WO2016185135A1 - Traitement et detection des trypanosomoses - Google Patents

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Jean-Loup Lemesre
Etienne Pays
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Definitions

  • the present invention provides methods and compositions for preventing, treating, and diagnosing trypanosome infection. It relates in particular to the use of excreted / secreted antigens (exoantigens, secretome) and, more particularly, the identification of a protein excreted / secreted by trypanosomes, whose neutralization or inhibition makes it possible to confer effective protection against infection, development or spread of trypanosomes, mainly by vaccination.
  • the invention cross-reacts against different strains of trypanosomes, and thus provides effective methods and compositions for preventing and controlling trypanosome-induced infections and pathologies in mammals, diagnose them more accurately, and monitor the evolution of trypanosomes. infection after treatment. INTRODUCTION
  • Trypanosomes are protozoan parasites that infect mainly mammalian animals, but also humans.
  • the infection causes trypanosomiasis, or trypanosomiasis, in animals which can lead to death of the animal.
  • human African trypanosomiasis begins with an inoculation canker, followed by a lymphatic-blood phase, with fever, lymphadenopathy, hepatosplenomegaly, pruritus, and edema.
  • a meningoencephalitic phase follows, when the parasite enters the central nervous system, with different neurological signs and in particular sleep disorders (hence its name sleeping sickness).
  • Chagas disease (American human trypanosomiasis) is caused by Trypanosoma cruzi, transmitted by bedbugs.
  • T. cruzi penetrates through the skin, an erysipeloid or pseodofuruncular lesion (chagome) may appear, followed by unilateral bi-palpebral edema (Romana's sign).
  • the acute phase may go unnoticed, and more rarely, manifest as febrile hepatosplenomegaly.
  • the chronic phase is dominated by the gravity of the heart forms and the existence of digestive forms with mega organs.
  • Trypanosomes are characterized by high genetic diversity, which plays on tropism, virulence, transmissibility, and susceptibility to trypanocides.
  • the stercoraria group in which Trypanosoma cruzi, T. theileri, T. lewisi and T. musculi are placed and the Salivaria group, which itself comprises three main subgenera: Trypanozoon, Duttonella and Nannomonas.
  • the Trypanozoon subgenus includes extracellular trypanosome species that infect animals and humans, while Duttonella and Nannomonas infect only non-human mammals.
  • the subgenus Trypanozoon is composed of polymorphic trypanosomes (long form and short or squat form), with optional free flagellum and small kinetoplast and subterminal (posterior) position.
  • the main species of this subgenus are Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi and T. equip dum.
  • T. brucei comprises three subspecies: T. b. brucei, T. b. gambiense and T. b. rhodesiense, which are very close morphologically, antigenically and biochemically, and are distinguished mainly by their infectivity, pathogenicity and geographical distribution.
  • T. brucei comprises three subspecies: T. b. brucei, T. b. gambiense and T. b. rhodesiense, which are very close morphologically, antigenically and biochemically, and are distinguished mainly by their infectivity, pathogenicity
  • T. evansi is transmitted to cattle, horses and camels by biting flies other than tsetse flies (Tabanidae) in Africa, South America and South East Asia.
  • T. equiperdum has no invertebrate host (sexual transmission in horses), it has been highlighted in Europe, Asia, Africa and America.
  • Trypanosomes of the subgenus Duttonella are club-like or club-like.
  • the main species are T. vivax and T. uniform, which have a tropism for wild and domestic ruminants. Trypanosomes of the subgenus Nannomonas are small and have no free flagellum.
  • the main species are T. congolense and T. simiae, which have an important tropism for cattle, pigs and dogs.
  • T. congolense, T. vivax, T. brucei and T. evansi are the main agents responsible for trypanosomosis, especially in domestic mammals such as ruminants, cattle, pigs, sheep, goats, equines and the canids.
  • T. brucei, and in particular the subspecies T. b. gambiense is probably the best known because it is responsible for the chronic form of sleeping sickness in humans in West and Central Africa.
  • the subspecies T. b. rhodesiense is the causative agent of the acute form of sleeping sickness.
  • T. vivax is a parasite essentially ungulates in tropical Africa and transmission is provided by horseflies or tabanids.
  • T. evansi is transmitted to cattle, horses and dromedaries, and has significant economic repercussions throughout the breeding areas.
  • the human cases caused by T. evansi are exceptional. Rare cases of trypanosomosis caused by other trypanosome species (trypanosomes of the lewisi group, T. theileri) have been reported in humans and animals.
  • Trypanosomes have a complex life cycle that includes different morphological forms, depending on the subspecies.
  • the tsetse flies or tsetse fly
  • Parasites multiply in the dermis at the point of inoculation, giving rise to blood forms. This stage can last from 1 to 3 weeks.
  • the parasites invade the blood, the lymphatic system, as well as various organs, such as the heart or the kidneys, where they cause important lesions.
  • the sources of infection of domestic animals are also other infected domestic animals, or diseased wild animals or healthy carriers.
  • control of the disease is mainly based on the control of the vectors by the use of insecticides, used in particular for the impregnation of traps, which has an environmental impact.
  • insecticides used in particular for the impregnation of traps, which has an environmental impact.
  • control of bed bugs, vectors of Chagas Disease is undertaken with residual insecticides sprayed into homes, coupled with habitat improvement.
  • the ability of trypanosomes to escape the host's immune defenses by expressing variable antigens on their surface has hitherto prevented the development of effective vaccine strategies. Only a few trypanocidal molecules are available, but they induce significant side effects and many resistant strains of parasites have emerged. From the diagnostic point of view, this is generally limited to a suspicion based on the observation of symptoms. But to date, there are no reliable markers for rapid and specific detection of infection at reasonable costs.
  • the present invention provides methods and compositions for treating and diagnosing trypanosome infection. It relates to the use of excreted / secreted antigens (exoantigens, secretome) and, more particularly, the identification of a protein secreted by trypanosomes, including neutralization (by antibodies acquired by vaccination or by injection) or inhibition (by different molecules) can confer effective protection against infection, development or dissemination of trypanosomes.
  • the invention cross-reacts against different strains of trypanosomes, and thus provides effective methods and compositions for controlling trypanosome-induced infections and pathologies in their mammalian hosts. It also allows the detection of this protein and antibodies directed against it in any sample, as well as the monitoring of the evolution of trypanosomosis, with or without treatment. It also allows the preparation of primers and probes for the use of different molecular biology techniques, such as the "polymerase chain reaction” (PCR) applied to the diagnosis of trypanosomoses.
  • PCR polymerase chain reaction
  • compositions comprising (i) the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, a nucleic acid encoding said protein or said peptide, or an inhibitor of the TbKHCl protein and (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient.
  • the invention relates to compositions, such as vaccines, comprising (i) the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or peptide, (ii) a excipient pharmaceutically or veterinarily acceptable, and (iii) optionally an adjuvant advantageously chosen to enhance an immune response.
  • compositions such as vaccines, comprising (i) the TbKHCl protein, or one or more antigenic peptides thereof, complexed with or in combination with one or more other molecules trypanosomes, (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient, and (iii) optionally an adjuvant preferably selected to enhance an antibody response.
  • the invention relates to compositions comprising (i) an anti-TbKHCl antibody, or a fragment or derivative thereof, and (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient.
  • the subject of the invention is also a composition as defined above, or the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or said peptide, for its use to vaccinate or immunize a patient. mammal against trypanosome and / or trypanosomoses.
  • the subject of the invention is also a composition as defined above, or the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or said peptide for use in protecting a mammal against trypanosomiasis.
  • the subject of the invention is also a composition as defined above, or the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or said peptide, or an inhibitor thereof, for use in treating a mammal having trypanosomosis.
  • the invention further relates to the use of the TbKHCl protein or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or peptide, or a secretion extract enriched therewith , for the preparation of a vaccine for immunizing or protecting a mammal against trypanosome.
  • the invention also relates to the use of an inhibitor of the TbKHCl protein for the preparation of a medicament for the treatment of a mammal having a trypanosomosis.
  • the invention also relates to a method for treating a mammal having a trypanosomosis, comprising inhibiting the TbKHCl protein in said mammal. Inhibition can be achieved by administration of an inhibitor (by for example, an antibody or a molecule interfering with the binding or function of this protein at mammalian host tissues), or by vaccinating said mammal against TbKHCl protein or an antigen thereof.
  • an inhibitor by for example, an antibody or a molecule interfering with the binding or function of this protein at mammalian host tissues
  • the invention thus proposes novel immunotherapies of trypanosomoses using any anti-TbKHCl antibody, in particular monoclonal antibody, or derivatives of such antibodies or constructs using the amino acid or nucleotide sequence of a portion of such antibodies.
  • the invention further relates to any antibody specifically binding TbKHCl protein.
  • Another subject of the invention also relates to a method for in vitro diagnosis of trypanosomosis in a mammal, characterized in that it comprises the identification and / or measurement, in a sample of said mammal, of the presence of the TbKHCl protein. or antigenic peptides thereof or antibodies directed against this protein.
  • Another subject of the invention relates to a method for monitoring the evolution of a trypanosome infection in a mammal, characterized in that it comprises the identification and / or measurement of the amount of TbKHCl protein or antibodies against this protein in mammalian samples taken at different time intervals.
  • Another subject of the invention also relates to a method for determining the efficacy of a treatment against trypanosome in a mammal, characterized in that it comprises the identification and / or measurement of the amount of TbKHCl protein in samples of the mammal or antibodies directed against this protein taken at different time intervals during treatment, and possibly after treatment.
  • the invention also relates to
  • kits for measuring trypanosome in a test sample characterized in that they comprise at least one antibody as defined above, a medium suitable for the formation of an immune complex with said antibody, and at least one reagent for the detection of an immunological reaction.
  • kits for detecting antibodies directed against the TbKHCl protein for the diagnosis of infection using the TbKHCl protein, peptides, or natural or synthetic epitopes derived from this protein.
  • Another subject of the invention also relates to any diagnostic method using the nucleotide sequence of the TbKHCl protein for the diagnosis of trypanosomosis or for the precise identification of a species of trypanosome (by for example, making primers or probes allowing the use of different molecular biology techniques such as PCR or hybridization).
  • the invention can be implemented to prevent, treat, detect or monitor the evolution after vaccination or treatment of any condition caused by parasites of the genus Trypanosoma, in any mammal, especially in domestic animals or livestock, as well as in humans.
  • FIG. 1 An inhibitor of TbKHCl inhibits parasite proliferation in vitro.
  • FIG. 1 A TbKHCl inhibitor decreases the parasite load in vivo.
  • Figure 4 Mouse survival rate (protective effect) to a parasitic infection after vaccination according to the invention.
  • Figure 5 Detection of an infection by measurement of antibodies directed against the TbKHCl protein.
  • FIG. 6 Seroprotection test: The naive mice receive, 24 hours before infection with T. fao (2000 parasites), 300 of serum from mice immunized with the total secretome of T. b. gambiense Féo ("Total PSF Serum") or the fraction containing high molecular weights greater than 100 kDa ("HPM Serum> 100") or the fraction containing high molecular weights greater than 50 kDa (“HPM Serum> 50”) or the fraction containing the low molecular weights of less than 50 kDa (“BPM serum ⁇ 50”) or the fraction containing the molecular weights of between 50 and 100 kDa ("Serum 100 ⁇ PM> 50"). The survival of the mice is monitored according to the number of days post-infection with T. Feo.
  • FIG. 7 Cross seroprotection test.
  • the mice receive 24 hours before infection with T. b. brucei (2000 parasites), 300 serum from mice immunized with the total secretome of T. b. gambiense Féo ("Total PSF Serum") or the fraction containing high molecular weights greater than 50 kDa ("HPM Serum> 50”) or the fraction containing low molecular weights of less than 50 kDa ("BPM Serum ⁇ 50”) or serum of naive mice.
  • the survival of the mice is monitored according to the number of days post-infection with T. b. brucei.
  • FIG. 8 A: Mouse survival rate to a parasitic infection after vaccination according to the invention: the mice are immunized twice, in the presence of adjuvant (saponin), or by the total secretome of T. b. gambiense Féo ("PSF Total") or the fraction containing high molecular weights greater than 50 kDa ("HPM>50") or fraction containing low molecular weights less than 50 kDa ("BPM ⁇ 50").
  • the control mice receive the adjuvant alone ("controls").
  • the mice are infected 2 months later with T. b. brucei (2,000 parasites).
  • the survival of the mice is monitored according to the number of days post-infection with T. b. brucei.
  • mice survival rate of mice to a parasitic infection after vaccination according to the invention: the mice are immunized twice, in the presence of adjuvant (saponin), with the total secretome ("PSF Total") of T. b. brucei or T. b. brucei KO for kinesin.
  • the control mice receive the adjuvant alone ("controls").
  • the mice are infected 2 months later with T. b. brucei (2,000 parasites).
  • the survival of the mice is monitored according to the number of days postinfection by T. b. brucei.
  • mice survival rate of mice to a parasitic infection after vaccination according to the invention: the mice are immunized twice, in the presence of adjuvant (saponin), or by the total secretome of T. evansi ("Total PSF"). The control mice receive the adjuvant alone ("controls"). The mice are infected 2 months later with T. b. brucei (2,000 parasites). The survival of the mice is monitored according to the number of days post-infection with T. b. brucei.
  • FIG. 9 Protein profile obtained by electrophoretic migration of 5 ⁇ g of each sample under denaturing and non-reducing conditions and then stained with Coomassie blue. Frames identify protein bands that may contain TbKHCl.
  • Figure 10 Immunoblot equivalent antigen protein after semi-dry transfer 3h30 24mA. Primary antibody (purified Mabl antibody) diluted 1: 200; secondary antibody (anti-total IgG mouse) diluted to 1 / 5000th.
  • Figure 11 Immunoblots assembly. Antigen deposition, wet transfer O / N 4 ° C 10mA. Primary antibody (T. fao anti-FFP serum) diluted 1: 200; secondary antibody (anti-total IgG mouse) diluted to 1 / 5000th.
  • Primary antibody T. fao anti-FFP serum
  • secondary antibody anti-total IgG mouse
  • Figure 12 immunoblotting assembly. Antigen deposition, wet transfer O / N 4 ° C 10mA. Primary antibody (anti-HPM50 T. fao serum) diluted 1: 200; secondary antibody (anti-total IgG mouse) diluted to 1 / 5000th.
  • the present invention relates to methods and compositions for preventing, treating, diagnosing, and monitoring the course of trypanosome infection based on neutralization or inhibition of TbKHCl protein and its detection or that of antibodies to the TbKHCl protein. -this.
  • the invention makes it possible to confer effective protection against the infection, development or dissemination of different strains of trypanosomes, mainly by vaccination. It is usable in any mammal. Definitions
  • trypanosomiasis or “trypanosomiasis” generally refers to all disorders caused by a trypanosome in mammals.
  • trypanosomiasis includes Nagana, Surra, Dourine, sleeping sickness, African trypanosomiasis, American trypanosomiasis, Chagas disease, and all organ damage (eg, kidney, heart, liver, testis). , gastrointestinal tract, brain) by a trypanosome infection.
  • the term “treatment” or “treating” refers to any improvement in the condition of a subject.
  • the treatment can be curative or preventive.
  • the curative treatment is for an infected mammal and is intended to prevent, reduce, slow down or delay the development of a disease in the infected mammal. It includes in particular, in an infected subject, the decrease in the parasite load, the disappearance of the parasite, the decrease in its proliferation or its transmission, the decrease in disorders caused by the parasite and in particular organ damage, the reduction of symptoms , or the total eradication of the disease.
