WO2011102626A2 - 폴리아자마크로사이클릭 화합물, 그 제조 방법 및 생의학적 적용 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is a bifunctional chelator (BFC), which is a novel polyazamacrocyclic compound that can be used for the treatment and diagnosis by connecting a bioactive molecule and a metal, a method for preparing the same, and a biomedical application. It is about.
  • BFC bifunctional chelator
  • cyclones (1,4,7,10-tetraazacyclododecane) and cyclam (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane) have been intensively studied. It is very advantageous for the formation of metal complexes.
  • the cyclic polyamine has a strong affinity with certain metals and can selectively bind to them, such as metal catalysts, reaction sites of metalloenzymes, cleavage agents of phosphate esters including DNA and RNA, and radiodiagnosis. It can be used not only for treatment but also as an MRI contrast agent.
  • ions that form stable complexes with cyclones or cyclam derivatives include Gd, which can be used as an MRI modeling agent, as well as radioisotopes that can be used in nuclear medicine.
  • 64 Cu, m In, 67 Ga and 86 Y are radioisotopes that can be used for diagnosis using positron emission tomography (PET) or single photon emission computed tomography (SPECT).
  • 90 Y is a radioisotope that can be used for treatment ⁇ Anderson CJ, Welch MJ. Rad i omet a 1-Labeled Agents (Non-Technet ium) for Diagnostic Imaging. Chem Rev 1999; 99: 2219-34; Anderson CJ, Lewis JS. Radiopharmaceuticals for targeted radiotherapy of cancer. Expert Opinion on Therapeutic Patents 2000; 10: 1057-69.
  • radionuclides such as 64 Cu in nuclear medicine and preclinical use
  • BFCs are used to securely attach radionuclides to bioactive molecules, or target molecules. Therefore, the development of BFC with excellent in vivo stability is very important in the design of a system for in vivo delivery of radionuclides.
  • the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, the object of the present invention is easy to synthesize, the introduction of various substituents, high yield, new polyaza macrocyclic useful as a BFC It is to provide a compound and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method of using the novel polyaza macrocyclic compound for biomedical use.
  • chelate refers to a compound in which a metal ion and a multidentate ligand of two or more sites are coordinated, and the ligand is called a chelator.
  • a conjugate compound refers to a compound in which a chelating agent is conjugated to a protein, peptide, antibody, etc. through conjugation, and the metal chelating conjugate compound is a conjugate of chelate, protein, peptide, antibody, etc. By a bond, or a compound in which the conjugate compound is combined with a metal ion (complex ion).
  • BFCs are semi-active such as aromatic isothiocyanate groups or activated esters It has a functional group and reacts with nucleophilic binding sites such as -NH 2 , -SH, or -0H of the target molecule ⁇ Liu, S., and Edwards, DS (2001) Bi functional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals.
  • the activated ester may be activated by, for example, the following functional group, but is not limited thereto.
  • linkers for adjusting pharmacokinetic properties and in vivo distribution may be introduced between the chelating agent and the target molecule as needed ⁇ Parry, JJ, Kelly , TS, Andrews, R., and Rogers, BE (2007) In vitro and in vivo evaluation of 64Cu ⁇ labeled DOTA-1 inkerbombesin (7-14) analogues containing different amino acid linker moieties. Bioconjugate Chem.
  • Polyaza macrocyclic compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is represented by the following formula (1).
  • n, p and q are the same or different and are each an integer of 2 or 3
  • r is an integer from 0 to 5
  • t is an integer of 0 or 1
  • R 6 is a cycloalkyl, - R 1, R 2, R 3, R 4 'R 5, R 6, R 7, R 8 are the same or different and each H, and d- 5 alkyl, or C 3
  • R 10 is H, d-5 alkyl, C 3 - and 14 aralkyl, - 6 cycloalkyl, or C 7
  • U and W are the same or different and are each H, d-5 alkyl, or C 3 - 6 cycloalkyl, and,.
  • A is C 6 - 10 aryl
  • Q is H, nitro, amino, isothiocyanato, maleimido, ester, alkyne, aminooxy, thiol, azide, or carboxylic acid.
  • R, R 2, R 3 , R 4, R 5, R 6, R 7, R 8, R 10, U, W, Y and Z of the Ci-5 alkyl, C 3 - 6 cycloalkyl , or C 7 - 14 aralkyl group is (can be substituted by 4-alkyl, halogen, hydroxyl, nitro, cyano, alkoxy, amino, ester group and a carboxyl group at least one of.
  • the A C 6 - 10 aryl group may be substituted by one or more d- eu 4 alkyl, halogen, hydroxyl, alkoxy, an ester group and a carboxyl group.
  • the pharmaceutically acceptable salt is selected from the group consisting of potassium, sodium, lithium, ammonium, silver, kalm and magnesium when the compound represented by Formula 1 includes a negatively charged component It may include a cation or a cation group, and when the compound represented by the formula (1) includes a positively charged component F-, C1 " , ⁇ , ⁇ , C10 4 —, BFV, HC0 3 " , C3 ⁇ 4C0 2 —, CH 3 S (V, C3 ⁇ 4C 6 H 4 S () 3 _ , CF 3 S0 3 " , H 2 P0 4 " and B (C 6 H 5 ) 4- It may include, but is not limited thereto.
  • the polyazamacrocyclic compound or pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention acts as a BFC and is conjugated to a protein, peptide, antibody or antibody fragment through an isothiocyanato group or an activated ester group or the like. .
  • the polyaza macrocyclic compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is, for example, 1,8-bis- (carboxymethyl) -4- (4'-isothiocy) represented by the following general formula (2).
  • 1,4, 7, 10-tetraazacyclododecane 1,7-bis- (carr) Carboxymethyl) -4— (4 1 -isothiocyanatophenethyl) -1,4,7,10-tetraazacyclo dodecane, 1,8-bis- (carboxymethyl) -4 represented by formula (6) -(4'-nitrophene ethyl) -1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane, or 1,8-bis- (carboxymethyl) -4- (methyl) -1,4 represented by formula (7) , 8, 11-tetraazacyclotetradecan.
  • Metals chelating with polyazamacrocyclic compounds or pharmaceutically acceptable salts according to the invention are radioactive or non-radioactive and include transition metals, lanthanides, actinides, and major metal elements.
  • chelating radioactive metals are 43 Sc, 3 V, 44 Sc, 45 Ti,
  • the SPECIE radioactive metal is preferably 67 Ga, 68 Ga, 99ra Tc, m In, or the radioactive metal for PET is preferably 60 Cu, 61 Cu, 62 Cu, 64 Cu, 86 Y, 89 Zr, 91 ⁇ 2 Tc, and the preferred radioactive metals include 67 Cu, 90 Y, 153 Sm, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re, 18 3 ⁇ 4e ⁇ S. Liu, Bi functional coupling agents for radiolabel ing of biomolecules and target one speci f ic delivery of metallic radionuclides, Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1347-1370>.
  • 64 Cu is suitable for producing large quantities with high specific activity using half-life (12.7 hours), decay properties ( ⁇ + (19%), ⁇ - (39%)), and biomedical cyclotrons. It is useful for positron emission tomography (PET) imaging and target radiotherapy.
  • PET positron emission tomography
  • Conjugate compounds according to the invention include amino acids, peptides, proteins, nucleosides, nucleotides, aptamers, nucleic acids, enzymes, lipids, nitrogen-containing vitamins, nitrogen-containing hormones, drugs, nanoparticles, antibodies, or antibody fragments. It includes a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof conjugated to.
  • Metal chelating conjugate compounds according to the invention amino acids, peptides, proteins, nucleosides, nucleotides, aptamers, nucleic acids, enzymes, lipids, nitrogen-containing vitamins, nitrogen-containing hormones, drugs, nanoparticles, antibodies, Or the chelate is conjugated to an antibody fragment or radioactive (e.g. for nuclear medicine treatment or diagnosis) or non-radioactive (e.g. for diagnosis such as magnetic resonance imaging contrast agent) to the conjugate compound
  • an antibody fragment or radioactive e.g. for nuclear medicine treatment or diagnosis
  • non-radioactive e.g. for diagnosis such as magnetic resonance imaging contrast agent
  • the contrast agent according to the present invention includes a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a chelating agent chelating paramagnetic metal ions, for example, Mn, Fe, Gd and the like, conjugated with disease-specific biomaterials
  • a contrast agent in diagnostic / testing such as an ultrasound contrast computed tomography (CT) contrast agent, magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent, SPECT or PET.
  • CT ultrasound contrast computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the pharmaceutical combination according to the present invention comprises the metal chelating conjugate compound and a pharmaceutically acceptable carrier, tumor, dementia, or mycoplasma, pathogen surface antigen, toxin, enzyme, allergen, drug, biological activity It is used to diagnose or treat diseases related to molecules, bacteria, bears, viruses, parasites, autoimmunity, heart and nervous system.
  • the pharmaceutical combinations according to the invention are especially used for diagnosing or treating tumors.
  • a method of diagnosing or treating a disease, eg, a tumor, of a mammal other than a human of the present invention comprises administering an effective amount of said metal chelating conjugate compound to a mammal, except human.
  • Antibodies to which the chelating agent or chelate conjugates according to the invention may be monoclonal or polyclonal antibodies, chimeric antibodies or heterologous antibodies, or for example annexin, anti-CEA, Tositumomab, trastuzumab (trastuzuniab), HUA33, Epratuzumab cG250, Ibritumomab Tiuxetan, and the like, and may include antibodies including proteins including derivatives such as Ibritumomab Tiuxetan.
  • Antibodies or antibody fragments that can be bound to chelating agents or chelates according to the present invention can be prepared by techniques well known in the art.
  • Proteins include, for example, albumin, TCII, HSA, annexin and Hb;
  • peptides include, for example, RGD-containing peptides, melanocyte-stimulating hormone (MSH) peptides, neurotensin, calcitonin, threotide, bombesin, neurotensin, urotensin II, and angiotensin;
  • Nitrogen-containing vitamins such as vitamins A, Bl, B2, B12, C, D2, D3, E, H and K;
  • nitrogen-containing hormones include, but are not limited to, estradiol, progesterone, testosterone, and the like.
  • R 9 is 5-alkyl, C 3 - and the keel 14 aralkyl, - 6 cycloalkyl, or C 7
  • X is F, CI, Br or I) d- alkyl 5 of the three R 9 in the present invention, C 3 - 6 cycloalkyl, or C 7 - 14 aralkyl group is (4 alkyl, halogen, hydroxyl, nitro, , Cyano, alkoxy, amino, ester group and carboxyl group.
  • the reaction for introducing Q may be carried out by a method known in the art.
  • step (iii) reacts the compound of Formula 11 with X- (CYZ) r -A t -H (X is as defined in Formula 10) Obtaining a compound of Formula 12 or 13
  • step (iii) The compound of Formula 11 is reacted with X- (CYZ) r -A t -N0 2 (X is the same as defined in Formula 10) to obtain a compound of Formula 14 or 15 below.
  • step (iii) further comprises reducing the nitro group of the compound of formula 14 or 15 to an amine group, wherein Q of formula is isothiocyanato If step (iii) is
  • step (iii) represents the nitro group of the compound of Formula 14 or 15 as an amine group.
  • step (iii) represents the nitro group of the compound of Formula 14 or 15 as an amine group.
  • step (iii) represents the nitro group of the compound of Formula 14 or 15 as an amine group.
  • step (iii) represents the nitro group of the compound of Formula 14 or 15 as an amine group.
  • step (iii) represents the nitro group of the compound of Formula 14 or 15 as an amine group.
  • After the reduction further comprises the step of reacting with maleic anhydride.
  • the reaction of conventional cyclones or cyclams with two equivalents of alkyl or aryl halides yields a mixture of mono-, di- and even tri-substituted macrocyclic molecules.
  • trans ⁇ , ⁇ '-disubstituted cyclic polyamines there are three ⁇ , ⁇ '-disubstituted cyclic polyamines, ie two cis-disubstituted derivatives and one trans-disubstituted derivative.
  • trans -N, N'-disubstituted cyclones and cyclams are particularly noteworthy because they can lead to stable 6-coordination compounds upon chelate formation.
  • trans ⁇ , ⁇ '-double-protected cyclones and cycllam are convenient precursors for synthesizing three-dimensional systems such as kryptands (cyclic polyether polyamines) based thereon.
  • the present invention provides a trans ⁇ , N'-disubstituted polyazamacro by preparing a bisaminal compound (Formula 9) as a starting material and reacting the ⁇ -halocarboxylic acid ester (X-CUW-C0 2 R 9 ) thereto. Cyclic compounds and derivatives (formulas 1, 8, 10-15) were readily synthesized in high yields.
  • R 9 as a carboxylic acid protecting group is, for example, methyl, ethyl, ⁇ - Propyl, isopropyl n_-butyl, t- butyl and the like of 5-alkyl, for example, such as cyclopentyl, haeksil C 3 - 6 cycloalkyl, such as phenyl, ⁇ - naphthyl such as C 6 - 12 aryl, for example benzyl, phenethyl and so on of the phenyl -d- 2 alkyl and ⁇ - naphthyl ⁇ - naphthyl, such as a-methyl-2-alkyl, such as C 7 - 14 aralkyl group, and the like, silyl, and these d- 4 may be substituted with one or more of alkyl, halogen, hydroxyl, nitro, cyano, alkoxy, amino, ester and carboxyl groups, but is not limited thereto.
  • benzyl and t-butyl as carboxylic acid protecting groups are preferable because they are stable in a basic environment and can be easily removed under acidic conditions.
  • ⁇ -halocarboxylic acid ester for example, t1 butylbromoacetate or benzyl bromoacetate is used.
  • any known method may be used, for example, a method of reduction or acid decomposition reaction.
  • the reduction method include a catalytic reduction using a catalyst such as palladium carbon, palladium black, platinum oxide, reduction with sodium in liquid ammonium, reduction with dithiothreyl, and the like.
  • the acid decomposition method for example, acid decomposition by inorganic acids such as hydrogen fluoride, hydrogen bromide, hydrogen chloride, organic acids such as trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, or a mixture thereof, etc. Can be mentioned.
  • Inert solvents used in the preparation method of the present invention include water, methanol, ethane, isopropanol, isobutyl alcohol, t-butyl alcohol, acetonitrile (MeCN), tetrahydrofuran (THF), chloroform (CHC1 3 ), Dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMS0), benzene, toluene, xylene, dichloromethane, ethylene glycol, acetone, n-propyl ketone, trichloroethylene, ether, cyclonuxanon, butyrolactone or their Includes but is not limited to the combination.
  • the base used for basic hydrolysis of the compound of Formula 10 may be KOH, NaOH, Ca (0H) 2l Li [NTf 2 ], KF / A1 2 0 3, etc., but is not limited thereto. .
  • trans-N, N'-disubstituted reaction according to the present invention is carried out at room temperature, but lower or higher temperatures may be used if necessary.
  • the reaction time of each step is generally 1 hour to 5 days, preferably 3 hours to 2 days, but a shorter or longer reaction time may be used if necessary.
  • the polyazamacrocyclic compounds according to the present invention can be easily synthesized and can be conveniently purified in high yield while minimizing separation using time and labor intensive chromatography.
  • transoxane, N 1 -disubstituted cyclic polyamine can be selectively synthesized by reacting bisaminal with ⁇ -halocarboxylic acid ester.
  • the polyazamacrocyclic compound according to the present invention acts as a useful BFC and can be biomedically used to chelate with radionuclides such as 64 Cu to radiolabel a target molecule such as a peptide.
  • 1 shows mass spectrometry spectra for TE2A-N02 according to one embodiment.
  • Figure 2 shows the mass spectrometry spectra for Cu-TE2A-N0 2 according to one embodiment.
  • 3A and 3B show Cu-TE2A and Cu- according to one embodiment, respectively, as controls.
  • the UV-Vis spectrophotometer spectra of TE2A-N0 2 for monitoring maximum absorption change over time in acid decomplexation experiments are shown.
  • 4A and 4B show the results of measuring the cyclic voltage current (cyclic ⁇ ⁇ 113 ⁇ 0 3) for Cu-TE2A and Cu-TE2A-N0 2 , respectively, as a control example.
  • FIG. 5 shows a mass spectrometry spectrum for TE2A-mono-methyl into which the protecting group t-butyl of carboxylic acid is introduced, according to one embodiment.
  • Figure 6 shows the mass spectrometry spectra for TE2A- mono-methyl from which the protecting group of carboxylic acid is removed according to one embodiment.
  • Figure 11 shows a semi-preparative HPLC chromatogram of TE2A-c (RGDyK) according to one embodiment.
  • Figure 12 shows an analytical HPLC chromatogram of TE2A-c (RGDyK) according to one embodiment.
  • FIG. 13 shows mass spectrometry for TE2A-c (RGDyK) according to one embodiment.
  • Figure 14 shows the c-TE2A 64 cover the 64 Cu in (RGDyK) Cu- TE2A-c ( RGDyK) metal chelating radio -TLC chromatogram of a conjugate compound according to one embodiment.
  • Figure 15 shows the HPLC chromatogram for analyzing the radio TE2A-c 64 a cover 64 for the Cu (RGDyK) Cu- TE2A-c ( RGDyK) metal chelating compound conjugate according to one embodiment.
  • Figure 16 is a metal chelating conjugate according to one embodiment to verify the production of the gate compound TE2A-c (RGDyK) conjugated compounds, and thereto 64 Cu A 64 Cu-TE2A-c (RGDyK ) covers the metal chelating conjugates Analytical HPLC chromatograms of each compound are shown together.
  • FIG. 17 is a view showing the biodistribution results of TE2A-c 64 a cover 64 for the Cu (RGDyK) Cu- TE2A-c ( RGDyK) metal chelating compound conjugate according to one embodiment.
  • FIG. 18 illustrates injecting a 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) metal chelating conjugate compound labeled 64 Cu to TE2A-c (RGDyK) according to an embodiment into female nude mice with U87MG tumor cells Drawing.
