KR101336073B1 - 암 진단용 ｓｐｅｃｔ／ｍｒｉ 이중 조영제 조성물 및 이를 이용한 ｓｐｅｃｔ／ｍｒｉ이중영상을 획득하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물을 포함하는 제1제; 및 화학식 2의 화합물을 포함하는 제2제를 포함하고, 상기 제1제 및 제2제는 서로 분리되어 존재하는 SPECT 및 MRI 이중 조영제 조성물을 제공한다. 또한 이들을 이용하여 효율적으로 SPECT/MRI 이중 영상을 획득할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이중 조영제 조성물 및 본 발명에서 제시하는 이중영상 획득방법은 동일한 부위에서 MRI 및 SPECT에 모두에 대한 조영효과를 나타낼 수 있으므로, 보다 정확한 질병의 진단이 가능할 뿐만 아니라, 방사선 과다노출의 위험 없이 안전하게 사용할 수 있다는 장점이 있다.

Description

암 진단용 ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ 이중 조영제 조성물 및 이를 이용한 ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ이중영상을 획득하는 방법{Composition for Dual SPECT/MRI contrast and a process for obtaining SPECT/MRI dual image using the same}

본 발명은 신규한 암 진단용 SPECT/MRI 이중 조영제 조성물 및 이를 이용한 SPECT/MRI 이중 영상을 획득하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 SPECT 및 MRI 모두에서 충분히 효과적인 조영제로서 작용할 수 있고, 방사선에 대한 불필요한 피폭을 피할 수 있으면서 암진단에 효과적으로 사용될 수 있는 이중 조영제 조성물에 관한 것이다.

핵의학 영상기기인 단일광자방출단층촬영기(Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT)와 양전자방출단층촬영기(Positron Emission Tomography, PET)는 체내에 주입 된 방사성 의약품의 분포를 영상화하는 기기로서, 질병으로 인한 인체의 생물학적 변화를 영상화 하여 질병의 조기진단 및 질환의 치료방법 결정에 정확한 정보를 제공할 수 있어 핵의학 영상기기의 중요성이 증가되고 있다.

자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자장을 발생하는 커다란 자석통 속에 인체를 들어가게 한 후 고주파를 발생시켜 신체부위에 있는 양성자를 공명시켜 각 조직에서 나오는 신호의 차이를 측정하여 컴퓨터를 통해 재구성하여, 영상화하는 기술이다. 이러한 자기공명영상(MR 영상)은 타 영상법에 비해 해상도 및 대조도가 높고 심부장기영상과 3차원 정보 제공이 실시간으로 가능한 장점을 가지고 있다. 상기 MR 영상은 고유한 조직 신호 차이를 다양한 기법으로 생체 영상화 할 수 있지만 조영제를 사용하면 조직 내 물 분자의 자기이완시간을 변화시켜 조직의 대조도를 더욱 증가시킬 수 있다.

조직 내 물 분자의 자기이완시간을 변화시킬 수 있는 상자성 물질로는 가돌리늄(Gd³⁺), 망간(Mn²⁺) 등이 있다. 그러나 가돌리늄 및 망간 원소 그 자체는 인체 내에서 유독한 물질이므로 독성을 상쇄시키기 위한 목적으로 DTPA(Diethylene triamine penta acetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), 또는 DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid)와 같은 리간드로 사용하여 착화(chelation) 시켜서 Gd-DTPA, Gd-DOTA, 또는 Gd-DO3A 착물로서 사용될 수 있다. 가돌리늄 원소의 독성은 이 원소가 생체 내에서 생체분자들과 반응할 수 있는 많은 결합 위치를 가지고 있음에 기인하기 때문에, 가돌리늄을 리간드에 착화시켜 가돌리늄이 생체 분자와 반응할 수 있는 결합위치들을 봉쇄하여 독성을 줄이는 것이다. 이렇게 착화된 금속 착화물(metal chelate)은 인체 내에서 화학적 안정성을 유지해야 한다. 여기서 화학적 안정성이란 금속 착화물이 얼마나 오랫동안 분리되지 않고 그 상태를 유지하느냐 여부이다. 만약 상기 Gd-DTPA 등이 인체 밖으로 배설되기 전 가돌리늄과 리간드로 분리된다면 이는 치명적인 결과를 유발하게 될 것이다. 이러한 화학적 안정성 여부는 흔히 열역학적 개념인 안정 상수(stability constant)로 표현된다. 또한, 높은 자기이완율을 갖는 조영제는 상대적으로 적은 양을 투여해도 높은 조영증강효과를 나타내기 때문에, MR 영상에서의 높은 자기이완율은 MRI 조영제의 고효율성을 증명해주는 인자이다. 즉, MRI 조영제는 자기이완율이 높고 열역학적으로 안정한 것이 바람직하다.

MRI는 타 영상법에 비해 해상도 및 대조도가 높긴 하지만, 핵의학 영상기기에 비해서는 민감도가 낮다. 이러한 낮은 민감도(10^-5 mole/L)를 가진 MRI의 단점을 극복하기 위한 방안으로 MRI에 비해 높은 민감도(10^-12 mole/L)를 가진 PET(Positron Emission Tomography) 혹은 SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography) 등의 핵의학 영상기기를 결합시킨 PET/MRI 혹은 SPECT/MRI 등의 다중영상기기가 연구되고 있다. 이러한 다중영상기기의 발전과 더불어 다중 방식의 조영제의 개발 또한 활발히 진행되고 있으며, 다중 방식의 조영제는 영상의 정확도 및 민감도를 개선시킬 수 있다. 다중 조영제란 자기공명영상과 핵의학영상, 자기공명영상과 광학영상 혹은 핵의학영상과 광학영상 등 두 가지 이상의 영상 획득에 사용될 수 있어 동일한 진단부위에서의 2 개 이상의 진단영상 획득이 가능하여 원하는 질병을 보다 빠르고 정확하게 진단하고 치료 단계로 들어가기에 앞서 질병에 대한 정확한 인지를 가능하게 하는 기능을 가진 조영제를 말한다. 이와 관련하여 PET/MRI 및 SPECT/MRI 등의 다중영상조영제에 대한 연구가 보고되고 있으나 아직 개발 초기 단계이다.

스탠포드 대학교 이하용 박사 연구팀에서는 MRI 조영제로 사용 가능한 산화철 나노입자의 표면에 종양 타겟용 펩타이드인 RGD 와 PET 영상용 방사성동위원소인 Cu-64를 표지시킨 암진단용 PET/MRI 이중영상 조영제를 개발하였다(비특허문헌 1).

