KR101375639B1

KR101375639B1 - 아미노시클로펜탄카르복실산-함유 시클로 ｒｇｄ 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 ｐｅｔ 조영제

Info

Publication number: KR101375639B1
Application number: KR1020120052216A
Authority: KR
Inventors: 박지애; 김정영; 이용진; 이교철; 김경민; 김병일; 안광일
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2014-03-19
Also published as: KR20130128284A

Abstract

본 발명은 암세포에 대해 선택성이 있는 것으로 알려진 시클로 RGDK 펩티드(cyclo Arg-Gly-Asp-Lys)의 라이신과 아스파르트산 사이에 아미노시클로펜탄 카르복실산(ACP)을 펩티드 결합에 의해 삽입시켜 얻어진 시클로 ACP-RGDK, 시클로 ACP-RGDK를 리간드를 경유하여 방사성 동위원소 ⁶⁴Cu²⁺와 결합시킨 신규 PET 조영제 화합물, 그 신규 화합물의 제조 중간제, 이들의 제조방법, 및 그 신규 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.

Description

아미노시클로펜탄카르복실산-함유 시클로 ＲＧＤ 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 ＰＥＴ 조영제{Aminocyclopentane carboxylic acid-containing cyclo RGD derivatives, a process for the preparation thereof and a PET contrast agent comprising the same}

본 발명은 신규한 암 진단용 PET(positron emission tomography) 조영제로서 사용될 수 있는 신규 화합물, 그 제조방법, 그것을 포함하는 PET 조영제 관한 것이다.

양전자방출단층촬영기(Positron Emission Tomography, PET)는 생체 내에 주입 된 방사성 의약품의 분포를 영상화하는 기기로서, 질병으로 인한 인체의 생물학적 변화를 영상화 하여 질병의 조기진단 및 질환의 치료방법 결정에 정확한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 핵의학 영상기기의 중요성이 증가되고 있다.

PET에 사용하는 방사성의약품은 물, 산소, 이산화탄소, 포도당 등과 같은 생체 내 특정 대사에 참여하고 있는 분자에 방사성동위원소인 [¹⁸F]불소(fluoride), [¹¹C]탄소(carbon), [¹⁵O]산소(oxygen), 또는 [¹³N]질소(nitrogen) 등을 표지한 C¹⁵O, [¹³N]암모니아, H₂ ¹⁵O, [¹⁸F]FDG(F-Deoxy Glucose) 등과 같은 합성 양전자 방출체들이다. 이들 방사성의약품과 민감도가 우수한 PET을 이용하여 종양 수용체(receptor), 대사(metabolism) 및 이와 관련된 다양한 생물학적 기능 및 정보에 관한 자료를 영상으로 표현할 수 있게 되었다.

양전자 방출이 가능한 방사성동위원소 중 핵의학 분야에서 비교적 근래에 개발된 금속성 방사성동위원소 [⁶⁴Cu]구리(양전자 방출율, 약 34%)는 농축 Ni-64에 사이클로트론에 의해 가속된 양성자들을 빔 형태로 조사시켜 Ni-64(p,n)Cu-64 핵반응으로 얻을 수 있으며, 임상적 사용을 위해서는 방사화학적 순도가 높은 Cu-64가 필요하다. 순도가 높은 Cu-64는 Cu와 Ni 및 기타 금속 불순물을 정전기적 성질을 이용한 컬럼을 통해 분리함으로써 얻어질 수 있다. 그렇게 정제된 Cu-64는 묽은 염산 수용액 상에서 2가 양이온으로 존재하여 음전하를 지닌 킬레이트와 쉽게 배위 결합할 수 있는 특징을 지닌다. 또한 Cu-64의 물리적 특성상 12.7 시간의 비교적 장시간의 반감기를 가지므로 기존의 2 시간 이내의 단반감기 방사성동위원소 표지 방사성의약품으로서는 얻을 수 없었던 주사 후 오랜 시간 경과후의 영상을 얻을 수 있는 장점이 있다.

