EP1576003A1 - Peptides pour la prevention, le diagnostic et le traitement de la leptospirose animale et/ou humaine - Google Patents

Peptides pour la prevention, le diagnostic et le traitement de la leptospirose animale et/ou humaine

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Publication number
EP1576003A1
EP1576003A1 EP03780234A EP03780234A EP1576003A1 EP 1576003 A1 EP1576003 A1 EP 1576003A1 EP 03780234 A EP03780234 A EP 03780234A EP 03780234 A EP03780234 A EP 03780234A EP 1576003 A1 EP1576003 A1 EP 1576003A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
protein
test
seq
leptospires
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03780234A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Geneviève ANDRE FONTAINE
Benoít CHATRENET
Christine Branger
André Aubert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Virbac SA
Ecole Nationale Veterinaire de Nantes
Original Assignee
Virbac SA
Ecole Nationale Veterinaire de Nantes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virbac SA, Ecole Nationale Veterinaire de Nantes filed Critical Virbac SA
Publication of EP1576003A1 publication Critical patent/EP1576003A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Definitions

  • the subject of the present invention is peptides capable of inducing protection against leptospirosis (in particular by vaccine), immunogenic compositions (diagnostic and / or therapeutic reagents), comprising one or more of these peptides or the antibodies, nucleic acids or vector derived from it.
  • immunogenic compositions diagnostic and / or therapeutic reagents
  • These compositions are particularly advantageous since they make it possible to induce an immune response or protection against different pathogenic strains, in particular against several pathogenic serogroups different from leptospires and to ensure a diagnosis common to all clinical cases whatever the species affected. .
  • Pathogenic leptospires are responsible for infectious diseases affecting humans and animals.
  • Leptospirosis is one of the zoonoses monitored by the WHO due to its global distribution and the severity of the disease (lethal in 2 to 20% of patients depending on the earliness of the diagnosis and treatment).
  • the economic impact is significant, the disease being responsible for reproductive disorders in farm animals (ruminants or pigs) or for serious clinical signs altering the health of the companion animal that is dog, or that of the sport animal that is the horse.
  • leptospirosis is illustrated in particular by two aspects: firstly their impact on public health (hospitalizations, incapacity for work, sometimes death, implementation of vaccinations as part of protection against occupational diseases in certain countries including France), on the other hand their economic impact (cost of implementing public health programs, loss of production for farm animals and cost of vaccines used in many countries to fight against this drop in production, emotional loss of the pet or / and cost of vaccines currently available in dogs in almost all countries of the world, and further financial loss due to the deterioration of horse sporting performance).
  • the fight against these infections is particularly difficult, given the bacteriological complexity of these germs and the diversity of reservoirs made up by wild animals, carriers, excretors and disseminators of these germs through their urine.
  • the bacteriological complexity of these bacteria is such that two classifications of these germs currently coexist: a serological classification and a genomic classification.
  • Leptospira interrogans sl have been classified in the same pathogenic species Leptospira interrogans sl as opposed to aquaculture saprophytic strains and classified in Leptospira biflexa sl
  • the Leptospira interrogans species is divided into more than 25 different serogroups, each of these serogroups being itself composed of several serovars having between them sufficient antigenic communities for their grouping. There are thus some 220 different serovars for the pathogenic species. This classification is made on the basis of antigens inducing agglutinating antibodies, this is why it is still the only one used within the framework of the serological diagnosis of the infection.
  • Leptospira interrogans if has been split into different species called genomospecies: Leptospira interrogans sensu stricto (ss), Leptospira kirshneri, L. borgpetersenii, L. wellii, L. noguchii, L. santarosai, L. meyeri, L.fainei ....
  • leptospirosis The clinical expression of leptospirosis is very polymorphic depending on the infecting strains but also on the species. Thus, humans, sensitive to leptospirosis, generally develop acute forms of rapid evolution, with hepatic, renal or pulmonary involvement. Early diagnosis generally conditions the effectiveness of antibiotic treatment.
  • the French vaccine directed against Icterohaemorrhagiae provides protection only against this serogroup considered to be the most pathogenic.
  • vaccination against the two serogroups considered to be dominant in this species Icterohaemorrhagiae and Canicola
  • the vaccine only protects against these two serogroups and does not prevent infection with a wild strain belonging to another serogroup. This explains the development of chronic disorders, still poorly identified by veterinary practitioners judging that a dog vaccinated against "leptospirosis cannot develop a chronic form linked to an infection by a wild strain.
  • any suspicion of leptospirosis is generally the subject of experimental confirmation methods .
  • Two parts of the diagnosis (and screening) may therefore be necessary, depending on the duration of the disease's progression.
  • direct identification of the germ is essential.
  • the indirect demonstration by the serological response is generally sufficient in terms of diagnosis, but, in a second step, the recognition of animals carrying germs, and therefore excretors, requires the demonstration of the germ .
  • the direct detection of the pathogen of the germ can be carried out essentially by two methods: isolation and PCR.
  • Bacteriological isolation is a very cumbersome method.
  • the natural fragility of leptospires means that only samples treated within a limited time allow the possible isolation of a strain of leptospires.
  • the probability of isolating a leptospire is generally low, given the requirements of these germs; in addition, the response time can be up to several weeks, given the slow development of the crops.
  • PCR has therefore proven to be a much more interesting tool in terms of diagnosis.
  • this method is currently only developed in humans, for which it is implemented from a blood sample from the patient in the acute phase. Carrying out PCR as a diagnostic method on tissues such as abortion products is still only at the experimental stage.
  • a method which would be useful in breeding it is not currently operational.
  • the serological diagnosis of the germ consisting of detecting antibodies indicating an infection, is generally carried out by the Microagglutination test (MAT) which is currently the reference method.
  • MAT Microagglutination test
  • the disadvantages of this method are linked to the bacteriological heterogeneity of leptospires.
  • the method requires the use of live germs (the culture of which is delicate) and, moreover, is based on the detection of agglutinating antibodies induced by the surface antigens of leptospires, antigens which have served for their classification and therefore express l heterogeneity of these bacteria.
  • This means that the implementation of serological diagnosis requires that the patient's serum be brought into contact with a living strain representative of each of the different serogroups, which means that the number of manipulations for the same serum must be increased.
  • the vaccines marketed are composed of a suspension or more exactly of an addition of suspensions of bacteria representative of each of the serogroups necessary for the protection of the species of destination of the vaccine. Given the great diversity of serogroups, a choice is required depending on the species and the epidemiological conditions. Thus, the usual vaccines used in dogs combine a suspension of bacteria inactivated from the Icterohaemorrhagiae serogroup and one from the Canicola serogroup.
  • Vaccines used in pigs and ruminants in the USA combine suspensions of serovars belonging to serogroups: Icterohaemorrhagiae, Pomona, Grippotyphosa, Canicola and Sejro ⁇ (serovar hardjo).
  • the vaccine for human use marketed in France at present comprises the Icterohaemorrhagiae serogroup, etc.
  • the problem with these vaccine preparations is their failure in terms of total protection against leptospirosis.
  • a vaccinated individual whose vaccination is maintained in the manner prescribed by the vaccine producers is protected against infection and / or disease induced by a wild strain belonging to the only serogroups present in the vaccine. It is therefore only protected (and still this protection may be imperfect) only against infection by one or more given serogroups, represented in the vaccine preparation.
  • a first step it was demonstrated that the presence of whole bacterial bodies was not essential for the induction of homologous protection.
  • response or homologous protection is meant the protection induced by a preparation composed by leptospires belonging to the same serogroup as the leptospires used in the virulent test carried out on sensitive laboratory animal and making it possible to assess the effectiveness and the authenticity of the protection conferred. This has been demonstrated by immunizing animals with a total extract of leptospires obtained by the bursting of bacteria.
  • a second step it has been demonstrated that total extracts from different serogroups make it possible to induce heterologous protection within the species L. interrogans si.
  • the fourth step consisted in identifying the antigens differentiating the pathogenic species from the saprophytic species: For this, comparisons of electrophoretic or immunotransfer profiles of total extracts of leptospires from different pathogenic or non-pathogenic serogroups were carried out and show antigenic bands ranging from 14 to 200 kD, of which 24 are common to the pathogenic species and in particular the zone 21-26 kD which is serogroup-specific (Gitton X, André-Fontaine G, André F, Gagro JP. "Immunoblotting study of the antigenic relationships among eight serogroups of Leptospira.
  • LPS corresponds to the external antigenic structures responsible for the production of agglutinating antibodies used as the basis for serological classification, but also responsible for the protective effect of vaccine preparations. According to the prior art, it was therefore necessary for a vaccine to be capable of inducing the production of agglutinating antibodies at significant levels for protect an animal from infection with a homologous leptospire.
  • the sixth step consisted in checking the capacity of a protein extract of an Autumnalis or Canicola strain purified of any trace of LPS to induce homologous protection in the same way as purified LPS but also to induce protection against a test virulent heterologous observed in previous tests with total extracts.
  • an eighth step degenerate nucleotide probes were constructed, the PPL gene was cloned, and the production of recombinant PPL protein was carried out and allowed the production of monoclonal antibodies.
  • the PPL gene has been inserted into a non-replicating human adenovirus and effective protection against virulent tests carried out on the gerbil has been observed after administration of these recombinant viruses, in particular as vaccines (Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B , Ruvoen-Clouet N, Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M. "Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination.” Infect Immun. 2001 Nov; 69 ( 11): 6831-8.).
  • the recombinant protein produced by a prokaryotic system does not provide significant protection against the different strains of pathogenic leptospires.
  • WO 99/42478 describes a membrane protein LipL32 which is present in certain pathogenic strains of leptospire. This protein contains 272 amino acids. It can be used to induce an immune response against certain strains of leptospires.
  • WO 96/36355 describes two membrane proteins of pathogenic strains of leptospire, LipL1 and LipL2, with a weight of 35 kDa and 41 kDa respectively. These proteins are used to produce an immune response against certain strains of leptospires. However, it is by no means envisaged in this document that this protein makes it possible to induce heterologous protection against different strains of leptospires.
  • the inventors have therefore set themselves the objective of identifying peptides capable of inducing effective protection against the various strains of pathogenic lepstopires, this protection being able to be induced directly, without passing through the expression of these peptides in an adenovirus.
  • the inventors have also set themselves the objective of developing a method for the early detection of infection by the different strains of pathogenic leptospires in order to allow a diagnosis of leptospirosis at a stage of infection where it is effective to administer treatment to the individual.
  • the present invention now makes it possible to solve the drawbacks of the various methods of vaccination, screening, diagnosis and treatment, described in the prior art.
  • the present invention indeed describes the identification of an antigenic motif of leptospire: the PP peptide, common to multiple serogroups of leptospires, in particular pathogenic leptospires.
  • the present invention also allows the production of polypeptides, peptides and antibodies, usable either in vaccine approaches or in effective therapeutic approaches and capable of inducing protection against multiple serovars of pathogenic leptospires.
  • the present invention thus makes it possible to carry out tests for the detection or screening of pathogenic leptospires themselves or of the infection which they cause, not restricted to particular serovars.
  • the present invention also makes it possible to carry out simpler detection tests than the MAT methods described in the prior art, since they do not require the culture of germs.
  • the current the invention furthermore describes nucleic acids, vectors, probes, primers and also recombinant cells which can be used for the production of polypeptides, peptides or proteins or for the detection of leptospires or their products in any test, biological sample (for example biological fluids such as blood, plasma, urine, milk, cerebrospinal fluid, tissue, organ, cell culture, etc.) or other origin (such as a sample contaminated with biological materials, such as river water, standing water , drinking water, stored water used by companies such as slate quarries, market gardeners, etc.
  • biological sample for example biological fluids such as blood, plasma, urine, milk, cerebrospinal fluid, tissue, organ, cell culture, etc.
  • other origin such as a sample contaminated with biological materials, such as river water, standing water , drinking water, stored water used by companies such as slate quarries
  • the first object of the invention is a peptide called PP, fragment of a PPL protein of 32 kDa described in International Application WO01 / 59123.
  • This PP peptide consists of 25 amino acids and is represented by the sequence SEQ ID No: 1 shown below:
  • sequence SEQ ID NO: 1 and, more generally, the compounds of the present invention have unpredictable advantages compared to proteins of the prior art: - obtaining protection against the different strains of pathogenic leptospires to from a single compound,
  • the invention also relates to homologs of the PP peptide, its pharmaceutically acceptable salts, its functional fragments, its chemical analogs and certain chemical derivatives of this peptide.
  • homologs is meant within the meaning of the present invention peptides whose amino acid sequence has at least 60% similarity to the sequence SEQ ID NO: 1, even more preferably 70%, even more preferably still 80%, of preferably at least 90%, and even more favorably at least 95%), or better, 98% similarity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • X% between a peptide P and the sequence SEQ ID NO: 1 it is meant that: when the sequence of P is aligned opposite SEQ ID NO: 1, in the same direction, X%> of the amino acids of P are identical to the corresponding amino acid of SEQ ID NO: 1 or are replaced by an amino acid of the same class, it being understood that if the sequences are not of the same length, a space may optionally be placed between the amino acids of the sequence concerned.
  • the degree of homology can be assessed by methods well known to those skilled in the art (e.g., WILBUR WJ et al Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983); MYERS et al, Comput. Appl Biosci. 4, 11-17 (1988)).
  • the homology with SEQ ID NO: 1 extends to peptides comprising from 15 to 40 amino acids and whose sequence, once aligned with SEQ ID NO: 1, with the spaces placed between the acids suitable amines, has a similarity included in the values indicated above.
  • the homology extends to peptides comprising from 20 to 30 amino acids, even more preferably from 22 to 28 amino acids.
  • amino acids of the same class is meant an amino acid having substantially identical chemical properties.
  • this term is understood to mean amino acids having substantially the same charge, and / or the same hydrophilicity or hydrophobia, and / or the same aromaticity.
  • Such amino acid groupings generally include:
  • amino acid substitutions can be envisaged within the meaning of the present invention in which an amino acid is replaced by another amino acid of the same class, that is to say having comparable properties, the amino acid of substitution being an unnatural amino acid.
  • This is the case, for example, of the enantiomers and diastereoisomers of natural amino acids, hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulin, cyclohexylalanine, ⁇ -amino acids such as 3-aminopropionic acid, ⁇ -amino acids such as 4-amino-butyric acid.
  • Such amino acids are well known to those skilled in the art and can be prepared by known methods.
  • substitution of one or more amino acids with an unnatural amino acid carrying a group allowing the detection of the peptide, such as an amino acid carrying a fluorescent, photoactivable group or a radiolabelled amino acid.
  • a particular example of homolog is constituted by the functional fragments of the peptides according to the invention: these are peptides corresponding to one of the sequences according to the invention in which one or more amino acids are removed from the sequence but which retain a immunogenic activity comparable to that described for the PP peptide, in particular a comparable antibody titer.
  • the preferred functional fragments of the peptides according to the invention are those for which at most six amino acids, more preferably 4 amino acids, more preferably still 2 amino acids, are removed. Even more preferably, those for which an amino acid is removed.
  • substitutions of amino acids of the same class allow the peptide to retain its immunogenic activity.
  • Appropriate substitutions can be determined by testing the antimicrobial properties of the peptides obtained using activity tests such as those described below.
  • the invention relates more specifically to molecules inducing an antibody titer and / or conferring protection comparable to those capable of being obtained by the use of the PP peptide.
  • the term salts relates both to the amine salts of a carboxyl function of the peptide chain as well as to the acid addition salts with an amino group of this same polypeptide chain.
  • the salts of a carboxyl function can be formed with an inorganic or organic base.
  • Inorganic salts include, for example, alkali metal salts such as sodium, potassium and lithium salts; alkaline earth salts such as for example calcium, barium and magnesium salts; ammonium salts, ferrous, ferric salts, zinc, manganese, aluminum, magnesium salts.
  • the salts with organic amines include those formed for example with trimethylamine, triethylamine, tri (n-propy ⁇ ) amine, dicyclohexylamine, triethanolamine, arginine, lysine, histidine, ethylenediamine, glucosamine , methylglucamine, purines, piperazines, piperidines, caffeine, procaine.
  • Acid addition salts include, for example, salts with mineral acids such as, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid; salts with organic acids such as, for example, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid , malic acid, ascorbic acid, benzoic acid.
  • mineral acids such as, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid
  • organic acids such as, for example, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid , malic acid, ascorbic acid, benzoic acid.
  • Chemical derivatives of the peptides according to the invention include the alpha-amino peptide compounds, the N-alpha acyl substituted derivatives of the RCO- form, in which R represents a linear, branched alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group , or cyclic comprising from 1 to 50, preferably from 1 to 8 carbon atoms.
  • the preferred N-alpha acyl group is the acetyl group.
  • Such amine-terminal substituents can increase the activity of the peptide by slowing down or preventing the enzymatic degradation of the peptides in vivo.
  • Other chemical derivatives of the peptides according to the invention include derivatives substituted on the C-terminal acid function by a group chosen from - NH 2 , alkyloxy, alkylthio or alkylamino of the form -OR, -SR or -NHR, in which R can represent an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl chain or an aralkyl group, linear, branched or cyclic comprising from 1 to 50, preferably from 8 to 50 carbon atoms.
  • Another kind of chemical derivative of the peptides according to the invention includes derivatives carrying a pharmacophore substituent, such as a fluorescent group, a photoactivable group, a radiolabelled group or any other group allowing detection by spectroscopy and quantitative evaluation. of the peptide according to the invention in a biological sample without degradation of the biological sample.
  • the amino acids of which the peptides are made up are L enantiomers.
  • one or more amino acids of the peptide sequence can be replaced by its D enantiomer.
  • one or more peptide amide bonds can be replaced by an isostere bond such as: -CH 2 NH-, CH 2 S-, -CH 2 CH 2 -, -CH ⁇ CH- (cis and trans), - COCH 2 -, -CH (OH) CH 2 - and -CH 2 SO-.
  • Derivatives of the peptides according to the invention include polymers of these peptides, more preferably dimers of these peptides via, for example, a thiol group of cysteine or oligomers by grafting peptides onto polylysines (MAP), or coupling of these peptides to carrier proteins (BSA,
  • MAP polylysines
  • BSA carrier proteins
  • the peptides which are the subject of the present invention can be easily obtained by any means known to a person skilled in the art, in particular by synthesis.
  • a subject of the invention is also peptides comprising a sequence SEQ ID NO: 1 or peptides comprising a functional fragment of these peptides, a homolog, a chemical analog of these peptides or a chemical derivative of these peptides.
  • the terminal amino acids of the PP peptide comprise, for one, a free terminal amino function, and for the other, a free terminal carboxyl function, these two functions each being capable of being engaged in a peptide bond with C - terminal acid, respectively the N - terminal amine of another peptide fragment.
  • these peptides contain at most 100 amino acids, preferably at most 80 amino acids, even more preferably at most 60 amino acids and advantageously at most 40 amino acids.
  • the immunogenic character of the polypeptides or peptides of the invention can be verified in various ways known to a person skilled in the art.
  • polypeptides can be brought into contact with antibodies (or serum of infected subjects), the detection of antigen-antibody complexes indicating the capacity of the polypeptides of the invention to carry epitopes or immunogenic fragments.
  • proteins comprising a peptide as defined above, coupled with a carrier protein, such as for example the KLH protein or the BSA protein. This coupling makes it possible to increase the immunogenicity of the peptide of the invention.
  • carrier proteins are illustrated in documents US-4,608,251; US-5,945,104; WO 90/15878.
  • the coupling of the peptide of the invention and the carrier protein can be done in a known manner by chemical coupling or by addition of the DNA sequence of the peptide before or after that of the carrier protein in a plasmid then expression and purification of the protein that it is designated by the name of fusion protein.
  • Another subject of the invention relates to antibodies directed specifically against a protein, a polypeptide or a peptide according to the invention. They are preferably anti-leptospire antibodies, binding an epitope present in a protein, a polypeptide or a peptide according to the invention.
  • the antibodies of the invention are preferably specific for leptospires, in particular pathogenic, although that a weaker (or non-specific) binding can be observed experimentally with other antigens.