전북대학교 정환정 박사 연구팀에서는 MRI 조영제로 사용 가능한 산화철 나노입자의 표면을 포스페이트 그룹 및 아민그룹을 가지는 물질로 코팅하여 타겟 리간드, 항체 및 형광프로브와 결합시켜 질환 진단 및 광학영상용으로도 사용가능한 듀얼 조영제를 개발하였다(특허문헌 1) 또한, MRI 조영제로서 사용될 수 있는 산화철 나노입자의 표면에 Tc-99m을 결합시켜 MRI와 SPECT에서 사용 가능한 이중 조영제를 개발하였다(비특허문헌 2). 베이징대학교 Fan Wang 과 Mingyuan Gao 연구팀에서는 산화철 나노입자와 I-125 를 결합시켜 MRI와 g-camera에서 사용가능한 이중 조영제를 개발하였다(비특허문헌 3).

그러나, MRI에서 T1 강조영상을 촬영할 때 일반적으로 상자성 가돌리늄 킬레이트를 조영제로서 사용하는데, 그 용량은 마이크로그람 혹은 밀리그람 이며, 핵의학 영상에서 사용되는 방사성동위원소의 용량은 나노그람 정도 이다. 즉, 핵의학 영상이 MRI에 비해 10⁶~10⁹ 배 높은 민감도를 가지므로 단순하게 MRI 조영제와 방사성동위원소를 결합시킨 단일분자 형태의 조영제는 MR 영상을 10⁶~10⁹ 분의 1의 효과로 낮게 나타내기 때문에, MRI 및 핵의학영상 모두를 효과적으로 조영시킬 수 없으며, MRI 조영에 효과적인 용량으로 환자에게 투여된다면 환자에게 방사선이 과다 피폭되고 영상의 질도 상당히 저하된다. 그렇기 때문에 종래 개발된 대부분의 이중 조영제는 가돌리늄 킬레이트 대신 가돌리늄 킬레이트의 자기적 성질에 비해 약 50 ~ 100 배나 큰 산화철 나노입자 형태를 갖는다(특허문헌 1). 이는 나노입자는 입자크기에 따라 다양한 물리적 성질을 나타내는 효과뿐만 아니라 표면개질 방법에 의한 다양한 변형이 가능하기 때문이기도 하다. 그러나, 아무리 산화철 나노입자 형태의 이중 조영제가 높은 자기적 성질을 가진다 해도 핵의학영상장비와 자기공명영상장비 사이의 민감도 차이 (10⁶~10⁹)를 극복하기에는 역부족이라고 할 수 있다. 또한, 나노입자 형태는 체내에서 존재하는 대식세포에 의해 제거될 확률이 높고 체내에 머무르는 시간이 길어 체내 독성을 유발할 가능성이 높기 때문에 임상적용이 어렵다.

따라서, MRI 및 핵의학 영상기기 모두에서 충분히 효과적인 조영제로서 작용할 수 있으면서, 독성을 최소화할 수 있는 이중 조영제의 개발이 필요하다.

한편, 상기 Gd에 대한 리간드로서 작용하는 DTPA, DOTA, 또는 DO3A는 암세포에 대한 특이성이 없어 Gd와 상기 리간드가 결합된 조영제는 암세포에 대한 선택성이 결여되어, 암세포에서의 신호가 오랫동안 지속되지 못하여 암 진단에 효과적인 조영제로서 효과적이지 못한 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 상기 리간드에 암세포에 대해 선택적인 RGD(Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 펩티드를 결합시킨 RGD-[리간드->Gd] 구조의 MRI 조영제가 개발되었다(특허문헌 2). 그러나, 상기 특허문헌은 MRI 및 핵의학 영상을 모두 획득할 수 있는 이중 조영제에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다.

1. 한국특허공개 2010-0031885 2. 한국특허공개 2009-0096816

1. Lee et al., PET/MRI Dual-Modality Tumor Imaging Using Arginine-Glycine-Aspartic (RGD)-Conjugated Radiolabeled Iron Oxide Nanoparticles, J Nucl Med 2008; 49:1371-1379 2. June et al., Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as a Dual Imaging Probe for Targeting Hepatocytes In Vivo. Magnetic Resonance in Medicine 2009, 62: 1440-1446 3. Fan Wang et al. A Novel Type of Dual-Modality Molecular Probe for MR and Nuclear Imaging of Tumor: Preparation, Characterization and in Vivo Application, Molecular pharmaceutics 2009, 6 :1074-1082

이에 본 발명자들은 신체에 대한 독성 없이 MRI 및 핵의학 영상기기 모두에 대해 충분한 조영제로서 작용할 수 있으면서도 암 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 이중 조영제의 개발을 위해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 MRI 및 SPECT 모두에 충분히 효과적이고 안전하며 암 진단에 효과적인 이중 조영제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중 조영제 조성물을 이용하여 암 진단에 유용하면서 MRI 및 SPECT 모두에 대해 충분히 효과적인 영상을 획득할 수 있는 MRI 및 SPECT 이중영상을 획득하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은

하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 제1제; 및

하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 제2제를 포함하고,

상기 제1제 및 제2제는 서로 분리되어 존재하는 SPECT 및 MRI 이중 조영제 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌(Cyclen), 또는 DFOM(Deferrioxamine) 이고,

상기 Gd는 가돌리늄이며, 상기 리간드에 배위결합되고,

상기 RGD는 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys를 포함하는 아미노산 서열이 환을 형성하는 시클릭 펩티드고, 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있고,

상기 X는 I-123, I-124, I-125, 및 I-131에서 선택된 방사성 요오드이고, 상기 RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있다;

[화학식 2]

상기 리간드, Gd, RGD는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같고,

상기 I는 비방사성 요오드이고, RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있다.

본 발명의 다른 일 측면은

상기 이중 조영제 조성물을 이용하여 SPECT 및 MRI 이중 영상을 획득하는 방법으로서,

상기 제1제를 대상에게 투여하고 SPECT 영상을 획득하는 단계;

그런 다음, 상기 제2제를 대상에게 투여하고 MR 영상을 획득하는 단계를 포함하는, SPECT/MRI 이중 영상을 획득하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 DOTA, DTPA 또는 DO3A 등의 리간드, 상기 리간드와 공유결합된 시클릭 RGD(Arg-Gly-Asp) 함유 펩티드, 및 상기 리간드와 착물을 형성한 가돌리늄을 포함하는 MRI 조영제에 방사성 요오드(I-123, I-124, I-125, 또는 I-131)를 결합시키면 SPECT 조영제로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라(실험예 8), MRI 조영제로서도 효과가 있는 SPECT/MRI 이중 조영제로서 사용할 수 있음을 밝혀냈다. 또한, 이러한 새로운 SPECT/MRI 이중 조영제 화합물(화학식 1)에서, 상기 방사성 요오드의 cold form인 비방사성 요오드를 대신 결합시킨 화합물(하기 화학식 2)을 상기 방사성 요오드 SPECT/MRI 이중 조영제 화합물(하기 화학식 1)과 함께 사용함으로써 SPECT 및 MRI 모두에 대해서 충분히 효과적인 SPECT/MRI 이중 조영제로서 작용할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,

하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 제1제; 및

하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 제2제를 포함하고,

상기 제1제 및 제2제는 서로 분리되어 존재하는 SPECT 및 MR 이중 조영제 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌(Cyclen), 또는 DFOM(Deferrioxamine) 이고,

상기 Gd는 가돌리늄이며, 상기 리간드에 배위결합되고,

상기 RGD는 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys를 포함하는 아미노산 서열이 환을 형성하는 시클릭 펩티드고, 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있고,

상기 X는 I-123, I-124, I-125, 및 I-131에서 선택된 방사성 요오드이고, 상기 RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있다;

[화학식 2]

상기 리간드, Gd, RGD는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같고,

상기 I는 비방사성 요오드이고, RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "착물"은 1 개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자(chelator:킬레이터) 또는 원자단을 리간드(ligand: 배위자)라고 부른다.

