WO2011063597A1

WO2011063597A1 - 一种治疗糖尿病的复合微生物制剂及其制备方法和应用

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Publication number: WO2011063597A1
Application number: PCT/CN2010/001769
Authority: WO
Inventors: 王立平
Original assignee: Wang Liping
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2011-06-03
Also published as: CN101703528A; EP2386624A4; US20120093779A1; JP5525622B2; JP2013512197A; EP2386624B1; EP2386624A1; CN101703528B

Description

一种治疗糖尿病的复合微生物制剂及其制备方法和应用技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用。背景技术

糖尿病是一种由于机体不能正常释放或利用胰岛素，而使血中葡萄糖（一种单糖）水平不适当升高所导致的一种常见的、多发的、伴随终身的疾病。世界卫生组织（WTO )调查：目前世界糖尿病人数高达约 1.6亿，而中国就有糖尿病人约 6000多万，占全球糖尿病人数的 1/3，据统计：因糖尿病而导致失明者比一般人多 10-23倍；坏疽和截肢比一般人多 20倍；肾功能衰竭比一般人多 17倍，冠心病、中风比一般人多 2-3倍；猝死比一般人多 3-8倍，因此，世界卫生组织呼吁：尽早治疗糖尿病，减少并发症至关重要。

糖尿病的药物治疗分胰岛素治疗、口服降糖西药治疗和中医药治疗，目前已发展到生物技术治疗。中国专利 99105621 "—种治疗糖尿病的药品" 是用单种微生物菌株的代谢产物提取液制成用于治疗糖尿病的药品。中国专利 00804999 "治疗糖尿病的药物" 涉及生理上可接受的来源于微生物或动物的酶混合物。中国专利 01130450 "生物降糖制剂" 是由放线菌、乳酸菌和酵母菌三种微生物组成，经常规的活化、扩大培养、发酵、过滤、除渣、除菌、冷冻干燥等方法制成。

西药治疗糖尿病价格昂贵，毒副作用大，治标不治本；中成药降糖见效慢，需要时间长；生物技术能够克服上述两者的不足。中国专利 99105621 "生物降糖剂" 是单菌种，治疗作用较单一；中国专利 00804999的药物是一种酶制剂，用于辅助治疗糖尿病；中国专利 01130450的生物降糖制剂虽然由放线菌、乳酸菌、酵母菌三种微生物组成，但只是一个简单的混合，并没有指明三种菌的混合比例，且没有一定数量的临床验证，其临床疗效尚待评价。发明内容

本发明的目的是提供一种复合微生物制剂。本发明的复合微生物制剂主要由多种益生菌组分组成，包括光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌和放线菌。

其中，所述组分按体积计用量比例分别为光合细菌 5〜15%、芽孢杆菌 10-20%, 酵母菌 20~35%、乳酸杆菌 30~45%、放线菌 3〜10%；优选地，所述体积比分别为光合细菌 5~10%、芽孢杆菌 10~14%、酵母菌 30~35%、乳酸杆菌 41〜45%、放线菌 3~8%；更优选地，所述体积比分别为光合细菌 10%、芽孢杆菌 10%、酵母菌 30%、乳酸杆菌 45%、放线菌 5%;

所述光合细菌优选为沼泽红假单抱菌（ Rhodopseudomonas palustris ); 所述芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis ); 所述酵母菌优选为啤酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae )；所述乳酸杆菌优选为嗜酸乳杆菌 ( Lactobacillus acidophilus ); 所述放线菌优选为： i¾阳链霉菌 ( Streptomyces jingyangesis )。

本发明的另一个目的是提供这种复合微生物制剂的制备方法。该制备方法包括将光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌和放线菌经一级复合发酵和二级复合发酵的步骤。

所述一级复合发酵包括如下步骤：

( 1 )分别将光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、放线菌的母种接种于一级培养基进行一级培养，获得一级菌种；

( 2 )分别将光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、放线菌的一级菌种接种于二级培养基进行一级培养，获得发酵菌液；