  • the antibodies according to the invention can be polyclonal or monoclonal antibodies. They are generally produced by immunizing an animal with a peptide, a polypeptide or a protein, according to the invention and recovering the serum, milk or the egg if they are birds (to obtain the antibodies polyclonal) or thymus or spleen cells, for the production of hybridomas producing monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the invention are more preferably antibodies recognizing the PP peptide of sequence SEQ ID NO: 1 as defined above, a functional fragment thereof, a homolog, a chemical analog or a chemical derivative thereof. this.
  • the antibodies of the invention advantageously have the capacity to recognize at least two pathogenic strains of leptospire belonging to different serogroups, more preferably at least 3 pathogenic strains of leptospire, in particular belonging to different genomic species.
  • the antibodies according to the invention are polyclonal antibodies prepared by immunization of an animal with the PP peptide.
  • the animal can be a rodent (rat, mouse, gerbil, hamster, guinea pig ...), a primate, a rabbit, a pig, a horse, a cattle, a bird, etc.
  • Polyclonal antibodies are generally recovered from the serum of immunized animals or eggs, according to protocols known to those skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are monoclonal antibodies prepared from hybridomas obtained by fusion between an immortalized cell (for example a myeloma) and an antibody-producing cell taken from an animal immunized with the PP peptide as defined above.
  • the animal can be a rodent (rat, mouse, gerbil, hamster, guinea pig ...), a primate, a rabbit, a pig, a horse, a cattle, a bird, etc.
  • the antibodies of the invention in particular the monoclonal antibodies, can also be humanized, that is to say modified artificially to contain regions of heavy or light chains of human origin.
  • the invention also relates to fragments or derivatives of such antibodies, for example Fab, F (ab ') 2 fragments, ScFv (single chain antibody), etc.
  • the antibodies of the invention can be used for example for the detection of pathogenic strains of leptospires or of products secreted by these same leptospires in test samples (in particular blood and milk samples , cerebrospinal fluid or urine), or to induce (emergency) protection against leptospire infections.
  • nucleic acids may be DNAs or RNAs, in particular recombinant, genomic, synthetic or semi-synthetic DNAs or also mRNAs, or fragments or derivatives thereof.
  • the nucleic acids can be obtained from banks, clones from leptospire bacteria (in particular by PCR), produced by artificial synthesis using synthesizers of nucleic acids, or also prepared using combinations of these methods (enzymatic digestions, ligatures, cloning, modifications, etc.).
  • the nucleic acids can also be modified to improve the use of codons, eliminate cryptic promoters, reduce secondary structures, etc.
  • the invention also relates to vectors comprising a nucleic acid as defined above. It can be a vector of plasmid, cosmid, episome, artificial chromosome, phage, virus, etc. type. It is more preferably a plasmid, for example a replicative or integrative plasmid in bacteria or eukaryotic cells (yeasts, mammalian, bird, insect cells, etc.) or a recombinant virus , in particular defective (such as a poxvirus, an adenovirus, a retrovirus, a baculovirus, a herpesvirus, etc.).
  • a plasmid for example a replicative or integrative plasmid in bacteria or eukaryotic cells (yeasts, mammalian, bird, insect cells, etc.) or a recombinant virus , in particular defective (such as a poxvirus, an adenovirus, a retrovirus, a baculovirus, a her
  • Plasmid vectors can be prepared by conventional techniques using commercially available plasmids, such as pUC, pBR, pCN, etc.
  • the invention also relates to any recombinant cell comprising a nucleic acid or a vector as defined above.
  • the recombinant cell can be a bacterium (for example an E. coli strain), or a eukaryotic cell, in particular a yeast, a mammalian, bird, or insect cell, etc.
  • the recombinant cells can be used in particular for the production of the polypeptides of the invention, as well as as models for the search for compounds capable of neutralizing or antagonizing the activity of the PP peptide.
  • the invention further relates to any non-human transgenic organism, in particular any non-human mammal, any bird, or any plant organism comprising a nucleic acid as defined above in its cells.
  • these transgenic organisms are obtained by homologous recombination.
  • mammals rodents, canines, rabbits, goats, pigs, etc.
  • plants can be used in particular for the production of the polypeptides of the invention and for the identification of compounds for therapeutic or vaccine purposes, for example.
  • nucleotide probes and / or primers which can be used for the detection and / or amplification of leptospire nucleic acids, and in particular for the detection of the presence of a pathogenic leptospire strain or of product secreted by it in a test sample (in particular a biological product or contaminated by a biological product).
  • the nucleotide probes according to the invention advantageously comprise a nucleic acid as defined above. They are preferably single-stranded, and can be labeled, for example by radioactive, enzymatic, fluorescent, chemical labeling, etc.
  • a probe according to the invention preferably comprises a sequence complementary to all or part of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or to one of the peptides according to the invention as defined above.
  • the probes of the invention can be used to detect the presence of a pathogenic strain of leptospire or of product secreted by it in any sample, in particular a biological sample.
  • a preferred probe according to the invention comprises the complete sequence of the nucleotide sequence coding for PP, or a fragment thereof.
  • the nucleotide primers according to the invention are oligonucleotides, of a size generally less than 40 bases, comprising the sequence of a nucleic acid as defined above.
  • the primers can be used for the amplification of Leptospires nucleic acids, in particular for the amplification of the sequence coding PP or a part thereof, for example by PCR reaction.
  • the invention relates more particularly to any pair of primers allowing the amplification of a region of the sequence coding PP as defined above.
  • the amplified region comprises at least 50 bp.
  • the probes, primers or oligonucleotides of the invention are preferably complementary to at least one region of the sequence coding PP.
  • the complementarity is generally perfect, so as to ensure better selectivity of hybridization. However, some mismatches can be tolerated.
  • These probes or oligonucleotides can be synthesized by any technique known to those skilled in the art, for example by cleavage from the nucleic acids described above, or by artificial synthesis, or by combining these techniques.
  • the probes and primers are particularly useful for the detection of the presence of pathogenic strains of leptospires, and / or the diagnosis of leptospiroses, as will be detailed below.
  • the detection of antibodies directed against an antigen specific for pathogenic strains is therefore particularly advantageous.
  • the present invention can thus be used on the diagnostic, vaccine, therapeutic and / or experimental level.
  • the PP peptide of the invention can be used as an antigenic motif capable of demonstrating antibodies produced during infection by a pathogenic strain, whatever its serogroup of membership. This therefore allows the experimental diagnosis of leptospirosis to be ensured by many laboratories with ordinary equipment (example ELISA or dot) while MAT requires maintenance of live cultures and its standardization, therefore, is very difficult.
  • a particular object of the invention therefore resides in the use of a polypeptide, peptide or a protein as defined above for detecting in vitro the presence of anti-leptospire antibodies in a biological test sample (in particular a biological sample such as blood, serum, milk, urine, tissue, etc.
  • Another object of the invention lies in an in vitro method for detecting the presence of anti-leptospire antibodies in a test sample, this method comprising bringing this sample (or a dilution) into contact with a polypeptide, peptide or a protein as defined above, and the demonstration of the formation of antigen-antibody complexes.
  • the antibodies (or fragments or derivatives of antibodies) according to the invention allow the direct detection of the pathogenic agent or of secreted products present in a test sample (such as a biological sample or another type of sample such as water).
  • a test sample such as a biological sample or another type of sample such as water.
  • the demonstration can be carried out by any immunological method known to a person skilled in the art, such as by ELISA capture, RIA, direct or sandwich tests, etc., or by immunological revelation of this peptide in pathological samples or not.
  • Another object of the invention therefore lies in the use of an antibody (or fragment or derivatives of antibodies) according to the invention, in particular of one or several monoclonal antibodies of the invention, for the detection of the presence of a pathogenic strain of leptospire or of its secreted products in a sample, in particular biological.
  • Another object of the invention resides in a method for detecting the presence of a pathogenic strain of leptospire or of its secreted products in a sample, comprising bringing this sample into contact (or a dilution, or a concentration) with an antibody (or fragment or derivatives of antibodies) according to the invention, and the demonstration of the formation of antigen-antibody complexes.
  • polypeptides, peptides, proteins and antibodies can be used in soluble form, or immobilized on solid or semi-solid supports, of the filter, silica, glass, plate, bead, etc. type.
  • immobilized form advantageously makes it possible to simplify the detection or the experimental diagnosis of leptospirosis.
  • These compounds can also be labeled, for example by means of fluorescent, enzymatic, biological or radioactive labels.
  • revelation of antigen-antibody complexes can also be carried out using an additional labeled antibody, or according to known immunological techniques (ELISA, RIA, sandwich, capture, etc.).
  • Another detection (or screening) method lies in bringing a test sample into contact with a nucleotide probe of the invention, and demonstrating hybridization between said probe and said sample. More preferably, the test sample is treated beforehand so as to make the nucleic acids which it contains accessible to a hybridization reaction.
  • the treatment may consist in breaking the cell membranes, for example by chemical treatment (detergent) and / or mechanical treatment (ultrasound, freeze-thaw, etc.). To this treatment can be added methods of concentration (filtration, centrifugation, etc.) of the samples, in particular non-biological samples such as water samples.
  • the sample, in particular biological, thus treated is subjected to an amplification reaction, using primers of the invention, prior to the hybridization reaction with the probe.
  • Amplification can be carried out under conventional conditions.
  • Hybridization can be carried out on supports, on which the probe is immobilized (filters, glass, silica, etc.).
  • the stringency conditions of the hybridization can be adjusted by a person skilled in the art, by adapting the temperature and / or the salinity of the media.
  • the invention further relates to a kit for carrying out the methods of the invention, comprising a probe or an oligonucleotide or a pair of primers as described above.
  • the kits of the invention advantageously comprise the reagents suitable for an amplification reaction and / or hybridization, and possibly a support for such reactions (filters, membranes, chips, etc.).
  • the present invention can also be used therapeutically and preventively. Indeed, although the pathogenic mode of action of the PP peptide is not yet defined, the present application shows that it is capable of inducing protection.
  • the administration of antibodies directed against this peptide, whether of poly or monoclonal origin makes it possible to neutralize the pathogenic impact of leptospires in the evolving individual and therefore to improve the prognosis of this disease.
  • the administration of a polypeptide, peptide or protein of the invention optionally in inactivated form, or of a corresponding nucleic acid or vector, makes it possible to induce a protective immune response against these infectious agents or their effects.
  • the effectiveness of the peptides of the invention in the early detection of pathogenic leptospires and the induction of immune protection against these same leptospires is particularly remarkable, in particular, because the PPL protein from which they are derived does not allow '' to obtain an immunization in a direct way, without passing by the expression in an adenovirus, and that it does not allow to detect in an early and specific way the presence of strains of pathogenic leptospires in a human or animal organism.
  • the peptides are generally weakly immunogenic.
  • the peptide consisting of this sequence ID No. 1 is recognized in ELISA by several monoclonal antibodies against the PPL protein and in particular 4D4H4E5 and 6E5A2F2 (International Application WO01 / 59123, Example 2).
  • the PP peptide is very immunogenic in the mouse, rabbit (Example 3) and gerbil (Example 7) model.
  • the antibody response directed against the PP peptide was analyzed on the sera of gerbils immunized with Padenovirus-PPL. A correlation can be observed between the immune response directed against the PP peptide and the protection of animals following immunization with PPL via the adenovirus, which supports the hypothesis of a protective effect associated with the sequence of this peptide (Example 6).
  • the PP peptide was coupled to the KLH carrier protein and effective protection against a virulent test was observed on the gerbil immunized with PP-KLH (Example 7).
  • the PP peptide has at least a protective epitope in its sequence. The peptide alone made it possible to induce significant protection against a virulent test (example 7).
  • the discriminating efficacy of the PP peptide as a diagnostic antigen for leptospirosis was evaluated on several species (humans, dogs, cattle, horses). Whatever the species considered, the PP peptide appears to be an antigen capable of demonstrating an immune response specific to infection by pathogenic leptospires, and in particular in the early phase (Example 4).
  • the lipopolyosidic antigens are indeed the support for effective protection against a homologous infection, the starting point for the constitution of the vaccine preparations currently used in both humans and animals, the PP peptide, used alone, is capable of inducing cross-protection between different serogroups of the species Leptospira interrogans ss (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Autumnalis). Heterologous protection is also induced between genomic species different from the old species Leptospira interrogans si (here L. borgpetersenii and interrogans ss), while it is absent from the old saprophytic species Leptospira biflexa si.
  • the present invention therefore relates to the use of the PP peptide, of its synthetic or natural fragments, of its chemical derivatives whatever they may be, of its counterparts, of its chemical analogues, used alone or associated with other proteins or fractions lipopolyosidiques derived from leptospires, or to adjuvants of immunity whatever their nature, for the preparation of a vaccine composition for veterinary or human use, in particular for the preparation of a composition intended to induce a protective immune response against different species and serovars of pathogenic leptospires.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition, in particular a vaccine, comprising a polypeptide or a nucleic acid as defined above.
  • Another subject of the invention is a composition comprising one or more antibodies as described above, in particular for inducing protection.
  • the immunogenic compositions, vaccines or antibodies of the invention can be used in injectable or per os or transcutaneous form, for example in association with vehicles acceptable on the pharmaceutical or veterinary level, or with adjuvants.
  • the quantities of immunogens administered, and the frequency or the number of administrations can be adapted by a person skilled in the art depending on the subject, the stage of development of the injection, etc. Typically one or two injections, 2 weeks apart, are carried out, with amounts suitable for the species, for example 30 ⁇ g of peptide coupled to the carrier protein according to the invention. Additional injections may be considered, or higher amounts may be administered, particularly in the case of oral administration.
  • the immunogenic compositions or vaccines of the invention have in particular the following advantages:
  • Efficacy Induction of cross-protection avoiding the accumulation of different antigenic preparations of partial effectiveness in order to prevent infection by the different infecting strains present in a given country for a given species.
  • a peptide of the invention avoids introducing into the vaccinated individual many antigens not necessary for protection, therefore at least useless, even dangerous during repeated use. It is thus believed that recurrent uveitis in the horse (which can lead to blindness in the animal) is induced by a post-infectious immune response due to leptospira proteins having a composition close to certain structural proteins of the horse's eye. Furthermore, it seems that in humans, repeated vaccinations are less and less well tolerated over time. In addition, no long-term pharmacovigilance data are available.
  • Antibody compositions can advantageously avoid urgently and passively a serious and / or lethal development of a declared leptospirosis in humans or animals.
  • Compatibility with health prophylaxis measures currently, it is impossible to differentiate post-vaccine antibodies from post-infectious antibodies, the production of agglutinating antibodies being obtained in both cases.
  • This vaccine used in large production species would allow to implement a medical prophylaxis allowing despite everything the detection of the infection wild and therefore the qualifications of herds free, rewarding qualifications for export.
  • the invention also relates to the polypeptides, proteins and peptides as defined above, in attenuated form, that is to say retaining the immunogenic properties and essentially devoid of other biological activity.
  • the invention also relates to the use of nucleic acids or vectors as described above for the in vitro or ex vivo production of the polypeptides, proteins and peptides of the invention, whatever the methods of genetic recombination employed: transgenic animals , bacteria, eukaryotic cells, plants, plasmids, viruses, extraction of cell-free culture media, etc.
  • the techniques for producing recombinant proteins are well known to those skilled in the art, and can be applied to the present invention (strong, inducible promoters, termination signals, transfection techniques, etc.).
  • Figure 1 IgGi antibody response of 5 mice immunized with the PP peptide coupled to the KLH carrier protein for test 1 and 2 expressed in optical density corrected as a function of the dilution.
  • FIG. 2 IgG A antibody response of 5 mice immunized with the PP peptide coupled to the KLH carrier protein for test 1 and 2 expressed in optical density corrected as a function of the dilution.
  • Figure 3 Rabbit IgG antibody response immunized with the PP peptide expressed in optical density corrected as a function of the dilution.
  • Figure 5 IgM and IgG antibody response of 5 sera from human patients with leptospirosis confirmed or not by MAT against the PP peptide expressed in optical density (OD).
  • Figure 6 Compared response PP and PPL, either IgM or IgG, for sera from 4 SPF dogs, three of which are vaccinated against leptospirosis (CN V) expressed in optical density (OD).
  • Figure 8 IgG antibody response of 4 bovine sera from suspected herds with leptospirosis against the PP peptide expressed in optical density.
  • Figure 9 IgG antibody response of 6 equine sera against the PP peptide expressed in optical density.
  • Figure 10 Kinetics of the antibody response against the PP peptide expressed in corrected optical density of gerbils immunized via adenovirus.
  • Figure 11 Kinetics of the IgG antibody response against the PP peptide expressed in optical density corrected as a function of the dilution (A) or time (B) of gerbils immunized by the PP peptide coupled to the KLH carrier protein.
  • Figure 12 Survival curve of gerbils immunized by the PP peptide coupled to the KLH carrier protein and subjected to a virulent test (EV) of leptospires of Leptospira interrogans if serovar canicola.
  • EV virulent test
  • Figure 13 Survival curve of gerbils immunized with PP-KLH or PP and subjected to an EN of leptospires of Leptospira interrogans if serovar canicola.
  • Figure 14 Schedule of the PP peptide vaccination test coupled to the carrier protein KLH in dogs with a virulent test of Leptospira interrogans leptospires if serovar canicola
  • Figure 15 Evolution of the increase in the weight of control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) before virulent test
  • Figure 16 Evolution of the increase in temperature of control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the protein carrier KLH) subjected to a virulent test of Leptospira of Leptospira interrogans if serovar canicola
  • Figure 17 Evolution of the variation in the platelets of control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of leptospires of Leptospira interrogans if serovar canicola
  • Figure 18 Quantitative evolution of the white blood cell variation of control and vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans leptospires if canovola serovar
  • Figure 19 Quantitative evolution of the lymphocyte variation in control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of leptospires of Leptospira interrogans if serovar canicola
  • Figure 20 Quantitative evolution of the variation in monocytes of control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans leptospires if serovar canicola
  • Figure 21 Evolution of the increase in creatinine from control and vaccinated dogs (immunized by the PP peptide coupled to the protein carrier KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans if serovar canicola
  • Figure 22 Evolution of the increase in urea in control and vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogators if serovar canicola
  • Figure 23 Evolution of the cumulative coefficient for cultures and PCR of batches of control and vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans leptospires if serovar canicola
  • Table 1 MAT and EIA titer of 5 sera from human patients with or without leptospirosis.
  • Table 2 Survival table of gerbils immunized by the recombinant protein PPL with Freund's adjuvant after virulent canicola test.
  • Table 3 Survival table of gerbils immunized with the recombinant protein PPL adjuvanted with aluminum hydroxide and QS 21 after virulent canicola test.
  • Table 4 Mortality table of gerbils immunized with the PP peptide coupled to the KLH carrier protein after virulent test of Leptospira interrogans if canicola leptospires.
  • Table 5 Table of mortality of gerbils immunized with the PP peptide coupled or not with the KLH carrier protein after virulent 10 "2 canicola test.
  • Table 6 Statistical analysis of vaccination trials with the PP peptide coupled or not coupled according to the Logrank test.
  • Table 7 Results of the cultures carried out on the plasma, urine and kidney samples of the 6 control dogs and the 6 vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira leptospires interrogans si serovar canicola.
  • Table 8 PCR results on the plasma, urine and kidney samples of the 6 control dogs and the 6 vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled with the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans if serovar
  • the PP peptide represented in the sequence SEQ ID No. 1, is a 25 amino acid peptide which corresponds to the aal53-aal77 fragment of the PPL protein of Leptospira interrogans si
  • Peptide ID No. 1 of 25 amino acids was synthesized by Neosystem.
  • the crude peptide is purified by HPLC.
  • the homogeneity of the purified peptide is verified by HPLC and the theoretical structure is confirmed by measurement of the mass of this peptide by ES-MS type mass spectrometry, relative to that calculated from the theoretical amino acid sequence of this peptide.
