WO2011055916A2 - 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법 - Google Patents

장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a methylation detection method of a bowel cancer specific methylation marker gene for the diagnosis of bowel cancer, and more specifically, to provide information for diagnosing bowel cancer by detecting methylation of a bowel cancer specific marker gene specifically methylated in bowel cancer cells. It is about how to.
  • the diagnosis of cancer in the current clinical practice is history taking, physical examination, clinical pathology, and once suspected, radiographic examination and endoscopy are performed. Finally, biopsy is confirmed.
  • the current clinical test method can be diagnosed only when the number of cancer cells 1 billion cells, the diameter of the cancer is more than 1cm. In this case, cancer cells are already metastatic, and in fact, more than half of the cancer has already metastasized.
  • tumor markers that look for substances produced directly or indirectly in the blood are used for cancer screening, which is limited in accuracy and appears to be about half normal even when cancer is present. In the absence of this, they often appear positive, causing confusion.
  • the anti-cancer agent mainly used for the treatment of cancer there is a problem that shows the effect only when the volume of cancer is small.
  • Cancer cells are highly viable survivors caused by mutations in many genes. In order for one cell to turn into a cancer cell and develop into a malignant cancer mass seen in the clinic, many genes must be mutated. Therefore, a gene-level approach is needed to diagnose and treat cancer fundamentally.
  • the simplest representative method is by PCR to find the presence or absence of the ABL: BCR fusion gene, a gene marker for leukemia in the blood. This is more than 95% accuracy, and is a simple test that is useful for the diagnosis of chronic myelogenous leukemia, evaluation of the result after treatment, and follow-up. However, this method is only applicable to minor hematologic cancers.
  • Cancer can be diagnosed by analyzing DNA abnormalities specific to cancer, such as mutations, loss, or loss of oncogenes and tumor suppressor genes, with DNA released from these cancers. Lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, colorectal cancer, mutant type K-Ras oncogenes, p53 tumor suppressor genes, promoter methylation of p16 genes, and microsatellite labeling and instability were examined in serum.
  • cancer DNA can also be tested in samples other than blood.
  • genetic or antibody tests have been used to detect the presence of cancer cells and cancer genes in sputum or bronchoalveolar lavage (Palmisano, WA et al., Cancer Res., 60: 5954, Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59: 1404, 1999), How to find cancer genes present in feces in bowel cancer (Ahlquist, DA et al., Gastroenterol., 119: 1219-27, 2000 ) And methods for testing for promoter methylation abnormalities present in urine and prostate fluid (Goessl, C.
  • gene abnormalities many diseases are caused by gene abnormalities, and the most common type of gene abnormality is a change in the coding sequence of a gene. Such genetic changes are called mutations.
  • mutations When a gene is mutated, the protein it encodes changes its structure and function, leads to disorders and defects, and these mutant proteins cause disease.
  • a typical example is methylation, in which the methyl group is attached to the regulatory region of gene transcription, ie, the cytosine base of the promoter CpG island, in which case the gene is blocked. This is called an epigenetic change, which, like a mutation, is transmitted to progeny cells and causes the same effect, namely loss of expression of the protein.
  • tumor suppressor genes are blocked by methylation of the promoter CpG island in cancer cells, which is an important mechanism of carcinogenesis (Robertson, KD et al., Carcinogensis , 21: 461, 2000).
  • the genomic DNA of mammalian cells contains a fifth base in addition to A, C, G, and T, which is 5-methylcytosine (5-mC) having a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring.
  • 5-mC always comes only to C of CG dinucleotide (5'-mCG-3 '), and this CG is often referred to as CpG.
  • Most of C of CpG is methylated because a methyl group is attached.
  • This methylation of CpG inhibits the expression of repetitive sequences in the genome, such as alu or transposon, and is the site where extragenic changes occur most frequently in mammalian cells.
  • CpG islands there are exceptionally dense ones, which are called CpG islands.
  • CpG islands are 0.2-3kb in length, and the distribution percentage of C and G bases is over 50%, and the distribution percentage of CpG is concentrated to 3.75% or more.
  • About 45,000 CpG islands appear in the entire human genome, particularly in promoter regions that regulate gene expression. Indeed, the promoters of housekeeping genes, which make up about half of human genes, show CpG islands (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5: 309, 1995).
  • methylation occurs in the promoter CpG island, which impairs the expression of the gene.
  • promoters of tumor suppressor genes that regulate cell cycle or apoptosis, repair DNA participate in cell adhesion and intercellular coordination, and inhibit invasion and metastasis. Like mutations, they block the expression and function of these genes, which in turn promote the development and progression of cancer.
  • methylation may occur partially on CpG islands with age.
  • mutations cause carcinogenesis
  • mutations cause methylation of the promoter CpG islands instead of mutations.
  • Representative examples include promoter methylation of genes such as VHL (von Hippel Lindau) in acquired kidney cancer, BRCA1 in breast cancer, MLH1 in colorectal cancer, and E-CAD in gastric cancer.
  • VHL von Hippel Lindau
  • BRCA1 in breast cancer
  • MLH1 in colorectal cancer
  • E-CAD in gastric cancer.
  • About half of all cancers show promoter methylation of p16 or mutations in Rb, and the other half show promoter methylation of p73, p14, etc.
  • CpG cancers have three common characteristics with respect to CpG: hypermethylation of the promoter CpG island of tumor suppressor genes, undermethylation of the remaining CpG bases, and increased activity of methylation enzymes, namely DNA cytosine methyltransferase (DNMT).
  • DNMT DNA cytosine methyltransferase
  • the present inventors have made efforts to develop an effective enteric cancer specific methylation marker capable of early diagnosis, risk of cancer, or predicting the prognosis of cancer, and thus, SDC2 (NM_002998, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, single minded) Homolog 1 (Drosophila), Single-minded homolog 1) and SORCS3 (NM_014978, Sortinin-related VPS10 domain containing receptor 3) genes are specifically methylated in intestinal cancer cells Using this as a biomarker, it was confirmed that intestinal cancer can be diagnosed by measuring the degree of methylation, thereby completing the present invention.
  • the main object of the present invention is to provide a bowel cancer-specific methylated biomarker that is specifically methylated in bowel cancer that can be effectively used for diagnosing bowel cancer, and to provide information for early diagnosis of bowel cancer using the same.
  • Another object of the present invention is the intestinal cancer specific methylation marker gene SDC2 (NM_002998, Syndecan 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), Single-minded homolog 1) and SORCS3 (NM_014978,
  • SDC2 intestinal cancer specific methylation marker gene
  • SIM1 NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), Single-minded homolog 1
  • SORCS3 NM_014978
  • the present invention provides a method for detecting methylation of a bowel cancer specific methylation marker gene, for diagnosing bowel cancer comprising the following steps:
  • the present invention also provides a composition for diagnosing bowel cancer, which contains a CpG island of at least one of the following genes or a CpG island of its promoter:
  • the present invention also provides a method for diagnosing bowel cancer through methylation detection of a bowel cancer specific methylation marker gene comprising the following steps:
  • the invention also relates to (i) SDC2 (NM_002998, Syndecan 2) for diagnosing bowel cancer; (ii) SIM1 (NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1); And (iii) the CpG island of any one or more genes of SORCS3 (NM_014978, Sotilin-Related VPS10 Domain Containing Receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) or CpG Island of its promoter.
