WO2011058080A1 - Vaccins et diagnostics contre les trypanosomoses - Google Patents

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WO2011058080A1
WO2011058080A1 PCT/EP2010/067245 EP2010067245W WO2011058080A1 WO 2011058080 A1 WO2011058080 A1 WO 2011058080A1 EP 2010067245 W EP2010067245 W EP 2010067245W WO 2011058080 A1 WO2011058080 A1 WO 2011058080A1
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WO
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tcots
vaccine
proteins
protein
sequences
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PCT/EP2010/067245
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Inventor
Virginie Coustou Linares
Theo Baltz
Nicolas Plazolles
Original Assignee
Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase

Definitions

  • the present invention relates to a novel genetic material coding for trans-sialidase-like proteins belonging to African trypanosome parasites, and relates to the use of said genes and proteins for vaccinal, therapeutic and diagnostic purposes.
  • the present invention also relates to the immunization of non-human animals and / or humans against trypanosomoses or trypanosomiases.
  • Trypanosomiasis or trypanosomiasis is caused by several species of protozoan parasites of the genus Trypanosoma and African trypanosomes generally refer to trypanosomes belonging to the Salivaria group, which itself comprises three main subgenera: Trypanozoon, Duttonella and Nannomonas.
  • the subgenus Trypanozoon consists of polymorphous trypanosomes (long form and short or stout form), with an optional free flagellum and a small kinetoplast in the subterminal (posterior) position.
  • the species of this subgenus are Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi, and T. equiperdum.
  • T. brucei comprises three subspecies: T. b. brucei, T. b. gambiense and T. b. rhodesiense, which are morphologically, antigenically and biochemically very similar, and are distinguished by their infectious characteristics, their pathogenicity and their geographical distribution.
  • T. brucei comprises three subspecies: T. b. brucei, T. b. gambiense and T. b. rhodesiense, which are morphologically, antigenically and biochemically very similar, and are distinguished by their infectious characteristics, their path
  • T. evansi is transmitted to cattle, horses and camels by biting flies other than tsetse flies (Tabanidae) in Africa, South America and South East Asia.
  • T. equiperdum has no invertebrate host (sexual transmission in horses). These last two species largely extend from tsetse flies and are cosmopolitan. Their morphology is similar to that of T. brucei but they are monomorphic (long forms only).
  • Trypanosomes belonging to the subgenus Duttonella have the shape of a club or club, with the rounded and broad posterior end, the body narrowing towards the anterior end.
  • the kinetoplast is bulky, rounded and in a terminal position; the undulating, undeveloped, narrow membrane terminates in free flagellum.
  • T. vivax and T. uniform are parasitic species of wild ruminants and servants. They can be transmitted mechanically or by tsetse flies, whose tubal and proventriculus they colonize exclusively.
  • Trypanosomes of the subgenus Nannomonas are small (8 to 24 ⁇ ), they have no free flagellum at any stage of their development.
  • the mid-sized kinetoplast is in a subterminal or marginal position.
  • the posterior end is rounded and the undulating membrane narrow.
  • Pathogenicity is important for livestock, pigs and dogs in Africa. Tsetse development takes place in the stomach and proboscis exclusively.
  • the main species are T. congolense and T. simiae. These trypanosomes are small, with rounded posterior end, kinetoplast in marginal position, narrow undulating membrane.
  • T. congolense pathogenic trypanosomes
  • T. vivax species of pathogenic trypanosomes
  • T. brucei pathogenic trypanosome species
  • Other animals are infected with another pathogenic trypanosome species, T. evansi, which is responsible for a pathology called Surra. Trypanosomes are characterized by a great genetic diversity, which concerns infectivity, virulence, pathogenicity, transmissibility, and susceptibility to trypanocidal products.
  • T. congolense is the main agent of bovine trypanosomosis in Africa, due to its frequency and pathogenicity. It also adapts to various non-human animal species, and can thus parasitize bovines, pigs, sheep, goats, equines, and canids.
  • T. brucei and in particular the subspecies Trypanosoma brucei gambiense is probably the most well-known because it is responsible for the chronic form of human sleeping sickness in West and Central Africa.
  • the subspecies Trypanosoma brucei brucei is a parasite of domestic and wild animals throughout Africa, but it is not infectious for humans because of the lytic effect on the blood forms of these trypanosomes, the protein Apolipoprotein L present in human serum.
  • the third subspecies is Trypanosoma brucei rhodesiense which is the agent of sleeping sickness in its acute form in Africa.
  • the subspecies T. evansi is transmitted to cattle, horses and camels, and has significant economic repercussions in Africa especially for the cattle and buffalo farms.
  • T. vivax is a parasite essentially ungulates in tropical Africa and transmission is provided by horseflies or tabanids.
  • Trypanosomes have a complex life cycle that includes different morphological forms. They generally have a fusiform body and possess a flagellum which is connected to the body by an undulating membrane. They reproduce asexually by binary fission.
  • the tsetse fly glossina sp.
  • tsetse fly injects into the dermis of the host at the site of the bite, infectious metacyclic forms present in the mouthparts. Parasites multiply in the dermis at the point of inoculation. A local reaction related to the multiplication of parasites in the dermis occurs, and parasites give birth to blood forms. This stage can last from 1 to 3 weeks for example in the case of T. congolense.
  • the parasites invade the blood, the lymphatic system, especially the lymph nodes, as well as various organs, such as the liver, spleen, heart, kidneys, testicles, and important lesions appear then.
  • the tsetse fly becomes infected and feeds on parasitized animals. Once infected, she remains infectious throughout her life.
  • T. brucei and T. congolense the trypanosome undergoes in the insect a complex cycle involving dedifferentiation in the intestine into non-infectious procyclic forms.
  • the trypanosomes turn into epimastigote, adherent forms, which actively multiply. Their differentiation leads to the infectious stage represented by the metacyclic forms, which no longer divide.
  • the T. vivax cycle does not involve a procyclic stage. It begins with the flagellar attachment of the blood forms ingested by the tsetse fly. They differentiate into epimastigote forms, which proliferate and then differentiate into infectious metacyclic forms.
  • the total cycle time in tsetse flies is approximately 5 to 10 days for T. vivax, 18 days for T. congolense, and 30 days for T. brucei.
  • Sources of infection of domestic animals are other domestic animals or diseased wild animals or healthy carriers.
  • the existence of reservoir comes from the fact that some species are not very receptive to infection, and not very sensitive to the disease.
  • T. congolense and T. brucei are exclusively transmitted by biological vectors such as tsetse flies, but T. vivax can also be transmitted by mechanical vectors such as biting flies (tabanids or stomoxes).
  • T. evansi is exclusively transmitted by mechanical vectors. The efficiency of transmission depends on the infection rate of tsetse flies and host-vector interactions. In general, infectious trypanosomes for animals give higher infection rates than trypanosomes infecting humans, which contributes to the very wide distribution of animal trypanosomosis.
  • Trypanosome analysis by electron microscopy shows the existence of a mantle of about 15 nm covering the entire cell body of the parasite.
  • This mantle is present only on the surface of blood and metacyclic forms. It consists essentially of a glycoprotein called VSG (Variable Surface Antigen) and other membrane proteins in small amounts. VSGs thus form a very dense structure constituting a physical barrier between the plasma membrane and the host. The 3D structure predicts that only a small portion of the protein is exposed to the surface of the parasite.
  • VSG Very Surface Antigen
  • the mantle would be to mask the nonvariable membrane antigens of the parasite by presenting some immunodominant motifs to the immune defenses of the host.
  • the mantle also protects the blood forms against lysis by activation of the alternative complement pathway.
  • the Applicant has identified and obtained a new genetic material coding for new trans-sialidase-like proteins, called TcoTS-like 1, 2, and 3, recognized by anti-anti-African trypanosomes.
  • the genetic material can be used to produce proteins and polypeptides for the development of diagnostic tests, the preparation of vaccine or pharmaceutical compositions against infections with African trypanosomes.
  • the protein and any corresponding polypeptide fragment can be used for the production of specific antibodies against the parasite for diagnostic purposes or for passive immunization.
  • Figure 1 represents the nucleotide sequence encoding the trans-sialidase-like protein TcoTS-like 1
  • Figure 2 represents the nucleotide sequence encoding the trans-sialidase-like protein TcoTS-like 2;
  • Figure 3 represents the nucleotide sequence encoding the trans-sialidase-like protein TcoTS-like 3;
  • Figure 4 represents the peptide sequence corresponding to the trans-sialidase-like protein like TcoTS-like 1;
  • Figure 5 represents the peptide sequence corresponding to the trans-sialidase-like protein like TcoTS-like 2;
  • Figure 6 represents the peptide sequence corresponding to the trans-sialidase-like protein TcoTS-like 3;
  • Figure 7 represents a sequence alignment between the transsialidase-like protein (TcoTS-like 2) and a trans-sialidase protein of the parasite Trypanosoma cruzi Y. cruzi TS);
  • Figures 8A and 8B show a schematic of the subfamilies of proteins related to trans-sialidases of the T. congolense parasite; Identity percentages between genes of the same subfamily are shown (Fig. 8A) with a table showing percentages of identity between these proteins (Fig. 8B);
  • Figure 9 Represents a nucleotide sequence encoding TcoTS-A1 protein
  • Figure 10 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-A2 protein
  • Figure 11 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-A3 protein
  • Figure 12 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-B1 protein
  • Figure 13 represents a nucleotide sequence encoding TcoTS-B2 protein
  • Figure 14 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-C protein
  • Figure 15 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-D1 protein
  • Figure 16 shows a nucleotide sequence encoding TcoTS-D2 protein
  • Figure 17 shows a peptide sequence corresponding to TcoTS-A1 protein
  • Figure 18 shows a peptide sequence corresponding to TcoTS-A2 protein
  • Figure 19 shows a peptide sequence corresponding to TcoTS-A3 protein
  • Figure 20 shows a peptide sequence corresponding to TcoTS-B1 protein
  • Figure 21 represents a peptide sequence corresponding to TcoTS-B2 protein
  • Figure 22 shows a peptide sequence corresponding to the TcoTS-1 protein.
  • Figure 23 shows the peptide sequence corresponding to the TcoTS-D1 protein
  • Figure 24 shows the peptide sequence corresponding to the TcoTS-D2 protein
  • Figures 25A and 25B show a sequence alignment between the 1 1 proteins related to trans-sialidases of the parasite Trypanosoma congolense
  • Figure 26 represents a table showing the identity percentages between the proteins related to trans-sialidases of T. congolense and T. brucei parasites.
  • Figure 27 represents a table of the different peptides identified in the immunoprecipitation experiment with anti-TcoTS-A1 serum. Their membership in TcoTS-A1, TcoTS-A2 or TcoTS-A3 (A), TcoTS-like 2 (B) and TcoTS-D2 (C) proteins.
  • Figure 28 represents a table of the different peptides identified in the experiment of T. congolense (A) blood-form membrane preparations, their membership in the TcoTS-A1, TcoTS-A2 or TcoTS-A3 proteins is represented by a +; and a table of peptides belonging to the TcoTS-like 2 protein identified during the immunoprecipitation experiments with anti-peptide 1, anti-peptide 2 or anti-peptide 3 (B) sera.
  • A blood-form membrane preparations
  • Figures 29A and 29B show the measurement of hematocrit (A) and mean survival (B) of mice after immunization with TcoTS-like 2, TcoTS-A1 and TcoTS-B1 proteins or with BSA. The number of mice (n) used during the different immunizations is indicated.
  • African trypanosomes means the protozoan parasites of the genus Trypanosoma belonging to the Salivaria group, which itself comprises three main subgenera: Trypanozoon, Duttonella and Nannomonas, as defined above. These are known as African trypanosomes, but are found today on the African continent as well as in Asia or South America. The most common African trypanosomes are Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, and Trypanosoma brucei.
  • trypanosomosis and "African animal trypanosomiasis (AAT)” generally refer to non-human animal infections caused by African trypanosomes, while the terms “trypanosomiasis” or “African trypanosomiasis” are used to refer to human infections also caused by African trypanosomes. For the sake of simplification, the terms trypanosomiasis and trypanosomiasis are used interchangeably.
  • the present invention relates to a DNA or RNA molecule encoding novel trans-sialidase-like proteins, called TcoTS-like 1, 2, and 3, and belonging to African trypanosomes.
  • novel DNA or RNA molecules comprise at least one strand comprising a nucleotide sequence chosen from sequences SEQ ID NOs: 1 -3, a sequence complementary, antisense, or equivalent to one of the sequences SEQ ID Nos: 1 -3, and in particular a sequence comprising an identity of at least 70%, with one of the SEQ sequences ID NOs: 1 -3, or a sequence having, on a sequence of 100 contiguous nucleotides, at least 50%, preferably at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, 85%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, or 95% homology with said sequences, or a nucleotide sequence capable of hybridizing with one of the sequences SEQ ID NOs: 1-3 under stringent conditions of hybridization.
  • stringent hybridization conditions hybridization at a temperature of 65 ° C overnight in a solution containing 0.1% SDS, 0.7% skimmed milk powder and 6X SSC, followed by washes at room temperature. room temperature in 2X SSC - 0.1% SDS and at 65 ° C in 0.2X SSC - 0.1% SDS.
  • the invention also relates to DNA or RNA fragments whose nucleotide sequence is identical, complementary, antisense, or equivalent to any one of the following sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, and especially DNA or RNA fragments, for any suite of contiguous monomers, at least 50%, preferably at least 60%, or at least 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, or 95% homology with any of said sequences.
  • nucleotide sequence is meant at least one strand of DNA or its complementary strand, either an RNA strand or its antisense strand or their corresponding complementary DNAs.
  • the DNA sequence as represented in one of the sequences SEQ ID NOs: 1 -3 corresponds to the sequence of the messenger RNA, it being understood that the thymine (T) in the DNA is replaced by the uracil (U). in RNA.
  • two nucleotide sequences are said to be equivalent to one another, because of the natural variability, in particular spontaneous mutation of the species from which they have been identified, or induced, as well as homologous sequences, the homology being defined below.
  • variability is meant any modification, spontaneous or induced of a sequence, in particular by substitution, and / or insertion and / or deletion of nucleotides and / or nucleotide fragments, and / or extension and / or shortening of the sequence to at least one of the extremities, or a non-natural variability that may result from the genetic engineering techniques used.
  • This variability can result in modifications of any starting sequence, considered as a reference, and which can be expressed by a degree of homology with respect to said reference sequence.
  • Homology characterizes the degree of identity of two nucleotide fragments (or peptides) compared; it is measured by the percentage of identity that is particularly determined by direct comparison of nucleotide (or peptide) sequences, relative to reference nucleotide (or peptide) sequences.
  • the subject of the invention is also proteins, called TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, having an apparent molecular mass of approximately 85 kDa for the TcoTS-like 1 protein, of approximately 76 kDa. for the TcoTS-like 2 protein, and about 78 kDa for the TcoTS-like 3 protein, and recognized by anti-anti-African Trypanosomes, as well as their antigenic peptide fragments or an immunological equivalent of these proteins or fragments.
