1 mM bis 5 mM, noch mehr bevorzugt von 0,1 mM bis 4 mM, auf die Pflanze oder Teilen davon aufgebracht.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Verbindung in einer Konzentration von 0,5 mM bis 2 mM, noch mehr bevorzugt von 1 mM bis 2 mM, auf die Pflanze aufgebracht. Diese Mengen an Wirkstoff sind für die gewünschte Wirkung beim Aufbringen des Pflanzenschutzmittels auf Pflanzen, insbesondere auf die Blüten, ausreichend.
Die erfindungsgemäßen Flavonoidverbindungen können besonders
gut zur Bekämpfung von Erwinia amylovora bei Kulturpflanzen eingesetzt werden. Beispielhafte Kulturpflanzen, welche häufig von Erwinia amylovora befallen werden, entstammen vorwiegend aus der Familie der Rosengewächse (Rosaceae) . Besonders anfällig ist dabei die Unterfamilie der Kernobstgewächse (Maloideae) . Im Holz von Kernobstgewächsen ist Erwinia amylovora zudem in der Lage zu überwintern. Daher ist es besonders bevorzugt, das erfindungsge¬ mäße Pflanzenschutzmittel bei Rosengewächsen, vorzugsweise bei Kernobstgewächsen, insbesondere bei Äpfeln der Sorten Berlepsch, Braeburn, Cox Orange, Granny Smith, Elstar, Fuji, Gala, Gloster, Golden Delicious, Gravensteiner , Idared, James Grieve, Jonagold- Gruppe, Jonathan, Weißer Klarapfel, Topaz und Vista Bella, und bei Birnen der Sorten Abbate Fetel, Conference, Williams Christ, Vereinsdechants , Gellerts Butterbirne, Harrow Sweet, Clapps Liebling, Comice, Concorde, Frühe von Trevoux, Gute Luise,
Bosc' s Flaschenbirne (Kaiser Alexander), Pastorenbirne und Passa Crassana zu verwenden. Neben Kulturpflanzen können auch Ziergehölze beziehungsweise Wildobst wie Quitten, Mispeln, Speierling, Eisbeere, Mehlbeeren wie Vogelbeere/Eberesche und Echte Mehlbeere, Apfelbeeren, Zierquitten, Weißdorne wie Rotdorn und Feuerdorn, Wollmispeln, Zwergmispeln und Glanzmispeln/Stranvaesia mit der erfindungsgemäßen Verbindung behandelt werden, um Erwinia amylovora auf diesen Pflanzen zu bekämpfen.
Mit der erfindungsgemäßen Verbindung kann besonders gut Erwinia amylovora bekämpft werden. Jedoch eignet sich die Verbindung auch zur Bekämpfung anderer Erwinia-Arten, die als Pflan- zenpathogene wirksam sind. Hierbei seien Erwinia carotovora (verursacht die Schwarzbeinigkeit bei Kartoffelpflanzen und die Nassfäule bei Kartoffelknollen) , Erwinia billingia , Erwinia cyp- ripedii und Erwinia papayae genannt.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise an jenen Stellen der Pflanze aufgebracht, die die bekannten Infektionspforten darstellen. Daher sind die Teile der Pflanze, welche be¬ vorzugt mit der erfindungsgemäßen Verbindung in Kontakt gebracht werden, vorzugsweise Blüten und/oder Blätter.
Die Schutzgruppe, d.h. der Glykosidrest , der Flavonoidver- bindung kann mit unterschiedlichsten Verfahren entfernt werden. So ist es möglich die Entfernung chemisch durchzuführen. Um jedoch die Reaktion möglichst unter physiologischen und damit die Pflanze schonenden Bedingungen durchzuführen, wird die Schutz-
gruppe vorzugsweise enzymatisch von der Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) entfernt. Geeignete Enzyme für diese Reaktion sind Glykosidasen, vorzugsweise Naringinase, ß- Glykosidase, Tannase oder andere, dem jeweiligen Glykosylrest entsprechende Glykosidasen.
Wie bereits eingangs erwähnt, kommen die erfindungsgemäßen Flavonoidverbindungen bzw. deren oxidierte Vorstufen in Pflanzen vor. Daher ist es besonders bevorzugt, die Pflanze oder Teile davon mit einem Pflanzenextrakt umfassend eine Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) in Kontakt zu bringen.
In der Natur kommen die erfindungsgemäßen Verbindungen relativ häufig vor. Insbesondere von Vorteil ist dabei, dass diese in Pflanzenextrakten vorhandenen Verbindungen zumeist eine
Schutzgruppe in Form z.B. eines Glykosids umfassen. Daher ist der Extrakt an sich bereits relativ stabil. Um die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme bzw. Pflanzenextrakte zu erhöhen, ist es von Vorteil, etwaig vorkommende Glykosidasen zu inaktivieren. Die Inaktivierung der Glykosidasen kann beispielsweise durch geeignete Inhibitoren oder durch chemische oder thermische Denaturierung erfolgen.