본 명세서에서 사용되는 용어 DTPA는 Diethylene triamine penta aeetic acid), DOTA는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DO3A는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, NOTA는 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NODAGA는 1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid, TETA는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid, TE3A는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid, TE2A는 1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid, PCTA는 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid의 약어로서 금속 친화성의 리간드 화합물이다. 상기 리간드는 금속 친화성의 리간드로서 작용하여 체내에서 방사성 금속 Gd가 유리되지 않도록 할 수 있고, 방사성 물질을 체외로 제거하는 작용이 있어 방사성 물질에 의한 세포독성을 줄일 수 있으므로 방사선 장해에 대한 화학적 방호제로서 작용할 수 있다(Marouan Rami et al., Carbonic anhydrase inhibitors: Gd(III) complexes of DOTA- and TETA-sulfonamide conjugates targeting the tumor associated carbonic anhydrase isozymes IX and XII , New J. Chem., 2010, 34, 2139-2144; Silvio Aime et al., NMR relaxometric studies of Gd(III) complexes with heptadentate macrocyclic ligands, Magnetic Resonance in Chemistry (1998) Volume: 36, Issue: S1, Pages: S200-S208).

상기 RGD는 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys를 포함하는 아미노산 서열이 환을 형성하는 시클릭 RGD 함유 펩티드이고, 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있는 형태이다. 정상 혈관내피세포에서는 발현되지 않고 암 세포의 신생혈관형시에는 발현되는 α_νβ₃ 인테그린은 RGD(Arg-Gly-Asp)서열을 갖는 펩티드와 결합하는 특징이 있다. 따라서, 상기 RGD는 Arg-Gly-Asp를 포함하는 것으로 인해 암세포에 존재하는 수용체에 선택적으로 결합될 수 있어 상기 화학식 1의 화합물을 암세포로 타겟팅하는 기능을 수행할 수 있다.

본 명세서에서 "RGD-리간드"는 상기 시클릭 RGD 함유 펩티드의 리신의 말단 아미노기가 리간드와 아미드 결합에 의해 공유결합을 형성한 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 "리간드→Gd"는 상기 리간드에 가돌리늄이 배위결합하여 형성된 착물을 의미한다.

본 명세서에서 "

"는 상기 RGD-리간드에 가돌리늄이 배위결합하여 형성된 착물을 의미한다.

상기 화학식 1의 화합물은 일 구현예에 따르면 하기 화학식 1a의 화합물일 수 있다:

[화학식 1a]

상기 화학식 1a에서,

X는 I-123, I-124, I-125, 또는 I-131 이다. 바람직하게는, X는 I-125이다.

상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3의 화합물을 화학식 4의 화합물과 반응시켜 RGD의 티로신의 메타 위치에 방사성 요오드를 표지하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

[화학식 3]

상기 리간드, Gd, 및 RGD는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같다;

[화학식 4]

MX

상기 M은 Na이고, 상기 X는 I-123, I-124, I-125, 또는 I-131이다.

상기 화학식 4의 방사성 요오드화 금속 화합물은 제조하고자 하는 화학식 1의 화합물의 X의 종류(I-123, I-124, I-125, 또는 I-131)에 따라 달라질 수 있다. X의 종류에 따라 달라지는 화학식 4의 화합물 및 구체적인 반응 조건은 본 명세서의 개시내용에 기초하여 유기 화합물 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.

상기 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물을 반응시키기 위한 용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 소량의 물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응 시 산화제를 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 산화제는 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 클로라민 T, 아이오드젠, 과산화수소, 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 상기 반응에 의해 티로신의 메타 위치에 방사성 요오드가 표지되어, 화학식 1의 화합물이 형성된다. 상기 반응은 실온에서 이루어질 수 있으며, 약 2-6분 동안 반응시키면 반응이 완료될 수 있다.

상기 반응에 의해 얻어지는 생성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 화학식 1 또는 1a의 화합물을 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다.

상기 화학식 3의 화합물은

상기 리간드와 상기 시클릭 RGD 함유 펩티드를 반응시켜 시클릭 RGD 함유 펩티드의 리신이 아미드 결합에 의해 리간드에 결합된 RGD-리간드의 화합물을 제조하는 단계; 및

상기 RGD-리간드의 화합물에 Gd 전구물질을 반응시켜 Gd를 상기 리간드에 배위결합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 RGD-리간드의 화합물을 제조하는 단계에서 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 소량의 물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응 시 촉매를 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 촉매는 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 또는 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole) DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DIC(diisopropylcarbodiimide), HBTu(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 우선 리간드 및 촉매의 혼합물을 pH를 약산으로 유지한 다음, 상기 시클릭 RGD 함유 펩티드를 부가하여 반응 시에는 약알카리성을 유지하는 것이 바람직하다. 상기 반응은 실온(room temp)에서 이루어질 수 있으며, 밤새 반응시킴으로써 반응이 완료될 수 있다. 그리하여 얻어지는 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 상기 RGD-리간드를 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다.

상기 Gd를 상기 리간드에 배위결합시키는 단계에서, 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물을 사용할 수 있다. 상기 RGD-리간드의 Gd 전구물질에 대한 반응 몰비는 1:1 내지 1:6 으로 반응시킬 수 있다. 상기 반응은 실온에서 약 24-48 시간동안 반응시킴으로써 완료될 수 있다. 그리하여 생성물을 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 상기 RGD-[리간드->Gd] 를 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다.

상기 화학식 2의 화합물은 일 구현예에 따르면 하기 화학식 2a의 화합물일 수 있다:

[화학식 2a]

상기 화학식 2a에서 I는 비방사성 요오드이다.

상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 4a의 화합물을 Gd 전구물질과 반응시켜 Gd를 리간드에 배위결합키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

[화학식 4a]

I-RGD-리간드

상기 I, RGD, 및 리간드는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같다.