  • the amino acid sequences of these proteins are shown in SEQ ID Nos. 4-6 and also include protein sequences homologous to at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or at least 95%. %.
  • the proteins newly characterized by the Applicant have in C-terminal a conserved lectin portion intended to allow the attachment on sialic acids of infected animals and N-terminal a catalytic part having a similarity with that of trans-sialidases enzymes and have therefore been designated by the Applicant trans-sialidases-like.
  • immunological equivalent any polypeptide or peptide capable of being immunologically recognized by the antibodies directed against said TcoTS-like proteins 1, 2, and 3.
  • the invention also relates to any fragment of the TcoTS-like 1, 2, and 3 proteins, and more particularly any antigenic peptide fragment specifically recognized by antisera anti-African trypanosomes.
  • proteins and said protein fragments according to the invention may comprise modifications, in particular chemical modifications, which do not alter their immunogenicity.
  • the present invention therefore also relates to one or more peptides, the amino acid sequence of which corresponds to a part of the TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and / or TcoTS-like 3 protein sequence, and which are present alone or in mixtures reactivity with all sera from non-human and / or human animals infected with African trypanosomes.
  • Peptides can be obtained by chemical synthesis, lysis of TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins, or by genetic recombination techniques.
  • the latter relates to a functional expression cassette, in particular in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, allowing the expression of DNA coding for all or a fragment of the proteins.
  • TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 as previously described.
  • a DNA fragment as defined above and placed under the control of the elements necessary for its expression. Said protein or protein fragment thus expressed is recognized by antisera ant-trypanosomes African.
  • any cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism may be used in the context of the present invention.
  • Such cells are known to those skilled in the art.
  • a eukaryotic organism such as cells derived from a mammal, in particular CHO (Chinese Hamster Ovarian) cells; insect cells; cells derived from a fungus, in particular a unicellular fungus or a yeast, in particular from the Pichia, Saccharomyces and Schizosaccharomyces strains, and very particularly selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae,
  • E coli Escherichia coli strain
  • enterobacterial cells may be used, but not limited to.
  • the cell may be wild type or mutant.
  • the mutations are described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • an E. coli cell such as for example BL21 (DE3), is used.
  • the expression cassette of the invention is intended for the production of TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins or fragments of these proteins, for example in E. coli, which are recognized by antisera. anti-African trypanosomes. Such antisera come from animals having acquired a recent or old infection by trypanosome species, T. congolense, T. brucei, T. evansi and / or T. vivax, and contain immunoglobulins specifically recognizing TcoTS-like proteins. TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3.
  • TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins can be recognized by other antibodies, for example monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunization of various species with the aforementioned natural protein, the recombinant protein, their fragments or peptides.
  • TcoTS-like 1 proteins, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, or fragment is meant the antigen or antigenic fragment of natural African Trypanosomes, belonging to the species T. congolense, T. brucei, T. evansi and / or T. vivax, produced in particular by the genetic recombination techniques described in the present application, or any fragment or mutant of this antigen provided that it is immunologically reactive with antibodies directed against TcoTS-like 1 proteins, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 of these parasites.
  • said proteins have an amino acid sequence having a degree of homology of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or minus 95% with respect to the sequences SEQ ID Nos: 4-6.
  • an equivalent can be obtained by deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids of the native or recombinant protein. It is within the abilities of those skilled in the art to make these modifications by known techniques without affecting the immunological recognition.
  • the TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins can be modified in vitro, in particular by deletion or addition of chemical groups, such as phosphates, sugars or myristic acids, in order to improve its stability or the presentation of one or more epitopes.
  • chemical groups such as phosphates, sugars or myristic acids
  • the expression cassette according to the invention allows the production of TcoTS TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, or an antigenic fragment of these proteins, having the amino acid sequences as specified. previously, and fragments of said proteins, may be advantageously fused to an exogenous element that may aid its stability, purification, production or recognition.
  • an exogenous element that may aid its stability, purification, production or recognition.
  • the choice of such an exogenous element is within the reach of those skilled in the art. It may especially be a hapten, or an exogenous peptide.
  • the expression cassette according to the invention comprises the elements necessary for the expression of said DNA fragment in the cell in question.
  • elements necessary for the expression is meant all the elements which allow the transcription of the DNA fragment into messenger RNA (mRNA), such as promoter sequences (for example the CMV promoter) and transcription terminator. , as well as elements allowing the translation of the latter into protein.
  • mRNA messenger RNA
  • promoter sequences for example the CMV promoter
  • transcription terminator for example the CMV promoter
  • the present invention extends to a vector comprising an expression cassette according to the invention. It may also be a plasmid vector with autonomous replication and in particular a multiplier vector. It may be a viral vector and in particular a vector derived from a baculovirus, more particularly intended for expression in insect cells, or a vector derived from an adenovirus for expression in the cells. mammalian cells.
  • the present invention also relates to a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, comprising an expression cassette, either in an integrated form in the cellular genome or inserted into a vector.
  • the present invention further relates to a process for preparing one or more proteins selected from TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, or from antigenic fragments of said protein, according to which: (i) a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, including the expression cassette according to the invention; and (ii) recovering the expressed protein from the above organism.
  • the invention relates to monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunological reaction of a non-human animal organism to an immunogenic agent consisting of one or more TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins. , natural or recombinant, and / or their antigenic peptide fragments, as defined above.
  • the polyclonal antibodies according to the present invention can be generated using the TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 (SEQ ID Nos: 4-6) proteins, which are injected into rabbits in order to immunize them as described in Example 2.
  • polyclonal rabbit sera which have been designated respectively anti-peptide 1 antibody, anti-peptide 2 antibody and anti-peptide 3 antibodies, are also part of the present invention since they exhibit a reactivity against their peptide of the invention by indirect ELISA.
  • the subject of the present invention is an active immunotherapeutic composition, especially a vaccine preparation which comprises one or more TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and natural TcoTS-like 3, recombinant proteins and / or their fragments. antigenic peptides, and / or a mixture of one or more TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3 proteins, and / or a mixture of one or more peptide fragments as defined above and optionally an excipient and / or a suitable adjuvant.
  • the vaccine or veterinary compositions according to the invention are intended for the treatment and / or prevention of infection by African trypanosomes in humans and / or non-human animals, particularly against infections with T. congolense, T. brucei, T. evansi and / or T. vivax.
  • African trypanosomiasis result in syndromes of varying severity, ranging from acute lethal infection in 3-4 weeks to chronic infection for months to years.
  • the chronic course characterized by intermittent parasitaemia, is most common in cattle.
  • the disease begins with a hyperthermia phase, then two to three weeks after the infective bite, the number of red blood cells, hemoglobin and hematocrit fall, reflecting anemia, which is the major symptom of trypanosomosis.
  • Chronically infected animals have reduced food consumption, become cachectic, slow growth, and negative reproductive effects.
  • Anemia of trypanosomoses is established in two phases. During the initial phase, anemia is accompanied by parasitaemia and results mainly from extra haemolysis.
  • Vascular Red blood cells are destroyed by the phagocytic system in the spleen, liver, circulation and bone marrow. In the long run, anemia results in a dysfunction of the bone marrow.
  • Said vaccine compositions may be in the form of antigenic vaccine and then comprise a therapeutically effective amount of one or more TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and natural TcoTS-like 3, recombinant proteins, and / or their peptide fragments. antigenic as previously described.
  • the vaccine compositions may be in the form of DNA vaccines and may then comprise an expression cassette, a vector, a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism as defined above, capable of expressing one or more TcoTS-like proteins. 1, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, and / or their antigenic peptide fragments, and / or a combination thereof.
  • the DNA vaccines may contain DNA or RNA, modified nucleotide sequences, and preferably one or more expression vectors encoding an antigenic peptide or fragment under the control of a eukaryotic promoter sequence.
  • the vaccines according to the present invention may be monovalent vaccines comprising a therapeutically effective amount of one or more TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, and natural TcoTS-like 3, recombinant proteins, and / or their antigenic peptide fragments, such as previously described and / or nucleotide sequences coding for these peptides or peptide fragments.
  • This monovalent vaccine prevents infestation and thus the expression of the disease.
  • anti-disease vaccine does not prevent the infestation but only the expression of the disease, it could be called “anti-disease” vaccine.
  • the use of multivalent vaccines combining the so-called “anti-disease” vaccine with antigens of other trypanosomes and / or Other therapeutic active agents and / or other vaccines commonly used for prophylaxis are particularly advantageous according to the present invention.
  • the vaccines according to the present invention may be monovalent vaccines combining one or more natural, recombinant proteins and / or peptide fragments and / or nucleotide sequence coding for said peptides and peptide fragments of one or more species of trypanosomes, and of preferably derived from one or more species similar or different from trypanosomes.
  • trans-sialidases examples include trans-sialidases of T. cruzi, T. congolense, T. vivax, T. evansi, T. brucei, T. rhodesiense. , and / or T. gambiense. Some trans-sialidases of T.
  • T. cruzi trans-sialidase chains A and B as deposited in GenBank under the numbers Gl: 29726491, Gl: 29726490, Gl: 29726489 and Gl: 29726488. It is also advantageous to use inactive mutated forms of transialidases. In this respect, mention may be made of the T. cruzi mutant trans-sialidases described, for example, in International Application WO2007 / 107488, which have conserved less than 20% of their sialidase and transferase enzymatic activity.
  • tubulin alpha T. brucei (deposited in GenBank accession number AAA30262.1), or tubulin beta (deposited in GenBank accession number AAA30261). .1), T. brucei epsilon tubulin (deposited in GenBank under accession number EAN77544.1), T. brucei epsilon tubulin TREU927 (referenced in NCBI under the numbers XP_822372.1 and XP_829157.1), T. brucei delta tubulin (deposited in GenBank under accession number EAN80045.1), T. brucei zeta tubulin (referenced in NCBI under the number XP 001218818.1), or T. brucei tubulins which are described in the international application WO 2008/134643.
  • flagellar proteins derived from trypanosomes mention may be made of the T. brucei flagellar protein as described in international application WO2002 / 19960, or the T. congolense flagellar protein described in the applicant's French application November 13, 2009 under the number FR09 / 58035. Mention may also be made of the T. brucei TREU927 flagellar protein or the flagella-like proteins (referenced in NCBI under the numbers XP 847376.1; XP_847374.1; XP_847295.1; XP_843961 .1; XP_847377.1), the TB-flagellar protein 44A from T.
  • T. brucei (deposited in GenBank accession number AAZ13310.1), the T. brucei flagellar protein TB-24 (deposited in GenBank accession number AAZ13308.1), the flagellar protein of T. brucei filed in GenBank under accession number AAZ1331 1 .1.
  • proteases examples include trypanosome cysteine proteases, such as T. congolense congopaine or trypanopaine-Tc, rhodesiense rhodesaine, chagasine or T. cruzi cruzipaine.
  • Vaccines according to the present invention may also include adjuvants to increase the antigenic response.
  • adjuvants are well known in the state of the art.
  • adjuvants mention may be made of vitamin E, gels or aluminum salts, such as aluminum hydroxide, aluminum phosphates, metal salts, saponins, polymers of aluminum, polyacrylic acid, such as carbopols®, non-ionic block polymers, fatty acid amines, such as avridine and DDA, dextran-based polymers, such as dextran sulfate, and DEAE dextran liposomes, bacterial immunogens, such as LPS, peptidoglycans, or CDMs.
  • vitamin E gels or aluminum salts, such as aluminum hydroxide, aluminum phosphates, metal salts, saponins, polymers of aluminum, polyacrylic acid, such as carbopols®, non-ionic block polymers, fatty acid amines, such as avridine and
  • Non-human animals that can be treated include, for example, cattle, ovids, felids, suids, camelids, and / or canines.
  • the vaccines may comprise a therapeutically effective amount of a monoclonal or polyclonal antibody as described below.
  • the multivalent vaccines according to the present invention may further contain antigens from other blood parasitoses derived for example from protozoa such as Theirera parva, Babesia bigemina, and B. divergens, T. annulata, for the treatment and / or prevention of trypanosomes. and theileriosis, anaplasmosis, and / or babesiosis.
  • the vaccines according to the present invention are particularly useful for treating and / or preventing trypanosomosis-induced pathogenesis, such as, in particular, anemia, deterioration of the general state, weight loss, and / or immunosuppression of men or women. non-human animals.
  • Monovalent or multivalent vaccines may also be administered in combination with anti-parasitic agents, anti-infective agents, and / or anti-symptomatic agents.
  • the antiparasitic agents are, for example, trypanocides, such as diamidine (pentamidine or pentamidine mesilate, diminazene or diminazene aceturate), arsenical derivatives such as melarsoprol®, melarsomine, eflornithine or DMFO, arsobal, MelBdm nitrofuran derivatives such as nifurtimox or 5-nitrofuran, ornithine analogues (eflornithine® or difluoromethylornithine), phenanthridrin (isometamidium or homidium®), a polysulfone naphthaea such as suramin®, an antimalinic such as quinapyramine, buthionine sulfoximine (BSO), azaserine, 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), and / or acivicin.
  • vaccines When vaccines are administered in combination with antiparasitics, these are preferably administered before and / or simultaneously and / or after the mono or multivalent vaccines previously described.
  • Other non-specific trypanosome antiparasitics are well known in the art, and are administered before and / or simultaneously and / or after the vaccines according to the invention. These include avermectins (ivermectin, abamectin, doramectin, eprinomectin and selamectin), pyrethrins (deltamethrin, etc.), and / or anthelmintic antiparasitics (oxybendazole, piperazine, flubendazole).
  • antibiotics such as ⁇ -lactams, fosfomycin, glycopeptides or polypeptides with antibiotic activity, bacitracin, aminoglycosides, macrolides, lincosamides, streptogramins , tetracyclines, phenicolis, fusidanides, or quinolones.
  • Anti-symptomatic agents are for example anti-anemic agents, such as iron, vitamin B12, folic acid, levofolinate calcium; hepatoprotective agents, such as flavonoids complexes (sylymarin silybin, etc.), turmeric, desmodium ascendens, and / or chrysanthellum Americanum (charcoal).
  • anti-anemic agents such as iron, vitamin B12, folic acid, levofolinate calcium
  • hepatoprotective agents such as flavonoids complexes (sylymarin silybin, etc.), turmeric, desmodium ascendens, and / or chrysanthellum Americanum (charcoal).
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs can be, among others, oxicams (meloxicam, piroxicam, and / or tenoxicam), salicylated derivatives (methyl salicylate and lysine acetylate), 2-arylpropionic acids (profenes), derivatives thereof. indolic sulfonamides, selective cox-2 NSAIDs (celecoxib, etoricoxib, etc.), phenylbutazone, niflumic acid, and / or phenamic acids.
  • oxicams meloxicam, piroxicam, and / or tenoxicam
  • salicylated derivatives methyl salicylate and lysine acetylate
  • 2-arylpropionic acids profenes
  • indolic sulfonamides selective cox-2 NSAIDs (celecoxib, etoricoxib, etc.)