  • the curative treatment typically uses an inhibitor of the pathogen (immunotherapy or chemotherapy).
  • the preventive treatment is for a mammal not infected with the parasite and is intended to prevent, prevent or reduce infection in a healthy mammal.
  • Preventive treatment usually uses a pathogen antigen to generate a protective immune response.
  • the invention results from the identification of the TbKHCl protein, secreted by trypanosomes, whose neutralization or blocking makes it possible to inhibit the proliferation of the parasite, its transmission, and its virulence.
  • the invention further shows that immunization with a preparation containing the TbKHCl protein produced by different trypanosomes is possible and induces cross-protection against different types of trypanosomes.
  • This protein therefore represents a particularly relevant and attractive target for any therapeutic or diagnostic strategy of trypanosome and trypanosomoses.
  • An object of the invention thus resides in the TbKHCl protein, or one or more antigenic peptides thereof, or a nucleic acid encoding said protein or said peptide, or an inhibitor of the TbKHCl protein, for their use for the preventive treatment or curative of a trypanosome infection in a mammal.
  • the invention also resides in the use of the TbKHCl protein, or one or more antigenic peptides thereof, or an inhibitor thereof, for treating a trypanosome infection in a mammal.
  • the invention also relates to a method for treating a trypanosome infection in a mammal comprising inhibiting (eg, reducing, neutralizing or blocking) the TbKHCl protein in the mammal.
  • the inhibition of the protein comprises reducing the amount or the inhibition of the activity of the protein and can be obtained for example by (i) immunization or vaccination of the mammal with a preparation containing the TbKHCl protein, for example by administration an immunogenic amount of the TbKHCl protein or one or more antigenic fragments thereof; and / or (ii) by inhibiting the mammalian protein TbKHCl by administering an inhibitor or competitor thereof.
  • the term “inhibit” or “inhibition” of a protein denotes any reduction in the amount or the activity of said protein.
  • the inhibition thus denotes, in particular, a decrease or a reduction in the amount of said protein by compounds that affect its synthesis, secretion, or structure.
  • Inhibition also refers to any decrease in the activity of the protein by compounds (antibodies or derivatives, peptides, chemical molecules) acting directly on it or on one or more of its target molecules in mammalian hosts, in order to interfere with his action.
  • TbKHCl protein denotes a protein comprising the amino acid sequence represented in SEQ ID NO: 2 or any natural variant of this sequence resulting from polymorphisms or variations between species or subgroups of trypanosomes. , or any kinesin-like protein secreted by a trypanosome and having a sequence having at least 45% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 60%, more preferably at least 70%>. Even more preferably, the sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 2 is 80% or more, preferably at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%; 98%, 99% or more.
  • the sequence SEQ ID NO: 2 is shown below. It corresponds to the T. brucei brucei TbKHCl protein.
  • TQMVDVSEME TLRVTMQADL DEAKAHNREL AREVEQLKFE LTATAIPLTA RLRCPPCATA RGPSPFDAAR NLCSTQRKPP QKDGTPSPNN TQNENLQRTV KQLTEQLEFS MRERKSLQDR VEAVETQLAS HGVEVPGPYV PPIKLGFPGS APVTSSETDA REPPEDTDMD VLLRVKEEEI DVLLETIERQ EHLLNAARSN EEFHRRVICE LQQQMVTAQI QVEDPQNAPP PVDAIAMDEY MSILRLVRES ERKLAAQLAE RDGEDGAEVE ALLEKKDAEL QMKEETILEK ASKAQYAAKL CIRLKNQMLR CGITPCCELP DSYNELIERE EEELNEQLMC QDELLARLRS EEEEKHRMQN MLKSLNEERE RQSSVIRTVQ ERCELVEKKQ LVTAAHLSRL ATEKSQRE
  • T. brucei gambiense 99% identity with SEQ ID NO: 2
  • T. brucei rhodesiense T. evansi; T. equiperdum
  • T. congolense 76% identity with SEQ ID NO: 2
  • T. vivax (69% identity with SEQ ID NO: 2
  • T. musculi a parasite of the lewisi group (61% identity with SEQ ID NO: 2), and T.
  • TbKHCl protein sequence of these species is represented in SEQ ID NO: 3 (Trypanosoma brucei gambiense), SEQ ID NO: 4 (Trypanosoma congolense), SEQ ID NO: 5 (Trypanosoma vivax), and SEQ ID NO: 6 (Trypanosoma cruzi).
  • SEQ ID NO: 3 Trypanosoma brucei gambiense
  • SEQ ID NO: 4 Trypanosoma congolense
  • SEQ ID NO: 5 Trypanosoma vivax
  • SEQ ID NO: 6 Trypanosoma cruzi
  • sequence identity applied to a nucleic acid or protein, refers to the quantification (usually as a percentage) of the micletotide or amino acid residues matches between two aligned sequences using a standardized algorithm such as the Smith-Waterman alignment (Smith and Waterman (1981) J. Mol Bioi 147: 195-197), CLUSTALW (Thompson et al (1994) Nucieic Acids Res 22: 4673-4680; Altschul et al (1997) Nucieic Acids Res 17: 3389-402), or BLAST2 (Nucieic Acids Res 25: 3389-3402).
  • BLAST2 can be used in a standardized and reproducible way to insert gaps in one of the sequences to optimize alignment and achieve a more meaningful comparison.
  • the TbKHCl protein can be obtained in different ways. It can be in pure form, enriched extract (for example an enriched secretion extract), recombinant, synthetic, etc. It can first be isolated as a fraction eluted or purified from a trypanosome culture. For this purpose, the purified parasites are preferably incubated in a secretion medium (for example of the Ringer Lactate + glucose type), then the secretion products (secretome) are recovered, for example by centrifugation, filtered to sterilize and then passed on a column. affinity comprising an anti-TbKHCl antibody.
  • a secretion medium for example of the Ringer Lactate + glucose type
  • the TbKHCl protein is obtained from the secretome by differential filtration on filters having cutoff thresholds of 50 or 100 kDa, which make it possible to separate a fraction containing the high molecular weight molecules (HPM) and a fraction containing low molecular weight molecules (BPM).
  • the TbKHCl protein is present in the HPM fractions, in particular HPM50 and HPM 100.
  • the fraction enriched in protein TbKHC 1 obtained may further comprise proteins or peptides of different nature derived from trypanosome.
  • the TbKHCl protein having the property of binding and / or transporting other trypanosome molecules, in particular thanks to its coil-coil structure which favors its interaction with other molecules, the fraction obtained may comprise the TbKHCl protein, or peptides thereof, in complex or association with other proteins or peptides or trypanosome molecules.
  • the TbKHCl protein may moreover be concentrated and / or further purified from this fraction, to obtain a purity greater than 90%, for example 95% or more, in particular 98% or more, in particular a TbKHCl protein devoid of any other trypanosome protein.
  • the invention also provides a method of preparing an antigenic fraction, comprising obtaining a trypanosome secretome, differentially filtering the filter secretome having a cut-off of 50 or 100 kDa, and recovery of the high molecular weight fraction.
  • This method has different advantages: it makes it possible to improve the production yield of the fractions enriched in TbKHCl, it improves the reproducibility (similar protein assay for the different batches), and it preserves the immunogenicity of the antigens (the differential filtration alters less the antigenic structure than an acid elution).
  • the invention also relates to the preparation obtained by this method and its veterinary or pharmaceutical use, as illustrated in the present application.
  • the TbKHCl protein can also be produced recombinantly by expressing a coding nucleic acid in a host cell.
  • another subject of the invention resides in a process for producing TbKHCl protein, comprising the culture of a recombinant cell comprising a nucleic acid encoding TbKHCl under conditions permitting the expression and, optionally, the secretion of the protein.
  • TbKHC 1 then, the recovery and, optionally, the purification of the TbKHCl protein.
  • the cell used may be prokaryotic (for example a bacterium such as E. coli) or eukaryotic (for example a yeast, a mammalian or insect cell).
  • the nucleic acid encoding TbKHCl may be DNA or RNA, and its sequence may be determined by those skilled in the art depending on the protein sequence to be encoded. As an illustration of a sequence coding for the protein of SEQ ID NO: 2, mention may be made of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, which is represented below:
  • the nucleic sequence may further be optimized for expression in the chosen host cell.
  • Another subject of the invention resides in an expression vector comprising a nucleic acid encoding the TbKHCl protein, preferably under the control of a promoter.
  • Another object of the invention is a host cell containing a such vector, or containing a nucleic acid encoding the TbKHCl protein inserted into its genome.
  • the TbKHCl protein can also be obtained by artificial synthesis, using protein synthesizers. It can also be produced by a combination of these methods.
  • antigenic peptide or "antigenic fragment” denotes a peptide whose sequence or part of the sequence corresponds to a part of the sequence of the TbKHCl protein, and which is capable of inducing a immune response against TbKHCl protein.
  • An antigenic peptide therefore generally comprises at least one specific epitope of the TbKHCl protein, making it possible to induce an immune response directed specifically against TbKHCl.
  • a peptide denotes a molecule having from 4 to 500 amino acids, for example from 4 to 450 amino acids, for example from 4 to 300 amino acids, or less, for example from 4 to 50, 40, or 30, or less.
  • antigenic peptides within the meaning of the invention are the peptides comprising at least residues 1000-1111, 900-1111, 800-1111, 700-1111, 687-1111, or 500-1111, of the sequence SEQ ID NO : 2 or natural variants thereof.
  • a particular antigenic peptide is in particular a peptide comprising residues 687-1111 of SEQ ID NO: 2.
  • the antigenic protein or peptides according to the invention may comprise modifications, in particular chemical modifications, which do not alter their immunological specificity.
  • they can be chemically modified to improve their stability, their tropism, their solubility, or their immunogenicity.
  • modifications are for example the addition of phosphates, sugars or myristic acids, polyethylene glycol.
  • they may comprise, in addition to the immunogenic sequence, one or more residues promoting expression, stability, or immunogenicity.
  • the peptides may also be coupled to carrier molecules, or other epitopes, to increase their immunological potential, or complexed or associated with other proteins to increase their immunogenicity.
  • Particular peptides of the invention are peptides consisting of an immunogenic sequence of the TbKHCl protein. Inhibitor of TbKHCl
  • TbKHCl inhibitor refers to any compound capable of reducing the amount (e.g., production or secretion) or activity of the TbKHCl protein. It is typically a specific inhibitor, i.e. capable of acting on TbKHCl without direct effect on other proteins produced by the trypanosome or the infected mammal.
  • the compound inhibitor may be a ligand of the TbKHCl protein, such as for example an antibody or an antibody fragment or derivative, a nucleic acid encoding an antibody or antibody fragment or derivative, an inhibitory nucleic acid (antisense, siRNA, ribozyme, etc.
  • the inhibitor is a compound capable of specifically binding the TbKHCl protein and neutralizing it.
  • An example of such a compound is an antibody, or an antibody fragment or derivative, or an inhibitor carried by that antibody.
  • Specific binding refers to the fact that the specific inhibitor binds the TbKHCl protein and does not specifically bind other proteins, or with a much lower affinity (by a factor of 10 or more).
  • the inhibitor is a TbKHCl-binding antibody and does not bind endogenous proteins of the infected mammal.
  • the antibody may be a polyclonal, or a monoclonal, or an antibody fragment or derivative such as Fab, Fab'2 fragments, CDRs, single chain antibodies (eg ScFvs), nanobodies, antibodies human or humanized, etc.
  • Antibodies can be produced by techniques well known to those skilled in the art, such as, for example, immunization of a non-human animal, and recovery of serum or antibody-producing cells. The production of monoclonals can be obtained by obtaining hybridomas according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • antibodies according to the present invention can be generated by injecting the TbKHCl protein or an immunogenic peptide of the invention into animals (for example a rabbit or a mouse), then collecting the sera or the B cells. The selectivity of the antibodies can then be tested and confirmed by standard ELISA tests.
  • Techniques for producing poly- or monoclonal antibodies, ScFv fragments, human or humanized antibodies are described for example in Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94 / 02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93 / 01288.
  • a particular object of the invention resides in an antibody specifically binding the TbKHCl protein. More preferably, the invention resides in an antibody binding an epitope contained in the C-terminal region of the TbKHCl protein, for example an epitope contained in residues 687-1111 of the TbKHCl protein.
  • the antibody of the invention is preferably a monoclonal antibody.
  • Another subject of the invention resides in an anti-TbKHCl antibody obtainable by immunization of a non-human mammal with an immunogenic composition comprising a peptide comprising an epitope between residues 687 and 1111 of the TbKHCl protein ( terminals included).
  • Another subject of the invention resides in an Fab or Fab'2 fragment of an antibody as defined above.
  • Another object of the invention resides in a single anti-TbKHC 1 chain antibody. It may be nanobodies, ScFv, Tandem antibodies, etc.
  • TbKHCl inhibitory nucleic acid especially an antisense, a ribozyme or an interfering RNA specific for TbKHCl.
  • Such nucleic acids comprise a portion (generally from 5 to 50 consecutive bases) of the coding sequence of TbKHC 1 or its complementary strand, for example a portion of the sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand, and allow for specifically inhibit the expression (transcription or translation) of the protein.
  • Another particular inhibitor and object of the invention is a molecule inhibiting the effect of TbKHCl at the level of the mammalian host. It is in particular of any molecule specifically binding to target molecules recognized by TbKHCl at the host, in particular receptors of the host transmitting the signal normally induced by the TbKHCl protein or its components.
  • target molecules recognized by TbKHCl at the host in particular receptors of the host transmitting the signal normally induced by the TbKHCl protein or its components.
  • the invention relates to any pharmaceutical or veterinary composition
  • any pharmaceutical or veterinary composition comprising (i) the TbKHCl protein, one or more antigenic peptides thereof, or an inhibitor of the TbKHCl protein, and (ii) a pharmaceutically acceptable excipient. or veterinary.
  • Such compositions block the action of the TbKHCl protein and thus prevent trypanosome infection or control.
  • compositions of the invention are of the vaccine type and make it possible to induce a very powerful anti-parasitic immunity in the mammals.
  • a particular object of the invention relates to compositions comprising (i) TbKHC 1 protein, or antigenic peptide (s) thereof, (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient, and (iii) optionally an adjuvant.
  • Such compositions make it possible to vaccinate or immunize mammals against the TbKHC1 protein, and thus to protect the mammal against a trypanosome infection or to treat such an infection.
  • the vaccines may include several antigenic peptides, so as to increase the immunogenicity of the vaccine.
  • they may comprise several peptides, overlapping or not, comprising from 5 to 100 amino acids each and each comprising an amino acid sequence identical to a domain of the protein TbKHC 1 preferably comprised between the residues 687 and 1111.
  • the vaccines may include other parasitic molecules associated with TbKHC 1.
  • the vaccine comprises a single antigenic peptide.
  • a particular vaccine of the invention comprises antigenic peptides of TbKHC 1 proteins from different strains of trypanosomes, allowing increase the potential of the vaccine.
  • the vaccine may thus comprise one or more antigenic peptides of a TbKHC 1 protein of one or more trypanosome species.
  • the vaccine comprises an entire TbKHC 1 protein.
  • the vaccine comprises a nucleic acid encoding said TbKHC 1 protein or the antigenic peptide (s).
  • the composition according to the invention comprises the protein of sequence SEQ ID NO: 2 or a natural variant thereof, or a nucleic acid encoding said protein.