  • the present invention also provides a sequencing sequence for pyro sequencing a PCR primer pair for amplifying a fragment comprising a CpG island of any one or more of the following genes or a CpG island of a promoter thereof and a PCR product amplified by the primer pair.
  • a kit for diagnosing bowel cancer containing primers :
  • the present invention also provides a nucleic acid chip for diagnosing bowel cancer in which a fragment comprising a CpG island of one or more of the following genes or a fragment comprising a CpG island of a promoter thereof and a probe capable of hybridizing under stringent conditions are immobilized.
  • 1 is a schematic diagram showing the process of discovering methylated biomarkers for diagnosing intestinal cancer from the urine cells of normal people and intestinal cancer patients through CpG microarray analysis.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the process of screening for cancer-specific hypermethylated genes from intestinal cancer CpG microarray data.
  • Figure 3 is a graph measuring the degree of methylation by pyro sequencing in the intestinal cancer cell line and normal intestinal tissue of the seven biomarker candidate genes.
  • Figure 4 is a graph measuring the degree of methylation in intestinal cancer tissues and normal finding tissues that are connected to the three methylated biomarkers by the pyro sequencing method.
  • FIG. 5 is a graph measuring sensitivity and specificity of bowel cancer diagnosis by performing ROC curve analysis to evaluate bowel cancer diagnosis ability of three methylated biomarkers.
  • the present invention relates to SDC2 (NM_002998, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), Single-minded homolog 1) and SORCS3 (NM_014978, Sotilin-related VPS10 domain containing receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3)
  • SDC2 NM_002998, Syndecan 2
  • SIM1 NM_05068
  • Single minded homolog 1 Single-minded homolog 1
  • SORCS3 NM_014978, Sotilin-related VPS10 domain containing receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3
  • the present invention in one aspect the CpG of any one or more of the following genes It relates to a composition for diagnosing intestinal cancer containing an islet or a CpG islet of its promoter:
  • the CpG island may be located at the intron region of the gene.
  • the intron region of the SDC2 gene may be a sequence from +681 to +1800 nt, based on a transcription start point, and may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the intron region of the SORCS3 gene may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a sequence from +851 to +2000 nt, based on the transcription start point.
  • the CpG island may be characterized in that it is located in the promoter region of the gene, wherein the promoter region of the SIM1 gene in the sequence from -1500 to -501 nt, based on the start of transcription, SEQ ID NO: It may be characterized by including the base sequence of 2.
  • biomarker candidate genes having the largest difference in methylation degree between normal people and intestinal cancer patients were selected, and among them, SDC2, SIM1, and SORCS3 genes were found to be useful for diagnosing bowel cancer.
  • the method of screening for cells comprises the following steps: (a) separating genomic DNA from transformed and non-transformed cells; (b) separating the methylated DNA from the separated genomic DNA by reacting with a protein that binds to the methylated DNA; And (c) amplifying the methylated DNA, hybridizing to a CpG microarray, and selecting a methylation marker gene having the largest difference in the degree of methylation between normal cells and cancer cells.
  • methylated biomarker gene As a screening method of the methylated biomarker gene, a variety of methylated genes can be found at various stages of dysplasia in intestinal cancer as well as bowel cancer, and the selected genes are screened for cancer, risk assessment, prediction, disease identification, and stage of disease. It can also be used to select diagnostic and therapeutic targets.
  • Identifying genes methylated at intestinal cancer and at various stages of abnormality enables early and accurate diagnosis of intestinal cancer and can identify new targets for establishing and treating methylation lists using multiple genes.
  • methylation data according to the present invention will be able to establish a more accurate bowel cancer diagnosis system in conjunction with other non-methylated associated biomarker detection methods.
  • the present invention it is possible to diagnose several stages or stages of intestinal cancer progression, including determining the methylation stage of one or more nucleic acid biomarkers obtained from a sample.
  • the methylation of nucleic acid isolated from a sample of each stage of intestinal cancer can be compared to the methylation of one or more nucleic acids obtained from a sample that does not have cell proliferative abnormality of the intestinal tissue, thereby identifying the specific stage of intestinal cancer of the sample,
  • the step may be hypermethylation.
  • the nucleic acid may be methylated at the regulatory site of a gene.
  • methylation starts from the outside of the regulatory region of the gene and proceeds to the inside, detection of methylation at the outside of the regulatory region enables early diagnosis of genes involved in cellular transformation.
  • the methylation gene marker can be used for early diagnosis of cells likely to form bowel cancer.
  • a gene identified to be methylated in cancer cells is methylated in cells that appear clinically or morphologically normal, the cells that appear to be normal are in progress of cancer. Therefore, bowel cancer can be diagnosed early by confirming methylation of a bowel cancer specific gene in cells that appear normal.
  • the method includes contacting a sample comprising one or more nucleic acids isolated from a sample with an agent capable of determining one or more methylation states.
  • the method includes identifying the methylation status of one or more sites in one or more nucleic acids, wherein the methylation status of the nucleic acid is determined by the methylation status of the same site in the nucleic acid of the sample that has no cell growth abnormality (intestinal dysplasia) of the intestinal tissue. It may be characterized by a difference.
  • the possibility of the development of tissue into bowel cancer may be evaluated by examining the methylation frequency of the gene specifically methylated in the bowel cancer and determining the methylation frequency of the tissue having the potential for bowel cancer progression.
  • the present invention relates to a method for detecting methylation of a bowel cancer specific methylation marker gene for the diagnosis of bowel cancer comprising the following steps:
  • step (b) may be characterized by detecting the methylation of the CpG island of the intron region of the gene.
  • the intron region of the SDC2 gene may be a sequence from +681 to +1800 nt, based on a transcription start point, and may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the intron region of the SORCS3 gene may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a sequence from +851 to +2000 nt, based on the transcription start point.
  • the CpG island may be characterized in that it is located in the promoter region of the gene, wherein the promoter region of the SIM1 gene in the sequence from -1500 to -501 nt, based on the start of transcription, SEQ ID NO: It may be characterized by including the base sequence of 2.
  • the methylation detection step of step (b) includes PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR , DNA chip, pyro sequencing and bisulfite sequencing may be performed by a method selected from the group consisting of.
  • the clinical sample may be characterized in that selected from the group consisting of tissue, cells, blood, plasma, feces and urine suspected of cancer or a diagnosis target, but is not limited thereto.
  • the method for detecting whether the gene is methylated may include the following steps: (a) preparing a clinical sample containing DNA; (b) isolating DNA from the clinical sample; (c) amplifying the isolated DNA using a primer capable of amplifying a fragment including a promoter of any one or more of SDC2, SIM1 and SORCS3 genes or a CpG island of an intron; And (d) determining whether the intron is methylated based on the presence or absence of the amplified product produced in step (c).