  • FIG. 19 is a time zone after the commitment to TE2A- c 64 a cover 64 for the Cu (RGDyK) Cu- TE2A-c ( RGDyK) with a metal chelating compound conjugated to the U87MG tumor cell female nude mice according to one embodiment Micro PET images are shown.
  • Figure 20 shows a chromatogram of the radio -ITLC TE2A- trastuzumab a 64 a 64 Cu Cu- TE2A- trastuzumab metal chelating compound conjugated to the cover in accordance with one embodiment.
  • Figure 21 is a metal chelating compound conjugated to TE2A- prepared according to one embodiment to determine trastuzumab conjugate compound and a Cu 64 In each of the 64 Cu-TE2A- trastuzumab metal chelating compound conjugated to the cover of the The SECHPLC chromatogram of is shown.
  • FIG. 22 shows 64 Cu—labeled with 64 Cu in TE2A—trastuzumab according to one embodiment.
  • the time-phase micro PET image is shown after TE2A-trastuzumab metal chelating conjugate compound is injected into female nude mice with NIH3T6.7 tumor cells. [Best form for implementation of the invention]
  • a functionalized TE2A-NCS was prepared from the compound (5) prepared in Example 2 by introducing different isothiocyanate groups via two routes represented by the following reaction formula 3.
  • Example 3 1,8-bis- (carboxymethyl) -4- (4'-isothiocyanatobenzyl) -1,4, 8, 11-tetraazacyclotetra with t-butylbromoacetate Preparation of Deccan (13) 1,8-bis- (carbo-t-buroxymethyl) -4- (4'-nitrobenzyl) -1,4, 8, 11-tetraazacyclotetedecane ( 7 Manufacturing
  • Example 5 From the compound (4) prepared in Example 1, a functionalized TE2A-NCS compound (13) was prepared by introducing an isothiocyanate group via a route shown in Scheme 4 below.
  • a functionalized TE2A-NCS compound (14) was prepared by introducing an isothiocyanate group via a route represented by Scheme 5 below.
  • Benzyl chloroformate (34.32 mL, 41.59 g, in a solution of cyclone compound 17 (20 g, 116.1 mmol) dissolved in CHC1 3 (200 mL) in a container with ice water 243.8 ⁇ l ol) was added dropwise. At this time the temperature was kept below 0 ° C. After complete addition the mixture was stirred at room temperature for 10 hours to ensure sufficient solids formed. The solvent was evaporated under reduced pressure to give a white solid, to which ether (200 mL) was added. The solid was filtered off, washed with ether (2 ⁇ 50 mL) and dried in vacuo while maintaining 45 ° C.
  • Acid decomplexation experiments were performed at 90 ° C., similar primary conditions, using a sample of compound (30) at a concentration of 2.2 mmol in 5 M HCl (2 mL). Changes in maximum absorption over time were determined using Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer (UV-1650PC). Was monitored in thermostated cells. The progress of decomplexation reaction was monitored using the decreasing absorption power in each spectrum (Cu-TE2A 549 nm, Cu—TE2A-N0 2 561 nm). The half-life was calculated from the slope in time coordinates for the linear In (absorbance). Each experiment was repeated 2-3 times, and the average of half-lives was obtained. The measured results are shown in Tables 2 and 3A and 3B.
  • Cyclic voltametry was carried out using a biological model SP-150 with a three-electrode structure.
  • the reference electrode was made of Ag / AgCl (saturated KC1)
  • the counter electrode was made of Pt wire.
  • Sample (2 mM) of compound (30) was operated at a scan rate of 100 mV / s in 0.1 M aqueous acetic acid adjusted to pH7.0 with glacial acetic acid.
  • the solution was deoxygenated with Ar for 30 minutes prior to use, and the Ar atmosphere was maintained during the measurement.
  • the measured results are shown in Table 2 below, FIGS. 4A and 4B.
  • TE2A-mono-Me (compound (32)) to which a methyl group was introduced was prepared from the compound (5) prepared in Example 2, via the route shown by the following reaction formula (9).
  • Cu-TE2A-di-Me (compound (36)) in which Cu was chelated was prepared from the compound (34) prepared in Example 13, via the route shown in Reaction Formula 12 below.
  • the metal chelating conjugate compound may be prepared by binding BFC to a bioactive molecule such as a peptide and then chelating the metal or binding a bioactive molecule such as a peptide to a pre-prepared metal-BFC chelate.
  • a bioactive molecule such as a peptide
  • a bioactive molecule such as a peptide to a pre-prepared metal-BFC chelate.
  • TE2A-c (RGDyK), which appears at retention time of 21.7 minutes on HPLC, was collected and freeze-dried to give white powdery TE2A-c (RGDyK) compound (37) in 82% yield.
  • FIG. 11 shows the chromatogram for TE2A-c (RGDyK) compound (37) on semi-preparative HPLC
  • FIG. 12 shows the chromatogram for TE2A-c (RGDy) compound (37) on analytical HPLC. It is shown.
  • FIG. 13 shows mass spectrometry spectra for TE2A-c (RGDyK) compound (37).
  • 64 Cu labeled peptide is reverse-phase (RP) HPLC (Vydac TP C18; 3 ym, 4.6 X 100 kPa; flow rate 1 mL / min, mobile phase 0,1% TFA / H 2 0 (solvent A) and 0.1% TFA / MeCN (solvent B), gradient elution conditions Further purified from 1% B to 703 ⁇ 4> B) at 20 min.
  • 64 Cu-TE2A—c (RGDyK) Compound (38) (retention time [t R ] 13.8 min) was collected in 12 mL HPLC solvent, the solvent was evaporated, and recovered with PBS (phosphate-buffered saline). .
  • the recovered 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) compound (38) was then passed through a 0.22 ⁇ millipore (Mi 1 lipore) filter and transferred to a sterile bottle for animal experiments.
  • FIG. 14 shows radio-TLC chromatogram for 64 Cu-TE2A—c (RGDyK) compound (38),
  • FIG. 15 shows 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) compound (38) on analytical HPIX. Radio chromatograms are shown.
  • FIG. 16 shows together chromatograms for each of TE2A-c (RGDyK) compound (37) and 64 Cu-TE2A c (RGDyK) compound (38) on analytical HPLC to confirm the preparation of the metal chelating conjugate It is.
  • Example 17 shows radio-TLC chromatogram for 64 Cu-TE2A—c (RGDyK) compound (38)
  • FIG. 15 shows 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) compound (38) on analytical HPIX. Radio chromatograms are shown.
  • FIG. 16 shows together chromatograms for each of TE2A-c (RGDyK) compound (37) and 64 Cu-TE2A c (RGDyK) compound (38) on analytical HPLC to confirm
  • PET scans and image analysis in this example were done using a micro PET R4 rodent model scanner. Imaging experiments were performed on female nude mice 41 days after U87MG injection. 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) Compound (38) (205 uCi) was injected into the tail of the mouse. After 1 hour, 4 hours, 1 day, 2 days and 3 days after injection, the rats were anesthetized with 1-2% isoflurane and fixed in the prone position to obtain an image. Images were reconstructed using a 2-dimensional ordered subsets expect at ion maximizat ion (OSEM) algorithm, with no attenuation or scatter correction.
  • FIG. 18 shows the incorporation of 64 Cu-TE2A-c (RGDyK) compound (38) into female nude mice with U87MG tumor cells as subjects, and FIG. 19 is a 64 Cu-TE2A—c (RGDyK) compound (38). 1), 4 hours, 1 day, 2 days, and 3 days of micro-PET images according to time.
  • Example 19 In the present Example, the TE2A-NCS compound (14) prepared in the above example was bound to the antibody trastuzumab (Herceptin) following the route shown in the following formula (14), followed by chelation of the metal 64 Cu [ 64 Cu -TE2A-trastuzumab] metal chelating conjugate compound (40) was prepared.
  • the solution was stirred gently at room temperature for 24 hours The next day it was transferred to centricon YM—50 and spun to reduce solvent PBS (pH) to the resulting TE2A-trastuzumab 7.2, 3 ⁇ 2 mL) and centrifuged to remove unreacted ligands 2.00 mL of PBS was added to purified TE2A-trastuzumab compound (39) and stored at 20 ° C.
  • Radiochemical purity was determined by Size Exclusion chromatography (SEC) HPLC (Bio Silect SEC 250-5300X7.8 ⁇ ; flow rate lmL / min, PBS as isotropic mobile phase, pH 7.4), instant TLC ITLC-SG, saline Development).
  • SEC Size Exclusion chromatography
  • FIG. 20 shows the radio ITLC chromatogram for 64 Cu-TE2A-trastuzumab compound 40
  • FIG. 21 shows the TE2A-trastuzumab compound on SEC HPLC to confirm the preparation of the metal chelating conjugate compound
  • the chromatograms for each of (39) and 64 Cu—TE2A-trastuzumab compound (40) are shown together.
  • PET scans and image analysis in this example were done using a micro PET R4 Rodent model scanner. Imaging experiments were conducted in female nude mice 31 days after NIH3T6.7 injection. 64 Cu-TE2A- trastuzumab compound (40) (145 Ci) was injected into the tail of the mouse. After 1 hour, 4 hours, 1 day, 2 days, 3 days, and 5 days after injection, the rats were anesthetized with 1-2% isoflurane and fixed in the prone position to obtain an image. The images were reconstructed with a two-dimensional 0SEM algorithm, with no attenuation or scatter correction.
  • Figure 23 is a diagram showing a 64 Cu- TE2A- trad Stu jumap
  • the compound 40 of the experiment female nude mice with a tumor cell target NIH3T6.7
  • 24 is 64 Cu-Triton TE2A- Stu jumap compound (40 1), 4 hours, 1 day, 2 days, 3 days, and 5 days of micro-PET images after the injection.
  • the various embodiments described above are intended to limit the scope of the invention. The true scope and spirit of the disclosure are indicated by the following claims.

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Abstract

본 발명에 따라 이작용기성 킬레이트제(BFC)로서 유용한 신규의 폴리아자마크로사이클릭 화합물을 선택적이며 높은 수율로 합성할 수 있다. 합성된 신규의 폴리아자마크로사이클릭 화합물은 금속에 킬레이트되어 펩티드 등의 생활성(bioactive) 분자와 컨쥬게이션될 수 있으며, 질환의 치료 및 진단에 응용될 수 있다.

Description

폴리아자마크로사이클릭 화합물， 그 제조 방법 및 생의학적 적용
【기술분야】
본 발명은 이작용기성 킬레이트제 (bifunctional chelator; BFC)로서 생활성 (bioactive) 분자와 금속을 연결하여 치료， 진단에 사용될 수 있는 신규의 폴리아자마크로사이클릭 화합물， 그 제조 방법 및 생의학적 응용에 관한 것이다.
【배경기술】
테트라아자사이클로알칸 유도체의 발견과 합성은 다양한 금속양이 온과 배위하는 거대고리분자의 능력 때문에 과거 몇 년 동안 관심이 증가 하고 있다. 그 중 사이클렌 (1，4，7，10-테트라아자사이클로도데칸) 및 사이 클람 (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸)이 집중적으로 연구되었는데， 이들의 거대고리분자 구조는 금속 복합체 형성에 매우 유리하다. 이처럼 고리계 폴리아민은 일정 금속과 강한 친화성을 나타내고 이들과 선택적으 로 결합할 수 있어서, 금속 촉매， 메탈로엔자임 (methalloenzyme)의 반웅 자리， DNA와 RNA를 비롯한 인산에스테르의 절단제, 방사성 진단과 치료뿐 만 아니라 MRI 조영제 등으로서 사용될 수 있다.
의료용으로 관심이 높은 금속 이온 중 사이클렌이나 사이클람 유도체와 안정한 착물을 형성하는 이온은 MRI 조형제로 사용할 수 있는 Gd 뿐만 아니라 핵의학에서 사용 가능한 방사성 동위원소들이 있다.64Cu, mIn, 67Ga, 86Y 등은 양전자방출 단층촬영 (PET; positron emission tomography)이나 단일광자방출 단층촬영 (SPECT; single photon emission computed tomography)을 이용한 진단에 사용 가능한 방사성동위 원소이고， 90Y는 치료용으로 사용 가능한 방사성 동위원소이다 <Anderson CJ, Welch MJ. Rad i omet a 1 -Labeled Agents (Non-Technet ium) for Diagnostic Imaging. Chem Rev 1999;99:2219-34; Anderson CJ, Lewis JS. Radiopharmaceuticals for targeted radiotherapy of cancer . Expert Opinion on Therapeutic Patents 2000 ;10:1057-69〉.
예를 들어， 핵의학이나 전임상 웅용에서 64Cu와 같은 방사성 핵종의 사용이 증가하고 있는데， 방사성 핵종을 생활성 분자 즉 표적 분자에 안전하게 부착시키는데 BFC가 사용된다. 따라서， 생체내 안정성이 우수한 BFC의 개발은 방사성 핵종의 생체내 전달을 위한 시스템의 고안에 있어 매우 중요하다.
그동안 생체내에서 안정하게 킬레이트할 수 있는 리간드를 개발하 기 위해서 많은 노력이 투입되었는데， 연구된 가장 일반적인 BFC는 D0TA( 1,4,7, 10-테트라아자사이클로도데칸 -1 ,4,7, 10-테트라아세트산)와 TETA ( 1， 4， 8 , 11-테트라아자사이클로테트라데칸 -1， 4， 8， 11-테트라아세트산)이 다. 그러나， 최근의 연구는 이렇게 일반적으로 사용되는 BFC가 근래에 개 발된 BFC, 예를 들어， 가교된 테트라아민 리간드, 사르코파진 (sarcophagine)리간드에 비해 금속의 해리가 증가하기 때문에 생체 내에서 불안정하다는 것을 보여준다.
최근 보스웰 (Boswell) 등은 펩티드 콘쥬게이션과 64Cu 방사성 표지를 위한 가교된 사이클람 유도체들을 보고하 ^다 [Bioconj'ugate Chew. 2008， 19, 1476-1484] . 이들은 64Cu-교차 연결된 (cross-bridged; CB)- £2/\(1，8-비스-(카르복시메틸)-1，4，8，11-테트라아자사이클로테트라데칸)- 프로펩티드 링커를 합성하고, c[RGDfK(s)]를 컨쥬게이션하였다. 또한， 아키발드 (Archibald) 그룹은 바이오 컨쥬게이션을 위한 NCSBz_CB-TE2A 유도체를 보고하였다 Commun. , 2004, 2122-2213] . 그러나， 고리계 폴리아민에 있어서 질소의 선택적 관능화는 자명하지 않고， 여전히 유기 합성 분야에서 어려운 일이다. 예를 들어， NCSBZ-CB-TE2A의 합성은 출발물질의 제조를 비롯하여 13 단계를 경유하여야 하고， 최종 생성물의 전체적인 수율이 8.7%에 불과하다. 따라서， BFC로서 유효하게 사용될 수 있는 새로운 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 고안 및 이를 높은 수율로 용이하게 제조할 수 있는 합성 방법의 개발이 필요하다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서， 본 발명의 목적은， 합성이 용이하고, 다양한 치환체의 도입이 가능하며， 수율이 높고, BFC로서 유용한 신규의 폴리아자마크로사이클릭 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 신규의 폴리아자마크로사이클릭 화합물을 생의학적 용도로 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
본 개시에 있어서， 킬레이트는 금속이온과 두 자리 이상의 여러 자리 리간드가 배위한 화합물을 의미하며， 이때의 리간드를 킬레이트제 (chelator)라고 한다.
또한， 본 개시에 있어서, 컨쥬게이트 화합물 (conjugate compound)은 킬레이트제가 단백질, 펩티드， 항체 등에 컨쥬게이션을 통해 결합한 화합물을 지칭하고, 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물은 킬레이트와 단백질, 펩티드, 항체 등이 컨쥬게이션을 통해 결합하거나, 컨쥬게이트 화합물이 금속 이온 (착이온)과 결합한 화합물을 의미한다.
본 발명에 의한 진단 또는 치료하기 위한 약학적 배합물은 BFC를 이용하여 금속 방사성 핵종의 킬레이트를 단백질， 펩티드， 항체 또는 항체 단편 등의 표적 분자에 컨쥬게이션하여 이루어진다. 따라서, BFC는 방향족 이소티오시아네이트 기 또는 활성화된 에스테르와 같은 반웅성 작용기를 가지며， 표적 분자의 -NH2, -SH, 또는 -0H과 같은 뉴클레오필릭 결합 부위와 반웅하게 된다 <Liu, S., and Edwards , D. S. (2001) Bi functional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals. Bioconjugate Chem. 12, 7-34>. 이 때 활성화된 에스테르는 예를 들어 하기 작용기 등으로 활성화될 수 있으며， 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure imgf000006_0001
본 발명에 의한 진단 또는 치료하기 위한 약학적 배합물에는 필요에 따라 약동학적 특성 (Pharmacokinetic properties) 및 생체 내 분포를 조정하기 위한 링커가 킬레이트제와 표적 분자 사이에 도입될 수 있다 <Parry, J. J. , Kelly, T. S. , Andrews, R. , and Rogers, B. E. (2007) In vitro and in vivo evaluation of 64Cuᅳ labeled DOTA-1 inkerbombesin(7-14) analogues containing different amino acid linker moieties. Bioconjugate Chem. 18, 1110-1117, Dijkgraaf, I. , Liu, S.， Kruijtzer, J. A. W.， Soede, A. C. , Oyen, W. J. G. , L i skamp , R. M. J. , Cor s tens, F. H. M. , and Boerman, 0. C. (2007) Effects of linker variation on the in vitro and in vivo characteristics of an lllln-labeled RGD pept ide. Nucl . Med. Biol . 34, 29- 35, Li， L. , Yazaki， P. J. , Anderson, A.-L.， Crow, D. , Colcher, D.， Wu, A. M. Williams, L. E. , Wong, J. Y. C. , Raubitschek, A. , andShively, J. E. (2006) Improved biodistr ibution and radioimmuno imaging with poly(ethylene glycol )-D0TA-conjugated anti-CEA diabody. Bioconjugate Chem. 17, 68ᅳ 76〉. 유용한 링커로 예를 들어 다음의 것들을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure imgf000007_0001
본 발명에 의한 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 1로 표시된다 .