  • the composition according to the invention comprises a peptide comprising residues 1000 to 111 1 of the sequence SEQ ID NO: 2 or a natural variant thereof, a variant thereof having at least 90% sequence identity, or a nucleotide sequence encoding said peptide.
  • the protein or the antigenic peptide (s) or the nucleotide sequence are in pure form or enriched, recombinant, or synthetic extract.
  • the veterinary vaccine compositions of the invention advantageously comprise an immuno logically effective amount of the TbKHCl protein or of antigenic peptides derived therefrom, as previously described, or of a nucleic acid or expression vector encoding or overexpressing the protein. TbKHCl or the antigenic peptide (s) thereof.
  • the vaccines according to the present invention may comprise one or more adjuvants in order to increase their effectiveness.
  • adjuvants are well known in the state of the art.
  • aluminum salts such as aluminum hydroxide, metal salts, bacterial immunogens such as LPS, CT or LT adjuvants of classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, or TLR9
  • saponins and their derivatives oil-in-water or water-in-oil emulsions, polysaccharides, cationic liposomes, virosomes or polyelectrolytes.
  • Other immunomodulators may be used, such as fly saliva proteins, cytokines or heat shock proteins.
  • Vaccines according to the present invention may be monovalent (i.e., inducing responses against a single type of pathogen) or multivalent (i.e. capable of inducing a protective response against several types of distinct pathogens).
  • the invention thus provides a multivalent vaccine comprising (i) the TbKHCl protein, or one or more antigenic fragments thereof, (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient, (iii) optionally a adjuvant and (iv) at least one antigen from another parasite.
  • the vaccines according to the present invention may include several other parasitic molecules, in association with TbKHCl, especially other kinesins.
  • compositions of the invention comprise an inhibitor of the TbKHCl protein and make it possible to treat, in a powerful and rapid manner, a trypanosome infection in mammals.
  • a particular object relates to a pharmaceutical or veterinary composition comprising (i) an inhibitor of the TbKHCl protein and (ii) a pharmaceutically or veterinarily acceptable excipient.
  • Such compositions block the action of the TbKHCl protein and thus prevent trypanosome infection or control.
  • the inhibitor is an anti-TbKHCl antibody.
  • the invention relates to compositions characterized in that the inhibitor is an anti-TbKHCl antibody, or a fragment or derivative of such an antibody.
  • any type of acceptable excipient may be used.
  • isotonic solutions for example physiological water, PBS, Ringer lactate, medium 199, Ham medium
  • stabilizing and preservative excipients such as acids, sugars, phenoxyethanol, medium 199, albumin, amino acids and derivatives, for example.
  • the compositions of the invention may be in liquid form, or solid (powder). They can be packaged in any suitable container (ampoule, syringe, vial, flasks, etc.).
  • compositions advantageously comprise an effective amount of TbKHCl protein or antigenic peptide.
  • This amount can be easily adapted by those skilled in the art.
  • an effective amount of TbKHCl protein or peptide means an amount to induce an anti-TbKHCl antibody response in the treated mammal.
  • Such an amount is generally between 0.1 g and 1 mg / dose, for example between 1 g and 50 g / dose, especially between 1 g and 100 g / dose
  • the effective amount means an amount to inhibit by at least 10%, preferably at least 20%, 30%>, 40%), 50% or more the production or activity of TbKHCl in vitro or in vivo
  • such an amount is generally between 0.1 g and 1 mg of inhibitor / dose, preferably between 1 g and 500 g / dose.
  • compositions of the invention may be used alone, or in combination with other treatments, for example trypanocides such as in particular Pentamidine, Eflornithine, Nifurtimox, NECT, Suramine, Melarsoprol, Exinidazole, Oxaborole Diminazene, Isometamidium, Homidium.
  • trypanocides such as in particular Pentamidine, Eflornithine, Nifurtimox, NECT, Suramine, Melarsoprol, Exinidazole, Oxaborole Diminazene, Isometamidium, Homidium.
  • the invention can be used to treat any mammal susceptible to trypanosome infection, such as, for example, cattle, ovids, felids, camelids, canids, or humans.
  • the compositions according to the present invention are particularly useful for treating pathologies induced by trypanosomes such as anemia, weight loss, and / or immunosuppression.
  • the present invention also relates to a method for identifying, producing or optimizing anti-trypanosome compounds, comprising a step of evaluating the ability of a test compound to inhibit the activity or production (or secretion) of TbKHCl protein. Compounds endowed with such activity possess an important anti-trypanosome activity.
  • the invention also relates to any compound identified, produced or optimized according to the preceding method, for its use for the treatment of a trypanosome infection. Diagnosis of a trypanosome infection
  • the TbKHCl protein is also a target of interest for the detection, in a mammal, of the presence of trypanosome. Since this protein is secreted, it can be detected as well as any antibody against it (antigen and / or antibody search) or any nucleic acid encoding TbKHCl, in any fluid of the mammal, in particular in the blood. On the other hand, the protein as well as the antibodies can not only detect the presence of the parasite, but also follow the evolution of an infection and / or the effectiveness of a treatment.
  • an object of the invention also resides in a method of in vitro diagnosis of trypanosomosis or detection of the presence of trypanosome in a mammal, characterized in that it comprises measuring, in a sample of said mammal, or detection the presence of the TbKHCl protein or a nucleic acid encoding the TbKHCl protein or antibodies directed against TbKHCl.
  • An object of the invention is also a method for monitoring the evolution of a trypanosome infection in a mammal, characterized in that it comprises measuring the amount of TbKHCl protein or a nucleic acid encoding the protein. TbKHCl or antibodies against TbKHCl in mammalian samples taken at different time intervals.
  • the invention also relates to a method for determining the efficacy of a treatment against trypanosome in a mammal, characterized in that it comprises measuring the amount of TbKHCl protein or a nucleic acid encoding the TbKHCl protein or Antibodies to TbKHCl in mammalian samples taken at different time intervals during treatment.
  • the invention also relates to a method for in vitro diagnosis of trypanosomosis in a mammal, characterized in that it comprises the measurement, in a sample of said mammal, of the presence of the TbKHCl protein, of a fragment thereof, of a nucleotide sequence encoding TbKHCl, or antibodies directed against TbKHCl or against one or more antigenic peptides thereof.
  • the invention also relates to a method for monitoring the evolution of a trypanosome infection in a mammal, characterized in that it comprises measuring the amount of TbKHCl protein, a fragment thereof, of a nucleotide sequence encoding TbKHCl, or antibodies directed against TbKHCl, in mammalian samples taken at different time intervals.
  • the invention further relates to a method for determining the efficacy of a trypanosome treatment in a mammal, characterized in that comprises measuring the amount of TbKHCl protein, a fragment thereof, a nucleotide sequence encoding TbKHCl, or antibodies to TbKHCl, in mammalian samples taken at different time intervals during treatment . Determination of the presence or amount (relative) of TbKHCl protein or antibody can be carried out by any technique known per se, such as in particular by means of a specific ligand, for example an antibody or a fragment or derivative of antibody, or the protein or a fragment thereof or an epitope or mimotope.
  • the ligand is an antibody specific for the polypeptide, or a fragment of such an antibody (for example an Fab, Fab ', CDR, etc.), or a derivative of such an antibody (for example a single antibody). chain, ScFv), or the protein or a fragment thereof or an epitope or mimotope.
  • the ligand is typically immobilized on a support, such as a slide, ball, column, plate, etc.
  • the presence or amount of protein of interest or its fragments or antibodies in the sample can be detected by demonstrating a complex between the target and the ligand, for example by using a labeled ligand, using a second labeled revealing ligand, etc.
  • the amount of detected polypeptide can be compared with a reference value, for example a median or mean value observed in human patients or non-human mammals that are not infected, or at a value measured in parallel in a control sample.
  • a reference value for example a median or mean value observed in human patients or non-human mammals that are not infected, or at a value measured in parallel in a control sample.
  • All immunological techniques based on antigen-antibody reactions can be implemented, using either the TbKHCl protein or its fragments or natural or synthetic derived compounds or an epitope, a mimotope as an antigen, or molecules specifically recognizing the TbKHCl protein or its fragments or natural or synthetic derivative compounds (for example, antibodies, Fab fragments, Fab ', CDRs, or derivatives of an antibody or a nanobody).
  • the basic immunological techniques for example, agglutination, precipitation, immunoenzymatic technique, immunoblotting, western blot are adapted.
  • the invention detects the presence of nucleic acid encoding TbKHCl.
  • This detection can be carried out by techniques known per se to those skilled in the art, such as in particular by Northern Blot, selective hybridization, use of supports coated with oligonucleotide probes, selective amplification of nucleic acid, for example by RT-PCR, Quantitative PCR or ligation-PCR, etc.
  • These methods may include the use of a nucleic probe (eg an oligonucleotide) capable of selectively or specifically detecting the target nucleic acid in the sample.
  • the amplification may be carried out according to various methods known per se to those skilled in the art, such as PCR, CSF, transcription-mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA), NASBA, the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), RPA (Recombinase Polymerase Amplification), Southern blot, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • TMA transcription-mediated amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • NASBA the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), RPA (Recombinase Polymerase Amplification), Southern blot, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis
  • the method comprises detecting the presence or absence (or the (relative) amount) of a nucleic acid encoding TbKHCl by selective hybridization or selective amplification.
  • nucleic probes preferably immobilized on a support, such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • a support such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, etc.
  • the nucleic probes can be any nucleic acid (DNA, RNA, PNA, etc.), preferably single-stranded, comprising a specific sequence of a nucleic acid encoding TbKHC 1.
  • the probes typically comprise from 5 to 400 bases, preferably from 8 to 200, more preferably less than 100, and even more preferably less than 75, 60, 50, 40 or even 30 bases.
  • the probes may be synthetic oligonucleotides, produced on the basis of the sequence SEQ ID NO: 1 according to conventional synthesis techniques. Such probe oligonucleotides typically have from 10 to 50 bases, preferably from 20 to 40, for example about 25 bases.
  • the probes may be synthesized beforehand and then deposited on the support, or synthesized directly in situ, on the support, according to methods known per se to those skilled in the art.
  • the probes can also be manufactured by genetic techniques, for example by amplification, recombination, ligation, etc.
  • the probes thus defined constitute another object of the present application, as well as their uses (essentially in vitro) for the detection of a trypnanosome infection in a subject.
  • Hybridization can be carried out under standard conditions known to those skilled in the art and adjustable by it (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the hybridization can be carried out under conditions of high, medium or low stringency, depending on the desired level of sensitivity, the quantity of available material, etc.
  • suitable hybridization conditions include a temperature of 55 to 63 ° C for 2 to 18 hours.
  • Other hybridization conditions, adapted to high density substrates are for example a hybridization temperature between 45 and 55 ° C.
  • washes may be performed to remove unhybridized molecules, typically in SSC buffers comprising SDS, such as buffer comprising 0.1 to 10 X SSC and 0.5-0.01% SDS.
  • SSC buffers comprising SDS
  • Other wash buffers containing SSPE, MES, NaCl or EDTA may also be used.
  • a particular object of the invention thus resides in a method for detecting the presence of a trypanosome in a mammal, or for evaluating the response to a treatment against trypanosome, comprising contacting, under conditions permitting hybridization between sequences. Nucleic acids derived from a mammalian sample and a TbKHCl-specific nucleic acid probe, the formation of a hybrid being indicative of the presence of trypanosome.
  • the selective amplification is preferably carried out using a primer or pair of primers allowing the amplification of all or part of a nucleic acid encoding TbKHCl.
  • the primer may be specific for a coding sequence (e.g., SEQ ID NO: 1), or a region flanking the coding sequence.
  • the primer typically comprises a single-stranded nucleic acid, preferably between 5 and 50 bases long, preferably between 5 and 30.
  • Such a primer constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in in vitro) for detecting the presence of trypanosome in a subject.
  • another object of the invention is the use of a nucleotide primer or a set of nucleotide primers for amplifying all or part of a TbKHCl gene to detect the presence of trypanosome in a mammal.
  • Another particular object of the invention resides in a method for detecting the presence of trypanosome in a mammal, comprising bringing into contact, under conditions allowing amplification, nucleic acids derived from a sample of the mammal and a mammal.
  • specific primer of TbKHCl the existence of an amplification product being characteristic of the presence of trypanosome in this mammal.
  • the detection method is applicable to any biological sample of the mammal tested.
  • sample within the meaning of the invention any sample comprising nucleic acids or polypeptides.
  • a sample of blood, plasma, platelet, ganglion, saliva, urine, stool, etc. may be advantageously mentioned, more generally any tissue, organ or, advantageously, biological fluid comprising nucleic acids or polypeptides or antibodies.
  • the sample used for the detection method is a sample derived from blood, for example a sample of blood, serum or plasma.
  • the sample can be obtained by any technique known per se, for example by sampling, by non-invasive techniques, from collections or sample banks, etc.
  • the sample can by Moreover, it can be pre-treated to facilitate the accessibility of the protein or its nucleic acid, for example by lysis (mechanical, chemical, enzymatic, etc.), purification, centrifugation, separation, etc.
  • the sample can also be labeled, to facilitate the determination of the presence of the target molecules (fluorescent, radioactive, luminescent, chemical, enzymatic labeling, etc.).
  • the nucleic acids of the sample can also be separated, processed, enriched, purified, retro-transcribed, amplified, fragmented, etc.
  • the nucleic acids of the sample are the DNAs or RNAs, in particular the mRNAs or mRNAs of the sample.
  • the nucleic acids are the amplification product of the RNAs, in particular mRNAs; or cDNAs prepared from RNAs, especially mRNAs of the sample.
  • TbKHC 1 The presence of the protein (or nucleic acid encoding the protein) TbKHC 1 in the sample is indicative of the presence of trypanosome in the mammal of interest.
  • kits for detecting or measuring trypanosomes in a test sample characterized in that it comprises at least one ligand specific for the TbKHC 1 protein, and at least one reagent for the detection of a Reaction between ligand and TbKHC protein 1.
  • the ligand is an anti-TbKHCl antibody and the reagent allows the detection of an immune complex.
  • the kit may comprise a suitable support (for example a plate, column, chip, etc.) on which the ligand is immobilized, allowing easy detection of the formation of a complex.
  • the detection reagent may be a second ligand (e.g., antibody) binding the TbKHC 1 protein or binding the first ligand. It can be any other reagent to reveal the formation of a complex (enzyme, dye, etc.).
  • kits for detecting or measuring trypanosomes in a test sample characterized in that it comprises at least one ligand specific for an anti-TbKHCl antibody, and at least one reagent for the detection of a reaction between the ligand and the antibody.
  • the ligand is a TbKHC 1 protein or an antigen peptide of TbKHC 1, or a synthetic product, and the reagent allows the detection of an immune complex.
  • the kit may comprise a suitable support (for example a plate, column, chip, etc.) on which the ligand is immobilized, allowing easy detection of the formation of a complex.
  • the detection reagent may be a second ligand (e.g., antibody) binding the antibodies. It can be any other reagent to reveal the formation of a complex (enzyme, dye, etc.).
  • Another object relates to a kit for detecting or measuring trypanosome in a test sample, characterized in that it comprises at least one antibody according to claim 12 or the TbKHC 1 protein or a peptide thereof, a suitable medium. for forming an immune complex, and at least one reagent for detecting an immunological reaction.
  • Another object relates to a kit for detecting or measuring trypanosome in a test sample, characterized in that it comprises at least one TbKHCl-specific nucleic acid probe, a medium suitable for the formation of a hybridization, and at least one reagent for detecting a hybridization reaction.