  • phenylbutazone niflumic acid,
  • the subject of the present invention is probes or primers specific for African Trypanosomes, and their uses in diagnostic tests.
  • probe refers to DNA or RNA comprising at least one strand having a nucleotide sequence allowing hybridization to nucleic acids having at least one nucleotide sequence as represented in the SEQ sequences ID Nos: 1 -3, or a complementary sequence, or antisense, or equivalent to said sequence, and in particular a sequence having, 5 to 100 contiguous nucleotides, at least 50%, preferably at least 60%, or at least 85% homology to the sequences SEQ ID Nos: 1 -3, or to a synthetic oligonucleotide allowing such hybridization, unmodified or comprising one or more modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine , dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base.
  • modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine , dimethylamino-5-
  • these probes can be modified at the level of the sugar, namely the replacement of at least one deoxyribose with a polyamide or at the level of the phosphate group, for example its replacement by esters, especially chosen from diphosphate, dialkyl and arylphosphonate and phosphorothioate esters.
  • the probes can be much shorter than the sequences identified in the sequences SEQ ID Nos: 1 -3.
  • such probes comprise at least 5 nucleotides, advantageously between 5 and 50 nucleotides, preferably around 20 nucleotides possessing hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with the DNA or the nucleotide.
  • the probes according to the invention can be used for diagnostic purposes, as a capture and / or detection probe.
  • the primers according to the invention comprise a sequence of 5 to 30 monomers chosen from the sequences SEQ ID Nos: 1 -3, and have a specificity of hybridization under predetermined conditions, for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction), in an elongation method such as sequencing, in a reverse transcription method or the like.
  • an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction)
  • elongation method such as sequencing
  • reverse transcription method or the like.
  • the present invention relates to a reagent for the detection and / or monitoring and a method and kits for the diagnosis of infections with African trypanosomes, including T. congolense, T. brucei, T. evansi and / or T. vivax.
  • the reagents for the detection or trypanosome diagnostic kits comprise as reactive substance at least one monoclonal or polyclonal antibody as described above.
  • the reagents for the detection or diagnostic kit of trypanosomes may comprise a probe and / or a primer as defined above, for detecting and / or identifying African trypanosomes in a biological sample, in particular a capture probe and a probe. detection, one and / or the other as defined above.
  • the above reagent can be attached directly or indirectly to a suitable solid support.
  • the solid support may be in particular in the form of a cone, a tube, a well, a ball, or the like.
  • the term "solid support” as used herein includes all materials on which a reagent may be immobilized for use in diagnostic tests.
  • Natural, synthetic, chemically modified or non-chemically modified materials can be used as solid supports, especially polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose; polymers such as vinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylate or copolymers such as polymers of vinyl chloride and propylene, polymers of vinyl chloride and vinyl acetate, styrene-based copolymers, natural fibers such as cotton and synthetic fibers such as nylon.
  • polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose
  • polymers such as vinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylate or copolymers such as polymers of vinyl chloride and propylene, polymers of vinyl chloride and vinyl acetate, styrene-based copolymers, natural fibers such as cotton and synthetic fibers such as nylon.
  • the attachment of the reagent to the solid support can be carried out directly or indirectly.
  • two approaches are possible: either by adsorption of the reagent on the solid support, that is to say by non-covalent bonds (mainly of hydrogen, Van der Walls or ionic type), or by establishment of covalent bonds between the reagent and the support.
  • an anti-TcoTS-like antibody 1, 2 and 3 provided that it is immunologically reactive with a part of the protein different from that involved in the antibody recognition reaction of the antibodies.
  • a ligand-receptor system for example by grafting on proteins TcoTS-like 1, 2, and 3 a molecule such as a vitamin, and immobilizing on the solid phase the corresponding receptor (for example the biotin-streptavidin system).
  • indirect means is also meant the prior grafting or fusion by genetic recombination of a protein, or a fragment thereof, or of a polypeptide, at one end of the TcoTS-like 1 proteins, TcoTS-like 2, and TcoTS-like 3, and the immobilization of the latter on the solid support by passive adsorption or covalence of the grafted or fused protein or polypeptide.
  • the capture probes can be immobilized on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or passive adsorption.
  • the detection probes are labeled with a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes chosen in particular from peroxidase and alkaline phosphatase, and those capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorogenic or luminescent substrate, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorogenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and biotin.
  • the probes of the present invention used for diagnostic purposes can be implemented in all known hybridization techniques, and in particular the so-called “Dot-Blot”, Southern blot, and Northern Blot techniques, which is a technique identical to the Southern blot technique but uses RNA as a target, the sandwich technique.
  • the method for detecting and / or monitoring an infection with African trypanosomes in a biological sample is to in contact with said sample and a reagent as defined above, in conditions permitting a possible immunological reaction, and then detecting the presence of an immune complex with said reagent.
  • the method of detection by the ELISA technique in one or more steps, which consists in reacting a first monoclonal or polyclonal antibody specific for a desired antigen, fixed on a solid support, with the sample, and to highlight the possible presence of an immune complex thus formed by a second antibody labeled with any suitable marker known to those skilled in the art, including a radioactive isotope, an enzyme, for example peroxidase or phosphatase alkaline or the like; by the so-called competition techniques well known to those skilled in the art.
  • the method for the selective detection of African trypanosomes in a biological sample, and the diagnosis of trypanosomoses consists in taking a blood sample, exposing the DNA extracted from the sample and optionally denatured to at least one probe as defined above. and hybridization of said probe is detected.
  • the subject of the present invention is a kit for veterinary use for the diagnosis of trypanosomiasis in a biological sample comprising a probe or a primer as described above, or an antibody as previously described, as well as a reagent for detection of an immunological reaction.
  • kits according to the present invention comprise at least one compartment for a possibly sterile packaging comprising a therapeutically effective amount of a reagent as described above, as well as an instruction sheet concerning the protocol for implementing the veterinary diagnosis according to the invention. 'invention.
  • the subject of the present invention is the sequences related to trans-sialidases-like in T. congolense. More specifically, eleven genes encoding sialidase-related sequences have been characterized and classified into 5 subfamilies according to their sequence homologies (FIGS. 8A and 8B):
  • the first subfamily Trans-sialidases-like comprises the 3 previously described genes designated TcoTS-like 1, 2, and 3, which have 17 to 24% identity with each other ( Figures 1 to 6).
  • the second subfamily has been named subfamily A and comprises three genes designated A1, A2, and A3 and whose nucleotide sequences are given respectively in SEQ ID Nos: 7, 8, and 9.
  • the genes A1, A2, and A3 have 94 to 97% identity with each other ( Figures 9 to 1 1) and encode respectively three proteins TcoTS-A1, TcoTS-A2, and TcoTS-A3, whose amino acid sequences are provided respectively in SEQ IDs. Nos .: 15, 16, and 17 ( Figures 17-19).
  • the third subfamily designated B comprises two genes designated hereinafter B1 and B2, whose nucleotide sequences are respectively given in SEQ ID Nos: 10 and 11, and which have 76% identity with each other (FIGS. 12 and 13). ).
  • Both genes B1 and B2 encode trans-sialidases TcoTS-B1 and TcoTS-B2 whose peptide sequences are shown in SEQ ID Nos: 18 and 19 (FIGS. 20 and 21).
  • the fourth subfamily designated C comprises a single gene designated C, whose nucleotide sequence is represented in SEQ ID NO: 12 (FIG. 14), and which encodes the TcoTS-C protein whose peptide sequence is provided in SEQ. ID NO: 20 ( Figure 22).
  • subfamily D comprises two genes named D1 and D2, whose nucleotide sequences are provided in SEQ ID Nos: 13 and 14 ( Figures 15 and 16). These two genes D1 and D2 have indeed 96% identity between them. They encode the TcoTS-D1 and TcoTS-D2 proteins whose amino acid sequences are provided in SEQ ID Nos. 21 and 22 (FIGS. 23 and 24).
  • the subject of the present invention is therefore new nucleotide sequences coding for new trans-sialidase-like proteins called TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS.
  • This novel DNA or RNA molecule comprises at least one strand comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NOs: 7-14, a complementary sequence, antisense, or equivalent to one of the sequences SEQ ID Nos: 7-14, and in particular a sequence comprising an identity of at least 70%, with one of the sequences SEQ ID NOs: 7-14, or a sequence having, on a sequence of 100 contiguous nucleotides, at least 50%, preferably at least 60%, or at least 70%, or at least 80% homology with said sequences, or a nucleotide sequence capable of hybridizing with one of the sequences SEQ ID NOs: 7-14 in stringen conditions Hybridization tests, as defined above.
  • the invention also relates to DNA or RNA fragments whose nucleotide sequence is identical, complementary, antisense, or equivalent to any one of the SEQ ID NOs: 7-14 sequences, and in particular the fragments of DNA or RNA, for any sequence of contiguous monomers, at least 50%, preferably at least 60%, or at least 85% homology with any one of said sequences.
  • the invention relates to the so-called TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2 proteins, as well as the peptide sequences. of these proteins as represented respectively in the sequences SEQ ID Nos: 15-22, and any amino acid sequences having a homology of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or from minus 95% with the peptide sequences SEQ ID Nos: 15-22.
  • the invention also relates to all antigenic peptide fragments of TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2 proteins, specifically recognized by antisera. anti-African trypanosomes, as well as all immunological functional equivalents of these proteins which may be immunologically recognized by the antibodies directed against TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C proteins, TcoTS-D1, and TcoTS-D2 of the present invention.
  • the proteins and said antigenic peptide fragments according to the invention may comprise modifications, in particular chemical modifications, which do not alter their immunogenicity.
  • a peptide antigenic fragment according to the present invention may be the peptide PKNIKGSWHRDRLQLWLTD (SEQ ID NO: 24) belonging to the TcoTS-B1 protein or peptides homologous to at least 70%, 75%, 80%, 85%. %, 90%, or at least 95% with said fragment.
  • the present invention further relates to the combination or a mixture of one or more proteins selected from TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS -B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2, and / or one or more antigenic peptide fragments of these proteins, and / or one or more immunological functional equivalents of these proteins.
  • These techniques for producing proteins, fragments, functional equivalents, and combinations are performed by chemical synthesis, lysis of proteins, or by genetic recombination techniques. They are well known to those skilled in the art, and have been described above.
  • the invention relates to monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunological reaction of a non-human animal organism to an agent.
  • immunogen consisting of one or more TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2 natural or recombinant proteins and their peptide fragments as previously described.
  • a vaccine composition comprising a mixture of one or more proteins selected from TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS -B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2, and / or one or more antigenic peptide fragments of these proteins, and / or one or more immunological functional equivalents of these proteins and / or a combination of said proteins, fragments or functional equivalents.
  • TbTS gene family (AF310231.1) in T. brucei. It describes, in particular, a truncated version of the TbTS gene, namely TbTSsh, the genes B and C coding for TbSA B and TbSA C transialidases of T. brucei, and finally the genes D1, D2 and E coding for trans-sialidases. like T. brucei.
  • TbTSsh a truncated version of the TbTS gene
  • the genes B and C coding for TbSA B and TbSA C transialidases of T. brucei and finally the genes D1, D2 and E coding for trans-sialidases.
  • T. brucei The identity percentages between the sequences identified in T. congolense and T. brucei are presented in Figure 26. Montagna et al.
  • trans-sialidases are expressed in vivo in insect or procyclic forms, and probably play an important role in the transfer of sialic acid to the parasite membrane, thus ensuring parasite protection and survival when transported by insect vectors.
  • Montagna et al. does not describe the possibility of detecting these trans-sialidases in sufficient quantities in the blood forms of the parasites, that is to say in the infected animals and thus to use them as vaccines or diagnoses.
  • the Applicant has furthermore demonstrated during the immunization protection experiment on murine models (Example 5, FIGS. 29A and 29B) that the TcoTS-A1, TcoTS-B1 and TS-like 2 antigenic proteins made it possible to obtain a protective effect. higher in terms of average survival of animals as well as in relation to hematocrit. This protection can even be total (absence of development of parasitaemia and normal hematocrit) in some cases: 3 mice out of 12 in the case of TcoTS-like2 and 1 out of 9 in the case of TcoTS-B1.
  • the present invention relates to vaccine or veterinary compositions for the treatment and / or prevention of infection with African trypanosomes in a non-human animal, particularly against T. congolense, T. brucei infections. , T. evansi and / or T. vivax.
  • These veterinary vaccine compositions may be in the form of antigenic vaccine and then comprise a therapeutically effective amount of one or more proteins selected from TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2.
  • said vaccine or veterinary compositions comprise at least one protein selected from TcoTS-A1, TcoTS-B1, and TcoTS-like 2. Even more preferably, said vaccine or veterinary compositions comprise at least TcoTS-like protein. 2, and / or an antigenic peptide fragment, and / or an immunological functional equivalent of TcoTS-like 2.
  • the vaccine compositions may comprise a therapeutically effective amount of a monoclonal or polyclonal antibody directed against one or more proteins selected from TcoTS. -like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2.
  • TcoTS monoclonal or polyclonal antibody directed against one or more proteins selected from TcoTS.
  • TcoTS TcoTS-like 1
  • TcoTS-like 3 TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2.
  • trypanosomosis-induced pathogenesis such as, in particular, anemia, general state deterioration, weight loss, and / or immunosuppression in non-human animals.
  • the present invention relates to a reagent for detection and / or monitoring and a method and kits for the diagnosis of infections with African trypanosomes, including T. congolense, T. brucei, T. evansi and / or T. vivax.
  • the detection reagents or trypanosome diagnostic kits comprise as reactive substance at least one monoclonal or polyclonal antibody directed against one or more TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS proteins. -C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2.
  • the reagents for the detection or trypanosome diagnostic kits comprise as reactive substance at least one monoclonal or polyclonal antibody directed against one or more proteins selected from TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, and TcoTS- like 2.
  • the method for detecting and / or monitoring an infection with African trypanosomes in a biological sample is to contacting said sample and a reagent as defined above, under conditions allowing a possible immunological reaction, and then detecting the presence of an immune complex with said reagent.
  • the method of detection by the ELISA technique in one or more steps, which consists in reacting a first monoclonal or polyclonal antibody specific for a desired antigen, fixed on a solid support, with the sample, and to highlight the possible presence of an immune complex thus formed by a second antibody labeled with any suitable marker known to those skilled in the art, including a radioactive isotope, an enzyme, for example peroxidase or phosphatase alkaline or the like; by the so-called competition techniques well known to those skilled in the art.
  • kits for veterinary use for the diagnosis of trypanosomosis in a biological sample comprising an antibody as described above and a reagent for the detection of an immunological reaction.
  • kits according to the present invention comprise at least one compartment for a possibly sterile packaging comprising a therapeutically effective amount of a reagent as described above, as well as an instruction sheet concerning the protocol for implementing the veterinary diagnosis according to the invention. 'invention.