【화학식 1】
Figure imgf000008_0001
(상기 식에서 ,
m, n, p 및 q는 동일하거나 상이하고 각각 2 또는 3의 정수이고, r은 0 내지 5의 정수이고，
t는 0 또는 1의 정수이고，
r+t >0 이고，
R1, R2, R3, R4' R5, R6, R7, R8은 동일하거나 상이하고 각각 H, d-5알킬， 또는 C3-6 시클로알킬이고,
R10은 H, d-5 알킬， C3-6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬이고，
U 및 W는 동일하거나 상이하고 각각 H, d-5 알킬， 또는 C3-6 시클로알킬이고， .
Y 및 Z는 동일하거나 상이하고 각각 H, d-5 알킬， 또는 C3-6 시클로알킬이고，
A는 C6-10아릴이고，
Q는 H, 니트로， 아미노, 이소티오시아네이토， 말레이미도, 에스테르, 알킨， 아미노옥시， 티을, 아지드， 또는 카르복실산이다.) 본 발명에 있어서, R , R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, U, W, Y 및 Z의 Ci-5 알킬， C3-6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬은 ( 4 알킬， 할로겐, 하이드록실， 니트로， 시아노, 알콕시， 아미노， 에스테르기 및 카르복실기 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 있어서 , A의 C6— 10아릴은 d-4 알킬ᅳ 할로겐, 하이드록실， 알콕시， 에스테르기 및 카르복실기 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 염은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 음으로 하전되는 성분을 포함할 경우에는 칼륨, 나트륨， 리튬， 암모늄， 은， 칼슴 및 마그네슘으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 양이온 또는 양이온 그룹을 포함할 수 있고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 양으로 하전되는 성분을 포함할 경우에는 F―， C1", ΒΓ, Γ, C104—， BFV, HC03 ", C¾C02—， CH3S(V, C¾C6H4S()3_, CF3S03 ", H2P04 " 및 B(C6H5)4-으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 음이온 또는 음이온 그룹을 포함할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 BFC로서 작용하며， 이소티오시아네이토 기 또는 활성화된 에스테르 기 등을 통해 단백질， 펩티드, 항체 또는 항체 단편 등에 컨쥬게이션한다.
본 발명에 의한 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적 으로 허용되는 염은， 예를 들어 하기 화학식 2로 표시되는 1,8-비스- (카르 복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토벤질)ᅳ 1ᅳ 4, 8， 11-테트라아자사이클로테 트라데칸， 화학식 3으로 표시되는 1,8-비스- (카르복시메틸) -4-(4'-이소티 오시아네이토펜에틸 )-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸， 화학식 4로 표시되는 1， 7-비스- (카르복시메틸) -4-(4 ' -이소티오시아네이토벤질) -
1,4， 7， 10-테트라아자사이클로도데칸， 화학식 5로 표시되는 1,7-비스- (카르 복시메틸) -4— (41 -이소티오시아네이토펜에틸) -1， 4， 7， 10-테트라아자사이클로 도데칸， 화학식 6으로 표시되는 1，8-비스- (카르복시메틸) -4-(4'-니트로펜 에틸) -1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸， 또는 화학식 7로 표시되는 1,8-비스- (카르복시메틸) -4- (메틸 )-1，4, 8， 11-테트라아자사이클로테트라데 칸일 수 있다.
【화학식 2]
Figure imgf000010_0001
【화학식 3】
Figure imgf000010_0002
【화학식 4】
Figure imgf000010_0003
【화학식 5】
/ᅳᅳ V /— GGOH
NH 【화학식 6]
Figure imgf000011_0001
【화학식 7】
Figure imgf000011_0002
발명에 따른 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 약학적으로 허용되는 염과 킬레이트하는 금속은 방사성 또는 비방사성으로， 전이 금속， 란탄족 원소， 악티니드 계열원소ᅳ 및 금속 주요군 원소를 포함한다. 예를 들어, 킬레이트하는 방사성 금속은 43Sc, 3V, 44Sc, 45Ti,
In, 51Cr, 52Mn, 52Fe, 53Fe, 55Co, 56CO, 57CO, 58CO, 59Fe, 60Cii, 61CU, 62Cu, 62Zn,
!Zn, 6Cu( 65Zn, 66Ga, 66Ge, 67Ge, 67Cu, 67Ga, 68Cu, 68Ga, 69Ge, 69As, 70As, 70Se,
"Se, 71As, 72As, 73Se, 74Kr， 74Br, 75Se, 75Br, 76Br, 77Br, 77Kr, 78Br, 78Rb, 79Rb,
'Kr ,81Rb, 82Rb, 83Sr, 84Rb, 84Zr, 85Y, 86Y, 87Y, 87Zr, 88Y, 89Zr, 90Y, 89Zr, 92Tc,
'Tc, 94Tc, 95Tc, 95Ru, 95Rh, 96Rh, 97Rh, 97Ru, 98Rh, 99Rh, 94raTc, 99mTC, 100Rh, 101Ag, 102Ag, 102Rh, 103Ag, 103Ru, 104Ag, 105Ag, 105Ru, 106Ag, 108In, 109In, 110In, inIn, 113Ίη, 115Sb, 116Sb, 117Sb, 115Te , 116Te, 117Te, 117I， 1181, 118Xe , 119Xe , 1191 , 119Te,
120
丄 120Xe, 121Xe, 121I, 122I, 123Xe, 124 I, 126I, 128 j 129La, 130La, 131La, 132La,
133La, 135La, 136 , 14 V 141Sm, 142Sm, 144Gd, 14¾d' 14¾u, 146Gd, 146Eu, 147Eu,
147Gd, 148Eu, 149Pr， 150Eu, 153Sm, 159Gd, 166Ho, 169Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 190Au, 191Au, 192Au, 193Au, 193T1， 19T1 , 19V 195T1 , 196T1， 197T1， 198T1 , 200Bi , 201T1, 202Bi , 203Bi , 205Bi , 206Bi , 211As , 212Bi , 또는 225Ac일 수 있으나 , 이에 한정되는 것은 아니다.
SPECIE 방사성 금속으로 바람직하게는 67Ga, 68Ga, 99raTc, mIn을 들 수 있고， 또는 PET용 방사성 금속으로 바람직하게는 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 86Y, 89Zr, 9½Tc를 들 수 있으며， 치료용 방사성 금속으로 바람직하게는 67Cu, 90Y, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 18¾e을 들 수 있다 <S. Liu, Bi functional coupling agents for radiolabel ing of biomolecules and target一 speci f ic delivery of metallic radionuclides, Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1347-1370>.
그 중 64Cu는 반감기 (12.7 시간)， 붕괴 특성 (β+ (19%), β- (39%)), 생의학 사이클로트론 (cyclotron)을 사용하여 높은 특이적 활성으로 많은 양을 생산하는데 있어서의 적합성 등으로 양전자방출단층촬영 (PET) 영상과 표적 방사선 치료에 유용한 핵종이다.
본 발명에 의한 컨쥬게이트 화합물은， 아미노산， 펩티드， 단백질, 뉴클레오시드， 뉴클레오티드， 압타머, 핵산, 효소， 지질, 질소 -함유 비타민， 질소 -함유 호르몬， 약물， 나노입자, 항체， 또는 항체 단편에 컨쥬게이션되는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명에 의한 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물은， 아미노산， 펩티드, 단백질, 뉴클레오시드， 뉴클레오티드， 압타머， 핵산， 효소， 지질， 질소 -함유 비타민， 질소 -함유 호르몬， 약물， 나노입자, 항체， 또는 항체 단편에 상기 킬레이트가 컨쥬게이션되거나， 상기 컨쥬게이트 화합물에 방사성 (예를 들어 핵의학 치료 또는 진단의 경우) 또는 비방사성 (예를 들어 자기공명영상 조영제 등의 진단의 경우) 금속 이은， 예를 들어 전이 금속， 란탄족 원소， 악티니드 계열원소， 금속 주요군 원소로부터 유래하는 금속 이온을 결합한 것으로서， 치료 또는 진단용으로 사용할 수 있다. 본 발명에 의한 조영제는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 구체적으로， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 킬레이트제로 이용하여 상자성올 띠는 금속 이온 예를 들어, Mn, Fe, Gd 등과 킬레이팅시키고, 질병특이적 생체물질과 컨쥬게이션시킴으로써, 예를 들어 초음파 조영제 컴퓨터단층촬영 (computed tomography: CT) 조영제， 자기공명영상 (magnetic resonance imaging: MRI) 조영제， SPECT또는 PET와 같은 진단 /검사시의 조영제로 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 약학적 배합물은， 상기 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고， 종양, 치매， 또는 마이코플라스마， 병원체표면항원， 독소， 효소， 알레르기원， 약물， 생물학적 활성분자， 박테리아， 곰광이， 바이러스， 기생층， 자가면역， 심장， 신경계와 관련된 질환을 진단 또는 치료하는데 사용된다. 본 발명에 의한 약학적 배합물은 특히 종양을 진단 또는 치료하는데 사용된다.
본 발명의 인간을 제외한 포유 동물의 질환, 예를 들어 종양을 진단 또는 치료하는 방법은， 효과량의 상기 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 인간을 제외한 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트가 컨쥬게이션하는 항체는 단일클론 또는 다클론 항체， 키메릭 항체 또는 이종항체， 또는 예를 들어， 아넥신, 항 -CEA, 토시투모맙 (Tositumomab), 트라스투주맙 (trastuzuniab), HUA33, 에프라투주맙 (Epratuzumab) cG250, 이브리투모맙 류세탄 (Ibritumomab Tiuxetan) 등의 유도체를 포함하는 단백질을 포함하는， 항체가 될 수 있다. 본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트에 결합될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 당 분야에서 잘 알려진 기술로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 킬레이트제 또는 킬레이트가 컨쥬게이션하는 단백질로 예를 들면, 알부민, TCII, HSA, 아넥신 및 Hb 등이 있고; 펩티드로 예를 들면， RGD-함유 펩티드, 멜라닌세포 -자극 호르몬 (MSH) 펩티드， 네우로텐신， 칼시토닌, 트레오티드， 봄베신， 뉴로텐신， 우로텐신 II 및 안지오텐신; 질소 -함유 비타민으로 예를 들면， 비타민 A, Bl, B2, B12, C,D2, D3, E, H 및 K; 질소 -함유 호르몬으로 예를 들면, 에스트라디을, 프로게스테론 및 테스토스테론 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1 또는 하기 화학식 8의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법을 설명하면 다음과 같다.
【화학식 8】
Figure imgf000014_0001
(상기 식에서， m, n, p, q, r, t, R1, 2, R3, R4, R5, 화학식 1에서 정의된 바와 동일하다.) 본 발명에 의한 상기 화학식 1 또는 8의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법은, (i) 하기 화학식 9의 화합물을 a-할로카르복실산 에스테르 (X-CUW-C02R9)와 반웅시켜 트랜스ᅦ， Ν'-이치환된 하기 화학식
10의 화합물올 얻는 단계， (ii) 화학식 10의 화합물을 염기와 반응시켜 하기 화학식 11의 화합물을 얻는 단계, (iii) 화학식 11의 화합물의 사이클릭 내 2차 아민에 작용기 -(CYZ)r-At-Q(r, t, Y, Z, A, Q는 화학식 1에 정의된 바와 동일함)를 도입하여 화학식 1 또는 8의 화합물을 생성하는 단계를 포함한다.
【화학식 91
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0003
【화학식 11】
Figure imgf000016_0001
(상기 식에서，
m, n, p, q, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, U, W는 화학식 1에서 정의된 바와 동일하고，
R9은 5 알킬， C3— 6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬이고，
X는 F, CI, Br 또는 I이다.) 본 발명에세 상기 R9의 d-5 알킬， C3-6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬은 ( 4알킬, 할로겐， 하이드록실, 니트로, 시아노， 알콕시， 아미노， 에스테르기 및 카르복실기 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 또는 8의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법에 있어서， Q를 도입하기 위한 반응은 당업계에 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식의 Q가 H인 경우 상기 단계 (iii)가 상기 화학식 11의 화합물을 X-(CYZ)r-At-H (X는 화학식 10에서 정의된 바와 동일함)와 반웅시켜 하기 화학식 12 또는 13의 화합물을 얻는 단계를 포함한다. 또한， 상기 화학식의 Q가 니트로， 아미노， 이소티오시아네이토， 또는 말레이미도인 경우, 상기 단계 (iii)가 상기 화학식 11의 화합물을 X-(CYZ)r-At-N02 (X는 화학식 10에서 정의된 바와 동일함)와 반웅시 켜 하기 화학식 14 또는 15의 화합물을 얻는 단계를 포함한다 . 【화학식 12】
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000018_0001
(상기 식에서，
m, n, p, q, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, U, W, Y, Z 및 A는 화학식
1에서 정의된 바와 동일하고, R9 및 X는 화학식 10에서 정의된 바와 동일하다) 본 발명에 의한 화학식 1 또는 8의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법에 있어서, 화학식 14， 15에서 Q를 도입하기 위한 추가 반웅은 당업계에 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식의 Q가 아미노기인 경우, 상기 단계 (iii)가 상기 화학식 14 또는 15의 화합물의 니트로기를 아민기로 환원시키는 단계를 더 포함하고, 상기 화학식의 Q가 이소티오시아네이토인 경우， 상기 단계 (iii)가 상기 화학식
14 또는 15의 화합물의 니트로기를 아민기로 환원시킨 후 티오포스겐과 반응시키는 단계를 더 포함하고, 상기 Q가 말레이미도인 경우， 상기 단계 (iii)가 상기 화학식 14 또는 15의 화합물의 니트로기를 아민기로 환원시킨 후 무수말레인산과 반응시키는 단계를 더 포함한다. 종래 사이클렌 또는 사이클람과 2 당량의 알킬 또는 아릴 할라이드의 반웅은 일치환-, 이치환-， 심지어는 삼치환-거대고리분자의 흔합물을 생성한다. 더욱이, 펜던트 암 (pendent arm)의 상대적 위치에 따라， 세 가지의 Ν,Ν'-이치환된 고리계 폴리아민， 즉, 두 종류의 시스- 이치환된 유도체와 한 종류의 트랜스-이치환된 유도체가 존재한다. 그 중 트랜스 -Ν,Ν'—이치환된 사이클렌 및 사이클람이 특히 주목할 만한데， 킬레이트 형성시 안정한 6-배위 화합물을 유도할 수 있기 때문이다. 또한， 트랜스 Ν,Ν'-이중보호된 사이클렌 및 사이클람은， 이들을 기재로 하는 크립탄드 (고리모양 폴리에테르 폴리아민)와 같은 3차원 시스템을 합성하는데 편리한 전구체이다.
본 발명은 출발물질로서 비스아미날 화합물 (화학식 9)을 제조하고 여기에 α-할로카르복실산 에스테르 (X-CUW-C02R9)를 반웅시킴으로써 트랜스^， Ν'-이치환된 폴리아자마크로사이클릭 화합물 및 유도체 (화학식 1， 8， 10 내지 15)를 용이하게 높은 수율로 합성하였다.
본 발명에서 카르복실산 보호기로서 R9은 예를 들어 메틸, 에틸， η- 프로필， 이소프로필 n_부틸， t-부틸 등의 5 알킬， 예를 들어 시클로펜틸， 시클로핵실 등의 C3-6 시클로알킬， 예를 들어 페닐, α-나프틸 등의 C6-12 아릴， 예를 들어 벤질, 펜에틸 등의 페닐 -d-2 알킬 그리고 α—나프틸메틸 등의 α-나프틸에-2 알킬 등의 C7-14 아랄킬， 실릴 등을 들 수 있으며， 이들은 d-4 알킬 , 할로겐, 하이드록실， 니트로, 시아노, 알콕시， 아미노， 에스테르기 및 카르복실기 중 하나 이상으로 치환될 수도 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
그 중 카르복실산 보호기로 벤질 및 t-부틸은 염기성 환경에서는 안정한 반면 산성 조건에서 쉽게 제거될 수 있어 바람직하다. 이와 관련하여， 상기 α-할로카르복실산 에스테르로서 예를 들어 t一 부틸브로모아세테이트 또는 벤질 브로모아세테이트를 사용하게 된다.
상기 카르복실산 보호기를 제거하는 방법은 공지된 어느 방법도 사용가능한데, 예를 들어 환원 또는 산분해 반웅의 방법을 들 수 있다. 상기 환원 방법으로서는， 예를 들어 팔라듐 탄소, 팔라듐 블랙， 산화 백금 등의 촉매를 사용하는 접촉환원, 액체 암모늄 중에서의 나트륨에 의한 환원， 디티오트레이를에 의한 환원 등을 들 수 있다. 산분해 방법으로서는， 예를 들어 불화 수소, 브름화 수소， 염화 수소 등의 무기산이나, 트리플루오로아세트산， 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산 등의 유기산， 또는 이들의 흔합물 등에 의한 산분해 등을 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 사용되는 비활성 용매로는 물， 메탄올, 에탄을， 이소프로판올， 이소부틸 알코올 , t-부틸 알코올， 아세토니트릴 (MeCN), 테트라하이드로푸란 (THF), 클로로품 (CHC13), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭시드 (DMS0), 벤젠， 를루엔， 크실렌， 디클로로메탄， 에틸렌글리콜， 아세톤， n-프로필 케톤, 트리클로로에틸렌， 에테르， 시클로핵사논， 부티로락톤 또는 이들의 흔합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 제조 방법에서 화학식 10의 화합물을 염기성 가수분해할 때 사용되는 염기는 KOH, NaOH, Ca(0H)2l Li[NTf2], KF/A1203 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한， 본 발명에 의한 트랜스 -Ν,Ν'-이치환 반응은 상온에서 행하여 지지만， 필요한 경우 이보다 낮거나 높은 온도를 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 제조 방법에서 각 단계의 반응 시간은 일반적으로는 1 시간 내지 5 일， 바람직하게는 3 시간 내지 2 일이지만， 필요한 경우 이보다 짧거나 긴 반웅 시간을 사용할 수 있다. 【유리한 효과】
본 발명에 따른 폴리아자마크로사이클릭 화합물은 용이하게 합성될 수 있으며， 시간 및 노동 집약적인 크로마토그래피를 이용한 분리를 최소화하면서 편리하게 높은 수율로 정제될 수 있다.