  • Another subject of the present application concerns a product comprising a support on which at least one ligand specific for the TbKHCl protein is immobilized.
  • the ligand is an antibody or an anti-TbKHCl antibody fragment or derivative.
  • Another subject of the present application relates to a product comprising a support on which at least one TbKHCl protein or an antigenic peptide thereof is immobilized.
  • nucleic acid probe is a single-stranded DNA molecule, 10 to 200 nucleotides in length, having a sequence complementary to the gene encoding the TbKHCl protein.
  • the support can be any solid or semi-solid support having at least one surface, flat or non-flat (that is to say in 2 or 3 dimensions), allowing the immobilization of nucleic acids or polypeptides.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, polystyrene, teflon, etc.
  • the reagents can be immobilized on the surface of the support by known techniques or, in the case of nucleic acids, synthesized directly in situ on the support. Immobilization techniques include passive adsorption (Inouye et al., J. Clin Microbiol 28 (1990) 1469), the covalent bond.
  • the reagents immobilized on the support can be ordered according to a pre-established scheme, to facilitate the detection and identification of the complexes formed, and in a variable and adaptable density.
  • the products of the invention typically comprise control molecules for calibrating and / or normalizing the results.
  • mice Female Swiss mice 25-30 gr (Charles River, Domaine des Oncins, 69592 Cedex trees) maintained in the laboratory according to the regulations on the protection of animals. Parasites
  • the parasites are purified by ion exchange chromatography (DEAE cellulose) from the blood of infected mice, and incubated for 2 hours in a secretion medium (Ringer Lactate + 50mM glucose) at 37 ° C.
  • the secretion products are recovered by centrifugation (1200 g, 10 minutes 4 ° C.). This supernatant is filtered through 0.22 ⁇ , aliquoted and stored at -80 ° C. The amount of protein present is measured by the Bradford technique.
  • This secretome also called PSF (Parasite Soluble Factor) or secretory product, containing the TbKHCl protein, can be used as it is.
  • mice were immunized with a preparation containing TbKHCl protein to hybridize by fusion.
  • the resulting monoclonal antibodies were used to screen an expression library of T. b. gambiense.
  • the recognized clones were then used for the production of recombinants.
  • the selected monoclonal antibody, Mabl binds the C-terminal region of kinesin, a region that is predicted to be a coiled region. Preparation of a fraction enriched in TbKHCl protein by chromato graphy of affinity
  • the parasites are purified by ion exchange chromatography (DEAE cellulose) from the blood of infected mice, and incubated for 2 hours in a secretion medium (Ringer Lactate + 50mM glucose) at 37 ° C.
  • the secretion products (secretome) are recovered by centrifugation (1200 g, 10 minutes 4 ° C.). This supernatant is filtered on a 0.22 ⁇ m filter, aliquoted and stored at -80.degree.
  • the amount of protein present is measured by the Bradford technique.
  • the Mabl monoclonal antibody in buffered solution (0.5M carbonate, 5M NaCl, pH 8.3) is grafted onto a chromatography column (Sephadex CNBr). After 48 hours at 4 ° C. and 5 washes in carbonate buffer, the secretion products are deposited on this column. After passage and successive washings in secretion medium, the molecules hooked by the antibody are eluted by successive additions of glycine buffer 1M / HCl pH3 and glycine buffer ⁇ / NaOH pH1. The pH of the eluted fraction is adjusted to pH8. After dialysis in 0.015M PBS, the enriched fraction is aliquoted into tubes stored at -80 ° C. The amount obtained is measured according to the Bradford technique. The content of the enriched fraction is analyzed by gel electrophoresis and Western blotting.
  • the vaccine fractions were prepared from the secretion products by differential filtration.
  • the parasites were purified on an ion exchange column (DEAE cellulose) and allowed to secrete (200 ⁇ 10 6 / ml of secretory medium for 2 hours).
  • the secretion products (PSF) of the strains of the following trypanosome species were thus obtained: - T. brucei brucei (T. b.
  • T. brucei brucei KO for the two alleles of TbKHCl (T. b, b KO);
  • T. brucei gambiense T. Feo
  • T. evansi T. e
  • the PSFs were then fractionated by differential filtration allowing separation into high weights (HPM) and low molecular weight (BPM).
  • HPM high weights
  • BPM low molecular weight
  • Different cut-off thresholds were used for the filtrations: 50 kDa, which gives the fractions HPM 50 and BPM 50; and 100kDa, which gives the fractions HPM 100 and BPM 100.
  • the intermediate fraction results from the passage of the PSF first on the filter having the 50 kDa cut-off point, then on the filter having a cut-off threshold of 100 kDa, and corresponds to molecules with a MW> 50kDa, but ⁇ 100kDa.
  • the secretome is placed on a filter having a cut-off of 50 or 100 kDa; after centrifugation (4000 g, 1 hour, 4 ° C.), the fraction containing molecules having a molecular weight below the cut-off point (BPM, low molecular weight) is separated from that containing the molecules having a molecular weight greater than the cut-off point (HPM, high molecular weight).
  • BPM low molecular weight
  • HPM high molecular weight
  • TbKHCl protein is present in HPM fractions. Fractions are aliquoted into tubes stored at -80 ° C. The amount obtained in each fraction is measured according to the Bradford technique.
  • the monoclonal antibody Mabl was added to parasites in co-culture with feeder layers (concentration of Mabl in the culture 4 ⁇ g / ml). Compared with control, it inhibits parasite growth whereas the IgG2b control isotype (4 ⁇ g / mL concentration) has no effect (Figure 1).
  • Mabl 200 ⁇ g in 200 ⁇ of PBS intraperitoneally
  • the fraction enriched with TbKHCl protein is injected (10-20 ⁇ g / mouse) twice, 30 days apart (day 0 and day 30), subcutaneously into the mouse, with or without adjuvant (saponin, 25 ⁇ g per mouse). ).
  • the control mice receive the medium alone with or without adjuvant.
  • mice are infected 1, 2, or 3 months after the last injection (see Figure 3).
  • the parasitaemia of vaccinated mice and controls (medium alone ⁇ adjuvant) is evaluated daily for 25 days after infection and once weekly thereafter. The results are shown in Figure 4.
  • mice that received medium with or without adjuvant die to the 7-8 th day post-infection. Remarkably, 22 out of 26 mice (84.6%) that received 2 injections of TbKHCl + adjuvant protein survive. Addition of the adjuvant to the TbKHCl protein increases the survival rate of the vaccinated mice and the duration of vaccine efficacy.
  • mice are immunized with the protein TbKHCl, then infected two months later with either the same trypanosome or with a trypanosome of another species.
  • mice that have received serum from mice immunized with T. fao PSF or T. fao HPM50 are also protected against T. b. b (cross-protection) ( Figure 7).
  • mice receive two injections at 3 week intervals, in the presence of saponin (25 ⁇ g / mouse), fractions from T. b. gambiense (Feo) and, more precisely, total PSF (30 ⁇ g / injection), HPM50 (20 ⁇ g / injection), or BPM50 (20 ⁇ g / injection).
  • saponin 25 ⁇ g / mouse
  • fractions from T. b. gambiense Freo
  • total PSF 30 ⁇ g / injection
  • HPM50 (20 ⁇ g / injection
  • BPM50 20 ⁇ g / injection
  • the protective antigens are present mainly in the high molecular weights of T. Féo PSFs.
  • mice receive two injections of total PSF (50 of T. b.brucei or T. b.brucei KO for kinesin 30 days apart (D0 and D30), subcutaneously with adjuvant (saponin, 25 ⁇ g
  • adjuvant serum, plasma, or aponin alone
  • mice are infected 2 months after the last injection (J30) with 2000 live T. brucei parasites.
  • mice that received T. b. brucei survive show that all mice that received T. b. brucei survive, whereas mice that received T. b. brucei KO for kinesin died 8 days after infection, at the same time as mice
  • mice receive two injections of total PSF (50 ⁇ g) of T. evansi, 30 days apart (day 0 and day 30), subcutaneously with adjuvant (saponin, 25 ⁇ g per mouse).
  • the "control" mice receive the adjuvant alone.
  • the mice are infected 2 months after the last injection with T. evansi (2000 parasites).
  • the protein profiles obtained after migration under denaturing and non-reducing conditions of the secretome or secretome fractions (HPM or HBM), show the presence of a band of high molecular weight (around 125 kDa-box in Figure 9) sufficiently present in pathogenic species of trypanosomes (T. Feo; T. b. brucei; T. rhodesiense; T. evansi) to be detected after staining with Coomassie blue.
  • This band corresponds to the molecular weight of the TbKHCl protein.
  • this band seems to be absent or too small in T. b. brucei KO for kinesin.
  • this band is present in the HPM fractions and little revealed in the BPM fractions.
  • the HPM50 and HPM100 fractions concentrate the protective antigens.
  • the serum of the mice immunized with these fractions and protected made it possible to analyze the antigenic targets of the protective antibodies.
  • Molecular weight markers are used to estimate the molecular weight of the antigens revealed by the sera.
  • Purified Mab monoclonal antibody targets Kinesin TbKHCl. It recognizes proteins of high molecular weight and in particular a protein with an apparent molecular weight of approximately 125 kDa as well as a protein of 59 kDa which seems common to all trypanosome species studied. Our data show that the 125 kDa antigen corresponds to kinesin TbKHCl (125.89kDa). The 59kDa protein corresponds to a fragment of the protein. This recognition for the 125 kDa protein is very marked in the HPM 100 Feo and HPM50 Feo samples; lighter for PSF samples Feo, PSF T. b. brucei and weak or nonexistent for PSF T. b. brucei KO.
  • the anti-HPM 50 serum selectively targets the antigen corresponding to a molecular weight of 125 kDa: the differential filtration> 50 thus concentrates this antigen, which corresponds to the kinesin protein TbKHCl (125.89 kDa).
  • the 125-kDa antigen is practically no longer recognized by this serum in PSF T. b. brucei KO for TbKHCl. This confirms that the 125 kDa antigen corresponds to kinesin TbKHCl.
  • the anti-HPM serum 100 also preferably targets a 125 kDa antigen: the differential filtration> 100 concentrates this antigen which corresponds to the kinesin protein TbKHCl (125.89 kDa).

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Abstract

La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir,traiter et diagnostiquer une infection par les trypanosomes.Elle concerne l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et plus particulièrement l'identification d'une protéine excrétée/sécrétée par les trypanosomes, dont l'inhibition permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes, principalement par vaccination.Elle concerne l'utilisation de la protéine ou de ses dérivés ou une séquence nucléotidique dérivée de celle-ci,ou d'un extrait enrichi en cette protéine, ainsi que celle d'anticorps dirigés contre eux pour l'immunothérapie, le diagnostic et le suivi des infections par les trypanosomes.

Description

TRAITEMENT ET DETECTION DES TRYPANOSOMOSES
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne notamment l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine excrétée/sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou l'inhibition permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes, principalement par vaccination. L'invention permet une action croisée contre différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour prévenir et lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez les mammifères, les diagnostiquer plus précisément, et suivre l'évolution de l'infection après traitement. INTRODUCTION
Les trypanosomes (Trypanosoma) sont des protozoaires parasites infectant principalement les animaux mammifères, mais également les humains. L'infection provoque chez les animaux une trypanosomose, ou trypanosomiase, qui peut conduire à la mort de l'animal. Chez l'homme, la trypanosomose humaine africaine débute par un chancre d'inoculation, puis lui succède une phase lymphatico-sanguine, avec en particulier une fièvre, des adénopathies, une hépatosplénomégalie, un prurit et des œdèmes. Une phase méningoencéphalitique lui succède, lorsque le parasite rentre dans le système nerveux central, avec différents signes neurologiques et en particulier les troubles du sommeil (d'où son nom de maladie du sommeil). La maladie de Chagas (trypanosomose humaine américaine), est provoquée par Trypanosoma cruzi, transmis par les punaises. Lorsque T. cruzi pénètre à travers la peau, il peut apparaître une lésion cutanée érysipeloïde ou pseodofuronculeuse (chagome), puis ensuite parfois un œdème unilatéral bi-palpébral (Signe de Romana). La phase aiguë peut passer inaperçue, et plus rarement, se manifester par une hépatosplénomégalie fébrile. La phase chronique est dominée par la gravité des formes cardiaques et l'existence de formes digestives avec méga organes.
Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui joue sur le tropisme, la virulence, la transmissibilité, et la sensibilité aux trypanocides. Parmi les différents groupes de trypanosomes, on mentionnera particulièrement le groupe stercoraria, dans lequel se placent Trypanosoma cruzi, T. theileri, T. lewisi et T. musculi et le groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas. Le sous-genre Trypanozoon comporte des espèces de trypanosomes à développement extracellulaire qui infectent les animaux et l'homme, tandis que Duttonella et Nannomonas n'infectent que les mammifères non- humains. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec flagelle libre facultatif et kinétoplaste petit et en position subterminale (postérieur). Les principales espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi et T. équiper dum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, et qui se distinguent essentiellement par leur caractère infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux), il a été mis en évidence en Europe, Asie, Afrique et Amérique. Les trypanosomes du sous- genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin. Les principales espèces sont T. vivax et T. uniforme, qui ont un tropisme pour les ruminants sauvages et domestiques. Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont petits et n'ont pas de flagelle libre. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae, qui ont un tropisme important pour le bétail, le porc et le chien.
En Afrique, T. congolense, T. vivax, T. brucei et T. evansi sont les agents principaux responsables des trypanosomoses, notamment chez les mammifères domestiques tels que les ruminants, les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés et les canidés. T. brucei, et notamment la sous-espèce T. b. gambiense, est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce T. b. rhodesiense est l'agent responsable de la forme aiguë de la maladie du sommeil. T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés. T. equiperdum est également présent en Afrique. La sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes partout dans les régions d'élevage. Les cas humains provoqués par T. evansi sont exceptionnels. De rares cas de trypanosomoses provoquées par d'autres espèces de trypanosomes (trypanosomes du groupe lewisi, T. theileri) ont été rapportés chez l'homme et l'animal.
Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques, selon les sous-espèces. D'une manière générale, lors de l'infection, la glossine (ou mouche tsé-tsé) injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqûre les formes métacycliques infectantes. Les parasites se multiplient dans le derme au point d'inoculation, donnant naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, ainsi que différents organes, tels le cœur ou les reins, où ils provoquent d'importantes lésions. Les sources d'infection des animaux domestiques sont également les autres animaux domestiques infectés, ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. A l'heure actuelle, le contrôle de la maladie repose principalement sur le contrôle des vecteurs par l'utilisation d'insecticides, utilisés en particulier pour l'imprégnation de pièges, ce qui présente un impact environnemental. En Amérique du Sud, une lutte contre les punaises, vecteurs de la Maladie de Chagas, est entreprise avec des insecticides rémanents pulvérisés dans les habitations, associés à une amélioration de l'habitat. Chez les mammifères infectés, la capacité des trypanosomes à échapper aux défenses immunitaires de l'hôte en exprimant à leur surface des antigènes variables a empêché jusqu'à présent le développement de stratégies vaccinales efficaces. Seules quelques molécules trypanocides sont disponibles, mais elles induisent des effets secondaires importants et de nombreuses souches résistantes de parasites sont apparues. Sur le plan diagnostique, celui-ci se limite généralement à une suspicion basée sur l'observation de symptômes. Mais il n'existe pas à ce jour de marqueurs fiables permettant une détection rapide et spécifique d'une infection, à des coûts raisonnables.
