WO2011065475A1 - ドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法および該方法によって得られた医薬組成物 - Google Patents

ドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法および該方法によって得られた医薬組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a drug effective for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctive disorder having a dry eye severity of 3 or more, as reported in International Dry Eye Research Workshop (DEWS) 2007 report, and the drug.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • the present invention provides a method for treating dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or more as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group using the above-mentioned drug.
  • the 2007 report of the International Dry Eye Study Group is a comprehensive summary of current dry eye findings by 70 dry eye specialists from around the world. Definitions, classification, pathogenesis, diagnosis and observation from each subcommittee Detailed reports have been made on each item such as management and treatment. This report is published in The Ocular Surface (APRIL 2007, VOL 5, NO.2 pp. 65-204) (Non-patent document 1, this document is incorporated herein by reference) and is available on the website (www. tearfilm.org).
  • dry eye is a multifactorial disease, so the treatment method varies depending on the condition and symptoms.
  • dry eye severity was classified into four levels (see “Management and Treatment of Dry Eye Disease” (pages 163-178) and Table 2 (page 173)). Corresponding recommended treatments are presented (see “Management and Treatment of Dry Eye Disease” and Table IV 4 (page 174)).
  • the object of the present invention is to provide a screening method for a drug effective for treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorder having a dry eye severity of 3 or more as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group.
  • the present invention also aims to provide a pharmaceutical composition for the treatment of such dry eye and / or keratoconjunctival disorders.
  • the present application is as follows.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or more in a 2007 report of the International Dry Eye Study Group comprising a drug obtained by the screening method described in (1) .
  • the drug is human-derived albumin.
  • the pharmaceutical composition according to (4), wherein the human-derived albumin is human serum albumin.
  • An effective amount of the drug obtained by the screening method described in (1) is administered to a patient with dry eye and / or keratoconjunctive disorder having a dry eye severity of 3 or more as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group A method for treating dry eye and / or keratoconjunctival disorder.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or more obtained by the screening method described in (1) Use for manufacturing.
  • the present invention it has become possible to provide a screening method for a drug effective in treating dry eye and / or keratoconjunctival disorder having a dry eye severity of 3 or more as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group.
  • the drug whose corneal tissue recovery effect has been confirmed by the screening method of the present invention is useful for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctive disorder having a dry eye severity of 3 or more in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group.
  • dry eye severity is classified as follows ("Management and treatment of dry eye disease”). (Pp. 163-178), Table 2 (p. 173).
  • dry eye and / or keratoconjunctive disorder with a dry eye severity of 3 or higher in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group means a dry eye severity of 3 or higher as defined in the above classification.
  • keratoconjunctival disorder showing dry eye and / or any of the same signs or symptoms.
  • the term “about”, when used with a numerical value means +/ ⁇ 30% and +/ ⁇ 20%, preferably +/ ⁇ 10%.
  • the keratoconjunctival disorder model rabbit used in the screening method of the present invention is prepared by instilling a rabbit with an n-heptanol solution.
  • anesthesia is given to rabbits by intramuscular injection, local ocular anesthesia is given by eye drops, and then n-heptanol solution is applied to each cornea and bulbar conjunctiva for each eye, forcing blinking.
  • n-heptanol solution is applied to each cornea and bulbar conjunctiva for each eye, forcing blinking.
  • it can be manufactured.
  • n-heptanol solution to be instilled is n-heptanol alone or a mixed solution of n-heptanol and ethanol.
  • a mixed solution of n-heptanol and ethanol is preferred for the purpose of improving hydrophilicity, facilitating conformity to the eye surface, and facilitating damage.
  • the ratio of n-heptanol to ethanol is about 9: 1 to about 7: 3, preferably about 8: 2.
  • the ophthalmic amount of the n-heptanol solution is a total amount (about 0.01 to about 0.1 mL, preferably about 0.03 to about 0.05 mL), and several times (2 to 4) so as to easily reach the cornea and the conjunctiva. It is preferable to apply the eye drops separately.
  • a stable keratoconjunctival disorder model can be created.
  • the number of administrations of the test drug by eye drop is not particularly limited, and is usually about 1 to 6 times a day, but in order to evaluate the titer of the test drug on the corneal tissue recovery effect, 1 day
  • the number of instillations should be small, usually about twice a day.
  • the administration period of the test drug may vary depending on the timing of the test, the type of rabbit used, etc., but can usually be evaluated in 10 days from the start of instillation.