( 3 )将各发酵菌液按比例混匀得到一级复合菌。

其中，步骤（1 )中光合细菌一级培养时接种量为 0.5%~1%，优选 0.5%, 培养 pH为 6〜10，培养温度为 28~36°C , 光照强度为 3000~4000勒克斯，培养时间为 7〜10天；芽孢杆菌一级培养时接种量为 0.5%〜1%, 优选 0.5%，培养 pH为 6〜8，培养温度为 28〜34°C，培养时间为 2~3天；酵母菌一级培养时接种量为 0.5%〜1%，优选 0.5%, 培养 pH为 4~7，培养温度为 25〜30°C，培养时间为 1~2天；乳酸菌一级培养时接种量为 0.5%~1%，优选 0.5%，培养 pH为 6〜8，培养温度为 28〜34°C，培养时间为 2〜5天；放线菌一级培养时接种量为 0.5%~1%，优选 0.5%，培养 pH为 6〜8, 培养温度为 27〜32°C，培养时间为 5〜7天;

步骤（2 ) 中光合细菌二级培养优选为间歇式通气培养，接种量为 5%〜15%，优选 10%，培养 pH为 6~10，培养温度为 28~36°C，光照强度为 3000-4000勒克斯，培养时间为 7~10天；芽孢杆菌二级培养优选为通气培养，接种量为 5°/。~15%，优选 10%，培养 pH为 6~8, 培养温度为 28〜32°C , 培养时间为 2〜5天；酵母菌二级培养优选为通气培养，接种量为 5%~15%，优选 10%, 培养 pH为 4〜7，培养温度为 25〜30°C，培养时间为 1~2天；乳酸菌二级培养优选为不通气培养，接种量为 5%〜15%，优选 10%, 培养 pH为 6~8, 培养温度为 28〜34°C , 培养时间为 2~5天；放线菌二级培养优选为通气培养，接种量为 5%〜15%, 优选 10%, 培养 pH为 6~8, 培养温度为 27~32°C，培养时间为 5〜7天。

所述二级复合发酵包括如下步骤：

向上述一级复合菌中加入无菌水进行 2~4倍稀释，再添加植物乳杆菌 10-20%, 嗜酸乳杆菌 10~20%、啤酒酵母 10~20%、红糖 5~15%混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 25~35°C，培养 pH为 5〜8，培养时间为 2~3天，得到二级复合菌。

对二级复合菌液进行取样检测：外观为液体，色泽一致，有微生物发酵产生的特殊气味，用酸度计直接测量 pH值，在 5〜8之间为正常值，用平板计数法测量活菌数及杂菌数，活菌总数大于 5xl0⁸cfo/g，杂菌率 < 5%即为合格品。

本发明的再一个目的是提供所述复合微生物制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用。对糖尿病人应用本发明的复合微生物制剂，用量为一曰三次，每次 20ml。一个疗程 15天，三个疗程后有效率可达 80%以上，血糖恢复正常。

本发明的关键点在于：

1. 本发明复合微生物制剂的所选组分中，光合细菌和芽孢杆菌具有微生态平衡功能；酵母菌含有多种蛋白质、 B族维生素、核酸和矿物质，可控制人体的代谢功能；乳酸杆菌在动物体内能发挥许多的生理功能，诸如降低血清胆固醇、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长、提高机体免疫力等；放线菌能产生抗生物质；

2. 将光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、放线菌等多种益生菌按照一定的比例，经过两次复合发酵制备本发明的复合微生物制剂；

3. 利用其发酵后产生的多种有益生物调节因子、氨基酸、抗生物质及各种复合微生物活性蛋白和活性酶制剂的共同作用，将本发明的复合微生物制剂用于制备治疗糖尿病的药物。本发明的复合微生物制剂能迅速调节人体代谢功能，修复和重组胰岛细胞群，转化血液中多余的糖，减轻受损胰岛 β细胞的负担，逐步恢复受损的胰岛功能，改善微循环灌流，维持内环境稳态，保持机体平衡，纠正代谢紊乱和失衡，从根本上消除糖尿病及并发症，提高糖尿病患者的生活质量，解除糖尿病患者长期服用西药、严格控制饮食的临床弊端。本发明的复合微生物制剂成本低、作用快、口感好，应用时不需要控制饮食、可治根治本。