Il existe donc un besoin dans l'art antérieur pour des approches efficaces de prévention, de traitement et de détection des infections à trypanosome.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation (par des anticorps acquis par vaccination ou par injection) ou l'inhibition (par différentes molécules) permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes. L'invention permet une action croisée contre différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez leurs hôtes mammifères. Elle permet également la détection de cette protéine et d'anticorps dirigés contre elle dans tout prélèvement, ainsi que le suivi de l'évolution de la trypanosomose, avec ou sans traitement. Elle permet également la confection d'amorces et de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire, telle que la « polymerase chain reaction « (PCR) appliquées au diagnostic des trypanosomoses.
Un objet de l'invention réside ainsi dans des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant (i) la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse immunitaire.
Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHCl, ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, complexé(e) à ou en association avec une ou plusieurs autres molécules de trypanosomes, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse anticorps.
Dans un autre mode particulier, l'invention concerne des compositions comprenant (i) un anticorps anti-TbKHCl, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire.
L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, pour son utilisation pour vacciner ou immuniser un mammifère contre le trypanosome et/ou les trypanosomoses.
L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide pour son utilisation pour protéger un mammifère contre les trypanosomoses.
L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de celle-ci, pour son utilisation pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.
L'invention concerne en outre l'utilisation de la protéine TbKHCl ou d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou d'un extrait de sécrétion enrichi en cette protéine, pour la préparation d'un vaccin pour immuniser ou protéger un mammifère contre le trypanosome.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine TbKHCl pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'un mammifère ayant une trypanosomose.
L'invention concerne également une méthode pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose, comprenant l'inhibition de la protéine TbKHCl chez ledit mammifère. L'inhibition peut être obtenue par administration d'un inhibiteur (par exemple un anticorps ou une molécule interférant avec la fixation ou la fonction de cette protéine au niveau des tissus des hôtes mammifères), ou par vaccination dudit mammifère contre la protéine TbKHCl ou un antigène de celle-ci. L'invention propose ainsi de nouvelles immunothérapies des trypanosomoses utilisant tout anticorps anti- TbKHCl, notamment monoclonal, ou des dérivés de tels anticorps ou des constructions utilisant la séquence en acides aminés ou en nucléotides d'une partie de tels anticorps.
L'invention a en outre pour objet tout anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHCl .
Un autre objet de l'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHCl ou des peptides antigéniques de celle-ci ou d'anticorps dirigés contre cette protéine.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre cette protéine dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.
Un autre objet de l'invention concerne encore une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure de la quantité de protéine TbKHCl dans des échantillons du mammifère ou d'anticorps dirigés contre cette protéine prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement, et éventuellement après traitement.
L'invention concerne par ailleurs également
- des kits de mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun avec ledit anticorps, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immuno logique.
- des kits de détection des anticorps dirigés contre la protéine TbKHCl pour le diagnostic de l'infection utilisant la protéine TbKHCl, des peptides, ou des épitopes naturels ou synthétiques dérivés de cette protéine.
Un autre objet de l'invention concerne également toute méthode de diagnostic utilisant la séquence nucléotidique de la protéine TbKHCl pour le diagnostic de trypanosomose ou pour l'identification précise d'une espèce de trypanosome (par exemple, la confection d'amorces ou de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire telles que la PCR ou l'hybridation).
L'invention peut être mise en œuvre pour prévenir, traiter, détecter ou suivre l'évolution après vaccination ou traitement de toute affection provoquée par les parasites du genre Trypanosoma, chez tout mammifère, notamment chez les animaux domestiques ou d'élevages, ainsi que chez l'homme.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Un inhibiteur de TbKHCl inhibe la prolifération parasitaire in vitro.
Figure 2 : Un inhibiteur de TbKHCl diminue la charge parasitaire in vivo.
Figure 3 : Stratégie de vaccination.
Figure 4 : Taux de survie de souris (effet protecteur) à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention. Figure 5 : Détection d'une infection par mesure d'anticorps dirigés contre la protéine TbKHCl .
Figure 6 : Test de séroprotection : Les souris naïves reçoivent, 24 heures avant l'infection par T. Féo (2 000 parasites), 300 de sérum provenant de souris immunisées avec le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« Sérum PSF total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 100 kDa (« Sérum HPM>100 ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« Sérum HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« Sérum BPM<50 ») ou la fraction contenant les poids moléculaires compris entre 50 et 100 kDa (« Sérum 100<PM>50 »). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. Féo.
Figure 7 : test de séroprotection croisée. Les souris reçoivent, 24 heures avant l'infection par T. b. brucei (2 000 parasites), 300 de sérum provenant de souris immunisées avec le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« Sérum PSF total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« Sérum HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« Sérum BPM<50 ») ou du sérum de souris naïves. La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei.
Figure 8 : A : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), soit par le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« PSF Total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« BPM<50 »). Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei. B : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), par le sécrétome total (« PSF Total ») de T. b. brucei ou de T. b. brucei KO pour la kinésine. Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours postinfection par T. b. brucei. C : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), soit par le sécrétome total de T. evansi (« PSF Total »). Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei.
Figure 9 : Profil protéique obtenu par migration électrophorétique de 5μg de chaque échantillon en condition dénaturante et non réductrice puis colorée au bleu de Coomassie. Les cadres identifient les bandes protéiques pouvant contenir la TbKHCl . Figure 10 : Immunoblot de équivalent protéine d'antigène après transfert semi-sec 3h30 24mA. Anticorps primaire (Anticorps Mabl purifié) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.
Figure 11 : Montage immunoblots. Dépôt ^g d'antigène, transfert humide O/N 4°C 10mA. Anticorps primaire (sérum anti-PSF T. Féo) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.
Figure 12 : Montage immunoblots. Dépôt ^g d'antigène, transfert humide O/N 4°C 10mA. Anticorps primaire (sérum anti-HPM50 T. Féo) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter, diagnostiquer et suivre l'évolution d'une infection par un trypanosome basées sur la neutralisation ou l'inhibition de la protéine TbKHCl et sur sa détection ou celle d'anticorps dirigés contre celle-ci. L'invention permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination de différentes souches de trypanosomes, principalement par vaccination. Elle est utilisable chez tout mammifère. Définitions
Le terme « trypanosomose » ou « trypanosomiase » désigne, de manière générale, tous les troubles causés par un trypanosome chez des mammifères. Le terme trypanosomose inclut notamment la Nagana, la Surra, la Dourine, la maladie du sommeil, la trypanosomose africaine, la trypanosomose américaine, la maladie de Chagas, ainsi que toutes les lésions causées aux organes (e.g., rein, cœur, foie, testicule, tube digestif, cerveau) par une infection à trypanosome.
Le terme « traitement » ou « traiter » désigne toute amélioration de l'état d'un sujet. Le traitement peut être curatif ou préventif. Le traitement curatif est destiné à un mammifère infecté et vise à empêcher, réduire, ralentir ou retarder le développement d'une maladie chez le mammifère infecté. Il comprend notamment, chez un sujet infecté, la diminution de la charge parasitaire, la disparition du parasite, la diminution de sa prolifération ou de sa transmission, la diminution des troubles causés par le parasite et notamment des lésions aux organes, la réduction des symptômes, ou l'éradication totale de la maladie. Le traitement curatif utilise typiquement un inhibiteur du pathogène (immunothérapie ou chimiothérapie). Le traitement préventif est destiné à un mammifère non-infecté par le parasite et vise à empêcher, prévenir ou réduire l'infection chez un mammifère sain. Le traitement préventif utilise généralement un antigène du pathogène, permettant de générer une réponse immunitaire protectrice.
Identification d'un facteur de virulence
L'invention découle de l'identification de la protéine TbKHCl, sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou le blocage permet d'inhiber la prolifération du parasite, sa transmission, et sa virulence. L'invention montre en outre qu'une immunisation avec une préparation contenant la protéine TbKHCl produite par différents trypanosomes, est possible et induit une protection croisée contre différents types de trypanosomes. Cette protéine représente donc une cible particulièrement pertinente et attractive pour toute stratégie thérapeutique ou diagnostique du trypanosome et des trypanosomoses.
Un objet de l'invention réside ainsi dans la protéine TbKHCl, ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl, pour leur utilisation pour le traitement préventif ou curatif d'une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention réside également dans l'utilisation de la protéine TbKHCl, ou d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un inhibiteur de celle-ci, pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention concerne également une méthode pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère comprenant une inhibition (e.g., une réduction, une neutralisation ou un blocage) de la protéine TbKHCl chez le mammifère. L'inhibition de la protéine comprend la réduction de la quantité ou l'inhibition de l'activité de la protéine et peut être obtenue par exemple (i) par immunisation ou vaccination du mammifère avec une préparation contenant la protéine TbKHCl, par exemple par administration d'une quantité immunogène de la protéine TbKHCl ou d'un ou de plusieurs fragments antigéniques de celle-ci ; et/ou (ii) par inhibition de la protéine TbKHCl présente chez le mammifère, par administration d'un inhibiteur ou d'un compétiteur de celle-ci.
Ainsi, au sens de l'invention, le terme « inhiber » ou « inhibition » d'une protéine désigne toute réduction de la quantité ou de l'activité de ladite protéine. L'inhibition désigne donc notamment une baisse ou une réduction de la quantité de ladite protéine par des composés affectant sa synthèse, sa sécrétion, ou sa structure. L'inhibition désigne également toute diminution de l'activité de la protéine par des composés (anticorps ou dérivés, peptides, molécules chimiques) agissant directement sur elle ou sur une ou plusieurs de ses molécules cibles chez les hôtes mammifères, afin d'interférer avec son action. Au sens de l'invention, le terme « protéine TbKHCl » désigne une protéine comprenant la séquence en acides aminés représentée dans SEQ ID NO : 2 ou tout variant naturel de cette séquence résultant de polymorphismes ou de variations entre espèces ou sous-groupes de trypanosomes, ou toute protéine de type kinésine sécrétée par un trypanosome et ayant une séquence ayant au moins 45% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 60%, plus préférentiellement au moins 70%>. Plus préférentiellement encore, l'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 est de 80% ou plus, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ; 98%, 99% ou plus. La séquence SEQ ID NO : 2 est représentée ci-dessous. Elle correspond à la protéine TbKHCl de T. brucei bruceï.
MSDADVKEGT AAGDSVAVPE SWKPDEGRR SRGESTGGTA AGDTGVPKNI ARCLVYCRLR
PRNKTDFKNG GFQLVTVSGN DIWKDQRFY KFDGAFGDEC TQSDIFEAVA VPCITHAFKG FCSALMCYGQ TGTGKSFTMC NTTPGQEGI I PRSAKLIFDK IQSDNARSYE VTGQFVQIYR
DNLGDLMSAT GRDRVDIHFD EQGGVELTGC SSHVLLSAQE FMRFYRIGND RRWTATAMN
PESSRGHTAL VLRIVSESPS DPEAGKLKGK ITFIDLAGYE RFSKTGITHD NPIMKDEAKC
INASLLSLGH WSCLSSGSR HIPWRDSKLT RILQDSIGGR SRTSIILTVG PSSDHLHETT
NSLQFGLRAM DVKVTAKQSV HVDYQKLAQK LQSLLDERDE RINLLEVQIA SRDAERHELM ERYNDRREDI DRRFEIEMAE LKRTGASEEQ MLNLREVYKA EVENLQEQQD EEFQYREEVY
SKEIVHLIRE QEHQEAKRRA EMKLAQDLI I AEFQKKLDNA REGTNDDLVR VLKQLSEKDA
ILASRANDTV RLHEHIEVLR EQVKELGGVP IEEATFPETF LDVGQVEEMR NRLEADVQRH
RAKGVELLAE VDRLSQLCSE RLEEINRLRD ENTQYRAALE NSGISLNDTD DLTEFLSEKR
TQMVDVSEME TLRVTMQADL DEAKAHNREL AREVEQLKFE LTATAIPLTA RLRCPPCATA RGPSPFDAAR NLCSTQRKPP QKDGTPSPNN TQNENLQRTV KQLTEQLEFS MRERKSLQDR VEAVETQLAS HGVEVPGPYV PPIKLGFPGS APVTSSETDA REPPEDTDMD VLLRVKEEEI DVLLETIERQ EHLLNAARSN EEFHRRVICE LQQQMVTAQI QVEDPQNAPP PVDAIAMDEY MSILRLVRES ERKLAAQLAE RDGEDGAEVE ALLEKKDAEL QMKEETILEK ASKAQYAAKL CIRLKNQMLR CGITPCCELP DSYNELIERE EEELNEQLMC QDELLARLRS EEEEKHRMQN MLKSLNEERE RQSSVIRTVQ ERCELVEKKQ LVTAAHLSRL ATEKSQREQI LEETLRRATQ ELLDCKIKMA MEKEAGSPGV LKRFLRRLRS N
Une recherche effectuée par les inventeurs a permis d'identifier d'autres protéines TbKHCl au sens de l'invention à partir d'autres espèces de trypanosomes, notamment à partir de T. brucei gambiense (99% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. brucei rhodesiense ; T. evansi ; T. equiperdum ; T. congolense (76% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. vivax (69% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. musculi (un parasite du groupe lewisi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2), et T. cruzi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2). La séquence des protéines TbKHCl de ces espèces est représentée dans SEQ ID NO : 3 (Trypanosoma brucei gambiense), SEQ ID NO : 4 (Trypanosoma congolense), SEQ ID NO : 5 (Trypanosoma vivax), et SEQ ID NO : 6 (Trypanosoma cruzi). Ces protéines représentent des exemples de protéines TbKHCl au sens de l'invention. Par ailleurs, l'homme du métier peut, sur la base des informations de la présente demande et des techniques classiques, identifier d'autres TbKHCl à partir d'autres sous-groupes de trypanosomes. Dans ce contexte, le terme «identité de séquence», appliqué à un acide nucléique ou une protéine, fait référence à la quantification (généralement en pourcentage) des correspondances de résidus de micléotides ou d'acides aminés entre deux séquences alignées en utilisant un algorithme normalisé tel que l'alignement de Smith- Waterman (Smith et Waterman (1981) J Mol Bioi 147: 195-197), CLUSTALW (Thompson et ai (1994) Nucieic Acids Res 22 : 4673- 4680; Altschul et al (1997) Nucieic Acids Res 17 : 3389-402), ou BLAST2 (Nucieic Acids Res 25: 3389-3402 ). BLAST2 peut être utilisé d'une manière standardisée et reproductible pour insérer des gaps dans l'une des séquences afin d'optimiser l'alignement et de parvenir à une comparaison plus significative.
La protéine TbKHCl peut être obtenue de différentes façons. Elle peut être sous forme pure, d'extrait enrichi (par exemple un extrait de sécrétion enrichi), recombinante, synthétique, etc. Elle peut tout d'abord être isolée sous forme de fraction éluée ou purifiée à partir d'une culture de trypanosomes. Pour cela, les parasites purifiés sont préférentiellement incubés dans un milieu de sécrétion (par exemple de type Ringer Lactate + glucose), puis les produits de sécrétion (sécrétome) sont récupérés, par exemple par centrifugation, filtrés pour stériliser, puis passés sur une colonne d'affinité comprenant un anticorps anti-TbKHCl . Après lavage, les molécules retenues sur la colonne sont éluées, permettant d'obtenir un extrait ou une fraction comprenant la protéine TbKHCl et/ou ses fragments. Dans une variante, la protéine TbKHCl est obtenue à partir du sécrétome par filtration différentielle sur filtres ayant des seuils de coupures de 50 ou 100 kDa, qui permettent de séparer une fraction contenant les molécules de hauts poids moléculaires (HPM) et une fraction contenant les molécules de bas poids moléculaires (BPM). La protéine TbKHCl est présente dans les fractions HPM, en particulier HPM50 et HPM 100.
