KR101743728B1 - Peg 및 nota 함유 rgd 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 pet 조영제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암세포에 대해 선택성이 있는 것으로 알려진 시클로 RGD-ACH-K를 각각 PEG를 경유하여 2량체로 하고, 그 2량체를 PEG를 경유하여 NOTA 리간드를 통해 방사성 동위원소와 결합시킨 신규 PET 조영제 화합물, 그 신규 화합물의 제조 중간제, 이들의 제조방법, 및 그 신규 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.
Description
본 발명은 암 진단용 PET(positron emission tomography) 조영제로서 사용될 수 있는 신규 화합물, 그 제조방법, 그것을 포함하는 PET 조영제 관한 것이다.
양전자방출단층촬영기(Positron Emission Tomography, PET)는 생체 내에 주입된 방사성 의약품의 분포를 영상화하는 기기로서, 질병으로 인한 인체의 생물학적 변화를 영상화 하여 질병의 조기진단 및 질환의 치료방법 결정에 정확한 정보를 제공할 수 있다.
PET 영상용 방사성 의약품에서 방사성 동위원소를 효율적이고 안정적으로 표지시키기 위해서, NOTA, DOTA 및 NODAGA 와 같은 형태의 다양한 리간드에 관한 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 1).
상기 PET 영상용 방사성의약품은, 생물학적 현상을 이해하거나 다양한 종양의 정확한 진단에 사용되는 중요한 도구이므로 1) 해당 종양에 대한 방사성의약품의 높은 선택성, 2) 주사 후 빠른 섭취 평형시간, 3) 영상 획득에 적합한 지속시간 등의 특성을 만족해야 한다. 또한, PET 방사성 의약품의 독성이 체내에서 발현되지 않도록 하기 위해 리간드로부터 분리되지 않고 안정해야 한다.
한편, 세포의 표면에는 수용체(receptor)가 존재하는데, 세포 외부로부터 전달되는 신호를 세포 안으로 알리는 구실을 담당한다. 세포는 여러 가지 외부 신호에 노출되어 있으며, 그만큼 수용체의 종류도 다양하다. 이런 수용체 종류 중의 하나인 인테그린 단백질은 세포의 고착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α 및 β 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체로서, 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 세포조직의 초기 발달에도 관여하며, 염증이나 혈액 응고, 세포 운동 등에도 인테그린 단백질의 기능이 필요하며 세포에 따라 여러가지 종류가 존재한다. 그 중에서도 비트로넥틴 수용체(vitronection receptor)라고 불리는 ανβ3 인테그린은 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암세포의 신생혈관형성시에 발현되며 RGD(arg-gly-asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드와 결합하는 특징이 있다. 종양 선택성 펩타이드인 RGD는 종양혈관에 선택적으로 결합하는 특성으로 인해 종양의 진단 및 치료에 적용하는 연구가 발표된 바 있다(비특허문헌 2).
종양 타겟용 펩타이드인 RGD에 방사성동위원소 (Ga-68, Cu-64, Tc-99m 등)를 표지시켜 효과적인 종양 핵의학 영상을 획득한 결과가 발표되었다(비특허문헌 3 및 4). 또한, 종양에 대한 결합력을 증가시키기 위한 노력으로, cyclo RGD, RGDyK, RGDfK, RGDfV 등으로 아미노산 서열을 다양하게 변화시키거나, 두 개의 RGD 혹은 다수의 Arg-Gly-Asp를 결합시킨 형태 등의 연구가 진행되고 있다(비특허문헌 5). 그러나 두 개 혹은 다수의 RGD를 결합시킨 형태의 화합물은 종양에 대한 선택적 섭취율뿐만 아니라 종양 외의 일반장기 (간, 신장 등)에 섭취율도 증가하는 경향이 있다.
종양의 진단을 위한 PET 영상용 방사성 의약품은 체내에 주입된 방사성의약품의 종양에 대한 선택적 섭취율이 높고 종양 외의 일반 장기의 섭취율이 낮아야 할 필요가 있다.