종양 영상용 방사성의약품은, 생물학적 현상을 이해하거나 다양한 종양의 정확한 진단에 사용되는 중요한 도구이므로 1) 해당 종양에 대한 방사성의약품의 높은 선택성, 2) 주사 후 빠른 섭취 평형시간, 3) 영상 획득에 적합한 지속시간 등의 특성을 만족해야 한다.

세포의 표면에는 수용체(receptor)가 존재하는데, 세포 외부로부터 전달되는 신호를 세포 안으로 알리는 구실을 담당한다. 세포는 여러 가지 외부 신호에 노출되어 있으며, 그만큼 수용체의 종류도 다양하다. 이런 수용체 종류 중의 하나인 인테그린 단백질은 세포의 고착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α및 β 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체로서, 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 세포조직의 초기 발달에도 관여하며, 염증이나 혈액 응고, 세포 운동 등에도 인테그린 단백질의 기능이 필요하며 세포에 따라 여러가지 종류가 존재한다. 그 중에서도 비트로넥틴 수용체(vitronection receptor)라고 불리는 α_νβ₃인테그린은 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암세포의 신생혈관형성시에 발현되며 RGD(arg-gly-asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드와 결합하는 특징이 있다. 종양 선택성 펩티드인 RGD는 종양혈관에 선택적으로 결합하는 특성으로 인해 종양 치료에 적용하는 연구가 발표된 바 있다(비특허문헌 1).

University of Southern caifornia 의 Peter S. Conti 그룹은 종양 타겟용 펩티드인 RGD 에 방사성동위원소인 Cu-64를 표지시켜 효과적인 종양 PET 영상을 획득하였다(비특허문헌 2).

효율적이고 안정적으로 Cu-64를 표지시키기 위해서, DOTA 및 NODAGA 와 같은 형태의 다양한 킬레이터에 관한 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 3).

종양에 대한 결합력을 증가시키기 위한 노력으로, cyclo RGD, RGDyK, RGDfK, RGDfV 등으로 아미노산 서열을 다양하게 변화시키거나, 두 개의 RGD 혹은 다수의 RGD를 결합시킨 형태 등의 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 4)

1. Arap W, Pasqualine R, Ruoslahti E, Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science. 1998 Jan 16;279(5349):377-80 2. Chen X, Park R, Tohme M, Shahinian AH, Bading JR, Conti PS. MicroPET and autoradiographic imaging of breast cancer alpha v-integrin expression using 18F- and 64Cu-labeled RGD peptide. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 41-49 3. Dumont RA, Deininger F, Haubner R, Maecke HR, Weber WA, Fani M. Novel (64)Cu- and (68)Ga-labeled RGD conjugates show improved PET imaging of α(ν)β(3) integrin expression and facile radiosynthesis. J Nucl Med. 2011 Aug;52(8):1276-84 4. Cai W, Sam Gambhir S, Chen X. Multimodality tumor imaging targeting integrin alphavbeta3. Biotechniques. 2005 Dec;39(6 Suppl):S14-25

본 발명의 목적은 종양에 대한 결합 친화도가 높은 RGD 펩티드 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 종양에 대한 결합 친화도가 높은 RGD 펩티드 유도체가 결합된 PET 조영제 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PET 조영제 화합물 제조용 중간체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물들의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PET 조영제 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

본 발명의 다른 일 측면은 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:

[화학식 2]

상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 또는 DFOM 이고,

상기 화학식 1의 화합물에 해당하는 환상의 아미노시클로펜탄 카르복실산-Arg-Gly-Asp-Lys(시클로 ACP-RGDK)의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 하기 화학식 3의 화합물을 제공한다:

[화학식 3]