本发明的复合微生物制剂的主要功效为：

1. 修复和重组胰岛细胞群，转化血液中多余的糖，减轻受损胰岛 β细胞的负担，激活修复因子，修复受损的胰岛功能，抑制并发症的发生，提高自身的免疫力，促进微生态循环，最终完全恢复胰岛功能达到彻底康复，标本兼治。

2. 通过调节新陈代谢，综合调控血糖，整体调整患者机体功能，通过激发患者自身功能，调节血糖恢复到正常水平，恢复人体自身调节血糖的能力。

3. 改善微循环灌流，促进细胞供氧供血；促进血液灌流，增加组织血流量，可以治疗和预防糖尿病微血管并发症，阻止糖尿病的致命危害。

4. 提高神经传导速度升高肢端温度，改善糖尿病患者的肢端搔痒、刺痛，预防坏疽和截肢的发生。

5. 改善糖尿病神经并发症患者的睡眠，纠正顽固性失眠以及乏力、精神不振等状态。

6. 改善糖尿病胃肠神经功能紊乱造成的腹泻便秘等症，以及糖尿病引起的高血压。 7. 维持人体内环境稳态，保持机体平衡，纠正代谢紊乱和失衡。附图说明

图 1为一级复合发酵的流程图；

图 2为二级复合发酵的流程图。具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

各菌种的培养基

沼泽红假单孢菌的一级培养基为： MgS0₄，7H₂0 0.2g、（N )₂S0₄ 1.0g、 NaHC0₃ 5.0g、 K₂HP0₄ 0.5g、 NaCl 0.2g、蛋白胨 1.5g; 将各成分溶于 400ml 蒸馏水中，用 H₃P0₄和 Na₂C0₃调 pH 7.1 , 再加入蒸馏水至 1000ml, 115°C灭菌 10分钟；二级培养基为： Na₂C0₃ 3g、 NaC1 0.1g、（NH4)₂S0₄ 0.3g、 MgS0₄ 0.2g、 KH₂PO₃ 0.5g、 K₂HPO₃ 0.3g、柠檬酸铁铵 7ml、蛋白胨 1.2g、用蒸馏水定容至 1000ml, 用 H₃P0₄和 Na₂C0₃调 pH为 7.2。

枯草芽孢杆菌的一级培养基为：牛肉膏 0.3%、蛋白胨 1.0%、 NaCl 0.5%, 用蒸馏水定容至 1000ml， pH 7.0; 二级培养基为：牛肉膏 1.0%、蛋白胨 1.0%、 NaCl 0.5%, 用蒸馏水定容至 1000ml, pH7.0。

啤酒酵母的一级培养基为：马铃薯汁 800ml、葡萄糖 20g、琼脂 20g，用蒸馏水定容至 1000ml, pH 6.0; 二级培养基：酵母膏 1%、蛋白胨 2%、葡萄糖 2%、 MgSO₄ 0.06%、 K₂HPO₄0.25%, 用水补足 100%, pH6.0。

嗜酸乳杆菌的一级培养基为： KN0₃ l g, 可溶性淀粉 10 g， K₂HPO₄0.5 g, MgS0₄ 0.5 g, NaCl 0.5 g， FeS0₄ 0.01 g, 琼脂 20 g，用蒸馏水定容至 1000ml, pH7.2; 二级培养基为： KNO₃0.8 g，可溶性淀粉 8 g, 葡萄糖 5 g，酵母汁 5 g, K₂HPO₄0.3 g, MgS0₄ 0.2 g， NaCl 0.4 g， FeS0₄ 0.05 g，用蒸馏水定容至 1000ml, ρΗ7·2。