Die Herstellung derartiger Extrakte ist in der Fachwelt hinreichend bekannt. Beispielsweise können Citrus- Fruchtsamenextrakte durch einen Druckaufschluss von etwa 12-72 Stunden, bevorzugt etwa 48 Stunden Dauer in Glycerin bei Temperaturen von etwa 50-150 °C und anschließendem Zentrifugieren und Filtrieren hergestellt werden.
Erfindungsgemäß werden die Pflanzenextrakte in Mengen von 0,001 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,005 bis 10, besonders bevorzugt 0,01 bis 5 Gew.-%, der erfindungsgemäßen Flavonoidverbindungen hergestellt bzw. eingesetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenextrakt vor dem Inkontaktbringen mit der Pflanze oder Teilen davon und vor dem Entfernen der Schutzgruppe reduziert.
Der Pflanzenextrakt wird vorzugsweise chemisch mit NaBH4, oder elektrolytisch reduziert. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Es ist daher besonders bevorzugt, Flavonoidverbindungen der allgemeinen Formel (I) einzusetzen, deren R4-Rest eine Hydroxygruppe aufweist.
Die erfindungsgemäßen Flavonoidverbindungen bzw. deren Vor-
läufer kommen in bestimmten Pflanzen gehäuft vor. Daher ist es von Vorteil, diese aus derartigen Pflanzen nach im Stand der Technik bekannten Verfahren zu extrahieren.
Gemäß einer besonders bevorzugten Aus'führungsform der vorliegenden Erfindung ist der Pflanzenextrakt ein Extrakt aus Ci- trus-Früchten, insbesondere aus Citrus paradisi und Citrus sinensis.
Die bakterielle Infektion ist vorzugsweise eine Erwinia amy- lovora-Infektion, vorzugsweise an Kernobst wie Apfel, Birne, Quitte.
Erfindungsgemäß kann das hierin geoffenbarte Pflanzenschutzmittel mittels der im Stand der Technik benannten Verfahren auf das Blüten- und Blattwerk der zu behandelnden Pflanzen aufgebracht werden. Üblicherweise erfolgt das Aufbringen von Pflanzenschutzmittel durch Spritzen, Sprühen oder Stäuben.
Da die Primärinfektion vieler bakterieller Erkrankungen bei Kernobst in der Regel über die Blüte durch Bienen, insbesondere wenn feuchtwarme Wetterbedingungen herrschen, stattfindet, ist es besonders bevorzugt, zu diesem Zeitpunkt das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel einzusetzen. Durch die nur kurzzeitige Anwendung während der Obstblüte werden bei dieser Ausführungsform kumulative phytotoxische Effekte auf die Obstbäume vermieden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, 3-Deoxyflavonoide wie z.B. Luteoforol chemisch mit einer Schutzgruppe bzw. Glyko- sylgruppe zu versehen. Dies wird vorzugsweise mit Glykosyltrans- ferasen durchgeführt ( z . B . Flavonoid-7-O-Glykosyltransferasen) .
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei einer Pflanze umfassend:
a) ein Behältnis umfassend eine Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) wie oben definiert oder einen erfindungsgemäßen Pflanzenextrakt,
b) ein Behältnis umfassend ein Mittel zum Entfernen einer Schutzgruppe an der Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) ·
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Mittel zum Entfernen einer Schutzgruppe ein Enzym, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glyko- sidasen wie Naringinase, ß-Glykosidase , Tannase oder andere, dem jeweiligen Glykosylrest entsprechende Glykosidasen .
Die gegenständliche Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher illustriert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt die Absorption bei 600 nm der Varianten 1-6 und der Kontrollen 1-3 des Küvettentests zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von Apiforol auf das Wachstum von E. amy- lovora .
Fig. 2 zeigt die Absorption bei 600 nm der Varianten 1-6 und der Kontrolle des Küvettentests zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration reduzierten Naringins auf das Wachstum von E. amylovora.
BEISPIELE :
Naringin, das 7-ß-Neohesperidosid von Naringenin, ist ein 3- Deoxy-Flavonoid von Zitrusfrüchten. In der Grapefruit (Citrus paradisi) kann Naringin. bis zu 70% des Trockengewichts grüner Früchte ausmachen. Naringin verleiht Grapefruits ihren charakteristischen bitteren Geschmack.
In den folgenden Beispielen wurde reduziertes Naringin verwendet, welches teilweise durch Zugabe von Naringinase zu
Apiforol deglykosyliert wurde.