특허문헌 1은 종양에 대한 섭취율을 증가시키기 위해 비트로넥틴에 대한 선택성이 우수한 시클로 cRGDfK를 2개 도입하였으며 정상조직에 대한 섭취율을 감소시키기 위해 글루코사민을 도입한 PET 조영제 화합물 cRGDfK2-NOTA-64Cu 을 개시하고 있다. 상기 PET 조영제 화합물은 종양에 대한 선택적 섭취율이 우수하기는 하나 보다 우수한 선택적 섭취율을 갖는 PET 조영제 화합물의 개발이 필요하다.
1. S. Roosenburg, et. al. Molecular pharmaceutics 2014 11, 3930-3937
2. Arap W, et. al. Science. 1998 Jan 16;279(5349):377-80
3. Jiyun Shi, et. al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 750-759
4. Lijun Wang, et. al. Molecular pharmaceutics 2008 6, 231-245
5. Yun Wu, et. al.J Nucl Med 2005; 47:2000-2007
6. Scott H. Medina, et. al. Adv, Healthcare Mater. 2013
본 발명의 목적은 종양에 대한 선택적 섭취율은 높고, 간 혹은 신장과 같은 일반장기에 대한 섭취율은 낮은 종양에 대한 선택적인 RGD 펩타이드 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종양에 대한 선택성이 높은 상기 RGD 펩타이드 유도체에 방사성 동윈원소가 배위결합된 PET 조영제 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양에 대한 선택성이 높은 상기 RGD 펩타이드 유도체 및 PET 조영제 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PET 조영제 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
본 발명의 다른 일 양상은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, M*은 Cu-64(Ⅱ), Ga-68(Ⅲ), Zr-89(Ⅳ), 및 Y-86(Ⅲ)에서 선택된 금속성 방사성동위원소로서, NOTA에 배위결합되어 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 화학식 2의 화합물을 금속성 방사성동위원소의 용액과 반응시켜 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양상은
하기 화학식 5의 화합물을 Fmoc-N-아미도-dPEG4-acid와 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계;
상기 화학식 4의 화합물을 (p-SCN-Bn)-NOTA와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 생성시키는 단계; 및
하기 화학식 3의 화합물을 탈보호시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
[화학식 5]
[화학식 4]
[화학식 3]
본 발명의 또 다른 일 양상은 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따른 화학식 1의 화합물은 종래의 PET 조영제에 비해 종양에 대한 섭취율은 우수하면서 정상조직에 대한 섭취율은 낮아 암세포에 대해 보다 특이적이면서 안전한 PET 조영제로서 사용될 수 있다. 따라서, 보다 효과적이고 안전한 암 진단용 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 화합물 8로부터 화합물 1의 제조방법을 나타낸 반응식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 의 Radio-TLC 스캐너의 결과 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2을 사람 혈청 및 마우스 혈청 중에서 37℃로 배양한 다음 시간의 경과에 따라 TLC를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2을 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi 주사하고 시간의 경과에 따라 촬영한 PET 영상이다.
도 5는 종양에 존재하는 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않고 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET 영상(차단안함)과 cRGDyK 펩타이드를 주사하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET 영상(차단함)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 를 주사하고 각종 장기에서 측정된 주사량대비 조직 방사능비(%ID/g)를 시간대별로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 종양조직대혈액비율 (tumor-to-blood ratio)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 혈액, 신장, 및 간에서의 섭취율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 의 Radio-TLC 스캐너의 결과 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2을 사람 혈청 및 마우스 혈청 중에서 37℃로 배양한 다음 시간의 경과에 따라 TLC를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 화학식 1의 화합물 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2을 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi 주사하고 시간의 경과에 따라 촬영한 PET 영상이다.