상기 리간드는 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,

상기 ⁶⁴Cu²⁺는 상기 리간드에 배위결합되어 있고,

상기 시클로 ACP-RGDK의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합시키는 것을 포함하는, 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 및 DFOM에서 선택된 리간드와 펩티드 결합 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 2의 화합물을 ⁶⁴Cu 용액과 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 3의 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 종래의 시클로 RGDK 펩티드(cyclo Arg-Gly-Asp-Lys)의 라이신과 아스파르트산 사이에 아미노시클로펜탄 카르복실산(ACP)을 펩티드 결합에 의해 삽입시켜, 시클로 ACP-RGDK를 형성시킬 경우 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체(α_νβ₃인테그린)와의 결합력이 현저히 증가하여 암조직에 대한 결합 친화도가 증가한다는 것을 밝혀냈다(실험예 1). 또한, 상기 시클로 ACP-RGDK를 리간드를 경유하여 방사성 동위원소 ⁶⁴Cu²⁺와 결합시킨 물질은 혈중에서 약 24시간 동안 안정하며(실험예 2), 실제 그 물질을 이용하여 종양을 가진 마우스의 PET 영상을 촬영한 결과 종양 부위에서의 증가된 신호를 관찰할 수 있었다(실험예 3). 또한, cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 다음 PET 영상을 촬영한 결과, 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타났다(실험예 4). 따라서, 시클로 ACP-RGDK를 결합시킨 방사성 동위원소 ⁶⁴Cu²⁺의 경우 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체에 대한 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,

하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

본 명세서에서 상기 화학식 1의 화합물은 시클로 ACP-RGDK 라고 약칭되며, 화학식 1의 시클로 ACP-RGDK는 종래의 시클로 RGDK 종양 선택성 펩티드에 시클로펜탄이 삽입된 구조로서, 종래의 시클로 RGDK 유도체에 비해 종양에 대한 선택성이 현저히 높다.

상기 화학식 1의 화합물을 ⁶⁴Cu²⁺와 보다 효율적이고 안정적으로 결합시키기 위해 리간드를 화학식 1에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:

[화학식 2]

상기 화학식 1의 화합물에 해당하는 시클로 ACP-RGDK의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.

상기 화학식 2의 화합물은 일 구현예에 따르면, 하기 화학식 2a의 구조를 가질 수 있다:

[화학식 2a]

상기 화학식 2의 화합물의 리간드에 ⁶⁴Cu²⁺를 배위결합시켜 착물을 형성함으로써, 하기 화학식 3의 화합물을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 하기 화학식 3의 화합물을 제공한다:

[화학식 3]

상기 리간드는 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,

상기 ⁶⁴Cu²⁺는 상기 리간드에 배위결합되어 있고,

본 명세서에서 용어 "착물"은 1 개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자(chelator:킬레이터) 또는 원자단을 리간드(ligand: 배위자)라고 부른다.

본 명세서에서 용어 DTPA는 Diethylene triamine penta aeetic acid, DOTA는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DO3A는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, NOTA는 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NODAGA는1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid, TETA는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid, TE3A는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid, TE2A는 1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid, PCTA는 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid의 약어로서 금속 친화성의 리간드 화합물이다. 상기 리간드는 금속 친화성의 리간드로서 작용하여 체내에서 방사성 금속 ⁶⁴Cu가 유리되지 않도록 할 수 있고, 방사성 물질을 체외로 제거하는 작용이 있어 방사성 물질에 의한 세포독성을 줄일 수 있으므로 방사선 장해에 대한 화학적 방호제로서 작용할 수 있다(Marouan Rami et al., Carbonic anhydrase inhibitors: Gd(III) complexes of DOTA- and TETA-sulfonamide conjugates targeting the tumor associated carbonic anhydrase isozymes IX and XII , New J. Chem., 2010, 34, 2139-2144; Silvio Aime et al., NMR relaxometric studies of Gd(III) complexes with heptadentate macrocyclic ligands, Magnetic Resonance in Chemistry (1998) Volume: 36, Issue: S1, Pages: S200-S208).