  • SDC2 NM_002998, Syndecan 2, Syndecan 2
  • SIM1 NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1
  • SORCS3 NM_014978, sotilin- retained VPS10 domains
  • the present invention provides a method of pi sequencing a PCR primer pair for amplifying a fragment comprising a CpG island of one or more of the following genes or a CpG island of a promoter thereof and a PCR product amplified by the primer pairs. It relates to a kit for diagnosing bowel cancer containing sequencing primers for sequencing:
  • the PCR primer pair is SEQ ID NO: 12 and 13; SEQ ID NOs: 14 and 15; And it may be characterized in that the primer pair selected from the group consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 and 17.
  • the sequencing primer may be selected from the group consisting of nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 22 to 24.
  • SDC2 (NM_002998, Syndecan 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1) and SORCS3 (NM_014978, sotilin- retained VPS10 domains Container receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3)
  • SDC2 NM_002998, Syndecan 2, Syndecan 2
  • SIM1 NM_05068, single minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1
  • SORCS3 NM_014978, sotilin- retained VPS10 domains Container receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3
  • the present invention relates to a nucleic acid chip for diagnosing bowel cancer in which a fragment including a CpG island of one or more of the following genes or a promoter thereof and a probe capable of hybridizing under stringent conditions are immobilized. :
  • the CpG island may be located at the intron region of the gene.
  • the intron region of the SDC2 gene may be a sequence from +681 to +1800 nt, based on a transcription start point, and may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the intron region of the SORCS3 gene may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a sequence from +851 to +2000 nt, based on a transcription start point.
  • the CpG island may be characterized in that it is located in the promoter region of the gene, wherein the promoter region of the SIM1 gene in the sequence from -1500 to -501 nt, based on the start of transcription, SEQ ID NO: It may be characterized by including the base sequence of 2.
  • the probe may be characterized in that it is selected from the group consisting of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 33 to 44, the specific sequence is as follows.
  • the method includes determining the methylation status of one or more nucleic acids isolated from the sample, wherein the methylation step of the one or more nucleic acids is compared with the methylation step of the nucleic acid isolated from the sample without cell growth abnormality (dysplasia) of the intestinal tissue. It can be characterized by.
  • transformed bowel cancer cells can be identified by examining methylation of the marker gene using the kit or nucleic acid chip.
  • bowel cancer may be diagnosed by examining methylation of a marker gene using the kit or nucleic acid chip.
  • the possibility of progression to intestinal cancer can be diagnosed by examining the methylation of the marker gene using the kit or the nucleic acid chip using a sample showing a normal phenotype.
  • the sample may use solid or liquid tissue, cells, feces, urine, serum or plasma.
  • cell transformation refers to the alteration of a cell's characteristics from one form to another, such as from normal to abnormal, from non-tumor to tumorous, from undifferentiated to differentiation, from stem cells to non-stem cells. Means that. Additionally, the transformation can be recognized by the morphology, phenotype, biochemical properties, etc. of the cell.
  • “Early identification” of cancer herein refers to finding the possibility of cancer before metastasis, preferably before morphological changes are observed in sample tissue or cells.
  • “early confirmation” of cell transformation refers to the likelihood of transformation occurring at an early stage before the cell is transformed.
  • “Hypermethylation” as used herein means methylation of a CpG island.
  • sample or “sample sample” means a wide range of body fluids, including all biological fluids obtained from an individual, body fluid, cell line, tissue culture, etc., depending on the type of assay being performed. Methods of obtaining bodily fluids and tissue biopsies from mammals are commonly known. Preferred source is intestinal biopsy.
  • normal cells refers to cells that do not exhibit abnormal cell morphology or changes in cytological properties.
  • a “tumor” cell refers to a cancer cell, and a “non-tumor” cell refers to a cell that is part of the diseased tissue but is not considered to be a tumor site.
  • the present invention provides bowel cancer and SDC2 (NM_002998, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, single-minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1); It is based on the discovery of the association between hypermethylation of the SORCS3 (NM_014978, Sotilin-Related VPS10 domain containing receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) genes.
  • the methylation stage of one or more nucleic acids isolated from a sample can be determined to early diagnose cell growth abnormalities of the intestinal tissue of the sample.
  • the methylation step of the one or more nucleic acids may be compared with the methylation status of one or more nucleic acids isolated from a specimen that does not have cell growth potential of intestinal tissue.
  • the nucleic acid is preferably a CpG-containing nucleic acid such as a CpG island.
  • nucleic acid is SDC2 (NM_002998, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, single-minded homolog 1 (Drosophila), single-minded homolog 1); SORCS3 (NM_014978, Sotilin-Related VPS10 Domain Containing Receptor 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) gene; And combinations thereof, wherein the methylation step of the one or more nucleic acids may be compared to the methylation status of one or more nucleic acids isolated from a sample that does not have a predisposition to cell growth potential of the intestinal tissue. have.
  • a virulent sample is a sample that does not yet have cell growth abnormalities, but has or has increased cell growth abnormalities.
  • the invention provides a method for cell growth of intestinal tissue of a sample comprising contacting a sample comprising the nucleic acid of the sample with an agent capable of determining the methylation state of the sample and confirming methylation of one or more sites of the one or more nucleic acids. It provides a method for diagnosing abnormalities.
  • the methylation of one or more sites of one or more nucleic acids can be characterized as different from the methylation step of the same site of the same nucleic acid of a sample having no cell growth potential.
  • nucleic acid or “nucleic acid sequence” means oligonucleotides, nucleotides, polynucleotides or fragments thereof, single stranded or double stranded genomic origin or synthetic genomic origin or synthesis of DNA, RNA, sense or antisense strands.
  • DNA or RNA of origin peptide nucleic acid (PNA) or DNA amount or RNA quantity material of natural or synthetic origin. If the nucleic acid is RNA, it is apparent to those skilled in the art that, instead of deoxynucleotides A, G, C, and T, it is replaced with ribonucleotides A, G, C, and U, respectively.
  • the CpG island is a CpG rich site in the nucleic acid sequence.
  • any nucleic acid in the purified or unpurified form of the present invention may be used, and any nucleic acid containing or suspected of containing a nucleic acid sequence containing a target site (eg, a CpG-containing nucleic acid) may be used.
  • a nucleic acid site that can be differentially methylated is a CpG island, which is a nucleic acid sequence having a high CpG density compared to other dinucleotide CpG nucleic acid sites. Doublet CpG is only 20% probable in vertebrate DNA as predicted by the ratio of G * C base pairs. At certain sites, the density of double CpG is ten times higher than at other sites in the genome.
  • the CpG islands have an average G * C ratio of about 60%, with an average DNA G * C ratio of 40%.
  • CpG islands are typically about 1 to 2 kb in length and there are about 45,000 CpG islands in the human genome.
  • CpG islands start upstream of the promoter and extend to the transcriptional site downstream. Methylation of CpG islands in promoters usually inhibits expression of genes.