본 발명에 의하면， 비스아미날과 α—할로카르복실산 에스테르를 반응시킴으로써 선택적으로 트랜스ᅦ， Ν1-이치환된 고리계 폴리아민을 합성할 수 있다.
본 발명에 의한 폴리아자마크로사이클릭 화합물은 유용한 BFC 로서 작용하며 64Cu 등의 방사성 핵종과 킬레이트되어 펩티드 등의 표적 분자를 방사성 표지하는 등 생의학적으로 웅용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 일 실시예에 따른 TE2A-N02에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른 Cu-TE2A-N02에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 각각 대조예로서 Cu-TE2A 및 일 실시예에 따른 Cu- TE2A-N02에 대해 산 탈착물화 실험에 있어서 시간에 따른 최대 흡수 변화를 모니터링한 UV-Vis 분광광도계 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 각각 대조예로서 Cu-TE2A 및 일 실시예에 따른 Cu- TE2A-N02에 대해 순환전압전류 (cyclic \^113醒0 3)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 일 실시예에 따른 카르복시산의 보호기 t-부틸이 도입된 TE2A-모노-메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 일 실시예에 따른 카르복시산의 보호기가 제거된 TE2A- 모노-메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 일 실시예에 따른 카르복시산의 보호기 t-부틸이 도입된
TE2A-다이-메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 일 실시예에 따른 카르복시산의 보호기가 제거된 TE2A- 다이—메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 9는 일 실시예에 따른 Cu-TE2A-모노-메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 알 실시예에 따른 Cu-TE2A-다이-메틸에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)의 세미 분취용 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 12는 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)의 분석용 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 13은 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)에 대한 질량 분석 스펙트럼올 나타낸 것이다.
도 14는 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 라디오 -TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 15는 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 분석용 HPLC 라디오 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 16은 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 제조를 확인할 수 있도록 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK) 컨쥬게이트 화합물 및 이에 64Cu를 표지한 64Cu-TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 각각의 분석용 HPLC 크로마토그램을 함께 도시한 것이다.
도 17은 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 생체 내 분포 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 일 실시예에 따른 TE2A-c(RGDyK)에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 U87MG 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 투입하는 것을 도시한 도면이다.
도 19는 일 실시예에 따른 TE2A— c(RGDyK)에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-c(RGDyK) 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 U87MG 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 투입한 후의 시간대별 마이크로 PET 영상을 나타낸 것이다.
도 20은 일 실시예에 따른 TE2A-트라스투주맙에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-트라스투주맙 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 라디오 -ITLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 21은 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 제조를 확인할 수 있도록 일 실시예에 따른 TE2A-트라스투주맙 컨쥬게이트 화합물 및 이에 64Cu를 표지한 64Cu-TE2A-트라스투주맙 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 각각의 SECHPLC 크로마토그램을 함께 도시한 것이다.
도 22는 일 실시예에 따른 TE2A—트라스투주맙에 64Cu를 표지한 64Cu-
TE2A-트라스투주맙 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물의 생체 내 분포 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 일 실시예에 따른 TE2A-트라스투주맙에 64Cu를 표지한 64Cu- TE2A-트라스투주맙 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 NIH3T6.7 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 투입하는 것을 도시한 도면이다.
도 24는 일 실시예에 따른 TE2A-트라스투주맙에 64Cu를 표지한 64Cu-
TE2A-트라스투주맙 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 NIH3T6.7 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 투입한 후의 시간대별 마이크로 PET 영상을 나타낸 것이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
하기에서 참고예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 그러나, 아래의 참고예 및 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 여기에 한정되지 않음을 밝혀둔다.
<참고예 1 내지 8>
α-할로카르복실산 에스테르 (X-CUW-C02R9)로서 t- 부틸브로모아세테이트 및 벤질 브로모아세테이트를 사용하여 하기 반웅식 1의 화합물 (1)과 반웅시키기 위한 조건을 조사하였다.
<반응식 1>
Figure imgf000024_0001
R=t-Bu,Bn 구체적으로 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 용매의 종류 및 α- 할로카르복실산 에스테르의 당량을 변화시켜 트랜스^， Ν'-이치환된 사이클람을 합성하였다. 【표 1】
Figure imgf000025_0001
상기 표 1에서 보는 바와 같이， t-부틸브로모아세테이트를 알킬화제로 사용하고, 용매로서 CH3CN(MeCN)을 사용할 경우 수율이 95%로 가장 효과적이었으며 (표 1의 참고예 1), THF와 CHC13는 각각 40%와 45%로 완만한 수율을 나타내었다 (표 1의 참고예 3 및 4). 또한, 2 당량과 4 당량의 t-부틸브로모아세테이트를 반웅에 사용하였는데， 4 당량의 t- 부틸브로모아세테이트를 사용했을 때 선택도 및 수율이 우수하였다 (표 1의 참고예 1 및 2).
<실시예 1 및 2>
α-할로카르복실산 에스테르 (X-CUW-C02R9)로서 t- 부틸브로모아세테이트 및 벤질 브로모아세테이트를 사용하고 아래 반응식 2에 도시된 경로를 통하여 TE2A ( 1,8-비스- (카르복시메틸) -1,4,8, 11- 테트라아자사이클로테트라데칸) (화합물 (6))를 합성하였다.
Figure imgf000026_0001
실시예 1: 벤질 2-브로모아세테이트를 이용한 TE2A(6)의 제조
1,4,8， 11-테트라아자사이클로 [9.3.1.1]-핵사데칸 (1)의 제조 화합물 (1)은 R. Guilard, C. Lecomte 등으로부터 이전에 보고된 방법을 수정하고 스케일을 증가시켜 제조하였다. 요약하면， 2 당량의 포름알데히드 (15.1 mL, 물 중 37%)를 0 내지 5°C의 온도에서 사이클람 수용액 (20.3 g, 증류수 200 mL 중 0.10 몰)에 빠르게 첨가하였다. 반응 흔합물을 상온으로 승온시킨 뒤, 2시간 동안 교반하였다. 반웅 흔합물을 다시 0 내지 5°C의 온도로 냉각시키고， 이때 형성된 흰색 침전물을 차가운 물로 여과 및 세척하였다 (2 X 10 mL). 얻어진 흰색 고체를 CHC13(200 mL)에 용해시키고， MgS04로 건조하였다. CHC13이 증발하도록 감압하여 화합물 (l)(20.95g, 92% 수율)을 얻었다. 화합물 (1)의 분광분석 데이터는 기존에 보고된 것과 정확하게 일치하였다. ¾ NMR (400 MHz, CDC13): δ 5.63- 5.60(dt, 2H, J = 10.8 Hz), 3.14-3.12(d, 4H, J = 9.8Hz), 2.90-2.87(d, 2H, J = 10.8 Hz), 2.84-8.80(m, 4H), 2.65-2.58(m, 4H) ' 2.38-2.35(d, 4H, J = 9.9Hz), 2.3-2. Km, 2H), 1.17-1.14(m, 2H); 13C匪 R(100.6腿 z,CDCl3) : δ 69.3 54.1, 49.8, 20.6.
1 , 8-비스- (벤질옥시카르보닐메틸) -4 , 11-디아조니아트리사이클로
[9.3.1.1]핵사데칸 디브로마이드 (2)의 제조
4당량의 벤질 2—브로모아세테이트 (10.29 mL, 15.03 g, 65.6 隱 ol)를
MeCN(100 mL) 중의 화합물 (1)(3.68 g, 16.40 瞧 ol)의 교반된 용액의 한 부분에 첨가하였다. 반응 흔합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 형성된 노란 빛을 띄는 흰색의 침전물이 형성되었고， 이것올 여과하여 MeCN으로 세척한 후 (2 X 20 mL) 진공에서 건조하였다. 미정제 생성물을 에탄을 중에서 재결정화하여 흰색 고체인 화합물 (2)를 얻었다 (10.3 g, 92% 수율). ¾ NMR (500 MHz, DMSOd6): δ 7.32-7.41(m, 10H, ArH), 5.16(s, 4H), 3.52(s, 4H), 3.33 (s, 4H) , 3.09(brs, 8H) , 2.85(brs, 4H), 2.76-2.74(t, 4H, J=5Hz),1.86(brs,4H); 13CNMR( 125MHz , DMS0-d6)： δ 172.2, 135.5, 128.4, 128.2， 128.0, 66.4, 55.9, 54.0, 52.8， 51.2, 47.3, 44.1， 22.1， 18.5； C30H42N404에 대해 계산된 HRMS (ESI): 523.3284 [(M+H)+], 실측치: 523.3281 [(M+H)+].
1， 8-비스- (벤질옥시카르보닐메틸) -1， 4 , 8， 11-테트라아자사이클로테트 라데칸 (4)의 제조
3 M NaOH 용액 (200 mL)을 화합물 (2) (9.23 g, 13.52 睡 ol)에 첨가하였다. 3시간 동안 교반한 후， 생성된 용액을 CHC13(3 X 100 mL)로 추출하고, 합한 유기상은 염수로 세척하고, MgS04로 건조하였다. 감압 하에서 용매를 증발시켜 오일을 얻고， 이를 고화하여 화합물 (4)를 얻었다 (6.58 g, 98%수율). ¾ NMR (500 MHz, CDC13): δ 7.20-7.14(m, 10H, ArH), 4.92(s, 4H), 3.25(s, 4H), 2.71-2.66(m, 12H), 2.49-2.47(t, 4H, J=4.2Hz), 1.70(brs,4H); 13C匪 R(125顧 z ,CDC13) : 8 171.3, 135.0, 128.3, 128.1, 127.8, 66.2， 54.7, 54.0， 51.9, 49.1， 46.3, 24.3； C28H4iN404에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 497.3128 [(M+H)+]， 실측치： 497.3129 [(M+H)+] .
1 , 8-비스- (카르복시메틸) -1 , 4 , 8， 11-테트라아자사이클로테트라데칸 (ΤΕ2Α) (6)의 제조
무수 에탄올 (40 mL) 중의 화합물 (4)(0.48 g, 0.96 腿 ol)의 용액에 10% Pd/C (0.12 g)를 첨가하였다. 생성된 흔합물을 상온에서 ¾ 기체 하에 10 시간 동안 교반하였다. 반웅 흔합물을 셀라이트 패드 (celite pad)에 통과시켜 여과하고， 에탄올로 세척하였다 (2 X 10 mL). 합한 여액올 진공에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고, 이를 디에틸 에테르 (Et20)로 처리하여 회색이 도는 흰색 고체를 얻었다 (0.29 g, 98%수율). ¾ NMR (500 MHz, D20): 6 3.48(brs, 2H)， 3.01-3.19(m, 10H), 2.80(brs, 6H), 2.67(brs, 2H), 1.84(brs, 4H)； 13C NMR (125 MHz, D20)： δ 179.0, 56.3， 55.7, 48.9， 45.4, 22.8； HRMS (FAB)： (： 14H28N404에 대한 계산치 : 317.2189 [ (M+H)+]， 실측치： 31그 2185 [(Μ+Η)Ί· 실시예 2: tᅳ부틸브로모아세테이트를 이용한 TE2A(6)의 제조
1,8-비스- (카르보 -t-부톡시메틸) -4, 11-디아조니아트리사이클로
[9.3.1.1]핵사데칸 디브로마이드 (3)의 제조
4당량의 t-부틸브로모아세테이트 (9.38 mL, 12.38 g, 63.48 隱 ol) 를
MeCNdOO mL) 중의 화합물 (1) (3.56 g, 15.87 隱 ol)의 교반된 용액의 한 부분에 첨가하였다. 반웅 흔합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 형성된 노란 빛을 띄는 흰색의 침전물을 여과하고, MeCN으로 세척하고 (2 X 20 mL), 진공에서 건조하였다. 미정제 생성물을 에탄올 중에서 재결정화하여 흰색 고체인 화합물 (3)을 얻었다 (9.26 gᅳ 95%수율). ¾ NMR (500 MHz, DMSO-de)： δ 1.48(s, 18H), 1.76-1.78(d, 2H, J=8.5Hz), 2.35- 2.45(m,4H), 2.70-2.73(d,2H,J=15Hz) , 3.08-3.09(d,2H,J=5Hz) , 3.24- 3.38(m,4H), 3.53-3.58(m,2H) , 3.64-3.66(d,2H,J=10Hz) , 3.79- 3.81(d)2H,J=11.5Hz), 4.33-4.38(t ,2H,/-14Hz) , 4.43-4.46(d,2H,>16.5Hz) , 4.59-4 · .62 ( d， 2H， J=16 · 5Hz )， 5.23-5.25 ( d , 2H , J=9.5Hz ) ; 13CNMR( 125MHz， DMS0- d6): δ 163.5, 84.2， 76.5， 59.8, 57.2, 50.6, 47.7, 46.3, 27.5, 19.2； C24H47N404에 대해 계산된 HRMS (ESI): 455.3591 [(M+H)+], 실측치: 455.3594 [(Μ+Η)Ί.
1， 8-비스ᅳ (카르보 -t-부록시메틸) -1 , 4, 8 , 11-테트라아자사이클로테트 라데칸 (5)의 제조
3 M NaOH 용액 (200 mL) 을 화합물 (3) (9.15 g, 14.89 隱 ol)에 첨가하였다. 3 시간 동안 교반한 후， 생성된 용액을 CHC13로 추출하고 (3 X 100 mL), 합한 유기상을 염수로 세척하고, MgS04로 건조하였다. 감압 하에서 용매를 증발시켜 오일을 얻고 이것을 고화하여 화합물 (5)를 얻었다 (6.25 g, 98%수율)이 된다 . 腿 (500 MHz, CDC13): ^ 3.25(s, 4H), 2.72-2.59(m, 16H), 1.71-1.69(m, 4H)ᅳ 1.37(s, 18H); 13CNMR(125MHz,CDCl3)： δ 170.43, 80.57, 54.74, 54.13, 52.47, 50.02， 47.59, 28.09， 25.78； C22H45N404에 대해 계산된 HRMS (FAB) ： 429.3441 [(M+H)+], 실측치 : 429.3439 [(Μ+Η)Ί.
1， 8-비스- (카르복시메틸) -1， 4， 8， 11-테트라아자사이클로테트라데칸 (ΤΕ2Α · 2TFA) (6 · 2TFA)의 제조
화합물 (5) (1.12 g, 2.61賺 ol) 를 CF3C02H (TFA)와 C¾C12 (40 mL)의 1:1 (vol: vol) 흔합물에 용해시켰다. 흔합물을 24 시간 동안 상온에서 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고, 이를 Et20로 처리하여 회색이 도는 화합물 (6)의 흰색 고체를 얻었다 (1.39 g, 98% 수율; 기본의 질량에 2 당량 TFA로 계산됨). ¾ NMR (500 MHz, D20): δ 3.31(brs, 2H), 3.22-2.95(m, 8H), 2.94-2.72(m, 8H), 2.64(brs, 2H) 1.83(brs, 4H); 13CNMR(125MHz, D20)： δ 180.9， 57.5, 56.9， 55.4, 49.2, 46.2， 23,7; HRMS (FAB): (：14¾8 04에 대한 계산치: 317.2189[(M+H)+], 실측치: 317.2185 [(M+H)+].
<실시예 3 및 4〉
상기 실시예 2에서 제조된 화합물 (5)로부터 하기 반웅식 3으로 나타낸 두가지 경로를 거쳐 상이한 이소티오시아네이트기가 도입되어 작용화된 TE2A-NCS를 제조하였다.
<반응식 3>
Figure imgf000030_0001
11 (n= 1)
12 (n = 2)
Figure imgf000030_0002
실시예 3: t-부틸브로모아세테이트를 이용한 1,8-비스- (카르복시메 틸) -4-(4'-이소티오시아네이토벤질) -1,4, 8, 11-테트라아자사이클로테트라데 칸 (13)의 제조 1,8-비스- (카르보 -t-부록시메틸) -4-(4'-니트로벤질) -1,4, 8, 11-테트 라아자사이클로테트라데칸 (7)의 제조
무수 CHCl3(50 mL) 중의 화합물 (5K1.27 g, 2.96隱 ol)의 용액에 트 리에틸아민 (1.21 mL, 0.90g, 8.88隱 ol)과 4-니트로밴질 브로마이드 (0.64g, 2.96 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 10 시간 동안 교반한 후， 용매를 감압 하에서 제거하고， 잔사를 알루미나 (염기성) 상의 컬럼 크로마토그래피를 통하여 제거하였다. 에틸 아세테이트:메탄올 (10:2)을 통하여 추출하여 정 제된 투명한 오일을 얻고， 이것을 고화하여 화합물 (7) 을 얻었다 (1.30 g, 78%수율). ¾ NMR (500丽 z, CDC13): δ 8.11—8.10(dd, 2H)， 7.55-7.53(dd, 2H), 3.56(s, 2H), 3.24(s, 2H), 3.20-3.06(m, 6H), 3.01(brs, 2H), 2.70- 2.58(m, 4H), 2.54-2.42(m, 4H) ' 2.39(brs, 2H) , 1.93(brs, 2H), 1.75(brs, 2H), 1.39-1.36(dd, 18H); 13CMR(125MHz,CDCl3)： ^ 171.3, 170.5, 147.0， 146.6, 130.1, 123.3, 81.9, 81.2， 58.1, 56.4, 55.8, 54.9, 53.1, 51.6， 51.5, 51.2， 49.6, 48.5, 46.1, 28.0, 25.1， 22.7； C29¾oN506에 대해 계산된 HRMS (FAB): 564.3761 [(M+H)+], 실측치 : 564.3757[(M+H)+] .