본 명세서에서 용어 "시클로 ACP-RGDK"는 Arg-Gly-Asp-Lys의 아미노산 서열이 아미노시클로펜탄 카르복실산과 아스파르트산 및 라이신을 경유한 펩티드 결합에 의해 형성된 환상 구조의 화합물을 의미하며, 상기 화학식 1의 화합물을 의미한다. 상기 화학식 3에서 시클로 ACP-RGDK는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합된다. 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암 세포의 신생혈관형성 시에는 발현되는 α_νβ₃인테그린은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 갖는 시클로 펩티드와 결합하는 특징이 있다. 상기 시클로 ACP-RGDK는 RGD 시클로펩티드에 비해 암세포에 대한 결합친화도가 현저히 높아, 암조직에 대한 타겟팅 효과가 현저히 증가된 PET 조영제를 형성시킬 수 있다.

본 명세서에서 "리간드→⁶⁴Cu²⁺"는 상기 리간드에 방사성 구리 원소이온 ⁶⁴Cu²⁺가 배위결합하여 형성된 착물을 의미한다.

상기 화학식 3의 화합물은 일 구현예에 따르면 하기 화학식 3a의 화합물일 수 있다:

[화학식 3a]

본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합시키는 것을 포함하는 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.

Fmoc 고체상 합성법에 의한 펩티드의 제조는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 당업자가 적절한 반응조건을 선택하여 상기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다.

본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물을 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 및 DFOM에서 선택된 리간드와 펩티드 결합 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계에서 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 소량의 DMSO를 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응 시 촉매를 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 촉매는 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 또는 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole) DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DIC(diisopropylcarbodiimide), HBTu(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 리간드 및 화학식 1의 화합물의 혼합물을 용매에 가하고 촉매를 가한 다음, 약 하루동안 반응시킨 다음 추출함으로써 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다. 상기 반응은 실온(room temp)에서 이루어질 수 있으며, 밤새 반응시킴으로써 반응이 완료될 수 있다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 상기 화학식 2의 화합물을 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다. 상기 리간드는 일 구현예에 따르면, DOTA가 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물을 ⁶⁴Cu 용액과 반응시키는 것을 포함하는 상기 화학식 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서는 완충용액 중의 ⁶⁴Cu의 용액(pH 5 ~ 6)을 화학식 2의 화합물의 용액과 혼합하여 약 40 ~ 60℃에서 반응시킴으로써, 화학식 3의 화합물을 생성시킬 수 있다. 상기 완충용액으로는 예를 들어, 소듐 아세테이트 완충용액 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다. 상기 리간드는 일 구현예에 따르면, DOTA가 사용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 화학식 3의 제조방법의 일 구현예를 하기 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

상기 화학식 3의 화합물은 실험 결과 PET 조영제로서 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.

하기 실험예에 따르면, 상기 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물에 대해 마우스의 혈청 내 안정성을 측정한 결과, 하루 이상 화합물이 분해되지 않고 안정한 것으로 나타났다(실험예 2). 또한, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여하고 소동물용 PET/SPECT/CT 영상시스템에서 촬영한 결과, PET/CT 영상을 획득하였다. 그 결과, 종양 부위에서 증가된 신호가 관찰되었다(실험예 3). 따라서, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물은 암에 특이적으로 선택적인 PET 조영제로서 사용될 수 있다. 또한, 종양을 가진 마우스에게 cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 다음 PET 영상을 촬영한 결과 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타났다(실험예 4). 따라서, 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물은 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체에 대한 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있었다. 실제로 화학식 3 또는 화학식 3a의 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여한 다음, 종양 및 장기를 적출하여 조직의 방사능을 측정한 결과 종양에 존재하는 방사선 수치가 1시간 후에 6% 이상이고, 18 시간 후에도 3.8% 이상인 것으로 나타나 조직 내 분포가 암에 대한 선택성이 높으며 효과가 지속적인 것으로 확인되었다. 그러므로, 암 진단에 매우 유용한 PET 조영제로서 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.