泾阳链霉菌的一级培养基为： KN0₃ l g, 可溶性淀粉 20 g, K₂HPO₄0.5 g, MgS0₄ 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeS0₄ 0.01 g, 琼脂 20 g，用蒸馏水定容至 1000ml, pH7.2; 二级培养基为 KNO₃0.8 g, 可溶性淀粉 8 g，葡萄糖 5 g，酵母汁 5 g, K₂HPO₄0.3 g, MgS0₄ 0.2 g， NaCl 0.4 g， FeS0₄ 0.05 g，用蒸馏水定容至 1000ml, 实施例 1 复合微生物制剂的制备方法

一级复合发酵：

( 1 )取沼泽红假单孢菌的茄瓶菌 300ml,接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 28°C , 光照强度为 3000勒克斯，培养时间为 10天，得到沼泽红假单孢菌的一级菌种；

取枯草芽孢杆菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 28°C , 培养时间为 3天，得到枯草芽孢杆菌的一级菌种；

取啤酒酵母的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 4, 培养温度为 25 V , 培养时间为 2天，得到啤酒酵母的一级菌种；取嗜酸乳杆菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6, 培养温度为 28°C，培养时间为 5天，得到嗜酸乳杆菌的一级菌种；

取泾阳链霉菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6, 培养温度为 27Ό , 培养时间为 7天，得到泾阳链霉菌的一级菌种；

( 2 )取沼泽红假单孢菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，间歇式通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 28°C , 光照强度为 3000，培养时间为 10天，得到沼泽红假单孢菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5xl0⁸ ~ lOxlO⁸个。

取枯草芽孢杆菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 6, 培养温度为 28°C，培养时间为 3天，得到枯草芽孢杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ 10⁸ ~ 50χ 10⁸个。

取啤酒酵母的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 4, 培养温度为 25°C，培养时间为 2天，得到啤酒酵母的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ10⁸ ~ 10χ 10⁸个。取嗜酸乳酸菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，静置不通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 28°C , 培养时间为 5天，得到嗜酸乳杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 20xl0⁸ ~ 30χ10⁸个。

取泾阳链霉菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 27°C，培养时间为 7天，得到泾阳链霉菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸ 个。

( 3 )将各组分的发酵菌液按沼泽红假单孢菌 10%、枯草芽孢杆菌 10%、啤酒酵母 30%、嗜酸乳杆菌 45%、泾阳链霉菌 5%的体积比在 1000L储液罐中混匀进行复合，得到 1000L—级复合菌。

二级复合发酵：

向 1000L—级复合菌加入无菌水 2450 L进行稀释，再添加植物乳杆菌 150L、嗜酸乳杆菌 150L、啤酒酵母 150L、红糖 100L混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 30°C , 培养 pH为 7，培养时间为 3天，得到二级复合菌 4000L。

经检测，所得复合菌中活菌总数为 20χ10⁸ ~ 30χ 10⁸个。其中，沼泽红假单孢菌为 8%、枯草芽孢杆菌为 12%、啤酒酵母为 32%、嗜酸乳杆菌为 44%、泾阳链霉菌为 4%。

实施例 2 复合微生物制剂的制备方法

一级复合发酵： ―

( 1 )取沼泽红假单孢菌的茄瓶菌 500ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8，培养温度为 32°C , 光照强度为 3500勒克斯，培养时间为 8 天，得到沼泽红假单孢菌的一级菌种；

取枯草芽孢杆菌的茄瓶菌 500ml,接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 7, 培养温度为 32°C，培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的一级菌种；取啤酒酵母的茄瓶菌 500ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 5, 培养温度为 28°C , 培养时间为 1天，得到啤酒酵母的一级菌种；取嗜酸乳杆菌的茄瓶菌 500ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 7，培养温度为 32°C，培养时间为 3天，得到嗜酸乳杆菌的一级菌种；