1 , 8-비스- (카르보 -t-부록시메틸 )-4-(4 ' -아미노벤질 )-1 , 4， 8， 11-테트 라아자사이클로테트라데칸 (9)의 제조
무수 에탄올 (100 mL) 중의 화합물 (7)(1.22 g, 2.16隱 ol)의 용액에 납이 억제제로 첨가된 5%Pd/CaC03(0.31 g)을 첨가하였다. 생성된 흔합물을 12시간 상온에서 ¾ 기체 하에서 교반하였다. 반웅 흔합물을 샐라이트 패 드를 통과시켜 여과하고， 에탄을로 세척하였다 (2 X 20 mL). 합한 여액을 진 공에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하여 회색이 도는 흰 색 고체의 화합물 (9)를 얻었다 (1.13 g, 98% 수율). ¾ NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.07-7.06(dd, 2H)， 6.67-6.65(dd, 2H), 3.39(s, 4H) , 3.30- 3.14(m, 4H), 3.12-3.01 (m, 4H), 2.77-2.75(m, 2H), 2.70-2.42(m, 8H), 1.96(brs, 2H), 1.80(brs, 2H), 1.46-1.45(dd, 18H); 13CNMR(125MHz,CDCl3)： δ 171.1, 170.7, 145.6, 130.7， 127.6, 115.0, 81.6， 81.2， 57.9, 55.4, 54.7, 54.1， 51.6, 51.5, 49.8, 49.7， 49.4, 46.0, 28.2, 24.3, 24.1, 22.5； C29H52N5O4 에 대해 계산된 HRMS (FAB): 534.4019 Μ+Η)+], 실측치 : 534.4024[(M+H)+] . 1 , 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 ' -아미노벤질 )-1 , 4， 8 , 11-테트라아자사 이클로테트라데칸 .2TFA(11 · 2TFA)의 제조
화합물 (9)(0.92 g, 1.72 隱 ol)를 TFA와 CH2C12 (28mL)의 1:1 (vol:vol) 흔합물에 용해시켰다. 흔합물을 24 시간 동안 상온에서 교반하 였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리 하여 회색이 도는 화합물 (11)의 흰색 고체를 얻었다 (1.11 g, 99%수율; 기 본의 질량에 2 당량 TFA로 계산됨). ¾ NMR (500 MHz, D20)： δ 7.20- 7.10(dd, 2H), 6.83-6.71(dd, 2H), 4.1(s, 2H), 3.52-2.42 (m, 20H) , 2.1- 1.62(III, 4H); 13C NMR (125 MHz, D20): δ 192.7, 180.5, 180.4， 149.5， 148.2, 145.3， 133.1, 129.8, 128.8, 117.76, 116.4， 116.2， 114.0， 58.3, 57.1, 56.5, 55.0, 51.1, 48.8, 46.5, 45.8, 45.4, 23.7, 23.3, 22.7； C H^N 에 대해 계 산된 HRMS(FAB): 422.2767 [(M+H)+], 실측치 : 422.2768[(M+H)+] .
1,8-비스— (카르복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토벤질) -1,4,8, 11- 테트라아자사이클로테트라데칸 .2TFA (13 · 2TFA)의 제조
0.5 M HCK10 mL) 중의 화합물 (11)(0.98 g, 1.51 隱 ol)의 용액에
CHC13(10 mL) 중의 티오포스겐 (CSC12) (3.47 mL, 5.21 g, 45.30睡 ol)을 조심 스럽게 첨가하였다. 반응 흔합물을 상온에서 5 시간 동안 교반하여 층이 분리되도록 하였다. 수성 층을 제거하고， 유기 CHC13 층을 물로 세척하였 다 (2 X 50 mL). 합한 수성 층을 CHC13로 세척하여 (3 x 50 mL) 미반웅 티오포 스겐을 제거하였다. 마지막으로， 수성 층을 동결건조하여 화합물 (13)의 흰색 고체를 얻었다 (1.02 g, 98%수율). ¾丽 R (500 MHz, D20)： 8 7.66- 7.64(dd, 2H), 7.49-7.47(dd, 2H)， 4.03(s, 2H), 3.50-2.51(m, 20H), 2.09(brs 2H), 1.87(brs, 2H)； 13CNMR(125MHz,D20) : δ 192.6, 176.2， 175.7， 133.7, 132.8, 132.0, 123.9, 56.4, 56.2, 54.5， 54.0， 51.4, 50.6， 50.2， 49.9, 49.28 47.7, 45.0, 22.6, 21.7， 13.4; C22H34N504S에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 464.2332 [(M+H)+] , 실측치 : 464.2329[(M+H)+] . 실시예 4: t-부틸브로모아세테이트를 이용한 1,8-비스- (카르복시메 틸 )-4-(4' -이소티오시아네이토펜에틸 )-1 ,4， 8, 11-테트라아자사이클로테트라 데칸 (14)의 제조
1 , 8-비스- (카르보 -t-부톡시메틸 )-4-(4 ' -니트로펜에틸) -1， 4 , 8， 11-테 트라아자사이클로테트라데칸 (8)의 제조
화합물 (5)(1.37 g,3.19 mmol), 4-니트로펜에틸 브로마이드 (1.47 g, 6.38瞧01)， 무수 K2C03(1.32g,9.57瞧 ol), 및 KI(1.59g, 9.57隱 ol)를 무수 를루엔 (150 mL)에 녹인 용액을 24시간 동안 환류 조건하에서 교반하였다. 감압 하에서 반웅 흔합물로부터 용매를 증발시켜주고， CH2C12(250 mL)를 첨가하였다. 갈색의 슬러리 상태의 결과물을 셀라이트 패드를 통과하여 여 과시켜준 후 CH2C12(2X30 mL)로 세척하였다. 감압 하에서 합한 여과액으로 부터 용매를 증발시켰다. 결과로 얻은 잔여물을 용매로 EtOAc/메탄올 (10:2)를 사용한 알루미나 (염기성) 컬럼 크로마토그래피를 통하여 정제하 여 노란색 오일 화합물 (8)을 얻었다 (1.26 g, 68% 수율). ¾NMR ( 500MHz, CDC13): δ 8.07-8.06(dd, 2Η)， 7.35-7.33(dd, 2H), 3.23- 3.20(dd, 4H), 2.97(brs, 4H), 2.87-2.82(m, 4H), 2.71-2.51(m, 12H), 1.88(brs, 2H), 1.61(brs, 2H), 1.39-1.37(dd, 18H)； 13CNMR(125MHz,CDCl3)： δ 170.7, 170.5, 148.6, 146.3， 129.5, 123.5, 81.3, 81.1， 55.7， 55.3， 55.0, 52.5， 52.0， 50.2， 49.5, 48.4, 46.1, 32.0, 28.1, 28.1, 24.4, 24.3, 23.2； C30H52N506에 대해 계산된 HRMS (FAB) ： 578.3918 [ (M+H)+] , 실측치 : 578.3915[(Μ+Η)+].
1 , 8-비스- (카르보 -t-부특시메틸 )-4-(4 ' -아미노펜에틸) -1 , 4 , 8 , 11-테 트라아자사이클로테트라데칸 (10)의 제조
무수 에탄올 (100 mL) 중의 화합물 (8X1.15 g, 1.99麵 ol)의 용액에 납이 억제제로 첨가된 5%Pd/CaC03(0.31 g)을 첨가하였다. 생성된 흔합물을 12시간 상온에서 ¾ 기체 하에서 교반하였다. 반웅 흔합물을 셀라이트 패 드를 통과시켜 여과하고， 에탄을로 세척하였다 (2 X 20 mL). 합한 여액을 감 압 하에서 용매를 제거하여 유성 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (10)를 얻었다 (1.09 g, 98%수율). ^NMR SOOMHz.CDCls): δ 6.90-6.88(dd, 2H), 6..55-6.54 (dd, 2H), 3.28-3.25(dd, 4H) , 2.96-2.94(m, 2H), 2.88-2.86(m, 2H), 2.81-2.79 (m, 2H), 2.70-2.68(m, 2H), 2.64-2.62(m, 2H), 2.56(brs, 8H), 2.47(brs, 2H) ' 1.86(brs, 2H) , 1.60(brs, 2H) , 1.39- 1.37(dd, 18H); 13CNMR(125丽 z ,CDC13) : δ 178.1， 170.5, 170.4, 144.5， 129.9, 129.2, 115.1， 81.1， 80.9， 55.3, 55.0, 54.8， 52.0, 51.7， 51.7， 51.3， 50.4, 48.6, 48.3, 48.22, 45.8， 30.9, 28.1, 28.1, 24.4, 23.8, 22.8； C30H54N504에 대 해 계산된 HRMS (FAB): 548.4Γ76[(Μ+Η)+], 실측치 : 548.4Γ72[(Μ+Η)+] ·
1，8-비스-(카르복시메틸)-4-(4'-아미노펜에틸)-1，4,8，11-테트라아자 사이클로테트라데칸 · 2TFA (12 · 2TFA)의 제조
화합물 (10X0.95 g, 1.73 瞧 ol)를 TFA와 CH2C12 (28 mL)의 1:1 (vol:vol) 흔합물에 용해시켰다. 흔합물을 24 시간 동안 상온에서 교반하 였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고, 이를 Et20로 처리 하여 화합물 (12)의 흰색 고체를 얻었다 (1.14 g, 99% 수율; 기본의 질량에 2 당량 TFA로 계산됨). ¾醒 R (500匪 z, D20)： δ 7.45-7.43(dd, 2H) , 7.38- 7.36(dd, 2H), 3.49-3.12(m, 18H), 2.82-2.62(m, 6H) , 1.91(brs, 4H); 13C NMR (125 MHz, D20): δ 177.0， 176.6, 163.4， 163.1, 162.8, 162.5, 137.4, 130.4， 128.9， 123.4， 119.9, 117.5, 115.2, 112.9, 56.0, 54.9, 54.4, 53.3, 51.6, 50.5， 48.8， 47.3, 45.0, 31.5, 27.6, 22.8, 21.3； C22H38N504에 대해 계산된 HRMS(FAB)： 436.2924[(M+H)+], 실측치 : 436.2925 [(M+H)+] .
1， 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 ' -이소티오시아네이토펜에틸) - 1,4, 8, 11-테트라아자사이클로테트라데칸 · 2TFA (14 · 2TFA)의 제조
0.5 M HCK10 mL) 중의 화합물 (12)(1.05 g, 1.58 國 ol)의 용액에 CHC13(10 mL) 중의 티오포스겐 (CSC12) (3.63 mL, 5.45 g, 47.40醒 ol)을 조심 스럽게 첨가하였다. 반응 흔합물을 상온에서 5 시간 동안 교반하여 층이 분리되도록 하였다. 수성 층을 제거하고， 유기 CHC13 층을 물로 세척하였 다 (2 X 50 mL). 합한 수성 층을 CHC13로 세척하여 (3 x 50 mL) 미반웅 티오포 스겐을 제가하였다. 마지막으로, 수성 층을 동결건조하여 화합물 (14)의 흰색 고체를 얻었다 (1.09 g, 98%수율). ¾ NMR (500 MHz, D20)： 6 7.67- 7.65(dd, 2H), 7.50-7.48(dd, 2H) , 3.923(s, 4Η), 3.48-2.52 (in, 20H)， 1.98(brs, 2H), 1.88(brs, 2H); 13CNMR(125MHz,D20)： 8 187.9， 174.4, 173.2, 145.7, 137.5, 136.8， 135.1， 129.1, 128.6, 125.5, 122.6, 121.6， 60.4, 59.7, 57.8， 57.2, 56.9, 56.1, 54.5， 48.5, 35.5, 29.7, 23.3， 20.7； C23H36N504S에 대 해 계산된 HRMS (FAB)： 478.2488 [(M+H)+] , 실측치 : 478.2484[(M+H)+] .
<실시예 5> 상기 실시예 1에서 제조된 화합물 (4)로부터 하기 반응식 4로 나타 낸 경로를 거쳐 이소티오시아네이트기가 도입되어 작용화된 TE2A-NCS 화합 물 (13)을 제조하였다.
<반응식 4>
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
벤질 2-브로모아세테이트를 이용한 1,8—비스- (카르복시메틸) -4— (4' - 이소티오시아네이토벤질) -1 , 4 , 8 , 11-테트라아자사이클로테트라데칸 ( 13)의 제조
1，8-비스-(벤질옥시카르보닐메틸)-4-(4'-니트로벤질)-1，4,8，11-테트 라아자사이클로테트라데칸 (15)의 제조
무수 CHC13(50 mL) 중의 화합물 (4)(1.17 g, 2.36醒 ol)의 용액에 트 리에틸아민 (0.99 mL, 0.72 g, 7.08隱 ol)과 4-니트로벤질 브로마이드 (0.51 g, 2.36隱 ol)를 첨가하였다. 상온에서 10 시간 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 제거하고， 잔사를 알루미나 (염기성) 상의 컬럼 크로마토그래피를 통하여 제거하였다. 아세테이트:메탄올 (10:2)올 통하여 추출하여 정제된 투명한 오일을 얻고, 이것을 고화하여 화합물 (15) 을 얻었다 (1.13 g, 76% 수율). 證 (500 MHz, CDCls): δ 8.12-8.10 (dd, 2H) , 7.51-7.49(dd, 2Η) , 7.34-7.27(m, 10Η), 5.11(s, 2H), 5.05(s, 2H), 3.55(s, 2H), 3.39(s, 2H), 3.34(s, 2H), 2.81(brs, 2H), 2.74-2.72(m, 4H), 2.67-2.64(m, 6H), 2.59- 2.57(m, 2H), 2.46-2.44(m, 2H), 1.71(brs, 2H), 1.61-1.59(m, 2H)； 13CNMR(125MHz,CDCl3): δ 171.3, 170.8, 148.1， 146.9, 135.7, 135.7, 129.3, 128.5， 128.2, 128.1, 123.3, 66.0, 65.8, 58.1， 55.5， 53.6, 53.1, 52.5, 52.0, 51.2， 49.6， 47.9, 47.2, 25.7； C35H46N506에 대해 계산된 HRMS (FAB) ： 632.3448[(M+H)+], 실측치 : 632.3447[(M+H)+] .
1,8-비스- (카르보 -t-부톡시메틸) -4-(4'-아미노벤질) -1,4, 8， 11-테트 라아자사이클로테트라데칸 (u)의 제조
무수 에탄을 (IOOIBL) 중의 화합물 (15) (1.08 g, 1.기議 ol)의 용액에 납이 억제제로 첨가된 5%Pd/CaC03(0.31 g)을 첨가하였다. 생성된 흔합물을 12시간 상온에서 ¾ 기체 하에서 교반하였다. 반웅 흔합물을 셀라이트 패 드를 통과시켜 여과하고, 에탄올로 세척하였다 (2 X 20 mL). 합한 여액올 진 공에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하여 회색이 도는 흰 색 고체의 화합물 (11)를 얻었다 (0.71 98%수율). ¾NMR (500 MHz, D20)： δ 7.20-7.10(dd, 2H) , 6.83-6.71 (dd, 2H), 4.1(s, 2H)， 3.52-2.42(m, 20H), 2.1-1.62(m, 4H)； 13C NMR (125 MHz, D20)： δ 192.7， 180.5, 180.4， 149.5, 148.2, 145.3, 133.1, 129.8, 128.8, 117.76, 116.4, 116.2, 114.0， 58.3, 57.1, 56.5， 55.0, 51.1， 48.8, 46.5， 45.8, 45.4, 23.7, 23.3, 22.7； C2iH36N504에 대 해 계산된 HRMS; 422.2767[(M+H)+], 실측치： 422.2768 [(M+H)+] · 1， 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 '-이소티오시아네이토벤질) -1 , 4 , 8， 11- 테트라아자사이클로테트라데칸 (13)의 제조 0.5 M HCK10 mL) 중의 화합물 (11)(0.89 g, 2.11 醒 ol)의 용액에 CHC13(10 mL) 중의 티오포스겐 (CSC12) (4.85 mL, 7.28g, 63.3画 ol)올 조심스 럽게 첨가하였다. 반응 흔합물을 상온에서 5 시간 동안 교반하여 층이 분 리되도록 하였다. 수성 층을 제거하고, 유기 CHC13 층을 물로 세척하였다 (2 X 50 mL). 합한 수성 층을 CHC13로 세척하여 (3 x 50 mL) 미반웅 티오포스 겐을 제거하였다. 마지막으로， 수성 층을 동결건조하여 화합물 (13)의 흰 색 고체를 얻었다 (0.96g, 98% 수율). ¾ NMR (500 MHz, D20)： δ 7.66- 7.64(dd, 2H), 7.49— 7.47(dd, 2H), 4.03(s, 2H), 3.50-2.51(m, 20H) , 2.09(brs 2H), 1.87(brs, 2H); 13CNMR( 125MHz , D20): 6 192.6, 176.2, 175.7, 133.7, 132.8, 132.0， 123.9, 56.4, 56.2, 54.5， 54.0, 51.4, 50.6, 50.2, 49.9, 49.28 47.7, 45.0, 22.6, 21.7, 13.4； C22H34N504S에 대해 계산된 HRMS (FAB): 464.2332 [(M+H)+]， 실측치： 464.2329 [(M+H)+] .
<실시예 6>
상기 실시예 1에서 제조된 화합물 (4)로부터 하기 반응식 5로 나타 낸 경로를 거쳐 이소티오시아네이트기가 도입되어 작용화된 TE2A-NCS 화합 물 (14)을 제조하였다.