상기 Gd 전구물질은 Gd(Ⅲ)X₃ 이며, 여기에서 X는 F, Cl, Br, I, 나이트레이트, 아세틸아세토네이트, 또는 아세테이트인 화합물 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Gd 전구물질의 종류에 따라 달라지는 구체적인 반응 조건은 본 명세서의 개시내용 및 유기 화합물 분야에 공지되어 있는 기술에 기초하여 당업자가 적절히 선택할 수 있다. Gd 전구물질은 상기 화학식 4a의 화합물과 반응 시 Gd가 I-RGD-리간드의 리간드와 배위결합하여 착물을 형성함으로써 화학식 2의 화합물이 형성될 수 있다. 상기 반응은 가온 조건 하에서, 약 35-45℃의 온도에서 이루어질 수 있으며, 약 36 내지 60 시간 동안 반응시키면 반응이 완료될 수 있다. 상기 반응에 의해 얻어지는 생성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 불순물을 제거함으로써 화학식 2의 화합물을 획득할 수 있으며, 바람직하게는 HPLC에 의해 불순물을 제거할 수 있다.

상기 화학식 4a의 화합물은

Arg, Gly, Asp, Iodo-Tyr, 및 Lys 아미노산을 이용하여 고체상 펩티드 합성법에 의해 하기 화학식 3a의 화합물을 생성시키는 단계; 및

하기 화학식 3a의 화합물을 DOTA, DPTA 및 DO3A에서 선택된 리간드와 반응시켜 하기 상기 화학식 4a의 화합물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

[화학식 3a]

I-RGD

상기 I 및 RGD는 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같다;

고체상 펩티드 합성법을 이용하여 원하는 아미노산 서열의 펩티드를 합성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(US 4,749,742; Atherton, E. and Sheppard, R.C., "Solid Phase Synthesis", IRL Press: Oxford, 1989).

상기 화학식 3a의 화합물은 비방사성 요오드로 치환된 Iodo-Tyr 및, Arg, Gly, Asp, Lys 아미노산을 이용하게 고체상 합성법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 "Iodo-Tyr"은 티로신의 메타 위치에 비방사성 요오드가 치환된 것을 말한다.

상기 화학식 4a의 화합물을 생성시키는 단계에서, 반응용매는 상기 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DMSO, DMF 등을 을 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응 시 촉매를 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 이러한 촉매는 반응물에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 또는 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole) DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DIC(diisopropylcarbodiimide), HBTu(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 상기 반응은 실온(room temp)에서 이루어질 수 있으며, 약 36-60 시간 정도 반응시킴으로써 반응이 완료될 수 있다. 그리하여 얻어지는 생성물은 에테르 중에 침전시켜 I-RGD-리간드를 획득할 수 있다.

상기 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물은 실험 결과 SPECT 조영제로서 효과가 있으며, 또한 MRI 조영제로서도 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 상기 화학식 2 또는 화학식 2a의 화합물은 실험 결과 MRI 조영제로서 효과가 있는 것으로 나타났다.

하기 실험예에 따르면, 상기 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물에 대해 마우스의 혈청 내 안정성을 측정한 결과, 3일 이상 화합물이 분해되지 않고 안정한 것으로 나타났다. 또한, 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물에서 방사성 요오드 대신 비방사성 요오드로 치환된 화합물(상기 화학식 2 또는 2a의 화합물)에 대해 세포독성 평가 및 종양을 가진 마우스에서의 MRI 영상을 획득한 결과, 세포독성이 매우 낮은 것으로 나타났으며 마우스의 종양부위에서 증가된 신호를 갖는 MR 영상이 획득되었다. 또한, 상기 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물에서 방사성 요오드 대신 비방사성 요오드로 치환된 화합물(상기 화학식 2 또는 2a의 화합물)에 대해 종양에 대한 선택성에 대해 실험한 결과, 종양에 대한 선택성이 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물 또한 세포독성이 낮고, MRI 조영제로서 사용될 수 있으며, 종양에 대한 선택성이 높다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 화학식 1 또는 화학식 1a의 화합물에 대해 종양을 가진 마우스에서의 SPECT 영상을 획득한 결과, 마우스의 종양부위에서 증가된 신호를 갖는 SPECT 영상이 획득되었다. 상기 실험결과로부터 상기 화학식 1 또는 1a의 화합물은 하나의 화합물에 방사성 요오드의 존재로 인해 SPECT 조영제로서 효과가 있음과 동시에 상자성 가돌리늄의 존재로 인해 MRI 조영제로서도 효과가 있으며, 특히 암 조직을 효과적으로 조영시켜 암 진단에 유용하게 사용할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 화학식 2 또는 화학식 2a의 화합물도 세포독성이 낮고, 효과적인 MRI 조영제로서 사용될 수 있으며, 종양에 대한 선택성이 높다는 것을 알 수 있다.

상기 화학식 1 또는 1a의 화합물은 SPECT/MRI 이중 조영제로서 사용할 수 있기는 하지만, SPECT와 같은 핵의학 영상이 MRI에 비해 10⁶~10⁹ 배 높은 민감도를 가지므로 상기 화학식 1 또는 1a와 같은 단일분자 형태의 조영제는 MRI 영상이 10⁶~10⁹ 분의 1의 효과로 낮게 나타날 수밖에 없다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물 자체는 SPECT 조영제로서는 충분히 효과적으로 사용될 수 있으나, MRI 및 SPECT 모두를 충분히 효과적으로 조영시키기 어려우며, 민감도가 낮은 MRI 조영에 효과적인 양으로 투여된다면 환자에게 방사선이 과다 피폭되고 영상의 질도 상당히 저하된다.

상기 화학식 1 또는 1a의 화합물은 상기 화학식 1 또는 1a의 화합물에서 hot form인 방사성 요오드를 그것의 cold form인 비방사성 요오드로 치환시킨 하기 화학식 2 또는 화학식 2a의 화합물과 조합함으로써 효과적인 MRI/SPECT 이중 조영제로서 사용될 수 있다. 즉, 상기 화학식 1 또는 1a의 화합물에서 방사성 요오드(I-123, I-124, I-125, 및 I-131)가 그것의 cold form의 형태인 비방사성 요오드로 치환된 화합물(화학식 2 또는 화학식 2a의 화합물)과 함께 사용하면 보다 효과적인 MRI/SPECT 이중 조영제로서 사용될 수 있다. 화학식 2 또는 2a의 화합물은 방사성 요오드를 포함하지 않아 SPECT 조영제로서의 효과는 없으며 MRI 조영제로서의 효과만 있고, 화학식 1 또는 1a의 화합물은 방사성 요오드를 포함하여 SPECT 조영제로서 작용할 수 있기 때문에, 화학식 1 또는 1a의 화합물 및 화학식 2 또는 2a의 화합물을 조합한 조영제는 MRI 및 SPECT 모두에 대한 효과적인 조영제로서 작용할 수 있으며, 화학식 1 또는 1a의 화합물을 화학식 2 또는 2a 의 화합물에 비해 적게 사용함으로써 방사선 피폭이 과다하지 않으면서 MRI 및 SPECT 모두의 조영에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "hot form"이란 비방사성 원소에 대해 그 원소와 동일한 화학적 성질을 가지고 생체에 투여 시 동일한 분포를 가지면서, 방사선을 방출하는 원소를 말한다. 반대로, 방사성 동위원소에 대해 그 원소와 동일한 화학적 성질을 가지고 생체에 투여 시 동일한 분포를 가지면서, 방사선을 방출하지 않는 원소를 "hot form" 에 대한 "cold form"이라고 한다. 비방사성 요오드에 대해서는 방사성 요오드(I-123, I-124, I-125, 및 I-131)가 hot form에 해당하며, 방사성 요오드(I-123, I-124, I-125, 및 I-131)에 대해 비방사성 요오드는 cold form 에 해당한다.