取泾阳链霉菌的茄瓶菌 500ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 7，培养温度为 30°C , 培养时间为 6天，得到泾阳链霉菌的一级菌种；

( 2 )取沼泽红假单孢菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，间歇式通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 32°C，光照强度为 3500，培养时间为 8天，得到沼泽红假单孢菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ10⁸ ~ ΙΟχΙΟ⁸个。

取枯草芽孢杆菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 7，培养温度为 32°C，培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸个。

取啤酒酵母的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 5, 培养温度为 28°C，培养时间为 1天，得到啤酒酵母的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ10⁸ ~ 10χ10⁸个。

取嗜酸乳酸菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，静置不通气培养，培养 pH为 7，培养温度为 32°C，培养时间为 3天，得到嗜酸乳杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 20xl0⁸ ~ 30χ10⁸。

取泾阳链霉菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 7, 培养温度为 30°C，培养时间为 6天，得到泾阳链霉菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸ 个。

( 3 )将各组分的发酵菌液 '按沼泽红假单孢菌 5%、枯草芽孢杆菌 14%、啤酒酵母 32%、嗜酸乳杆菌 41%、泾阳链霉菌 8%的体积比在 1000L储液罐中混匀进行复合，得到 1000L—级复合菌。

二级复合发酵：

向 1000L—级复合菌加入无菌水 2150L进行稀释，再添加植物乳杆菌 100L、嗜酸乳杆菌 100L、啤酒.酵母 100L、红糖 50L混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 25°C , 培养 pH优选为 5，培养时间为 2天，得到二级复合菌 3500L。

经检测，所得复合菌中活菌总数为 20χ10⁸ ~ 30χ 10⁸个。其中，沼泽红假单孢菌为 6%、枯草芽孢杆菌为 15°/。、啤酒酵母为 33%、嗜酸乳杆菌为 42%、泾阳链霉菌为 4%。

实施例 3 复合微生物制剂的制备方法

一级复合发酵：

( 1 )取沼泽红假单孢菌的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 10, 培养温度为 36°C，光照强度为 4000勒克斯，培养时间为 7天，得到沼泽红假单孢菌的一级菌种；

取枯草芽孢杆菌的茄瓶菌 600ml,接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8，培养温度为 34°C , 培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的一级菌种；

取啤酒酵母的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 7，培养温度为 30°C，培养时间为 1天，得到啤酒酵母的一级菌种；取嗜酸乳杆菌的茄瓶菌 600ml, 接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8，培养温度为 34°C，培养时间为 2天，得到嗜酸乳杆菌的一级菌种；

取泾阳链霉菌的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8，培养温度为 32°C，培养时间为 5天，得到泾阳链霉菌的一级菌种；

( 2 )取沼泽红假单孢菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，间歇式通气培养，培养 pH为 10，培养温度为 36°C，光照强度为 4000, 培养时间为 7天，得到沼泽红假单孢菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ10⁸ ~ ΙΟχΙΟ⁸个。

取枯草芽孢杆菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 34°C , 培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸个。

取啤酒酵母的一级菌种 60L,接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 7，培养温度为 30°C，培养时间为 1天，得到啤酒酵母的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ 10⁸ ~ 10χ10⁸个。

取嗜酸乳酸菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，静置不通气培养，培养 pH为 8, 培养温度为 34°C，培养时间为 2天，得到嗜酸乳杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 20χ 10⁸ ~ 30χ10⁸个。

取泾阳链霉菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 32°C，培养时间为 5天，得到泾阳链霉菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸ 个》

( 3 )将各组分的发酵菌液按沼泽红假单孢菌 8%、枯草芽孢杆菌 12%、啤酒酵母 35%、嗜酸乳杆菌 42%、泾阳链霉菌 3%的体积比在 1000L储液罐中混匀进行复合，得到 1000L—级复合菌。

二级复合发酵：

向 1000L—级复合菌加入无菌水 3250L进行稀释，再添加植物乳杆菌 200L、嗜酸乳杆菌 200L、啤酒酵母 200L、红糖 150L混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 35 °C , 培养 pH优选为 8，培养时间为 3天，得到二级复合菌 5000L。