<반웅식 5>
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0002
벤질 2-브로모아세테이트를 이용한 1 ,8-비스- (카르복시메틸) -4— (4' - 이소티오시아네이토펜에틸) -1， 4 , 8 , 11—테트라아자사이클로테트라데칸 ( 14)의 제조
1， 8-비스- (벤질옥시카르보닐메틸) -4-(4'-니트로펜에틸 )-1,4ᅳ 8 ,11-테 트라아자사이클로테트라데칸 (16)의 제조
화합물 (4X1.19 g, 2.39誦 ol), 4-니트로펜에틸 브로마이드 (1.09 g, 4.78瞧 ol), 무수 K2C03(0.99 g, 7.17隱01)， 및 KI(1.19 g, 7.17隱01)를 무 수 를루엔 (150 mL) 에 녹인 용액을 24시간 동안 환류 조건하에서 교반하였 다. 감압 하에서 반웅 흔합물로부터 용매를 증발시켜주고， C¾C12(250 mL) 를 첨가하였다. 갈색의 슬러리 상태의 결과물을 셀라이트 패드를 통과하여 여과시켜준 후 C¾C12(2X30 mL)로 세척하였다. 감압 하에서 합한 여과액으 로부터 용매를 증발시켰다. 결과로 얻은 잔여물을 용매로 EtOAC/메탄을 (10:2)를 사용한 알루미나 (염기성) 컬럼 크로마토그래피를 통하여 정제하 여 노란색 오일 화합물 (16)을 얻었다 (1.08 g, 70%수율). ¾NMR (500 MHz, CDCls): δ 8.14-8.12(dd, 2H), 7.49-7.47(dd, 2H), 7.33-7.28 (m, 10H) , 5.09(s, 2H), 5.03(s, 4H) , 3.46(s, 2H), 3.36(s, 2H)， 3.25(s, 2H) , 2.87(brs, 2H), 2.76-2.72(m, 4H) , 2.65-2.63(m, 6H), 2.59— 2.57 (m, 2H), 2.44-2.42(m, 2H), 1.69(brs, 2H) , 1.62-1.59(m, 2H); 13CNMR(125MHz,CDCl3)： δ 171.3, 170.8, 148.1, 146.9, 135.7, 135.7, 129.3, 128.5, 128.2, 128.1, 123.3， 66.0, 65.8, 58.1, 55.5, 53.6, 53.1, 52.5, 52.0, 51.2, 49.6, 47.9, 47.2, 25.7； C36H48N506에 대해 계산된 HRMS (FAB) ： 646.3605[(M+H)+] , 실측치 : 646.3602 [(Μ+Η)+] . 1， 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 ' -아미노펜에틸) -1 , 4， 8， 11-테트라아자 사이클로테트라데칸 (12)의 제조 무수 에탄을 (100 mL) 중의 화합물 (16)(0.86 g, 1.33誦 ol)의 용액에 10%Pd/C (0.26 g)을 첨가하였다. 생성된 흔합물을 12시간 상온에서 ¾ 기체 하에서 교반하였다. 반웅 흔합물을 셀라이트 패드를 통과시켜 여과하고， 에탄을로 세척하였다 (2 X 20 mL). 합한 여액을 진공 상태에서 용매를 제거 하여 유성 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (12)를 얻었다 (0.57 g, 98%수율). ¾腹 (500 MHz, D20)： ^7.45-7.43(dd, 2H)， 7.38- 7.36(dd, 2H), 3.49-3.12(m, 18H), 2.82-2.62(m, 6H) , 1.91(brs, 4H)； 13C NMR (125匪 z, D20): δ 177.0, 176.6, 163.4, 163.1, 162.8， 162.5， 137.4, 130.4， 128.9, 123.4, 119.9, 117.5, 115.2, 112.9， 56.0， 54.9, 54.4, 53.3, 51.6, 50.5, 48.8, 47.3, 45.0， 31,5， 27.6, 22.8， 21.3； C22H38N504에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 436.2924[(M+H)+]， 실측치： 436.2925 [(M+H)+] .
1,8-비스- (카르복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토펜에틸) - 1,4,8, 11-테트라아자사이클로테트라데칸 (14)의 제조
0.5 M HCK10 mL) 중의 화합물 (12)(0.79g, 1.81隱 ol)의 용액에
CHCbdOmL) 중의 티오포스겐 (CSC12) (4.17mL, 6.26 g, 54.4瞧 ol)을 조심스 럽게 첨가하였다. 반웅 흔합물을 상온에서 5 시간 동안 교반하여 층이 분 리되도록 하였다. 수성 층을 제거하고， 유기 CHC13 층을 물로 세척하였다 (2 X 50 mL). 합한 수성 층을 CHC13로 세척하여 (3 x 50 mL) 미반웅 티오포스 겐을 제거하였다. 마지막으로， 수성 층을 동결건조하여 화합물 (14)의 흰 색 고체를 얻었다 (0.85g, 98% 수율). ¾ NMR (500 MHz, D20)： 6 7.67- 7.65(dd, 2H), 7.50-7.48(dd, 2H)， 3.923(s, 4H)， 3.48-2.52(m, 20H), 1.98(brs, 2H), 1.88(brs, 2H); 13CNMR( 125MHz , D20) : 8 187.9, 174.4, 173.2, 145.7, 137.5, 136.8, 135.1, 129.1， 128.6, 125.5, 122.6, 121.6, 60.4, 59.7, 57.8, 57.2, 56.9， 56.1, 54.5, 48.5， 35.5, 29.7, 23.3， 20.7； C23H36N504S에 대 해 계산된 HRMS (FAB) ： 478.2488 [(M+H)+]， 실측치： 478.2484 [(M+H)+] . <실시예 7>
하기 반웅식 6에 도시된 경로를 통하여 이소티오시아네이트기가 도 입되어 작용화된 D02AU, 7-비스- (카르복시메틸) -1,4,7, 10-테트라아자사이 클로도데칸) -NCS (화합물 (24))를 합성하였다.
<반응식 6〉
Figure imgf000041_0001
17 18 19
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000041_0003
t-부틸브로모아세테이트를 이용한 D02A-NCS(24)의 제조
1， 7-비스- (벤질옥시카르보닐 )-1ᅳ 4， 7， 10-테트라아자사이클로도데칸 (18)의 제조
얼음물이 담긴 용기에서 CHC13(200 mL)에 녹인 사이클렌 화합물 (17) (20 g, 116.1mmol) 용액에 벤질 클로로포메이트 (34.32 mL, 41.59 g, 243.8 瞧 ol)를 한 방울씩 첨가하였다. 이 때 온도는 0°C 아래로 유지시켰 다. 완전히 첨가가 끝난 후 충분한 고체가 형성되게 하기 위해 흔합물을 10시간 동안 상온에서 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 흰색 고 체를 얻었고, 여기에 에테르 (200 mL)를 첨가하였다. 고체를 여과하고, 에 테르 (2X50 mL)를 이용하여 세척한 후， 45°C를 유지하면서 진공에서 건조시 켜 흰색 고체로 디하이드로클로라이드 염이 59.01 g (99%) 수율로 생성되었 다. 이 고체에 3 M NaOH (250 mL)을 첨가하여 유리 염기 (free base)를 얻었 다. 수성 충은 CHCl3(3x200 mL)으로 추출하고 합한 추출물은 염수로 세척 하고 MgS04로 건조시켰다. 회전 증발기를 통해서 용매를 제거하고 잔여물 은 진공 상태에서 여러 시간 동안 건조시켜 고체 상태로 굳어진 투명한 오 일상의 화합물 (18)을 얻었다 (50.12 g, 98%수율). ¾NMR (400 MHz, CDC13)： δ 7.52-7.32 (m, lOH), 5.18(s, 4H) , 3.83-3.65(m, 8H), 3.10-2.83 (m, 8H); 13CNMR( 100.6MHz, CDC 13): δ 156.5, 136.3, 136.2, 129.0, 128.8, 128.7, 128.4 128.3, 128.268.1, 68.0， 50.9, 50.8, 50.6， 50.5, 50.3， 50.0， 49.6, 49.3.
1 , 7-비스- (벤질옥시카르보닐 )-4 , 10-비스 (카르보 -t-부록시메틸 ) - 1 , 4 , 7 , 10-테트라아자사이클로도데칸 ( 19 )의 제조
무수 MeCN(150 mL) 중의 화합물 (18K6.84 g, 15.53 隱 ol) 용액에 Ν,Ν'-디이소프로필에틸 아민 (13.52 mL, 10.03 g, 77.63隱 ol)과 t-부틸 브로 모아세테이트 (4.82 mL, 6.36 g, 32.61 隱 ol)를 첨가시켰다. 반웅 흔합물을 60°C까지 천천히 가열시킨 후 10시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 용매 를 증발시키고 남은 잔여물을 Na2C03 용액 (100 mL)에 녹였다. 수성 층을 CH2C12(3 X 100 mL)로 추출하고 합한 추출물을 염수로 세척하고 MgS04로 건 조시켜 농도가 질은 흰색의 오일을 얻었다. 오일을 Et20로 재결정화하여 흰색의 고체 화합물 (19)를 얻었다 (9.55 g, 92% 수율). ¾ NMR (500 MHz, CDCI3): δ 7.26-7.19(m, 10H), 5.04(s, 4H) , 3.34-3.05 (m, 12H) ,2.9-2.6(m, 8H), 1.35(s, 18H); 13CNMR(125MHz,CDCl3)： 8 170.4, 156.3， 136.7, 128.3, 127.8, 127.7， 80.8, 66.8, 55.8, 54.2， 46.9, 46.5， 28.1； C36H53N408에 대해 계산된 HRMS(FAB): 669.3863 [(M+H)+], 실측치 :669.3860 [(M+H)+] . 1 , 7-비스 (카르보 -t-부톡시메틸) -1， 4， 7 , 10-테트라아자사이클로도데칸
(20)의 제조
에탄을 (130 mL) 중의 화합물 (19X8.52 g, 12.74 mmol) 용액에 10% Pd/C (2.6 g)을 첨가하였다. 얻어진 흔합물을 ¾(g)가 있는 상태에서 상온 에서 12시간 교반하였다. 반응 흔합물을 셀라이트 패드로 통과시켜 여과 하고， 에탄올 (2 X 20 mL)로 세척하였다. 여과된 흔합물을 진공 상태에서 증 발시켜 유성 잔사를 얻고， 이것을 Et20로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (20)을 얻었다 (4.85 g, 97%수율). ¾ NMR (500丽 z, CD30D)： δ 3.44(s, 4H) , 2.91(s, 16H), 1.47(s, 18H)； 13CNMR(125MHz,CD30D)： 6 173.0, 82.8, 57.4, 52.2， 46.5, 28.5； C20H41N404에 대해 계산된 HRMS(FAB)： 401.3128 [(M+H)+], 실측치： 401.3132 [(M+H)+].
1 , 7—비스- (카르보 -t-부톡시메틸) -4-(4 ' -니트로벤질) -1， 4 , 7， 10-테트 라아자사이클로도데칸 (21)의 제조
무수 CHCl3(50mL) 중의 화합물 (20K1.85 gᅳ 4.62隱 ol) 용액에 트리 에틸아민 (1.93mL, 1.40 g, 13.86画 ol)과 4-니트로 벤질 브로마이드 (0.99g, 4.62 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 10시간 동안 교반 후 감압 하에서 용 매를 제거하고 알루미나 (염기성) 컬럼크로마토그래피를 통하여 잔여물을 정제하였다. 에틸 아세테이트 /메탄올 (10:2)을 통하여 추출하여 고체 상태 로 웅고된 깨끗한 오일 화합물 (21)을 얻었다 (1.98 g, 80%수율).
1,7-비스- (카르보 -t-부록시메틸) -4-(4'-아미노벤질) -1，4，7,10-테트 라아자사이클로도데칸 (22)의 제조
무수 에탄을 (100 mL) 중의 화합물 (21X1.72 g, 3.21 腿 ol) 용액에 납이 억제제로 첨가된 5%Pd/CaC03(0.31g)을 첨가하였다. 결과의 흔합물을 ¾(g)가 있는 상태에서 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 흔합물올 셀라이트 패드로 통과시켜 여과하고 에탄올 (2 X 20 mL) 로 세척하였다. 여 과된 흔합물을 진공 상태에서 증발시켜 유성의 잔사를 얻고， 이것을 Et20 로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (22)을 얻었다 (1.59 g, 98%수율).
1， 7-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 -아미노벤질 )-1 , 4， 7， 10—테트라아자사 이클로도데칸 .2TFA(23 · 2TFA)의 제조
화합물 (22X1.48 g, 2.93 誦 ol)을 TFA 및 CH2Cl2(48mL)의 1:1 (vol:vol) 흔합물에 용해시켰다. 흔합물을 상온에서 24시간 동안 교반하였 다. 감압 하에서 용매를 제거하여 유상의 잔사를 얻고, 이것을 Et20로 처 리하여 흰색 고체의 화합물 (23)을 얻었다 (1.80 g, 99% 수율; 기본의 질량 에 2 당량 TFA로 계산됨).
1,7-비스- (카르복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토벤질) -1,4, 7,10- 테트라아자사이클로도데칸ᅳ 2TFAC24 · 2TFA)의 제조
0.5 M HC1 (10 mL) 중의 화합물 (23)(1.56 g, 2.51 隱 ol) 용액에 CHCl3(10mL)에 녹인 티오포스겐 (CSC12)(5.77 mL, 8.66 g, 75.30睡 ol)을 조 심스럽게 첨가하였다. 반웅물을 5시간 동안 상온에서 교반한 후 생성된 층 을 분리시켰다. 수성 층을 추출하고 유기상의 CHC13 층을 물 (2 X 50 mL)로 세척하였다. 합한 수성 층을 CHC13(3X50 mL)로 세척하여 미반웅 티오포스 겐올 제거하였다. 마지막으로 수성 층을 동결 건조하여 화합물 (24)의 흰 색 고체를 얻었다 (1.63g, 98% 수율). <실시예 8>
α-할로카르복실산 에스테르 (X-CUW-C02R9)로서 t-부틸브로모아세테 이트를 사용하고 아래 반응식 7에 도시된 경로를 통하여 이소티오시아네이 트기가 도입되어 작용화된 D02A-NCS (화합물 (28))를 합성하였다.
<반웅식 7>
Figure imgf000045_0001
t-부틸브로모아세테이트를 이용한 D02A-NCS(28)의 제조
1，7-비스-(카르보-1;-부록시메틸)-4-(4'-니트로펜에틸)-1,4,7,10-테 트라아자사이클로도데칸 (25)의 제조
화합물 (20K1.56 g,3.89隱 ol), 4-니트로펜에틸 브로마이드 (1.79 g, 7.78國 01)， 무수 K2C03(1.61g, 11.67画 ol) 및 KI(1.94g, 11.67麵 ol)를 무 수 를루엔 (150 mL)에 용해시킨 용액을 24시간 동안 교반하였다. 감압 하에 서 용매를 반응 흔합물로부터 증발시키고， C¾Cl2(250 nL)를 첨가하였다. 갈 색의 슬러리 상태의 결과물을 셀라이트 패드로 통과시켜 여과한 후， CH2C12(2X30 mL)로 세척하였다. 감압 하에서 합한 여과액으로부터 용매를 증발시킨 후 세척하였다. 결과로 얻은 잔여물을 용매로 EtOAC/메탄올 (10:2)을 사용한 알루미나 (염기성) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 노란색 오일의 화합물 (25)를 얻었다 (1.46g, 68%수율).
1 , 7-비스- (카르보 -t-부특시메틸 )-4-(4 '—아미노펜에틸) -1 , 4， 7 , 10-테 트라아자사이클로도데칸 (26)의 제조
무수 에탄올 (100 mL) 중의 화합물 (25X1.35 g, 2.46 mmol) 용액에 10% Pd/C (0.41 g)을 첨가하였다. 결과의 흔합물을 H2(g)가 있는 상태에서 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 흔합물을 샐라이트 패드로 통과시 켜 여과하고, 에탄올 (2 X 20 mL) 로 세척하였다. 여과된 흔합물올 진공 상 태에서 증발시켜 유성 잔사를 얻고， 이것을 Et20로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (26)을 얻었다 (1.25g, 98% 수율). 1， 7-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 ' -아미노펜에틸) -1， 4 , 7 , 10-테트라아자 사이클로도데칸 .2TFA (27 · 2TFA)의 제조
화합물 (26)(1.12 2.16顯01)을 TFA 및 CH2Cl2(35mL) 1： 1 (vol :vol ) 의 흔합물에 용해시켰다. 흔합물을 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 감 압 하에서 용매를 제거하여 유성의 잔사를 얻고， 이것올 Et20로 처리하여 흰색 고체의 화합물 (27)를 얻었다 (1.37 g, 99% 수율; 기본의 질량에 2 당 량 TFA로 계산됨).
1,7-비스- (카르복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토펜에틸) - 1,4,7， 10-테트라아자사이클로도데칸 · 2TFA (28 · 2TFA)의 제조
0.5 M HC1 (10 mL) 중의 화합물 (27)(1.25 g, 1.97 醒 ol) 용액에
CHCl3(10mL)에 녹인 티오포스겐 (CSC12) (4.53 mL, 6.79 g, 59.10瞧 ol )을 조심 스럽게 첨가하였다. 반웅물을 5시간 동안 상온에서 교반한 후 생성된 층을 분리시켰다. 수성 층을 추출하고 유기상의 CHC13 층을 물 (2 X 50 mL)로 세 척하였다ᅳ 합한 수성 층을 CHC13(3X50 mL)로 세척하여 미반웅 티오포스겐 을 제거하였다. 마지막으로 수성 층을 동결 건조하여 흰색 고체의 '화합물 (28)을 얻었다 (1.31g, 98%수율).
<실시예 9>
상기 실시예 4에서 제조된 화합물 (8)로부터 하기 반응식 8로 나타 낸 경로를 거쳐 금속 Cu가 결합된 킬레이트 Cu-TE2A-N02 (화합물 (30))을 제조하였다.
Figure imgf000047_0001
6Cu-TE2A-N02 킬레이트 화합물 (30)의 제조
1 , 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(4 ' -니트로펜에틸) -1， 4， 8， 11—테트라아자 사이클로테트라데칸 · 2TFA (29.2TFA)의 제조
화합물 (8)(0.95g,1.64隱 ol)을 CF3C02H(TFA) 및 CH2Cl2(35mL)의 1:1 (vol:vol) 흔합물에 용해하였다. 흔합물을 상온에서 24시간 동안 교반하였 다. 용매를 감압하에 제거하여 오일상 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하여 백색 고체 화합물 (29)를 얻었다 (1.14 g, 97% 수율; 기본의 질량에 2 당량 TFA로 계산됨). ¾賺( 500MHz 0)： δ 8.14-8.12 (dd, 2H), 7.49-7.48 (dd, 2H), 3.49 (br s, 4H), 3.45-2.92 (m, 14H) , 2.90-2.61 (m, 6H), 1.97-1.91 (m, 4H); 13C NMR (125 MHz, D20)： δ 176.9, 176.6, 146.7, 144.4, 129.9, 124.0, 56.0, 54.9, 54.4, 52.9 51.7 50.5 47.4, 45.0, 28.0 22.9, 21.0； C22H36N506 에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 466.2666 [(M+H)+]， 실측치： 466.2661 [(M+H)+] . 도 1에 화합물 (29)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다.