  • Peptide ID No. 1 was used in ELISA. It was used as adsorption antigen (diagnostic protocol) with, as primary antibodies, different monoclonal antibodies directed against the PPL protein, in particular two monoclonal antibodies 6E5A2F2 and 4D4H4E5 and gerbil sera tested by a challenge Leptospira interrogans ss serovar canicola. The two monoclonal antibodies have recognized this peptide, which demonstrates that it has one or more immunogenic epitopes of the PPL protein. Furthermore, polyclonal gerbil sera have made it possible to demonstrate the presence of antibodies directed against this peptide in an early phase after infection with pathogenic leptospires in the gerbil. EXAMPLE 3 Immunogenicity of the PP Peptide
  • the peptide used corresponds to the peptide PP (SEQ ID NO: 1) to which a cysteine is added in the N-terminal position.
  • the heterobifunctional reagent, sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccimide ester (sulfo-MBS, Pierce) used allows activation of the free amino functions of the carrier protein KLH (keyhole-limpet-haemocyanin, Pierce), then coupling of the peptide via the reaction of the sulfhydryl group of cysteine added to the N-terminal end of the peptide with the maleimide part of the sulfo-MBS reagent.
  • This is added in an amount of 1 mg of reagent for 10 mg of KLH, then the whole is placed under stirring for 1 h in the dark at a temperature of 15 to 25 ° C.
  • the KLH protein is desalted on an NAP5 column balanced by the coupling buffer. The elution of the protein is carried out using this buffer.
  • the fractions containing the activated KLH protein are combined.
  • 8.5 mg of peptide in the previous buffer at a concentration of 2 mg / ml
  • 10 mg of KLH concentration of the order of 5 mg / ml
  • the whole is placed under stirring for 2 hours at a temperature of 15 to 25 ° C and in the dark.
  • the preparation is then distributed, at a rate of 100 ⁇ g per eppendorf tube and frozen at - 80 ° C.
  • mice A batch of 5 mice was formed. Two injections were administered two weeks apart subcutaneously.
  • the 1st injection consists of 10 ⁇ g of PP peptide coupled to KLH with the complete Freund's adjuvant in a volume of 200 ⁇ l (v / v).
  • the 2 nd injection consists of 10 mcg PP peptide coupled to KLH with incomplete Freund's adjuvant in a volume of 200 .mu.l (v / v). This test was carried out twice.
  • mice receiving nothing is used as a control.
  • a blood test was taken two weeks after the second injection for serological control.
  • mice The anti-PP antibodies produced in mice are assayed by an ELISA technique either on individual serological samples or on pools of several sera.
  • the reaction is stopped by adding an H 2 0 / DMF solution (v / v) containing 5% SDS at a rate of 100 ⁇ l per well.
  • the colored reaction is read with a spectrophotometer at 405 nm.
  • the results of the IgGi anti-PP antibody response expressed in OD corrected for immunization tests 1 and 2 by the PP peptide coupled to KLH are presented in FIG. 1.
  • the corrected OD corresponds to the OD of the immunized animal minus the DO from pools of control animals.
  • this response is very high since the sera diluted 1/8000 and 1/16000 give an OD corrected between 0.8 and 1.2 (optimum reading).
  • mice except mouse 5 in test 1 There is a certain homogeneity of the IgG 2A anti-PP antibody response in mice except mouse 5 in test 1. Furthermore, this response is high but less important than the IgG1 anti-PP response. Similar results were obtained for test 2, the homogeneity of the antibody response being however lower.
  • mice with the PP peptide coupled to KLH induces an anti-PP IgGi and IgG 2 A response that is both high and homogeneous.
  • the PP peptide coupled to the KLH protein is therefore very immunogenic. 3-2 Immunogenicity of the uncoupled PP peptide
  • the two injections were administered two weeks apart subcutaneously. Rabbit serum was collected two weeks after the second injection. Anti-PP antibodies were titrated on this serum.
  • Anti-PP antibodies were assayed in rabbits by the ELISA technique described above with a biotinylated anti-rabbit antiglobulin (BioAtlantic) at 1/3000 and as a revealer of streptavidin coupled with peroxidase (RPN1231, Amersham pharmacia biotech) .
  • the results of the anti-PP IgG antibody response expressed in corrected DO (DO at D28 therefore after the second immunization minus the DO at D0) of the immunization test with the PP peptide are presented in FIG. 3.
  • the antibody response against the PP peptide is very high since at a dilution of 102400, a response against the PP peptide is always detectable.
  • the PP peptide alone is very immunogenic.
  • the PP peptide whether or not coupled to a carrier protein, is capable of inducing a strong serological response in different animal models. So the PP peptide is very immunogenic. EXAMPLE 4 Diagnostic Use of the PP Peptide
  • the animal species tested are 4 in number and represent the companion or production animals most affected by leptospirosis: "the dog” the bovine
  • the horse • the pig ELISA technique The anti-PP antibodies were measured by the ELISA technique described above with the antiglobulins coupled to the peroxidase chosen according to the species from which the serum analyzed came from (anti-human, anti -dog, anti-cattle, anti-horse or anti-pig (Jackson).
  • the anti-PPL antibodies were assayed by the same technique. Results
  • the negative control corresponds to a pool of sera from healthy individuals (before vaccination) and individually checked in MAT.
  • Table 1 MAT and EIA titer of 5 sera from human patients suspected of clinical leptospirosis Analysis of the specificity of the IgM and IgG antibody responses against the PP peptide and against the recombinant PPL protein in human sera without leptospirosis
  • the serum 153 272 of the confirmed lyme positive case exhibits a significant IgM serological response against the recombinant protein PPL.
  • IGM directed against the PP peptide was analyzed on thirty human sera suffering from leptospirosis (from the Pasteur Institute).
  • IgG and IgM dogs Vaccinated SPF dogs: Analysis of the specificity of IgM and IgG antibody responses against the PP peptide and against the recombinant PPL protein in sera from SPF dogs vaccinated or not against leptospirosis Firstly, serologies were carried out on sera from SPF dogs vaccinated against leptospirosis or not. The MAT test was carried out in parallel in the laboratory. The results of the IgG and IgM response directed against the PP peptide and against the recombinant PPL protein of these sera are shown in FIG. 6 in comparison with the negative control (pool of sera from unvaccinated SPF dogs).
  • the high IgG serological response against the recombinant protein of the negative control does not allow the specific vaccine response to be estimated.
  • FIG. 7A The results of the study of the IgG and IgM antibody response directed against the PP peptide of unvaccinated dogs are presented in FIG. 7A.
  • the negative control corresponds to the serum of SPF dogs and does not show a significant IgM and IgG antibody response.
  • Sera 210749 and 210750 were taken from the same dog 4 days apart.
  • the MAT titer of the first sample is negative while the IgM anti-PP antibody response is very high (OD> 0.6) and the IgG anti-PP response begins since an OD of 0.3 is reached at the end of the evolution. clinical.
  • There is a seroconversion with MAT (titer 160) and at the same time, the anti-PP IgM response decreased to give way to a very high anti-PP IgG response (OD> 0.9).
  • the PP peptide can therefore prove to be very useful for the diagnosis of leptospirosis and more particularly in the early phase since an IgM anti-PP antibody response can be detected while the MAT titer is still negative.
  • Serum 210845 corresponds to a dog suffering from confirmed leptospirosis. A high anti-PP IgM and IgG antibody response can be observed and of the same intensity.
  • Serum 211466 corresponds to a dog with clinical signs of leptospirosis, however the MAT titer of this serum is not significant.
  • the anti-PP IgM antibody response is very high (OD> 0.7) while the anti-PP IgG response is not significant. The dog is therefore most likely suffering from leptospirosis in the very early phase.
  • the significant anti-PP IgM response is in favor of an initial serological response (attested by the moderate titer in MAT).
  • Sera 21463 and 21457 correspond to dogs with clinical signs of Leptospirosis confirmed in MAT with a longer duration of evolution than the previous case. They exhibit a strong IgM and IgG response directed against the PP peptide.
  • the PP peptide appears to be a discriminating antigen of leptospirosis infection whether dogs are vaccinated or not.
  • the use of the PP antigen makes it possible to detect cases of leptospirosis in the early phase, the previous vaccine state does not prevent diagnostic interpretation unlike MAT for which the interpretation of low titers is questionable.
  • Sera 421 and 1992 correspond to a serological kinetics of the same animal. During the first sample the animal was negative in MAT and became positive during the second sample, attesting that this uveitis could be interpreted as a sign of active infection in progress by leptospires.
  • Animals 2077 and 6771 are slightly positive in MAT but also with respect to PP, confirm the leptospirosic origin of the uveitis observed.
  • the PP peptide appears to be an antigen capable of demonstrating an immune response to an infection by leptospires, and in particular in the early phase because a response IgM anti-PP antibodies can be detected while the MAT titer is still negative or is questionable in the case of vaccinated animals.
  • EXAMPLE 5 Antibody Response Against the PP Peptide of PPL Immunized Gerbils Via the Adenovirus
  • a vaccination / test protocol made it possible to demonstrate the protection induced by a suspension of the recombinant Ad-ppl virus which expresses the recombinant protein PPL (International Application WO01 / 59123, Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen -Clouet N, Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M. "Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination". Infect Immun. 2001 Nov; 69 (11) : 6831-8).. Anti-PP antibodies were assayed in the gerbil by the technique
  • the sera were grouped on the different sampling dates D0 (before the first immunization), D21 (before the second immunization), D35 (before the virulent test) and D70 (35 days after the virulent test ).
  • the anti-PP antibody response following the first injection, appears rapidly for the group immunized by the adenovirus expressing the recombinant protein PPL.
  • the antibody response remained stable between 21 and 35 days ⁇ eme ⁇ eme day: the second immunization did not induce booster effect, the maximum of the vaccine response appears to be achieved as early as 21 lth day.
  • test canicola effected on 35 th day allows the appearance of a response against the peptide PP in the control group and causes an anamnestic response in the group immunized by the PPL protein via adenovirus.
  • An antibody response directed against the PP peptide is therefore observed following immunization with PPL via the adenovirus and this antibody response may have a role in the protection observed in this vaccinated group subjected to a canicola EN.
  • Vaccination induced a maximum anti-PP response for the stimulation induced by the dose of PPL expressing adenovirus used.
  • the anamnestic recovery caused by the virulent test follows a slower slope than the response developed by the witnesses.
  • the PPL protein carrying the PP epitopes being secreted by pathogenic leptospires, the antigenic stimulation induced by the test virulent is weaker in animals protected by vaccination than in controls, in which the virulent strain does not encounter any obstacle to its multiplication.
  • Example 6 Vaccination test with the recombinant protein PPL (comparative):
  • Immunization with the recombinant protein PPL was carried out on the gerbil model in order to test the protection likely to be provided by this protein.
  • Adjuvants make it possible to increase the immunogenicity of the antigens by generally creating an inflammatory reaction which slows down the elimination of the antigen and promotes its capture and its presentation to the lymphocytes. The nature of the adjuvant will guide the production of cytokines favoring the development of a cell or humoral mediated response.
  • Table 2 Survival table of gerbils immunized by the recombinant protein PPL with Freund's adjuvant after virulent canicola test GRAS characters: start of gerbil mortality for each batch
  • the mortality of the batches subjected to the same virulent test begins at the same time: the nth and the 12th day for the virulent tests at 100 UT respectively diluted to 10 "1 and 10 " 2 .
  • Test 2 Alumina hydroxide and QS 21 adjuvant
  • the immunization assay with the recombinant protein PPL was repeated under the same conditions, however the protein was adjuvanted with QS 21 and aluminum hydroxide.
  • Table 3 Survival table of gerbils immunized with the recombinant protein PPL adjuvanted by aluminum hydroxide and QS 21 after virulent canicola test Characters in GRAS: start of mortality of gerbils for each batch * workforce considered from the virulent OJ test The survival rate for the batch immunized with the adjuvanted PPL recombinant protein and the control batch are similar. The mortality of the gerbils of the two lots begins on the same day: the 8 th day. It was not possible for us to demonstrate any significant protection provided by the recombinant protein PPL, whether in the presence of Freund's adjuvant or the aluminum hydroxide coupled with QS 21.
  • the purpose of immunization with the PP peptide on the gerbil model is both to assess the antigenicity of the sequence chosen by the antibody response and the possible protection provided by this peptide.
  • Test 1 Protocol for vaccinating gerbils with the PP peptide coupled to the KLH carrier protein
  • a vaccination / test protocol has been implemented to evaluate the protection that the PP peptide (seq ID No. 1) coupled to the KLH protein can provide.
  • This construct is administered subcutaneously without adjuvant with PBS as negative control (lot 2).
  • Lot 2 10 gerbils, 2 injections of PBS under 300 ⁇ l The two injections in a volume of 300 ⁇ l were administered two weeks apart by the subcutaneous route.
  • a virulent test by intraperitoneal injection of 0.5 ml of a canicola culture grading 90 to 100 UT (turbidimetry) diluted to 10 "2 ' 5 was carried out two weeks after the second injection.
  • Antigenic response ELISA monitoring of the immune response of gerbils against the PP peptide
  • Anti-PP antibodies were assayed in the gerbil by an ELISA technique (described above) with a biotinylated anti-gerbil antiglobulin (BioAtlantic) at 1/3000 and as a developer of streptavidin coupled to peroxidase (RPN1231, Amersham pharmacia biotech).
  • the antigenicity of the chosen peptide is important.
  • Table 4 Table of mortality of gerbils immunized by the PP peptide coupled to the protein carrier KLH after virulent test canicolalO " "' 5 .
  • the mortality of lot 2 corresponding to the control group having received PBS (0/10) is very high since on day 8 no gerbil survived a virulent test of E. interrogans serovar canicola.
  • This virulent challenge is severe because on one hand the DL100 was reached in 8 days and secondly mortality began early, as early as 5 ⁇ eme day, and was very quick since all the witnesses are dead in 3 days.
  • Test 2 Protocol for vaccinating gerbils with the PP peptide coupled or not coupled to the KLH carrier protein
  • a vaccination / trial has been implemented to assess the protection that the PP peptide (seq ID No. 1) can provide, whether or not coupled to the KLH protein.
  • This construct is administered subcutaneously without an adjuvant, PBS as a negative control is administered by the same route (lot 3).
  • Lot 1 12 gerbils, 2 injections of 30 ⁇ g of PP-KLH under 300 ⁇ l
  • Lot 2 12 gerbils, 2 injections of 30 ⁇ g of PP in 300 ⁇ l
  • Lot 3 15 gerbils, 2 injections of PBS in 300 ⁇ l
  • Table 5 Table of mortality of gerbils immunized by the PP peptide coupled or not with the KLH carrier protein after virulent canicolalO "2 test .
  • the mortality of batch 3, control group having received PBS, is the highest of all the batches and corresponds to the lethal dose 50 (7/15).
  • the mortality in the controls started early on D6 whereas it did not start until D8 for the batch immunized with PP and D9 for the batch immunized with PP-KLH.
  • the PP peptide coupled to the KLH carrier protein provides significant protection against a canicola challenge for the two experiments. This protection is significant on the survival of the animals estimated by the logrank test whatever the experience; the combination of the two experiences increases the significance of the experience, whether with the ⁇ test or the Logrank test.
  • Vaccination with the PP peptide coupled or not with the KLH protein made it possible to show the protective effect of the PP peptide, twice, following a virulent test (canicola).
  • Example 8 Vaccination test with the peptide PP coupled in NH 2 to the carrier protein KLH in dogs.
  • the purpose of immunizing dogs with the PP peptide is to assess the protective effect provided by this peptide. Protection will be studied under two components: clinical protection but also protection against renal carriage.
  • This construct is administered subcutaneously without adjuvant with PBS as negative control (lot 2).
  • the Virulent Test was performed on D 0 .
  • the animals receive a virulent test at the rate of a virulent culture of 4 to 6 days.
  • each animal receives 0.3 ml in each eye of the culture titrating 120 UT (that is 2 ⁇ 10 8. Leptospires per ml) and intraperitoneally 4 ml of the same culture diluted to the tenth.
  • BALANCE SHEET
  • the test phase took place from Ji to D 41 , with the test on D 0 . During this phase, the temperature was measured at Jo, Ji, h, h, h,,, -
  • the haematological parameters were measured on D- 1; J 3 , J, J ÎO , J 1 , Jis and
  • the evolution of the lymphocytes between D ⁇ and D 41 is shown in FIG. 19. Significant lymphopenia is noted on D 4 in the controls, perfectly unnoticed in the vaccinated in which only post-infectious lymphoproliferation is observed.
  • Period of acute renal involvement (Jo-Jio): no significant difference between controls and vaccinated despite a tendency (p ⁇ 0.15) to a more intense expression in the controls (higher urea)
  • the presence of leptospires was studied jointly by PCR (PCR specific for pathogenic leptospires) and by culture in the urine on D 0 , D 10s D 1 , J ⁇ 8 , D25, D41 and in the kidney samples of each animal at the end of the test on D 41 .
  • the PCR results are shown in Table 8.
  • the bacteriological results were quantified thanks to the implementation of a coefficient: by immediate culture.
  • a single living leptospire can give a positive culture.
  • a relative estimate of the bacterial concentration is expressed by a coefficient of 3 when a culture has developed in the third serial dilution made from the sample. by PCR on frozen samples.
  • a positive PCR does not prejudge the viability of the bacteria detected and, moreover, a PCR is only positive for 10 leptospires present.
  • a coefficient of 1 was assigned to a PCR with a weak signal and a coefficient of 2 to a strongly positive PCR.
  • the urea and creatinine levels are lower in the vaccinated during the septicemia phase than those observed in the controls.
  • Renal colonization detected later in vaccinated dogs than in control dogs corresponds to colonization with lower noise or later.
  • the fact of simultaneously observing a significant increase in urea in control dogs is in favor of colonization at a lower level in the vaccinated.
  • Table 7 Results of the cultures carried out on the plasma, urine and kidney samples of the 6 control dogs and the 6 vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira leptospires interrogans if serovar canicola
  • Table 8 PCR results on plasma, urine and kidney samples from 6 control dogs and 6 vaccinated dogs (immunized with the PP peptide coupled to the carrier protein KLH) subjected to a virulent test of Leptospira interrogans leptospires if serovar canicola

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Abstract

Peptides susceptibles d'induire une protection contre les leptospires (notamment par voie vaccinale), compositions immunogènes (réactifs diagnostiques et/ou thérapeutiques), comprenant un ou plusieurs de ces peptides ou les anticorps, acides nucléaires ou vecteur qui en dérivent. Lesdits peptides sont notamment choisis parmi le peptide de SEQ ID NO:1, les homologues et les dérivés de ce peptide.

Description

PEPTIDES POUR LA PREVENTION, LE DIAGNOSTIC ET LE TRAITEMENT DE LA LEPTOSPIROSE ANIMALE ET/OU HUMAINE
La présente invention a pour objet des peptides susceptibles d'induire une protection contre les leptospiroses (notamment par voie vaccinale), des compositions immunogènes (réactifs diagnostiques et/ou thérapeutiques), comprenant un ou plusieurs de ces peptides ou les anticorps, acides nucléiques ou vecteur qui en dérivent. Ces compositions sont particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent d'induire une réponse ou une protection immune contre différentes souches pathogènes, notamment contre plusieurs sérogroupes pathogènes différents de leptospires et d'assurer un diagnostic commun à tous les cas cliniques quelle que soit l'espèce affectée.
Les leptospires pathogènes sont responsables de maladies infectieuses atteignant l'homme et l'animal. Les leptospiroses font partie des zoonoses surveillées par l'OMS du fait de leur répartition mondiale et de la gravité de la maladie (létale chez 2 à 20 % des malades en fonction de la précocité du diagnostic et du traitement). Chez l'animal, l'impact économique est important, la maladie étant responsable de troubles de la reproduction chez les animaux d'élevage (ruminants ou porc) ou de signes cliniques graves altérant la santé de l'animal de compagnie qu'est le chien, ou celle de l'animal de sport qu'est le cheval. L'importance des leptospiroses s'illustre notamment par deux aspects : tout d'abord leur impact en santé publique (hospitalisations, incapacités de travail, parfois décès, mise en œuvre de vaccinations dans le cadre de la protection contre les maladies professionnelles dans certains pays dont la France), d'autre part leur impact économique (coût de mise en œuvre des programmes de santé publique, perte de production pour les animaux d'élevage et coût des vaccins employés dans de nombreux pays pour lutter contre cette baisse de production, perte affective de l'animal de compagnie ou/et coût des vaccins disponibles actuellement chez le chien dans la quasi-totalité des pays du monde, et encore perte financière du fait de l'altération des performances sportives du cheval). La lutte contre ces infections est particulièrement difficile, compte tenu de la complexité bactériologique de ces germes et de la diversité des réservoirs que constituent les animaux de la faune sauvage, porteurs, excréteurs et disséminateurs de ces germes par leurs urines. La complexité bactériologique de ces bactéries est telle qu'actuellement coexistent deux classifications de ces germes : une classification sérologique et une classification génomique.