상기 PET 조영제는 상기 활성성분인 화학식 3 또는 3a의 화합물을 기준으로 성인에게 0.1 ~ 30 mCi 투여할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 PET 조영제는 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 PET 조영제는 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 3 또는 3a의 화합물은 비트로넥틴에 대해 결합 친화도가 높은 시클로 RGD 펩티드 유도체를 함유하므로 종래의 PET 조영제에 비해 암세포에 대해 보다 특이적이면서 안전한 PET 조영제로서 사용될 수 있다. 따라서, 보다 효과적이고 안전한 암 진단용 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGDK의 HPLC 이미지이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGDK 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGDK-DOTA의 HPLC 이미지이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGDK-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGDK-DOTA-⁶⁴Cu 의 TLC 이미지이다.
도 6은 U87MG 세포에 대한 cRGDyK 와 ACP-RGD-DOTA 의 결합 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi의 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상이다.
도 8은 종양에 존재하는 수용체를 차단하지 않고 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상(위) 및 cRGDyK 펩타이드를 주사하여 종양에 존재하는 수용체를 차단한 후 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상(아래)이다.
도 9는 종양의 수용체를 차단하지 않은 종양과 수용체를 차단한 종양의 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 주사량대비 종양 조직의 방사능비(%ID/g)를 측정한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하고 각종 장기에서 측정된 주사량대비 조직 방사능비(%ID/g)를 시간대별로 비교하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

약어에 대한 정의

DCM : Dichloromethane

DMF : N,N-dimethylformamide

ACN : Acetonitrile

DIEA : Diisopropylethylamine

DOTA :1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

DIC : diisopropylcarbodiimide

HOBt : N-hydroxybenzotriazole

HBTu : 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate

HPLC : High-performance liquid chromatograph

ACP-RGDK : 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK

실시예 1 : 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK(시클로 ACP-RGDK)의 제조(화학식 1)

Fmoc-Lys(Boc)-O-trityl resin을 적절한 반응기에 채운 후 DCM, DMF로 2 회 세척하였다. 20 % 피페리딘/DMF 용매를 이용하여 Fmoc 을 제거한 후 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산 25 mmol, 티로신 25 mmol, HOBT/DIC 2 M을 DMF 용매 조건에서 약 6 시간동안 교반하여 커플링을 진행하였다. 이 과정을 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 반복하였다. 최종 아미노산의 커플링 후, 트리플루오로아세트산 용액을 이용하여 레진 분할(resin cleavage)를 진행하였다. 분할 용액을 필터하여 얻은 후 에테르를 첨가하여 재결정시켰다. 얻어낸 결정을 건조한 후 고리화를 진행하였다. 제조된 아미노시클로펜탄카르복실산 함유 cRGDK(ACP-RGDK)는 HPLC로 분석하였는데, SHIMADZU C-18 분석 칼럼(10.0 mm ㅧ 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA 수용액(A 용액) 과 0.1% TFA의 ACN 용액(B 용액)을 5% B 에서 65% B 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 11.7 분에서 피크를 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK의 HPLC 이미지이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK 의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

실시예 2 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 제조 (화학식 2)

실시예 1에서 제조한 시클로 ACP-RGDK 5 mM과 DOTA 10 mM을 반응기에 넣고 DMSO 250 mL로 용해시켰다. 반응기에 HOBt 20 mM, DIC 20 mM 을 넣고 하루동안 교반 시켰다. 반응 완료 후 일부(1 ml 소량)용액을 에테르를 이용하여 추출하였다. 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA는 HPLC로 분석하는데, SHIMADZU C-18 분석컬럼(10.0 mm ㅧ 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA 수용액(A 용액) 과 0.1% TFA의 ACN 용액(B 용액)을 5% B 에서 65% B 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 10.3 분에서 피크를 확인할 수 있었다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 HPLC 이미지이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

실시예 1-3 : 시클로 ACP-RGDK-DOTA- ⁶⁴ Cu 의 제조 (화학식 3)