  • the CpG islands may also surround the 3 'region of the gene coding region, as well as the 5' region of the gene coding region. Therefore, CpG islands are found at several sites, including upstream of a coding sequence of a regulatory region comprising a promoter region, a coding region (eg exon region), downstream of a coding region, eg, an enhancer region and an intron. do.
  • the CpG-containing nucleic acid is DNA.
  • the method of the present invention may apply for example a sample containing DNA or RNA containing DNA and mRNA, wherein the DNA or RNA may be single stranded or double stranded, or DNA-RNA hybrids. It may be characterized by the contained sample.
  • Nucleic acid mixtures may also be used.
  • the specific nucleic acid sequence to be detected may be a fraction of a large molecule, and from the outset the specific sequence may exist in the form of isolated molecules that make up the entire nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid sequence need not be nucleic acid present in pure form, and the nucleic acid may be a small fraction in a complex mixture, such as containing whole human DNA.
  • Nucleic acids included in the sample used to measure the degree of methylation of nucleic acids contained in the sample or used to detect methylated CpG islands are described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989). It can be extracted by various methods described in.
  • the nucleic acid isolated from the sample is obtained by biological sample of the sample. If one wants to diagnose bowel cancer or the progression of bowel cancer, the nucleic acid should be separated from the intestinal tissue with a scrap or biopsy. Such samples may be obtained by various medical procedures known in the art.
  • the degree of methylation of the nucleic acid of the sample obtained from the sample is measured in comparison to the same nucleic acid portion of the sample that is free of cell growth abnormalities of the intestinal tissue.
  • Hypermethylation refers to the presence of methylated alleles in one or more nucleic acids. Samples without cell growth abnormality of the intestinal tissues do not show methylation alleles when the same nucleic acid is tested.
  • the present invention can be used individually as a diagnostic or predictive marker, or a combination of several marker genes in the form of a panel display, and several marker genes can be used to improve reliability and efficiency through an overall pattern or a list of methylated genes. It can confirm that it improves.
  • the genes identified in the present invention can be used individually or as a set of genes in which the genes mentioned in this example are combined. Alternatively, genes can be ranked, weighted, and selected for the level of likelihood of developing cancer, depending on the number and importance of the genes methylated together. Such algorithms belong to the present invention.
  • PCR primers corresponding to the sites where the 5'-CpG-3 'nucleotide sequence exists were prepared for the converted nucleotide sequence after bisulfite treatment.
  • PCR primers corresponding to methylation and two types of primers corresponding to unmethylated were prepared.
  • the PCR product is made by using the primer corresponding to the methylated sequence when methylated.
  • the PCR product is produced by using a primer corresponding to unmethylation. Methylation can be qualitatively confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • Real-time methylation-specific PCR converts methylation-specific PCR into a real-time measurement method. After treating bisulfite with genomic DNA, design PCR primers corresponding to methylated cases, and perform real-time PCR using these primers. To do. At this time, there are two methods of detection using a TanMan probe complementary to the amplified base sequence and a method of detection using Sybergreen. Thus, real-time methylation specific PCR can selectively quantitate only methylated DNA. At this time, a standard curve was prepared using an in vitro methylated DNA sample, and amplification of the gene without the 5'-CpG-3 'sequence in the nucleotide sequence by a negative control group was quantitatively analyzed.
  • the pyro sequencing method is a method of converting the bisulfite sequencing method into quantitative real-time sequencing. Similar to bisulfite sequencing, the genomic DNA was converted by bisulfite treatment, and PCR primers corresponding to sites without the 5'-CpG-3 'sequencing were prepared. After treating genomic DNA with bisulfite, it was amplified by the PCR primers, and real-time sequencing was performed using the sequencing primers. Quantitative analysis of cytosine and thymine at the 5′-CpG-3 ′ site indicated the methylation degree as the methylation index.
  • methylated DNA-specific binding proteins when a protein that specifically binds to methylated DNA is mixed with DNA, only methylated DNA can be selectively separated because the protein specifically binds to methylated DNA. . After genomic DNA was mixed with methylated DNA specific binding proteins, only methylated DNA was selectively isolated. These isolated DNAs were amplified using PCR primers corresponding to intron sites, and then subjected to agarose electrophoresis to determine methylation.
  • methylation can also be determined by quantitative PCR.
  • Methodhylated DNA separated by methylated DNA-specific binding proteins can be labeled with a fluorescent dye and hybridized to DNA chips having complementary probes to measure methylation.
  • the methylated DNA specific binding protein is not limited to MBD2bt.
  • Detection of differential methylation can be accomplished by contacting the nucleic acid sample with a methylation sensitive restriction endonuclease that cleaves only unmethylated CpG sites.
  • the samples were contacted with isochimers of methylation sensitive restriction endonucleases that cleave both methylated and unmethylated CpG sites, thereby cleaving the methylated nucleic acids.
  • Specific primers were added to the nucleic acid sample and the nucleic acid was amplified by conventional methods. If there is an amplification product in the sample treated with the methylation sensitive restriction endonuclease, and there is no amplification product in the isomerized sample of the methylation sensitive restriction endonuclease that cleaves both methylated and unmethylated CpG sites , Methylation occurred in the analyzed nucleic acid site. However, no amplification products were present in the samples treated with methylation sensitive restriction endonucleases, and the amplification products were also found in the samples treated with isosomeomers of methylation sensitive restriction endonucleases that cleave both methylated and unmethylated CpG sites. Existence means that no methylation occurs in the analyzed nucleic acid site.
  • a "methylation sensitive restriction endonuclease” is a restriction enzyme that contains CG at the recognition site and has activity when C is methylated compared to when C is not methylated (eg, Sma I).
  • Non-limiting examples of methylation sensitivity limiting endonucleases include Msp I, Hpa II, Bss HII, Bst UI and Not I. The enzymes may be used alone or in combination.
  • Other methylation sensitivity limiting endonucleotides include, but are not limited to, for example, Sac II and Eag I.
  • Isochimers of methylation sensitive restriction endonucleases are restriction endonucleases that have the same recognition site as methylation sensitive restriction endonucleases, but cleave both methylated and unmethylated CGs, e.g., Msp. I can be mentioned.
  • the primers of the present invention are designed to have "alternatively" complementarity with each strand of the locus to be amplified and, as described above, include the appropriate G or C nucleotides. This means that the primers have sufficient complementarity to hybridize with the corresponding nucleic acid strands under the conditions for carrying out the polymerization.
  • the primer of the present invention is used in the amplification process, which is an enzymatic continuous reaction in which the target locus, such as PCR, increases to an exponential number through many reaction steps. Typically, one primer (antisense primer) has homology to the negative (-) strand of the locus and the other primer (sense primer) has homology to the positive (+) strand.
  • the chain is stretched by enzymes and reactants such as DNA polymerase I (Klenow) and nucleotides, resulting in newly synthesized + and-strands containing the target locus sequence.
  • the newly synthesized target locus is also used as a template, and the cycle of denaturation, primer annealing and chain extension repeats exponential synthesis of the target locus sequence.
  • the product of the continuous reaction is an independent double stranded nucleic acid having an end corresponding to the end of the specific primer used in the reaction.
  • the amplification reaction is preferably a PCR that is commonly used in the art.