상기 본 발명의 이중 조영제 조성물은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 구조가 서로 동일하되, 단 RGD의 티로신에 치환된 요오드가 서로 hot form 및 cold form의 관계이므로, 화학식 1 및 2의 화합물은 생체 내에서 동일한 흡수, 분포, 대사, 배설의 약물동태학적 양상을 나타낸다. 상기 화학식 1의 화합물은 SPECT 조영제로서의 활성이 있고, 상기 화학식 2의 화합물은 방사성의 요오드를 함유하지 않아 SPECT 조영제 활성이 없고 MRI 조영제로서의 현저히 우수한 활성(높은 자기 이완율)을 나타낼 수 있다. 상기 화학식 2의 화합물은 MRI 조영제 활성을 나타낼 수 있다는 것은 하기 실험예 4 및 6에서 확인되었다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물이 방사성 요오드를 가지므로 SPECT 활성을 나타낼 수 있다는 것은 하기 실험예 8 에서 확인되었다.

상기 본 발명에 따른 이중 조영제 조성물은 SPECT 조영제인 화학식 1의 화합물의 MRI 조영제인 화학식 2의 화합물에 대한 몰비는 1: 10⁶ ~ 1: 10⁹ 인 것이 바람직하다. MRI 조영제는 그 민감도가 SPECT 조영제에 비해 약 10⁶~10⁹ 분의 1이므로, MRI 조영제인 화학식 2의 화합물을 10⁶~10⁹ 배 더 많이 함유시킴으로써 MRI 조영제로서의 효과 및 SPECT 조영제로서의 효과 모두가 충분히 얻어질 수 있다. 이와 같은 함량 조절에 의해, 민감도가 높은 SPECT에 대한 조영제로서 작용하는 화학식 1의 화합물의 함량을 줄이면서, 상대적으로 민감도가 낮은 MRI의 조영제로서 작용하는 화학식 2의 화합물의 함량을 충분히 증가시킬 수 있어, 생체에 대한 과도한 방사선 노출을 피하면서 MRI 영상 또한 효과적으로 얻어질 수 있는 MRI/SPECT 이중 조영제로서 사용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 MRI/SPECT 이중 조영제는 상기 활성성분인 화학식 1의 화합물은 0.1~30 mCi 및 화학식 2의 화합물은 0.1~1 mmol/kg 의 용량으로 투여할 수 있다.

상기 이중 조영제 조성물의 일 구현예는 상기 화학식 1a를 포함하는 제1제 및 하기 화학식 2a의 화합물을 포함하는 제2제를 포함한다:

[화학식 2a]

단, 상기 화학식 1a 및 2a는 요오드를 제외하고 서로 동일한 구조를 갖는다.

상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물은 생체 내에서 동일한 분포 형태를 나타내므로, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 모두 포함하는 조영제는 동일한 부위에서 MRI 및 SPECT에 대한 조영효과를 나타내므로, MRI 및 SPECT에 대한 효과적인 이중 조영제로서 사용될 수 있다. 그러나, 상기 화학식 1 및 2의 화합물은 그에 함유된 RGD로 인해 암세포에 존재하는 α_vβ₃ 수용체에 대한 선택적인 특이성을 가지므로(실험예 7), 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물을 동시에 투여할 경우 현저히 높은 투여량으로 제공되는 화학식 2의 화합물이 암세포의 상기 수용체를 선점해 버리는 효과가 있어 SPECT 조영제에 해당하는 화학식 1의 화합물은 암세포에 대한 선택성이 현저히 떨어지는 결과를 갖게 된다.

그리하여, 본 발명은 다른 측면에 있어서,

상기 본 발명에 따른 이중 조영제 조성물을 이용하여 SPECT 및 MR 이중 영상을 획득하는 방법으로서,

상기 제1제를 대상에게 투여하고 SPECT 영상을 획득하는 단계; 및

그런 다음, 상기 제2제를 대상에게 투여하고 MR 영상을 획득하는 단계를 포함하는, SPECT/MR 이중 영상을 획득하는 방법을 제공한다.

상기 이중영상을 획득하는 방법에 따르면, 상대적으로 현저히 적은 함량으로 투여되는 화학식 1의 화합물이 암세포의 수용체에 결합한 다음에도, 아직 화학식 1의 화합물이 결합하지 않은 사용 가능한(available) 암세포 수용체가 충분한 양으로 남아 있어 추후 투여되는 화학식 2가 암세포에 충분히 결합할 수 있게 된다. 상기 제1제 및 제2제의 투여순서를 반대로 하거나 동시에 투여한다면, 과량으로 투여되는 상기 화학식 2의 화합물이 상기 암세포 수용체를 모두 선점함으로써 암세포 수용체의 블록킹(blocking) 현상이 발생되어 추후 투여되는 상기 화학식 1의 화합물이 암세포 수용체에 결합할 수 없게 될 것이다.