사이클로트론으로부터 생산된 ⁶⁴Cu는 묽은 염산 용액에 녹여진 무색의 투명한 용액으로 수득되며, 실험에 필요한 방사능량에 따라 적절하게 취득한 뒤(0.1mCi 이상) ⁶⁴Cu 용액을 적절한 유리용기에 담아 질소를 불어주면서 100 ℃에서 건조시켰다. 건조된 ⁶⁴Cu는 투명한 막의 형태로 유리용기에 붙어 있고, 여기에 1M 소듐아세테이트 버퍼 용액(pH 5-6)을 0.2-0.3 mL 추가한 뒤 녹였다. 이어서 실시예 1-2에서 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA를 에탄올에 녹여 100μg/0.01mL 정도를 취득하여 상기 ⁶⁴Cu 용액에 혼합시켜 50℃에서 표지반응을 30분 동안 진행시켰다. 상기 최종 물질인 시클로 ACP-RGDK-DOTA-⁶⁴Cu를 박막 크로마토그래피에 흡착시켜 전개액(0.1M 시트레이트 버퍼용액)으로 충분히 전개한 뒤 방사화학적 수율과 순도를 확인하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGDK-DOTA-⁶⁴Cu 의 TLC 이미지이다. 도 5의 TLC 이미지로부터 방사화학적 수율과 순도는 평균적으로 98% 이상임을 알 수 있다.

실험예 1: 시클로 ACP-RGDK-DOTA의 U87MG 세포결합 어세이(cell binding assay)

상기 실시예 2에서 제조된 시클로 ACP-RGD-DOTA의 U87MG 세포에 대한 결합능력을 비교하는 실험을 하였다. 대조군으로는 cRGDyK(시클로 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 사용하였다. U87MG세포(2X10⁶)에 0.06 nM ¹²⁵I-labeled echistatin(NEX439025UC, PerkinElmer Co. MA)와 다양한 농도(1.00-E4~1.00-E13M)의 물질(cRGDyk, ACP-RGD-DOTA)을 인테그린 결합 버퍼에 넣고 실온에서 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 인테그린 결합 버퍼로서 25mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM MnCl₂와 0.1% BSA(bovine serum albumin)를 혼합하여 제조한 것을 사용하였다. 반응이 끝난 후 PBS(Phosphate buffed saline)로 2회 수세 후 각 튜브에 남아있는 방사능을 감마 카운터(PerkinElmer Co. MA)로 측정 하였다. IC₅₀ 값은 GrasphPad Prism(GraphPad Software, Inc., CA)를 이용하여 비선형회귀법(nonlinear regression)으로 얻었다.

도 6은 U87MG 세포에 대한 cRGDyK와 시클로 ACP-RGD-DOTA 의 결합 정도를 나타낸 그래프이다. 도 6의 결과에 따르면, cRGDyK 보다 시클로 ACP-RGD-DOTA 가 U87MG 세포에 대한 결합 능력이 현저히 크다는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 시클로 ACP-RGD-DOTA- ⁶⁴ Cu 의 in-vitro 혈청 안정성(serum stability) 측정

상기 실시예 3에서 제조된 화학식 3의 화합물(시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu)의 사람 혈청 및 마우스 혈청 내 안정성을 측정하였다. ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu (0.1 mCi, 10 mL)을 사람 혈청 및 마우스 혈청(0.5 mL)에 섞고 37℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대(30 분, 1 시간, 2 시간, 24 시간)에 TLC를 실시하였다. 시간대별 혈청 내 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 의 안정성 측정 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 결과에 따르면, 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu는 사람 및 마우스 혈청 내에서 24시간 동안 안정함을 알 수 있다.

실험예 3 : 시클로 ACP-RGD-DOTA- ⁶⁴ Cu 의 PET 영상 획득

PET 영상은 다중 PET/SPECT/CT 시스템(INVEON, Simens Medical Solutions)으로 촬영하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 어깨에 피하 주입하여 종양을 만들었다. 종양을 가진 마우스(nude, 20 g)의 꼬리정맥을 통해 상기 실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 0.2 mCi를 주사하여 PET/CT 영상을 획득하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다. CT 영상은 해부학적 위치를 알아보기 쉽게 하기 위하여 같은 위치에서 촬영하여 PET 영상에 정합하였다.

도 7은 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi의 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상이다.

도 7에 따르면, 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 를 투여한 후에 종양 부위에서 증가된 신호(색이 밝아짐)를 관찰할 수 있다.