도 5는 종양에 존재하는 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않고 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET 영상(차단안함)과 cRGDyK 펩타이드를 주사하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET 영상(차단함)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 를 주사하고 각종 장기에서 측정된 주사량대비 조직 방사능비(%ID/g)를 시간대별로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 종양조직대혈액비율 (tumor-to-blood ratio)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 혈액, 신장, 및 간에서의 섭취율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명자들은 비트로넥틴에 대한 선택성이 우수한 시클로 RGD-ACH-K (cyclo Arg-Gly-Asp-aminocyclohexane-Lys) 2 개를 각각 PEG를 경유하여 2 량체로서 포함하고 그 2량체를 PEG를 경유하여 NOTA 리간드를 통해 방사성 동위원소와 결합시켜서 제조한 화합물(화학식 1의 화합물)이 혈중에서 약 48 시간 동안 안정하며(실험예 1, 도 3), 실제 그 화합물을 이용하여 종양을 가진 마우스의 PET 영상을 촬영한 결과 종양 부위에서의 증가된 신호를 관찰할 수 있었다(실험예 2, 도 4). 또한, cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 다음 PET 영상을 촬영한 결과, 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타나 종양에 대한 선택성이 확인되었다(실험예 3). 또한, 실제 그 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여 후 감마 카운터로 조직의 방사능을 측정한 결과, 정상조직에 비해 종양에서의 섭취율이 현저히 높다는 것을 확인하였으며, 종래 유사한 구조의 PET 조영제에 비해 종양에 대한 선택성이 현저히 높은 것으로 나타났다. 따라서, 화학식 1의 화합물이 종양에 대한 선택성이 매우 우수한 효과적인 조영제로서 작용할 수 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 일 양상에 있어서, 방사성 동위원소와의 결합에 의해 화학식 1의 화합물을 형성할 수 있는, 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
본 명세서에서 상기 화학식 2의 화합물은 종래의 시클로 RGD-ACH-K를 2 개 포함하고 각각 PEG를 경유하여 2 량체로서 포함하고 그 2량체를 PEG를 경유하여 NOTA 리간드와 결합시킨 것으로서 종래의 시클로 RGD-ACH-K 유도체에 비해 종양에 대한 선택성이 현저히 높다.
상기 화학식 2의 화합물은 종래 시클로 RGD-ACH-K 유도체에 비해 암세포에 대한 선택성이 현저히 높아, 암조직에 대한 타겟팅 효과가 현저히 증가된 PET 조영제를 형성시킬 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물의 리간드에 방사성 동위원소를 배위결합시켜 착물을 형성함으로써, 하기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 일 양상에 있어서, 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, M*은 Cu-64(Ⅱ), Ga-68(Ⅲ), Zr-89(Ⅳ), 및 Y-86(Ⅲ)에서 선택된 금속성 방사성동위원소로서, NOTA에 배위결합되어 있다.
일 구체예에서, 상기 M*은 Cu-64(Ⅱ)이다.
본 명세서에서 용어 "착물"은 1 개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자(chelator:킬레이터) 또는 원자단을 리간드(ligand: 배위자)라고 부른다.
본 명세서에서 용어 NOTA는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)의 약어로서 금속 친화성의 리간드 화합물이다. 상기 리간드는 금속 친화성의 리간드로서 작용하여 체내에서 방사성 금속이 유리되지 않도록 할 수 있고, 방사성 물질을 체외로 제거하는 작용이 있어 방사성 물질에 의한 세포독성을 줄일 수 있으므로 방사선 장해에 대한 화학적 방호제로서 작용할 수 있다(Marouan Rami et al., Carbonic anhydrase inhibitors: Gd(III) complexes of NOTA- and TETA-sulfonamide conjugates targeting the tumor associated carbonic anhydrase isozymes IX and XII , New J. Chem., 2010, 34, 2139-2144; Silvio Aime et al., NMR relaxometric studies of Gd(III) complexes with heptadentate macrocyclic ligands, Magnetic Resonance in Chemistry (1998) Volume: 36, Issue: S1, Pages: S200-S208).