  • the general procedure for evaluating the corneal tissue recovery effect of the test drug is as follows. That is, before and after the instillation of the n-heptanol solution, before the first test drug instillation every day, after the second instillation on the fourth, fifth and sixth day of the test drug administration and on the day after the last instillation, Observe the condition of the keratoconjunctiva.
  • the dye used include fluorescein, rose bengal, and lissamine green, with fluorescein being preferred.
  • the stained state of the cornea is observed and photographed, and the degree of disorder of the cornea is scored. A high staining score indicates a high degree of corneal damage, and a low staining score indicates a low degree of corneal damage.
  • a conventionally known method can be used for scoring.
  • the cornea is divided into five sections (center, upper, ear side, nose side, and lower), and the score of each section is scored with a maximum of 3 points, and the total score (15 points) is evaluated.
  • the degree of staining is 0 points for no staining, 1 point for partial staining, 2 points for staining up to about 2/3, and 3 points when the entire surface is stained.
  • the corneal tissue recovery effect of the test drug is determined by performing a significant difference test between the test drug instillation and the saline instillation on the staining score of the degree of corneal injury at each observation time of the keratoconjunctiva. The case of less than% is determined to be significant.
  • a method used for the significant difference test a desired method may be selected as appropriate. For example, Paired Student ’s t-test is exemplified.
  • the method for evaluating the corneal tissue recovery effect using the corneal and conjunctival disorder model rabbit of the present invention is a treatment for dry eye and / or keratoconjunctive disorder having a dry eye severity of 3 or more in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group. It is understood that it is effective as a screening method for effective drugs.
  • human-derived albumin is significantly increased in the keratoconjunctive disorder model rabbit of the present invention by the screening method of the present invention, similar to the drug (serum) recommended for dry eye severity 3 in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group. It has been shown to exhibit a corneal tissue recovery effect. Therefore, it is understood that human-derived albumin is effective for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctive disorder having a dry eye severity of 3 or more in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group.
  • human-derived albumin used in the present invention for example, human serum albumin is suitable. Any human serum albumin can be used without particular problem in the present invention as long as it has been purified to the purity usually used for medical purposes. Specifically, it is preferable that 80% or more of the albumin is analyzed by electrophoresis. Moreover, the thing heat-processed for the inactivation of a virus etc. is preferable.
  • Human serum albumin marketed as a pharmaceutical is particularly preferably used. Human serum albumin produced by a microorganism by a gene recombination technique is also preferably used in the present invention. Production methods according to genetic recombination techniques are well known to those skilled in the art.
  • a vector containing a gene encoding human serum albumin is prepared, and this vector is introduced into a host cell and transformed. Then, a transformed cell producing the target protein is selected, the selected transformed cell is cultured, and human serum albumin is isolated and purified from the culture supernatant or cell.
  • host cells include yeast, E. coli, and the like that are commonly used by those skilled in the art for protein production.
  • the yeast is preferably Kluyveromyces yeast, Saccharomyces yeast or Pichia yeast, specifically, Kluyveromyces laactis , Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris ( Pichia pastoris ).
  • Kluyveromyces lactis CBS 2360 strain, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS 115 strain (his 4) and the like are preferably used.
  • treatment includes all management of symptoms such as symptom prevention, treatment, symptom reduction, symptom reduction, progression stoppage and the like.
  • the preparation form of the pharmaceutical composition of the present invention may be a preparation for topical ocular administration, and an ophthalmic preparation is particularly preferable.
  • the composition of the present invention contains about 1 mg / ml to 1000 mg / ml (0.1 to 100 wt / ml) of human-derived albumin. v%), more preferably about 10 mg / ml to 1000 mg / ml (1 to 100 wt / v%), more preferably 10 mg / ml to 250 mg / ml (1 to 25 wt / v%), and if desired Contains an acceptable diluent.
  • the “pharmaceutically acceptable diluent” used in the present invention includes all diluents used in ophthalmic preparations and known to those skilled in the art, and includes water, physiological saline, artificial tears and the like. Illustrated.
  • the composition of the present invention further contains various components that can be used in normal ophthalmic preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants, and the like. But you can. In the case of eye drops, the pH of the preparation is preferably adjusted to 5-8.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be instilled at about 1 to about 100 ⁇ l / eye, preferably about 10 to about 50 ⁇ l / eye, more preferably about 30 to 50 ⁇ l / eye per administration.