Beispiel 1: Herstellung von reduziertem Naringin und Freisetzung der aJtiven Wirkstoffe aus reduziertem Naringin:
Reduktion von Naringin
Durch die Reduktion von Naringin wurde das stabile Apiforol- Glykosid, das nach der Aktivierung (Glykosidspaltung) für 1) Einzelblüten-Inokulationstests , 2) Küvettentests und 3) Plattiertests (bakterizid vs . bakteriostatisch) verwendet wurde,
1. in einem Rundkolben wurden 290 mg Naringin eingewogen und in 24 ml EtOH gelöst
2. 50 mg aBH4 wurden in den Rundkolben dazugegeben
3. nach ca. 3 h wurde die Mischung eingedampft und in 2 ml Wasser aufgenommen
4. anschließend wurde mit ca. 10 μΐ Essigsäure angesäuert, gemischt und eingefroren
5. die Extrakte wurden mit 3 ml Mc Illvaine-Puffer (0,1 M NaHPC>4, 0,4% Na-Ascorbat, pH 6,0) komplettiert und bis zur Verwendung wieder eingefroren
Reduktion von Hesperidin
1. in einem Spitzkolben wurden 305 mg Hesperidin eingewogen und in 4,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst.
2. 50 mg aBH4 wurden dazugegeben
3. nach ca. 3 h wurde die Mischung eingedampft und in 2 ml Wasser aufgenommen
4. anschließend wurde mit ca. 10 μΐ Essigsäure angesäuert, gemischt und eingefroren
5. die Extrakte wurden mit 3 ml Mc Illvain-Puffer (0,1 M NaHPO_i, 0,4% Na-Ascorbat, pH 6,0) komplettiert und bis zur Verwendung eingefroren.
Für Küvettentests wurden 160 μΐ reduziertes Naringin mit 240 μΐ Mc Illvaine-Puffer (0,1 M NaHP0 , 0,4% Na-Ascorbat, pH 6,0) verdünnt. 70 mg Naringinase wurden in 240 μΐ Mc Illvaine-Puffer vollständig gelöst und dem reduzierten Naringin zugegeben. Das Gemisch wurde 15 min bei 40°C inkubiert. Anschließend wurde es je nach weiterer Verwendung entweder mit 1280 μΐ sterilem vollentsalztem Wasser verdünnt oder es wurden 1280 μΐ E. amylovora- Suspension in KB-Medium pH 6,0 mit einem ODgoo_Wert von 0/2 zuge¬ geben. Die so entstandene Wirkstofflösung beziehungsweise E.
amylovora-Suspension enthielt nominell 2 mM reduziertes deglyko- syliertes Naringin (Apiforol) .
Spritzlösung für Einzelblüten-Inokulations-Tests :
für reduziertes Naringin:
1. 2 ml red. Naringin wurden mit 3 ml Mc Illvain-Puffer (0,1 M NaHP04, 0,4% Na-Ascorbat, pH 6,0) komplettiert
2. 875 mg Naringinase wurden in 4 ml Mc Illvaine-Puffer (= 500 U/Test) gelöst und zum reduzierten Naringin gegeben
3. Inkubation für 15 min. bei 40 °C
4. Mit 16 ml Wasser wurde auf 25 ml Spritzlösung verdünnt für reduziertes Hesperidin:
1. 2 ml red. Hesperidin wurden mit 3 ml Mc Illvaine-Puffer (0,1 M NaHP04, 0,4% Na-Ascorbat, pH 6,0) komplettiert
2. 1500 mg Hesperidinase wurden in 4 ml Mc Illvaine-Puffer gelöst und zum reduzierten Hesperidin gegeben
3. Inkubation für 30 min. bei 40 °C
4. Mit 16 ml Wasser wurde auf 25 ml Spritzlösung verdünnt
Beispiel 2: Plattiertest zur Bestimmung der bakteriziden Wirkung potentieller Wirkstoffe auf Erwinia amylovora
Für diesen Test wurden, entsprechend dem Küvettentest (siehe Beispiel 1), pro Ansatz 2 ml E. amylovora-Suspension mit einer OD 00 von 0/2 in üvetten vorgelegt und anschließend der jeweilige Wirkstoffkandidat zugegeben. Nach dem Verschließen der Ansätze mit Parafilm wurden diese jedoch für 0,5, 2 oder 15 Stunden bei 28°C und 180 rpm im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden jeweils 1:10-, 1:100-, 1:1000- und 1 : 10000-Verdünnungen mit KB- Medium hergestellt, daraus je Aliquots zu 10 μΐ entnommen und diese auf Wirkstofffreie KB-Platten ausplattiert.
Die Platten wurden bei 28°C 1-2 Tage inkubiert, um anschließend gewachsene Kolonien auszuzählen.