Selon la classification sérologique, toutes les souches pathogènes ont
• été classées dans une même espèce pathogène Leptospira interrogans s.l. par opposition aux souches saprophytes aquacoles et classées dans Leptospira biflexa s.l. L'espèce Leptospira interrogans est divisée en plus de 25 sérogroupes différents, chacun de ces sérogroupes étant lui-même composé de plusieurs sérovars présentant entre eux des communautés antigéniques suffisantes pour leur regroupement. On dénombre ainsi quelque 220 sérovars différents pour l'espèce pathogène. Cette classification est faite sur la base des antigènes inducteurs d'anticorps agglutinants, c'est pourquoi elle est encore la seule employée dans le cadre du diagnostic sérologique de l'infection.
Selon la classification génomique, fondée sur l'étude d'homologies génétiques, l'espèce pathogène Leptospira interrogans si a été éclatée en espèces différentes dites genomospecies : Leptospira interrogans sensu stricto (s. s.), Leptospira kirshneri, L. borgpetersenii, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. meyeri, L.fainei....
L'expression clinique de la leptospirose est très polymorphe en fonction des souches infectantes mais aussi des espèces. Ainsi, l'homme, sensible à la leptospirose, développe généralement des formes aiguës d'évolution rapide, avec atteinte hépatique, rénale ou pulmonaire. La précocité du diagnostic conditionne en général l'efficacité du traitement antibiotique. Le vaccin français dirigé contre Icterohaemorrhagiae n'assure une protection que contre ce sérogroupe considéré comme le plus pathogène. Chez le chien, espèce animale la plus sensible, une vaccination contre les deux sérogroupes considérés comme dominants dans cette espèce (Icterohaemorrhagiae et Canicola) a été mise en œuvre. Cependant, le vaccin ne protège que contre ces deux sérogroupes et ne permet pas d'éviter l'infection par une souche sauvage appartenant à un autre sérogroupe. Ceci explique le développement de troubles chroniques, encore mal identifiés par les vétérinaires praticiens jugeant qu'un chien vacciné contre "la" leptospirose ne peut développer une forme chronique liée à une infection par une souche sauvage.
Chez le cheval, très exposé du fait de ses conditions d'entretien, de rares formes aiguës mais aussi des formes non caractéristiques telles que des baisses de forme, des contre performances sportives apparaissent. Certains avortements de cette espèce sont également liés à l'infection leptospirosique. Enfin, une affection oculaire récidivante est attribuée aux suites de l'infection par les leptospires. Cette affection compromettant l'avenir de l'animal par la cécité qu'elle peut entraîner est d'ailleurs inscrite en France sur la liste des vices rédhibitoires. Chez les ruminants et le porc, la leptospirose s'exprime essentiellement par des troubles de la reproduction, comprenant soit des avortements, soit de l'infertilité, troubles dont le poids économique peut être estimé suffisamment important pour que certains pays mettent en place à grande échelle des mesures de vaccination et/ou d'éradication.
Compte tenu de l'importance et de la diversité des formes pathologiques, toute suspicion de leptospirose, qu'il s'agisse d'un cas clinique individuel ou d'un problème d'élevage, fait généralement l'objet de méthodes de confirmation expérimentale. Deux volets du diagnostic (et dépistage) peuvent ainsi être nécessaires, en fonction de la durée d'évolution de la maladie. Dans les cas aigus, la mise en évidence directe du germe est primordiale. Dans les cas chroniques, la mise en évidence de façon indirecte par la réponse sérologique est généralement suffisante en terme de diagnostic, mais, dans un deuxième temps, la reconnaissance des animaux porteurs de germes, et donc excréteurs, nécessite la mise en évidence du germe.
Actuellement, la mise en évidence directe de l'agent pathogène du germe peut être effectuée essentiellement par deux méthodes : l'isolement et la PCR.
L'isolement bactériologique est une méthode très lourde. La fragilité naturelle des leptospires fait que seuls les prélèvements traités dans un délai restreint permettent l'éventuel isolement d'une souche de leptospires. Il faut noter que la probabilité d'isoler un leptospire est en général faible, étant données les exigences de ces germes ; en outre le délai de réponse peut aller jusqu'à plusieurs semaines compte tenu de la lenteur de développement des cultures. La PCR s'est donc révélée un outil beaucoup plus intéressant en terme de diagnostic. Cependant, cette méthode n'est actuellement développée que chez l'Homme, pour lequel elle est mise en œuvre à partir d'un prélèvement sanguin sur le malade en phase aiguë. La réalisation de la PCR comme méthode de diagnostic sur des tissus comme des produits d'avortement n'est encore qu'au stade de l'expérimentation. Quant au dépistage des animaux excréteurs de leptospires par l'analyse des urines, méthode qui serait utile en élevage, elle n'est pas actuellement opérationnelle.
Le diagnostic sérologique du germe, consistant à mettre en évidence des anticorps témoins d'une infection, est généralement effectué par le test de Microagglutination (MAT) qui est actuellement la méthode de référence. Les inconvénients de cette méthode sont liés à l'hétérogénéité bactériologique des leptospires. La méthode requiert l'utilisation de germes vivants (dont la culture est délicate) et par ailleurs, repose sur la mise en évidence d'anticorps agglutinants induits par les antigènes de surface des leptospires, antigènes qui ont servi à leur classification et donc expriment l'hétérogénéité de ces bactéries. Ceci signifie que la mise en œuvre du diagnostic sérologique nécessite que le sérum du malade soit mis en contact avec une souche vivante représentative de chacun des sérogroupes différents, ce qui oblige à multiplier les manipulations pour un même sérum. Sur le plan de la protection, il a toujours été considéré dans l'art antérieur que seules les bactéries entières sont susceptibles d'apporter les antigènes protecteurs et par ailleurs qu'il n'existe pas de protection croisée entre des sérogroupes différents. Ce qui signifie qu'actuellement, les vaccins commercialisés sont composés d'une suspension ou plus exactement d'une addition de suspensions de bactéries représentatives de chacun des sérogroupes nécessaires à la protection de l'espèce de destination du vaccin. Compte tenu de la grande diversité des sérogroupes, un choix s'impose en fonction de l'espèce et des conditions épidémiologiques. Ainsi, les vaccins usuels utilisés chez le chien associent une suspension de bactéries inactivées du sérogroupe Icterohaemorrhagiae et une du sérogroupe Canicola. Des vaccins utilisés chez le porc et les ruminants aux USA associent des suspensions de sérovars appartenant aux sérogroupes : Icterohaemorrhagiae, Pomona, Grippotyphosa, Canicola et Sejroë (sérovar hardjo) par exemple. Le vaccin à usage humain commercialisé en France à l'heure actuelle comporte le sérogroupe Icterohaemorrhagiae etc.. Le problème de ces préparations vaccinales est leur défaillance en termes de protection totale contre la leptospirose. Un individu vacciné dont la vaccination est entretenue selon les modalités prescrites par les producteurs de vaccin est protégé contre l'infection et/ou la maladie induite par une souche sauvage appartenant aux seuls sérogroupes présents dans le vaccin. On ne protège donc (et encore cette protection peut-elle être imparfaite) que contre l'infection par un ou plusieurs sérogroupes donnés, représentés dans la préparation vaccinale.
Cependant dans des travaux précédents (Gitton X, André-Fontaine G, André F, Ganière J-P. « Immunoblotting study of the antigenic relationships among eight serogroups of Leptospira." Vet Microbiol 1992 ; 32:293-303.), nous avons déterminé des antigènes communs à tous les leptospires pathogènes capable d'induire une protection croisée entre plusieurs sérogroupes selon la démarche suivante.
Ainsi, dans une première étape, il a été démontré que la présence de corps bactériens entiers n'était pas indispensable à l'induction d'une protection homologue. On entend par réponse ou protection homologue, la protection induite par une préparation composée par les leptospires appartenant au même sérogroupe que les leptospires employés dans l'épreuve virulente réalisée sur animal de laboratoire sensible et permettant d'apprécier l'efficacité et l'authenticité de la protection conférée. Ceci a été démontré par immunisation d'animaux avec un extrait total de leptospires obtenu par éclatement des bactéries. Dans une seconde étape, il a été démontré que des extraits totaux de différents sérogroupes permettaient d'induire une protection hétérologue à l'intérieur de l'espèce L. interrogans si. On parle de protection hétérologue lorsque l'épreuve virulente ("challenge") est réalisée avec une souche n'appartenant pas au sérogroupe utilisé pour l'immunisation. Ceci a été démontré par des immunisations réalisées avec des extraits totaux de cultures des sérogroupes Autumnalis, Canicola ou Icterohaemorrhagiae suivies d'épreuves virulentes utilisant des souches Icterohaemorrhagiae ou Canicola dont la virulence est entretenue au laboratoire. La troisième étape a consisté à démontrer que l'antigène ou les antigènes responsables de cette protection croisée étaient absents de, ou très peu exprimés par, l'espèce saprophyte: un extrait total de L. biflexa n'a pas permis de protéger des animaux contre une épreuve virulente. La quatrième étape a consisté à identifier les antigènes différenciant l'espèce pathogène de l'espèce saprophyte : Pour cela, des comparaisons de profils électrophorétiques ou d'immunotransferts d'extraits totaux de leptospires de différents sérogroupes pathogènes ou non ont été réalisées et montrent des bandes antigéniques s' échelonnant de 14 à 200 kD dont 24 sont communes à l'espèce pathogène et en particulier la zone 21-26 kD qui est sérogroupe-spécifique (Gitton X, André-Fontaine G, André F, Ganière J-P. « Immunoblotting study of the antigenic relationships among eight serogroups of Leptospira." Vet Microbiol 1992 ; 32:293-303.). Des immunotransferts d'extraits totaux reconnus par des sérums de chiens infectés ont été réalisés ; ceci a permis de montrer que la zone 21-31 kD et plus particulièrement 25-31, 32-34 et 45 kD seraient associés à l'appartenance à l'espèce pathogène, la zone antigénique différenciant l'espèce pathogène de l'espèce saprophyte se situait donc entre 21 et 45 kD. (Gitton X, Buggin-Daubié M, André F, Ganière J-P, André-Fontaine G. « Récognition of Leptospira interrogans antigens by vaccinated or infected dogs ». Vet Microbiol 1994 ; 4:87-97.). Cependant l'utilisation d'un extrait total permettait la migration des antigènes protéiques mais également des antigènes lipopolyosidiques. Or l'art antérieur définit ces derniers comme responsables de la protection contre la leptospirose. La cinquième étape devait donc apprécier le rôle respectif éventuel dans la protection croisée des antigènes lipopolyosidiques et des antigènes protéiques préparés séparément. Cette cinquième étape a défini la nature de l'antigène ou des antigènes responsables de cette protection croisée. Des extraits purifiés de lipopolysaccharides (LPS) ont été préparés par la méthode d'extraction à chaud phénol-eau de estphall. Ce mode de préparation permet d'obtenir la fraction lipopolyosidique (LPS) pure. L'extrait résiduel contient les protéines (simples ou complexes), mais aussi du LPS résiduel. Nous avons démontré que l'extrait pur LPS est responsable d'un puissant effet protecteur, mais exclusivement homologue. Ceci confirme bien les données antérieures concernant l'absence de protection croisée entre sérogroupes. En effet, le LPS correspond aux structures antigéniques externes responsables de la production d'anticorps agglutinants utilisés comme base de la classification sérologique, mais aussi responsables de l'effet protecteur des préparations vaccinales. Selon l'art antérieur, il était donc nécessaire qu'un vaccin soit capable d'induire la production d'anticorps agglutinants à des taux significatifs pour protéger un animal contre une infection par un leptospire homologue. La sixième étape a consisté à contrôler la capacité d'un extrait protéique d'une souche Autumnalis ou Canicola purifié de toute trace de LPS d'induire une protection homologue au même titre que le LPS purifié mais aussi d'induire une protection contre une épreuve virulente hétérologue observée lors des essais précédents avec des extraits totaux. Ceci a été réalisé par une immunisation avec un extrait protéique obtenu par une extraction chloroforme méthanol effectuée sur l'interface d'une extraction phénol eau ayant permis la purification préalable du LPS et suivie d'une épreuve virulente homologue ou hétérologue suivant le cas (Sonrier C, Branger C, Michel V, Ruvoen-Clouet N, Ganière JP, Andre-Fontaine G. « Evidence of cross-protection within Leptospira interrogans in an expérimental model.Vaccine ». 2000 Aug 15 ; 19(l):86-94.). Lors de la septième étape, il a été possible par l'utilisation du Prep-cell de Biorad de séparer différentes protéines ségrégeant dans cette zone afin de réaliser leur séquençage. Trois bandes ont fait l'objet de l'étude en séquençage, une protéine de 32 kD et deux protéines de 34 kD. Les séquences NH2 terminales ont été définies ainsi qu'une séquence interne d'une douzaine d'acides aminés correspondant au pic majeur (pic 14) obtenu en HPLC. La protéine de 32 kD a été désignée PPL. Dans une huitième étape, des sondes nucléotidiques dégénérées ont été construites, le gène de PPL a été clone, et la production de protéine PPL recombinante a été effectuée et a permis la production d'anticorps monoclonaux. Le gène PPL a été inséré dans un adénovirus humain non réplicatif et une protection efficace contre des épreuves virulentes effectuées sur la gerbille, a été observée après administration de ces virus recombinants en particulier comme vaccins (Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen-Clouet N, Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M. « Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination. » Infect Immun. 2001 Nov ; 69(11) : 6831-8.).
Toutefois, la protéine recombinante produite par un système procaryote ne permet pas d'apporter de protection significative contre les différentes souches de leptospires pathogènes.
Par ailleurs, le diagnostic sérologique des leptospiroses par le test de microagglutination est tardif et ne permet pas une détection précoce de la maladie. Il n'est pas rare qu'un animal meure de leptospirose avant que celle-ci soit diagnostiquée. Le document WO 01/59123 décrit l'identification d'une protéine désignée PPL de 32 kD, comportant une séquence SEQ ID NO:l = TFLPYGSVINYYGYNK, cette protéine étant commune à certaines souches pathogènes de leptospirose. La séquence de PPL comprend 272 acides aminés. Ce document indique avoir pour objet des fragments de PPL mais n'en décrit aucun en particulier. La séquence de cette protéine PPL intégrée dans un vecteur adéno-virus a montré un effet de protection hétérologue.
Le document WO 99/42478 décrit une protéine membranaire LipL32 qui est présente chez certaines souches pathogènes de leptospire. Cette protéine comporte 272 acides aminés. Elle peut être utilisée pour induire une réponse immunitaire dirigée contre certaines souches de leptospires.
Toutefois, il n'est nullement envisagé dans ce document que cette protéine permette d'induire une protection hétérologue contre différentes souches de leptospires.
Le document WO 96/36355 décrit deux protéines membranaires de souches pathogènes de leptospire, LipLl et LipL2, d'un poids respectif de 35 kDa et 41 kDa. Ces protéines sont utilisées pour produire une réponse immunitaire contre certaines souches de leptospires. Toutefois, il n'est nullement envisagé dans ce document que cette protéine permette d'induire une protection hétérologue contre différentes souches de leptospires.
Les inventeurs se sont donc fixé pour objectifs l'identification de peptides susceptibles d'induire une protection efficace contre les différentes souches de lepstopires pathogènes, cette protection pouvant être induite de façon directe, sans passer par l'expression de ces peptides dans un adénovirus.
Les inventeurs se sont également fixé pour objectifs la mise au point d'une méthode de détection précoce de l'infection par les différentes souches de leptospires pathogènes afin de permettre un diagnostic de leptospirose à un stade de l'infection où il est efficace d'administrer un traitement à l'individu.
La présente invention permet à présent de résoudre les inconvénients des différentes méthodes de vaccination, de dépistage, de diagnostic et de traitement, décrites dans l'art antérieur. La présente invention décrit en effet l'identification d'un motif antigénique de leptospire : le peptide PP, commun à de multiples sérogroupes de leptospires, notamment de leptospires pathogènes. La présente invention permet également la production de polypeptides, peptides et anticorps, utilisables soit dans des approches vaccinales soit dans des approches thérapeutiques efficaces et susceptibles d'induire une protection contre de multiples sérovars de leptospires pathogènes. La présente invention permet ainsi la réalisation de tests de détection ou de dépistage des leptospires pathogènes eux-mêmes ou de l'infection qu'ils provoquent, non restreints à des sérovars particuliers. La présente invention permet en outre la réalisation de tests de détection plus simples que les méthodes MAT décrites dans l'art antérieur, puisqu'elles ne nécessitent pas la culture de germes. La présente invention décrit en outre des acides nucléiques, vecteurs, sondes, amorces ainsi que des cellules recombinantes utilisables pour la production des polypeptides, peptides ou protéines ou pour la détection de leptospires ou de leurs produits dans tout échantillon test, biologique (par exemple fluides biologiques tels que sang, plasma, urine, lait, liquide céphalorachidien, tissu, organe, culture cellulaire, etc.) ou d'autre origine (comme par exemple un échantillon souillé par des matières biologiques, telles qu'une eau de rivière, une eau stagnante, une eau de boisson, une eau stockée utilisées par des entreprises telles que des ardoisières, des maraîchers, etc.
Le premier objet de l'invention est un peptide dénommé PP, fragment d'une protéine PPL de 32 kDa décrite dans la Demande Internationale WO01/59123. Ce peptide PP est constitué de 25 acides aminés et est représenté par la séquence SEQ ID N°: 1 représentée ci-dessous :
SEQ ID NO : 1 Lys-Ala-Lys-Pro-Val-Gln-Lys-Leu-Asp-Asp-Asp- Asp-Asp-Gly-Asp-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Glu-Arg-His-Asn-Lys
La séquence SEQ ID NO:l et, de façon plus générale, les composés de la présente invention sont dotés d'avantages imprévisibles par rapport aux protéines de l'art antérieur : - obtention d'une protection contre les différentes souches de leptospires pathogènes à partir d'un seul composé,
- obtention d'un diagnostic précoce de leptospirose,
- obtention d'un diagnostic discriminant (infection/vaccin) de leptospirose. L'invention a également pour objet des homologues du peptide PP, ses sels pharmaceutiquement acceptables, ses fragments fonctionnels, ses analogues chimiques et certains dérivés chimiques de ce peptide.
Par homologues, on entend au sens de la présente invention des peptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 1, encore plus préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%), ou mieux, 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : l.
Par similarité de X% entre un peptide P et la séquence SEQ ID NO : 1, on entend que : lorsque la séquence de P est alignée face à SEQ ID NO : 1, dans le même sens, X%> des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de SEQ ID NO : 1 ou sont remplacés par un acide aminé de même classe, étant entendu que si les séquences ne sont pas de même longueur, on placera éventuellement un espace entre les acides aminés de la séquence concernée. Le degré d'homologie peut être évalué par des méthodes bien connues de l'homme du métier (par exemple, WILBUR W.J. et al Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) ; MYERS et al, Comput. Appl Biosci. 4, 11-17 (1988)).
Au sens de la présente invention l'homologie avec la SEQ ID NO : 1 s'étend aux peptides comportant de 15 à 40 acides aminés et dont la séquence, une fois alignée avec SEQ ID NO : 1, avec les espaces placés entre les acides aminés appropriés, possède une similarité comprise dans les valeurs indiquées ci-dessus. Préférentiellement, l'homologie s'étend aux peptides comportant de 20 à 30 acides aminés, encore plus préférentiellement de 22 à 28 acides aminés.