  • the present invention relates to a human-derived albumin for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or more as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group. Also provided for use.
  • the present invention provides an effective amount of human-derived albumin for a subject in need of treatment for dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or higher as reported in the 2007 International Dry Eye Study Group.
  • a method for treating dry eye and / or keratoconjunctival disorder with a dry eye severity of 3 or more in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group, including administration is provided.
  • the “effective amount” of human-derived albumin is the amount necessary for the desired treatment, and includes the patient's symptoms, age, sex, weight, diet, other pharmaceuticals used in combination, and The optimum amount should be selected according to various factors recognized by those skilled in the medical field. This effective amount also varies depending on the type and activity of human-derived albumin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is about 1 to about 100 ⁇ l per eye, preferably about 10 to 50 ⁇ l / eye, more preferably about 30 to 50 ⁇ l / eye per administration. The amount is about 1 to about 20 times per day, particularly 1 to 10 times per day, but is not limited thereto.
  • composition used in the present invention can also be co-administered with other pharmaceutically active compounds as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • “Simultaneous administration” means that other pharmaceutically active compounds are administered before, simultaneously (eg, in the same formulation or in another formulation) or after administration of the pharmaceutical composition of the present invention. means.
  • artificial tears sulfated polysaccharides (hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc.), cyclosporine, glutathione, flavin adenine nucleotide sodium, corticosteroid, tetracycline, vitamin A (retinol) and derivatives thereof (retinol palmitate, retinol acetate, etc.) Vitamin A esters, etc.), cell growth factors (hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF), nerve growth factor (NGF) Platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factors (TGF- ⁇ and TGF- ⁇ ), keratinocyte growth factor (KGF), etc.) can be co-administered.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • Test example 1 Production method of keratoconjunctival disorder model
  • Rabbits (std: NZW) were anesthetized by intramuscular injection of ketamine (10 mg / kg) and xylazine (4 mg / kg), followed by local ocular anesthesia by instillation with 0.4% oxybuprocaine (2 drops / eye).
  • Put rabbit in recumbent position, and apply one eye at a time to 0.06 ml of n-heptanol solution (n-heptanol: ethanol 8: 2) prepared at the time of use (0.01 ml four times) over the cornea and bulbar conjunctiva.
  • the keratoconjunctival disorder model was prepared by forcibly blinking 3 times and closing the eye for 2 minutes in the third forced blink.
  • the degree of staining was 0 points for no staining, 1 point for partial staining, 2 points for staining up to about 2/3, and 3 points for staining on the entire surface.
  • 1% fluorescein was prepared by dissolving fluorescein sodium salt in physiological saline.
  • Table 3 shows the fluorescein staining score of the cornea after n-heptanol treatment.
  • the corneal fluorescein staining score before treatment with n-heptanol was 0 for all individuals.
  • Table 3 shows that in serum instillation, a significant corneal epithelial recovery effect was observed with respect to instillation on the fourth day after treatment of the disorder (p ⁇ 0.05).
  • instillation of 0.3% sodium hyaluronate showed no corneal epithelial recovery effect.
  • Test example 2 A method for preparing a corneal conjunctival disorder model, administration of a test drug, and evaluation of corneal disorder were performed in the same manner as in Test Example 1.
  • a test drug a 0.05% cyclosporine preparation or a cationic emulsion was used.
  • a 0.05% cyclosporine preparation Restasis (registered trademark) (Allergan, Inc. (USA)) was used.
  • As the cationic emulsion Cationorm (registered trademark) (Novagali Pharma SA (France) was used.
  • Table 5 shows the fluorescein staining score of the cornea after n-heptanol treatment.
  • the corneal fluorescein staining score before treatment with n-heptanol was 0 for all individuals.
  • no corneal epithelial recovery effect was observed in any of the instillations of 0.05% cyclosporine and cation emulsion.
  • the corneal and conjunctival disorder model rabbit of the present invention is an animal model that develops eye surface disorders such as dry eye, especially keratoconjunctiva, according to the classification of 2007 report of the International Dry Eye Study Group, especially the classification of dry eye severity 3 or more. It is understood that it is useful.
  • Test example 3 A method for preparing a corneal conjunctival disorder model, administration of a test drug, and evaluation of corneal disorder were performed in the same manner as in Test Example 1.
  • 10% nHSA was used as the test drug.
  • donated albumin-Wf (25% human serum albumin preparation, Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) was diluted with a sodium chloride solution so as to be almost isotonic with physiological saline.