Beispiel 3: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von reduziertem Naringin auf in vitro-Suspensionkulturen von Erwinia amylovora
Es wurden Küvettentests (siehe oben) mit abnehmenden Konzentrationen von durch Naringinase degklykosyliertem, reduziertem Naringin (Apiforol) durchgeführt.
In der ersten Reihe wurde die minimale Hemmkonzentration von Apiforol (reduziertes Naringin / Naringinase) bestimmt. Es wurden Konzentrationen von 2 mM, 1 m , 0,5 m , 0,2 mM, 0,1 mM und 0, 02 mM getestet .
Die Zubereitung der 2 mM Wirkstofflösung erfolgte wie oben beschrieben (siehe Reduktion von Naringin) . Nach der Inkubation der Lösung bei 40°C wurden 1280 μΐ E. amylovora-Suspension in KB-Medium pH 6,0 zugegeben. Die in den Lösungen mit geringeren Konzentrationen an reduziertem .Naringin entstandene Volumendifferenz wurde durch die Zugabe von Mc Illvaine-Puffer kompensiert .
Als Kontrolle dienten Ansätze, welche nur Naringinase beziehungsweise nur 2 mM reduziertes Naringin enthielten, sowie ein Ansatz, welchem weder reduziertes Naringin noch Naringinase zugegeben worden war (Tab. 1). Die jeweiligen Volumendifferenzen wurden auch bei diesen Ansätzen durch die Zugabe von Mc Illvaine-Puffer kompensiert.
Tab. 1: Kontrollen und Varianten des Küvettentests zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von reduziertem Naringin
c (red. Naringin) [mM] m (Naringina.se) [mg]
Kontrolle 1 0 0
Kontrolle 2 2 0
Kontrolle 3 0 70
Variante 1 2 70
Variante 2 1 70
Variante 3 0,5 70
Variante 4 0,2 70
Variante 5 0, 1 70
Variante 6 0, 02 70
Die Herstellung der Ansätze erfolgte in steril gehaltenen Küvetten, welche anschließend mit Parafilm verschlossen und bei 28°C und 180 rpm inkubiert wurden. Es wurde die optische Dichte bei 600 nm bei 0, sowie nach 2, 4 und 6 Stunden gemessen.
Das Lösen von Naringinase in Mc Illvaine-Puffer führte zu einer starken Rotfärbung. Die Zugabe von reduziertem Naringin löste eine weitere Farbveränderung aus. Aus diesem Grund weisen die Ansätze, die sowohl reduziertes Naringin als auch Naringinase enthalten schon zu Beginn der Messreihe eine höhere optische Dichte auf als solche, welchen nur eine oder keine der beiden Substanzen zugegeben worden war.
Abgesehen von dem Ansatz, der lediglich 2 mM reduziertes Naringin enthält, stieg bei allen Ansätzen die optische Dichte im Laufe des Versuches an (Fig. 1) .
Die optische Dichte der Kontrolle ohne reduziertes Naringin und ohne Naringinase wächst um 450%.
Es wurde die minimale Hemmkonzentration von reduziertem Naringin bestimmt. Es wurden Konzentrationen von 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0,02 mM getestet.
Die Zubereitung der 2 mM Stammlösung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Allerdings wurden anstatt der Naringina- se-Lösung 320 μΐ Mc Illvaine-Puffer zugegeben. Die Inkubation bei 40°C für die Naringinase-Reaktion wurde nicht durchgeführt, es wurden direkt 1280 μΐ E. amy1ovora-Suspension mit einer ODgoo von 0,2 zugegeben. Für die Herstellung der geringer konzentrier-
ten Lösungen wurde entsprechend weniger reduziertes Naringin eingesetzt und die Volumendifferenz mit Mc Illvaine-Puffer kompensiert (siehe Fig. 2).
Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Wirkstoff.
Reduziertes Naringin hat bis zu einer Konzentration von 1 mM eine vollständig wachstumshemmende Wirkung auf E. amylovora. Bei niedrigeren Konzentrationen nähert sich die Wachstumskurve sukzessive dem Wachstum der Kontrolle an (Fig. 2) .
Beispiel 4: Bestimmung der bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkungsweise reduzierten Naringins
Mittels Küvettentests wurde gezeigt, dass reduziertes Naringin einen wachstumshemmenden Effekt auf E. amylovora hat. In dem nun durchgeführten Plattiertest wurde ermittelt, ob der
Wirkstoff bakteriostatisch oder bakterizid wirkt. Bei einer bakteriostatischen Wirkungsweise enthält eine E. amylovora- Suspension nach der Inkubation mit reduziertem Naringin noch den Anfangstiter an lebenden Zellen. Durch das Ausplattieren von Aliquots der E. amylovora-Suspension auf Wirkstofffreien Platten verdünnt sich der in der Suspension enthaltene Wirkstoff unter die physiologisch schädliche Konzentration und es kommt zum
Wachstum von Kolonien.