经检测，所得复合菌中活菌总数为 20x l0⁸ ~ 30x l0⁸个。其中，沼泽红假单孢菌为 7%、枯草芽孢杆菌为 11%、啤酒酵母为 34%、嗜酸乳杆菌为 43%、泾阳链霉菌为 5%。实施例 4 复合微生物制剂的制备方法

一级复合发酵：

( 1 )取沼泽红假单孢菌的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 10，培养温度为 36V，光照强度为 4000勒克斯，培养时间为 7天，得到沼泽红假单孢菌的一级菌种；

取枯草芽孢杆菌的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8 , 培养温度为 34°C , 培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的一级菌种；

取啤酒酵母的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 7，培养温度为 30°C , 培养时间为 1天，得到啤酒酵母的一级菌种；取嗜酸乳杆菌的茄瓶菌 600ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8，培养温度为 34°C , 培养时间为 2天，得到嗜酸乳杆菌的一级菌种；

取泾阳链霉菌的茄瓶菌 600ml, 接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 8 , 培养温度为 32°C，培养时间为 5天，得到泾阳链霉菌的一级菌种；

( 2 )取沼泽红假单孢菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，间歇式通气培养，培养 pH为 10，培养温度为 36°C，光照强度为 4000，培养时间为 7天，得到沼泽红假单孢菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ 10⁸ ~ ΙΟχ ΙΟ⁸个。

取枯草芽孢杆菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 34°C，培养时间为 2天，得到枯草芽孢杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30x l0⁸ ~ 50χ 10⁸个。

取啤酒酵母的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 7，培养温度为 30°C，培养时间为 1天，得到啤酒酵母的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5x l0⁸ ~ 10x l0⁸个。

取嗜酸乳酸菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，静置不通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 34°C , 培养时间为 2天，得到嗜酸乳杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 20χ10⁸ ~ 30χ10⁸个。

取泾阳链霉菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 8，培养温度为 32°C，培养时间为 5天，得到泾阳链霉菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30x l0⁸ ~ 50x l0⁸ 个。

( 3 )将各组分的发酵菌液按沼泽红假单孢菌 15%、枯草芽孢杆菌 20%、啤酒酵母 20%、嗜酸乳杆菌 35%、泾阳链霉菌 10%的体积比在 1000L储液罐中混匀进行复合，得到 1000L—级复合菌。

二级复合发酵：

向 1000L—级复合菌加入无菌水 3250L进行稀释，再添加植物乳杆菌 200L、嗜酸乳杆菌 200L、啤酒酵母 200L、红糖 150L混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 35 °C，培养 pH优选为 8, 培养时间为 3天，得到二级复合菌 5000L。 ' 经检测，所得复合菌中活菌总数为 20χ10⁸ ~ 30χ 10⁸个。其中，沼泽红假单孢菌为 12%、枯草芽孢杆菌为 17%、啤酒酵母为 25%、嗜酸乳杆菌为 38%、泾阳链霉菌为 8%。

实施例 5 复合微生物制剂的制备方法

一级复合发酵：

( 1 )取沼泽红假单孢菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 28°C，光照强度为 3000勒克斯，培养时间为 10天，得到沼泽红假单孢菌的一级菌种；

取枯草芽孢杆菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 28°C，培养时间为 3天，得到枯草芽孢杆菌的一级菌种；

取啤酒酵母的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 4, 培养温度为 25°C , 培养时间为 2天，得到啤酒酵母的一级菌种；取嗜酸乳杆菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 28°C，培养时间为 5天，得到嗜酸乳杆菌的一级菌种；

取泾阳链霉菌的茄瓶菌 300ml，接种于 60L所述菌种的一级培养基中，培养 pH为 6，培养温度为 27°C , 培养时间为 7天，得到泾阳链霉菌的一级菌种 ·，