La fraction enrichie en protéine TbKHC 1 obtenue peut en outre comprendre des protéines ou peptides de nature différente provenant de trypanosome. En particulier, la protéine TbKHCl ayant pour propriété de lier et/ou transporter d'autres molécules du trypanosome notamment grâce à sa structure coil-coil qui favorise son interaction avec d'autres molécules, la fraction obtenue peut comprendre la protéine TbKHCl, ou des peptides de celle-ci, en complexe ou association avec d'autres protéines ou peptides ou molécules de trypanosome. La protéine TbKHCl peut par ailleurs être concentrée et/ou purifiée davantage à partir de cette fraction, pour obtenir une pureté supérieure à 90%, par exemple de 95% ou plus, notamment de 98%> ou plus, en particulier une protéine TbKHCl dépourvue de toute autre protéine de trypanosome.
A cet égard, l'invention vise également un procédé de préparation d'une fraction antigénique, comprenant l'obtention d'un sécrétome de trypanosome, la fïltration différentielle du sécrétome sur filtre ayant un seuil de coupure de 50 ou 100 kDa, et la récupération de la fraction de haut poids moléculaire. Ce procédé présente différents avantages : il permet d'améliorer le rendement de production des fractions enrichies en TbKHCl, il améliore la reproductibilité (dosage protéique similaire pour les différents lots), et il conserve l'immunogénicité des antigènes (la fïltration différentielle altère moins la structure antigénique qu'une élution acide). L'invention concerne également la préparation obtenue par ce procédé et son utilisation vétérinaire ou pharmaceutique, comme illustré dans la présente demande.
La protéine TbKHCl peut également être produite par voie recombinante, en exprimant dans une cellule hôte un acide nucléique codant. A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans un procédé de production de protéine TbKHCl, comprenant la culture d'une cellule recombinante comprenant un acide nucléique codant TbKHCl dans des conditions permettant l'expression et, éventuellement la sécrétion de la protéine TbKHC 1 puis, la récupération et, éventuellement, la purification de la protéine TbKHCl . La cellule utilisée peut être procaryote (par exemple une bactérie telle que E. colï) ou eucaryote (par exemple une levure, une cellule de mammifère ou d'insecte). L'acide nucléique codant TbKHCl peut être de l'ADN ou de l'ARN, et sa séquence peut être déterminée par l'homme du métier en fonction de la séquence protéique à coder. A titre illustratif d'une séquence codant la protéine de SEQ ID NO : 2, on peut mentionner la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, qui est représentée ci-dessous :
ATGTCGGATG CCGATGTGAA AGAGGGAACG GCGGCCGGCG ATTCAGTGGC CGTTCCCGAG TCGGTTGTAA AACCAGATGA AGGACGGCGG AGCAGAGGTG AGTCTACTGG CGGGACAGCT GCTGGGGATA CCGGTGTGCC AAAGAATATA GCACGGTGTC TTGTTTATTG CAGGTTGAGG CCACGGAACA AGACTGATTT TAAGAACGGT GGGTTCCAAC TAGTGACAGT AAGCGGGAAT GATATTGTTG TGAAGGATCA ACGCTTTTAC AAGTTTGATG GTGCTTTTGG CGACGAATGT ACACAAAGTG ATATATTTGA AGCGGTGGCC GTCCCTTGCA TAACACACGC A TAAAGGT TTTTGCTCAG CGTTGATGTG CTACGGACAG ACGGGTACAG GTAAGTCTTT CACTATGTGT AATACCACTC CTGGCCAAGA AGGCATCATT CCACGGTCCG CCAAACTTAT TTTCGACAAA ATTCAATCAG ACAATGCGCG GAGTTATGAA GTGACAGGAC AGTTTGTTCA GATTTACCGT GACAACCTTG GTGACTTGAT GAGTGCAACT GGAAGGGACC GAGTGGATAT TCACTTCGAC GAACAAGGGG GCGTAGAACT TACCGGTTGC AGCTCCCATG TTCTTCTGAG TGCCCAAGAG TTTATGCGCT TTTACCGCAT CGGCAATGAC CGTCGGGTTG TAACTGCGAC TGCTATGAAT CCGGAGTCCA GCCGCGGCCA TACAGCTTTA GTTCTCCGCA TCGTATCAGA GAGCCCCAGC GACCCAGAGG CAGGTAAACT GAAGGGAAAG ATTACATTCA TCGACTTAGC AGGATACGAG CGTTTTAGTA AAACTGGTAT TACACATGAC AACCCCATTA TGAAGGATGA GGCGAAGTGC ATCAACGCCT CTCTTCTTTC ACTTGGTCAC GTTGTGTCGT GTTTGTCGTC AGGTAGCCGG CACATTCCTT GGCGTGATTC GAAGCTGACG CGGATCCTGC AGGACTCTAT TGGCGGAAGG AGCCGTACCT CTATTATTTT GACTGTTGGG CCAAGTAGTG ATCACCTCCA CGAAACCACA AATTCACTGC AGTTTGGTTT GCGAGCAATG GATGTGAAGG TGACGGCCAA ACAGTCGGTT CATGTGGATT ACCAGAAGCT GGCCCAGAAG CTGCAATCAC TCTTGGATGA AAGGGACGAG AGAATCAATT TACTCGAAGT GCAGATCGCT TCTCGTGACG CAGAAAGACA CGAGTTAATG GAGCGTTACA ACGATCGCCG GGAAGACATT GACAGACGTT TTGAGATTGA GATGGCTGAA CTGAAGAGAA CTGGTGCATC GGAAGAGCAG ATGCTGAACC TGCGTGAAGT ATACAAGGCT GAGGTGGAAA ACCTCCAGGA GCAGCAAGAC GAGGAGTTCC AATACAGGGA GGAAGTGTAT TCAAAGGAGA TCGTCCACCT TATTCGCGAG CAGGAGCATC AGGAAGCGAA GCGACGGGCA GAGATGAAAT TGGCGCAAGA TCTTATCATT GCGGAGTTCC AAAAGAAGCT CGACAACGCG CGTGAGGGAA CAAATGATGA TCTCGTCAGA GTTTTGAAGC AACTGTCCGA AAAGGACGCC ATATTGGCCA GCCGAGCGAA CGACACGGTG AGACTCCACG AACATATTGA GGTGCTCAGG GAGCAAGTGA AGGAGCTCGG TGGAGTGCCT ATAGAGGAGG CGACGTTTCC CGAAACCTTT CTGGACGTTG GCCAGGTGGA GGAGATGCGG AACCGGCTGG AGGCGGATGT GCAACGCCAT CGTGCTAAGG GTGTGGAATT GCTTGCGGAA GTGGATCGTC TTTCGCAGCT CTGCTCTGAG CGGTTGGAGG AGATAAACCG ACTCCGCGAC GAAAACACAC AATATCGCGC CGCATTGGAA AACAGTGGCA TTTCATTGAA TGACACTGAT GATTTGACGG AATTCCTTTC TGAGAAGCGC ACTCAGATGG TGGATGTTTC TGAGATGGAA ACTCTTCGTG TCACCATGCA GGCCGACCTT GATGAAGCGA AGGCGCACAA CCGGGAGCTG GCGCGGGAGG TGGAGCAGTT GAAGTTTGAA TTAACCGCAA CCGCTATTCC ACTCACAGCC CGGCTTCGAT GTCCGCCGTG CGCAACTGCA CGAGGTCCTT CCCCGTTTGA CGCCGCGCGC AACCTGTGTT CGACGCAGCG TAAACCACCT CAAAAGGATG GCACGCCATC CCCAAACAAC ACTCAAAATG AAAACTTGCA AAGGACCGTG AAGCAGCTTA CGGAGCAACT GGAATTCAGC ATGCGTGAGA GGAAGTCGCT TCAGGACCGC GTTGAGGCTG TTGAGACGCA ACTTGCTTCG CATGGTGTTG AGGTTCCGGG GCCGTACGTA CCCCCAATCA AACTTGGTTT CCCCGGCTCT GCACCAGTGA CGTCATCGGA AACAGATGCA AGGGAGCCAC CGGAGGATAC CGATATGGAT GTGCTGCTCC GTGTAAAAGA GGAGGAAATC GATGTGTTAT TGGAAACAAT TGAACGGCAG GAGCACTTGC TCAATGCTGC GAGGTCGAAT GAAGAGTTTC ACCGACGCGT CATTTGTGAG TTGCAGCAGC AGATGGTGAC TGCGCAAATC CAGGTGGAAG ATCCTCAGAA CGCCCCTCCT CCTGTTGACG CCATTGCAAT GGATGAGTAT ATGTCAATTT TGCGTTTAGT TCGGGAGTCC GAACGCAAGT TGGCAGCTCA ATTGGCTGAG CGCGATGGAG AGGATGGCGC GGAGGTGGAG GCCCTGTTGG AGAAGAAGGA TGCGGAACTA CAAATGAAGG AGGAGACCAT ACTCGAGAAG GCGTCGAAGG CGCAGTATGC AGCGAAGCTC TGCATTCGTC TGAAGAACCA GATGCTGCGT TGTGGCATCA CACCGTGTTG TGAGCTTCCA GACTCGTATA ACGAGTTGAT CGAGCGCGAA GAGGAGGAAC TGAATGAGCA ACTAATGTGC CAAGATGAAC TGTTAGCCAG GCTTCGTTCG GAGGAGGAAG AAAAGCATCG CATGCAGAAT ATGCTGAAAT CACTTAATGA GGAGCGCGAG AGGCAATCCA GCGTCATTCG AACTGTTCAA GAGCGCTGTG AACTGGTGGA AAAGAAACAA TTGGTTACGG CAGCCCACTT GTCGCGATTG GCAACGGAAA AATCCCAGAG GGAGCAAATT CTTGAGGAAA CGCTACGACG TGCAACACAA GAATTGTTGG ATTGCAAGAT TAAGATGGCC A GGAAAAAG AAGCAGGTAG CCCGGGTGTG TTAAAGCGTT TCCTCCGCCG CCTGCGCTCC AACTGA
La séquence nucléique peut en outre être optimisée pour l'expression dans la cellule hôte choisie. Un autre objet de l'invention réside dans un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant la protéine TbKHCl, de préférence sous contrôle d'un promoteur. Un autre objet de l'invention réside dans une cellule hôte contenant un tel vecteur, ou contenant un acide nucléique codant la protéine TbKHCl inséré dans son génome.
La protéine TbKHCl peut également être obtenue par synthèse artificielle, en utilisant des synthétiseurs de protéines. Elle peut aussi être produite par une combinaison de ces méthodes.
Au sens de l'invention, le terme « peptide antigénique » ou « fragment antigénique » désigne un peptide dont la séquence ou une partie de la séquence correspond à une partie de la séquence de la protéine TbKHCl, et qui est capable d'induire une réponse immunitaire contre la protéine TbKHCl . Un peptide antigénique comporte donc généralement au moins un épitope spécifique de la protéine TbKHCl, permettant d'induire une réponse immune dirigée spécifiquement contre TbKHCl . Un peptide désigne au sens de l'invention une molécule ayant de 4 à 500 acides aminés, par exemple de 4 à 450 acides aminés, par exemple de 4 à 300 acides aminés, ou moins, comme par exemple de 4 à 50, 40, ou 30, ou moins encore. Des exemples de peptides antigéniques au sens de l'invention sont les peptides comprenant au moins les résidus 1000-1111, 900-1111, 800-1111, 700-1111, 687-1111, ou 500-1111, de la séquence SEQ ID NO :2 ou de variants naturels de celle-ci. Un peptide antigénique particulier est notamment un peptide comprenant les résidus 687-1111 de SEQ ID NO : 2.
La protéine ou les peptides antigéniques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur spécificité immunologique. Ainsi notamment, ils peuvent être modifiés chimiquement pour améliorer leur stabilité, leur tropisme, leur solubilité, ou leur immunogénicité. Des exemples de modifications sont par exemple l'addition de phosphates, sucres ou acides myristiques, de polyéthylène glycol. Dans le cas plus particulier des peptides, ils peuvent comprendre, outre la séquence immunogène, un ou plusieurs résidus favorisant l'expression, la stabilité, ou l'immunogénicité. Les peptides peuvent aussi être couplés à des molécules porteuses, ou à d'autres épitopes, afin d'augmenter leur potentiel immunologique, ou complexés ou associés à d'autres protéines pour augmenter leur immunogénicité. Des peptides particuliers de l'invention sont des peptides consistant en une séquence immunogène de la protéine TbKHCl . Inhibiteur de TbKHCl
L'invention concerne également tout inhibiteur de TbKHCl et son utilisation pour le traitement d'infections à trypanosome. Le terme « inhibiteur de TbKHCl » désigne tout composé capable de réduire la quantité (par exemple la production ou la sécrétion) ou l'activité de la protéine TbKHCl . Il s'agit typiquement d'un inhibiteur spécifique, c'est-à-dire capable d'agir sur TbKHCl sans effet direct sur d'autres protéines produites par le trypanosome ou par le mammifère infecté. Le composé inhibiteur peut être un ligand de la protéine TbKHCl, comme par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique codant un anticorps ou fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique inhibiteur (antisens, siARN, ribozyme, etc.) inhibant la synthèse de la protéine, un peptide inhibant l'activité de TbKHCl, ou une molécule se liant spécifiquement aux molécules cibles reconnues par TbKHCl au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs transmettant le signal normalement induit par la protéine TbKHCl ou ses composantes, ou une combinaison de ceux-ci. Dans un mode particulier, l'inhibiteur est un composé capable de lier spécifiquement la protéine TbKHCl et de la neutraliser. Un exemple de tel composé est un anticorps, ou un fragment ou dérivé d'anticorps ou un inhibiteur véhiculé par cet anticorps. La liaison spécifique désigne le fait que l'inhibiteur spécifique lie la protéine TbKHCl et ne lie pas spécifiquement d'autres protéines, ou avec une affinité bien inférieure (d'un facteur 10 ou plus). De manière particulièrement préférée, l'inhibiteur est un anticorps liant TbKHCl et ne liant pas de protéines endogènes du mammifère infecté.
L'anticorps peut être un polyclonal, ou un monoclonal, ou un fragment ou dérivé d'anticorps tel que les fragments Fab, Fab'2, les CDRs, les anticorps simple-chaîne (par exemple les ScFv), les nanobodies, les anticorps humains ou humanisés, etc. Les anticorps peuvent être produits par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple l'immunisation d'un animal non-humain, et la récupération du sérum ou des cellules productrices d'anticorps. La production de monoclonaux peut être obtenue par obtention d'hybridomes selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemples, des anticorps selon la présente invention peuvent être générés en injectant la protéine TbKHCl ou un peptide immunogène de l'invention à des animaux (par exemple un lapin ou une souris), puis en récoltant les sérums ou les cellules B. La sélectivité des anticorps peut ensuite être testée et confirmée par des tests classiques de type ELISA. Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al, Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al, Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al, Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; WO93/01288.