Wirkt reduziertes Naringin jedoch bakterizid, enthält die E. amylovora-Suspension nach der Inkubation mit dem Wirkstoff keine lebenden Zellen mehr beziehungsweise weniger lebende Zellen als zu Beginn des Experiments.
Der Plattiertest wurde mit vier verschiedenen Varianten durchgeführt (Tab. 2). Die Herstellung von reduziertem, deglyko- syliertem Naringin (Apiforol) erfolgte wie beim Küvettentest . Nach der Inkubation bei 40°C wurden 1280 μΐ E. amylovora- Suspension zugegeben.
Tab. 2: Pipettierschema zur Herstellung der unterschiedlichen Ansätze des Plattiertest zur Bestimmung der bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkung reduzierten Naringins
Ansatz V (red. Naringin) V (Naringinase- V (Mc Illvaine- [μΐ] Lösung) [μΐ] Puffer) [μΐ]
1 0 0 720
2 0 320 400
3 1 60 0 560
4 1 60 320 24 0
Die Varianten 1 und 2 stellten die Kontrollen dar. Sie enthielten weder Naringinase noch reduziertes Naringin (Variante 1) beziehungsweise lediglich Naringinase (Variante 2). Das Endvolumen von 2 ml wurde in diesen Ansätzen durch die Zugabe von Mc Illvaine Puffer erreicht.
In Variante 3 diente reduziertes Naringin als Wirkstoff. Die Herstellung erfolgte wie oben beschrieben, allerdings wurde anstatt der Naringinase-Lösung 320 μΐ Mc Illvaine-Puffer zugegeben. Die Inkubation bei 40°C wurde nicht durchgeführt, es wurden direkt 1280 μΐ E. amylovora-Suspension zugegeben.
Variante 4 (Tab. 2) enthielt 2 mM Apiforol (reduziertes Naringin / Naringinase) .
Der Versuch wurde nacheinander dreimal mit unterschiedlichen Inkubation.s Zeiten von 30 min, 2 h beziehungsweise 15 h durchgeführt. In der dritten Durchführung (Inkubationszeit 15 h) wurde neben den in Tabelle 2 aufgeführten Ansätzen ein weiterer Ansatz 1b angesetzt, welcher bei 4°C inkubiert wurde.
In den ersten beiden Versuchsdurchläufen (Inkubationszeit 30 min beziehungsweise 2 h) wurden anschließend unverdünnte E. amy- lovora-Suspension, sowie je eine 1:10-, 1:100- und 1:1000- Verdünnung, ausplattiert. In dem dritten Versuchsdurchlauf (Inkubationszeit 15 h) wurden je eine 1:100-, 1:1000- und eine
1 : 10000-Verdünnung ausplattiert.
Bei der ersten Durchführung des Versuches (Inkubationszeit 30 min) war keine durch das reduzierte Naringin beziehungsweise Apiforol bedingte Hemmwirkung auf das Wachstum von E. amylovora erkennbar. Alle Platten waren konfluent mit Bakterien bewachsen. Nach 2 h Einwirkungszeit von reduziertem Naringin (Versuchsdurchlauf 2) waren auf den Platten, auf denen die 1:1000- Verdünnungen ausplattiert worden waren, Einzel kolonien auszählbar (Tab. 3) . Die zweistündige Behandlung mit dem jeweiligen Wirkstoff führte zu einer Reduktion der Bakteriendichte auf
56,5% (reduziertes Naringin) beziehungsweise 44,1% (Apiforol), bezogen auf die Bakteriendichte von parallel ungestört wachsenden Zellen. Da nach 2 Stunden Inkubationszeit noch immer sehr viele Bakterien wachstumsfähig waren, wurde der Versuch ein
drittes Mal wiederholt und die Inkubationszeit auf 15 Stunden verlängert .
Tab. 3: Anzahl gewachsener E. amylovora-Kolonien nach zweistündiger Inkubation der einzelnen Varianten des Plattiertests zur Bestimmung der bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkung reduzierten Naringins
In der dritten Versuchsdurchführung (Inkubationszeit 15 h) waren bei den ausplattierten Aliguots der 1:100- und 1:1000- Verdünnungen der Ansätze ohne Wirkstoff sowohl nach einer voran¬ gegangenen Inkubation bei 4°C (lb) als auch nach einer Inkubation bei 28°C (la) keine Einzelkolonien auszählbar. Ebenso waren die 1:100- und 1 : 1000-Verdünnungen des Ansatzes 2 mit einem kon- fluenten Bakterienrasen überwachsen.