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서,
상기 화학식 2의 화합물을 금속성 방사성동위원소의 용액과 반응시켜 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 반응은 방사성 동위원소를 화학식 2의 화합물의 NOTA 리간드에 배위결합에 의해 결합시켜 착물을 형성하는 과정이다. 상기 방사성 동위원소에 따라 적절한 반응 조건은 달라질 수 있다. 구체적인 반응 조건은 유기화학 분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방사성 동위원소가 64Cu인 경우, 완충용액 중의 64Cu의 용액(pH 5 ~ 6)을 화학식 2의 화합물의 용액과 혼합하여 약 40 ~ 60℃에서 반응시킴으로써, 화학식 1의 화합물을 생성시킬 수 있다. 상기 완충용액으로는 예를 들어, 소듐 아세테이트 완충용액 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물은
하기 화학식 5의 화합물을 Fmoc-N-아미도-dPEG4-acid와 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계;
상기 화학식 4의 화합물을 (p-SCN-Bn)-NOTA와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 생성시키는 단계; 및
하기 화학식 3의 화합물을 탈보호시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다：
[화학식 5]
[화학식 4]
[화학식 3]
상기 화학식 5와 Fmoc-N-아미도-dPEG4-acid의 반응으로 화학식 4의 화합물을 생성시키는 구체적인 반응조건은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다. 일 구체예에서, 화학식 5를 녹인 용액에 Fmoc-N-아미도-dPEG4-acid, N, N-디이소프로필에틸아민(18.3 μL, 0.105 mmol), TBTU(20.2 mg, 0.063 mmol), 및 HOBt(8.5 mg, 0.063 mmol)을 추가하고, 아르곤 대기 환경에서 실온에서 반응시킨 다음, 피페리딘/DMF을 첨가하고 추가적으로 반응시킴으로 수행할 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물을 (p-SCN-Bn)-NOTA와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 생성시키는 구체적인 반응조건은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다. 일 구체예에서, (p-SCN-Bn)-NOTA를 녹인 용액에 화학식 4의 화합물 및 N, N-디이소프로필에틸아민의 혼합용액을 첨가하고, 아르곤 대기 환경에서 실온으로 반응시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 화학식 3의 화합물을 탈보호시키는 단계는 구체적인 반응조건은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 화학식 5의 화합물은 하기 화학식 7의 화합물을 화학식 6의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다.
[화학식 7]
[화학식 6]
상기 화삭식 7의 화합물은, 라이신 및 (1S,3R)-3-아미노시클로헥산-1-카르복실산을 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩타이드 결합반응시킨 다음, 아스파르트산, 글리신, 아르기닌의 순으로 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩타이드 결합시키는 것을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. Fmoc 고체상 합성법에 의한 펩타이드의 제조는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 당업자가 적절한 반응조건을 선택하여 상기 화학식 7의 화합물을 제조할 수 있다. 그런 다음, 보호기의 도입은 유기화학 분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물의 제조방법의 일 구체예의 반응식을 도 1에 나타내었다.
상기 화학식 1의 화합물은 실험 결과 PET 조영제로서 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 PET 조영제를 제공한다.