상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 1a, 및 화학식 2a의 화합물을 조영제로서 투여하기 위해서는 합성된 화합물을 정제하고 멸균한 다음 사용할 수 있다. 정제 및 멸균은 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 정제 및 멸균 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어 고성능액체크로마토그래피(HPLC), Sep-Pak 등을 이용하여 정제한 다음, 멸균 필터를 통과시켜 멸균시킬 수 있다. 멸균필터로는 0.22 mm의 포어 사이즈를 갖는 멸균 필터가 이용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 SPECT 조영제 및 SPECT/MRI 이중 조영제인 약제학적 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는 제1제; 및 화학식 2의 화합물을 포함하는 제2제를 포함하고, 상기 제1제 및 제2제는 서로 분리되어 존재하는 SPECT 및 MR 이중 조영제 조성물은 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 함량 및 투여 순서를 조절함으로써 암 조직에 대한 MRI 및 SPECT 영상 모두를 충분히 효과적으로 얻을 수 있으면서 방사선에 대한 과도한 노출을 피할 수 있어 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 이중 조영제 조성물은 동일한 부위에서 MRI 및 SPECT에 모두에 대한 조영효과를 나타낼 수 있으므로, 보다 정확한 질병의 진단이 가능할 뿐만 아니라, 방사선 과다노출의 위험 없이 안전하게 사용할 수 있다는 장점이 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 이중 조영제 조성물은 정확한 해부학적 정보뿐만 아니라 높은 민감도의 정보를 제공하여 각종 질병, 특히 암의 진단 및 질병 치료과정을 모니터링 하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 RGD-DOTA의 HPLC 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 RGD-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 RGD-[DOTA->Gd]의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC(gamma tracer) 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 제조방법의 간략한 반응식이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD의 HPLC (UV 254 nm)이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC (UV 254 nm) 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 제조방법의 간략한 반응식이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd](1a, 적색) 및 I-RGD-[DOTA->Gd](2a, 청색)의 혼합물의 HPLC 이미지이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스 혈청 내어서의 안정성을 시간의 경과에 따라 측정한 HPLC 이미지이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스 혈청 내어서의 안정성을 시간의 경과에 따라 측정한 HPLC 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 농도에 따른 세포 생존율을 MTT 검사법에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]를 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi 주입하여 촬영한 SPECT/CT 영상이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]를 종양을 가진 마우스에게 주입하기 전, 후에 촬영한 MR 영상이다.
도 18은 종양을 가진 마우스에게 시클릭 RGDYK 펩타이드를 주입한 다음 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 주입 전, 후에 촬영한 MR 영상이다.
도 19은 종양을 가진 마우스에게 시클릭 RGDYK 펩티드를 주입하지 않거나 주입한 다음(receptor blocking) 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd] 투여시의 MR 영상의 종양 부위의 신호를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

약어에 대한 정의

EDC : 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide

sulfo-NHS : N-Hydroxysulfosuccinimide

DCM : Dichloromethane

DMF : N,N-dimethylformamide

ACN : Acetonitrile

DIEA : Diisopropylethylamine

DOTA :1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid

GdCl₃ ·6H₂O : Gadolinium(Ⅲ) chloride hexahydrate

DIC : diisopropylcarbodiimide

HOBt : N-hydroxybenzotriazole

HBTu : 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate

HPLC : High-performance liquid chromatograph

실시예 1-1 : RGD - 리간드의 제조

DOTA 96.0 mg(192.0 μmol)를 증류수 4.0 mL에 녹인 후에, 증류수 1 ml에 녹인 EDC 18.4 mg(96.0 mmol)를 첨가하고 교반하였다. 여기에 NaOH 0.1 M을 첨가하면서 상기의 용액의 pH를 5.0으로 맞췄다. 상기의 용액에 Sulfo-NHS 16.8 mg(76.8μmol)를 넣어서 pH를 5.5로 맞추고 4 ℃ 에서 30분 동안 교반 시켰다. 30 분 후, 증류수 2.4 ml에 녹인 c(RGDYK) 12.0 mg(19.2 μmol)를 상기의 용액에 넣었다. 여기에 NaOH 0.1 M을 첨가하면서 상기의 용액의 pH를 8.5 로 맞춘 후 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 제조된 RGD-DOTA는 HPLC로 분리하는데, VYDAC C-18 컬럼(10.0 mm x 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액) 과 0.1% TFA의 수용액 (B 용액)을 0% A에서 35% A 조성으로 32분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 14 분에서 피크를 확인할 수 있다.

상기의 제조에서 DOTA 대신, DTPA, DO3A를 사용할 수도 있다.

도 1은 제조된 RGD-DOTA의 HPLC 이미지이고, 도 2는 제조된 RGD-DOTA의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

실시예 1-2 : RGD -[ 리간드 -> Gd ]의 제조

상기에서 제조한 DOTA-RGD 95mg(94.4 μmol)를 증류수 100 mL에 녹인 후, 증류수 100mL에 녹인 GdCl₃·6H₂O 175.5 mg(472 μmol)를 첨가하여 실온에서 36시간 동안 교반하였다. 여기서는 DOTA-RGD와 GdCl₃·6H₂O의 M 농도 (mol/L) 비율을 1 : 5로 하여 반응시켰으나, 상기의 M농도(mol/L) 비율은 1 : 1 내지 1 : 6으로 변경할 수 있다. 제조된 Gd-DOTA-RGD는 HPLC로 분리하는데, VYDAC C-18 semi-preparative column (10.0 mm x 250 mm)을 이용하여 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액) 과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 65% A 조성으로 32분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 9.2 분에서 피크를 확인할 수 있다. 도 3은 제조된 RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC 이미지이고, 도 4는 제조된 RGD-[DOTA->Gd]의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

실시예 1-3 : ¹²⁵ I- RGD -[ 리간드 -> Gd ] (화학식 1a)의 제조

[125I]NaI 1.0 mCi/0.015 mL을 chloramin T (0.15 mg/0.015 mL PBS, pH 7.0)와 섞은 후 RGD-[DOTA->Gd] (0.05 mg/0.05 mL PBS, pH 7.0)를 넣고 2분 동안 반응 시켰다. 여기에 Na₂S₂O₅ (0.5 mg/0.05 mL)를 넣어주고 2 분 동안 반응시킨 후에 HPLC로 확인한다. 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]는 HPLC (gamma-trace)로 분리하는데, Altlantis dC-18 column (4.6 x 300 mm)을 이용하여 0.1% TFA in ACN (A 용액) 과 0.1% TFA in water (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 3 ml/min 속도로 흘려주면 RT 20 분에서 피크를 확인할 수 있다(도 5).

도 5는 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC 이미지이다.

상기 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 제조방법의 간략한 반응식을 도 6에 나타내었다.

실시예 2-1 : I- RGD 의 제조

Fmoc-Lys(Boc)-O-trityl 레진을 적당한 반응기에 채운 후 DCM 와 DMF로 세척하였다. Fmoc-L-아미노산(4.5 mmol)과 HOBT/DIC (2 M) 용액을 DMF 용매 조건에서 약 4 시간동안 교반하여 결합(coupling)을 진행하였다. 이 과정을 펩타이드 서열대로 반복하였다. 이때 사용한 펩타이드 서열은 Arg(R), Gly(G), Asp(D), Iodo-Tyr(Y), Lys(K)이다. 최종 아미노기의 결합 후, 트리플루오로아세트산 칵테일 용액(cocktail solution)을 이용하여 레진에서의 분리를 진행하였다. 얻어진 용액을 필터한 후 에테르를 첨가하여 선형(linear, crude)를 재결정시키고 건조하였다. 건조시킨 펩티드(1.5 mM), HBTu(4.5 mM), HOBt(4.5 mM), DIEA(7.5 mM), DMF(75 ml), 및 DCM(300 ml)를 반응기에 투입 후 12 시간 이상 교반을 진행한 후, 에테르를 첨가하고 에테르 가용성 분획을 추출하여 HPLC로 정제하였다.