  • Table 7 shows the fluorescein staining score of the cornea after n-heptanol treatment.
  • the corneal fluorescein staining score before treatment with n-heptanol was 0 for all individuals.
  • corneal fluorescein staining scores at 4, 4.5, 5, 5.5, 6 and 10 days after injury treatment with 10% nHSA instillation were significantly higher than with saline instillation.
  • a low value was exhibited, and a corneal epithelial recovery effect was observed (4, 5, 5.5, 6, 10th day: p ⁇ 0.05, 4.5th day: p ⁇ 0.01).
  • human serum albumin has the same or better corneal tissue recovery effect than the serum recommended for dry eye severity 3 (Test Example 1) in the 2007 report of the International Dry Eye Study Group.

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Abstract

本発明は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法、および該薬剤を含む医薬組成物を提供する。さらに本発明は、前記薬剤を用いて国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/また角結膜障害を処置する方法を提供する。

Description

ドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法および該方法によって得られた医薬組成物
　本発明は、国際ドライアイ研究会（International Dry Eye WorkShop（ＤＥＷＳ））2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法、および該薬剤を含む医薬組成物を提供する。さらに本発明は、前記薬剤を用いて国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/また角結膜障害を処置する方法を提供する。
　国際ドライアイ研究会2007年報告は、世界中のドライアイ専門家70名によって現在のドライアイに関する知見を統括的にまとめたもので、各分科会から定義・分類、発症機序、診断・観察、管理・治療などの各項目について詳細な報告がなされている。この報告は、The Ocular Surface(APRIL 2007, VOL 5, NO.2 pp. 65-204)（非特許文献１、本文献は引用によって本明細書に含まれる）に掲載され、ウェブサイト（www.tearfilm.org）で閲覧可能である。
　国際ドライアイ研究会2007年報告は、ドライアイについて次のように定義している（「ドライアイ疾患の定義および分類」(75-92頁)の項参照）。
「ドライアイは、涙液と眼表面の多因子的な疾患であり、その結果として眼表面の潜在的な障害とともに、不快感、視覚障害、涙液層の不安定性などの症状を生じる。それは涙液層の浸透圧の上昇と眼表面の炎症を伴う。」
　上記定義のとおり、ドライアイは多因子的な疾患であるため、その状態や症状により対処法も異なってくる。国際ドライアイ研究会2007年報告では、ドライアイ重症度を4段階に分類し（「ドライアイ疾患の管理と治療」(163-178頁)およびTable 2(173頁)参照）、各重症度に対応した推奨される治療法を提示している（「ドライアイ疾患の管理と治療」の項およびTable 4(174頁)参照）。
　国際ドライアイ研究会2007年報告において、ドライアイ重症度１および２に推奨される薬剤はいくつか存在するが、ドライアイ重症度３以上のドライアイ、特に角結膜などの眼表面障害に推奨される薬剤は血清のみである。しかも、血清とは、患者自身の血液から得られたもの（いわゆる自己血清）であり、これを適宜希釈して点眼投与しなければならない。
　現状では、国際ドライアイ研究会2007年報告で分類されたドライアイ重症度３以上に対する有効な薬剤は実質的に存在しない。従って、国際ドライアイ研究会2007年報告の分類、特にドライアイ重症度３以上の分類に則したドライアイ、特に角結膜などの眼表面障害を発現する動物モデルを確立すること、この動物モデルを薬剤のスクリーニングに用いることによって、国際ドライアイ研究会2007年報告で分類されたドライアイ重症度３以上のドライアイ、特に角結膜などの眼表面障害に対する有効な医薬組成物を提供することが望まれている。
The Ocular Surface(APRIL 2007, VOL 5, NO.2 pp. 65-204)
　本発明は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明はまた、かかるドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本出願は以下の通りである。
（１）ウサギにn-ヘプタノール溶液を点眼して角結膜上皮が剥離した角結膜障害モデルウサギを作製すること、および該モデルウサギの眼に被験薬剤を点眼投与して該被験薬剤の角膜組織回復効果を評価することを特徴とする、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法。