Ansatz lb zeigte bei einer 1 : 10000-Verdünnung 1488 gewachse¬ ne Kolonien, Ansatz la 4686. Da Ansatz lb im Kühlschrank aufbe¬ wahrt worden war, entsprechen die gezählten Kolonien dem An- fangstiter an E. amylovora in der Suspension. Die Anzahl der bei 28°C gewachsenen Kolonien des Ansatzes lb entsprechen der Anzahl der am Ende der Versu hszeit und bei ungestörtem Wachstum vor¬ liegenden. Zellen E. amylovora. In 15 Stunden hat ein Bakterien¬ wachstum um 214,9% stattgefunden.
Durch die Zugabe von Naringinase (Ansatz 2) zu der E. amylo- vora-Suspension wurde das Wachstum leicht gehemmt. In der ausplattierten 10 μΐ der 1 : 10000-Verdünnung befanden sich noch 3756 Kolonien (Tab. 4). Dies entspricht einem Wachstum um 152,4% in
15 Stunden.
Tab. 4: Anzahl gewachsener E. amylovora-Kolonien nach 15- stündiger Inkubation der einzelnen Varianten des Plattiertests zur Bestimmung der bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkung reduzierten Naringins.
Bei den reduziertem Naringin (Variante 3) beziehungsweise Apiforol (reduziertes Naringin / Naringinase) (Variante 4) aus¬ gesetzten E. a/nylovora-Suspensionen verringerte sich die Anzahl lebender Bakterien in den ausplattierten 10 μΐ der 1:10000- Verdünnung auf 283 beziehungsweise 254. Dies entspricht einer Verringerung der Bakteriendichte um 81% (Variante 3) bzw. 83% (Variante 4) im Vergleich zu der Bakte iendichte zu Beginn des Versuches .
Reduziertes Naringin hat demzufolge sowohl im glykosylierten als auch im deglykosylierten Zustand eine bakterizide Wirkung auf E. amylovora , wobei Apiforol (reduziertes Naringin / Na¬ ringinase) einen etwas stärkeren bakteriziden Effekt aufweist.
In Tabelle 5 ist die prozentuale Bakteriendichte von E. amy¬ lovora in den einzelnen Ansätzen dargestellt, bezogen auf die Bakteriendichte zu Beginn des Versuches (Ansatz lb) und bezogen auf die Dichte einer parallel ungestört wachsenden Population (Ansatz .la) . Letzteres stellt den praxisrelevanten Wert dar.
Tab.5: Prozentuales Wachstum der Bakterien nach Behandlung mit Naringinase (Ansatz 2), 1 mM reduziertem Naringin (Ansatz 3) beziehungsweise 1 m Apiforol (Ansatz 4)
In 10 μΐ der 1 : 100-Verdünnung der Variante 3 befanden sich 1085, in 10 μΐ der 1 : 1000-Verdünnuhg desselben Ansatzes 350 lebende Bakterien. In den ausplattierten 10 μΐ der jeweiligen Verdünnungsstufen der Variante 4 befanden sich 326 beziehungsweise 206 E. amylovora-Zellen (Tab. 4) . Da zwischen den Kolonieanzahlen der einzelnen Verdünnungsstufen jeweils der Faktor 10 liegen sollte und dies bei den Ansätzen der Varianten 3 und 4 nicht der Fall ist, wurden die 6 Platten dieser beiden Varianten in einem Kontrollexperiment erneut für 4 Tage bei 28 °C inkubiert. Daraufhin konnte anhand der typischen gelblichen Schleimbildung von E. amylovora eine Kontamination der Platten mit anderen Bakterien ausgeschlossen werden.
Beispiel 5: In-vitro £inzelj luten-Inr"eitionstests mit Blüten des Apfels (M. x dorn.)
Einzelblüten-Infektionstests simulieren eine natürliche Infektion von Apfelblüten mit E. amylovora , um anschließend verschiedene potentielle Wirkstoffe direkt auf den Blüten testen zu können.
Apfelblüten der Sorten Gala und Opal stammten von getopften Bäumen. 1,50 m große, getopfte Bäume waren bei 4°C zur Blühverzögerung aufbewahrt und etwa zwei Wochen vor Verwendung der Blüten angetrieben worden.
Am Tag 1 wurden die E. amylovora-Stämme 295/93 und 763 auf je einer KB-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 28°C inkubiert. Zudem. wurden für jede Testreihe in 15 Plastikboxen je 20
2 ml Eppendorfgefäße geklebt, welche mit 1,9 ml 10%iger Saccharoselösung befüllt wurden.