  • TcoTS-A1 protein was produced in the yeast Pichia pastoris.
  • the X33 strain was transformed by the PICZ vector (Invitrogen) containing the coding sequence for the TcoTS-A1 protein lacking its first 29 amino acids.
  • Protein secreted into the culture supernatant after 4 days of induction of methanol expression was purified by successive ion exchange chromatography. First, the culture supernatant was dialyzed against 20mM NaAc buffer pH4.5 for 16 hours, centrifuged for 30 minutes at 10000g, and then chromatographed on 1 HP HiTrap SP HP column (GE Healthcare).
  • This purified recombinant protein was then used to immunize Balb-c mice or rabbits. 20 g of recombinant protein were injected into the mice at 4 times spaced 15 days or 100 g of recombinant protein were injected into the rabbits at a rate of 4 times spaced 15 days. For the first injection the recombinant protein was mixed as an emulsion with complete Freund's adjuvant and then for subsequent injections with incomplete Freund's adjuvant. The serum of the immunized animals was collected at the end of the experiment (anti-TcoTS-A1 serum) and its reactivity against the recombinant protein was verified by indirect ELISA test.
  • Example 2 Production of polyclonal antibodies against peptides derived from sequences related to sialidases.
  • C-RTSIDYHLIDTVAKYSADDG SEQ ID NO: 23
  • C-PKNIKGSWHRDRLQLWLTD SEQ ID NO: 24
  • C-PVSAQGQDHRYEAANAEHT SEQ ID NO: 25
  • peptides 1, 2 and 3 were coupled through cysteine Nter to a carrier protein (KLH) activated by a maleimide function and used to immunize rabbits at 5 injections of 100 g spaced 20 days.
  • KLH carrier protein
  • the recombinant protein was mixed as an emulsion with complete Freund's adjuvant and then for subsequent injections with incomplete Freund's adjuvant.
  • the polyclonal sera obtained were designated respectively as anti-peptide 1, anti-peptide 2, and anti-peptide 3 antibodies, were harvested at the end of the experiment and checked for their reactivity against their respective peptide by indirect ELISA.
  • the IgGs were then incubated for 2 hours at room temperature with BrCN-activated Sepharose (Sigma) previously prepared according to the supplier's recommendations. After centrifugation for 1 minute at 1000 g, the resin was washed with the previous buffer and then saturated by adding Tris-HCl 0.1 M pH8 for 2 hours at room temperature. After centrifugation for 1 minute at 1000 g, the resin was washed successively with Tris-HCl buffer pH8 0.5M NaCl and then 0.1 M NaCl pHM NaCl 0.5M buffer.
  • the resin thus ready for use for an immunoprecipitation experiment was equilibrated with OLB buffer (100 mM KCl, 17% glycerol, 1 mM MgCl 2 , 2.25 mM CaCl 2 0.5% NP40, 10 mM Tris -HCl pH8).
  • OLB buffer 100 mM KCl, 17% glycerol, 1 mM MgCl 2 , 2.25 mM CaCl 2 0.5% NP40, 10 mM Tris -HCl pH8.
  • 10 9 cell of the IL3000 strain were lysed in the OLB buffer for 1 hour at 4 ⁇ C and then centrifuged 10 minutes at 20,000 g. The supernatant was incubated with the resin previously prepared for 16 hours at 4 ° C. The resin was then centrifuged for 1 minute at 1000 g and then rinsed with OLB buffer The IgG-bound antigens were eluted with boiling SDS 2%.
  • the eluate was dialyzed against water and then freeze-dried
  • the gel was then stained with silver nitrate and the bands thus revealed were cut and analyzed by mass spectrometry using MSMS technology.
  • 109 cells of the IL3000 strain were lysed in 1 ml of hypotonic buffer (5 mM Na2HP04, 0.3 mM KH2P04) for 30 minutes at 4 ⁇ € then centrifuged 10 minutes at 20,000 g. The pellet was subjected to the same treatment 3 times in a row. The last pellet is taken up at 4 ° C. in 100 ⁇ l of this same hypotonic lysis buffer, to which 0.5 ml of the following buffer are then added: 2 mM EDTA, 15.4 mM NaOH, 0.2 mM dithiothreitol. After 10 minutes of incubation, the mixture is centrifuged for 10 minutes at 20000 g.
  • hypotonic buffer 5 mM Na2HP04, 0.3 mM KH2P04
  • the supernatant is recovered (soluble fraction) and the pellet (insoluble fraction) is taken up in 50 ⁇ l of water to which are then added 50 ⁇ l of 2% SDS.
  • mice 2 batches of Balb-c mice are injected intraperitoneally with 20 g of BSA (negative control mouse lot) or with a TcoTS-like 1 recombinant protein (batch of immunized mice) at a rate of 4 times spaced 15 days apart. Then, the mice are infected with 10 4 parasites of the T. congolense strain IL3000. Hematocrit and parasitaemia are measured every 2 days on both lots of mice.
  • the average hematocrit over the duration of the parasitaemia was calculated: it is 43.311, 2% for the mice immunized with TcoTS-like2 and 37.0 + 0.7% for the control mice immunized with BSA ( Figure 28)
  • mice survival was also determined, it is 453 + 81 hours for the TcoTS-like2 immunized mice and 267 + 23 hours for the BSA immunized control mice.
  • mice 2 batches of Balb-c mice are injected intraperitoneally with 20 g of BSA (batch of negative control mice) or with the recombinant protein TcoTS-like 3 (batch of immunized mice) at a rate of 4 times spaced 15 days. Then, the mice are infected with 10 4 parasites of the T. congolense strain IL3000. Hematocrit and parasitaemia are measured every 2 days on both lots of mice.
  • Example 5.4 TocTS-A1 vaccination trials
  • mice were injected intraperitoneally with 20 g of BSA (8 negative control mice) or TcoTS-A1 recombinant protein (5 mice) at a rate of 4 times spaced 15 days apart. Then, the mice were infected with 10 4 parasites of the T. congolense strain IL3000. Hematocrit and parasitaemia were measured every 2 days.
  • the average hematocrit over the duration of the parasitaemia was calculated: it is 41.4% for the TcoTS-A1 immunized mice and 37.0 ⁇ 0.7% for the immunized mice. of the BSA ( Figure 28)
  • mice survival was also determined, it is 299 ⁇ 14 hours for the TcoTS-A1 immunized mice and 267 ⁇ 23 hours for the BSA immunized control mice.
  • mice were injected intraperitoneally with 20 g of BSA (8 negative control mice) or TcoTS-B1 recombinant protein (4 mice) 4 times spaced 15 days apart. Then, the mice were infected with 10 4 parasites of the strain IL3000 from T. congolense. Hematocrit and parasitaemia were measured every 2 days.
  • the average hematocrit over the duration of the parasitaemia was calculated: it is 41.4 ⁇ 0.5% for the mice immunized with TcoTS-B1 and 37.0 ⁇ 0.7% for the control mice immunized with of the BSA ( Figure 28)
  • Example 5.6 Vaccination assays with one or more proteins selected from TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2.
  • mice 2 batches of Balb-c mice are injected intraperitoneally with 20 g of BSA (negative control mouse lot) or with one or more recombinant proteins selected from the TcoTS-A2 proteins, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS- C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2 (batch of immunized mice) at 4 times spaced 15 days. Then, the mice are infected with 10 4 parasites of the T. congolense strain IL3000. Hematocrit and parasitaemia are measured every 2 days on both lots of mice.
  • 2 batches of cattle are injected subcutaneously with one or more antigens such as TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2 , TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2, mixed with two types of additives Quil A (saponin) 1 mg / ml and Adjuphos (colloidal aluminum phosphate) volume to volume in a final volume of 1 mL or just with the mixture of adjuvants (control). 3 injections at 3-week intervals are carried out with respectively 100 ⁇ g, 50 ⁇ g and 25 ⁇ g of antigen (s).
  • antigens such as TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2 , TcoTS-C, TcoTS-D1, and
  • the animals are infected with T. congolense strain IL3000 3 weeks after the last injection at the rate of 1000 parasites per animal intradermally.
  • Daily blood samples are taken until all the animals are recognized as infected, the determination of the parasitemia being done on buffy-coat.
  • weekly blood samples are taken to monitor parasitaemia and anemia, the weight of the animals is monitored monthly. The kinetics of response to immunization and infection is followed by ELISA on the different immunizing antigens.
  • the antigens used in this immunization experiment may be TcoTS-like 1, 2 or 3 or TcoTS-A1 or TcoTS-B1, alone or in combination in any combination possible.
  • Example 7 Example of diagnostic tests on blood of infected animals.
  • This test is carried out by detection of circulating antigens such as TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, and TcoTS-like 2 by the sandwich ELISA method.
  • the capture of said antibody is adsorbed to the wells of a 96 well plate by incubation overnight at 4 ⁇ C of 1 to 10 .mu.g / ml capture antibody diluted in 100 ⁇ ⁇ - NaHC0 3 buffer 50 mM pH 9 6.
  • the plate is then emptied and then washed 3 times with 200 ⁇ l per well of a solution of PBS-Tween (3.2 mM Na 2 HPO 4, 0.5 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM KCl, 135 mM NaCl, pH 7, 4, 0.05% Tween 20). Then 100 ⁇ l of a blocking solution (PBS-Tween 0.2% gelatin) are added to each well and incubated for 30 minutes at room temperature. The plates are emptied then 100 ⁇ of sera of test animals are deposited in the wells and incubated for 2 hours at 37 ⁇ ⁇ . The plate is then emptied and then washed 3 times with 200 ⁇ l per well of a solution of PBS-Tween.
  • PBS-Tween 3.2 mM Na 2 HPO 4, 0.5 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM KCl, 135 mM NaCl, pH 7, 4, 0.05% Tween 20.
  • the capture antibody used may be either an immunopurified polyclonal serum against one or a mixture of T. congolense sialidase-like proteins, such as TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS -A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, and TcoTS-D2, or a monoclonal antibody recognizing an epitope present on one or more of these T. congolense sialidase-like proteins. .
  • the second antibody is a monoclonal antibody different from the capture antibody which recognizes an epitope different from one or more of the TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-2 sialidase-like proteins.

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Abstract

La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant pour des protéines trans-sialidase-like appartenant aux trypanosomes africains, et concerne l'utilisation desdits gènes et protéines à des fins vaccinale, thérapeutique et diagnostique. La présente invention concerne également l'immunisation des humains et/ou d'animaux non humains contre les trypanosomoses.

Description

VACCINS ET DIAGNOSTICS CONTRE LES TRYPANOSOMOSES
La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant pour des protéines trans-sialidase-like appartenant aux parasites trypanosomes africains, et concerne l'utilisation desdits gènes et protéines à des fins vaccinale, thérapeutique et diagnostique. La présente invention concerne également l'immunisation des animaux non humains et/ou des humains contre les trypanosomoses ou les trypanosomiases.
La trypanosomose ou trypanosomiase est causée par plusieurs espèces de protozoaires parasites du genre Trypanosoma et les trypanosomes africains désignent généralement les trypanosomes appartenant au groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas.
Seul le sous-genre Trypanozoon comporte, outre des espèces infectantes pour les animaux, deux espèces infectantes pour l'homme chez qui elles provoquent la maladie du sommeil. Les autres sous-genres comprennent des espèces qui infectent les animaux sauvages et domestiques et ne sont jamais infectantes pour l'homme mais peuvent avoir des répercussions indirectes importantes pour sa santé.
Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec un flagelle libre facultatif et un petit kinétoplaste en position subterminale (postérieur). Les espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi, et T. equiperdum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, et se distinguent par leurs caractères infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous- espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux). Ces deux dernières espèces débordent largement des régions à glossines et sont cosmopolites. Leur morphologie est semblable à celle de T. brucei mais elles sont monomorphes (formes longues uniquement).
Les trypanosomes appartenant au sous-genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin, avec l'extrémité postérieure arrondie et large, le corps se rétrécissant vers l'extrémité antérieure. Le kinétoplaste est volumineux, arrondi et en position terminale; la membrane ondulante peu développée, étroite, se termine en flagelle libre. T. vivax et T. uniforme, sont des espèces parasites des ruminants sauvages et domestiques. Ils peuvent être transmis par voie mécanique ou par les glossines, dont ils colonisent exclusivement la trompe et le proventricule.
Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont de petite taille (8 à 24 μηι), ils n'ont de flagelle libre à aucun stade de leur développement. Le kinétoplaste de taille moyenne se trouve en position subterminale ou marginale. L'extrémité postérieure est arrondie et la membrane ondulante étroite. La pathogénicité est importante pour le bétail, le porc et le chien en Afrique. Le développement chez la glossine prend place dans l'estomac et le proboscis exclusivement. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae. Ces trypanosomes sont de petite taille, avec extrémité postérieure arrondie, kinétoplaste en position marginale, membrane ondulante étroite.
Les ruminants domestiques en Afrique sont essentiellement infectés par trois espèces de trypanosomes pathogènes, T. congolense, T. vivax, ou T. brucei qui sont responsables de la pathologie Nagana. D'autres animaux sont infectés par une autre espèce de trypanosome pathogène, T. evansi, qui est responsable d'une pathologie dénommée Surra. Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui concerne l'infectivité, la virulence, la pathogénicité, la transmissibilité, et la sensibilité aux produits trypanocides.
T. congolense est l'agent principal de la trypanosomose bovine en Afrique, par sa fréquence et sa pathogénicité. Il s'adapte également à diverses espèces animales non humaines, et peut ainsi parasiter indifféremment les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés, et les canidés.
T. brucei et notamment la sous-espèce Trypanosoma brucei gambiense est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce Trypanosoma brucei brucei est un parasite des animaux domestiques et sauvages dans toute l'Afrique, mais elle n'est pas infectieuse pour l'homme en raison de l'effet lytique sur les formes sanguines de ces trypanosomes, de la protéine Apolipoprotéine L présente dans le sérum humain. La troisième sous-espèce est Trypanosoma brucei rhodesiense qui est l'agent de la maladie du sommeil dans sa forme aiguë en Afrique.
Egalement, la sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes en Afrique notamment pour les élevages des bovins et des buffles.
Enfin, T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés.
Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques. Ils présentent en général un corps fusiforme et possèdent un flagelle qui est relié au corps par une membrane ondulante. Ils se reproduisent de manière asexuée par fission binaire. Lors de l'infection, la glossine (glossina sp.) ou mouche tsé-tsé injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqûre, les formes métacycliques infectieuses présentes dans les pièces buccales. Les parasites se multiplient dans le derme au point de l'inoculation. Une réaction locale liée à la multiplication des parasites dans le derme se produit, et les parasites donnent naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines par exemple dans le cas de T. congolense. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, notamment les ganglions lymphatiques, ainsi que différents organes, tels le foie, la rate, le cœur, les reins, les testicules, et d'importantes lésions apparaissent alors. La glossine s'infecte et se nourrit sur les animaux parasités. Une fois infectée, elle reste infectieuse durant toute sa vie. Dans le cas de T. brucei et T. congolense, le trypanosome subit chez l'insecte un cycle complexe impliquant une dédifférenciation dans l'intestin en formes procycliques non-infectieuses. Dans les glandes salivaires, ou les pièces buccales, les trypanosomes se transforment en formes épimastigotes, adhérentes, qui se multiplient activement. Leur différenciation conduit au stade infectieux représenté par les formes métacycliques, qui ne se divisent plus.