  • alternative methods such as real-time PCR or linear amplification with isothermal enzymes can also be used, and multiplex amplification reactions can also be used.
  • detecting nucleic acids containing methylated CpG include contacting a sample containing nucleic acid with an agent that modifies unmethylated cytosine and amplifying the CpG-containing nucleic acid of the sample using CpG-specific oligonucleotide primers. It includes.
  • the oligonucleotide primer may be characterized by detecting the methylated nucleic acid by distinguishing the modified methylated and unmethylated nucleic acid.
  • the amplification step is optional and desirable but not necessary.
  • the method relies on a PCR reaction that distinguishes between modified (eg, chemically modified) methylated and unmethylated DNA. Such methods are disclosed in US Pat. No. 5,786,146, which is described in connection with bisulfite sequencing for the detection of methylated nucleic acids.
  • kits useful for detecting cell growth abnormality of a specimen comprising a compartment containing carrier means for holding a sample, a second container containing a pair of PCR primers capable of amplifying a 5'-CpG-3 'sequencing site for pyrosequencing the sample, and an amplified PCR product.
  • One or more containers including a third container containing sequencing primers for pyrosequencing.
  • the carrier means is suitable for containing one or more containers, such as bottles, tubes, each container containing independent components used in the method of the invention.
  • containers such as bottles, tubes
  • each container containing independent components used in the method of the invention.
  • one of ordinary skill in the art can readily dispense the required formulation in the container.
  • the nucleic acid amplification product can be hybridized with a known gene probe immobilized on a solid support (substrate) to detect the presence of the nucleic acid sequence.
  • a “substrate” is a mixture means comprising a substance, structure, surface or material, abiotic, synthetic, inanimate, planar, spherical or specific binding, flat surface material, hybridization or enzyme recognition site Or many other recognition sites beyond the vast majority of other recognition sites or numerous other molecular species composed of surfaces, structures or materials.
  • Such substrates include, for example, semiconductors, (organic) synthetic metals, synthetic semiconductors, insulators and dopants; Metals, alloys, elements, compounds and minerals; Synthesized, degraded, etched, lithographic, printed and microfabricated slides, devices, structures and surfaces; Industrial, polymers, plastics, membranes, silicones, silicates, glass, metals and ceramics; Wood, paper, cardboard, cotton, wool, cloth, woven and non-woven fibers, materials and fabrics, but are not limited thereto.
  • membranes are known in the art to have adhesion to nucleic acid sequences.
  • membranes for gene expression detection such as nitrocellulose or polyvinylchloride, diaotized paper and commercially available membranes such as GENESCREEN TM, ZETAPROBE TM (Biorad) and NYTRAN TM.
  • Beads, glass, wafers and metal substrates are also included. Methods of attaching nucleic acids to such objects are well known in the art. Alternatively, screening can also be performed in the liquid phase.
  • nucleic acid hybridization reactions the conditions used to achieve stringent specific levels vary depending on the nature of the nucleic acid being hybridized. For example, the length of the nucleic acid region to be hybridized, degree of homology, nucleotide sequence composition (eg, GC / AT composition ratio), and nucleic acid type (eg, RNA, DNA) select hybridization conditions. Is considered. Further considerations are whether the nucleic acid is immobilized, for example, in a filter or the like.
  • Examples of very stringent conditions are as follows: 2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at 42 ° C. (conditions with moderate stringency); 0.1X SSC at 68 ° C. conditions with high stringency.
  • the washing process can be carried out using one of these conditions, for example a condition with high stringency, or each of the above conditions, each of 10-15 minutes in the order described above, all or all of the conditions described above. Some iterations can be done. However, as described above, the optimum conditions vary with the particular hybridization reaction involved and can be determined experimentally. In general, conditions of high stringency are used for hybridization of critical probes.
  • Probes are labeled so that they can be detected, for example, with radioisotopes, fluorescent compounds, bioluminescent compounds, chemiluminescent compounds, metal chelates or enzymes. Proper labeling of such probes is a technique well known in the art and can be carried out by conventional methods.
  • genomic DNA 500 ng of genomic DNA (Biochain) from normal non-cancer patients, cancer tissues from 12 surgical tissues from intestinal cancer patients, and 500 ng of normal-segmented genomic DNA contiguous with ultrasound were pulverized. (Vibra Cell, SONICS) to produce genomic DNA fragments of about 200-300bp.
  • a methyl binding domain known to bind to methylated DNA (Fraga et al., Nucleic Acid Res., 31: 1765, 2003) was used. That is, 2 ⁇ g of 6X His-tagged MBD2bt was pre-incubated with 500 ng of E. coli JM110 (Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, No. 2638) genomic DNA, followed by binding to Ni-NTA magnetic beads (Qiagen, USA).
  • 500 ng of genomic DNA isolated from the ultrasonically crushed normal and intestinal cancer tissue cells was bound to a reaction solution (10 mM Tris-HCl, pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 mM MgCl 2 , 0.1% Triton-X100 , 5% glycerol, 25 mg / ml BSA), and reacted at 4 ° C. for 20 minutes, and then washed three times using 500 ⁇ l of a binding reaction solution containing 700 mM NaCl, followed by QiaQuick PCR for methylated DNA bound to MBD2bt. Separation was performed using a purification kit (QIAGEN, USA).
  • the methylated DNA bound to the MBD2bt was amplified using a genome amplification kit (Sigma, USA, Cat. No. WGA2), and then 4 ⁇ g of the amplified genomic DNA was prepared using BioPrime Total Genomic Labeling system I (Invitrogen Corp. , USA) was used to label Cy5.
  • Standard comparative DNA was prepared to indirectly compare the degree of methylation between normal and bowel cancer patients. Standard DNA was mixed in equal amounts to genomic DNA of 12 intestinal cancer patient tissues used for methylation analysis and the DNA was amplified using a genome amplification kit (Sigma, USA, Cat. No. WGA2), followed by the amplified genome.
  • probes with reliable hybridization signals we used a GeneSpring 7.3 program (Agilent, USA) to apply a cross gene error model, with 64,325 probes with Cy3 signals of at least 112.8 in at least 21 arrays out of a total of 26 arrays. Were selected with probes with reliable signals. From these, two methods were used to select probes specifically hypermethylated for bowel cancer. First, the normal findings of normal intestinal tissues and intestinal cancers connected with intestinal cancers were considered to be the same group, and ANOVA test was performed to select probes showing differential methylation compared to intestinal cancers. 4,498 probes were selected.
  • biomarker candidate genes Four genes among the biomarker candidate genes analyzed by the above two methods were identified as common genes, and thus, seven biomarker candidate genes were obtained (Table 1). In addition, using MethPrimer (http://itsa.ucsf.edu/ ⁇ urolab/methprimer/index1.html) for the nucleotide sequence of the site corresponding to each probe of these seven genes showing hypermethylation in CpG microarray analysis. It was confirmed that the CpG islands exist.
  • PCR and sequencing primers for performing pyro sequencing for the seven genes were designed using the PSQ assay design program (Biotage, USA). PCR and sequencing primers for methylation measurement of each gene are shown in Tables 2 and 3 below.