Par acides aminés de même classe, on entend un acide aminé possédant des propriétés chimiques sensiblement identiques. En particulier, on entend par ce terme des acides aminés ayant sensiblement la même charge, et/ou la même hydrophilie ou hydrophobie, et/ou la même aromaticité.
De tels regroupements d'acides aminés incluent généralement :
(i) glycine, alanine, valine, (ii) isoleucine, leucine,
(iii) tryptophane, tyrosine, phénylalanine,
(iv) acide aspartique, acide glutamique,
(v) arginine, lysine, histidine,
(vi) asparagine, glutamine, (vii) serine, thréonine.
D'autres substitutions d'acides aminés peuvent être envisagées au sens de la présente invention dans lesquelles on remplace un acide aminé par un autre acide aminé de même classe, c'est-à-dire possédant des propriétés comparables, l'acide aminé de substitution étant un acide aminé non naturel. C'est le cas, par exemple, des énantiomères et des diastéréoisomères des acides aminés naturels, de l'hydroxyproline, de la norleucine, de l'ornithine, de la citruline, de la cyclohexylalanine, des acides β-aminés tels que l'acide 3-amino- propionique, des acides Ω-aminés tels que l'acide 4-amino-butyrique. De tels acides aminés sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être préparés par des méthodes connues. Sont également inclues dans la présente invention les substitution d'un ou plusieurs acides aminés par un acide aminé non naturel porteur d'un groupement permettant la détection du peptide, tels qu'un acide aminé porteur d'un groupement fluorescent , photoactivable ou un acide aminé radiomarqué.
Un exemple particulier d'homologue est constitué par les fragments fonctionnels des peptides selon l'invention : ce sont des peptides répondant à l'une des séquences selon l'invention dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés sont ôtés de la séquence mais qui conservent une activité immunogéniques comparable à celle décrite pour le peptide PP, en particulier un titre en anticorps comparable. Les fragments fonctionnels préférés des peptides selon l'invention sont ceux pour lesquels au plus six acides aminés, plus préférentiellement 4 acides aminés, plus préférentiellement encore 2 acides aminés, sont ôtés. Encore plus préférentiellement, ceux pour lesquels un acide aminé est ôté.
Habituellement, des substitutions d'acides aminés de même classe permettent de conserver au peptide son activité immunogène. Des substitutions appropriées pourront être déterminées en testant les propriétés antimicrobiennes des peptides obtenus en utilisant des tests d'activité tels que ceux décrits ci-après. L'invention concerne plus spécifiquement des molécules induisant un titre en anticorps et/ou conférant une protection comparable à ceux susceptibles d'être obtenus par l'utilisation du peptide PP.
Selon l'invention, le terme sels se rapporte à la fois aux sels d'aminé d'une fonction carboxyle de la chaîne peptidique aussi bien qu'aux sels acides d'addition à un groupe aminé de cette même chaîne polypeptidique. Les sels d'une fonction carboxyle peuvent être formés avec une base inorganique ou organique. Les sels inorganiques incluent par exemple les sels de métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium et de lithium ; les sels alcalino-terreux tels que par exemple les sels de calcium, de barium et de magnésium ; les sels d'ammonium, les sels ferreux, ferriques, les sels de zinc, de manganèse, d'aluminium, de magnésium. Les sels avec des aminés organiques incluent ceux formés par exemple avec la triméthylamine, la triéthylamine, la tri(n-propyι)amine, la dicyclohexylamine, la triéthanolamine, l'arginine, la lysine, l'histidine, l'éthylènediamine, la glucosamine, la méthylglucamine, les purines, les pipérazines, les pipéridines, la caféine, la procaïne.
Les sels d'addition acides incluent, par exemple, les sels avec des acides minéraux tels que par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide nitrique ; les sels avec des acides organiques tels que par exemple, l'acide acétique, l'acide oxalique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide malique, l'acide ascorbique, l'acide benzoïque. Des dérivés chimiques des peptides selon l'invention incluent les composés des-alpha amino peptides, les dérivés N-alpha acyl substitués de la forme RCO-, dans laquelle R représente un groupement alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou aralkyle, linéaire, ramifié, ou cyclique comprenant de 1 à 50, préférentiellement de 1 à 8 atomes de carbone. Le groupement N-alpha acyle préféré est le groupement acétyle. De tels substituants amine-terminaux peuvent augmenter l'activité du peptide en ralentissant ou en empêchant la dégradation enzymatique des peptides in vivo.
D'autres dérivés chimiques des peptides selon l'invention incluent les dérivés substitués sur la fonction acide C-terminale par un groupement choisi parmi - NH2, les alkyloxy, alkylthio ou alkylamino de la forme -OR, -SR or -NHR, dans lesquels R peut représenter une chaîne alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou un groupement aralkyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 1 à 50, préférentiellement de 8 à 50 atomes de carbone.
Une autre sorte de dérivé chimique des peptides selon l'invention inclut les dérivés porteurs d'un substituant pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection par spectroscopie et l'évaluation quantitative du peptide selon l'invention dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique. Préférentiellement, selon l'invention, les acides aminés dont sont constitués les peptides sont des énantiomères L. Toutefois, un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique peut être remplacé par son énantiomère D.
Au titre des analogues chimiques, dans les peptides selon l'invention, une ou plusieurs liaisons amides peptidiques (-CO-NH-) peuvent être remplacées par une liaison isostère telle que : -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2-, -CH≈CH- (cis et trans), - COCH2-, -CH(OH)CH2- et -CH2SO-. Cette substitution peut être faite par des méthodes bien connues de l'homme du métier (on peut se reporter par exemple à : SPATOLA, Vega Data, Vol.l, issue 3 (1983) ; SPATOLA, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, Weinstein, éd., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983) . MORLEY.J.-S., Trends Pharm. Sci., 463-468 (1980) ; HUDSON et al, Int. J. Pept. Prot. Res. 14, 177-185 (1979) ; SPATOLA et al, Life Sci., 38, 1243-1249 (1986) ; Hann, J.Chem. Soc. Perkin Transi 307-314 (1982) ; ALMQUIST et al, J. Med. Chem., 23, 1392-1398 (1980) ; JENNLNGS-WHITE et al, EP-45665 ; HOLLADAY et al, Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (1983) . HRUBY et al, Life Sci. 31, 189-199 (1982)).
Des dérivés des peptides selon l'invention incluent des polymères de ces peptides, plus préférentiellement des dimères de ces peptides via par exemple un groupement thiol de cystéine ou des oligomères par greffage de peptides sur des polylysines (MAP), ou couplage de ces peptides à des protéines porteuses (BSA,
KLH, Toxines, etc.), ou à des chaînes lipidiques.
Les peptides objets de la présente invention peuvent être aisément obtenus par tous moyens connus de l'homme du métier, notamment par voie de synthèse.
L'invention a également pour objet des peptides comprenant une séquence SEQ ID NO : 1 ou des peptides comprenant un fragment fonctionnel de ces peptides, un homologue, un analogue chimique de ces peptides ou un dérivé chimique de ces peptides. En effet, les acides aminés terminaux, du peptide PP comportent, pour l'un, une fonction aminé terminale libre, et pour l'autre, une fonction carboxyle terminale libre, ces deux fonctions étant chacune susceptibles d'être engagées dans une liaison peptidique avec l'acide C - terminal, respectivement l'aminé N - terminale d'un autre fragment de peptide. De préférence, ces peptides comportent au plus 100 acides aminés, préférentiellement au plus 80 acides aminés, encore plus préférentiellement au plus 60 acides aminés et de façon avantageuse au plus 40 acides aminés.
Le caractère immunogène des polypeptides ou peptides de l'invention peut être vérifié de différentes manières connues de l'homme du métier.
Ainsi, les polypeptides peuvent être mis en contact avec des anticorps (ou sérum de sujets infectés), la mise en évidence de complexes antigènes-anticorps indiquant la capacité des polypeptides de l'invention de porter des épitopes ou des fragments immunogènes.
Un autre objet de l'invention réside dans des protéines comprenant un peptide tel que défini ci-dessus, couplé avec une protéine porteuse, comme par exemple la protéine KLH ou la protéine BSA. Ce couplage permet d'augmenter l'immunogénicité du peptide de l'invention. Des protéines porteuses sont illustrées dans les documents US-4,608,251 ; US-5,945,104 ; WO 90/15878.
Le couplage du peptide de l'invention et de la protéine porteuse peut être fait de façon connue par couplage chimique ou par addition de la séquence ADN du peptide avant ou après celle de la protéine porteuse dans un plasmide puis expression et purification de la protéine que l'on désigne du nom de protéine de fusion.
Un autre objet de l'invention concerne des anticorps dirigés spécifiquement contre une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Il s'agit préférentiellement d'anticorps anti-leptospire, liant un épitope présent dans une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Les anticorps de l'invention sont préférentiellement spécifiques des leptospires, notamment pathogènes, bien qu'une liaison plus faible (ou non-spécifique) puisse être observée expérimentalement avec d'autres antigènes.
Les anticorps selon l'invention peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Ils sont généralement produits par immunisation d'un animal avec un peptide, un polypeptide ou une protéine, selon l'invention et récupération du sérum, du lait ou de l'œuf s'il s'agit d'oiseaux (pour obtenir les anticorps polyclonaux) ou de cellules du thymus ou de la rate, pour la production d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux.
Les anticorps selon l'invention sont plus préférentiellement des anticorps reconnaissant le peptide PP de séquence SEQ ID NO : 1 telle que définie ci- avant, un fragment fonctionnel de celui-ci, un homologue, un analogue chimique ou un dérivé chimique de celui-ci.
Les anticorps de l'invention possèdent avantageusement la capacité de reconnaître au moins deux souches de leptospire pathogènes appartenant à des sérogroupes différents, plus préférentiellement au moins 3 souches pathogènes de leptospire, en particulier appartenant à des espèces génomiques différentes.
Selon un mode de réalisation particulier, les anticorps selon l'invention sont des anticorps polyclonaux préparés par immunisation d'un animal avec le peptide PP. L'animal peut être un rongeur (rat, souris, gerbille, hamster, cobaye...), un primate, un lapin un porc, un cheval, un bovin, un oiseau, etc. Les anticorps polyclonaux sont généralement récupérés dans le sérum des animaux immunisés ou les œufs, selon des protocoles connus de l'homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les anticorps selon l'invention sont des anticorps monoclonaux préparés à partir d'hybridomes obtenus par fusion entre une cellule immortalisée (par exemple un myélome) et une cellule productrice d'anticorps prélevée chez un animal immunisé avec le peptide PP telle que définie ci-avant. L'animal peut être un rongeur (rat, souris, gerbille, hamster, cobaye...), un primate, un lapin, un porc, un cheval, un bovin, im oiseau, etc.
Les anticorps de l'invention, notamment les anticorps monoclonaux, peuvent en outre être humanisés, c'est-à-dire modifiés artificiellement pour comporter des régions de chaînes lourdes ou légères d'origine humaine.
L'invention concerne également des fragments ou dérivés de tels anticorps, par exemple des fragments Fab, F(ab')2, des ScFv (anticorps simple- chaîne), etc. Comme il sera développé dans la suite du texte, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés par exemple pour la détection de souches pathogènes de leptospires ou de produits sécrétés par ces mêmes leptospires dans des échantillons tests (notamment des prélèvements de sang, de lait, de liquide céphalorachidien ou d'urine), ou pour induire une protection (d'urgence) contre des infections par leptospire.
Un autre objet de l'invention réside dans tout acide nucléique codant un polypeptide, peptide ou une protéine tels que définis ci-avant. Les acides nucléiques peuvent être des ADN ou des ARN, notamment des ADN recombinants, génomiques, synthétiques ou semi-synthétiques ou encore des ARNm, ou des fragments ou dérivés de ceux-ci. Les acides nucléiques peuvent être obtenus à partir de banques, clones à partir de bactéries leptospires (notamment par PCR), produits par synthèse artificielle en utilisant des synthétiseurs d'acides nucléiques, ou encore préparés en utilisant des combinaisons de ces méthodes (digestions enzymatiques, ligatures, clonage, modifications, etc.). Les acides nucléiques peuvent en outre être modifiés pour améliorer l'usage des codons, éliminer des promoteurs cryptiques, réduire des structures secondaires, etc.
L'invention concerne également des vecteurs comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un vecteur de type plasmide, cosmide, épisome, chromosome artificiel, phage, virus, etc. Il s'agit plus préférentiellement d'un plasmide, par exemple d'un plasmide réplicatif ou intégratif chez les bactéries ou cellules eucaryotes (levures, cellules de mammifères, d'oiseaux, d'insectes, etc.) ou d'un virus recombinant, notamment défectif (tel qu' un poxvirus, un adénovirus, un rétrovirus, un baculovirus, un herpesvirus , etc.).
Les vecteurs plasmidiques peuvent être préparés par les techniques conventionnelles en utilisant des plasmides disponibles dans le commerce, tels que pUC, pBR, pCN, etc.
L'invention concerne aussi toute cellule recombinante comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. La cellule recombinante peut être une bactérie (par exemple une souche de E.coli), ou une cellule eucaryote, notamment une levure, une cellule de mammifère, d'oiseau, ou d'insecte, etc. Les cellules recombinantes peuvent être utilisées notamment pour la production des polypeptides de l'invention, ainsi que comme modèles pour la recherche de composés susceptibles de neutraliser ou d'antagoniser l'activité du peptide PP.
L'invention concerne en outre tout organisme transgénique non humain, en particulier, tout mammifère non humain, tout oiseau, ou tout organisme végétal comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant dans ses cellules. Avantageusement, ces organismes transgéniques sont obtenus par recombinaison homologue. De tels mammifères (rongeurs, canins, lapins, chèvre, porc, etc.) et végétaux sont notamment utilisables pour la production des polypeptides de l'invention et pour l'identification de composés à visée thérapeutique ou vaccinale, par exemple. Un autre objet de la présente invention réside dans des sondes et/ou amorces nucléotidiques, utilisables pour la détection et/ou l'amplification d'acides nucléiques de leptospires, et notamment pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire ou de produit sécrété par celui-ci dans un échantillon test (notamment un produit biologique ou contaminé par un produit biologique).
Les sondes nucléotidiques selon l'invention comprennent avantageusement un acide nucléique tel que défini ci-avant. Elles sont préférentiellement simple-brin, et peuvent être marquées, par exemple par marquage radioactif, enzymatique, fluorescent, chimique, etc. Une sonde selon l'invention comprend préférentiellement une séquence complémentaire de tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou de l'un des peptides selon l'invention tels que définis ci-dessus. Les sondes de l'invention peuvent être utilisées pour détecter la présence d'une souche pathogène de leptospire ou de produit sécrété par celui-ci dans tout échantillon, notamment un échantillon biologique. En effet, elles sont préférentiellement (i) spécifiques des souches pathogènes de leptospire et (ii) réactives avec des sérovars différents et des espèces génomiques différentes de leptospires pathogènes. Une sonde préférée selon l'invention comprend la séquence complète de la séquence nucléotidique codant PP, ou un fragment de celle-ci.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont des oligonucléotides, d'une taille généralement inférieure à 40 bases, comprenant la séquence d'un acide nucléique tel que défini ci-avant. Les amorces sont utilisables pour l'amplification d'acides nucléiques de Leptospires, notamment pour l'amplification de la séquence codant PP ou d'une partie de celui-ci, par exemple par réaction PCR. L'invention concerne plus particulièrement tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région de la séquence codant PP tel que défini ci- avant. Préférentiellement, la région amplifiée comporte au moins 50 pb.
Les sondes, amorces ou oligonucléotides de l'invention sont préférentiellement complémentaires d'une région au moins de la séquence codant PP. La complémentarité est généralement parfaite, de manière à assurer une meilleure sélectivité d'hybridation. Toutefois, certains mésappariements peuvent être tolérés. Ces sondes ou oligonucléotides peuvent être synthétisés par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par clivage à partir des acides nucléiques décrits ci- avant, ou par synthèse artificielle, ou en combinant ces techniques. Les sondes et amorces sont particulièrement utiles pour la détection de la présence de souches pathogènes de leptospires, et/ou le diagnostic de leptospiroses, comme il sera détaillé ci-après. Diverses équipes travaillent sur l'amélioration des antigènes de diagnostic indirect de la leptospirose, le but étant d'aboutir à des méthodes opérationnelles, facilement utilisables en particulier dans les pays non industrialisés, victimes majeures de ces pathologies. Les produits actuellement proposés sur le marché sont des extraits complexes de cultures de leptospires. Cette complexité reproduit celle des souches vivantes utilisées dans le MAT et n'apporte donc pas d'amélioration sensible en terme de reproductibilité et de practicabilité.
La mise en évidence d'anticorps dirigés contre un antigène spécifique des souches pathogènes est donc particulièrement avantageuse. La présente invention peut ainsi être utilisée sur le plan diagnostique, vaccinal, thérapeutique et/ou expérimental.
Sur le plan du diagnostic indirect, compte tenu de sa présence dans ou de sa sécrétion par les souches pathogènes, le peptide PP de l'invention peut être utilisé comme motif antigénique capable de mettre en évidence des anticorps produits lors d'une infection par une souche pathogène, quel que soit son sérogroupe d'appartenance. Ceci permet donc que le diagnostic expérimental de la leptospirose puisse être assuré par de nombreux laboratoires disposant d'un équipement ordinaire (exemple ELISA ou dot) alors que le MAT exige en entretien de cultures vivantes et que sa standardisation, de ce fait, est très difficile. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine tels que définis ci-avant pour détecter in vitro la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon biologique test (notamment un échantillon biologique tel que sang, sérum, lait, urine, tissu, etc. ou non biologique tel que eau, etc.). Un autre objet de l'invention réside dans une méthode in vitro de détection de la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon test, cette méthode comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution) avec un polypeptide, peptide ou une protéine tels que définis ci-avant, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène-anticorps.
Sur le plan du diagnostic direct, les anticorps (ou fragments ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, notamment les anticorps monoclonaux de l'invention, permettent la mise en évidence directe de l'agent pathogène ou de produits sécrétés présents dans un échantillon test (tel qu'un prélèvement biologique ou un autre type d'échantillon tel que de l'eau). La mise en évidence peut être réalisée par toute méthode immunologique connue de l'homme du métier, telle que par ELISA capture, RIA, essais directs ou sandwich, etc., ou par révélation immunologique de ce peptide dans les prélèvements pathologiques ou non.
Un autre objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un anticorps (ou fragment ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, notamment d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux de l'invention, pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire ou de ses produits sécrétés dans un échantillon, notamment biologique. Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire ou de ses produits sécrétés dans un échantillon, comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution, ou une concentration) avec un anticorps (ou fragment ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène- anticorps.
Pour ces utilisations, les polypeptides, peptides, protéines et anticorps peuvent être utilisés sous forme soluble, ou immobilisés sur des supports solides ou semi-solides, de type filtre, silice, verre, plaque, bille, etc. L'utilisation sous forme immobilisée permet avantageusement de simplifier la détection ou le diagnostic expérimental de la leptospirose. Ces composés peuvent en outre être marqués, par exemple au moyen de marqueurs fluorescents, enzymatiques, biologiques ou radioactifs. Comme indiqué ci-avant, la révélation de complexes antigène-anticorps peut également être réalisée au moyen d'un anticorps supplémentaire marqué, ou selon les techniques immunologiques connues (ELISA, RIA, sandwich, capture, etc.).
Une autre méthode de détection (ou dépistage) selon l'invention réside dans la mise en contact d'un échantillon test avec une sonde nucléotidique de l'invention, et la mise en évidence d'une hybridation entre ladite sonde et ledit échantillon. Plus préférentiellement, l'échantillon test est traité préalablement de manière à rendre les acides nucléiques qu'il contient accessibles à une réaction d'hybridation. Le traitement peut consister à casser les membranes cellulaires, par exemple par traitement chimique (détergent) et/ou mécanique (ultra son, congélation- décongélation, etc.). A ce traitement, peuvent s'ajouter des méthodes de concentration (filtration, centrifugation, etc.) des prélèvements, notamment non biologiques tels que des échantillons d'eau. Dans un mode particulier de mise en œuvre, l'échantillon, notamment biologique, ainsi traité est soumis à une réaction d'amplification, au moyen d'amorces de l'invention, préalablement à la réaction d'hybridation avec la sonde. L'amplification peut être réalisée dans des conditions conventionnelles. L'hybridation peut être réalisée sur des supports, sur lesquels la sonde est immobilisée (filtres, verre, silice, etc.). Les conditions de stringence de l'hybridation peuvent être ajustées par l'homme du métier, en adaptant la température et/ou la salinité des milieux. L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces tels que décrits ci-avant. Les kits de l'invention comprennent avantageusement les réactifs appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et, éventuellement, un support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.).