Le cycle de T. vivax ne comporte pas de stade procyclique. Il débute par l'attachement flagellaire des formes sanguines ingérées par la glossine. Elles se différencient en formes épimastigotes, qui prolifèrent puis se différencient en formes métacycliques infectieuses. La durée totale du cycle chez la glossine est d'environ 5 à 10 jours pour T. vivax, 18 jours pour T. congolense, et 30 jours pour T. brucei.
Les sources d'infection des animaux domestiques sont les autres animaux domestiques ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. L'existence de réservoir provient du fait que certaines espèces sont peu réceptives à l'infection, et peu sensibles à la maladie.
Les vecteurs potentiels varient en fonction de l'espèce de trypanosome considérée. T. congolense et T. brucei sont exclusivement transmis par des vecteurs biologiques comme les mouches tsé-tsé, mais T. vivax peut être également transmis par des vecteurs mécaniques tels que les mouches piqueuses (tabanidés ou stomoxes). T. evansi est exclusivement transmis par des vecteurs mécaniques. L'efficacité de la transmission dépend du taux d'infection des glossines et des interactions hôte-vecteurs. De façon générale, les trypanosomes infectieux pour l'animal donnent des taux d'infection plus élevés que les trypanosomes infectant l'homme, ce qui contribue à la très large distribution de la trypanosomose animale. L'analyse des trypanosomes par microscopie électronique montre l'existence d'un manteau d'environ 15 nm recouvrant la totalité du corps cellulaire du parasite. Ce manteau est présent uniquement à la surface des formes sanguines et métacycliques. Il est essentiellement constitué d'une glycoprotéine appelée VSG (Antigène Variable de Surface) et d'autres protéines membranaires en faibles quantités. Les VSGs forment ainsi une structure très dense constituant une barrière physique entre la membrane plasmique et l'hôte. La structure 3D prédit que seule une faible partie de la protéine est exposée à la surface du parasite. Ainsi le principal rôle du manteau serait de masquer les antigènes membranaires non variables du parasite en présentant quelques motifs immunodominants aux défenses immunitaires de l'hôte. Le manteau protège par ailleurs les formes sanguines contre la lyse par activation de la voie alterne du complément.
La lutte contre la trypanosomose animale dépend du dépistage chez les animaux et du traitement sur la base de recouvrement des coûts. Les principaux composés chimiques utilisés pour le traitement des trypanosomoses sont : l'acéturate de diminazène, le bromure ou le chlorure d'homidium, le chlorure d'isométamidium, la quinapyramine, la suramine et la melarsomine. Toutefois aucune nouvelle molécule n'a été mise sur le marché depuis au moins trente ans, alors que l'on observe depuis quelques années une recrudescence de la maladie du fait de l'apparition de résistances aux trypanocides, de l'emploi extensif et parfois inapproprié de médicaments entraînant la sélection et l'amplification des résistances qui sont rapportées notamment dans toutes les régions de l'Afrique concernées par la maladie.
Résumé de l'invention
Le Demandeur a identifié et obtenu un nouveau matériel génétique codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-like 1 , 2, et 3, reconnues par des anti-sera anti-trypanosomes africains. Le matériel génétique peut être utilisé pour produire des protéines et polypeptides destinés au développement de tests de diagnostic, à la préparation de compositions vaccinales ou pharmaceutiques contre les infections par des trypanosomes africains. De même, la protéine et tout fragment polypeptide correspondant peuvent être utilisés pour la production d'anticorps spécifiques contre le parasite, à des fins de diagnostic ou d'immunisation passive.
Brève description des Figures
Figure 1 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 1 ; Figure 2: représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 2 ;
Figure 3 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 3 ;
Figure 4 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 1 ;
Figure 5 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 2 ;
Figure 6 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type trans-sialidase-like TcoTS-like 3 ;
Figure 7 : représente un alignement de séquence entre la protéine de type trans- sialidase-like (TcoTS-like 2) et une protéine de type trans-sialidase du parasite Trypanosoma cruzi Y. cruzi TS);
Figures 8A et 8B : représentent un schéma des 5 sous familles de protéines apparentées à des trans-sialidases du parasite T. congolense ; les pourcentages d'identité entre les gènes d'une même sous-famille sont indiqués (Fig. 8A) avec un tableau montrant les pourcentages d'identité entre ces protéines (Fig. 8B) ;
Figure 9 : représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-A1
Figure 10 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-A2
Figure 11 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-A3
Figure 12 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-B1
Figure 13 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-B2
Figure 14 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-C;
Figure 15 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-D1 ;
Figure 16 représente a séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-D2;
Figure 17 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-A1
Figure 18 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-A2
Figure 19 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-A3
Figure 20 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-B1
Figure 21 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-B2
Figure 22 représente a séquence peptidique correspondant à la protéine de TcoTS-
C ;
Figure 23 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-D1 ;
Figure 24 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-D2 ; Figures 25A et 25B : représentent un alignement de séquence entre les 1 1 protéines apparentées à des trans-sialidases du parasite Trypanosoma congolense; Figure 26 : représente un tableau montrant les pourcentages d'identité entre les protéines apparentées à des trans-sialidases des parasites T. congolense et T. brucei. Figure 27 : représente un tableau des différents peptides identifiés dans l'expérience d'immunoprécipitation avec le sérum anti-TcoTS-A1 . Leur appartenance aux protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2 ou TcoTS-A3 (A), TcoTS-like 2 (B) et TcoTS-D2 (C).
Figure 28 : représente un tableau des différents peptides identifiés dans l'expérience de préparations de membranes de formes sanguines de T. congolense (A), leur appartenance aux protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2 ou TcoTS-A3 est figuré par un + ; et un tableau des peptides appartenant à la protéine TcoTS-like 2 identifiés lors des expériences d'immunoprécipitation avec les sérums anti-peptide 1 , anti-peptide 2 ou anti- peptide 3 (B).
Figures 29A et 29B: représentent la mesure de l'hématocrite (A) et de la survie moyenne (B) de souris après immunisation avec les protéines TcoTS-like 2, TcoTS-A1 et TcoTS-B1 ou avec la BSA. Le nombre de souris (n) utilisées lors des différentes immunisations est indiqué.
Définitions
On entend par « trypanosomes africains », les protozoaires parasites du genre Trypanosoma appartenant au groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas, tels que définis précédemment. Ceux-ci sont ont été qualifiés de trypanosomes africains, mais se retrouvent toutefois aujourd'hui aussi bien sur le continent africains qu'en Asie ou en Amérique du Sud. Les trypanosomes africains les plus courants sont Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, et Trypanosoma brucei.
Les termes « trypanosomose » et « trypanosomose africaine animale (TAA) » désignent généralement les infections des animaux non humains causées par des trypanosomes africains, alors que les termes « trypanosomiase » ou « trypanosomiase africaine » sert à désigner les infections humaines également causées par les trypanosomes africains. Dans un but de simplification, on utilise ci-dessous indifféremment les termes trypanosomose et trypanosomiase.
Description détaillée de l'invention
La présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-like 1 , 2, et 3, et appartenant aux trypanosomes africains. Ces nouvelles molécules d'ADN ou d'ARN comprennent au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 1 -3, une séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à une des séquences SEQ ID Nos : 1 -3, et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 70%, avec une des séquences SEQ ID NOs : 1 -3, ou une séquence présentant, sur une séquence de 100 nucléotides contigus, au moins 50%, de préférence au moins 60%, ou au moins 70%, ou encore au moins 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, ou 95% d'homologie avec lesdites séquences, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 1 -3 dans des conditions stringentes d'hybridation.
On entend par conditions stringentes d'hybridation, une hybridation à une température de 65 °C pendant une nuit dans une solution contenant 0,1 % de SDS, 0,7% de lait en poudre écrémé et 6X de SSC, suivie de lavages à température ambiante dans du 2X SSC - 0,1 % SDS et à 65°C dans du 0,2X SSC - 0,1 % SDS.
L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à l'une quelconque des séquences suivantes SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou encore, au moins 85 %, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, ou 95%d'homologie avec l'une quelconque desdites séquences.
Par séquence nucléotidique, on entend au moins un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou leurs ADN complémentaires correspondants. La séquence d'ADN telle que représentée dans une des séquences SEQ ID NOs : 1 -3 correspond à la séquence de l'ARN messager, étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacé par l'uracile (U) dans l'ARN.
Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que des séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après. Par variabilité, on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou extension et/ou raccourcissement de la séquence à l'une au moins des extrémités, ou bien une variabilité non naturelle pouvant résulter des techniques de génie génétique utilisées. Cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence de départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré d'homologie par rapport à ladite séquence de référence.
L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques (ou peptidiques) comparés; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé pair comparaison directe de séquences nucléotidiques (ou peptidiques), par rapport à des séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence.
L'invention a aussi pour objet des protéines, dénommées TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, présentant une masse moléculaire apparente d'environ 85 kDa pour la protéine TcoTS-like 1 , d'environ 76 kDa pour la protéine TcoTS-like 2, et d'environ 78 kDa pour la protéine TcoTS-like 3, et reconnues par des anti-sera anti-Trypanosomes africains, ainsi que leurs fragments peptidiques antigéniques ou un équivalent immunologique de ces protéines ou fragments. Les séquences en acides aminés de ces protéines sont représentées dans les séquences SEQ ID Nos : 4-6 et comprennent également les séquences de protéines homologues à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95%.
Les protéines nouvellement caractérisées par le Demandeur présentent en C- terminal une partie lectine conservée visant à permettre la fixation sur des acides sialiques des animaux infectés et en N-terminal une partie catalytique présentant une similitude avec celle des enzymes trans-sialidases et ont donc été désignées par le Demandeur trans-sialidases-like.
Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnu par les anticorps dirigés contre lesdites protéines TcoTS-like 1 , 2, et 3.
L'invention concerne par ailleurs tout fragment des protéines TcoTS-like 1 , 2, et 3, et plus particulièrement tout fragment peptidique antigénique spécifiquement reconnu par des antisera anti-trypanosomes africains.
Les protéines et lesdits fragments protéiques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité.
La présente invention concerne donc aussi un ou plusieurs peptides, dont la séquence en acides aminés correspond à une partie de la séquence des protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et/ ou TcoTS-like 3, et présentant seuls ou en mélanges une réactivité avec la totalité des sera d'animaux non humains et/ou humains infectés par trypanosomes africains. Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse des protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou par des techniques de recombinaison génétique.
Selon un deuxième aspect de la présente invention, cette dernière a pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment des protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 tels que décrits précédemment. En particulier, un fragment d'ADN tel que défini précédemment et placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ladite protéine ou fragment protéique ainsi exprimé est reconnu par des antisera anti-trypanosomes africains.
D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que les cellules issues d'un mammifère, notamment les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae,
Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux cellules d'une souche Escherichia coli (E coli) ou à des cellules d'entérobactéries. La cellule peut être de type sauvage ou mutant. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier. De préférence, on utilise une cellule E. coli, telle que par exemple BL21 (DE3).
La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production des protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 ou des fragments de ces protéines par exemple dans E. coli, qui sont reconnus par des antisera anti-trypanosomes africains. De tels antisera proviennent d'animaux ayant contracté une infection récente ou ancienne par les espèces de trypanosomes, T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, et contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement les protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3. Egalement, les protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 peuvent être reconnues par d'autres anticorps, comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides.
Par protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou fragment on entend l'antigène ou fragment antigénique des Trypanosomes africains naturels, appartenant aux espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, produit notamment par les techniques de recombinaison génétique décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés contre les protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 de ces parasites.
De manière avantageuse, lesdites protéines possèdent une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95% par rapport aux séquences SEQ ID Nos : 4-6. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique.
Dans le cadre de la présente invention, les protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 peuvent être modifiées in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes.
La cassette d'expression selon l'invention permet la production des TcoTS protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou d'un fragment antigénique de ces protéines, ayant les séquences en acides aminés telles que spécifiées précédemment, et de fragments desdites protéines, peuvent être avantageusement fusionnées à un élément exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut notamment s'agir d'un haptène, ou d'un peptide exogène.
La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm), tels que des séquences promotrice (par exemple le promoteur CMV) et terminatrice de la transcription, ainsi que des éléments permettant la traduction de ce dernier en protéine.
La présente invention s'étend à un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur. Il peut s'agir d'un vecteur viral et notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou un vecteur dérivé d'un adénovirus pour l'expression dans les cellules de mammifères.
La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de préparation d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou de fragments antigéniques de ladite protéine, selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et (ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, naturelles ou recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, tels que définis précédemment. A titre d'exemples, les anticorps polyclonaux selon la présente invention peuvent être générés en utilisant les protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 (SEQ ID Nos : 4-6), qui sont injectés à des lapins afin de les immuniser comme cela est décrit dans l'Exemple 2. Les sérums polyclonaux de lapin ainsi obtenus qui ont été désignés respectivement anticorps anti- peptide 1 , anticorps anti-peptide 2, et anticorps anti-peptides 3, font également partis de la présente invention étant donné qu'ils présentent une réactivité contre leur peptide de l'invention par ELISA indirect.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale qui comprend une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 naturelles, recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, et/ou d'un mélange d'une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, et/ou un mélange d'un ou plusieurs fragments peptidiques tels que définis ci-dessus, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié.
Les compositions vaccinales ou vétérinaires selon l'invention sont destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez l'homme et/ou des animaux non humains, particulièrement contre les infections par les espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax.
Les trypanosomoses africaines se traduisent par des syndromes de gravité variable, allant de l'infection aiguë mortelle en 3 à 4 semaines, jusqu'à l'infection chronique durant des mois voire des années. L'évolution chronique, caractérisée par des parasitémies intermittentes, est la plus fréquente chez les bovins. La maladie débute par une phase d'hyperthermie, puis deux à trois semaines après la piqûre infectante, le nombre de globules rouges, le taux d'hémoglobine et l'hématocrite chutent, reflétant l'anémie, qui est le symptôme majeur des trypanosomoses. Les animaux chroniquement infectés ont une consommation alimentaire réduite, ils deviennent cachectique, leur croissance est freinée, et des effets négatifs sur la reproduction sont observés. L'anémie des trypanosomoses s'établit selon deux phases. Au cours de la phase initiale, l'anémie s'accompagne de la parasitémie et résulte essentiellement d'une hémolyse extra- vasculaire : les globules rouges sont détruits par le système phagocytaire dans la rate, le foie, dans la circulation et la moelle osseuse. A terme, l'anémie se traduit par un dysfonctionnement de la moelle osseuse.