( 2 )取沼泽红假单孢菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，间歇式通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 28°C , 光照强度为 3000, 培养时间为 10天，得到沼泽红假单孢菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ 10⁸ ~ ΙΟχΙΟ⁸个。

取枯草芽孢杆菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 28°C，培养时间为 3天，得到枯草芽孢杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ 10⁸个。

取啤酒酵母的一级菌种 60L,接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 4，培养温度为 25°C , 培养时间为 2天，得到啤酒酵母的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 5χ10⁸ ~ 10χ10⁸个。

取嗜酸乳酸菌的一级菌种 60L，接种于 600L所述菌种的二级培养基中，静置不通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 28°C，培养时间为 5天，得到嗜酸乳杆菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 20χ 10⁸ ~ 30χ 10⁸个。

取泾阳链霉菌的一级菌种 60L, 接种于 600L所述菌种的二级培养基中，通气培养，培养 pH为 6，培养温度为 27°C，培养时间为 7天，得到泾阳链霉菌的发酵菌液；经检测，该发酵菌液中所述菌的活菌数为 30χ10⁸ ~ 50χ10⁸ 个。

( 3 )将各组分的发酵菌液按沼泽红假单孢菌 15%、枯草芽孢杆菌 20%、啤酒酵母 25%、嗜酸乳杆菌 30%、泾阳链霉菌 10%的体积比在 1000L储液罐中混匀进行复合，得到 1000L—级复合菌。二级复合发酵：

向 1000L—级复合菌加入无菌水 2450 L进行稀释，再添加植物乳杆菌 150L、嗜酸乳杆菌 150L、啤酒酵母 150L、红糖 100L混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 30Ό , 培养 pH为 7，培养时间为 3天，得到二级复合菌 4000L。

经检测，所得复合菌中活菌总数为 20χ10⁸ ~ 30χ10⁸个。其中，沼泽红假单孢菌为 13%、枯草芽孢杆菌为 16%、啤酒酵母为 29%、嗜酸乳杆菌为 33%、泾阳链霉菌为 9%。

实验例 1 本发明复合微生物制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用

1. 一般资料：门诊患者 103例，其中男性 81例，女性 22例；年龄： 40-70 岁。

2. 诊断标准：根据根据世界卫生组织制定的糖尿病诊断标准，确诊大部分患者为中长期糖尿病患者。

3. 治疗方法：本发明实施例 1所述的复合微生物制剂，用量为一日三次，饭后十分钟口服，每次 20ml。 15天为一个疗程，服用六个疗程。

注意事项： 1 )服用前将瓶底朝上摇匀； 2 )服用后 1小时内不能饮水； 3 ) 不用控制饮食； 4 )使用胰岛素的患者可在 7天内逐步减少胰岛素的用量，血糖正常后可停用； 5 )其他糖尿病药物可在 15天内逐步减量，血糖正常后可停用； 6 ) 常温下避光保存。

4. 疗效评定标准：

显效：空腹血糖及餐后 2小时血糖下降至正常范围；或空腹血糖及餐后 2 小时血糖值下降超过治疗前的 40%; 糖化血红蛋白值下降至正常，或下降超过治疗前的 30%。

好转：空腹血糖及餐后 2小时血糖下降超过治疗前的 20%，但未达到显效标准；糖化血红蛋白值下降超过治疗前的 10%, 但未达到显效标准。

无效：空腹血糖及餐后 2小时血糖无下降，或下降未达到好转标准；糖化血红蛋白值无下降，或下降未达到好转标准。

5. 治疗结果（见表 1 ) 表 1 经本发明复合微生物制剂治疗后的疗效观察

典型病例：

毛某：男， 61岁，患糖尿病 18年，打胰岛素 9年，未服用本发明复合微生物制剂前，控制饮食，体质虛弱，最高血糖 18.5 mmol/L、甘油三脂 7.6 mmol/L、总胆固醇 9.4 mmol/L。服用本发明复合微生物制剂 15天后停止打胰岛素，其他糖尿病用药减少 50%，未控制饮食，血糖、甘油三脂、胆固醇等各项指标明显下降； 45天后检查，血糖 5.7 mmol/L、甘油三脂 2.3 mmol/L、总胆固醇 4.5 mmol/L, 体质和饮食全面恢复正常。