La présente invention est également utilisable sur le plan thérapeutique et préventif. En effet, bien que le mode d'action pathogénique du peptide PP ne soit pas encore défini, la présente demande montre qu'il est capable d'induire une protection. L'administration des anticorps dirigés contre ce peptide, qu'ils soient d'origine poly ou monoclonale permet de neutraliser l'impact pathogénique des leptospires chez l'individu en cours d'évolution et donc d'améliorer le pronostic de cette maladie. De même, l'administration d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine de l'invention, éventuellement sous forme inactivée, ou d'un acide nucléique ou vecteur correspondant, permet d'induire une réponse immune protectrice contre ces agents infectieux ou leurs effets.
L'efficacité des peptides de l'invention dans la détection précoce des leptospires pathogènes et l'induction d'une protection immunitaire contre ces mêmes leptospires est particulièrement remarquable, en particulier, du fait que la protéine PPL dont ils sont issus ne permet pas d'obtenir une immunisation de façon directe, sans passer par l'expression dans un adénovirus, et qu'elle ne permet pas non plus de détecter de façon précoce et spécifique la présence de souches de leptospires pathogènes dans un organisme humain ou animal. En outre, il est bien connu de l'homme du métier que les peptides sont en règle générale faiblement immunogènes.
Dans des exemples qui sont destinés à illustrer l'invention, les propriétés remarquables suivantes du peptide PP sont illustrées :
Le peptide constitué de cette séquence ID N°l est reconnu en ELISA par plusieurs anticorps monoclonaux contre la protéine PPL et en particulier 4D4H4E5 et 6E5A2F2 (Demande Internationale WO01/59123, Exemple 2).
On a également montré que le peptide PP, qu'il soit couplé ou non à une protéine porteuse, est très immunogène sur le modèle souris, lapin (Exemple 3) et gerbille (Exemple 7). Dans un troisième temps, la réponse anticorps dirigée contre le peptide PP a été analysée sur les sérums de gerbilles immunisées par Padénovirus- PPL. Une corrélation peut être observée entre la réponse immunitaire dirigée contre le peptide PP et la protection des animaux suite à l'immunisation par PPL via l' adénovirus ce qui conforte l'hypothèse d'un effet protecteur associé à la séquence de ce peptide (Exemple 6).
Dans un quatrième temps, le peptide PP a été couplé à la protéine porteuse KLH et une protection efficace contre une épreuve virulente a été observée sur la gerbille immunisée par PP-KLH (Exemple 7). Le peptide PP présente au moins un épitope protecteur dans sa séquence. Le peptide seul a permis d'induire une protection significative contre une épreuve virulente (exemple 7).
Dans un cinquième temps, l'efficacité discriminante du peptide PP comme antigène de diagnostic pour la leptospirose a été évaluée sur plusieurs espèces (homme, chien, bovin, cheval). Quelle que soit l'espèce considérée, le peptide PP se révèle être un antigène capable de mettre en évidence une réponse immunitaire spécifique d'une infection par les leptospires pathogènes, et en particulier en phase précoce (Exemple 4).
Enfin, des essais de vaccination ont montré l'effet protecteur du peptide PP chez le chien (Exemple 8).
Ces résultats démontrent que si les antigènes lipopolyosidiques sont bien le support d'une protection efficace vis-à-vis d'une infection homologue, point de départ de la constitution des préparations vaccinales employées actuellement tant chez l'homme que chez l'animal, le peptide PP, employé seul, est capable d'induire une protection croisée entre sérogroupes différents de l'espèce Leptospira interrogans ss (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Autumnalis). La protection hétérologue est également induite entre espèces génomiques différentes de l'ancienne espèce Leptospira interrogans si (ici L. borgpetersenii et interrogans ss), alors qu'il est absent de l'ancienne espèce saprophyte Leptospira biflexa si. La présente invention concerne donc l'utilisation du peptide PP, de ses fragments de synthèse ou naturels, de ses dérivés chimiques quels qu'ils soient, de ses homologues, de ses analogues chimiques, utilisés seuls ou associés à d'autres protéines ou fractions lipopolyosidiques dérivées de leptospires, ou à des adjuvants de l'immunité quelle que soit leur nature, pour la préparation d'une composition vaccinale à usage vétérinaire ou humain, notamment pour la préparation d'une composition destinée à induire une réponse immune protectrice contre des espèces et des sérovars différents de leptospires pathogènes.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique, notamment un vaccin, comprenant un polypeptide ou un acide nucléique tels que définis ci-avant.
L'invention a encore pour objet une composition comprenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-avant, notamment pour induire une protection.
Les compositions immunogènes, vaccins ou anticorps de l'invention peuvent être utilisés sous forme injectable ou per os ou transcutanée, par exemple en association avec des véhicules acceptables sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, ou avec des adjuvants. Les quantités d'immunogènes administrées, et la fréquence ou le nombre des administrations peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du sujet, du stade d'évolution de l'injection, etc. Typiquement, une ou deux injections, à 2 semaines d'intervalle, sont réalisées, avec des quantités adaptés à l'espèce par exemple 30 μg de peptide couplé à la protéine porteuse selon l'invention. Des injections supplémentaires peuvent être envisagées, ou des quantités supérieures peuvent être administrées, notamment dans le cas d'administrations orales. Les compositions immunogènes ou des vaccins de l'invention présentent notamment les avantages suivants :
Efficacité : Induction d'une protection croisée évitant l'accumulation de préparations antigéniques différentes d'efficacité partielle afin de prévenir l'infection par les différentes souches infectantes présentes dans un pays donné pour une espèce donnée.
Innocuité : L'utilisation d'un peptide de l'invention (couplé ou non à une protéine porteuse, ou des polypeptides, anticorps et acides nucléiques) évite d'introduire chez l'individu vacciné de nombreux antigènes non nécessaires à la protection, donc pour le moins inutiles, voire dangereux lors d'utilisations répétées. On pense ainsi que l'uvéite récidivante du cheval (pouvant aboutir à la cécité de l'animal) est induite par une réponse immunitaire post infectieuse due à des protéines de leptospires ayant une composition proche de certaines protéines structurales de l'œil du cheval. Par ailleurs, il semble que chez l'Homme les vaccinations répétées sont de moins en moins bien tolérées au cours du temps. De plus, aucune donnée de pharmacovigilance à long terme n'est disponible.
Les compositions d'anticorps (polyclonaux, monoclonaux humanisés ou non) peuvent avantageusement éviter en urgence et passivement une évolution grave et/ou létale d'une leptospirose déclarée chez l'homme ou l'animal.
Compatibilité avec les mesures de prophylaxie sanitaire : actuellement, il est impossible de différencier les anticorps post-vaccinaux des anticorps post-infectieux, la production d'anticorps agglutinants étant obtenue dans les deux cas. Ce vaccin employé dans les grandes espèces de production (il n'en existe pas actuellement en France et ceux existant à l'étranger ont une efficacité difficile à démontrer) permettrait de mettre en œuvre une prophylaxie médicale permettant malgré tout le dépistage de l'infection sauvage et donc les qualifications de cheptels indemnes, qualifications valorisantes à l'exportation.
Limitation de l'usage des antibiotiques en élevage : l'absence de possibilités d'éradication des leptospires (entretenus dans l'environnement par de nombreuses espèces d'animaux réservoirs de la faune sauvage) oblige actuellement à mettre en œuvre un traitement antibiotique élargi à l'ensemble du troupeau quand des troubles cliniques ou des pertes économiques sont reconnus liés à l'infection leptospirosique. Ceci contribue donc à l'utilisation intensive des antibiotiques en élevage, usage discuté en terme de retombées pour la santé publique. La production industrielle d'un tel vaccin devrait enfin être simplifiée par rapport aux vaccins de l'art antérieur puisqu'il n'est pas nécessaire de modifier la composition antigénique de la préparation vaccinale en fonction de l'espèce, ni des conditions épidémiologiques spécifiques des zones géographiques où elle serait appliquée.
L'invention concerne aussi les polypeptides, protéines et peptides tels que définis ci-avant, sous forme atténuée, c'est-à-dire conservant les propriétés immunogènes et essentiellement dépourvus d'autre activité biologique.
L'invention concerne également l'utilisation des acides nucléiques ou vecteurs tels que décrits ci-avant pour la production in vitro ou ex vivo des polypeptides, protéines et peptides de l'invention, quelles que soient les méthodes de recombinaison génétique employées : animaux transgéniques, bactéries, cellules eucaryotes, végétales, plasmides, virus, extraction de milieux de culture acellulaire etc. Les techniques de production de protéines recombinantes sont bien connues de l'homme du métier, et peuvent être appliquées à la présente invention (promoteurs forts, inductibles, signaux de terminaison, techniques de transfection, etc.).
Description des outils : identification d'un peptide (PP) à des fins d'utilisation comme vaccin, diagnostic et thérapeutique La présente invention sera décrite en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs
Légende des figures :
Figure 1 : Réponse anticorps IgGi de 5 souris immunisées par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH pour l'essai 1 et 2 exprimée en densité optique corrigée en fonction de la dilution.
Figure 2 : Réponse anticorps IgG A de 5 souris immunisées par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH pour l'essai 1 et 2 exprimée en densité optique corrigée en fonction de la dilution.
Figure 3 : Réponse anticorps IgG de lapin immunisé par le peptide PP exprimée en densité optique corrigée en fonction de la dilution.
Figure 4 : Comparaison de la Réponse anticorps IgM et IgG de sérums provenant de malades humains non atteints de leptospirose (confirmée par le
MAT) mais atteints de la maladie de Lyme pour deux d'entre eux (sérum 151358 et
153272) contre le peptide PP et contre la protéine recombinante PPL exprimée en densité optique (DO).
Figure 5 : Réponse anticorps IgM et IgG de 5 sérums provenant de malades humains atteints de leptospirose confirmée ou non par le MAT contre le peptide PP exprimée en densité optique (DO). Figure 6 : Réponse comparée PP et PPL, soit IgM, soit IgG, pour des sérums provenant de 4 chiens SPF dont trois sont vaccinés contre la leptospirose (CN V) exprimée en densité optique (DO).
Figure 7 : Réponse anticorps IgM et IgG de 7 sérums provenant de chiens, suspects cliniques (leptospirose confirmée par le MAT) comparée à celle de 3 chiens sains SPF vaccinés (3039, 3051, 3058) contre le peptide PP exprimée en densité optique (DO) ; les N° 210749 et 210750 proviennent d'un même animal prélevé à 4 jours d'intervalle (CN = chien).
Figure 8 : Réponse anticorps IgG de 4 sérums bovins issus de cheptels suspectés atteints de leptospirose contre le peptide PP exprimée en densité optique.
Figure 9 : Réponse anticorps IgG de 6 sérums équins contre le peptide PP exprimée en densité optique.
Figure 10 : Cinétique de la réponse anticorps contre le peptide PP exprimée en densité optique corrigée des gerbilles immunisées via l'adénovirus.
Figure 11 : Cinétique de la réponse anticorps IgG contre le peptide PP exprimée en densité optique corrigée en fonction de la dilution (A) ou du temps (B) de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH.
Figure 12 : Courbe de survie de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH et soumises à une épreuve virulente (EV) de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola.
Figure 13 : Courbe de survie de gerbilles immunisées par PP-KLH ou PP et soumises à une EN de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola. Figure 14 : Calendrier de l'essai de vaccination par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH chez le chien avec épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 15 : Evolution de l'augmentation du poids des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) avant épreuve virulente
Figure 16 : Evolution de l'augmentation de la température des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 17 : Evolution de la variation des plaquettes des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola Figure 18 : Evolution quantitative de la variation des globules blancs des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 19 : Evolution quantitative de la variation des lymphocytes des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 20 : Evolution quantitative de la variation des monocytes des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola Figure 21 : Evolution de l'augmentation de la créatinine des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 22 : Evolution de l'augmentation de l'urée des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Figure 23 : Evolution du coefficient cumulé pour les cultures et PCR des lots des chiens témoins et vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Légende des tableaux
Tableau 1 : Titre MAT et EIA de 5 sérums provenant de malades humains atteints ou non de leptospirose.
Tableau 2 : Tableau de survie de gerbilles immunisées par la protéine recombinante PPL avec l'adjuvant de Freund après épreuve virulente canicola.
Tableau 3 : Tableau de survie de gerbilles immunisées par la protéine recombinante PPL adjuvée par l'hydroxyde d'alumine et le QS 21 après épreuve virulente canicola. Tableau 4 : Tableau de mortalité de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH après épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si canicola.
Tableau 5 : Tableau de mortalité de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé ou non à la protéine porteuse KLH après épreuve virulente canicola 10"2.
Tableau 6 : Analyse statistique des essais vaccinations par le peptide PP couplé ou non selon le test de Logrank. Tableau 7 : Résultats des cultures effectuées sur les prélèvements de plasma, d'urines et de reins des 6 chiens témoins et des 6 chiens vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola. Tableau 8 : Résultats PCR sur les prélèvements plasma, urines et reins des 6 chiens témoins et des 6 chiens vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar
Légendes des séquences
Seq ID N° 1 : séquence peptidique PP
Exemple 1 : Synthèse du peptide PP
Le peptide PP représenté dans la séquence SEQ ID N°l, est un peptide de 25 acides aminés qui correspond au fragment aal53-aal77 de la protéine PPL de Leptospira interrogans si
Le peptide ID N°l de 25 acides aminés a été synthétisé par Neosystem.
Le peptide brut est purifié par HPLC. L'homogénéité du peptide purifié est vérifiée en HPLC et la structure théorique est confirmée par mesure de la masse de ce peptide en spectrométrie de masse de type ES-MS, par rapport à celle calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés de ce peptide.
Exemple 2 : identification du peptide PP contre des anticorps monoclonaux
Le peptide ID N°l a été utilisé en ELISA. Il a été utilisé comme antigène d'adsorption (protocole diagnostic) avec comme anticorps primaires, différents anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine PPL, en particulier deux anticorps monoclonaux 6E5A2F2 et 4D4H4E5 et des sérums de gerbilles éprouvées par un challenge Leptospira interrogans ss sérovar canicola. Les deux anticorps monoclonaux ont reconnu ce peptide ce qui démontre qu'il possède un ou des épitopes immunogènes de la protéine PPL. Par ailleurs, les sérums polyclonaux de gerbilles ont permis de mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre ce peptide dans une phase précoce après infection par des leptospires pathogènes chez la gerbille. Exemple 3 : Immunogénicité du peptide PP
3-1 Immunogénicité du peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH
Couplage chimique pour obtenir PP-KLH Dans cet exemple, le peptide utilisé correspond au peptide PP (SEQ ID NO : 1) auquel est ajouté un cystéine en position N-terminal. Le réactif hétérobifonctionnel, sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccimide ester (sulfo-MBS, Pierce) utilisé permet une activation des fonctions aminé libres de la protéine porteuse KLH (keyhole-limpet-haemocyanin, Pierce), puis un couplage du peptide via la réaction du groupement sulfhydryl de la cystéine ajoutée à l'extrémité N-terminale du peptide avec la partie maléimide du réactif sulfo-MBS.
Brièvement la protéine porteuse KLH solubilisée dans de l'eau à une concentration de 10 mg/ml est activée à l'aide du réactif sulfo-MBS dilué dans du tampon de couplage (Phosphate sodique 83 mM, pH = 7,2, NaCl 0,9 mM, EDTA 0,1 M) à une concentration finale de 2 mg/ml. Celui-ci est ajouté à raison de 1 mg de réactif pour 10 mg de KLH, puis l'ensemble est placé sous agitation pendant 1 h à l'obscurité à une température de 15 à 25°C. La protéine KLH est dessalée sur colonne NAP5 équilibrée par le tampon de couplage. L'élution de la protéine est réalisée à l'aide de ce tampon. Les fractions contenant la protéine KLH activée sont rassemblées. Pour le couplage, 8.5 mg de peptide (dans le tampon précédent à une concentration de 2 mg/ml) sont ajoutés à 10 mg de KLH (concentration de l'ordre de 5 mg/ml) dans un volume final de 6 ml. L'ensemble est placé sous agitation pendant 2 heures à une température de 15 à 25°C et à l'obscurité. Le conjugué est ensuite dialyse contre un tampon PBS (Phosphate sodique 20 mM pH = 7,4, NaCl 130 mM) : 3 dialyses successives de 2 fois 1 heure puis une nuit à 4°C avant dosage protéique. La préparation est ensuite répartie, à raison de 100 μg par tube eppendorf et congelée à - 80°C.
Réponse anticorps contre le peptide PP chez la souris Un protocole d'immunisation a été mis en œuvre pour évaluer la réponse immunitaire contre le peptide PP couplé à la KLH.
Un lot de 5 souris a été constitué. Deux injections ont été administrées à deux semaines d'intervalle par voie sous cutanée. La lere injection est constituée de 10 μg de peptide PP couplé à la KLH avec l'adjuvant complet de Freund sous un volume de 200 μl (v/v). La 2nde injection est constituée de 10 μg de peptide PP couplé à la KLH avec l'adjuvant incomplet de Freund sous un volume de 200 μl (v/v). Cet essai a été réalisé deux fois.
En parallèle, un lot de 5 souris ne recevant rien est utilisé comme témoin. Une prise de sang a été réalisée deux semaines après la seconde injection pour contrôle sérologique.
Les anticorps anti-PP produits chez les souris sont dosés par une technique ELISA soit sur des prélèvements sérologiques individuels soit sur des pools de plusieurs sérums. L'adsorption de l'antigène PP s'effectue dans les plaques Immulon 4 (Dynatech) à raison de 500 ng de PP par puits dilué dans du tampon carbonate de sodium 10 mM, pH = 9,4.
Après une nuit à 4°C, les plaques sont lavées par du PBS contenant 0,2 % tween 0 puis saturées par une solution de BSA à 1 % dans du TNE (Tris 50 mM,
NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) pendant 60 min à 37°C. Après 3 lavages avec
PBS tween, cent μl de sérum dilués dans du TNE contenant 0.1 % de BSA sont déposés dans chaque cupule et incubés 60 min à 37°C. Après 5 lavages, les antiglobulines IgGl ou IgG A de souris couplées à la peroxydase diluées au 1/5000 dans la tampon TNE-0.1% BSA sont ajoutées à raison de 100 μl par puits et placées
60 min à 37°C. Après 5 lavages, la révélation est réalisée par adjonction de 100 μl par puits d'un tampon [citrate/ ABTS] contenant H O2. Après 10 min à une température de
15-25°C, la réaction est arrêtée par ajout d'une solution H20/DMF (v/v) contenant 5 % de SDS à raison de 100 μl par cupule. La réaction colorée est lue au spectrophotomètre à 405 nm.
Les résultats de la réponse anticorps IgGi anti-PP exprimée en DO corrigée des essais d'immunisation 1 et 2 par le peptide PP couplé à la KLH sont présentés dans figure 1. La DO corrigée correspond à la DO de l'animal immunisé moins la DO du pools des animaux témoins. On constate une grande homogénéité de la réponse anticorps anti-PP chez les souris. Par ailleurs, cette réponse est très élevée puisque les sérums dilués au 1/8000 et au 1/16000 donnent une DO corrigée entre 0,8 et 1,2 (optimum de lecture).
Des résultats similaires ont été obtenus pour l'essai 2.
Les résultats de la réponse anticorps IgG A anti-PP exprimée en DO corrigée des essais d'immunisation 1 et 2 par le peptide PP couplé à la KLH sont présentés dans la figure 2.