Daraufhin wurden pro Testreihe ca. 300 Blüten (Ballonstadium) geschnitten und in die Saccharoselösungen gestellt. Die Plastikboxen wurden über Nacht bei 22°C inkubiert, sodass sich die Blüten gänzlich öffneten. Knospen, welche an Tag 2 noch geschlossen waren, wurden von Hand geöffnet und Blütenblätter gegebenenfalls abgeschnitten, sodass die Narben frei zugänglich waren. Beschädigte und von Schädlingsraupen angefressene Blüten, sowie solche mit dunklen Staubblättern (Zeichen für zu alte Blüten) wurden ausgetauscht.
Von den E. amylovora-Stämmen 295/93 und 763 wurden Bakterien mit der Impföse in je 5 ml Natrium-Kalium-Phosphatpuffer (0,05
M, pH 7,0) überführt und resuspendiert. Es wurde die OD420 gemes-
7 sen und die Suspensionen auf eine Bakteriendichte von je 10 cfu/ml eingestellt. 1 ml der Suspension des E. amylovora 295/93- Stammes wurde mit 1 ml der Suspension des E. amylovora 763- Stammes gemischt. Für die Inokulation wurde je 1 μΐ der so entstandenen Suspension zweier Standard-Inokulationsstämme gleichmäßig auf die 5 Narben der Blüten pipettiert.
Die Blüten wurden zwei Stunden nach der künstlichen Infektion mit einer entsprechenden Wirkstofflösung besprüht. Die
Spritzmittel wurden hierzu in Hand-Pumpzerstäuber gefüllt und 2 Hübe auf jede Blüte gesprüht (150 μΙ/Hub) . Nach der Wirkstoffbehandlung wurden die Boxen circa 10 min offen stehen gelassen. Nach der Wirkstoffapplikation wurden jeweils 30 ml 32,6%iges Glycerin in die Plastikboxen gegeben. Falls der Wirkstoff vor der Inokulation mit E. amylovora appliziert wurde, erfolgte die Zugabe des Glycerins nach der Applikation der Inokulationssuspension. Das 32,6%ige Glycerin soll zu einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70% in den Plastikboxen führen, welche bei 22°C aufbewahrt und täglich von 7.00 - 18.00 Uhr beleuchtet wurden.
Ca. 46 Stunden nach der Infektion mit E. amylovora wurde ein Nässeereignis simuliert. Dazu wurden mit einer Handsprühflasche 2 Hübe autoklaviertes Leitungswasser mit Cantus® (0,5 g/1) auf jede Blüte gesprüht. Dabei sollten die Bakterien, sofern durch den Wirkstoff nicht abgetötet, ähnlich zu einer natürlichen Infektion, in den Blütenboden gewaschen werden. Cantus® ist ein Fungizid und schützt die Blüten vor übermäßigem Pilzbefall während der Inkubation.
Die Auswertung erfolgte 8-10 Tage später durch Bonitur der Einzelblüten auf Befall mit E. amylovora. Bei befallenen Blüten verfärbte sich der Blütenboden braun. Teilweise waren austretende, rot-braune Bakterientröpfchen am Blütenboden und -stiel zu beobachten.
Anschließend wurde mit nachfolgender Formel der Wirkungsgrad η der Wirkstoffe berechnet: η = 1 - (prozentualer Anteil befallener Blüten Wirkstoffkan- didat) / (prozentualer Anteil befallener Blüten Kontrolle)
Für die in-vitro Infektionstests mit Apfelblüten wurden reduziertes und enzymatisch entschütztes Naringin (WS-N) bzw. Hes- peridin (WS-H) getestet. Streptomyzin wurde dabei als Positivkontrolle verwendet (Tabellen A, B und _C) . Es können für WS-N und WS-H keine genauen Konzentrationen angegeben werden, weshalb nur die theoretisch maximal enthaltene Konzentration in der
Spritzlösung (errechnet sich aus der Ausgangskonzentration von Naringin im Syntheseansatz) angegeben ist. WS-N hatte im Vergleich zu WS-H höhere Wirkungsgrade (77 - 87 % vs . 48 %) . Da die beiden Wirkstoffe und deren Applikation bislang noch nicht optimiert wurden, könnte der Wirkungsgrad noch zusätzlich gesteigert werden und jenem von Streptomyzin (92 - 100 %) angenähert werden. Tabelle C zeigt zusätzlich die konzentrationsabhängige Abnahme des Wirkungsgrades von 77, 74 und 26 % beim Einsatz von (maximal) 2 m , 1 mM und 0,1 mM Wirkstoff WS-N. Phytotoxische Schäden traten konzentrationsabhängig bei beiden Wirkstoffen und auch bei einzelnen Kontrollen auf. Die Tatsache, dass Petalen besonders empfindliches Gewebe darstellen und daher Verbräu- nungsschäden auftraten, während die reproduktiven Organe wie Stempel und Narbe augenscheinlich keine Schäden durch die Applikationen aufwiesen, lässt vermuten, dass der mögliche Einsatz dieser Mittel in der Praxis einen vernachlässigbaren Einfluss auf den Fruchtansatz haben dürfte.