제조된 I-RGD는 HPLC (UV 254 nm)로 분리하는데, Altlantis dC-18 column (4.6 x 300 mm)을 이용하여 0.1% TFA in ACN (A 용액) 과 0.1% TFA in water (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주면 RT 15.5 min에서 피크를 확인할 수 있다(도 7). Maldi-TOF-MS에서 745.5 로 확인되었다(도 8).

도 7은 제조된 I-RGD의 HPLC 이미지이고, 도 8은 제조된 I-RGD의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

실시예 2-2 : I- RGD -[ DOTA -> Gd ](화학식 2a)의 제조

실시예 2-1에서 제조된 I-RGD (1.5 mM)와 DOTA (3.0 mM)를 DMSO 150 mL에 녹인 후 HOBt(1.8 mM), DIC(1.8 mM)를 반응기에 투입 후 48 시간 동안 교반하였다. 생성된 화합물 I-[RGD->DOTA]을 에테르에 침전시켜 추출하였다. 추출된 I-[RGD->DOTA](15 mM) 용액에 GdCl₃·6H₂O(15 mM)를 섞은 후 40℃ 조건에서 48 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 반응액을 동결 건조하였다. 생성된 I-RGD-[DOTA->Gd]를 HPLC(UV 254 nm)로 분리하였으며, Altlantis dC-18 column(4.6 x 300 mm)을 이용하였다. 0.1% TFA의 ACN 용액(A 용액)과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 1 ml/분 속도로 흘려주면 RT 19.8 분에서 피크를 확인할 수 있다(도 9). Maldi-TOF-MS에서 1286.2 로 확인되었다 (도 10).

도 9는 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 HPLC 이미지이고, 도 10은 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 MALDI-TOF-MS 이미지이다.

상기 실시예 2에 따른 제조방법의 반응식을 도 11에 나타내었다.

실험예 1 : HPLC 에 의한 화학식 1a 와 2a의 동등성 확인

실시예 1-3에서 제조된 화학식 1a의 화합물 및 실시예 2-2에서 제조된 화학식 2a의 화합물은 티로신에 결합되어있는 요오드가 방사성동위원소의 형태이면 화학식 1a의 화합물이고, 비방사성 동위원소이면 화학식 2a의 화합물이 된다. 화학식 1a 와 2a는 화학적으로 동등한 구조를 가지며 이는 HPLC에서 동일한 시간에 검출이 되는 것을 확인함으로써 입증될 수 있다. 그리하여, ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd] 및 I-RGD-[DOTA->Gd]의 혼합물에 대해 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액)과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 1 ml/분 속도로 흘려주면서 HPLC 이미지를 획득하였다. 그 결과를 도 12 에 나타내었다.

도 12는 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd](1a, 적색) 및 I-RGD-[DOTA->Gd](2a, 청색)의 혼합물의 HPLC 이미지이다.

실험예 2: I- RGD -[ DOTA -> Gd ]의 in - vitro 혈청 안정성( serum stability ) 측정

실시예 2-2에서 제조된 화학식 2a의 화합물 I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스의 혈청 내 안정성을 측정하였다. I-RGD-[DOTA->Gd](10 mM, 0.05 mL)을 마우스 혈청(0.95 mL)에 섞고 37℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대(0 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 24 시간, 4 일, 7 일)에 소량을 덜어내어 에탄올을 가하여 침전시켰다. 원심분리(13200 rpm, 10 분)로 분리한 후 상층액을 덜어내어 필터한 후 HPLC를 실시하였다. I-RGD-[DOTA->Gd]가 혈청 내에서 분해되었다면, 기준시간(0 분, RT 13 min) 대비 측정시간대에서의 RT 및 면적이 달라질 것이다. HPLC 조건은 Altlantis dC-18 column (3 x 150 mm)을 이용하여 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액) 과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 0.43 ml/min 속도로 흘려주었다. 시간대별 마우스 혈청 내 I-RGD-[DOTA->Gd]의 안정성 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13은 I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스 혈청 내에서의 안정성을 시간의 경과에 따라 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이러한 결과로부터 I-RGD-[DOTA->Gd]는 마우스 혈청 내에서 7일 동안 안정함을 알 수 있다.

실험예 3: ¹²⁵ I- RGD -[ DOTA -> Gd ]의 in - vitro 혈청 안정성( serum stability ) 측정

실시예 1-3에서 제조된 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스 혈청내 안정성을 측정하였다. ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd](0.1 mCi, 0.01 mL)을 마우스 혈청(0.5 mL)에 섞고 37℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대(0 분, 분, 1 시간, 4 시간, 16 시간, 3 일)에 소량을 덜어내어 HPLC를 실시하였다. I-RGD-[DOTA->Gd]가 혈청 내에서 분해되었다면, 기준시간(0 분, RT 20 min) 대비 측정시간대에서의 RT 및 면적이 달라질 것이다. HPLC 조건은 Altlantis dC-18 column (4.6 x 300 mm)을 이용하여 0.1% TFA의 ACN 용액 (A 용액) 과 0.1% TFA 수용액 (B 용액)을 5% A에서 40% A 조성으로 30분 동안 1 ml/min 속도로 흘려주었다. 시간대별 마우스 혈청 내 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 안정성 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14는 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]의 마우스 혈청 내어서의 안정성을 시간의 경과에 따라 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이러한 결과로부터 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]는 마우스 혈청 내에서 3일 동안 안정함을 알 수 있다.

실험예 4 : I- RGD -[ DOTA -> Gd ]의 자기이완율( Relaxivity ) 측정

실시예 2-2에서 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 자기이완율을 측정하였다. 이완시간은 3T(128 MHz) MRI 장비에서 측정하였다. T1 이완시간을 측정하기 위하여 반전 회복(inversion-recovery) 펄스열을 사용하였으며, T2 이완시간은 CPMG(Carr-Purcell-Meiboon-Gill) 펄스열을 사용하였다. 이완율(R1, R2)은 mM 당 이완시간의 역으로서 계산되었다. 대조군으로서 Dotarem^® 을 사용하였다.

그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

표 1에 따르면, I-RGD-[DOTA->Gd]는 Dotarem^® 에 비해 약 2배 정도의 큰 자기이완율을 가지므로, 좀 더 효과적으로 신호를 나타낼 수 있는 MRI 조영제라고 할 수 있다.