실험예 4 : 시클로 ACP-RGD-DOTA- ⁶⁴ Cu 의 종양 선택성 확인

실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu의 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성을 확인하는 실험을 하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 어깨에 피하 주사하여 종양을 만들었다. 먼저 수용체 차단을 위해 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 cRGDyK 펩티드(10 mg/kg)를 주사하였다. 30 분 후에 상기 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 0.2 mCi를 주사하여 실험예 3과 동일한 방법으로 PET/CT 영상을 획득하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 종양에 존재하는 수용체를 차단하지 않고 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상(위) 및 cRGDyK 펩타이드를 주사하여 종양에 존재하는 수용체를 차단한 후 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하여 촬영한 PET/CT 영상(아래)이다.

도 8에 따르면, 수용체가 차단되지 않은 종양 부위의 신호에 비해서 수용체가 차단(blocking)된 종양부위의 신호가 더 낮음을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu가 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성이 있음을 알 수 있다.

또한, 실험예 3에서 PET 영상을 획득 한 후, 종양 부위를 적출 하여 감마카운터를 측정하여, 수용체를 차단하지 않은 조직(실험예 3)과 수용체를 차단한 조직(실험예 4)에서의 조영제 축적 정도를 비교한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 종양의 수용체를 차단하지 않은 종양과 수용체를 차단한 종양의 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 주사량 대비 종양 조직의 방사능비(%ID/g)를 측정한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 9에 따르면 수용체를 차단하지 않은 군이 수용체를 차단한 군 보다 높은 조직내 방사능을 나타내는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu 가 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대해 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있다.

실험예 5 : 시클로 ACP-RGD-DOTA- ⁶⁴ Cu의 조직 내 분포 확인

상기 실시예 3에서 제조된 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu의 마우스 조직의 분포를 확인하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스(BW 20 g) 어깨에 피하 주사하여 종양을 만들었다. 종양을 가진 마우스의(n=4) 꼬리정맥을 통해 0.01 mCi의 cRGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사한 후, 30 분, 1 시간, 3 시간, 18 시간에 장기(종양, 뇌, 갑상선, 심장, 폐, 간, 이자, 신장, 비장, 뼈, 지방, 근육)를 적출하여 감마카운터로 조직의 방사능을 측정하여 도 10에 나타내었다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 시클로 ACP-RGD-DOTA-⁶⁴Cu를 주사하고 각종 장기에서 측정된 주사량대비 조직 방사능비(%ID/g)를 시간대별로 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 10에 따르면 종양에 존재하는 방사능 수치가 주사 후 1 시간에 6% 이상, 주사 후 18 시간에도 3.8% 이상으로 유지되는 것을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물:
[화학식 1]
하기 화학식 2의 화합물:
[화학식 2]

상기 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 또는 DFOM(Deferrioxamine) 이고,
제1항의 화학식 1의 화합물에 해당하는 환상의 아미노시클로펜탄 카르복실산-Arg-Gly-Asp-Lys(시클로 ACP-RGDK)의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.
제2항에 있어서, 하기 화학식 2a의 구조를 갖는 화합물:
[화학식 2a]
하기 화학식 3의 화합물:
[화학식 3]

상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 또는 DFOM 이고,
상기 ⁶⁴Cu²⁺는 상기 리간드에 배위결합되어 있고,
상기 시클로 ACP-RGDK의 구조는 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있다.
제4항에 있어서, 하기 화학식 3a의 구조를 갖는 화합물:
[화학식 3a]
라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로펜탄-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합시켜, 제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법.
제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌, 및 DFOM에서 선택된 리간드와 펩티드 결합 반응시키는 것을 포함하는 제2항에 따른 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법.
제2항에 따른 화학식 2의 화합물을 ⁶⁴Cu 용액과 반응시키는 것을 포함하는 제4항에 따른 화학식 3의 화합물을 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 리간드는 DOTA인 방법.
제4항 또는 제5항에 따른 화합물을 포함하는 PET 조영제.
제10항에 있어서, 암 진단에 사용되는 PET 조영제.