刘某：男， 57岁，患糖尿病 17年，打胰岛素 6年，未服用本发明复合微生物制剂前，控制饮食，体质虛弱，最高血糖 16.9 mmol/L、甘油三脂 6.9 mmol/L、总胆固醇 8.2 mmol/L。服用本发明复合微生物制剂 13天后停止打胰岛素，其他糖尿病用药减少 50%, 不用控制饮食，血糖、甘油三脂、胆固醇各项指标明显下降； 45天后检查，血糖 4.6 mmol/L、甘油三脂 2.8 mmol/L、总胆固醇 5.3 mmol/L, 体质和饮食全面恢复正常。工业实用性

本发明公开的复合微生物制剂，能够迅速调节人体代谢功能，修复和重组胰岛细胞群，转化血液中多余的糖，减轻受损胰岛 β细胞的负担，逐步恢复受损的胰岛功能，改善微循环灌流，提高神经传导速度升高肢端温度，改善糖尿病神经并发症患者的睡眠，维持内环境稳态，保持机体平衡，纠正代谢紊乱和失衡，用于治疗糖尿病及其并发症，提高糖尿病患者的生活质量。

Claims

权利要求书

1、一种复合微生物制剂，其特征在于，由光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌和放线菌按比例组成，各组分按体积计用量比分别为：光合细菌 5-15%,芽孢杆菌 10~20%、酵母菌 20~35%、乳酸杆菌 30~45%、放线菌 3~10%。

2、根据权利要求 1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述组分按体积计用量比例分别为光合细菌 5~10%、芽孢杆菌 10~14%、酵母菌 30~35%、乳酸杆菌 41~45%、放线菌 3~8%。

3、根据权利要求 2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述组分按体积计用量比例分别为光合细菌 10%、芽孢杆菌 10%、酵母菌 30%、乳酸杆菌 45%、放线菌 5%。

4、根据权利要求 1-3任一项所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述光合细菌为沼泽红假单孢菌；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为啤酒酵母；所述乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌；所述放线菌为泾阳链霉菌。

5、一种权利要求 1-4任一项所述复合微生物制剂的制备方法，其包括将光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌和放线菌经一级复合发酵和二级复合发酵的步骤。

6、根据权利要求 5所述的制备方法，其特征在于，所述一级复合发酵包括如下步骤：（1 )分别将所述光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、放线菌接种于一级培养基进行一级培养，得到各组分的一级菌种；（2 )分别将所述各组分的一级菌种接种于二级培养基进行二级培养，得到各组分的发酵菌液；（3 )将所述各组分的发酵菌液复合，得到一级复合菌。

7、根据权利要求 6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2 ) 中所述光合细菌为间歇式通气培养；所述芽孢杆菌为通气培养；所述酵母菌为通气培养；所述乳酸杆菌为静置不通气培养；所述放线菌为通气培养。

8、根据权利要求 5所述的制备方法，其特征在于，所述二级复合发酵包括如下步骤：向所述一级复合菌中添加无菌水进行 2〜4倍稀释，再添加植物乳杆菌 10~20%、嗜酸乳杆菌 10~20%、啤酒酵母 10〜20%、红糖 5~15%混匀，在储液罐中进行复合，无菌密闭发酵，培养温度为 25~35 °C , 培养 pH为 5~8，培养时间为 2〜3天，得到二级复合菌。

9、权利要求 1-4任一项所述的复合微生物制剂或者由杈利要求 5-8任一项所述的制备方法得到的复合微生物制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用。

10、权利要求 1-4任一项所述的复合微生物制剂或者由权利要求 5-8任一项所述的制备方法得到的复合微生物制剂在治疗糖尿病中的应用。