Lesdites compositions vaccinales peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace d'une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 naturelles, recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques tels que précédemment décrits.
Les compositions vaccinales peuvent se présenter sous forme de vaccins ADN et peuvent alors comprendre une cassette d'expression, un vecteur, une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tels que définis précédemment, susceptible d'exprimer une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, et/ou encore une combinaison de ceux-ci. Les vaccins ADN peuvent contenir de l'ADN ou de l'ARN, des séquences nucléotidiques modifiées, et de préférence un ou plusieurs vecteurs d'expression codant pour un peptide antigénique ou un fragment sous le contrôle d'une séquence promoteur eucaryotique.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une ou plusieurs protéines TcoTS- like 1 , TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 naturelles, recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques tels que précédemment décrits et/ou des séquences nucléotidiques codant pour ces peptides ou fragments peptidiques.
Ce vaccin monovalent prévient l'infestation et donc l'expression de la maladie.
Si ce vaccin ne prévient pas l'infestation mais uniquement l'expression de la maladie, il pourrait être appelé vaccin «anti-maladie». Dans ce cas et étant donné que le diagnostic différentiel avec d'autres parasitoses du sang n'est actuellement pas systématique, l'utilisation de vaccins multivalents associant le vaccin dit « anti-maladie » à des antigènes d'autres trypanosomes et/ou d'autres actifs thérapeutiques et/ou d'autres vaccins couramment utilisés en prophylaxie est particulièrement avantageux selon la présente invention.
Ainsi les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents associant une ou plusieurs protéines naturelles, recombinantes et/ou des fragments peptidiques et/ou séquence nucléotidique codant pour les dits peptides et fragments peptidiques d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes, et de préférence dérivés d'une ou plusieurs espèces similaires ou différentes de trypanosomes.
Ces peptides, fragments antigéniques ou cocktails de peptides antigéniques dérivés de trypanosomes, sont par exemple d'autres sialidases ou trans-sialidases, des tubulines, des protéases, des lipases, et/ou des protéines flagellaires. A titre d'exemples de trans-sialidases susceptibles d'être incorporées dans les vaccins multivalents, on peut citer les trans-sialidases de T. cruzi, T. congolense, T. vivax, T. evansi, T. brucei, T. rhodesiense, et/ou T. gambiense. Certaines trans-sialidases de T. congolense sont entre autres décrites dans la demande internationale WO2004/55176 ou par Tiralongo E. et al. (JBC vol. 278, No. 26, pp 23301 -10, 2003). Plus précisément, on peut citer les chaînes A et B des trans-sialidase de T.cruzi telles que déposées dans GenBank sous les numéros Gl:29726491 , Gl:29726490, Gl:29726489 et Gl:29726488. Il est également avantageux d'utiliser des formes mutées inactives des transialidases. A cet égard, on peut citer les trans-sialidases mutantes de T. cruzi décrites par exemple dans la demande internationale WO2007/107488, qui ont conservées moins de 20% de leur activité enzymatique de sialidase et transferase.
A titre d'exemples de tubulines dérivées de trypanosomes, on peut citer la tubuline alpha T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAA30262.1 ), ou la tubuline beta (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAA30261 .1 ), la tubuline epsilon de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession EAN77544.1 ), les tubuline epsilon de T. brucei TREU927 (référencée dans NCBI sous les numéros XP_822372.1 et XP_829157.1 ), la tubuline delta de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession EAN80045.1 ), la tubuline zeta de T. brucei (référencée dans NCBI sous le numéro XP 001218818.1 ), ou encore les tubulines de T. brucei qui sont décrites dans la demande internationale WO 2008/134643.
A titre d'exemples de protéines flagellaires dérivées de trypanosomes, on peut citer la protéine flagellaire de T. brucei telle que décrite dans la demande internationale WO2002/19960, ou encore la protéine flagellaire de T. congolense décrite dans la demande française du Demandeur déposée le 13 novembre 2009 sous le numéro FR09/58035. On peut encore citer la protéine flagellaire de T. brucei TREU927 ou les protéines flagelles-like (référencées dans NCBI sous les numéros XP 847376.1 ; XP_847374.1 ; XP_847295.1 ; XP_843961 .1 ; XP_847377.1 ), la protéine flagellaire TB- 44A de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ13310.1 ), la protéine flagellaire TB-24 de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ13308.1 ), la protéine flagellaire de T. brucei déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ1331 1 .1 .
A titre d'exemples de protéases on peut citer les cystéines protéases des trypanosomes, telles que la congopaine ou la trypanopaine-Tc de T. congolense, la rhodesaine de T. rhodesiense, la chagasine ou la cruzipaine de T. cruzi.
Les vaccins selon la présente invention qu'ils soient monovalents ou multivalents peuvent également comprendre des adjuvants afin d'augmenter la réponse antigénique. Les adjuvants son bien connus dans l'état de la technique. A titres d'exemples d'adjuvants, on peut citer la vitamine E, les gels ou les sels d'aluminium, tells que l'hydroxyde d'aluminium les phosphates d'aluminium, les sels de métaux, les saponines, polymères de l'acide polyacrylique, tels que les carbopols®, les polymères à bloc non ioniques, les aminés d'acides gras, telles que l'avridine et le DDA, les polymères à base de dextran, tels que le sulfate dextran, et le DEAE dextran, les liposomes, des immunogènes bactériens, tels que le LPS, les peptidoglycanes, ou les MDP.
Les animaux non humains susceptibles d'être traités incluent par exemple les bovidés, les ovidés, les félidés, les suidés, les camélidés, et/ou les canidés.
Alternativement, les vaccins peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit ci-dessous.
Les vaccins multivalents selon la présente invention peuvent en outre contenir des antigènes des autres parasitoses du sang dérivés par exemple de protozoaires tels que Theirlera parva, Babesia bigemina, et B. divergens, T. annulata, pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomes et de la theilériose, l'anaplasmose, et/ ou la babésiose.
Ceux-ci peuvent être en outre associés à d'autres vaccins standards utilisés pour la prophylaxie et/ou le traitement de parasitoses dans les zones cibles, à savoir contre la fièvre aphteuse, les clostridioses, la peste, la fièvre catarrhale, la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), le charbon symptomatique, les pasteurelloses, et/ou la clavelée.
Les vaccins selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des hommes ou des animaux non humains.
Les vaccins monovalents ou multivalents peuvent être également administrés en association avec des agents anti-parasitaires, des agents anti-infectieux, et/ou des agents anti-symptomatiques.
Les agents antiparasitaires sont par exemple des trypanocides, tels que la diamidine (pentamidine ou mésilate de pentamidine, diminazène ou acéturate de diminazène), des dérivés arsenicaux tels que le mélarsoprol®, melarsomine, l'eflornithine ou DMFO, l'arsobal, le MelBdm, des dérivés du nitrofurane tel que le nifurtimox ou le 5- nitrofurane, des analogues de l'ornithine (éflornithine® ou difluorométhylornithine), la phénanthridrine (isométamidium ou homidium®), un naphturée polysulfoné tel que la suramin®, un antimalinique tel que la quinapyramine, le buthionine sulfoximine (BSO), l'azaserine, 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), et/ou l'acivicine. Lorsque les vaccins sont administrés en association avec des antiparasitaires, ces derniers sont de préférence administrés avant et/ou simultanément et/ou après les vaccins mono ou multivalents précédemment décrits. D'autres antiparasitaires non spécifiques des trypanosomes sont bien connus dans le domaine, et sont administrés avant et/ou simultanément et/ou après les vaccins selon l'invention. Parmi ceux-ci on peut citer les avermectines (ivermectine, abamectine, doramectine, eprinomectine et selamectine), des pyréthrines (deltaméthrine, etc.), et/ou les antiparasitaires anthelminthiques (oxybendazole, piperazine, flubendazole).
A titre d'exemples d'agents anti-infectieux, on peut citer les antibiotiques tels que les β-lactamines, la fosfomycine, les glycopeptides ou les polypeptides à activité antibiotique, la bacitracine, les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines, les tétracyclines, les phénicolés, les fusidanides, ou les quinolones.
Les agents anti-symptomatiques sont par exemple des agents anti-anémiques, tels que le fer, la vitamine B12, l'acide folique, le calcium lévofolinate ; des agents hépatoprotecteurs, tels que les complexes de flavonoides (sylymarin silybin, etc.), le curcuma, le desmodium ascendens, et/ou le chrysanthellum Americanum (charbon).
Les anti-inflammatoires non stéroidiens (AINS) peuvent être entre autres des oxicams (meloxicam, piroxicam, et/ou ténoxicam), des dérivés salicylés (salicylate de méthyle et acétylate de lysine), des acides 2-arylproprioniques (profènes), des dérivés indoliques des sulfonamides, des AINS cox-2 sélectifs (célécoxib, étoricoxib, etc .), la phénylbutazone, l'acide niflumique, et/ou les acides phénamiques.
Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet des sondes ou des amorces spécifiques des Trypanosomes africains, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic.
Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins un brin présentant une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques présentant au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans les séquences SEQ ID Nos : 1 -3, ou une séquence complémentaire, ou anti-sens, ou équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, 5 à 100 nucléotides contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou au moins 85 % d'homologie aux séquences SEQ ID Nos :1 -3, ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, dialkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate.
Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que les séquences identifiées dans les séquences SEQ ID Nos : 1 -3. En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5 nucléotides, avantageusement entre 5 et 50 nucléotides, de préférence aux alentours de 20 nucléotides possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection.
Les amorces selon l'invention comprennent une séquence de 5 à 30 monomères choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 1 -3, et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue.
Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par les trypanosomes africains, notamment par T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment. Alternativement, les réactifs pour la détection ou kit de diagnostic des trypanosomes peuvent comprendre une sonde et/ou une amorce telle que définie précédemment, pour détecter et/ou identifier les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, en particulier une sonde de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition ci- dessus.
Le réactif ci-dessus peut être fixé directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cône, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, des copolymères à base de styrène, des fibres naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon.
La fixation du réactif sur le support solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-TcoTS-like 1 , 2, et 3, à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur les protéines TcoTS-like 1 , 2, et 3 une molécule telle qu'une vitamine, et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine-streptavidine). Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité des protéines TcoTS-like 1 , TcoTS- like 2, et TcoTS-like 3, et l'immobilisation de ces dernières sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné.
Les sondes de capture peuvent être immobilisées sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. Les sondes de détection sont marquées au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.
Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en œuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les techniques dites "Dot-Blot", Southern Blot, Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich.
Le procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par les trypanosomes africains, consiste à mettre en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif.
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier.
Alternativement, le procédé pour la détection sélective des trypanosomes africains dans un échantillon biologique, et le diagnostic des trypanosomoses consiste à prélever un échantillon de sang, exposer l'ADN extrait de l'échantillon et éventuellement dénaturé à au moins une sonde telle que définie précédemment et on détecte l'hybridation de ladite sonde.
Enfin, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomiase dans un échantillon biologique comprenant une sonde ou une amorce telle que décrite ci-dessus, ou bien un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique.
Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en œuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet les séquences apparentées aux trans-sialidases-like chez T. congolense. Plus précisément, onze gènes codant pour des séquences apparentées à des sialidases ont été caractérisés et classifiés en 5 sous-familles selon leurs homologies de séquences (Figures 8A et 8B) :
La première sous-famille des Trans-sialidases-like comprend les 3 gènes précédemment décrits et désignés TcoTS-like 1 , 2, et 3, qui présentent 17 à 24% d'identité entre eux (Figures 1 à 6).
La deuxième sous-famille a été nommée sous famille A et comprend trois gènes désignés A1 , A2, et A3 et dont les séquences nucléotidiques sont données respectivement dans les SEQ ID Nos : 7, 8, et 9. Les gènes A1 , A2, et A3 présentent 94 à 97% d'identité entre eux (Figures 9 à 1 1 ) et codent respectivement pour trois protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, et TcoTS-A3, dont les séquences en acides aminés sont fournies respectivement dans les SEQ ID Nos : 15, 16, et 17 (Figures 17 à 19). La troisième sous-famille désignée B comprend deux gènes désignés ci-après B1 et B2, dont séquences nucléotidiques sont données respectivement dans les SEQ ID Nos : 10 et 1 1 , et qui présentent 76% d'identité entre eux (Figures 12 et 13). Les deux gènes B1 et B2 codent pour les trans-sialidases TcoTS-B1 et TcoTS-B2 dont les séquences peptidiques sont représentées dans les SEQ ID Nos : 18 et 19 (Figures 20 et 21 ).
La quatrième sous-famille désignée C comprend un seul gène désigné C, dont la séquence nucléotidique est représentée dans la SEQ ID NO : 12 (Figure 14), et qui code pour la protéine TcoTS-C dont la séquence peptidique est fournie dans la SEQ ID NO : 20 (Figure 22).
Enfin, la cinquième sous-famille qui a été désignée sous-famille D comprend deux gènes nommés D1 et D2, dont les séquences nucléotidiques sont fournies dans les SEQ ID Nos : 13 et 14 (Figures 15 et 16). Ces deux gènes D1 et D2 présentent en effet 96% d'identité entre eux. Ils codent pour les protéines TcoTS-D1 et TcoTS-D2 dont les séquences en acides aminés sont fournies dans les SEQ ID Nos : 21 et 22 (Figures 23 et 24).
Les pourcentages d'identité entre les protéines codées par ces 1 1 gènes selon l'invention tels que décrits ci-dessus sont présentés dans les Figures 8A et 8B. Un alignement des séquences est donné dans les Figures 25A et 25B. Les trans-sialidases- like 1 à 3 sont très divergentes par rapport aux autres gènes.
Selon cet aspect, la présente invention a donc pour objet de nouvelles séquences nucléotidiques, codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS- D1 , et TcoTS-D2 appartenant aux trypanosomes africains Ces nouvelles molécules d'ADN ou d'ARN comprennent au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 7-14, une séquence complémentaire, antisens, ou équivalente à une des séquences SEQ ID Nos : 7-14, et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 70%, avec une des séquences SEQ ID NOs : 7-14, ou une séquence présentant, sur une séquence de 100 nucléotides contigus, a moins 50%, de préférence au moins 60%, ou au moins 70%, ou encore au moins 80% d'homologie avec lesdites séquences, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 7-14 dans des conditions stringentes d'hybridation, telles que définies précédemment.
L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 7-14, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou encore, au moins 85 % d'homologie avec l'une quelconque desdites séquences.
Egalement, selon cet aspect, l'invention concerne les protéines dénommées TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS- D2, ainsi que les séquences peptidiques de ces protéines telles que représentées respectivement dans les séquences SEQ ID Nos : 15-22, et toutes séquences en acides aminés présentant une homologie d'au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou d'au moins 95% avec les séquences peptidiques SEQ ID Nos : 15-22. L'invention a également pour objet tous fragments peptidiques antigéniques des protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, spécifiquement reconnu par des antisera anti-Trypanosomes africains, ainsi que tous équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines susceptibles d'être immunologiquement reconnus par les anticorps dirigés contre les protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2 de la présente invention. Les protéines et lesdits fragments peptidiques antigéniques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité.