Tabelle A
p) leichte bzw. p-) sehr leichte phytotoxische Reaktion bei v.a. Petalen, aber augenscheinlich nicht bei den Stempeln oder Narben
Tabelle B
p+) starke bzw. p-) sehr leichte phytotoxische Reaktion bei v.a. Petalen, aber augenscheinlich nicht bei den Stempeln oder Narben
Tabelle C
Sorte : Opal
Varianten : Anzahl Blübefallene % Befall MW WG ten Blüten in
%
WS-N (max. 2 mM) p 20 2 10 18 77
20 5 25
WS-N (max. 1 mM) p 20 1 5 20 74
20 7 35
WS-N (max. 0,1 mM) 20 13 65 58 26 p-
20 10 50
Kontrolle (ohne 20 16 80 68 13 WS-N, nur Naringi- nase) p+
20 11 55
Kontrolle (Wasser) 20 16 80 78 -
20 15 75
Kontrolle (0,06 % 20 2 10 5 94 Strepto)
20 0 0
p-) sehr leichte, p) leichte, bzw. p+) starke phytotoxische aktion bei v.a. Petalen, aber augenscheinlich nicht bei den
Stempeln oder Narben
Schlussfolgerung
Besonders WS-N (η = 77 - 87 %) aber auch WS-H (η = 48) zeigten eine Wirkung gegen E. amylovora im Einzelblüten- Infektionstest und besitzen deshalb ein gutes Potential als Wirkstoff zur Kontrolle von primärem Feuerbrand (Blüteninfektionen) .
Besonders die Anwendung von nominell 2 mM WS-N in den in- vitro Einzelblüten-Infektionstests zeigt einen hohen Wirkungsgrad von 77 - 87 %, im direkten Vergleich zu 92 - 100 % für das konventionelle Pflanzenschutzmittel Streptomyzin.
Claims
1. Verfahren zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei einer Pflanze umfassend den Schritt des Inkontaktbringens der
Pflanze oder Teilen davon mit einer Flavonoidverbindung der allgemeinen. Formel (I)
Formel (I) wobei
R3 und R6 Wasserstoff,
R4 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl-, Oxo- oder Succinoyl- Gruppe,
R5 eine Hydroxy-, Methoxy-, Malonoyl- oder Succinoyl-Gruppe ,
R7 ein Glykosylrest ,
R3 ' , R ' und R5 ' jeweils unabhängig voneinander eine Wasserstoff-, Hydroxy- oder Methoxy-Gruppe sind .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Glykosylrest unmittelbar vor, während oder nach dem Schritt des Inkontaktbringens von der Verbindung gemäß Formel (I) entfernt wird .
3. Verfahren nach Anspruch 1 -oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Glykosylrest ein Mono-, Di- oder Triglykosid ist!
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Glycosylrest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gluco- syl-, Mannosyl-, Galactosyl-, Fructosyl-, Ribosyl- ,■ Arabinosyl- , Rhamnosyl- oder Xylosyl-Resten .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flavonoidverbindung ein mit einem Glykosid versehenes Flavan-4-ol, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Apiforol und Luteoforol, ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Konzentration von 0,1 mM bis 10 mM, vorzugsweise von 0,1 mM bis 5 mM, noch mehr bevorzugt von 0,1 mM bis 4 mM, auf die Pflanze oder Teilen davon aufgebracht wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Teile der Pflanze Blüten und/oder Blätter sind .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykosid enzymatisch durch Glykosidasen von der Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) entfernt wird .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze oder Teile davon mit einem Pflanzenextrakt umfassend eine Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) in Kontakt gebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Pflanzenextrakt vor dem Inkontaktbringen mit der Pflanze oder Teilen davon und vor dem Entfernen des Glykosids reduziert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Pflanzenextrakt chemisch mit NaBH4 oder elektrolytisch reduziert wird .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass der Pflanzenextrakt ein Extrakt aus Citrusfrüch- ten, insbesondere aus Citrus paradisi und/oder Citrus sinensis , ist .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Infektion eine Erwinia amylovora Infektion ist.
14. Kit zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei einer Pflanze umfassend:
a) ein Behältnis umfassend eine Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert oder einem Pflanzenextrakt nach einem der Ansprüche 10 bis 12, b) ein Behältnis umfassend ein Mittel zum Entfernen einer Schutzgruppe an der Flavonoidverbindung der allgemeinen Formel. (I) ·
15. Kit . nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Entfernen einer Schutzgruppe ein Enzym, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glykosidasen ist.
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Cited By (1)
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