Complex	R1 (mM-1 s-1)	R2 (mM-1 s-1)
Dotarem®	3.4 ± 0.1	3.9 ± 0.1
1a	6.2 ± 0.1	6.4 ± 0.1

실험예 5 : I- RGD -[ DOTA -> Gd ]의 세포독성 측정

세포독성을 확인하기 위하여 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 검색법을 사용하였다. MTT 검색법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 청자색의 비수용성 MTT formazan(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 것이다. 살아있는 세포2400918에 MTT tetrazolium를 처리하게 되면, 미토콘드리아의 리덕타아제(reductase)에 의해 MTT tetrazolium이 환원되어 MTT formazan을 형성하게 된다. 즉, 어떤 화합물을 농도별로 일정 시간 동안 처리해서 세포의 사멸을 충분히 유도한 뒤에 MTT tetrazolium를 처리하면, 세포독성이 나타나지 않는 낮은 농도에서는 MTT formazan이 형성되고, 세포독성이 나타나는 높은 농도에서는 MTT formazan이 형성되지 않는 것이다. 이러한 화합물을 농도구배 별로 MTT formazan의 형성을 측정하면 세포 생존도를 결정할 수 있다. 세포에 아무것도 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, 대조군의 MTT formazan의 형성을 측정하여 세포 생존도 100%로 정하였다. 양의 대조군으로서 Dotarem^? 을 사용하였다. 그 결과 측정된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 농도에 따른 세포 생존율 측정 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15는 MTT 검사법에 따라 I-RGD-[DOTA->Gd]의 농도에 따른 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

세포에 다양한 농도의 I-RGD-[DOTA->Gd](0.0005 - 500μM)를 첨가한 경우, 80% 이상의 세포 생존도를 보여주었고, Dotarem^® 과 비슷한 정도의 세포 생존도를 나타냈다. 이러한 결과로부터 I-RGD-[DOTA->Gd]는 세포독성이 매우 낮아서 조영제로서 사용하기에 유용한 것임을 알 수 있다.

실험예 6 : ¹²⁵ I- RGD -[ DOTA -> Gd ] SPECT 영상 획득

SPECT 영상은, 다중 PET/SPECT/CT 시스템 (INVEON, Simens Medical Solutions)에서 촬영하였다. 종양을 가진 마우스(ICR, 35 g)의 꼬리 정맥을 통해 0.2 mCi의 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 SPECT/CT 영상을 획득하였으며, 그 결과를 도 16에 나타냈다.

도 16는 종양을 가진 마우스에게 0.2 mCi의 ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 SPECT/CT 영상을 촬영한 것이다.

도 16에 따르면, ¹²⁵I-RGD-[DOTA->Gd]를 투여한 후에 종양 부위에서 증가된 신호(색이 밝아짐)를 관찰할 수 있다.

실험예 7 : I- RGD -[ DOTA -> Gd ]를 이용한 MR 영상 획득

실시예 2-2에서 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 in vivo 조영효과를 확인하기 위해, 종양을 가진 마우스(ICR, 35 g)에서 T1 강조영상을 얻었다.

MR 영상은, 3T 자기공명 영상장비(Magnetom Trio Tim, Siemens, Erlangen, Germany)에서 T1 강조 영상법으로 촬영하였다. 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 0.1 mmol/kg의 I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 주입 전, 후의 영상을 촬영하였으며, 그의 결과를 도 17에 나타냈다.

도 17은 종양을 가진 마우스에게 I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 주입 전, 후의 MR 영상을 촬영한 것이다.

도 17에서 알 수 있는 바와 같이, I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하기 전보다 주입 후에 종양 부위에서 증가된 신호(색이 밝아짐)가 관찰되었다.

실험예 8 : I- RGD -[ DOTA -> Gd ]의 종양 선택성 확인

종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 실시예 2-2에서 제조된 I-RGD-[DOTA->Gd]의 선택적 특이성을 확인하는 실험을 하였다. 먼저 수용체 차단을 위해 마취된 마우스의 꼬리 정맥을 통해 시클릭 RGDYK 펩타이드(10 mg)를 주입하였다. 30분 후에 상기 I-RGD-[DOTA->Gd](0.1 mmol/kg)를 주입하여 실험예 7과 동일한 방법으로 MR 영상을 획득하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18은 종양을 가진 마우스에게 시클릭 RGDYK 펩타이드를 주입한 다음 I-RGD-[DOTA->Gd]를 주입하여 주입 전, 후의 MR 영상을 촬영한 것이다.

도 18에 따르면, 수용체를 차단한 후에는 종양(점선표시부)에서 증가된 신호를 관찰할 수 없었다. 이러한 결과로부터 I-RGD-[DOTA->Gd]가 종양 세포에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 특이성이 있음을 알 수 있다.

또한, 상기 실험예 7과 8에서 얻은 MR 영상에서 종양 부위의 신호가 시간의 경과에 따라 변화하는 양상을 비교한 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19은 종양을 가진 마우스에게 시클릭 RGDYK 펩티드를 주입하지 않거나 주입한 다음(receptor blocking) I-RGD-[DOTA->Gd] 투여시의 MR 영상의 종양 부위의 신호를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

도 19의 결과에 따르면, 리셉터가 차단되지 않은 종양 부위의 신호에 비해서 리셉터가 차단(blocking)된 종양부위의 신호가 더 낮음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 제1제; 및
   하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 제2제를 포함하고,
   상기 제1제 및 제2제는 서로 분리되어 존재하는 SPECT 및 MRI 이중 조영제 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 또는 사이클렌(Cyclen) 이고,
   상기 Gd는 가돌리늄이며, 상기 리간드에 배위결합되고,
   상기 RGD는 Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys를 포함하는 아미노산 서열이 환을 형성하는 시클릭 펩티드고, 라이신을 경유해 상기 리간드와 아미드 결합되어 있고,
   상기 X는 I-123, I-124, I-125, 및 I-131에서 선택된 방사성 요오드이고, 상기 RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있다;
   [화학식 2]
   

   

   
   상기 리간드, Gd, RGD는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 같고,
   상기 I는 비방사성 요오드이고, RGD의 티로신의 메타 위치에 공유결합되어 있으며,
   단, 상기 화학식 1 및 2는 요오드를 제외하고 서로 동일한 구조를 갖는다.
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1은 하기 화학식 1a의 구조를 갖고, 상기 화학식 2는 하기 화학식 2a의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물:
   [화학식 1a]
   

   

   
   
   상기 화학식 1에서,
   X는 I-123, I-124, I-125, 또는 I-131 이다.
   [화학식 2a]
   

   

   
   
   상기 화학식 2a에서, I는 비방사성 요오드 이다.
3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1 화합물의 상기 화학식 2 화합물에 대한 몰비는 1:10⁶ ~ 1:10⁹ 인 것을 특징으로 하는 이중 조영제 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 화학식 1a 화합물의 상기 화학식 2a 화합물에 대한 몰비는 1:10⁶ ~ 1:10⁹ 인 것을 특징으로 하는 이중 조영제 조성물.
5. 삭제

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