A titre d'exemple, un fragment antigénique peptidique selon la présente invention peut être le peptide PKNIKGSWHRDRLQLWLTD (SEQ ID NO : 24) appartenant à la protéine TcoTS-B1 ou des peptides homologues à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95% avec ledit fragment.
La présente invention concerne en outre la combinaison ou un mélange d'un ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines. Egalement, elle a pour objet un procédé de préparation d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS- like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS- B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, ou un mélange desdites protéines, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines. Ces techniques de production des protéines, fragments, équivalents fonctionnels, et des combinaisons sont effectuées par synthèse chimique, lyse des protéines, ou par des techniques de recombinaison génétique. Elles sont bien connues de l'homme du métier, et ont été par ailleurs décrites ci-dessus.
Selon cet aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par une ou plusieurs protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2 naturelles, ou recombinantes et leurs fragments peptidiques tels que précédemment décrits. Elle a également pour objet une composition vaccinale comprenant un mélange d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS- B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines et/ou une combinaison desdites protéines, fragments ou équivalents fonctionnels.
Jusqu'à présent, aucune de ces onze protéines n'avait été mise en évidence dans les formes sanguines de T. congolense. En effet, Tiralongo et al. ((2003) J. Biol. Chem 278(26) :23301 -10) ainsi que la publication internationale WO2004/055176 décrivent le clonage dans les formes procycliques présentes chez l'insecte vecteur de deux trans- sialidases TS1 et TS2 de T. congolense. Ces protéines ont été uniquement décrites comme étant exprimées dans les formes procycliques présentes chez l'insecte vecteur. Egalement, une étude des gènes apparentés à des sialidases a également été réalisée chez T. brucei (Montagna et al. (2006) J. Biol. Chem. 281 (45) : 33949-58). Montagna et al. décrit ainsi l'identification de plusieurs séquences de protéines de la famille du gène TbTS (AF310231 .1 ) chez T. brucei. Il décrit notamment une version tronquée du gène TbTS, à savoir TbTSsh, les gènes B et C codant pour les transialidases TbSA B et TbSA C de T. brucei, et enfin des gènes D1 , D2, et E codant pour des trans-sialidases-like de T. brucei. Les pourcentages d'identité entre les séquences identifiée chez T. congolense et T. brucei sont présentés dans la Figure 26. Montagna et al. décrit que ces trans-sialidases sont exprimées in vivo dans les formes insectes ou formes procycliques, et jouent probablement un rôle important dans le transfert d'acide sialique sur la membrane des parasites, assurant ainsi la protection des parasites et leur survie lorsqu'ils sont transportés par des insectes vecteurs. Toutefois, Montagna et al. ne décrit pas la possibilité de détecter ces trans-sialidases en quantité suffisante dans les formes sanguines des parasites, c'est-à-dire chez les animaux infectés et ainsi de les utiliser en tant que vaccins ou diagnostics.
Egalement, jusqu'à présent aucune activité sialidase n'avait été décrite de ces onze protéines dans les formes sanguines; la littérature décrivant au contraire l'absence d'activité de type sialidase dans les formes sanguines de T. congolense (Engstler et al. (1995) Acta Trop. 59 : 1 17-29).
Alors qu'aucune de ces onze protéines n'avait jamais été mise en évidence dans les formes sanguines de T. congolense et aucune activité sialidase n'a été décrite dans ces formes, le Demandeur a mis en évidence de manière suprenante une activité sialidase dans les formes sanguines de T. congolense, et a démontré par immunoprécipitation suivie d'une analyse en spectrométrie de masse, l'expression des protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2 dans les formes sanguines de T. congolense (Exemple 3 et Figure 27). L'expression de ces mêmes protéines ainsi que de la protéine TcoTS-D2 a également été démontré par analyse en spectrométrie de masse de préparations de membranes de formes sanguines de T. congolense (Exemple 4 et Figure 28). Le demandeur a par aillieurs démontré lors d'expérience de protection par vaccination sur modèles murins (Exemple 5, Figures 29A et 29B) que les protéines antigéniques TcoTS-A1 , TcoTS-B1 , et TS-like 2 permettaient d'obtenir un effet protecteur supérieur en termes de survie moyenne des animaux ainsi que par rapport à l'hématocrite. Cette protection pouvant même être totale (absence de développement de la parasitémie et hématocrite normal) dans certains cas : 3 souris sur 12 dans le cas de TcoTS-like2 et 1 sur 9 dans le cas de TcoTS-B1 .
Par conséquent, la présente invention a pour objet des compositions vaccinales ou vétérinaires destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez un animal non humain, particulièrement contre les infections par les espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Ces compositions vaccinales vétérinaires peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS- A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines et/ou une combinaison desdites protéines, fragments ou équivalents fonctionnels. De préférence, lesdites compositions vaccinales ou vétérinaires comprennent au moins d'une protéine choisie parmi TcoTS-A1 , TcoTS-B1 , et TcoTS-like 2. De manière encore plus préférentielle, lesdites compositions vaccinales ou vétérinaires comprennent au moins la protéine TcoTS-like 2, et/ou un fragment peptidique antigénique, et/ou un équivalent fonctionnel immunologique de TcoTS-like 2. Alternativement, les compositions vaccinales peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2. Elles sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des animaux non humains. Encore selon cet aspect, la présente invention concerne un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par les trypanosomes africains, notamment par T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2. De préférence, les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2.
Le procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par les trypanosomes africains, consiste à mettre en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et détecter ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif.
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier.
Enfin selon cet aspect, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomose dans un échantillon biologique comprenant un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en œuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine TcoTS- A1 La protéine TcoTS-A1 a été produite dans la levure Pichia pastoris. Pour cela, la souche X33 a été transformée par le vecteur PICZ (Invitrogen) contenant la séquence codant pour la protéine TcoTS-A1 dépourvue de ses 29 premiers acides aminés. La protéine sécrétée dans le surnageant de culture après 4 jours d'induction d'expression au méthanol a été purifiée par des chromatographies échangeuses d'ions successives. Premièrement le surnageant de culture a été dialysé contre du tampon Na acétate 20mM pH4,5 pendant 16 heures, centrifugé 30 minutes à 10000g, puis soumis à une chromatographie sur 1 colonne HiTrap SP HP de 1 ml (GE Healthcare). L'élution a été réalisée selon un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCI. Les fractions contenant une activité sialidase (test par fluorimétrie avec le substrat 2'-(4-methylumbelliferryl)- -D-N- acetylneuraminic acid, comme décrit dans la publication Montagna et al. (2006) J. Biol. Chem. 281 (45) : 33949-58), ont été rassemblées et dialysées 16 heures contre du tampon Tris-HCI 20 mM pH 8. Après centrifugation 30 minutes à 10000g, le surnageant a été soumis à une deuxième chromatographie sur 1 colonne HiTrap Q HP de 1 ml (GE Healthcare). L'élution a été réalisée selon un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCI. Les fractions contenant une activité sialidase ont été regroupées et soumises à un traitement par la déglycosidase endoHF (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. L'échantillon déglycosylé a été à nouveau soumis à une chromatographie sur 1 colonne HiTrap Q HP de 1 ml (GE Healthcare) comme décrit ci-dessus. L'intégrité de la protéine a été vérifiée par électrophorèse SDS-PAGE et coloration au bleu de coomassie.
Cette protéine recombinante purifiée a été ensuite utilisée pour immuniser des souris de type Balb-c ou des lapins. 20 g de protéine recombinante ont été injectés aux souris à raison de 4 fois espacées de 15 jours ou 100 g de protéine recombinante ont été injectés aux lapins à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Pour la première injection la protéine recombinante a été mélangée sous forme d'émulsion à de l'adjuvant de Freund complet puis pour les injections suivantes avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Le sérum des animaux immunisés a été collecté en fin d'expérimentation (sérum anti-TcoTS- A1 ) et sa réactivité contre la protéine recombinante a été vérifiée en test ELISA indirect. Exemple 2 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre des peptides issus de séquences apparentées à des sialidases.
Les peptides suivants : C-RTSIDYHLIDTVAKYSADDG (SEQ ID NO : 23), C- PKNIKGSWHRDRLQLWLTD (SEQ ID NO : 24), et C-PVSAQGQDHRYEAANAEHT (SEQ ID NO : 25), respectivement nommés peptides 1 , 2 et 3 ont été couplés grâce à la cysteine Nter à une protéine carrier (KLH) activée par une fonction maleimide et utilisés pour immuniser des lapins à raison de 5 injections de 100 g espacées de 20 jours. Pour la première injection la protéine recombinante a été mélangée sous forme d'émulsion à de l'adjuvant de Freund complet puis pour les injections suivantes avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Les sérums polyclonaux obtenus ont été désignés respectivement anticorps anti-peptide 1 , anticorps anti-peptide 2, et anticorps anti-peptides 3, ont été récoltés en fin d'expérimentation et vérifiés pour leur réactivité contre leur peptide respectif par ELISA indirect.
Exemple 3 : Mise en évidence de l'expression des protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-like 2 dans les formes sanguines de T. congolense.
3 mL de sérum de lapin ou 1 mL de sérum de souris ont été dialysés contre 1 L de tampon phosphate 20 mM pH7 pendant 16 heures. Le sérum dialysé a été centrifugé 20 minutes à 5000g puis passé sur 1 colonne de sépharose protéine G Fast Flow (GE healthcare) préalablement préparée comme indiqué par le fournisseur. Après lavage de la colonne avec du tampon phosphate 20 mM pH7, les IgG fixées sur la colonne ont été éluées avec du tampon Glycine HCI 0,1 M pH2,6. Les IgG ainsi purifiées ont a été dialysées 16 heures contre 1 L de tampon NaHCo3 0,1 M pH8,3, NaCI 0,5M. Les IgG ont a été ensuite incubées 2 heures à température ambiante avec de la sépharose activée au BrCN (Sigma) préalablement préparée selon les recommandations du fournisseur. Après centrifugation 1 minute à 1000g, la résine a été lavée avec le précédent tampon puis saturée par ajout de Tris-HCI 0,1 M pH8 pendant 2 heures à température ambiante. Après centrifugation 1 minute à 1000g, la résine a été lavée successivement avec du tampon Tris-HCI pH8 NaCI 0,5M puis du tampon Na Acétate 0,1 M pH4 NaCI 0,5M. La résine ainsi prête à l'utilisation pour une expérience d'immunoprécipitation a été équilibrée avec du tampon OLB (100 mM KCI, 17% glycérol, 1 mM MgCI2, 2,25 mM CaCI2 0,5% NP40, 10 mM Tris-HCI pH8). 109 cellules de la souche IL3000 ont été lysées dans le tampon OLB pendant 1 heure à 4<C puis centrifugées 10 minutes à 20000g. Le surnageant a été incubé avec la résine préalablement préparée pendant 16 heures à 4"C. La résine a été alors centrifugée 1 minute à 1000g puis rincée avec du tampon OLB. Les antigènes liés aux IgG ont été élués avec du SDS2% bouillant. L'éluat a été mis en dialyse contre de l'eau puis soumis à lyophilisation. Le lyophilisât a été ensuite repris dans du tampon Laemmli (50 mM Tris- HCI pH=6,8 ; 10 % glycérol ; 1 % SDS ; 2,5 % γ-mercaptoéthanol ; 0.01 % bleu de bromophénol) puis soumis à une électrophorèse SDS PAGE. Le gel a été ensuite coloré au nitrate d'argent et les bandes ainsi révélées ont été découpées et analysées en spectrométrie de masse par la technologie MSMS.
Ce protocole a été réalisé avec les sérums polyclonaux anti-TcoTS-A1 , anti-peptide 1 , anti-peptide 2 et anti-peptide 3 sur les formes procycliques et sur les formes sanguines de la souche IL3000 de T congolense. Les résultats concernant les formes sanguines ont été représentés dans la Figure 27. L'immunoprécipitation avec le sérum anti-TcoTS-A1 a permis d'identifier les protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2 et TcoTS-A3 dans les formes procycliques et dans les formes sanguines de T. congolense. Les immunoprécipitations avec les sérums anti-peptide 1 anti-peptide 2 et anti-peptide 3 ont permis d'identifier la protéine TcoTS-like2 uniquement dans les formes sanguines de T. congolense. Ces résultats ont démontré pour la première fois l'expression des protéines TcoTS-A1 , TcoTS- A2, TcoTS-A3 et TcoTS-like2 dans les formes sanguines du parasite. Exemple 4 : Mise en évidence de l'expression des protéines TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-like 2 et TcoTS-D2 dans des préparations de membranes des formes sanguines de T. congolense.
109 cellules de la souche IL3000 ont été lysées dans 1 mL de tampon hypotonique (5 mM Na2HP04, 0,3 mM KH2P04) pendant 30 minutes à 4<€ puis centrifugées 10 minutes à 20000g. Le culot a été soumis au même traitement 3 fois d'affilée. Le dernier culot est repris à 4°C dans 100 μ\- de ce même tampon de lyse hypotonique auquel on ajoute ensuite 0,5 mL du tampon suivant : 2 mM EDTA, 15,4 mM NaOH, 0,2 mM dithiothreitol. Après 10 minutes d'incubation, le mélange est centrifugé 10 minutes à 20000g. Le surnageant est récupéré (fraction soluble) et le culot (fraction insoluble) est repris dans 50 μ\- d'eau auxquels sont ensuite ajoutés 50 μ\- de SDS 2%. 50 L de chacune de ces deux fractions sont mélangés avec 15 L de tampon Laemmli 4 fois concentré (200 mM Tris- HCI pH=6,8 ; 40 % glycérol ; 4 % SDS ; 10 % γ-mercaptoéthanol ; 0.04 % bleu de bromophénol) chauffés à Ι ΟΟ 'Ό 10 minutes puis soumis à une électrophorèse SDS PAGE. Le gel a été ensuite coloré au nitrate d'argent et les bandes ainsi révélées ont été découpées et analysées en spectrométrie de masse par la technologie MSMS.
Exemple 5 : Essais de vaccination sur modèle murins
Exemple 5.1 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 1
2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec une protéine recombinante TcoTS-like 1 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris. Exemple 5.2 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 2 14 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (7 souris témoin négatif) ou avec la protéine recombinante TcoTS-like 2 (7 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours.
L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 43,311 ,2% pour les souris immunisées avec TcoTS-like2 et de 37,0+0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28)
La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 453+81 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-like2 et de 267+23 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA.
Exemple 5.3 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 3
2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec la protéine recombinante TcoTS-like 3 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris. Exemple 5.4 : Essais de vaccination avec TcoTS-A1
13 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (8 souris témoin négatif) ou de protéine recombinante TcoTS-A1 (5 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours.