하기 실험예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물에 대해 마우스의 혈청 내 안정성을 측정한 결과, 2일 이상 화합물이 분해되지 않고 안정한 것으로 나타났다(실험예 1, 도 3). 또한, 화학식 1의 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여하고 PET 영상시스템에서 촬영한 결과, 종양 부위에서 증가된 신호가 관찰되는 PET 영상을 획득하였다(실험예 2, 도 4). 따라서, 화학식 1의 화합물은 암에 특이적으로 선택적인 PET 조영제로서 사용될 수 있다. 또한, 종양을 가진 마우스에게 cRGDyK(cyclo Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)를 먼저 투여하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 다음 PET 영상을 촬영한 결과 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않은 경우에 비해 종양부위의 신호가 더 낮은 것으로 나타났다(실험예 3). 따라서, 화학식 1의 화합물은 암세포에서 발현되는 비트로넥틴 수용체에 대한 특이적인 선택성이 있음을 알 수 있었다. 또한, 실제 그 화합물을 종양을 가진 마우스에게 투여 후 감마 카운터로 조직의 방사능을 측정한 결과, 정상조직에 비해 종양에서의 섭취율이 현저히 높다는 것을 확인하였으며(실시예 4), 종래 유사한 구조의 PET 조영제에 비해 종양에 대한 선택성이 현저히 높은 것으로 나타났다(실시예 5). 따라서, 상기 화학식 1의 화합물이 종래 PET 조영제에 비해 종양에 대한 선택성이 더욱 개선된 매우 효과적인 조영제로서 작용할 수 있는 것으로 확인되었다.
상기 PET 조영제는 상기 활성성분인 화학식 1의 화합물을 기준으로 성인에게 0.1 ~ 30 mCi 투여할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 PET 조영제는 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 PET 조영제는 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
약어에 대한 정의
DCM : Dichloromethane
DMF : N,N-dimethylformamide
ACN : Acetonitrile
DIEA : Diisopropylethylamine
NOTA : 1,4,7-triazacyclononanetriacetic acid
DIC : diisopropylcarbodiimide
HOBt : N-hydroxybenzotriazole
HBTu : 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HPLC : High-performance liquid chromatograph
c(RGD-ACH-K) : 아미노사이클로헥산카르복실산(ACH)이 공유결합으로 삽입된 cRGDK(cyclo Arg-Gly-Asp-Lys)
(p-SCN-Bn)-NOTA : 2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7 -triacetic acid
Fmoc-N-아미도-dPEG4-산 : 15-amino-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid
실시예 1 : NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
(화학식 2)의 제조
고체상 펩타이드 합성법(Solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 화합물 8을 합성하였다. 화합물 8(730 mg, 0.82 mmol)을 DMF(10 mL)에 녹인 뒤, N,N-디이소프로필에틸아민(407 μL, 2.46 mmol), Fmoc-N-아미노-dPEG4-산(440 mg, 0.90 mmol), TBTU(395 mg, 1.23 mmol), HOBt(166 mg, 1.23 mmol)을 첨가하고, 아르곤 대기 환경에서 실온으로 16 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 CH2Cl2(10 mL)을 추가하여 감압증류장치로 일부 용매를 제거하며 농축한 뒤, 이 혼합용액에 포화 NaHCO3 용액을 추가하여 추출을 실시하였다. 여기서 분리된 유기용매에 소금물로 다시 한번 추출을 실시한 뒤, Na2SO4을 첨가하여 수분을 제거하고 감압증류장치에서 농축하였다. 이 용액에 20% 피페리딘(10 mL)을 첨가하고 15분 동안 교반한 다음, 진공에서 농축하여 액체크로마토그래피(20% 메탄올/CH2Cl2)를 실시하여 화합물 7(699 mg, 75%)을 획득하였다.
MS (ESI): [MH]+=1138.6(m/z),calc.molecularweight(MW):1137.4(C53H88N10O15S)
상기 화합물 7을 DMF(3 mL)로 녹인 용액에 화합물 6 (3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노]-1,5-비스(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)에스테르)을 포함한 혼합용액(DMF 7 mL에 화합물 6(139 mg, 0.247 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (215 μL, 1.235 mmol)을 녹인 혼합용액)을 첨가하고 아르곤 대기 환경에서 실온으로 16시간을 반응시켰다. 반응 종결 후, 감압증류장치로 상기 혼합용액을 농축하고 액체크로마토그래피(30% 메탄올/CH2Cl2)을 실시하여 하얀색 고체의 화합물 5(489 mg, 83%)를 수득하였다.