  • nucleotide from transcription initiation point (+1) location on genomic DNA of CpG site used for methylation measurement
  • PCR reaction solution (20 ng genomic DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), 5 units of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ l of 2.5 mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l of PCR primer) 10 pmole / ⁇ l)
  • PCR reaction solution (20 ng genomic DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), 5 units of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ l of 2.5 mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l of PCR primer) 10 pmole / ⁇ l)
  • Amplification of the PCR product was confirmed
  • pyro sequencing was performed using the PSQ96MA system (Biotage, USA). After the pyro sequencing, the degree of methylation was measured by calculating the methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG site.
  • the degree of methylation of the biomarker candidate gene in the intestinal cancer cell line was quantitatively measured using a pyro sequencing method. As shown in FIG. 3A, all of the seven biomarker genes were at high levels in at least one cell line. It was confirmed that it was methylated. The seven genes showed high methylation levels in intestinal cancer cell lines, demonstrating their potential as a biomarker for diagnosing intestinal cancer. Therefore, to verify this, a methylation verification experiment using tissue samples was further performed.
  • biomarker candidate genes of Example 1 In order for the seven biomarker candidate genes of Example 1 to be useful as markers for diagnosing bowel cancer, they should exhibit low methylation levels in the intestinal tissues of non-patients while high methylation levels in intestinal cancer tissues.
  • the genomic DNA was isolated from two normal intestinal tissues (Biochain Co., Ltd.) by using a QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, USA), and then EZ into 200ng of the isolated genomic DNA. Bisulfite was treated using a DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA), followed by elution with 20 ⁇ l of sterile distilled water and used for pyro sequencing.
  • PCR reaction solution (20ng genomic DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ m 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l PCR primer (10 pmole/ ⁇ l)) was treated for 5 minutes at 95 ° C., and then 45 times at 95 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • IRX1, IRX5, KCNA1 and CHST11 among the seven genes showed a high methylation level of more than 40% in normal tissue, it was determined that it is not useful as a biomarker, and therefore excluded from the biomarker candidate I was.
  • SIM1, SDC2 and SORCS3 showed a relatively low degree of methylation. Therefore, the utility of these SIM1, SDC2 and SORCS3 genes as biomarkers was verified in the tissues of intestinal cancer patients as follows.
  • Enteric cancer obtained from 12 intestinal cancer surgical tissues (Yonsei University-designated biochip center designated by the Ministry of Health, Welfare and Family Affairs) to verify the usefulness of SIM1, SDC2 and SORCS3 genes as diagnostic biomarkers for intestinal cancer Genomic DNA was isolated from tissues and normal finding tissues in contact with it.
  • Bisulfite was treated using the EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA) on 200 ng of the isolated genomic DNA, and then eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water to be used for pyro sequencing.
  • PCR reaction solution (20ng genomic DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ m 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), 2 ⁇ l PCR primer (10 pmole/ ⁇ l)) was treated for 5 minutes at 95 ° C., and then 45 times at 95 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • SDC2 and SIM1 genes showed higher methylation levels in all 12 patients (100%) compared to normal-tissue tissues that were contiguous with intestinal cancer tissue.
  • the SORCS3 gene showed high levels of methylation in 10 (83.3%) intestinal cancer tissues of 12 patients, indicating that all three genes were highly useful as methylated biomarkers for diagnosing bowel cancer.
  • Table 4 shows the average value of methylation in the intestinal cancer tissues of the three biomarker genes and the normal finding tissues contiguous thereto. To determine whether the methylation levels of intestinal cancer tissues and normal tissues differed statistically, chi-square tests were performed. As a result, all three genes showed a high significance level with a p value of 0.01 or less. Can be (Table 4).
  • the sensitivity and specificity of the SDC2 gene were 100%, the SIM1 gene was 83.3%, 100%, and the SORCS3 gene was 83.3% and 100%, respectively. I could confirm it.
  • the diagnostic ability of bowel cancer in stool samples was evaluated by using the SDC2 gene, which has the best diagnostic ability in intestinal cancer tissues among the three biomarkers.
  • genomic DNA was isolated from fecal samples (Yonsei University Biochip Research Center designated by the Ministry of Health and Welfare) of 4 normal and 10 bowel cancer patients using nested methylation-specific PCR (MSP). 4 ⁇ g of the isolated genomic DNA was treated with bisulfite using an EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA), and then eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water to be used for nested MSP experiments. Primer sequences used in the Nested MSP experiment are shown in Table 5.
  • PCR reaction solution (1ug genomic DNA converted to bisulfite, 5 ⁇ l 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units (Enzynomics, Korea), 4 ⁇ l 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), Outer PCR primer 2 5 ⁇ l (5 pmole / ⁇ l) was treated at 95 ° C. for 5 minutes, followed by a total of 30 times of 40 seconds at 95 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes. Taking the PCR product 1/2, the PCR was performed 45 times by the same method, and the amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
  • the methylation detection method and the diagnostic composition, kit and nucleic acid chip according to the present invention it is possible to diagnose intestinal cancer in the early transformation stage, it is possible to diagnose early and accurately and faster than conventional methods It is useful to be able to diagnose.

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Abstract

본 발명은 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출하여 장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 장암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 장암을 진단할 수 있어 유용하다.

Description

장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법
본 발명은 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출하여 장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료효과는 치료법의 문제뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.
현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억개, 암의 직경이 1㎝ 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.
상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다. 하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.
최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.
또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 가양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어렵고, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al., Clin. Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al., Clin. Chem., 47:505, 2001).
혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5~10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).
한편, 혈액외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암 환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999), 장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법 (Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219-27, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법 (Goessl, C. et al., Cancer Res., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.
이에 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.
상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위, 즉 프로모터 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 유전자외 변화(epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다. 가장 대표적인 것이 암세포에서 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의해 종양억제 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 이는 발암의 중요한 기전이 된다 (Robertson, K.D. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000).
암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.
포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 × 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.
CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).
한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체상의 유전자들은 메틸화되어 있다.
발암과정 중에는 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.
흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 프로모터 메틸화가 있다. 아울러 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 프로모터 메틸화를 보인다.
중요한 사실은 이러한 프로모터 메틸화에 의한 유전자외 변화가 곧 유전자의 변화, 즉 코딩서열의 돌연변이를 유발하며, 이들 유전자 및 유전자외의 변화가 결합하여 발암이 진행된다는 것이다. MLH1 유전자를 예로 들면, 대장암세포에서 흔히 MLH1 유전자의 한 대립유전자(allele)는 돌연변이나 결실로 인해 기능이 상실되어 있고, 나머지 한 대립유전자는 프로모터 메틸화 때문에 고장이 나있는 경우가 있다. 아울러 프로모터 메틸화 때문에 DNA 복구 유전자인 MLH1의 기능이 상실되면, 이는 곧 다른 중요 유전자에 돌연변이가 일어나는 것을 용이하게 함으로써 발암을 촉진한다.
대부분의 암은 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. ＆ Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. ＆ Brown, K.W., Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000).