（２）（１）記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤を含む、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物。
（３）該薬剤がヒト由来アルブミンである、（２）記載の医薬組成物。
（４）ヒト由来アルブミンを有効成分とする、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物。
（５）ヒト由来アルブミンがヒト血清アルブミンである、（４）記載の医薬組成物。
（６）（１）記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤の有効量を、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害を有する患者へ投与することを含む、ドライアイおよび／または角結膜障害処置方法。
（７）ヒト由来アルブミンの有効量を、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害を有する患者へ投与することを含む、ドライアイおよび／または角結膜障害処置方法。
（８）（１）記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤の、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物の製造のための使用。
（９）ヒト由来アルブミンのドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物の製造のための使用。
　本発明により、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法を提供することが可能となった。本発明のスクリーニング方法で角膜組織回復効果が確認された薬剤は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置に有用である。さらに本発明により、前記薬剤を用いて国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害を処置する方法を提供することが可能となる。
　　国際ドライアイ研究会2007年報告（The Ocular Surface(APRIL 2007, VOL 5, NO.2) pp65-204）において、ドライアイ重症度は以下のとおり分類される（「ドライアイ疾患の管理と治療」(163-178頁)、Table 2（表２）(173頁）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書並びに請求の範囲における「国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害」とは、上記分類に定義されるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/またはこれと同じ徴候または症状のいずれかを示す角結膜障害を意味する。
　本明細書並びに請求の範囲における「約」という語は数値とともに用いる場合、＋／－３０％および＋／－２０％、好ましくは＋／－１０％の意味である。
　本発明のスクリーニング方法に用いる角結膜障害モデルウサギは、ウサギにn-ヘプタノール溶液を点眼することで作製される。一般的には、ウサギに筋肉内注射による麻酔を施した後、点眼により眼局所麻酔を施し、次いで片眼ずつにn-ヘプタノール溶液を角膜、球結膜に行き渡るように点眼し、強制瞬目させることにより、作製することができる。
　使用するウサギの種類は特に限定されないが、ニュージーランドホワイト種、日本白色種、ダッチ種などを使用することができ、特にニュージーランドホワイト種が好ましい。筋肉内注射による麻酔としては、ケタミン、キシラジン、メデトミジンなどが使用できるが、ケタミンとキシラジンの併用が好ましい。眼局所麻酔としては、オキシブプロカイン、リドカイン、ブピバカインなどが使用できるが、オキシブプロカインが好ましい。
　点眼するn-ヘプタノール溶液とはｎ－ヘプタノール単独あるいはｎ－ヘプタノールとエタノールとの混合溶液である。親水性を向上させ眼表面になじみやすくし、障害を与えやすくする理由から、ｎ－ヘプタノールとエタノールの混合溶液が好ましい。n-ヘプタノールとエタノールの比率は約９：１から約７：３、好ましくは約８：２である。n-ヘプタノール溶液の点眼量は、総量（約０．０１～約０．１ｍL、好ましくは約０．０３～約０．０５ｍL）で、角膜、球結膜に行き渡りやすいように数回（２～4回）に分けて点眼するのが好ましい。
　n-ヘプタノール溶液点眼後、強制瞬目（１～５回、好ましくは２～４回）させ、次いで数分程度（約０．５～約５分、好ましくは約１～約３分）閉眼させると、角結膜上皮が剥離する。本発明によって安定した角結膜障害モデルを作製することができる。
　本発明の角結膜障害モデルウサギを用いて被験薬剤の角膜組織回復効果を評価することで、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤をスクリーニングすることが可能となる。
　本発明のスクリーニング方法において、被験薬剤の点眼投与回数は特に限定的ではなく、通常１日１～６回程度であるが、角膜組織回復効果に対する被験薬剤の力価を評価するためには１日点眼回数は少ない方がよく、通常１日２回程度が好ましい。被験薬剤の投与期間は、試験の実施時期、使用するウサギの種類などにより異なる場合もあるが、通常は点眼開始から１０日間で評価可能である。