L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 41 ,4+0,9% pour les souris immunisées avec TcoTS-A1 et de 37,0+0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28)
La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 299+14 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-A1 et de 267+23 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA.
Exemple 5.5 : Essais de vaccination avec TcoTS-B1
12 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (8 souris témoin négatif) ou de protéine recombinante TcoTS-B1 (4 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours.
L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 41 ,4±0,5% pour les souris immunisées avec TcoTS-B1 et de 37,0±0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28)
La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 463194 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-B1 et de 267123 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA. Exemple 5.6: Essais de vaccination avec une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2.
2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 g de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec une ou plusieurs protéines recombinantes choisies parmi les protéines TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris.
Exemple 6 : Essais de vaccination sur les bovins.
2 lots de bovins sont injectés en sous-cutané avec un ou plusieurs antigènes tels que TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, mélangés avec deux types d'ajuvants Quil A (saponine) 1 mg/ml et Adjuphos (Phosphate d'aluminium colloïdal) volume à volume selon un volume final de 1 mL ou juste avec le mélange d'adjuvants (contrôle). 3 injections à 3 semaines d'intervalle sont réalisées avec respectivement 100 μg, 50 μg et 25 μg d'antigène(s). Les animaux sont infectés par la souche IL3000 de T. congolense 3 semaines après la dernière injection à raison de 1000 parasites par animal en intradermique. Des prélèvements de sang journaliers sont réalisés jusqu'à ce que tous les animaux soient reconnus infectés, la détermination de la parasitémie se faisant sur buffy- coat. Puis des prélèvements de sang hebdomadaires sont réalisés pour suivre la parasitémie et l'anémie, le poids des animaux est suivi mensuellement. La cinétique de réponse à l'immunisation et à l'infection est suivie par ELISA sur les différents antigènes immunisants.
Les antigènes utilisés lors de cette expérience d'immunisation peuvent être TcoTS-like 1 , 2 ou 3 ou TcoTS-A1 ou TcoTS-B1 , seuls ou en association selon toutes les combinaisons possibles. Exemple 7 : Exemple de tests de diagnostic sur sang d'animaux infectés.
Ce test est réalisé par détection des antigènes circulants tels que TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2 par la méthode ELISA sandwich. L'anticorps dit de capture est adsorbé dans les puits d'une plaque 96 puits par incubation sur la nuit à 4<C de 1 à 10 μg/mL d'anticorps de capture dilué dans 100 μ\- tampon NaHC03 50 mM pH9,6. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS- Tween (3,2 mM Na2HP04 ; 0,5 mM KH2P04 ; 1 ,3 mM KCI ; 135 mM NaCI, pH 7,4 ; 0,05% Tween 20). Puis 100 μΐ d'une solution de blocage (PBS-Tween 0,2% de gélatine) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont vidées puis 100 μΙ des sérums d'animaux à tester sont déposés dans les puits et incubés 2 heures à 37 <Ό. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 μ\- d'une solution contenant le deuxième anticorps couplé à de la biotine (PBS-Tween contenant 1 à 10 μg mL d'anticorps biotinylé) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 1 heure à 37°C. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 μ\- de PBS- Tween contenant de la streptavidine couplée à la peroxydase (Sigma) sont ajoutés selon recommandations du fournisseur. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. Enfin la réaction est révélée par ajout de substrat de la peroxydase selon les recommandations du fournisseur (exemple de révélateur pouvant être utilisé : ABTS (Sigma)). Le résultat est lu à l'aide d'un lecteur de plaque ou fluorimètre selon recommandations du fournisseur.
L'anticorps de capture utilisé peut être soit un sérum polyclonal immunopurifié contre une ou un mélange des protéines de type sialidase de T. congolense, telles que TcoTS-like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2, ou bien un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope présent sur une ou plusieurs de ces protéines de type sialidase de T. congolense. Le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal différent de l'anticorps de capture qui reconnaît un épitope différent d'une ou plusieurs des protéines de type sialidase TcoTS- like 1 , TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1 , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS- B2, TcoTS-C, TcoTS-D1 , et TcoTS-D2 de T. congolense.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Molécule d'ADN ou d'ARN caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique isolée codant pour une trans-sialidase-like appartenant aux trypanosomes africains, choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 1 -3, une séquence complémentaire d'une séquence choisie d'une des séquences SEQ ID Nos : 1 -3, une séquence comprenant une identité d'au moins 70% avec une des séquences SEQ ID NOs : 1 -3, un fragment des desdites séquences, ou une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 1 -3 dans des conditions stringentes d'hybridation.
2. Une protéine codée par la séquence nucléotidique selon la revendication 1 .
3. Un protéine selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos : 4-6, désignées respectivement TcoTS-like 1 , 2, et 3, ou un fragment peptidique antigénique desdites protéines.
4. Une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule d'ADN selon la revendication 1 .
5. Un vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 4.
6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit vecteur est d'origine eucaryote ou procaryote.
7. Une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 , une cassette d'expression selon la revendication 4, ou encore un vecteur recombinant selon la revendication 5 ou 6.
8. Cellule hôte selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule est d'origine eucaryote, telle que notamment les cellules issues d'un mammifère, les cellules d'insectes, les cellules issues d'un champignon, les cellules issues d'une levure, ou ladite cellule est d'origine procaryote, telle que notamment les cellules issues d'E.coli, ou les cellules d'entérobactéries.
9. Protéine selon la revendication 2 ou 3, ou un fragment peptidique antigénique, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit fragment présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par un trypanosome africain.
10. Protéine selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par les trypanosomes africains, choisis parmi Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, et/ou Trypanosoma brucei.
1 1 . Vaccin pour la prévention et/ou le traitement des trypanosomoses et pathogénies induites par les trypanosomoses chez les animaux non humains, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 9, et 10.
12. Vaccin pour la prévention et/ou le traitement des trypanosomiases et pathogénies induites par les trypanosomiases chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 9, et 10.
13. Vaccin selon la revendication 1 1 ou 12 pour la protection contre les infections à Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, et/ou Trypanosoma brucei.
14. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 13 caractérisé en ce que lesdites pathogénies induites comprennent les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression desdits animaux et/ou homme.
15. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 , 13 et 14, caractérisé en ce que lesdits animaux non humains sont choisis parmi les bovidés, les ovidés, les félidés, les suidés, les camélidés et/ou les canidés.
16. Vaccin multivalent selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs peptides antigéniques et/ou des fragments antigéniques et/ou des séquences nucléotidiques codant pour lesdits peptides dérivés d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes africains.
17. Vaccin multivalent selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 16, caractérisé en ce que le ou lesdits peptides et/ou fragments et/ou séquences nucléotidiques sont dérivés des protéines flagellaires, des sialidases, des trans-sialidases, des lipases, des protéases et/ou des tubulines.
18. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un agent antiparasitaire, au moins un agent infectieux, et/ou au moins un agent anti-symptomatique.
19. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent antiparasitaire est un trypanocide et/ou un agent antiparasitaire non spécifique des trypanosomes.
20. Vaccin selon à la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent anti-infectieux est choisi parmi les β-lactamines, la fosfomycine, les glycopeptides ou les polypeptides à activité antibiotique, la bacitracine, les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines, les tétracyclines, les phénicolés, les fusidanides, ou les quinolones.
21 . Vaccin selon à la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent anti- symptomatique est un agent anti-anémique, un agent hépatoprotecteur, et/ou un anti- inflammatoire non stéroidien.
22 Vaccin selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisé en ce que l'agent antiparasitaire, et/ou l'agent infectieux, et/ou l'agent anti-symptomatique est administré avant et/ou simultanément et/ou après ledit vaccin.
23. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant.
24. Vaccin comprenant le vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 23 et un vaccin et/ou ou un antigène dirigé contre la theilériose, l'anaplasmose, et/ou la babésiose.
25. Vaccin comprenant le vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 23 et un vaccin et/ou ou un antigène dirigé contre la fièvre aphteuse, les clostridioses, la peste, la fièvre catarrhale, la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), le charbon symptomatique, les pasteurelloses, et/ou la clavelée.
26. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction immunologique d'un organisme animal non humain et/ou l'homme avec au moins une protéine ou un fragment peptidique antigénique selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 9, et 10.
27. Sonde pour l'identification des parasites trypanosomes africains, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique selon la revendication 1 .
28. Réactif pour la détection de trypanosomose dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon la revendication 26 ou une sonde selon la revendication 27.
29. Procédé de détection de trypanosomose dans un échantillon biologique, tel que le sang d'un animal non humain et/ou de l'homme susceptible d'avoir été infecté par un trypanosome africain, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon et un anticorps selon la revendication 26 dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et en ce que l'on détecte ensuite la présence d'un complexe immun.
30. Kit pour le diagnostic de trypanosomose dans un échantillon biologique comprenant un anticorps selon la revendication 26 ou une sonde selon la revendication 27.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180185462A1 (en) * 2015-06-23 2018-07-05 Saint Louis University Peptides for inducing chagas disease responses

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9744220B2 (en) 2013-03-14 2017-08-29 Tufts University Compositions and methods for treating inflammatory diseases
BR112015025951A2 (pt) * 2013-04-12 2017-10-17 Univ Danmarks Tekniske sialidase mutante com atividade trans-sialidase, para uso em produção de glicanos sialilados
CN103278642A (zh) * 2013-05-15 2013-09-04 广西大学 一种检测伊氏锥虫vsg抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及制备方法
RU2686695C1 (ru) * 2017-11-27 2019-04-30 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко" (ФГБНУ ВИЭВ) Способ дифференциальной диагностики случной болезни (t. equiperdum) и сурры (t. evansi) лошадей
CN110964843B (zh) * 2020-01-06 2024-07-26 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR958035A (fr) 1950-03-02
WO2002019960A2 (fr) 2000-09-06 2002-03-14 Pays, Etienne Purification, caracterisation et utilisation de structures antigeniques protectrices contre des trypanosomes et des parasites apparentes
WO2004055176A2 (fr) 2002-12-13 2004-07-01 N.V. Nutricia Trans-sialidases issues de trypanosoma congolense
WO2007107488A2 (fr) 2006-03-17 2007-09-27 Vib Vzw Nouveau vaccin contre l'infection a trypanosoma cruzi
WO2008134643A2 (fr) 2007-04-28 2008-11-06 Fraunhofer Usa, Inc. Antigènes de trypanosome, compositions de vaccins et procédés associés

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029699A1 (fr) * 1994-04-29 1995-11-09 Curtis Powell Vaccin, procede de determination diagnostique et procede de traitement des protozoaires hemoflagelles parasites
TNSN97045A1 (fr) * 1996-03-12 2005-03-15 Sovarec Sa Histones de trypanosomatides, genes et derives de genes les codant, construction d'adn, vecteur, organismes hote, tests et vaccins correspondants, et leur utilisation.
JP4553354B2 (ja) * 2004-10-04 2010-09-29 正隆 井原 抗トリパノソーマ剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR958035A (fr) 1950-03-02
WO2002019960A2 (fr) 2000-09-06 2002-03-14 Pays, Etienne Purification, caracterisation et utilisation de structures antigeniques protectrices contre des trypanosomes et des parasites apparentes
WO2004055176A2 (fr) 2002-12-13 2004-07-01 N.V. Nutricia Trans-sialidases issues de trypanosoma congolense
WO2007107488A2 (fr) 2006-03-17 2007-09-27 Vib Vzw Nouveau vaccin contre l'infection a trypanosoma cruzi
WO2008134643A2 (fr) 2007-04-28 2008-11-06 Fraunhofer Usa, Inc. Antigènes de trypanosome, compositions de vaccins et procédés associés

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL [online] 20 May 2008 (2008-05-20), "Trypanosoma brucei TREU927 BAC26D11 sequence, strain TREU 927/4 GUTat10.1", XP002583638, retrieved from EBI accession no. EMBL:FM160648 Database accession no. FM160648 *
DATABASE EMBL [online] 26 September 2009 (2009-09-26), "Trypanosoma congolense isolate IL3000 EST read Tcep23c02.p1k from epimastigote stage cDNA library", XP002584449, retrieved from EBI accession no. EMBL:FN279329 Database accession no. FN279329 *
ENGSTLER ET AL., ACTA TROP., vol. 59, 1995, pages 117 - 29
ENGSTLER M ET AL: "Distribution of developmentally regulated trans-sialidases in the Kinetoplastida and characterization of a shed trans-sialidase activity from procyclic Trypanosoma congolense.", ACTA TROPICA MAY 1995 LNKD- PUBMED:7676903, vol. 59, no. 2, May 1995 (1995-05-01), pages 117 - 129, XP002583635, ISSN: 0001-706X *
HELM JARED R ET AL: "Analysis of expressed sequence tags from the four main developmental stages of Trypanosoma congolense.", MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY NOV 2009 LNKD- PUBMED:19559733, vol. 168, no. 1, November 2009 (2009-11-01), pages 34 - 42, XP002583637, ISSN: 1872-9428 *
JBC, vol. 278, no. 26, 2003, pages 23301 - 10
MONTAGNA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 45, 2006, pages 33949 - 58
MONTAGNA ET AL., L'IDENTIFICATION DE PLUSIEURS SÉQUENCES DE PROTÉINES DE LA FAMILLE DU GÈNE
MONTAGNA G ET AL: "The trans-sialidase from the African trypanosome Trypanosoma brucei", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, BLACKWELL PUBLISHING, BERLIN, DE, vol. 269, no. 12, 1 June 2002 (2002-06-01), pages 2941 - 2950, XP002276141, ISSN: 0014-2956, DOI: DOI:10.1046/J.1432-1033.2002.02968.X *
NOK ANDREW J ET AL: "A bloodstream Trypanosoma congolense sialidase could be involved in anemia during experimental trypanosomiasis.", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY JUN 2003 LNKD- PUBMED:12869528, vol. 133, no. 6, June 2003 (2003-06-01), pages 725 - 730, XP002583634, ISSN: 0021-924X *
SCHRADER SILKE ET AL: "A nonradioactive 96-well plate assay for screening of trans-sialidase activity.", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 15 NOV 2003 LNKD- PUBMED:14596820, vol. 322, no. 2, 15 November 2003 (2003-11-15), pages 139 - 147, XP002583636, ISSN: 0003-2697 *
TIRALONGO E ET AL: "Two trans-sialidase forms with different sialic acid transfer and sialidase activities from Trypanosoma congolense", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, INC, US LNKD- DOI:10.1074/JBC.M212909200, vol. 278, no. 26, 27 June 2003 (2003-06-27), pages 23301 - 23310, XP002293242, ISSN: 0021-9258 *
TIRALONGO ET AL., J. BIOL. CHEM, vol. 278, no. 26, 2003, pages 23301 - 10

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180185462A1 (en) * 2015-06-23 2018-07-05 Saint Louis University Peptides for inducing chagas disease responses
US10821164B2 (en) * 2015-06-23 2020-11-03 Saint Louis University Peptides for inducing Chagas disease responses

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