Un objet particulier de l'invention réside dans un anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHCl . Plus préférentiellement, l'invention réside dans un anticorps liant un épitope contenu dans la région C-terminale de la protéine TbKHCl, par exemple un épitope contenu dans les résidus 687-1111 de la protéine TbKHCl . L'anticorps de l'invention est préférentiellement un anticorps monoclonal. Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps anti-TbKHCl susceptible d'être obtenu par immunisation d'un mammifère non- humain avec une composition immunogène comprenant un peptide comprenant un épitope compris entre les résidus 687 et 1111 de la protéine TbKHCl (bornes incluses).
Un autre objet de l'invention réside dans un fragment Fab ou Fab'2 d'un anticorps tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps simple-chaîne anti- TbKHC 1. Il peut s'agir de nanobodies, ScFv, anticorps Tandem, etc.
Un autre inhibiteur et objet de l'invention est un acide nucléique inhibiteur de TbKHCl, notamment un antisens, un ribozyme ou un ARN interférant spécifique de TbKHCl . De tels acides nucléiques comprennent une partie (généralement de 5 à 50 bases consécutives) de la séquence codante de TbKHC 1 ou de son brin complémentaire, par exemple une partie de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de son brin complémentaire, et permettent d'inhiber spécifiquement l'expression (transcription ou traduction) de la protéine.
Un autre inhibiteur et objet particulier de l'invention est une molécule inhibant l'effet de TbKHCl au niveau de l'hôte mammifère. Il s'agit en particulier de toute molécule se liant spécifiquement aux molécules-cibles reconnues par TbKHCl au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs de l'hôte transmettant le signai normalement induit par la protéine TbKHCl ou ses composantes. On peut citer à titre d'exemple des sucres, des peptides ou d'autres molécules (small drugs) bloquant la fixation de TbKHCl sur des récepteurs cellulaires ou humoraux de l'hôte.
Compositions vétérinaires et pharmaceutiques L'invention concerne toute composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) la protéine TbKHCl, un ou des peptides antigéniques de celle-ci, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHCl et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler.
Selon un premier mode de réalisation, les compositions de l'invention sont de type vaccin et permettent d'induire une immunité anti-parasitaire très puissante chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne des compositions comprenant (i) la protéine TbKHC 1 , ou un ou des peptides antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant. De telles compositions permettent de vacciner ou immuniser des mammifères contre la protéine TbKHC 1, et ainsi de protéger le mammifère contre une infection à trypanosome ou de traiter une telle infection.
Les vaccins peuvent comprendre plusieurs peptides antigéniques, de façon à augmenter le pouvoir immunogène du vaccin. Ainsi, ils peuvent comprendre plusieurs peptides, chevauchants ou non, comprenant de 5 à 100 acides aminés chacun et comprenant chacun une séquence d'acides aminés identique à un domaine de la protéine TbKHC 1 compris de préférence entre les résidus 687 et 1111. Les vaccins peuvent inclure d'autres molécules parasitaires associées à TbKHC 1. Dans un mode particulier, le vaccin comprend un seul peptide antigénique.
Dans un autre mode particulier, il comprend 2, 3 4, ou 5 peptides antigéniques distincts de TbKHC 1. A cet égard, un vaccin particulier de l'invention comprend des peptides antigéniques de protéines TbKHC 1 provenant de souches différentes de trypanosomes, permettant d'augmenter le potentiel du vaccin. Le vaccin peut ainsi comprendre un ou plusieurs peptides antigéniques d'une protéine TbKHC 1 d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes.
Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend une protéine TbKHC 1 entière.
Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend un acide nucléique codant ladite protéine TbKHC 1 ou le(s) peptide(s) antigénique(s). Dans un mode particulier, la composition selon l'invention comprend la protéine de séquence SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine.
Dans un mode plus particulier, la composition selon l'invention comprend un peptide comprenant les résidus 1000 à 111 1 de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant naturel de celle-ci, un variant de celui-ci ayant au moins 90% d'identité de séquence, ou une séquence nucléotidique codant ledit peptide.
Avantageusement, dans les compositions de l'invention, la protéine ou le(s) peptide(s) antigénique(s) ou la séquence nucléotidique sont sous forme pure ou d'extrait enrichi, recombinante, ou synthétique. Les compositions vaccinales vétérinaires de l'invention comprennent avantageusement une quantité immuno logiquement efficace de la protéine TbKHCl ou de peptides antigéniques issus de celle-ci, tels que précédemment décrits, ou d'un acide nucléique ou vecteur d'expression codant ou surexprimant la protéine TbKHCl ou le(s) peptide(s) antigénique(s) de celle-ci.
Les vaccins selon la présente invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants afin d'augmenter leur efficacité. Les adjuvants sont bien connus dans l'état de la technique. A titres d'exemples, on peut citer notamment les sels d'aluminium, tels que l'hydroxyde d'aluminium, les sels de métaux, les immunogènes bactériens tels le LPS, la CT ou la LT les adjuvants des classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, ou TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly-électrolytes. D'autres immunomodulateurs peuvent être utilisés, tels que les protéines de salive de mouche, les cytokines ou les protéines de choc thermique.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents (c'est-à-dire induisant une réponse contre un seul type de pathogène) ou multivalents (c'est-à-dire capable d'induire une réponse protectrice contre plusieurs types de pathogènes distincts). Dans un mode particulier, l'invention vise ainsi un vaccin multivalent comprenant (i) la protéine TbKHCl, ou un ou des fragments antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, (iii) optionnellement un adjuvant et (iv) au moins un antigène d'un autre parasite. Les vaccins selon la présente invention peuvent inclure plusieurs autres molécules parasitaires, en association avec TbKHCl, notamment d'autres kinésines.
Selon un autre mode de réalisation, les compositions de l'invention comprennent un inhibiteur de la protéine TbKHCl et permettent de traiter de manière puissante et rapide une infection à trypanosome chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier concerne une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) un inhibiteur de la protéine TbKHCl et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHCl et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler. Dans un mode préféré, l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHCl .
Ainsi, dans un mode particulier de mise en œuvre, l'invention concerne des compositions caractérisées en ce que l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHCl, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps. Dans les compositions de l'invention, tout type d'excipient acceptable peut être utilisé. A cet égard, on peut citer des solutions isotoniques, tampons phosphates ou autres solution salines et milieux de culture (par exemple eau physiologique, PBS, Ringer lactate, milieu 199, milieu Ham) et des excipients stabilisateurs et conservateurs (tels que acides, sucres, phénoxy-éthanol, milieu 199, albumine, acides aminés et dérivés, par exemple). Par ailleurs, les compositions de l'invention peuvent être sous forme liquide, ou solide (poudre). Elles peuvent être conditionnées dans tout conteneur adapté (ampoule, seringue, fiole, flacons, etc.).
Comme indiqué, les compositions comprennent avantageusement une quantité efficace de protéine TbKHCl ou de peptide antigénique. Cette quantité peut être aisément adaptée par l'homme du métier. D'une manière générale, une quantité efficace de protéine TbKHCl ou de peptide désigne une quantité permettant d'induire une réponse anticorps anti-TbKHCl chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,^g et lmg/dose, par exemple entre ^g et 50(^g/dose, notamment entre l(^g et 100 μg/dose. Dans le cas d'un inhibiteur de TbKHCl, la quantité efficace désigne une quantité permettant d'inhiber par au moins 10%, de préférence au moins 20%, 30%>, 40%), 50%o ou plus la production ou l'activité de TbKHCl in vitro ou in vivo, chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,^g et lmg d'inhibiteur/dose, de préférence entre ^g et 500μg/dose.
Les compositions de l'invention peuvent être utilisées seules, ou en combinaison avec d'autres traitements, comme par exemple des trypanocides tels que notamment Pentamidine, Eflornithine, Nifurtimox, NECT, Suramine, Melarsoprol, Fexinidazole, Oxaborole Diminazène, Isometamidium, Homidium.
L'invention peut être utilisée pour traiter tout mammifère susceptible d'être infecté par un trypanosome, tel que par exemple les bovidés, les ovidés, les félidés, les camélidés, les canidés, ou les humains. Les compositions selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter les pathologies induites par les trypanosomes comme notamment l'anémie, l'amaigrissement, et/ou une immunosuppression.
Production d'agents anti-trypanosomes
La présente invention concerne également une méthode d'identification, de production ou d'optimisation de composés anti-trypanosomes, comprenant une étape d'évaluation de la capacité d'un composé test à inhiber l'activité ou la production (ou sécrétion) de la protéine TbKHCl . Les composés doués d'une telle activité possèdent une action importante anti-trypanosome. L'invention concerne également tout composé identifié, produit ou optimisé selon la méthode précédente, pour son utilisation pour le traitement d'une infection à trypanosome. Diagnostic d'une infection à trypanosomes
La protéine TbKHCl constitue en outre une cible d'intérêt pour la détection, chez un mammifère, de la présence de trypanosome. Cette protéine étant sécrétée, elle peut être détectée ainsi que tout anticorps contre celle-ci (recherche d'antigène et/ou d'anticorps) ou tout acide nucléique codant TbKHCl, dans tout fluide du mammifère, en particulier dans le sang. Par ailleurs, la protéine comme les anticorps peuvent permettre non seulement de détecter la présence du parasite, mais également de suivre l'évolution d'une infection et/ou l'efficacité d'un traitement.
Ainsi, un objet de l'invention réside également dans une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose ou de détection de la présence de trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, ou la détection de la présence de la protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl .
Un objet de l'invention réside également dans une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.
L'invention concerne aussi une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl ou contre un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci.
L'invention concerne en outre une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.
L'invention concerne encore une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement. La détermination de la présence ou de la quantité (relative) de protéine TbKHCl ou d'anticorps peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, ou la protéine ou un de ses fragments ou un épitope ou un mimotope. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv), ou la protéine ou un de ses fragments ou un épitope ou un mimotope. Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité de protéine d'intérêt ou de ses fragments ou d'anticorps dans l'échantillon peuvent être détectées par la mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immuno logiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients humains ou des mammifères non-humains qui ne sont pas infectés, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin.
Toutes les techniques immunologiques basées sur les réactions antigènes- anticorps peuvent être mises en œuvre, utilisant soit la protéine TbKHCl ou ses fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques ou un épitope, un mimotope comme antigène, ou des molécules reconnaissant spécifiquement la protéine TbKHCl ou ses fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques (par exemple, anticorps, fragments Fab, Fab', CDR, ou des dérivés d'un anticorps ou un nanobody). Les techniques immunologiques de base, par exemple, agglutination, précipitation, technique immunoenzymatique, immunoempreinte, western blot sont adaptées.
Dans une autre variante, l'invention détecte la présence d'acide nucléique codant TbKHCl . Cette détection peut être effectuée par des techniques connues en soi de l'homme du métier, comme notamment par Northern Blot, hybridation sélective, utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, amplification sélective d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, la LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), la RPA (Recombinase Polymerase Amplification), le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc.
Selon un mode préféré de mise en œuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence (ou de la quantité (relative)) d'un acide nucléique codant TbKHCl par hybridation sélective ou amplification sélective.
L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi- solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'un acide nucléique codant TbKHC 1. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base de la séquence SEQ ID NO : 1 selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides sondes comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.
Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection d'une infection par trypnanosome chez un sujet.
L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63°C pendant 2 à 18 heures. D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité, sont par exemple une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCl ou du EDTA peuvent également être utilisés.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence d'un trypanosome chez un mammifère, ou pour évaluer la réponse à un traitement contre le trypanosome, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon du mammifère et d'une sonde nucléique spécifique de TbKHCl, la formation d'un hybride étant indicative de la présence de trypanosome.
L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique codant TbKHCl . L'amorce peut être spécifique d'une séquence codante (par exemple SEQ ID NO : 1), ou d'une région flanquant la séquence codante. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection de la présence de trypanosome chez un sujet.
A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un du gène TbKHCl pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon du mammifère et d'une d'amorce spécifique de TbKHCl, l'existence d'un produit d'amplification étant caractéristique de la présence de trypanosome chez ce mammifère.
La méthode de détection est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé. A ce titre, on entend de manière générale par « échantillon » au sens de l'invention tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, ganglion, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides ou des anticorps. Dans un mode de mise en œuvre préféré et particulièrement avantageux, l'échantillon utilisé pour la méthode de détection est un échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de plasma. L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité de la protéine ou de son acide nucléique, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.). Les acides nucléiques de l'échantillon peuvent par ailleurs être séparés, traités, enrichis, purifiés, rétro-transcrits, amplifiés, fragmentés, etc. Dans un mode particulier, les acides nucléiques de l'échantillon sont les ADN ou des ARN, notamment les ou des ARNm de l'échantillon. Dans un mode tout particulier, les acides nucléiques sont le produit d'amplification des ARN, notamment des ARNm ; ou les/des ADNc préparés à partir des ARN, notamment des ARNm de l'échantillon.
La présence de la protéine (ou d'un acide nucléique codant la protéine) TbKHC 1 dans l'échantillon est indicative de la présence de trypanosome chez le mammifère considéré. Kits
Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique de la protéine TbKHC 1, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction entre le ligand et la protéine TbKHC 1. De manière avantageuse, le ligand est un anticorps anti-TbKHCl et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un second ligand (e.g, anticorps) liant la protéine TbKHC 1 ou liant le premier ligand. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.).
Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique d'un anticorps anti-TbKHCl, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction entre le ligand et l'anticorps. De manière avantageuse, le ligand est une protéine TbKHC 1 ou un peptide antigénique de TbKHC 1, ou un produit de synthèse, et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un second ligand (e.g, anticorps) liant les anticorps. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.).
Un autre objet concerne un kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 12 ou la protéine TbKHC 1 ou un peptide de celle-ci, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immuno logique.
Un autre objet concerne un kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHCl, un milieu approprié pour la formation d'une hybridation, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction d'hybridation.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand spécifique de la protéine TbKHCl . De préférence, le ligand est un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps anti-TbKHCl .
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une protéine TbKHCl ou un peptide antigénique de celle-ci.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHCl . De préférence, la sonde nucléique est une molécule d'ADN simple-brin, de 10 à 200 nucléotides de longueur, ayant une séquence complémentaire du gène codant la protéine TbKHCl .
Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403. Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma préétabli, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES
Matériels & Méthodes
Animaux
Souris Swiss femelles 25-30 gr (Charles River, Domaine des Oncins, 69592 L'arbresle cedex) entretenues au laboratoire selon les règlements sur la protection des animaux. Parasites
Les souches de parasites suivantes ont été utilisées :
Trypanosoma brucei brucei (Antat LI E)
Trypanosoma brucei gambiense "Féo" (ITMAP 1893)
Trypanosoma brucei gambiense « Biyamina » (MHOM/SD 82),
Trypanosoma brucei brucei EATRO 1125
Trypanosoma musculi « Partinico II »
Trypanosoma brucei rhodesiense (Etat 1.2/R)
Trypanosoma evansi (Mantecal EC8)
Trypanosoma congolense (E325)
Trypanosoma cruzi (MN cl2)
Préparation du sécrétome
Les parasites sont purifiés par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE cellulose) à partir du sang de souris infectées, et incubés pendant 2 heures dans un milieu de sécrétion (Ringer Lactate + glucose 50mM) à 37°C. Les produits de sécrétion sont récupérés par centrifugation (1200 g, 10 minutes 4°C). Ce surnageant est filtré sur 0,22μιη, aliquoté et conservé à -80°C. La quantité de protéines présentes est mesurée par la technique de Bradford. Ce sécrétome, aussi appelé PSF {Parasite Soluble Factor) ou produit de sécrétion, contenant la protéine TbKHCl, peut être utilisé tel quel.