　被験薬剤の角膜組織回復効果を評価する一般的手順は以下の通りである。すなわち、n-ヘプタノール溶液の点眼前後、毎日１回目の被験薬剤点眼投与前、被験薬剤投与４、５および６日目の２回目の点眼投与後および最終点眼投与日の翌日に、それぞれ色素染色により角結膜の状態を観察する。用いる染色色素としては、フルオレセイン、ローズベンガル、リサミングリーンがあげられるが、フルオレセインが好ましい。角膜の染色状態の観察および写真撮影を行い、角膜部分の障害度合をスコア化する。高い染色スコアは角膜障害の度合が大きいことを示し、低い染色スコアは角膜障害の度合が小さいことを示す。
　スコア化については従来から知られている手法を用いることができる。例えば、角膜を５区画（中央、上、耳側、鼻側、下）に分け、各区画の染色度３点満点でスコア化し、その合計点（１５点満点）で評価する。染色度は、無染色が０点、一部染色が１点、３分の２程度までの染色が２点、全面に染色している場合は３点とする。
　本発明において、被験薬剤の角膜組織回復効果は、角結膜の観察時点毎に角膜障害度合の染色スコアについて被験薬剤点眼眼と生理食塩水点眼眼との間で有意差検定を行い、危険率５％未満の場合を有意と判定する。有意差検定に用いる手法は、適宜所望の手法を選択すればよく、例えば、Paired Student’s t-testなどが例示される。
　国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度１、２および３に推奨される薬剤について、本発明の角結膜障害モデルウサギを用いて角膜組織回復効果を確認すると、ドライアイ重症度１で推奨されている粘性成分を含む薬剤（ヒアレイン（登録商標）ミニ点眼液0.3％：参天製薬（日本）：日本承認）や電解質を含む薬剤（Cationorm（登録商標）：Novagali Pharma（フランス）：EU承認）およびドライアイ重症度２で推奨されている抗炎症成分を含む薬剤（Restasis（登録商標）：Allergan（米国）：米国承認）では有意な角膜組織回復効果は認められず、ドライアイ重症度３で推奨される血清（ヒトプール血清：コージンバイオ（日本））では有意な角膜組織回復効果が認められた。したがって、本発明の角結膜障害モデルウサギを用いて角膜組織回復効果を評価する方法は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法として有効であることが理解される。
　さらに、本発明のスクリーニング方法により、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３に推奨される薬剤（血清）と同様に、ヒト由来アルブミンが本発明の角結膜障害モデルウサギにおいて有意に角膜組織回復効果を発現することが示された。よって、ヒト由来アルブミンが、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効であることが理解される。
　本発明に用いられるヒト由来アルブミンとしては、例えばヒト血清アルブミンが好適である。ヒト血清アルブミンとしては、医療用に通常使用される純度にまで精製されたものであれば、本発明においては特に問題なく使用できる。具体的には電気泳動法で分析した場合にその80％以上がアルブミンであるものが好ましい。また、ウイルス等の不活性化のため、加熱処理したものが好ましい。医薬品として市販されているヒト血清アルブミンが特に好適に用いられる。 遺伝子組換え技術によって微生物により産生されるヒト血清アルブミンもまた、本発明に好適に用いられる。遺伝子組換え技術に従う製造法は、当業者によく知られている。簡単に説明すると、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を含むベクターを作製し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換させる。そして、目的とするタンパク質を産生する形質転換細胞を選出し、選出した形質転換細胞を培養して、その培養上清あるいは細胞からヒト血清アルブミンを単離、精製する。宿主細胞としては、タンパク質の産生のために当業者に通常用いられる酵母、大腸菌等が例示される。酵母としては、クルイベロミセス属酵母、サッカロマイセス属酵母もしくはピキア属酵母が好ましく、具体的には、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces laactis)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)もしくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）が使用され、特にクルイベロミセス・ラクチスＣＢＳ２３６０株、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（a,his 4,leu 2,can 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4）等が好適に用いられる。
　本発明において、「処置」なる用語には、症状の予防、治療、症状の軽減、症状の減退、進行停止等、症状のあらゆる管理が含まれる。
　本発明の医薬組成物の製剤形態は、眼局所投与のための製剤であればよく、特に点眼用剤が好ましい。
　本発明の医薬組成物を点眼用剤として製剤する場合、有効成分がヒト由来アルブミンであれば、本発明の組成物はヒト由来アルブミンを約１ｍｇ／ｍｌ～１０００ｍｇ／ｍｌ（０．１～１００ｗｔ／ｖ％）、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ～１０００ｍｇ／ｍｌ（１～１００ｗｔ／ｖ％）、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍｌ（１～２５ｗｔ／ｖ％）含有し、さらに所望により薬学上許容される希釈剤を含有する。