프로모터 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(domain protein, MBD), 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase)가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.
프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000).
프로모터 메틸화를 이용한 암 진단의 정확도를 극대화하고 발암을 단계별로 분석하며, 암과 고령화에 따른 변화를 감별하기 위해서는 프로모터 CpG 섬의 전체 시토신 염기의 메틸화를 모두 정확하게 분석할 수 있는 검사가 필요하다. 현재 이를 위한 표준적 방법은 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이다. 이는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 다음, 표적 유전자의 검사하고자 하는 CpG 섬 전체 부위를 PCR로 증폭한 후, 그 염기서열을 분석하는 것이다. 그러나 이 검사는 한번에 검사할 수 있는 유전자의 수나 검체의 수에 한계가 있으며, 자동화가 어렵고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.
존스 홉킨스 의대와 MD 엔더슨 암센터, 베를린의대 등에서 암과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이렇게 얻어진 기초자료는 DNA Methylation Society(DMS)에서 교류가 이루어지고 있으며, MethDB (http://www.methdb.de) 자료가 저장되고 있다. 한편, EpiGenX Pharmaceuticals사는 CpG 섬의 메틸화와 관련된 치료제를 개발하고 있고, Epigenomics사는 DNA칩과 MALDI-TOF 등의 기법으로 프로모터 메틸화를 검사하여 암 진단에 응용하려는 연구를 진행 중이다.
이에, 본 발명자들은 조기 진단, 발암 위험 또는 암의 예후 예측 등이 가능한 효과적인 장암 특이적 메틸화 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자가 장암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있으며, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 장암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 장암 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 장암에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 메틸화 바이오마커를 제공하고, 이를 이용하여 조기에 장암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장암 특이적 메틸화 마커 유전자인 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 검출방법 및 이를 이용한 장암 진단용 키트 및 핵산 칩을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법을 제공한다:
(a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 임상샘플의 DNA로부터 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 단계:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물을 제공한다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출을 통한 장암의 진단방법을 제공한다:
(a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 임상샘플의 DNA로부터 (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및 (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 또는 그 프로모터의 CpG 섬이 메틸화된 것으로 검출되는 경우 장암 또는 그 진행단계인 것으로 진단하는 단계.
본 발명은 또한, 장암 진단을 위한 (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및 (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG 섬 또는 그 프로모터의 CpG 섬의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트를 제공한다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩을 제공한다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 정상인과 장암 환자의 소변세포로부터 CpG 마이크로어레이 분석을 통하여 장암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커를 발굴하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 장암 CpG 마이크로어레이 데이터로부터 장암 특이적 과메틸화 유전자를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 7개의 바이오 마커 후보 유전자의 장암 세포주 및 정상인 장조직에서 메틸화 정도를 파이로시퀀싱으로 측정한 그래프이다.
도 4는 3개의 메틸화 바이오 마커의 장암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 그래프이다.
도 5는 3개 메틸화 바이오마커의 장암 진단능력을 평가하기 위하여 ROC 커브 분석을 수행하여 장암진단에 대한 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 측정한 그래프이다.
도 6은 SDC2 바이오마커 유전자의 정상인 및 장암환자의 대변조직에서 메틸화 여부를 메틸화-특이적 PCR 방법으로 검증한 것이다 (Circles: 메틸화 특이 PCR 산물).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 장암에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자인 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 CpG섬을 바이오마커로서 사용하는 것으로서, 이에 본 발명은 일 관점에서 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물에 관한 것이다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명에 있어서, 상기 CpG섬은 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, ＋681 ~ ＋1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, ＋851 ~ ＋2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 CpG섬은 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SIM1 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, －1500 ~ －501 nt까지의 서열로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 정상인과 장암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 7개의 바이오마커 후보 유전자를 선별한 다음, 이 중 SDC2, SIM1 및 SORCS3 유전자가 장암 진단에 유용함을 확인하였으며, 본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 정상 세포와 암 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계.
상기 메틸화 바이오 마커 유전자의 선별방법으로 장암뿐만 아니라, 장암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 장암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.
장암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 장암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이터는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 장암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 장암 진행을 진단할 수 있다. 장암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 장 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 장암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.
본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 장암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 장암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 장암을 조기 진단할 수 있다.
본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 장 조직의 세포 성장성 이상 (이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 장암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 장암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 장암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것이다:
(a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 임상샘플의 DNA로부터 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 단계:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 상기 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, ＋681 ~ ＋1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, ＋851 ~ ＋2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 CpG섬은 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SIM1 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, －1500 ~ －501 nt까지의 서열로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 메틸화 검출단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 특징으로 할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 일례로 상기 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; (b) 상기 임상샘플로부터 DNA를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 DNA를 SDC2, SIM1 및 SORCS3 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 프로모터 또는 인트론의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 인트론의 메틸화 여부를 결정하는 단계.
다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 상태를 키트를 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트에 관한 것이다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 12 및 13; 서열번호 14 및 15; 및 서열번호 16 및 17로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 또한, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 22 내지 24로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 할 수 있다.
다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 상태를 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩에 관한 것이다:
(i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
(ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
(iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
본 발명에 있어서, 상기 CpG섬은 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, ＋681 ~ ＋1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +851 ~ +2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 CpG섬은 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SIM1 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, －1500 ~ －501 nt까지의 서열로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 33 내지 44로 표시되는 염기서열로 구성되는 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 그 구체적인 서열은 다음과 같다.
SDC2
1) 5’-tgggtcgggc ccgcgaggga acggc-3’ (서열번호 33)
2) 5’-ggggggagcc tgggtcgggc ccgcgaggga acggctccac-3’ (서열번호 34)
3) 5’-tcgccctcgg cgggtcttgc tgcgtggtct gggaaggacg gaggggaaag-3’ (서열번호 35)
4) 5’-ggggtccctt cctccgcaca ccatcccccc cgcgccagct ttcctgtttg actgcatgca agttctgggg agatgggggc cagatttaag agacccgcga-3’ (서열번호 36)
SIM1
1) 5’-gatgggcgcc cccgaaacct ctgcc-3’ (서열번호 37)
2) 5’-gccccgcgcc cgcccagcag ccccgcagct ccgcggtggt-3’ (서열번호 38)
3) 5’-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga-3’ (서열번호 39)
4) 5’-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga acagttaaga
gatgggcgcc cccgaaacct ctgccgcttg tggggactga-3’ (서열번호 40)
SORCS3
1) 5’-cgagaggtgg cgtcgttgag cccgg-3’ (서열번호 41)
2) 5’-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3’ (서열번호 42)
3) 5’-cgagaggtgg cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3’ (서열번호 43)
4) 5’-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac tgggcgcccg actgagcatc gcgcctgcct ggcagctgca gcggcccgca gcgcgtgccc ggaggggctc-3’ (서열번호 44)
본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체에서 장 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 장암 세포를 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 장암을 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 장암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 대변, 소변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다.
본원에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.
본원에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다.
본원에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 체액, 포함하는 폭넓은 범위의 체액을 의미하는 것이다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 장의 생검(biopsy)이다.