Production d'un anticorps anti-TbKHCl
Des souris BALB/c ont été immunisées avec une préparation contenant la protéine TbKHCl pour réaliser des hybridomes par fusion. Les anticorps monoclonaux résultants ont été utilisés pour cribler une banque d'expression de T. b. gambiense. Les clones reconnus ont ensuite été utilisés pour la production de recombinants. L'anticorps monoclonal sélectionné, Mabl, fixe la région C-terminale de la kinésine, région qui est prédite pour être une région enroulée. Préparation d'une fraction enrichie en protéine TbKHCl par chromato graphie d'affinité
Les parasites sont purifiés par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE cellulose) à partir du sang de souris infectées, et incubés pendant 2 heures dans un milieu de sécrétion (Ringer Lactate + glucose 50mM) à 37°C. Les produits de sécrétion (sécrétome) sont récupérés par centrifugation (1200 g, 10 minutes 4°C). Ce surnageant est filtré sur filtre 0,22μιη, aliquoté et conservé à -80°C. La quantité de protéines présentes est mesurée par la technique de Bradford.
L'anticorps monoclonal Mabl en solution tamponnée (carbonate 0 ,ΙΜ/NaCl 5M, pH 8,3) est greffé sur une colonne de chromatographie (Sephadex CNBr). Après 48 heures à 4°C, et 5 lavages en tampon carbonate, les produits de sécrétion sont déposés sur cette colonne. Après passage et lavages successifs en milieu de sécrétion, les molécules accrochées par l'anticorps sont éluées par additions successives de tampon glycine 1M/HC1 pH3 et de tampon glycine ΙΜ/NaOH, pHl l . Le pH de la fraction éluée est ajusté à pH8. Après dialyse en PBS 0,015M, la fraction enrichie est aliquotée dans des tubes conservés à -80°C. La quantité obtenue est mesurée selon la technique de Bradford. Le contenu de la fraction enrichie est analysé par électrophorèse sur gel et par Western blot.
Préparation d'une fraction enrichie en protéine TbKHCl par filtration différentielle Dans cet exemple, les fractions vaccinales ont été préparées à partir des produits de sécrétion par filtration différentielle. Les parasites ont été purifiés sur colonne échangeuse d'ions (DEAE cellulose) et mis à sécréter (200x 106/ml de milieu de sécrétion pendant 2 heures). Les produits de sécrétion (PSF) des souches des espèces de trypanosomes suivantes ont ainsi été obtenus: - T. brucei brucei (T. b. b) ;
- T. brucei brucei KO pour les deux allèles de TbKHCl (T. b. b KO);
- T. brucei gambiense (T. Féo) ;
- T. evansi (T. e). Les PSF ont ensuite été fractionnés par filtration différentielle permettant une séparation en hauts poids (HPM) et bas poids moléculaires (BPM). Différents seuils de coupure ont été utilisés pour les fîltrations : 50kDa, qui donne les fractions HPM 50 et BPM 50 ; et lOOkDa, qui donne les fractions HPM 100 et BPM 100. La fraction intermédiaire résulte du passage des PSF d'abord sur le filtre ayant le seuil de coupure de 50 kDa, puis ensuite sur le filtre ayant un seuil de coupure de lOOkDa, et correspond aux molécules ayant un PM >50kDa, mais <100kDa. Le sécrétome est placé sur un filtre ayant un seuil de coupure de 50 ou 100 kDa ; après centrifugation (4000g, 1 heure, 4°C), la fraction contenant les molécules ayant un poids moléculaire inférieur au seuil de coupure (BPM, bas poids moléculaire) est séparée de celle contenant les molécules ayant un poids moléculaire supérieur au seuil de coupure (HPM, haut poids moléculaire). La protéine TbKHCl est présente dans les fractions HPM. Les fractions sont aliquotées dans des tubes conservés à -80°C. La quantité obtenue dans chaque fraction est mesurée selon la technique de Bradford.
Exemple 1 : Inhibition de la croissance des parasites par un anticorps monoclonal dirigé contre la Kinésine
In vitro, l'anticorps monoclonal Mabl a été ajouté à des parasites en co-culture avec des cellules nourricières (feeder layers) (concentration en Mabl dans la culture 4μg/mL). Comparé au contrôle, il inhibe la croissance parasitaire tandis que F isotype contrôle IgG2b (concentration 4μg/mL) n'a pas d'effet (Figure 1).
In vivo, l'injection de Mabl (200 μg dans 200μί de PBS par voie intrapéritonéale) à des souris parasitées depuis 2 jours inhibe le développement de la parasitémie
(exprimée en loglO du nombre de parasites par mL de sang), l'isotype contrôle IgG2b (200 μg dans 200 de PBS par voie intrapéritonéale) est sans effet (Figure 2).
Exemple 2 : Protection in vivo contre les parasites par vaccination
La fraction enrichie en protéine TbKHCl est injectée (10-20 μg/souris) deux fois, à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée à la souris, avec ou sans adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris contrôles reçoivent le milieu seul avec ou sans adjuvant.
Les souris sont infectées 1, 2, ou 3 mois après la dernière injection (voir Figure 3).
La parasitémie des souris vaccinées et des contrôles (milieu seul ± adjuvant) est évaluée quotidiennement pendant les 25 jours suivant l'infection, puis une fois par semaine ensuite. Les résultats sont présentés sur la Figure 4.
Les souris contrôles ayant reçu le milieu avec ou sans adjuvant meurent vers le 7-8eme jour post infection. De manière remarquable, 22 souris sur 26 (84,6%) ayant reçu 2 injections de protéine TbKHCl + adjuvant survivent. L'addition de l'adjuvant à la protéine TbKHCl augmente le taux de survie des souris vaccinées et la durée d'efficacité du vaccin.
Exemple 3 : La vaccination avec TbKHCl induit une protection croisée
Les souris sont immunisées avec la protéine TbKHCl, puis infectées deux mois après soit avec le même trypanosome soit avec un trypanosome d'une autre espèce. Lots Origine de Nombre Infection 2 mois Etude
TbKHCl pour d'injections sous après la dernière parasitémie et immunisation cutanées + injection + survie
saponine adjuvant
Lot 1 (14 T. brucei 2 T. b. gambiense Aucun parasite souris) gambiense détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours
Lot 2 (14 T. brucei 2 T. b. brucei Aucun parasite souris) gambiense détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours
Ces résultats montrent une protection croisée, la protéine TbKHCl de T. brucei gambiense étant capable d'induire une protection contre une infection par T. brucei brucei.
Exemple 4 : Diagnostic de patients infectés
Présence d'anticorps anti-TbKHCl dans le sérum des malades atteints de trypanosomose humaine africaine et leur absence dans le sérum des sujets contrôles de la même région endémique.
Les résultats sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que des anticorps anti-kinésine TbKHCl ont été détectés chez tous les patients testés atteints de trypanosomose humaine africaine. Ces résultats illustrent ainsi la possibilité de discriminer les patients infectés par mesure d'anticorps dirigés contre TbKHCl . Exemple 5 : Essai de protection par sérothérapie
Des essais de sérothérapie effectués sur des lots de 5, 8 ou 10 souris, ont mis en évidence que les sérums de souris ayant reçu deux injections espacées de trois semaines de PSF de T. Féo totaux (30μg/injection), ou de fractions HPM 50 (20μg/injection) ou HPM 100 (20μg/injection), en présence de saponine {25 ig), protègent efficacement (100% de protection) les souris naïves expérimentalement infectées par T. Féo (2 000 parasites en sous-cutané) (Figure 6). En revanche, les sérums des souris ayant reçu deux injections espacées de un mois de fractions BPM50 ou intermédiaire (100<PM>50) n'ont pas d'effet protecteur chez les souris naïves infectées. Les souris recevant du sérum de souris normal avant l'infection (non indiquées sur la Figure 6) meurent 7 jours après l'infection.
De plus, les souris ayant reçu du sérum de souris immunisées avec les PSF de T. Féo ou avec la fraction HPM50 de T. Féo sont aussi protégées contre une infection à T. b. b (protection croisée) (Figure 7).
Exemple 6 : Essai de protection par vaccination
6.1. Vaccination avec une fraction de T. b. gambiense (Féo)
Les souris naïves reçoivent deux injections à 3 semaines d'intervalle, en présence de saponine (25μg/souris), de fractions provenant de T. b. gambiense (Féo) et, plus précisément, de PSF total (30μg/injection), de HPM50 (20μg/injection), ou de BPM50 (20μg/injection). Les souris sont ensuite challengées par des parasites vivants T. b. b (2 000 par souris) deux mois après l'administration de la deuxième immunisation.
Les résultats présentés sur la figure 8A montrent :
- que les antigènes protecteurs sont présents principalement dans les hauts poids moléculaires des PSF de T. Féo ; et
- qu'une protection croisée est obtenue contre une infection à T. b. brucei.
6.2. Vaccination avec une fraction de T.b. brucei
Les souris reçoivent deux injections de PSF total (50 de T. b. brucei ou de T. b. brucei KO pour la kinésine à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée avec adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris « contrôles » reçoivent l'adjuvant seul. Les souris sont infectées 2 mois après la dernière injection (J30) par 2000 parasites vivants de T. b. brucei.
Les résultats présentés sur la figure 8B montrent que toutes les souris ayant reçu le PSF de T. b. brucei survivent, alors que les souris ayant reçu le PSF de T. b. brucei KO pour la kinésine sont mortes 8 jours après l'infection, en même temps que les souris
« contrôles ». 6.3. Vaccination avec une fraction de T. evansi
Les souris reçoivent deux injections de PSF total (50 μg) de T. evansi, à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée avec adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris « contrôles » reçoivent l'adjuvant seul. Les souris sont infectées 2 mois après la dernière injection par T. evansi (2000 parasites).
Les résultats présentés sur la figure 8C montrent une survie améliorée des souris ayant reçu le PSF de T. evansi, alors que tous les témoins meurent.
Exemple 7 : Analyses protéomiques
7.1. Profils protéiques
Les profils protéiques, obtenus après migration en conditions dénaturantes et non réductrices du sécrétome ou de fractions du sécrétome (HPM ou HBM), montrent la présence d'une bande de haut poids moléculaire (autour de 125 kDa- encadré sur la Figure 9) suffisamment présente chez les espèces pathogènes de trypanosomes {T. Féo ; T. b. brucei ; T. rhodesiense ; T. evansi) pour être détectée après coloration au bleu de Coomassie. Cette bande correspond au poids moléculaire de la protéine TbKHCl . En revanche, cette bande semble absente ou en trop faible quantité chez T. b. brucei KO pour la kinésine. De manière significative, cette bande est bien présente dans les fractions HPM et peu révélée dans les fractions BPM.
7.2. Spectrométrie de masse
Tous les échantillons ont étés analysés par HPLC nano débit (Ultimate 3000, Dionex) couplée à un spectromètre de masse ayant une source nanoelectrospray (Orbitrap Elite, Thermo Fisher Scientific). Les peptides ont été séparés sur une colonne capillaire (phase inverse Cl 8, Nano Viper, Dionex) suivant un gradient de 0-40% de B en 60 min (run de 105 min) (A = 0,1% acide formique, 2% acétonitrile ; B = 0.1 % acide formique dans acétonitrile) à un débit de 300 nl/min. Les spectres ont été enregistrés via le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Les données spectrales ont été analysées via le logiciel MaxQuant 1.5.0.0 puis retraités avec le logiciel Perseus 1.5.3.0 après utilisation du script Leading v2.2 développé par Oana Vigy. Nous avons utilisé comme base de données : Uniprot_Trypanosoma-all_2016_01.fasta avec les modifications suivantes : Carbamidomethylation (C) en fixe et Oxydation (M) en variable. Cette technique a permis d'identifier la présence de TbKHCl dans les échantillons protecteurs de T. Féo (PSF Féo et HPM50) et son absence dans la fraction BPM 50.
7.3. Analyse du profil immunologique par Western blot
Après filtration différentielle des produits de sécrétion PSF, les fractions HPM50 et HPM100 concentrent les antigènes protecteurs. Le sérum des souris immunisées par ces fractions et protégées a permis d'analyser les cibles antigéniques des anticorps protecteurs. Les marqueurs de poids moléculaire (MM) permettent d'estimer le poids moléculaire des antigènes révélés par les sérums.
Western blot révélés par le Mabl purifié (Figure 10):
L'anticorps monoclonal Mabl purifié cible la Kinésine TbKHCl . Il reconnaît des protéines de hauts poids moléculaire et notamment une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 125 kDa ainsi qu'une protéine de 59 kDa qui semble commune à toutes les espèces de trypanosomes étudiées. Nos données montrent que l'antigène de 125 kDa correspond à la kinésine TbKHCl (125,89kDa). La protéine de 59kDa correspond à un fragment de la protéine. Cette reconnaissance pour la protéine de 125 kDa est très marquée dans les échantillons HPM 100 Féo et HPM50 Féo ; plus légère pour les échantillons PSF Féo, PSF T. b. brucei et faible voire inexistante pour les échantillons PSF T. b. brucei KO.
Western blot révélés par le sérum anti-PSF féo (Figure 11):
Deux complexes immunogènes majeurs, compris entre 198 et 120kDa et autour de 55kDa, sont révélés par le sérum anti-PSF Féo.
Western blot révélés par le sérum anti-HPM50 Féo (Figure 12) :
Le sérum anti-HPM 50 cible sélectivement l'antigène correspondant à un poids moléculaire de 125 kDa : La filtration différentielle >50 concentre donc bien cet antigène, qui correspond à la protéine kinésine TbKHCl (125,89kDa). L'antigène de 125 kDa n'est pratiquement plus reconnu par ce sérum dans le PSF T. b. brucei KO pour TbKHCl . Cela confirme bien que l'antigène de 125 kDa correspond bien à la kinésine TbKHCl . Western blot révélés par le sérum anti-HPM100 Féo :
Le sérum anti-HPM 100 cible aussi préférentiellement un antigène de 125 kDa : La fïltration différentielle >100 concentre cet antigène qui correspond à la protéine kinésine TbKHCl (125,89kDa).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) la protéine TbKHC 1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci ; un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide ; ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la protéine de séquence SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine.
4. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide comprenant les résidus 1000 à 111 1 de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant naturel de celle-ci, un variant de celui-ci ayant au moins 90% d'identité de séquence, ou une séquence nucléotidique codant ledit peptide.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la protéine ou le(s) peptide(s) antigénique(s) ou la séquence nucléotidique sont sous forme pure ou d'extrait enrichi, recombinante, ou synthétique.
6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHCl, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, pour son utilisation pour vacciner ou immuniser un mammifère contre le trypanosome.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, pour son utilisation pour protéger un mammifère contre une trypanosomose.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.
10. Utilisation de la protéine TbKHCl, d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle- ci, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou d'un extrait de sécrétion enrichi en cette protéine, pour la préparation d'un vaccin pour immuniser ou protéger un mammifère contre le trypanosome.
11. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine TbKHCl pour la préparation d'un médicament pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.
12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHC 1.
13. Méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl ou contre un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci.
14. Méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.
15. Méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement.
16. Kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 12 ou la protéine TbKHCl ou un peptide de celle-ci, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immuno logique.
17. Kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHCl, un milieu approprié pour la formation d'une hybridation, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction d'hybridation.
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