　本発明において用いられる「薬学上許容される希釈剤」には、眼科用製剤に用いられ、当業者に知られているあらゆる希釈剤が含まれ、水、生理的食塩水、人口涙液等が例示される。本発明の組成物はさらに、通常の眼科用製剤に使用し得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調節剤、界面活性剤等を含んでもよい。点眼用製剤の場合、製剤のpHは５～８に調整するのが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、１回の投与につき約１～約１００μｌ/眼、好ましくは約１０～約５０μｌ/眼、より好ましくは約３０～５０μｌ/眼を点眼すればよい。
　別の観点において、本発明は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物の製造のためのヒト由来アルブミンの使用についても提供する。
　さらに別の観点において本発明は、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置を必要とする対象に対して有効量のヒト由来アルブミンを投与することを含む、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置方法を提供する。
　本発明のこれらの方法において、ヒト由来アルブミンの「有効量」としては、所望の処置のために必要な量であって、患者の症状、年齢、性別、体重、食餌、併用する他の医薬およびその他医学分野の当業者に認識されている様々な要因に応じた最適量を選択すべきである。また、この有効量は、ヒト由来アルブミンの種類や活性によっても異なる。本発明のこれらの方法において、具体的には上記本発明の医薬組成物を１回の投与につき約１～約１００μｌ眼、好ましくは約１０～５０μl/眼、より好ましくは約３０～５０μl/眼の量、１日につき約１～約２０回、特に１日に１～１０回投与することが例示されるが、これに限定されるものではない。
　本発明で用いられる医薬組成物はまた、本発明の効果を阻害しない限り、他の薬学的に活性な化合物と同時投与することができる。「同時投与」は、他の薬学的に活性な化合物を、本発明の医薬組成物の投与前に、同時に（例えば、同一の製剤中または別の製剤中で）、または投与後に投与することを意味する。例えば、人工涙液、硫酸多糖類（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）、シクロスポリン、グルタチオン、フラビンアデニンヌクレオチドナトリウム、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ビタミンＡ（レチノール）およびその誘導体（パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールなどのビタミンＡのエステル類等）、細胞成長因子（肝細胞成長因子（HGF）、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インシュリン様成長因子（IGF）、神経成長因子（NGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、形質転換成長因子（TGF-αおよびTGF-β）、角質細胞成長因子（KGF）等）等を同時投与することができる。
　以下、本発明を試験例により、さらに詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
　試験例１
（角結膜障害モデルの作製方法）
　ウサギ（std:NZW）にケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射による麻酔後、０．４％オキシブプロカイン（2滴/眼）の点眼により眼局所麻酔を施した。ウサギを横臥位にし、片眼ずつ、用時に調製したn-ヘプタノール溶液（n-ヘプタノール：エタノール＝８：２）０．０４ｍｌ（０．０１ｍｌを４回）を角膜、球結膜に行き渡るように点眼した後、３回強制瞬目させ、３回目の強制瞬目では２分間閉眼させることにより角結膜障害モデルを作製した。
（被験薬剤の投与）
　角結膜障害作製日から、血清あるいは０．３％ヒアルロン酸ナトリウム製剤をそれぞれ１日２回、１０日間反復点眼した。各被験薬剤点眼眼の対側眼には生理食塩水を同様に点眼した。１回の点眼容量は、いずれも５０μl／眼とした。
　血清については、ヒトプール血清（コージンバイオ株式会社(日本)）を濾過滅菌（MILLEX GV、PVDF、０．２２μｍ、MILLIPORE）したものを、ドライアイ治療を目的に用いられる自己血清療法における血清点眼液の調製方法に準じ、生理食塩液で５倍希釈して用いた。
　０．３％ヒアルロン酸ナトリウム製剤は、ヒアレイン（登録商標）ミニ点眼液０．３％（参天製薬株式会社（日本））を用いた。
（試験群）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　体重の層別無作為化により群分けを行った。
（角膜障害の評価）
　角結膜の状態の観察を、n-ヘプタノール処置前（初回投与前日）、処置直後、各投与日の１回目の点眼前、投与４、５および６日目の２回目の点眼後、ならびに最終投与日の翌日に行った。
　１％フルオレセイン２μlを点眼し、その２分後にデジタルマイクロスコープ（VHX-900、株式会社キーエンス（日本））を用い、発光部にはコバルトブルーフィルター（FUJI FILTER BPB45）を、レンズ手前にはイエローフィルター（FUJI FILTER SC52）を装着し、角結膜の染色状態の写真撮影および観察を行い、角膜の障害の程度をスコア化した。スコア化は、角膜を５区画（中央、上、耳側、鼻側、下）に分け、各区画のフルオレセイン染色度を３点満点とし、その合計点（１５点満点）で評価した。染色度は、無染色が０点、一部染色が１点、３分の２程度までの染色の場合は２点、全面に染色している場合は３点とした。
　なお、１％フルオレセインは、フルオレセインナトリウム塩を生理食塩液に溶解させて調製した。
（結果）