MS (ESI): [M+2H]2+=1194.4(m/z),calc(MW):2385.9(C111H181N21O32S2)
상기 화합물 5(50 mg, 0.021 mmol)을 DMF(1 mL)에 녹인 뒤, 여기에 N, N-디이소프로필에틸아민(18.3 μL, 0.105 mmol), Fmoc-N-아미도-dPEG4-산(14.3 mg, 0.029 mmol), TBTU(20.2 mg, 0.063 mmol), HOBt(8.5 mg, 0.063 mmol)을 추가하고, 아르곤 대기 환경에서 실온으로 16시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 20% 피페리딘/DMF(2 mL)을 첨가하고 15분 동안 추가적으로 교반하였다. 반응 종결 후, 감압증류장치로 상기 혼합용액을 농축시키고, 분리용 HPLC((a)컬럼: YMC-Pack ODS-A C18, 5 μm, 250 x 20 mm, (b) 선형 구배(10분까지 65% A용액): 50% A(아세토니트릴 중의 0.1% TFA용액), 50% B(0.1% TFA 수용액), (c) 유속: 10 mL/min)로 화합물을 분리하고 건조시켜 하얀색 고체의 화합물 4(42 mg, 76%)를 수득하였다.
MS (ESI): [M+3H]3+=879.0(m/z),calc(MW):2633.2(C122H202N22O37S2)
DMF(0.5 mL)로 (p-SCN-Bn)-NOTA(16 mg, 28.5 μmol)을 녹인 용액에 상기 화합물 4(50 mg, 19.0 μmol)와 N, N-디이소프로필에틸아민(26.5 μL, 152 μmol)을 DMF(1 mL)으로 녹인 혼합용액을 첨가하고, 아르곤 대기 환경에서 실온으로 12시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 분리용 HPLC((a)컬럼: YMC-Pack ODS-A C18, 5 μm, 250 x 20 mm, (b)유속: 10 mL/min, (c)이동상(11분 동안 선형 구배): 50-65% 아세토니트릴 중의 0.1% TFA/0.1% TFA 수용액)으로 화합물을 분리하였고 건조시켜 하얀색 고체의 화합물 3(32 mg, 54%)로 수득하였다. MS (ESI): [M+3H]3+=1029.0(m/z),calc(MW):3083.7(C142H228N26O43S3)
상기 화합물 3(31 mg, 10.1 μmol)을 혼합용액(2 mL, 트리플루오로아세트산:증류수:트리이소프로필실란 = 1.9 mL/0.05 mL/0.05 mL)으로 녹인 뒤 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 감압증류장치에서 농축을 실시하였다. 상기 농축된 용액을 분리용 HPLC((a)컬럼: Waters XTerra C18, 5 μm, 250 x 10 mm, (b)유속: 5 mL/min, (c)이동상(20분 동안 선형 구배); 15-50% 아세토니트릴 중의 0.1% TFA/0.1% TFA 수용액)로 화합물을 분리하였고 건조시켜 하얀색 고체의 화합물 2(NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2, 20 mg, 66%)를 수득하였다.
MALDI-TOF-MS: [MH]+=2465.27(m/z),calc:2466.14(C108H180N26O37S)
실시예 2 :
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
(화학식 1)의 제조
사이클로트론으로부터 생산된 방사성동위원소 64Cu는 묽은 염산 용액에 녹여진 무색의 투명한 용액으로 수득되며, 실험에 필요한 방사능량에 따라 적절하게 취득한 뒤 64Cu 용액(0.1mCi 이상)을 적절한 유리용기에 담아 질소를 불어주면서 100 ℃에서 건조시켰다. 건조된 64Cu는 투명한 막의 형태로 유리용기에 붙어 있고, 여기에 1M 소듐아세테이트 버퍼 용액(pH 5-6)을 0.1-0.4 mL 추가한 뒤 녹였다.