On constate une certaine homogénéité de la réponse anticorps IgG2A anti-PP chez les souris exceptée la souris 5 dans l'essai 1. Par ailleurs cette réponse est élevée mais moins importante que la réponse IgGl anti-PP. Des résultats similaires ont été obtenus pour l'essai 2, l'homogénéité de la réponse anticorps étant cependant plus faible.
Au bilan, l'immunisation de souris par le peptide PP couplé à la KLH induit une réponse anti-PP IgGi et IgG2A à la fois élevée et homogène.
Le peptide PP couplé à la protéine KLH est donc très immunogène. 3-2 Immunogénicité du peptide PP non couplé
Pour tester l' immunogénicité du peptide PP seul, une immunisation par le peptide PP sur le modèle lapin a été effectué avec adjonction à chaque injection de l'adjuvant incomplet de Freund. Plus précisément, deux injections de 400 μg de peptide PP avec l'adjuvant incomplet de Freund (v/v) ont été réalisées sous un volume total de 2 ml.
Les deux injections ont été administrées à deux semaines d'intervalle par voie sous cutanée. Le sérum de lapin a été récupéré deux semaines après la seconde injection. Un titrage des anticorps anti-PP a été effectué sur ce sérum.
Les anticorps anti-PP ont été dosés chez le lapin par la technique ELISA décrite ci-dessus avec une antiglobuline anti-lapin biotinylée (BioAtlantic) au 1/3000 et comme révélateur de la streptavidine couplée à la peroxydase (RPN1231, Amersham pharmacia biotech). Les résultats de la réponse anticorps IgG anti-PP exprimée en DO corrigée (DO à J28 donc après la seconde immunisation moins la DO à J0) de l'essai d'immunisation par le peptide PP sont présentés dans la figure 3.
La réponse anticorps contre le peptide PP est très élevée puisque à une dilution de 102400, une réponse contre le peptide PP est toujours détectable. Le peptide PP seul est très immunogène.
Bilan
Le peptide PP qu'il soit couplé ou non à une protéine porteuse est capable d'induire une forte réponse sérologique sur différents modèles animaux. Donc le peptide PP est très immunogène. Exemple 4 : Utilisation diagnostique du peptide PP
Pour tester l'efficacité discriminante du peptide PP comme antigène de diagnostic pour la leptospirose, nous avons étudié des sérums issus d'humains, et d'animaux de différentes espèces vaccinées ou non, atteintes ou non de leptospirose clinique. Les sérums ont été sélectionnés en fonction des commémoratifs cliniques mais aussi en fonction de leur réponse au test de référence (MAT).
Les espèces animales testées sont au nombre de 4 et représentent les animaux de compagnie ou de production les plus touchés par la leptospirose : " le chien " le bovin
" le cheval • le porc Technique ELISA Les anticorps anti-PP ont été dosés par la technique ELISA décrite ci- dessus avec les antiglobulines couplées à la peroxydase choisies en fonction de l'espèce dont est issu le sérum analysé (anti-humain, anti-chien, anti-bovin, anti-cheval ou anti-porc (Jackson).
Les anticorps anti-PPL ont été dosés par la même technique. Résultats
4-1 Humains IgG et IgM (ref fig 4)
L'étude a été réalisée sur quarante sérums humains :
- 10 de ces sérums sont des cas non atteints de leptospirose mais confirmée lyme positif.
- Trente de ces sérums proviennent de l'institut Pasteur. Les tests MAT et EIA ont été réalisés par le CNR des leptospires de l'Institut Pasteur de Paris. Les résultats, titre en MAT et en EIA (IgM) de cinq de ces sérums représentatifs des trente sont présentés dans le tableau 1 dont 4 seulement la leptospirose a été sérologiquement confirmée par l'Institut Pasteur.
Dans tous les cas de figure, le témoin négatif correspond à un pool de sérums d'individus en bonne santé (avant vaccination) et contrôlés individuellement en MAT.
*limite 400 **limite 100
Tableau 1: Titre MAT et EIA de 5 sérums provenant de malades humains suspectés de leptospirose clinique Analyse de la spécificité des réponses anticorps IgM et IgG contre le peptide PP et contre la protéine recombinante PPL sur des sérums humains non atteints de leptospirose
Afin d'estimer les potentielles réponses croisées entre spirochètes, dans un premier temps, des sérologies ont été effectuées sur onze sérums humains dont dix proviennent de cas atteints de la maladie de Lyme ; les réponses anticorps IgM et IgG ont été analysées contre le peptide PP mais aussi contre la protéine recombinante PPL.
Les résultats de la réponse IgG et IgM dirigée contre le peptide PP et contre la protéine recombinante PPL de 3 sérums représentatifs sont représentés dans la figure 4 en comparaison du témoin négatif (pool de sérums négatifs en MAT d'individus sains).
Réponse contre la protéine recombinante PPL
Compte tenu du témoin et du sérum2, le sérum 153 272 du cas confirmé lyme positif présente une réponse sérologique IgM significative contre la protéine recombinante PPL.
Par ailleurs, une réponse sérologique IgG importante contre la protéine recombinante est détectée pour le témoin mais aussi pour les sérums négatifs pour la leptospirose ne permettant pas un usage sérologique discriminant de PPL. Réponse contre le peptide PP Ces résultats montrent que pour des cas confirmés de maladie de Lyme et indemnes de leptospirose (sérums 151358 et 153272), la réponse IgM et IgG contre le peptide PP est du même ordre que celle du témoin (pool de sérums).
Analyse des réponses anticorps IgM et IgG contre le peptide PP sur des sérums d'humains atteint ou non de leptospirose Dans un second temps, afin d'apprécier la sensibilité, la réponse IgG et
IGM dirigée contre le peptide PP a été analysée sur trente sérums humains atteints de leptospirose (provenant de l'institut Pasteur).
Les résultats de la réponse IgG et IgM dirigée contre le peptide PP de 5 sérums représentatifs (voir tableau 1) sont représentés dans la figure 5 en comparaison du même témoin négatif.
Chiens IgG et IgM Chiens SPF vaccinés : Analyse de la spécificité des réponses anticorps IgM et IgG contre le peptide PP et contre la protéine recombinante PPL sur des sérums de chiens SPF vaccinés ou non contre la leptospirose Dans un premier temps, des sérologies ont été effectuées sur des sérums de chiens SPF vaccinés contre la leptospirose ou non. Le test MAT a été réalisé parallèlement dans le laboratoire. Les résultats de la réponse IgG et IgM dirigée contre le peptide PP et contre la protéine recombinante PPL de ces sérums sont représentés dans la figure 6 en comparaison du témoin négatif (pool de sérums provenant de chiens SPF non vaccinés).
Réponse contre la protéine recombinante PPL Compte tenu du témoin (chiens SPF non vaccinés), la réponse sérologique IgM anti-PPL des chiens vaccinés est significativement plus intense.
Par ailleurs, la réponse sérologique IgG élevée contre la protéine recombinante du témoin négatif ne permet pas d'estimer la réponse vaccinale spécifique.
Réponse contre le peptide PP Les résultats de l'étude de la réponse anticorps IgG et IgM dirigée contre le peptide PP des chiens vaccinés sont présentés dans la figure 6. Les sérums de trois chiens SPF vaccinés par différents vaccins contre la leptospirose (N° de sérum : 3039, 3051, 3058) développent une réponse IgM du même ordre que celle du témoin négatif (pool de sérums). La réponse IgG anti-PP quant à elle est plus forte que celle du témoin mais reste faible puisque inférieure à une DO de 0,25.
Chiens tout venants suspectés de leptospirose clinique par comparaison aux chiens SPF : analyse des réponses anticorps IgM et IgG contre le peptide PP sur des sérums de chiens tout venants atteints ou non de leptospirose (qu'ils soient vaccinés ou non) L'étude a été réalisée sur plus de quarante sérums canins. Les réponses anticorps IgM et IgG dirigées contre l'antigène PP sont présentées pour 10 chiens représentatifs des différents cas que l'on peut observer.
Le test MAT a été réalisé parallèlement dans le laboratoire. Les résultats de ces réponses anticorps anti-PP sur ces 10 sérums canins sont présentés dans la figure 7 en comparaison d'un témoin négatif.
Les chiens suspects de leptospirose clinique non vaccinés
Les résultats de l'étude de la réponse anticorps IgG et IgM dirigée contre le peptide PP des chiens non vaccinés sont présentés dans la figure 7A. Le témoin négatif correspond au sérum de chiens SPF et ne présente pas de réponse anticorps IgM et IgG significatives. Les sérums 210749 et 210750 ont été prélevés sur le même chien à 4 jours de différence. Le titre MAT du premier prélèvement est négatif alors que la réponse anticorps IgM anti-PP est très élevée (DO>0,6) et la réponse IgG anti-PP débute puisqu'on atteint une DO de 0,3 en fin d'évolution clinique. On constate une séroconversion par le MAT (titre = 160) et parallèlement, la réponse IgM anti-PP a diminué pour laisser place à une réponse IgG anti-PP très élevée (DO>0,9).
Le peptide PP peut donc s'avérer très utile pour les diagnostics de leptospirose et plus particulièrement en phase précoce car une réponse anticorps IgM anti- PP peut être détectée alors que le titre MAT est encore négatif. Le sérum 210845 correspond à un chien atteint de leptospirose confirmée. On peut observer une réponse anticorps IgM et IgG anti-PP élevées et de même intensité.
Les chiens vaccinés Les résultats de l'étude de la réponse anticorps IgG et IgM dirigée contre le peptide PP des chiens vaccinés sont présentés dans la figure 7B avec la référence des témoins SPF vaccinés (N° de sérum : 3039, 3051, 3058)
Le sérum 211466 correspond à un chien présentant des signes cliniques de leptospirose, cependant le titre MAT de ce sérum est non significatif. La réponse anticorps IgM anti-PP est très élevée (DO>0,7) alors que la réponse IgG anti-PP est non significative. Le chien est donc bien probablement atteint de leptospirose en phase très précoce. La réponse importante en IgM anti-PP est en faveur d'un début de réponse sérologique (attesté par le titre modéré en MAT).
Les sérums 21463 et 21457 correspondent à des chiens présentant des signes cliniques de leptospirose confirmée en MAT de durée d'évolution plus longue que le cas précédent. Ils présentent une forte réponse en IgM et IgG dirigée contre le peptide PP.
Bilan :
Le peptide PP se révèle un antigène discriminant de l'infection leptospirosique que les chiens soient vaccinés ou non. L'utilisation de l'antigène PP permet de détecter des cas de leptospiroses en phase précoce, l'état vaccinal antérieur n'empêchant pas l'interprétation diagnostique contrairement au MAT pour lequel l'interprétation de titres faibles est sujette à caution.
Bovins IgG L'étude a été réalisée sur trente sérums bovins.
Les résultats des réponses anticorps anti-PP sur 4 sérums bovins représentatifs des trente analysés sont présentés dans la figure 8 en comparaison d'un témoin négatif.
Si tous les animaux des cheptels bovins (et autres ruminants et porcs) sont exposés à l'infection leptospirosique, peu d'animaux expriment cliniquement la maladie. Néanmoins, la cohorte est soumise au risque infectieux et tous les animaux développent une réponse immunitaire, parfois difficile à détecter en MAT, d'où la nécessité de diagnostic de groupe.
Les résultats présentés proviennent donc d'animaux n'ayant pas nécessairement avorté eux-mêmes mais provenant de cheptels dans lesquels des avortements liés à la leptospirose ont été suspectés car non reliés à des étiologies classiques et par ailleurs fortement suspectés de leptospirose sur les résultats globaux du groupe en
MAT. La réponse IgG vis à vis de PP a été étudiée sur 30 sérums de bovins provenant de 7 cheptels différents, par comparaison d'un sérum témoin provenant d'un pool de sérums de cheptels composés d'animaux tous négatifs en MAT. Les résultats de quatre sérums représentatifs sont présentés dans la figure 8. Les sérums 1398, 1399 et 1401 sont des sérums positifs en MAT. Le sérum 4126 provient d'un cheptel comportant des animaux positifs en MAT, mais est lui-même négatif à ce test alors que la réponse est très forte vis à vis de PP.
Bilan : ces résultats confirment l'intérêt du peptide en tant qu'antigène capable de mettre en évidence une réponse immunitaire à une infection par les leptospires. Cheval IgG
Les résultats des réponses anticorps anti-PP sur 6 sérums équins sont présentés dans la figure 9 en comparaison d'un témoin négatif.
Pour cette espèce, le choix s'est porté sur une catégorie particulière d'animaux : les animaux atteints d'uvéite. Certaines uvéites du cheval sont liées soit à une phase primaire d'mvasion par les leptospires (auquel cas l'animal est généralement positif en MAT) soit une phase clinique tardive ou récidivante provoquée par un phénomène dit d' autoimmunisation. Ce phénomène s'expliquerait par la sensibilisation à une protéine de leptospire proche d'une protéine de leptospire. Cette protéine aurait une MM de 55-60 kDa et est donc différente de celle de PPL, protéine porteuse de la séquence PP décrite ici. La figure 9 présente des résultats caractéristiques de 6 animaux atteints d'uvéite :
Les sérums 421 et 1992 correspondent à une cinétique sérologique du même animal. Lors du premier prélèvement l'animal était négatif en MAT et est devenu positif lors du deuxième prélèvement, attestant que cette uvéite pouvait être interprétée comme un signe d'infection évolutive en cours par les leptospires.
Les animaux 2077 et 6771 sont légèrement positifs en MAT mais aussi vis à vis de PP, confortent l'origine leptospirosique de l'uvéite observée.
En revanche Les animaux 3848 et 4507 développent une uvéite (probablement une récidive) dont l'origine leptospirosique ne peut être confirmée par le MAT. En revanche ces animaux ont développé une forte réponse vis à vis de PP confortant l'origine leptospirosique de l'uvéite.
Bilan : ces résultats confirment l'intérêt du peptide en tant qu'antigène capable de mettre en évidence une réponse immunitaire à une infection par les leptospires.
Bilan global de l'utilisation diagnostique de PP : Quelle que soit l'espèce considérée, le peptide PP se révèle être un antigène capable de mettre en évidence une réponse immunitaire à une infection par les leptospires, et en particulier en phase précoce car une réponse anticorps IgM anti-PP peut être détectée alors que le titre MAT est encore négatif ou est sujet à caution dans le cas d'animaux vaccinés. Exemple 5 : Réponse anticorps contre le peptide PP des gerbilles immunisées par PPL via l' adénovirus
Un protocole de vaccination/épreuve a permis de mettre en évidence la protection induite par une suspension du virus recombinant Ad-ppl qui exprime la protéine recombinante PPL (Demande Internationale WO01/59123, Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen-Clouet N, Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M. « Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination ». Infect Immun. 2001 Nov; 69(11):6831-8.). Les anticorps anti-PP ont été dosés chez la gerbille par la technique
ELISA décrite ci-dessus avec une antiglobuline anti-gerbille biotinylée (BioAtlantic) au 1/3000 et comme révélateur de la streptavidine couplée à la peroxydase (RPN1231, Amersham pharmacia biotech).
Pour chaque lot de gerbilles, les sérums ont été regroupés aux différentes dates de prélèvements J0 (avant la première immunisation), J21 (avant la seconde immunisation), J35 (avant l'épreuve virulente) et J70 (35 jours après l'épreuve virulente).
Les résultats de la réponse anticorps IgG contre le peptide PP exprimée en DO corrigée à sont présentés dans la figure 10. L'immunisation par la protéine PPL via l' adénovirus induit une réponse anticorps contre le peptide PP significative.
La réponse anticorps anti-PP, suite à la première injection apparaît rapidement pour le groupe immunisé par l' adénovirus exprimant la protéine recombinante PPL. La réponse anticorps reste stable entre le 21ιeme jour et le 35ιeme jour : la seconde immunisation n'a pas induit d'effet rappel, le maximum de la réponse vaccinale semble atteint dès le 21leme jour.
L'épreuve canicola effectuée le 35,eme jour permet l'apparition d'une réponse contre le peptide PP dans le groupe témoin et provoque une réponse anamnestique dans le groupe immunisé par la protéine PPL via l'adénovirus. On observe donc une réponse anticorps dirigée contre le peptide PP suite à l'immunisation par PPL via l'adénovirus et cette réponse anticorps peut avoir un rôle dans la protection observée sur ce groupe vacciné soumis à une EN canicola.
Bilan
La vaccination a induit une réponse anti-PP maximale pour la stimulation induite par la dose d' adénovirus exprimant PPL employée. La relance anamnestique provoquée par l'épreuve virulente suit une pente plus faible que la réponse développée par les témoins. La protéine PPL porteuse des épitopes PP étant sécrétée par les leptospires pathogènes, la stimulation antigénique induite par l'épreuve virulente est plus faible chez les animaux protégés par la vaccination que chez les témoins, chez lesquels la souche virulente ne rencontre pas d'obstacle à sa multiplication.
Exemple 6 : Essai de vaccination par la protéine recombinante PPL (comparatif) :
L'immunisation avec la protéine recombinante PPL a été effectuée sur le modèle gerbille afin de tester la protection susceptible d'être apportée par cette protéine. Les adjuvants permettent d'augmenter l' immunogénicité des antigènes en créant généralement une réaction inflammatoire qui ralentit l'élimination de l'antigène et favorise sa capture et sa présentation aux lymphocytes. La nature de l'adjuvant va orienter la production de cytokines favorisant le développement d'une réponse à médiation cellulaire ou humorale.
Trois adjuvants ont été testés : d'une part l'adjuvant de Freund dans l'expérience 1 et d'autre part le QS 21 (saponine) avec l'hydroxyde d'aluminium dans l'expérience 2.
Essai 1 : Adjuvant de Freund
L'immunisation par la protéine recombinante PPL a été effectuée sur le modèle gerbille et suivie d'une épreuve virulente canicola à 100 UT diluée à 10"1 (lot 1 et 2) et à 10"2 (lot 3 et 4) Les résultats de cette expérience (taux de survie) sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 2 : Tableau de survie de gerbilles immunisées par la protéine recombinante PPL avec l'adjuvant de Freund après épreuve virulente canicola Caractères en GRAS : début de la mortalité des gerbilles pour chaque lot
* effectif considéré à partir de l'épreuve virulente J0
Le taux de mortalité du lot immunisé par la protéine recombinante PPL en présence d'adjuvant de Freund quelle que soit l'épreuve virulente considérée avec celui des lots témoins correspondant, sont similaires.
La mortalité des lots soumis à la même épreuve virulente débute en même temps : le nιeme et le I2ιeme jour pour respectivement les épreuves virulentes à 100 UT diluée à 10"1 et 10"2.
Cet essai n'a pas permis de mettre en évidence une protection significative induite par l'immunisation par la protéine recombinante PPL après une épreuve virulente canicola.
Essai 2 : Adjuvant hydroxyde d'alumine et QS 21
L'essai d'immunisation par la protéine recombinante PPL a été reconduite dans les mêmes conditions cependant la protéine a été adjuvée avec le QS 21 et l'hydroxyde d'alumine.
L'Immunisation de gerbilles par la protéine recombinante PPL adjuvée par le QS 21 et l'hydroxyde d'alumine a été suivie d'une épreuve virulente canicola. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3 : Tableau de survie de gerbilles immunisées par la protéine recombinante PPL adjuvée par l'hydroxyde d'alumine et le QS 21 après épreuve virulente canicola Caractères en GRAS : début de la mortalité des gerbilles pour chaque lot * effectif considéré à partir de l'épreuve virulente JO Le taux de survie pour le lot immunisé par la protéine recombinante PPL adjuvée et le lot témoin sont similaires. La mortalité des gerbilles des deux lots débute le même jour : le 8ιeme jour. II ne nous a pas été possible de mettre en évidence une protection significative apportée par la protéine recombinante PPL que ce soit en présence d'adjuvant de Freund ou l'hydroxyde d'alumine couplée à le QS 21.
Donc, quel que soit l'adjuvant utilisé, aucune protection significative suite à l'immunisation par la protéine recombinante PPL n'a pu être mise en évidence. Or, un protocole de vaccination/épreuve a permis de mettre en évidence la protection induite par une suspension du virus recombinant Ad-ppl qui exprime la protéine recombinante PPL (Brevet WO01/59123, Branger et al, 2001). Il paraît donc essentiel de déterminer le ou les épitopes de la protéine PPL responsables de l'effet protecteur observé.