64Cu-TE2A-N02 킬레이트 화합물 (30)의 제조
메탄올 20 mL 중의 화합물 (29) (247 mg, 0.36 mmol) 및 Cu(C104)2 - 6¾0(132 ，0.36隱01)의 용액에 1M의 NaOH 수용성 용액 (2.16 ml)을 첨가하 였다. 얻어진 맑은 파란색 용액을 2 시간 동안 환류하고， 식힌 후, 셀라 이트 패트를 통과시켜 여과하였다. 여과물에 대해 Et20 확산을 실시하였 다. 침적된 푸른색 결정을 수득한 후 건조시켜 화합물 (30)을 얻었다. (163 mg, 87% 수율).： C22H33CuNaN506에 대해 계산된 HRMS (FAB): 549.1625 [(M+Na)+], 실측치: 549.1629 [(M+Na)+]; 가시 전자 스펙트럼: 1 (5 M HCl)/561nm (e = 100 M' 1).
도 2에 화합물 (30)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다.
<실시예 10>
64Cu-TE2A-N0g 킬레이트 화합물 (30)의 산 탈착물화실험
5 M HCl(2mL) 중의 2.2 mmol 농도의 화합물 (30)의 샘플을 이용하여 90 °C, 유사 일차 조건하에서 산 탈착물화 실험을 수행하였다. 시간에 따른 최대 흡수의 변화를 시마쥬 (Shimadzu) UV-Vis 분광광도계 (UV-1650PC) 를 이용하여 온도조절 샐 (thermostated cell)에서 모니터하였다. 각 스펙트럼 (Cu-TE2A 549 nm, Cu— TE2A-N02 561nm)의 에서의 감소하는 흡수력을 이 용하여 탈착화물 반웅의 진전을 모니터링하였다. 선형 In (흡광도)에 대한 시간 좌표에서의 기울기로부터 반감기를 계산하였다. 각 실험은 2-3회 반 복하였고， 반감기의 평균값을 구하였다. 측정된 결과를 하기 표 2， 도 3a 및 3b에 나타내었다.
<실시예 11>
64Cu-TE2A-N0g 킬레이트 화합물 (30)의 전기 화학 실험
3-전극 구조를 갖는 생물학적 모델 SP-150을 이용하여 순환전압전 류법 (cyclic volta誦 etry)을 실시하였다. 작업 전극 (working electrode)은 유리상 탄소 (직경 = 3 mm), 기준 전극은 Ag/AgCl (포화된 KC1), 상대 전극 은 Pt 와이어로 하였다. 화합물 (30)의 샘플 (2mM)을 빙초산으로 pH7.0으 로 조절된 0.1 M 수용성 아세트산에서 스캔 속도 100 mV/s로 작동시켰다. 용액은 사용 전 Ar 으로 30분 동안 산소를 제거하였고， 측정 동안 Ar 분위 기를 유지하였다. 측정된 결과를 하기 표 2， 도 4a 및 4b에 나타내었다.
【표 2】
Figure imgf000049_0001
화합물 (30)의 키네틱 불활성 및 환원 전위는 CU-TE2A와 거의 같았 다. 이로부터 TE2A 골격에 펩티드 또는 항체와 컨쥬게이션을 위한 NCS 작 용기를 갖는 게 3의 직교 (orthogonal) 펜던트 암을 도입하는 것이 가장 통 상적으로 사용되던 TETA (반감기 4.7분) 유사물보다 높은 키네틱 불활성을 저해하지 않는 것을 알 수 있다. <실시예 12>
상기 실시예 2에서 제조된 화합물 (5)로부터 하기 반웅식 9로 나타 낸 경로를 거쳐 메틸기가 도입된 TE2A-모노 -Me (화합물 (32))을 제조하였다.
Figure imgf000050_0001
31
Figure imgf000050_0002
32
1 , 8-비스- (카르복시메틸 )-4-(메틸) -1， 4 , 8 , 11-테트라아자사이클로테 트라데칸 2TFA(322TFA)의 제조
1 , 8-비스- (카르보 -t-부톡시메틸 )-4- (메틸) -1， 4， 8 , 11-테트라아자사이 클로테트라데칸 (31)의 제조
무수 클로로품 (50 mL) 중의 화합물 (5) (2.33 g, 5.43瞧 ol)의 용액 에 메틸 요오드 (6.78 ml, 15.43 g, 108.72 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 24시간 동안 교반 후에， 감압하에 용매를 제거하고 잔여물을， 용매로 클로 로품 /이소프로필 아민 (20:2)을 사용하는 실리카상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 투명 오일의 화합물 (31)을 얻었다 (2.41 g, 84% 수율). ¾NMR( 500MHz ,CDC13): δ 3.27-3.25 (dd, 4Η), 2.84-2.43 (m, 16H) , 2.16 (s, 3H), 1.73-1.59 (m, 4H)， 1.45 (s, 18H)； 13CNMR(125MHz,CDCl3)： δ 170.94, 170.68, 80.57， 55.99, 55.93, 54.80, 53.77, 53.40, 52.26, 50.11, 48.34， 47.41, 47.17, 41.88, 28.18, 25.59, 25.00；) C23H47N404에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 443.3597 [(Μ+Η)+] , 실측치： 443.3600 [(Μ+Η)+] .
도 5에 화합물 (31)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다. 1， 8-비스- (카르복시메틸 )-4- (메틸 )ᅳ1， 4, 8， 11-테트라아자사이클로테 트라데칸 .2TFA (32.2TFA)의 제조
화합물 (31)(1.56g,3.52隱 ol)을 CF3C02H(TFA) 및 CH2Cl2(60mL)의 1:1 (vol: vol) 흔합물에 용해하였다. 흔합물올 상은에서 24시간 동안 교반하였 다. 용매를 감압하에 제거하여 오일상의 잔사를 얻고， 이를 Et20로 처리하 여 백색 고체의 화합물 (32)를 얻었다 (1.95 g, 99% 수율; 기본의 질량에 2 당량 TFA로 계산됨). ¾NM ( 500MHz, D20): δ 3.60-3.05 (m, 13H)， 2.98-2.641 (m, 10H), 2.12-1.82 (ni, 4H)； 13C NMR (125腿 z, D20)： δ 177.20， 175.83, 56.71, 55.87, 54.50, 54.22, 52.92, 48.268, 44.94, 41.15， 22.61, 20.64； C15H31N4046에 대해 계산된 HRMS (FAB): 331.2345 [(M+H)+], 실측치: 331.2347 [(M+H)+].
도 6에 화합물 (32)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다. <실시예 13>
상기 실시예 1에서 제조된 화합물 (3)으로부터 하기 반웅식 10으로 나타낸 경로를 거쳐 2개의 메틸기가 도입된 TE2A-다이 -Me (화합물 (34))를 제조하였다. <반응식 10>
Figure imgf000052_0001
34
1 , 8-비스— (카르복시메틸) -4 , 11-비스- (메틸 )-14 , 8 , 11-테트라아자사 이클로테트라데칸 (34)의 제조
18-비스- (카르보 -t—부톡시메틸) -4 , 11-비스- (메틸 )-148 , 11-테트라 아자사이클로테트라데칸 (33)의 제조
무수 에탄올 (80 mL) 중의 화합물 (3) (3.06 g, 7.14 ol)의 용액에 NaBH4(8.10g, 214.2 ol)를 첨가하였다. 상온에서 24 시간 동안 교반한 후， 감압하에서 용매를 제거하고， 잔사를 C¾Cl2(150mL)에 용해시킨 후 여과하 였다. 여과물을 건조하고 잔여물을 용매로 클로로품 /이소프로필 아민 (20:2)을 사용하는 실리카상 컬럼 크로마트그래피로 정제하여 투명 오일의 화합물 (33)을 얻었다 (3.05g, 94% 수율). ifflfflR OOMHz DCl^: δ 3.23 (s, 4H), 2.80-2.62 (m, 8H) 2.43 (br s, 8H), 2.19 (s, 6H) , 1.68-1.58 (m, 4H), 1.42 (s, 18H); 13CNMR (125MHz, CDC 13): δ 170.89, 80.61, 56.50， 54.51, 53.91 51.00, 50.55, 43.29, 28.15, 24.66； C24H49N404에 대해 계산된 HRMS (FAB): 457.3754 [(M+H)+]， 실측치： 457.3756 [(M+H)+] .
도 7에 화합물 (33)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다. 1， 8-비스- (카르복시메틸 )-4, 11-비스- (메틸 )-1 ,4, 8, 11-테트라아자사 이클로테트라데칸 (34)의 제조
화합물 (33)(l.46g,3.19隱 ol)을 CF3C02H(TFA) 및 CH2Cl2(50tnL)의 l:l(vol:vol) 흔합물에 용해시겼다. 흔합물을 상온에서 24시간 동안 교반 하였다. 용매를 감압하에 제거하여 오일상 잔사를 얻고, 이를 Et20로 처 리하여 백색 고체의 화합물 (34)를 얻었다 (1.09 g, 99%수율). C16H33N404에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 345.2502 [(M+H)+]， 실측치： 345.2506 [(M+H)+] . 도 8에 화합물 (34)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다. 실시예 13에서 보는 바와 같이， 본원 발명에 의하면 화합물 (32) 등과 같이 아민에 비대칭적으로 치환기가 도입된 것뿐만 아니라， 화합물 (34)와 같이 아민에 대칭적으로 치환기가 도입된 것도 합성가능하다.
<실시예 14>
상기 실시예 12에서 제조된 화합물 (32)으로부터 하기 반웅식 11로 나타낸 경로를 거쳐 Oi가 킬레이트된 Cu-TE2A-모노— Me (화합물 (35))를 제 조하였다.
<반웅식 11>
Figure imgf000053_0001
Cu-TE2A-모노 -Me 킬레이트 화합물 (35)의 제조
메탄을 22 mL 중의 화합물 (32) (265 mg, 0.47麵 ol) 및 Cu(C104)2 · 6¾0(1761 ,0.47隱01)의 용액에 NaOH수용성 용액 1M (2.82 ml)을 첨가하였 다. 얻어진 푸른색 용액을 2시간 동안 환류하고, 식힌 후， 셀라이트 패드 를 통과시켜 여과하였다. 여과물에 대해 Et20 확산을 실시하였다. 침적된 푸른색 결정을 수득하고 건조시켜 화합물 (35)를 얻었다 (166 mg, 89% 수율). Ci5¾8CuNaN404에 대해 계산된 HRMS (FAB)： 414.1304 [(M+Na)+], 실측치: 414.1302 [(M+Na)+] .
도 9에 화합물 (35)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다.
<실시예 15>
상기 실시예 13에서 제조된 화합물 (34)로부터 하기 반웅식 12로 나타낸 경로를 거쳐 Cu가 킬레이트된 Cu-TE2A-다이 -Me (화합물 (36))를 제 조하였다.
Figure imgf000054_0001
Cu-TE2A-다이 -Me 킬레이트 화합물 (36)의 제조
메탄을 25 mL 중의 화합물 (34) (253 mg, 0.73瞧 ol) 및 Cu(C104)2 · 6¾0(272 ,0.73隱01)의 용액에 NaOH 수용성 용액 1M (4.38.ml)올 첨가하였 다. 얻어진 푸른색 용액을 2시간 동안 환류하고， 식힌 후， 셀라이트 패드 를 통과시켜 여과하였다. 여과물에 대해 Et20 확산을 실시하였다. 침적된 푸른색 결정을 수득하고 건조시켜 화합물 (36)을 얻었다 (253 mg, 85%수율). C16H30CuNaN404에 대해 계산된 HRMS (FAB): 428.1461 [(M+Na)+], 실측치: 428.1462 [(M+Na)+].
도 10에 화합물 (36)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타내었다.
<실시예 16>
금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물은 BFC를 펩티드 등 생활성 분자 에 결합시킨 뒤 금속을 킬레이트화시키거나 또는 미리 제조된 금속 -BFC 킬 레이트에 펩티드 등의 생활성 분자를 결합시키는 방법으로 제조될 수 있다. 본 실시예에서는 하기 반웅식 13으로 나타낸 경로를 따라 상기 실시예에서 제조된 TE2A-NCS 화합물 (14)를 펩티드 c(RGDyK)에 결합시켜 컨쥬게이션 화합물로 만든 뒤 금속 64Cu을 킬레이트화시켜 [64Cu(TE2A-c(RGDyK)] 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (38)을 제조하였다.
<반웅식 13>
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000056_0002
[64Cu-TE2A-c(RGDyK)3 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (38)의 제 TE2A-NCS 및 펩티드 c(RGDyK)의 컨쥬게이트 화합물 (37)의 제조
TE2A-NCS 화합물 (14) (495 nmol , 2.36 mg) 용액을 0.1 MNa2C03 버퍼 (pH 9.5) 중의 펩티드 c(RGDyK) (165 nmol, 1.02 mg )와 배합하였다. 빛이 차단된 환경 하에서 22시간 동안 상온에서 교반한 후에， 세미 분취용 HPLC (semi-preparative High performance liquid chromatography) (Agilent preparative 컬럼 C18; 5 μιτι, 21.2X 100隱; 유속 3 mL/min, 이동상은 95% 용매 A [0.1% TFA 물 용액] 및 5% 용매 B [MeCN에 0.1% TFA] [0-2분]을 시작 으로 32분에 35% 용매 A 및 6¾ 용매 B)을 이용하여 TE2A에 컨쥬게이션된 c(RGDyK) 펩티드를 분리하였다. HPLC 상에서 체류시간 21.7분에 보이는 TE2A-c(RGDyK)를 모았고, 이를 동결 건조하여 흰색 가루의 TE2A-c(RGDyK) 화합물 (37)를 82%수율로 얻었다. 분석용 HPLC Vydac TP C18; 3 ym, 4.6 X 100mm; 유속 lmL/min, 이동상은 0. WTFA/¾0 (용매 A) 및 0.1 TFA/MeCN (용매 B), 기울기 용리 조건은 20분에 1% B에서 70% B로) 상에서 TE2A- c(RGDyK) 화합물 (37)의 체류시간은 12.8 분이었다. 정제된 TE2A- c(RGDyK) 화합물 (37)는 분사형 질량분석기로 확인하였다 (C50H77N14012S에 대 한 계산된 m/z값 1097.55， [MH]+와 [MH2]+2에 대한 확인된 m/z 값은 각각 1097.58와 549.62이었음).
도 11은 세미 분취용 HPLC 상에서의 TE2A-c(RGDyK) 화합물 (37)에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이고， 도 12는 분석용 HPLC 상에서의 TE2A- c(RGDy ) 화합물 (37)에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 13은 TE2A-c(RGDyK) 화합물 (37)에 대한 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[64Cu-TE2A-c(RGDyK)] 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (38)의 제 조
0.1 M NH40Ac 완충액 (pH 8.0) 100 yL 중의 64Cu (0.52 n£i)를 0.1 M NH40Ac 완층액 (pH 8.0) 100 uL 중의 TE2A-c(RGDyK) 화합물 (37) 2yg에 첨가 하였다. 흔합물을 30°C에서 5분간 반웅시켰다. 반웅은 10% NH40Ac/메탄을 30:70에 전개된 와트만 (Whatman) MKC18F 박막 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography; TLC)판을 라디오 -TLC로 모니터링하여 수행하였다 (64Cu_ TE2A— c(RGDyK)의 Rf=0.9). 64Cu 표지된 펩티드는 역상 (reverse-phase; RP) HPLC (Vydac TP C18; 3 ym, 4.6 X 100隱; 유속 1 mL/min, 이동상은 0,1% TFA/H20 (용매 A) 및 0.1% TFA/MeCN (용매 B), 기울기 용리 조건은 20분에 1% B에서 70¾> B로)로 추가적으로 정제하였다. 64Cu-TE2A— c(RGDyK) 화합물 (38) (체류시간 [tR] 13.8분)는 12mL HPLC 용매로 모은 후， 용매를 증발키고， PBS(phosphate-buffered saline: 인산 완층 식염수)로 회수하였다. 이어 서 회수된 64Cu-TE2A-c(RGDyK) 화합물 (38)을 0.22μιη 밀리포어 (Mi 1 lipore) 필터로 통과시키고， 동물 실험올 위해 멸균된 병으로 옮겼다.