　n-ヘプタノール処置後の角膜のフルオレセイン染色スコアを表３に示した。なお、n-ヘプタノール処置前における角膜のフルオレセイン染色スコアは、すべての個体について０点であった。
　表３に示すように、血清点眼では、障害処置後４日目において、点眼に対し有意な角膜上皮回復効果がみられた（ｐ＜０．０５）。
　一方、０．３％ヒアルロン酸ナトリウムの点眼では、角膜上皮回復効果はみられなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
試験例２
（試験方法）
　角結膜障害モデルの作製方法、被験薬剤の投与、角膜障害の評価は試験例１と同様に行った。
　被験薬剤には、０．０５％シクロスポリン製剤あるいは陽イオン乳剤を用いた。０．０５％シクロスポリン製剤は、Restasis（登録商標）（Allergan, Inc.（米国））を用いた。陽イオン乳剤は、Cationorm（登録商標）（Novagali Pharma SA（フランス））を用いた。
（試験群）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　体重の層別無作為化により群分けを行った。
（結果）
　n-ヘプタノール処置後の角膜のフルオレセイン染色スコアを表５に示した。なお、n-ヘプタノール処置前における角膜のフルオレセイン染色スコアは、すべての個体について０点であった。
　表５に示すように、０．０５％シクロスポリン、陽イオン乳剤の点眼では、いずれにおいても角膜上皮回復効果はみられなかった。
　試験例１および２の結果から、本願のモデルウサギを用いた評価系において、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度１および２で推奨される薬剤では角膜組織回復効果が認められず、ドライアイ重症度３で推奨される薬剤（血清）でのみ角膜組織回復効果が認められることが確認された。本発明の角結膜障害モデルウサギは、国際ドライアイ研究会2007年報告の分類、特にドライアイ重症度３以上の分類に則したドライアイ、特に角結膜などの眼表面障害を発現する動物モデルとして有用であることが理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例３
（試験方法）
　角結膜障害モデルの作製方法、被験薬剤の投与、角膜障害の評価は試験例１と同様に行った。
　被験薬剤には、１０％ nHSAを用いた。
　１０％ nHSAについては、献血アルブミン-Wf（２５％ヒト血清アルブミン製剤、田辺三菱製薬株式会社）を、生理食塩液とほぼ等張となるように塩化ナトリウム溶液で希釈して用いた。
（試験群）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（結果）
　n-ヘプタノール処置後の角膜のフルオレセイン染色スコアを表７に示した。なお、n-ヘプタノール処置前における角膜のフルオレセイン染色スコアは、すべての個体について０点であった。
　表７に示すように、１０％ nHSAの点眼により、障害処置後４、４．５、５、５．５、６および１０日目における角膜のフルオレセイン染色スコアは、生理食塩液点眼に対し有意に低値を示し、角膜上皮回復効果がみられた（４、５、５．５、６、１０日目：ｐ＜０．０５、４．５日目：ｐ＜０．０１）。
　以上の結果から、ヒト血清アルブミンは、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３で推奨される血清（試験例１）と同等以上の角膜組織回復効果を有することが理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (9)

  1. 　ウサギにn-ヘプタノール溶液を点眼して角結膜上皮が剥離した角結膜障害モデルウサギを作製すること、および該モデルウサギの眼に被験薬剤を点眼投与して該被験薬剤の角膜組織回復効果を評価することを特徴とする、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害に対する処置に有効な薬剤のスクリーニング方法。
  2. 　請求項１記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤を含む、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物。
  3. 　該薬剤がヒト由来アルブミンである、請求項２記載の医薬組成物。
  4. 　ヒト由来アルブミンを有効成分とする、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物。
  5. 　ヒト由来アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４記載の医薬組成物。
  6. 　請求項１記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤の有効量を、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害を有する患者へ投与することを含む、ドライアイおよび／または角結膜障害処置方法。
  7. 　ヒト由来アルブミンの有効量を、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害を有する患者へ投与することを含む、ドライアイおよび／または角結膜障害処置方法。
  8. 　請求項１記載のスクリーニング方法によって得られた薬剤の、国際ドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物の製造のための使用。
  9. 　ヒト由来アルブミンのドライアイ研究会2007年報告におけるドライアイ重症度３以上のドライアイおよび/または角結膜障害の処置のための医薬組成物の製造のための使用。
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