이어서 실시예 1에서 제조된 NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 에탄올에 녹여 100μg/0.01mL 농도로 녹여 제조한 용액을 상기 64Cu 용액에 혼합하여 50℃에서 표지반응을 30분 동안 진행시켰다. 상기 최종 물질인 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2을 박막 크로마토그래피에 흡착시켜 전개액(0.1M 시트레이트 버퍼용액)으로 충분히 전개한 뒤 방사화학적 수율과 순도를 확인하였다.
상기 화합물 2로부터 화합물 1의 제조방법을 반응식으로서 도 1에 함께 나타내었다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2의 Radio-TLC 스캐너의 결과 이미지이다. 도 2의 Radio-TLC 이미지로부터 방사화학적 수율과 순도는 평균적으로 99% 이상임을 알 수 있다.
실험예 1:
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
(화학식 1)의 in-vitro 혈청 안정성(serum stability) 측정
상기 실시예 2에서 제조된 화학식 1의 화합물(64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2)의 사람 혈청 및 마우스 혈청 내 안정성을 측정하였다. 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 (0.1 mCi, 100 mL)을 사람 혈청 및 마우스 혈청 및 PBS (0.5 mL)에 섞고 37℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대(30 분, 60 분, 3시간, 24시간, 48시간)에 TLC를 실시하였다. 시간대별 혈청 내 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 의 안정성 측정 결과를 하기 도 3에 나타내었다.
도 3은 화학식 1의 화합물(64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2)을 사람 혈청 및 마우스 중에서 37℃로 배양한 다음 시간의 경과에 따라 TLC를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3에 따르면, 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 는 사람 및 마우스 혈청 및 PBS 내에서 48시간 동안 안정함을 알 수 있다.
실험예 2 :
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
의 PET 영상 획득
PET 영상은 다중 PET/SPECT/CT 시스템(INVEON, Simens Medical Solutions)으로 촬영하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 어깨에 피하 주입하여 종양을 만들었다. 종양을 가진 마우스(nude, 20 g)의 꼬리정맥을 통해 상기 실시예 2에서 제조된 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 0.2 mCi를 주사하여 PET 영상을 획득하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4는 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi의 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하고 시간의 경과에 따라 촬영한 PET영상이다.
도 4에 따르면, 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 를 투여한 후에 종양 부위에서 증가된 신호(색이 밝아짐)를 관찰할 수 있다.
실험예 3 :
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
의 종양 선택성 확인
상기 실시예 2에서 제조된 화학식 1의 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 의 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성을 확인하는 실험을 하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 어깨에 피하 주사하여 종양을 만들었다. 먼저 수용체 차단을 위해 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 cRGDyK 펩타이드(10 mg/kg)를 주사하였다. 30분 후에 상기 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 0.2 mCi를 주사하여 실험예 2과 동일한 방법으로 PET 영상을 획득하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 종양에 존재하는 비트로넥틴 수용체를 차단하지 않고 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET 영상(차단안함)과 cRGDyK 펩타이드를 주사하여 비트로넥틴 수용체를 차단한 후 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사하여 촬영한 PET영상(차단함)이다.
도 5에 따르면, 수용체가 차단되지 않은 종양 부위의 신호에 비해서 수용체가 차단된 종양부위의 신호가 더 낮음을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 가 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성이 있음을 알 수 있다.
실험예 4 :
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
의 조직분포
상기 실시예 2에서 제조된 화학식 1의 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2의 마우스 조직의 분포를 확인하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스(BW 20 g) 어깨에 피하 주사하여 종양을 만들었다. 종양을 가진 마우스(n=4)의 꼬리정맥을 통해 0.01 mCi의 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2를 주사한 후, 30분, 1 시간, 3 시간, 18 시간에 장기(혈액, 근육, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 장, 신장, 뼈, 종양)를 적출하여 감마카운터로 조직의 방사능을 측정하여 도 6에 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 를 주사하고 각종 장기에서 측정된 주사량대비 조직 방사능비(%ID/g)를 시간대별로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6에 따르면 주사 후 혈액 내에 존재하는 방사능 수치가 주사 후 30분에 0.5% 였으나 1시간 이후부터는 0.06 % 이하로 아주 낮게 유지가 되었으며, 간 조직의 방사능 수치가 주사 후 30분에 0.8 %, 1시간 이후부터는 0.9% 미만으로 아주 낮은 수치를 나타내었다. 그로 인해, 종양조직대혈액비율 (tumor-to-blood ratio)이 1시간에 35.5, 3시간에 53.9 로 아주 높은 수치를 나타냈으며, 이는 화학식 1의 화합물이 정상조직에서의 섭취율은 낮으면서도 종양조직에는 효율적으로 높은 섭취율을 나타내는 것을 의미하다.