도 14는 64Cu-TE2A— c(RGDyK) 화합물 (38)에 대한 라디오 -TLC 크로마 토그램을 나타낸 것이고, 도 15는 분석용 HPIX 상에서의 64Cu-TE2A- c(RGDyK) 화합물 (38)에 대한 라디오 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 16은 금속 킬레이팅 컨쥬게이트의 제조를 확인할 수 있도록 분석용 HPLC 상에서의 TE2A-c(RGDyK) 화합물 (37) 및 64Cu-TE2A c(RGDyK) 화합물 (38) 각각에 대한 크로마토그램을 함께 도시한 것이다. <실시예 17>
64Cu-TE2A-c(RGDyK)의 생체 내 분포 실험
PBS 120 yL 중의 64Cu-TE2A-c(RGDyk) 화합물 (38) 10 yCi를 U87MG 종양이 이식된 암컷 누드 마우스의 꼬리에 주사하였다. 시간대별로 주사 후 1시간 및 4시간의 2개 그룹을 측정하였고, 각 그룹 당 개수는 4 마리로 하였다. 실험은 실험대상을 죽인 후 관심 있는 조직과 장기를 떼어내어 무게를 재고， 감마카운터로 방사선양을 측정하여 이루어졌다. 그람당 주사 한 양의 백분율을 알고 있는 기준값과 비교하여 계산하였으며, 측정된 결 과 ( D/g土 SD, n=4)를 하기 표 3 및 도 17에 나타내었다. 【표 3】
Figure imgf000059_0001
<실시예 18>
64Cu-TE2A-c(RGDyK)의 마이크로 PET 영상실험
본 실시예에서 PET 스캔 및 영상 분석은 마이크로 PET R4 로덴트 (rodent) 모델 스캐너를 사용하여 이루어졌다. 영상 실험은 U87MG 주사 후 41일된 암컷 누드 마우스를 대상으로 하여 진행하였다. 64Cu-TE2A-c(RGDyK) 화합물 (38) (205 uCi)를 마우스의 꼬리로 주사하였다. 주사 후 1시간, 4 시간， 1일， 2일 및 3일 후에 1-2% 이소플루란 (isoflurane)으로 쥐를 마취하 고， 엎드린 자세로 고정한 뒤 이미지를 얻었다. 이미지는 이차원 (2- dimensional ) 기대값최대화 (ordered subsets expect at ion maximizat ion; OSEM) 알고리즘으로 재구성하였고， 감쇄나 흩어짐 보정은 하지 않았다. 도 18은 실험 대상인 U87MG 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 대한 64Cu-TE2A-c(RGDyK) 화합물 (38)의 투입을 나타내는 도면이고， 도 19 는 64Cu-TE2A— c(RGDyK) 화합물 (38)의 투입 후 1시간， 4시간, 1일， 2일 및 3일의 시간대별 마이크로 PET 영상을 나타낸 것이다.
<실시예 19> 본 실시예에서는 하기 반웅식 14로 나타낸 경로를 따라 상기 실시 예에서 제조된 TE2A-NCS 화합물 (14)를 항체 트라스투주맙 (trastuzumab, 허셉틴)에 결합시킨 뒤 금속 64Cu을 킬레이트화시켜 [64Cu-TE2A-트라스투주 맙] 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (40)를 제조하였다.
<반웅식 14>
Figure imgf000060_0001
14 라스早주맙
Figure imgf000060_0002
[64Cu-TE2A-트라스투주맙] 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (40)의 제조
TE2A-NCS 및 항체 트라스투주맙의 컨쥬게이트 화합물 (39)의 제조 트라스투주맙 (2mg)에 0.1 M Na2C03(pH 9.5, 100 uD 중의 TE2A-NCS 화합물 (14) (0.33 mg)을 50배 과량으로 첨가하였다. 이 용액을 24시간 동 안 상온에서 부드럽게 교반하였다. 다음 날 센트리콘 (centricon) YM—50으 로 옮기고 용매를 줄이기 위해 회전시켰다. 생성된 TE2A-트라스투주맙에 PBS (pH 7.2, 3X2mL)를 첨가하고, 반웅하지 않은 리간드를 제거하기 위해 원심 분리하였다. PBS 2.00 mL를 정제된 TE2A-트라스투주맙 화합물 (39)에 첨가하고,— 20°C에서 보관하였다.
[64Cu-TE2A-트라스투주맙] 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 (40)의 제조
0.1 M NH40Ac 완층액 (pH 8.0) 100 중의 64Cu (0.52 mCi)를 0.1 M NH40Ac 버퍼 (pH8.0) 100 uL 중의 TE2A-트라스투주맙 화합물 (39) 50 에 첨가하였다. 이 용액올 30°C에서 5분간 반웅시켰다. 64Cu 표지된 TE2A-트라 스투주맙은 센트리콘 YM-50을 사용한 원심 분리법으로 정제하였다. 방사화 학적 순도는 크기 배제 ((Size Exclusion chromatography; SEC) HPLC (Bio Si lect SEC 250-5300X7.8隱; 유속 lmL/min, 등용리 이동상으로는 PBS, pH 7.4)와 인스턴트 TLC ITLC-SG, 식염수로 전개)로 확인하였다.
도 20은 64Cu-TE2A-트라스투주맙 화합물 (40)에 대한 라디오 ITLC 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 21은 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 의 제조를 확인할 수 있도록 SEC HPLC 상에서의 TE2A-트라스투주맙 화합물 (39) 및 64Cu— TE2A-트라스투주맙 화합물 (40) 각각에 대한 크로마토그램을 함께 도시한 것이다. <실시예 20>
[64Cu-TE2A-트라스투주맙]의 생체 내 분포 실험
PBS 120 uL 중의 64Cu— TE2A-트라스투주맙 화합물 (40) 20 uCi 를 NIH3T6.7 종양이 이식된 암컷 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 시 간 대별로 주사후 1일 및 2일간의 2개 그룹을 측정하였고， 각 그룹 당 개 수는 4마리로 하였다. 실험은 실험대상을 죽인 후 관심 있는 조직과 장기 를 떼어내어 무게를 재고， 감마카운터로 방사선양을 측정하여 이루어졌다. 그람당 주사한 양의 백분율을 알고 있는 기준값과 비교하여 계산하였으며 , 측정된 결과 (%ID/g±SD, n=4)를 하기 표 4 및 도 22에 나타내었다. 【표 4】
Figure imgf000062_0001
<실시예 21〉
64Cu-TE2A-트라스투주맙의 마이크로 PET영상실험
본 실시예에서 PET 스캔 및 영상 분석은 마이크로 PET R4 로덴트 모델 스캐너를 사용하여 이루어졌다. 영상 실험은 NIH3T6.7 주사 후 31일된 암컷 누드 마우스를 대상으로 하여 진행하였다. 64Cu-TE2A- 트라스투주맙 화합물 (40) (145 Ci)를 마우스의 꼬리로 주사하였다. 주사 후 1시간, 4시간， 1일， 2일， 3일 및 5일 후에 1-2% 이소플루란으로 쥐를 마취하고， 엎드린 자세로 고정한 뒤 이미지를 얻었다. 이미지는 이차원 0SEM 알고리즘으로 재구성하였고, 감쇄나 흩어짐 보정은 하지 않았다. 도 23은 실험 대상인 NIH3T6.7 종양 세포를 지닌 암컷 누드 마우스에 대한 64Cu— TE2A-트라스투주맙 화합물 (40)의 투입을 나타내는 도면이고， 도 24는 64Cu-TE2A-트라스투주맙 화합물 (40)의 투입 후 1시간， 4시간， 1일, 2일， 3일 및 5일의 시간대별 마이크로 PET 영상을 나타낸 것이다. 상기 기재된 다양한 실시예는 본 발명의 내용을 제한하려는 의도로 개시된 것이 아니며， 본 개시의 진정한 범위 및 취지는 후술하는 특허청구범위에 의해 지시된다.

Claims

【청구의 범위】 【청구항 1】 하기 화학식 1로 표시되는 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 염 .
[화학식 1]
Figure imgf000064_0001
(상기 식에서，
m, n, p 및 q는 동일하거나 상이하고 각각 2 또는 3의 정수이고， r은 0 내지 5의 정수이고,
t는 0 또는 1의 정수이고,
r+t >0 이고,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8은 동일하거나 상이하고 각각 H, Ci-5알킬 또는 C3-6 시클로알킬이고，
R10은 H, Ci-5 알킬 C3-6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬이고，
U 및 W는 동일하거나 상이하고 각각 H, d-5알킬 또는 C3-6 시클로알 킬이고,
Y 및 Z는 동일하거나 상이하고 각각 H, d-5알킬 또는 C3-6 시클로알 킬이고,
A는 C6-10아릴이고，
Q는 H, 니트로， 아미노, 이소티오시아네이토， 말레이미도， 에스테 르， 알킨 아미노옥시， 티을, 아지드， 또는 카르복실산이다.)
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
상기 약학적으로 허용되는 염은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 음으로 하전되는 성분을 포함할 경우에는 칼륨， 나트륨， 리튬， 암모늄， 은， 칼슘 및 마그네슴으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 양이온 또는 양이온 그룹을 포함하고，
상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 양으로 하전되는 성분을 포함할 경우에는 Γ, CF, ΒΓ, Γ, C104 ", BFV, HCO3", CH3CO2", CHsSOs", C¾C6H4S03ᅳ, CF3S03 ", H2P04 " 및 B(C6¾)4으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 음이온 또는 음이온 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
【청구항 3】
제 1항에 있어서，
Q 는 이소티오시아네이토인 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
【청구항 4】
제 1항에 있어서，
Q 는 아미노인 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
【청구항 5】
게 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서，
1,7-비스- (카르복시메틸) -4— (4' -이소티오시아네이토벤질) - 1,4,7, 10-테트라아자사이클로도데칸 ,
1 , 7-비스- (카르복시메틸 )— 4-(4 ' -이소티오시아네이토펜에틸 ) - 1,4,7, 10-테트라아자사이클로도데칸，
1，8_비스- (카르복시메틸) -4-(4'-이소티오시아네이토벤질) - 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸，
1，8-비스- (카르복시메틸) -4ᅳ (4' -이소티오시아네이토펜에틸) - 1,4,8， 11-테트라아자사이클로테트라데칸，
1,8ᅳ비스_(카르복시메틸)-4-(4'-니트로펜에틸)-1，4,8，11-테트라아 자사이클로테트라데칸， 또는
1 , 8-비스- (카르복시메틸) -4- (메틸 )-1， 4， 8 , 11-테트라아자사이클로테 트라데칸인 폴리아자마크로사이클릭 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되 느 ᄋ3
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【청구항 6】
67Ga, 68Ga, 99mTc , mIn, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 6Cu, 86Y, 89Zr, 9½Tc , 67Cu, 90Y, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 및 18¾e로 구성된 그룹 중에서 선택된 금속 이은과 킬레이트된 제 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 킬레이트.
【청구항 7】
상기 계 6항에 있어서，
상기 금속은 60Cu,61Cu, 62Cu, 64Cu 또는 67Cu 인 킬레이트.
【청구항 8】
펩티드, 단백질， 항체, 또는 항체 단편에 컨쥬게이션되는 게 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 화합물.
【청구항 9】
펩티드， 단백질， 항체， 또는 항체 단편에 게 6항에 따른 킬레이트가 컨쥬게이션되거나,
제 8항에 따른 컨쥬게이트 화합물에 67Ga, 68Ga, 99mTc, mIn, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 86Y, 89Zr, 94mTc, 67Cu, 90Y, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 및 188Re로 구성된 그룹 증에서 선택된 금속 이온이 결합된 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물 .
【청구항 10]
거 U항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 종양을 진단 또는 치료하기 위한 약학적 배합물.
【청구항 111
게 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조영제.
【청구항 12]
제 9항의 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양을 진단 또는 치료하기 위한 약학적 배합물.
【청구항 13】
효과량의 제 9항의 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 인간을 제외한 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는， 인간을 제외한 포유 동물의 종양을 '진단하는 방법 .
【청구항 14】
효과량의 게 9항의 금속 킬레이팅 컨쥬게이트 화합물을 인간을 제외한 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는， 인간을 제외한 포유 동물의 종양올 치료하는 방법 .
【청구항 15】
(i) 하기 화학식 9의 화합물을 α-할로카르복실산 에스테르 (X- CUW-C02R9)와 반응시켜 트랜스 ^,Ν'-이치환된 하기 화학식 10의 화합물을 얻는 단계 , (ii) 화학식 10의 화합물을 염기와 반응시켜 하기 화학식 11의 화합물을 얻는 단계,
(iii) 화학식 11의 화합물의 사이클릭 내 2차 아민에 작용기 - (CYZ)r-At— Q를 도입하여 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계
를 포함하는,
하기 화학식 1의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법.
[화학식 1]
Figure imgf000068_0001
Q
Figure imgf000068_0002
[화학식 10]
Figure imgf000069_0001
[화학식 11]
Figure imgf000069_0002
(상기 식에서，
m, n, p 및 q는 동일하거나 상이하고 각각 2 또는 3의 정수이고， r은 0 내지 5의 정수이고，
t는 0 또는 1의 정수이고， r+t >0 이고,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8은 동일하거나 상이하고 각각 H, Ci-5알킬 또는 C3— 6 시클로알킬이고，
R9은 d-5알킬 , C3-6 시클로알킬， 또는 C7_14 아랄킬이고，
R10은 H, Ci-5 알킬， C3-6 시클로알킬， 또는 C7-14 아랄킬이고，
U 및 W는 동일하거나 상이하고 각각 H, Ci-5 알킬 또는 C3-6 시클로알킬이고，
X는 F, CI, Br 또는 I이고，
Y 및 Z는 동일하거나 상이하고 각각 H, Ci-5 알킬 또는 C3-6 시클로알킬이고，
A는 C6-10아릴이고，
Q는 H, 니트로， 아미노， 이소티오시아네이토, 말레이미도， 에스테르， 알킨， 아미노옥시， 티올， 아지드, 또는 카르복실산이다.) 【청구항 16】
제 15항에 있어서，
상기 α-할로카르복실산 에스테르는 t-부틸브로모아세테이트 또는 벤질 브로모아세테이트인 화학식 1의 폴리아자마크로사이클릭 화합물의 제조 방법 .
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115175910A (zh) * 2019-11-08 2022-10-11 昆士兰大学 放射性标记的靶向配体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023178313A2 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 The Research Foundation For The State University Of New York Radiopharmaceutical compositions, synthetic methods, and methods of treatment

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4885363A (en) * 1987-04-24 1989-12-05 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1-substituted-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane and analogs
WO1989011475A1 (en) * 1988-05-25 1989-11-30 The United States Of America, As Represented By Th Macrocyclic chelates and methods of use thereof
DE353450T1 (de) * 1988-06-24 1990-09-06 The Dow Chemical Co., Midland, Mich. Macrocyclische bifunktionelle chelatbildner, komplexe davon und ihre konjugierten antikoerper.
IT1291624B1 (it) * 1997-04-18 1999-01-11 Bracco Spa Chelati complessi di metalli paramagnetici a bassa tossicita'
IT1292131B1 (it) * 1997-06-11 1999-01-25 Bracco Spa Processo per la preparazione di 5h,9bh-2a,4a,7,9a-ottaidrotetraaza- ciclootta(cd)pentalene
IT1293778B1 (it) * 1997-07-25 1999-03-10 Bracco Spa 1,4,7,10-tetraazabiciclo(8.2.2.)tetradecan-2 one, sua preparazione e suo uso per la preparazione di tetraazamacrocicli
DE10135356C1 (de) * 2001-07-20 2003-04-17 Schering Ag Makrocyclische Metallkomplexe und deren Verwendung zur Herstellung von Konjugaten mit Biomolekülen
WO2005003105A1 (en) * 2003-07-08 2005-01-13 The University Of Hong Kong Synthesis of tris n-alkylated 1,4,7,10-tetraazacyclododecanes
WO2005062828A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Bracco Imaging S.P.A. New compounds useful as metal chelators
ES2547220T3 (es) * 2004-04-20 2015-10-02 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Polímeros dendríticos con amplificación y funcionalidad interior mejoradas
EP1765812B1 (en) * 2004-07-02 2009-04-29 Bracco Imaging S.p.A Contrast agents endowed with high relaxivity for use in magnetic resonance imaging (mri) which contain a chelating moiety with polyhydroxylated substituents
NO20051911D0 (no) * 2005-04-19 2005-04-19 Amersham Health As Synthesis
WO2008073828A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Northwestern University Compositions and methods for magnetic resonance imaging contrast agents
JP2011520971A (ja) * 2008-05-19 2011-07-21 ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニ ガストリン放出ペプチド化合物
US20120095185A1 (en) 2010-09-20 2012-04-19 Nordion (Canada) Inc. Process for chelating copper ions using cb-te2a bifunctional chelate

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 60, 2008, pages 1347 - 1370
ANDERSON CJ; LEWIS JS: "Radiopharmaceuticals for targeted radiotherapy of cancer", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS, vol. 10, 2000, pages 1057 - 69, XP055072556, DOI: doi:10.1517/13543776.10.7.1057
ANDERSON CJ; WELCH MJ: "Radiometal-Labeled Agents (Non-Technetium) for Diagnostic Imaging", CHEM REV, vol. 99, 1999, pages 2219 - 34, XP000852432, DOI: doi:10.1021/cr980451q
BIOCONJUGATE CHEM., vol. 19, 2008, pages 1476 - 1484
CHEM. COMMUN., 2004, pages 2122 - 2213
DIJKGRAAF, L; LIU, S.; KRUIJTZER, J. A. W; SOEDE, A. C.; OYEN, W. J. G; LISKAMP, R. M. J.; CORSTENS, F. H. M.; BOERMAN, O. C.: "Effects of linker variation on the in vitro and in vivo characteristics of an 111In-labeled RGD peptide", NUCL. MED. BIOL., vol. 34, 2007, pages 29 - 35, XP005823964, DOI: doi:10.1016/j.nucmedbio.2006.10.006
LI, L.; YAZAKI, P. J.; ANDERSON, A. -L.; CROW, D.; COLCHER, D.; WU, A. M.; WILLIAMS, L. E.; WONG, J. Y. C.; RAUBITSCHEK, A.; SHIVE: "Improved biodistribution and radioimmunoimaging with poly(ethylene glycol)-DOTA- conjugated anti-CEA diabody", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 17, 2006, pages 68 - 76, XP055072586, DOI: doi:10.1021/bc0502614
LIU, S.; EDWARDS, D. S.: "Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 12, 2001, pages 7 - 34, XP001092538, DOI: doi:10.1021/bc000070v
PARRY, J. J.; KELLY, T. S.; ANDREWS, R.; ROGERS, B. E.: "In vitro and in vivo evaluation of 64 Cu-labeled DOTA-linkerbombesin (7-14) analogues containing different amino acid linker moieties", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 18, 2007, pages 1110 - 1117, XP055072561, DOI: doi:10.1021/bc0603788
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115175910A (zh) * 2019-11-08 2022-10-11 昆士兰大学 放射性标记的靶向配体

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Publication number Publication date
WO2011102626A3 (ko) 2012-01-19
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US9079867B2 (en) 2015-07-14
KR20110095143A (ko) 2011-08-24
KR101253100B1 (ko) 2013-04-10
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EP2537834A4 (en) 2013-09-11

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