Dans cet objectif, l'effet protecteur du peptide PP a été comparé avec celui obtenu avec PPL.
Exemple 7 : Essai de vaccination par le peptide PP couplé ou non à la protéine porteuse KLH
Le but de l'immunisation par le peptide PP sur le modèle gerbille est à la fois d'évaluer l'antigénicité de la séquence choisie par la réponse anticorps et l'éventuelle protection apportée par ce peptide.
Essai 1 : Protocole de vaccination des gerbilles par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH
Un protocole de vaccination /épreuve a été mis en œuvre pour évaluer la protection que peut apporter le peptide PP (seq ID N°l) couplé à la protéine KLH. Cette construction est administrée par voie sous cutanée sans adjuvant avec comme contrôle négatif du PBS (lot 2).
Loti : 10 gerbilles, 2 injections de 30 μg de PP-KLH sous 300 μl en sous cutanée
Lot 2 : 10 gerbilles, 2 injections de PBS sous 300 μl Les deux injections sous un volume de 300 μl ont été administrées à deux semaines d'intervalle par voie sous cutanée. Une épreuve virulente par injection par voie intra-péritonéale de 0,5 ml d'une culture canicola titrant 90 à 100 UT (turbidimétrie) diluée à 10"2'5 a été réalisée deux semaines après la seconde injection.
Réponse antigénique : Suivi par ELISA de la réponse immunitaire des gerbilles contre le peptide PP
Les anticorps anti-PP ont été dosés chez la gerbille par une technique ELISA (décrite ci-dessus) avec une antiglobuline anti-gerbille biotinylée (BioAtlantic) au 1/3000 et comme révélateur de la streptavidine couplée à la peroxydase (RPN1231, Amersham pharmacia biotech).
Pour chaque lot de gerbilles, les sérums ont été regroupés aux différentes dates de prélèvements jO (avant la première immunisation), J14 (avant la seconde immunisation), J28 (avant l'épreuve virulente).
Les résultats de la réponse anticorps IgG contre le peptide PP exprimée en DO corrigée (DO des sérums traités corrigée par la DO du sérum témoin) sont présentés dans la figure 11.
L'immunisation par le peptide PP couplé à la KLH induit une réponse anticorps significative contre le peptide PP. La réponse anticorps anti-PP, suite à la première injection est très élevée puisque les sérums dilués au 1/6400 et au 1/12800 (figure 11, A) donnent une DO corrigée entre 0,8 et 1,2 (optimum de lecture). Un net effet rappel est provoqué par la seconde injection puisque la DO corrigée obtenue à j28 est supérieure au double de celle obtenue à j 14 pour les trois dilutions observées (figure 11 , B).
Conclusion :
L'antigénicité du peptide choisi est importante.
Protection contre EV
Les résultats de cet essai en terme de taux de mortalité et courbe de survie sont présentés respe
Tableau 4 : Tableau de mortalité de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH après épreuve virulente canicolalO""'5. La mortalité du lot 2 correspondant au groupe témoin ayant reçu du PBS (0/10) est très forte puisque à j8 aucune gerbille n'est survivante à une épreuve virulente E. interrogans sérovar canicola. Cette épreuve virulente est sévère car d'une part la DL100 a été atteinte en 8 jours et d'autre part la mortalité a débuté précocement, dès le 5ιeme jour, et a été très rapide puisque tous les témoins sont morts en 3 jours. En revanche, on constate que 4 des 10 animaux du lot de gerbilles vaccinées par le peptide PP couplé à la protéine KLH survivent de façon définitive (surveillance de quatre semaines après épreuve virulente).
Cette expérience ne permet pas de démontrer au risque usuel de 0,05 une protection significative induite par le peptide PP contre un challenge Canicola 10 ~2,5. Cependant, cette protection existe pour un risque p<0,07 (test de Logrank).
Essai 2 : Protocole de vaccination des gerbilles par le peptide PP couplé ou non à la protéine porteuse KLH
L'expérience de vaccination par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH a été reconduite dans les conditions similaires pour valider les résultats obtenus dans l'essai 1. Cependant, il nous a semblé intéressant de reproduire également cet essai avec le peptide non couplé compte tenu de la forte antigénicité du peptide PP mise en évidence dans l'essai 1.
Un essai de vaccination /épreuve a été mis en œuvre pour évaluer la protection que peut apporter le peptide PP (seq ID N°l) couplé ou non à la protéine KLH.
Cette construction est administrée par voie sous cutanée sans adjuvant, le PBS comme contrôle négatif est administré par la même voie (lot 3).
Lot 1 : 12 gerbilles, 2 injections de 30 μg de PP-KLH sous 300 μl
Lot 2 : 12 gerbilles, 2 injections de 30 μg de PP sous 300 μl Lot 3 : 15 gerbilles, 2 injections de PBS sous 300 μl
Les deux injections sous un volume de 300 μl ont été administrées à deux semaines d'intervalle par voie sous cutanée. Une épreuve virulente par injection par voie intra-péritonéale de 0,5 ml d'une culture de leptospires sérovar canicola titrant 90 à 100 UT (turbidimétrie) diluée à 10" a été réalisée trois semaines après la seconde injection. Les résultats de cet essai en terme de taux de mortalité et courbe de survie sont présentés respectivement dans le tableau 5 et la figure 13 :
Tableau 5 : Tableau de mortalité de gerbilles immunisées par le peptide PP couplé ou non à la protéine porteuse KLH après épreuve virulente canicolalO"2.
La mortalité du lot 3, groupe témoin ayant reçu du PBS, est la plus forte de tous les lots et correspond à la dose létale 50 (7/15). La mortalité chez les témoins a débuté précocement dès J6 alors qu'elle ne commence qu'à J8 pour le lot immunisé par PP et J9 pour le lot immunisé par PP-KLH.
La mortalité dans le groupe immunisé par PP-KLH suite à une épreuve virulente L. interrogans sérovar canicola est la plus faible (1/12) et la plus tardive (J9), alors que celle du lot immunisé par PP est de 4/12 et débute à J8.
Bien que la protection observée par le peptide couplé à la protéine porteuse KLH soit plus efficace, cette expérience permet de mettre en évidence un effet protecteur induit par le peptide PP, couplé ou non à la protéine porteuse KLH, contre une épreuve virulente de leptospires sérovar canicola 10"2 à une probabilité p<0,02 (test de Logrank) Le taux de survie observé pour le lot immunisé par PP-KLH par voie sous cutanée confirme les résultats observés lors de la première expérimentation (Essai 1). Par ailleurs, le bilan de l'essai 1 suite à l'immunisation par le peptide PP confirme la forte immunogénicité de ce peptide et met en évidence son effet protecteur.
Analyse statistique des résultats des deux expériences
Tableau 6 : analyse statistique des essais vaccinations par le peptide PP couplé ou non selon le test de Logrank
Le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH apporte une protection significative contre un challenge canicola pour les deux expériences. Cette protection est significative sur la survie des animaux estimée par le test de logrank quelle que soit l'expérience ; la combinaison des deux expériences augmente la significativité de l'expérience que ce soit avec le test du χ ou le test de Logrank.
Bilan
La vaccination avec le peptide PP couplé ou non à la protéine KLH a permis de montrer l'effet protecteur du peptide PP, à deux reprises, à la suite d'une épreuve virulente (canicola).
Exemple 8 : Essai de vaccination par le peptide PP couplé en NH2 à la protéine porteuse KLH chez le chien.
Le but de l'immunisation de chiens par le peptide PP est d'évaluer l'effet protecteur apporté par ce peptide. La protection sera étudiée sous deux volets : protection clinique mais aussi protection contre le portage rénal.
• Protocole de vaccination des chiens par le peptide PP couplé à la protéine porteuse KLH
Un protocole de vaccination /épreuve a été mis en œuvre pour évaluer la protection que peut apporter le peptide PP (seq ID N°l) couplé en NH à la protéine porteuse KLH (Figure 14).
Cette construction est administrée par voie sous cutanée sans adjuvant avec comme contrôle négatif du PBS (lot 2).
Loti : 6 chiens SPF, 2 injections de 250 μg de PP-KLH sous 1 ml en sous cutanée.
Lot 2 : 6 chiens SPF, contrôle Les deux injections ont été administrées à 18 jours d'intervalle par voie sous cutanée.
L'Epreuve virulente (EV) a été réalisée à J0. Les animaux reçoivent une épreuve virulente à raison d'une culture virulente de 4 à 6 jours. Pour un lot vacciné et un lot témoin, chaque animal reçoit 0,3mL dans chaque œil de la culture titrant 120 UT (soit 2xl08.leptospires par mL) et par voie intra-peritonéale 4 mL de la même culture diluée au dixième. • BILAN :
• Phase d'immunisation La phase d'immunisation s'est déroulée de J-39 à J.i (J0 le jour de l'épreuve virulente), avec la première injection à J-35 et la seconde à J-18. La tolérance a été parfaite.
Lors de cette phase, le poids a été mesuré à L3g, J-35, J- 8, et J-7 (Figure 15). L'évolution de l'augmentation moyenne des poids entre J-35 et J- n'est pas significativement différente entre les chiens témoins et vaccinés (p=0.8509), mais il y a une évolution significative du poids au cours du temps (pθ.0001).
• Phase d'épreuve :
La phase d'épreuve s'est déroulée de J-i à J41, avec l'épreuve à J0. Lors de cette phase, la température a été mesurée à Jo, Ji, h, h, h, , , -
Les paramètres hématologiques ont été mesurés à J-1; J3, J , JÎO, J1 , Jis et
Les paramètres biochimiques ont été mesurés à J.ls J3, J7, J10, J14, J18, J25 et J41.
- Survie
Aucune mortalité n'a été constatée suite à l'épreuve virulente
- Evolution de la température
L'évolution de la variation moyenne de la température entre J0 et J est représentée dans la figure 16. L'évolution de l'augmentation moyenne de la température entre J0 et J n'est pas significativement différente entre les chiens témoins et vaccinés (p=0.7944), Cependant ponctuellement, il existe une différence significative entre les chiens témoins et vaccinés à J3 et J4 (p<0,05). Les chiens témoins développent un pic fébrile plus accusé. - Evolution des paramètres hématologiques :
- plaquettes Les moyennes des plaquettes étant significativement différentes à J.l5 la valeur à \ est incluse dans le modèle d'analyse. L'évolution de la variation moyenne des plaquettes entre \ et J 1 est représentée dans la figure 17. L'évolution de la variation moyenne des plaquettes entre J-i et J41 est significativement différente entre les chiens témoins et vaccinés (p=0.0412). L'évolution est significative au cours du temps (p=0.0003). La trombocytopénie est significativement plus accusée chez les témoins que chez les vaccinés.
- Evolution des globules blancs
L'évolution globale des globules blancs entre ].\ et J41 est représentée dans la figure 18. L'évolution des globules blancs entre J-i et J41 n'est pas significativement différente entre les chiens témoins et vaccinés (p=0.4407).
Cependant la leucopénie transitoire précédant la leucocytose (phénomène classique en matière de leptospirose) est significativement plus importante chez les témoins que chez les vaccinés à J (p<0.05). L'évolution de la formule leucocytaire a aussi été analysée.
Cette évolution a été étudiée en numération par classe de leucocyte, numération estimée par la formule sanguine et rapportée à la numération.
- Lymphocytes
L'évolution des lymphocytes entre J^ et J41 est représentée dans la figure 19. Une lymphopénie significative est constatée à J4 chez les témoins, parfaitement inaperçue chez les vaccinés chez lesquels seule la lymphoprolifération post-infectieuse est observée.
- Monocytes
L'évolution des monocytes entre J-i et J41 est représentée dans la figure 20. La déplétion monocytaire est observée précocement à J4 chez les seuls témoins (p<0,05)
- Paramètres Biochimiques
L'hétérogénéité de la réaction des individus du lot témoin ne permet pas d'objectiver une protection contre l'atteinte rénale aiguë pour les deux paramètres biochimiques: taux de créatinine et d'urée dans le sang représentée respectivement dans les figures 21 et 22.
Si aucune différence significative ne peut être mise en évidence sur la totalité de la période de suivi, on constate deux périodes différentes :
Période d'atteinte rénale aiguë (Jo-Jio) : pas de différence significative entre témoins et vaccinés malgré une tendance (p<0,15) à une expression plus intense chez les témoins (urée plus élevée)
Période de colonisation rénale (J10 -J41) : au cours de cette période, le taux d'urée des témoins reste plus élevé et ce de façon significative (p<0,02). - Résultats bactériologiques
La présence de leptospires a été étudiée conjointement par PCR (PCR spécifique des leptospires pathogènes) et par culture dans les urines à J0, J10s J1 , Jι8, J25, J41 et dans les prélèvements de reins de chaque animal au terme de l'essai à J41. Les résultats PCR sont figurés dans le tableau 8.
Par ailleurs, les résultats bactériologiques ont été quantifiés grâce à la mise en place d'un coefficient : par culture immédiate. Un seul leptospire vivant peut donner une culture positive. Une relative estimation de la concentration bactérienne est exprimée par un coefficient de 3 quand une culture s'est développée dans la troisième dilution sériée faite à partir du prélèvement. par PCR sur des prélèvements congelés. Une PCR positive ne préjuge pas de la viabilité des bactéries mises en évidence et par ailleurs une PCR n'est positive que pour 10 leptospires présents. Un coefficient de 1 a été attribué à une PCR avec un faible signal et un coefficient de 2 à une PCR fortement positive.
Le coefficient global correspond à la somme de la cotation de chaque chien rapportée à la cotation maximale qu'aurait obtenu l'ensemble des chiens. Ces résultats sont exprimés dans la figure 23.
En ce qui concerne la septicémie, on constate une concordance parfaite entre les deux tests à J3 (Figure 23 et tableaux 7 et 8). Tous les animaux ont donc encore à cette date la souche d'épreuve circulante.
En ce qui concerne la colonisation rénale, Pour les deux lots, il convient de séparer les résultats finaux obtenus à partir des reins (3 juillet) de ceux obtenus à partir des urines. Lors de l'euthanasie les deux groupes sont porteurs rénaux, portage détecté tant par culture que par PCR.
Cependant en ce qui concerne l'excrétion urinaire proprement dite, on constate une différence importante de l'évolution au cours de la période d'épreuve, des coefficients, obtenus tant pour les cultures que pour les PCR. L'excrétion des leptospires dans les urines témoignant d'une colonisation rénale se révèle plus tardive ou à niveau plus faible chez les vaccinés (tableaux 7 et 8, figure 23). Il faut noter que la mise en culture des reins est une méthode de détection très sensible et ne permet pas la semi quantification qui a été faite pour culture et PCR. CONCLUSION GLOBALE Au cours de cet essai, nous avons démontré que l'immunisation par PP
(seq ID N°l) couplée à une protéine porteuse permet d'induire une protection contre une épreuve virulente canicola chez le chien.
Plus particulièrement, nous avons observé : une limitation des perturbations générales (comportement et syndrome fébrile) de façon significative des chiens vaccinés par rapport aux chiens témoins une limitation des altérations hématologiques, plaquettes et leucocytes en particulier, et ce de façon significative chez les chiens vaccinés par rapport aux chiens témoins une limitation des atteintes rénales avec cette souche canicola dont le tropisme rénal est accusé, objectivé par :
Sur le plan fonctionnel : les taux d'urée et de créatinine sont plus faibles chez les vaccinés lors de la phase de septicémie que ceux observés chez les témoins.
La colonisation rénale plus tardivement détectée chez les chiens vaccinés que chez les chiens témoins correspond à une colonisation à plus faible bruit ou plus tardive. Or, le fait de constater simultanément sur les chiens témoins une augmentation significative de l'urée est en faveur d'une colonisation à plus faible niveau chez les vaccinés.
Tableau 7 : Résultats des cultures effectuées sur les prélèvements de plasma, d'urines et de reins des 6 chiens témoins et des 6 chiens vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola
Tableau 8 : Résultats PCR sur les prélèvements plasma, urines et reins des 6 chiens témoins et des 6 chiens vaccinés (immunisés par le peptide PP couplé à la protéine carrier KLH) soumis à une épreuve virulente de leptospires de Leptospira interrogans si sérovar canicola

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - le peptide représenté par la séquence SEQ ID N°l ci-dessous :
SEQ ID NO : 1 Lys-Ala-Lys-Pro-Val-Gln-Lys-Leu-Asp-Asp-Asp- Asp-Asp-Gly-Asp-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Glu-Arg-His-Asn-Lys
ainsi que : - les homologues de ce peptide présentant au moins 60%> de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant de 15 à 40 amino acides, - les dérivés de ce peptide sélectionnés parmi :
- les sels pharmaceutiquement acceptables de ce peptide,
- les fragments fonctionnels de ce peptide, - les analogues chimiques de ce peptide choisis parmi ceux dans lesquels : un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique ont été remplacés par leur énantiomère D ; une ou plusieurs liaisons amides peptidiques (-CO- NH-) ont été remplacées par une liaison isostère telle que : -CH2NH-, CH2S-, - CH2CH2-, -CH≈CH- (cis et trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- et -CH2SO- ; un ou plusieurs acides aminés ont été remplacés par un acide aminé non naturel,
- les dérivés chimiques de ce peptide ' choisis parmi : les composés des-alpha amino peptides ; les dérivés N-alpha acyl substitués de la forme RCO-, dans laquelle R représente un groupement alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou aralkyle, linéaire, ramifié, ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone ; les dérivés substitués sur la fonction acide C-terminale par un groupement choisi parmi - NH2, les alkyloxy, alkylthio ou alkylamino de la forme -OR, -SR or -NHR, dans lesquels R représente une chaîne alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou un groupement aralkyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone, les dérivés porteurs d'un substituant pharmacophore, les polymères de ce peptide.
2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente au moins 70% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 1, encore plus préférentiellement 80%, de manière préférée au moins 90%), et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : l.
3. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte de 20 à 30 acides aminés.
4. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un fragment fonctionnel du peptide SEQ ID NO : 1 capable d'induire une réponse immunitaire
5. Peptide comportant au plus 100 acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence selon la revendication 1 choisie parmi : SEQ ID NO : 1, un fragment fonctionnel de SEQ ID NO : 1, un homologue de SEQ ID NO : 1, un analogue chimique de SEQ ID NO : 1 ou un dérivé chimique de SEQ ID NO : 1.
6. Protéine comprenant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 couplé à une protéine porteuse.
7. Anticorps caractérisé en ce qu'il reconnaît un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou une protéine selon la revendication 6.
8. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre le peptide de séquence SEQ ID NO : 1.
9. Anticorps selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est un anticorps polyclonal.
10. Anticorps selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est un anticorps monoclonal.
11. Fragment ou dérivé d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments Fab,
F(ab')2, ScFv.
12. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il code un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou une protéine selon la revendication 6.
13. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comporte un acide nucléique selon la revendication 12.
14. Cellule recombinante comprenant un acide nucléique ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 et 13.
15. Organisme transgénique non humain comprenant un acide nucléique selon la revendication 12 dans ses cellules.
16. Sonde ou amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique selon la revendication 12.
17. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce selon la revendication 16 pour la détection in vitro de la présence de souches pathogènes de leptospires dans un échantillon biologique ou une eau contaminée.
18. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 pour la détection in vitro de la présence de souches pathogènes de leptospires dans un échantillon biologique ou une eau contaminée.
19. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'une protéine selon la revendication 6 pour la détection in vitro de la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon biologique.
20. Kit pour la détection in vitro de la présence de souches pathogènes de leptospires dans un échantillon biologique ou une eau contaminée caractérisée en ce qu'il comporte une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces selon la revendication 16.
21. Composition pharmaceutique comprenant un peptide ou une protéine ou un anticorps ou un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et un support pharmaceutiquement acceptable.
22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un vaccin.
23. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation d'anticorps anti-PP à usage thérapeutique
24. Utilisation d'un acide nucléique ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 et 13 pour la production in vitro d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'une protéine selon la revendication 6.
25. Utilisation d'un acide nucléique ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 et 13 pour la production ex vivo d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'une protéine selon la revendication 6.
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