실시예 5 :
64
Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]
2
와 RGDfK
2
-NOTA-
64
Cu 의 조직 분포 비교시험
상기 실시예 2에서 제조된 화학식 1의 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2의 마우스 조직의 분포에 대한 측정을 화학식 1과 비교적 유사한 구조의 RGDfK2-NOTA-64Cu (한국특허등록 1471890) 와 함께 비교시험 하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2와 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 종양조직대혈액비율 (tumor-to-blood ratio)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2와 및 RGDfK2-NOTA-64Cu 각각에 대해 혈액, 신장, 및 간에서의 섭취율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7에 따르면 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2가 RGDfK2-NOTA-64Cu에 비해 현저히 높은 종양조직대혈액비율을 나타내었으며, 따라서 PET 영상에 의한 종양 진단에 있어서 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2가 RGDfK2-NOTA-64Cu에 비해 현저히 효율적임을 알 수 있다.
또한, 도 8에 따르면 64Cu-NOTA-PEG[c(RGD-ACH-K)]2 가 RGDfK2-NOTA-64Cu에 비해 혈액, 신장, 및 간 모두에서 현저히 낮은 수치를 보여줌으로써 정상조직에서 더 낮은 독성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
Claims (8)
- 하기 화학식 2의 화합물:
[화학식 2]
.
- 하기 화학식 1의 화합물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, M*은 Cu-64(Ⅱ), Ga-68(Ⅲ), Zr-89(Ⅳ), 및 Y-86(Ⅲ)에서 선택된 금속성 방사성동위원소로서, NOTA에 배위결합되어 있다. - 제2항에 있어서, 상기 M*은 Cu-64(Ⅱ)인 것인 화합물.
- 하기 화학식 2의 화합물을 금속성 방사성동위원소의 용액과 반응시켜 제2항에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법:
[화학식 2]
- 하기 화학식 5의 화합물을 Fmoc-N-아미도-dPEG4-acid와 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계;
상기 화학식 4의 화합물을 (p-SCN-Bn)-NOTA와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 생성시키는 단계; 및
하기 화학식 3의 화합물을 탈보호시키는 단계를 포함하는 제1항에 따른 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법:
[화학식 5]
[화학식 4]
[화학식 3]
- 제5항에 있어서, 상기 화학식 5의 화합물은 하기 화학식 7의 화합물을 화학식 6의 화합물과 반응시켜 제조된 것인 방법:
[화학식 7]
[화학식 6]
- 제1항에 따른 화합물을 포함하는 PET 조영제.
- 제7항에 있어서, 암 진단에 사용되는 것인 PET 조영제.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160044942A KR101743728B1 (ko) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | Peg 및 nota 함유 rgd 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 pet 조영제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020160044942A KR101743728B1 (ko) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | Peg 및 nota 함유 rgd 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 pet 조영제 |
Publications (1)
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| KR101743728B1 true KR101743728B1 (ko) | 2017-06-05 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101471890B1 (ko) | 2013-05-13 | 2014-12-12 | 한국원자력의학원 | NOTA 표지 글루코사민-함유 시클로 RGDfK 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 핵의학 영상 조영제 및 암 치료제 |
-
2016
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ACS Med. Chem. Lett., 2014, Vol. 5, p. 979-982. |
| Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, Vol. 455, p. 246-250. |
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