장암에 대한 바이오 마커-정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도
본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 장암과 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, 싱글-마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다.
본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.
본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, 싱글-마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자; 및 그의 조합인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.
본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.
서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.
메틸화(methylation)
본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G＊C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G＊C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.
여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3’ 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5’ 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.
통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.
핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.
검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 장암이나 장암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 장 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.
개별 유전자 및 패널
본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.
메틸화 검출 방법
메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)
지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5’-CpG’-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5’-CpG-3’ 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.
실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)
실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5’-CpG-3’ 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
파이로시퀀싱
파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5’-CpG-3’ 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5’-CpG-3’ 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.
메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩
메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.
또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.
차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제
차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.
별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.
특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.
여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.
본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(＋) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 ＋ 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.
상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.
차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법
메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.
키트(Kit)
본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 샘플을 파이로시퀀싱하기 위한 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기, 및 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.
캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
기질
타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.
여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREEN™, ZETAPROBE™(Biorad) 및 NYTRAN™ 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.
하이브리다이제이션 조건
핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
표지(Label)
중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 장암 특이적 메틸화 유전자 발굴
장암에서 특이적으로 메틸화된 바이오 마커를 선별하기 위하여, 암 환자가 아닌 정상인 2명의 게놈 DNA (Biochain), 장암환자 12명의 수술조직으로부터 얻은 암 조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직 게놈 DNA 500ng을 초음파 분쇄(Vibra Cell, SONICS)하여, 약 200~300bp의 게놈 DNA 절편을 제작하였다.
게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 메틸화 DNA에 결합한다고 알려진 메틸바인딩 도메인 (Methyl binding domain; MBD) (Fraga et al., Nucleic Acid Res., 31: 1765, 2003)을 사용하였다. 즉, 6X His가 tagging된 MBD2bt 2㎍을 대장균 JM110(한국생명공학연구원 생명자원센터, No. 2638) 게놈 DNA 500ng과 pre-incubation시킨 다음, Ni-NTA 마그네틱 비드 (Qiagen, USA)에 결합시켰다. 여기에 상기 초음파 분쇄된 정상인 및 장암 환자 조직세포에서 분리한 게놈 DNA 500ng을 결합 반응 용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 3mM MgCl2, 0.1% Triton-X100, 5% 글리세롤, 25㎎/㎖ BSA)하에서 4℃, 20 분간 반응시킨 후, 700mM NaCl이 포함된 결합 반응 용액 500㎕를 이용하여 3회 세척한 다음, MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 QiaQuick PCR purification kit(QIAGEN, USA)을 사용하여 분리하였다.
이후, 상기 MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy5로 표지하였다. 정상인과 장암 환자간의 메틸화 정도를 간접적으로 비교하기 위하여 표준비교 DNA를 제작하였다. 표준비교 DNA는 메틸화 분석을 위해 사용한 12명의 장암 환자 조직의 게놈 DNA를 동량으로 혼합하고 이를 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy3로 표지하였다. 상기 표준비교 DNA 및 정상인과 장암 환자의 DNA 각각을 혼합한 후, 244K human CpG 마이크로어레이(Agilent, USA)에 하이브리다이제이션시켰다 (도 1). 상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음. Agilent scanner를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent)을 이용하여 정상인과 장암 환자 시료 간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하였다.
신뢰할 만한 하이브리다이제이션 시스날을 갖는 프로브들을 선별하기 위하여 GeneSpring 7.3 프로그램 (미국 Agilent 사)을 이용하여 cross gene error model을 적용하여 Cy3 시그날이 총 26개의 array중 최소 21개 array에서 112.8 이상인 64,325개의 프로브들을 신뢰할 만한 시그날을 갖는 프로브들로 선별하였다. 이로부터 장암에 특이적으로 과메틸화 되어 있는 프로브들을 선별하기 위하여 두 가지 방법으로 분석하였다. 첫째는 정상인의 장조직 및 장암과 연접하고 있는 정상소견조직을 동일그룹으로 간주하고 장암 조직과 비교하여 차별적인 메틸화를 보이는 프로브들을 선별하기 위하여 아노바 테스트 (ANOVA test)를 수행하여 p 값이 0.05 이하인 4,498개의 프로브를 선별하였다. 이로부터 장암조직에 과메틸화 되어 있는 1,560개의 프로브들을 다시 선별하고, 이중 약 400 bp 이내에 존재하는 2개 이상의 연접한 프로브에서 과메틸화를 동시에 나타내는 4개의 바이오마커 유전자 후보 (CHST11, IRX5, KCNA1, SDC2, SORCS3)를 발굴하였다 (도 2). 둘째는 조기진단에 적합한 메틸화 바이오마커를 발굴하기 위하여 장암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직을 동일 그룹으로 간주하고, 정상인의 장조직과 차별적으로 메틸화 되어 있는 프로브들을 아노바 테스트를 수행하여 p 값이 0.01 이하인 3,242개의 프로브를 선별하였다. 3,242개의 프로브중 장암 조직 및 이와 연접한 정상 소견 조직에서 과메틸화를 나타내는 705개의 프로브를 선별하고 이로부터 약 400 bp 이내에 존재하는 2개 이상의 연접한 프로브가 동시에 과메틸화를 나타내는 6개의 바이오마커 후보 유전자 (CHST11, IRX1, IRX5, KCNA1, SIM1, SORCS3)를 선별하였다 (도 2).
상기 두 가지 방법으로 분석한 바이오마커 후보 유전자들 중 4개의 유전자는 공통적인 유전자로 확인되었으며, 이에 전체 바이오마커 후보유전자는 7개를 확보하였다 (표 1). 또한, CpG 마이크로 어레이 분석에서 과메틸화를 보이는 이들 7개의 유전자들의 각 프로브에 해당하는 부위의 염기서열에 대해서 MethPrimer (http://itsa.ucsf.edu/~urolab/ methprimer/index1.html)을 이용하여 CpG islands가 존재하는 것을 확인하였다.
표 1 장암 진단용 메틸화 바이오 마커 후보유전자 목록
후보유전자 프로브 위치a GenBank No. Description
CHST11 ＋501, ＋605 NM_018413 carbohydrate(chondroitin4) sulfotransferase 11
IRX1 ＋809, ＋956, ＋1, 021, ＋1, 097 NM_024337 iroquois homeobox 1
IRX5 ＋2,647,＋2,724 NM_005853 iroquois homeobox 5
KCNA1 -1,853,-1,612 NM_000217 potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, member 1 (episodic ataxia with myokymia)
SDC2 +1,168, +1,282 NM_002998 Syndecan 2
SIM1 -1,242, -1,178 NM_005068 single-minded homolog 1 (Drosophila)
SORCS3 +1,478, +1,519 NM_014978 sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3
a, 전사개시부위 (+1)로부터의 염기서열 거리 (bp)
실시예 2: 암 세포주에서의 바이오마커 유전자의 메틸화 측정
실시예 1에서 선별된 바이오마커 후보 유전자의 메킬화 상태를 추가적으로 확인하기 위하여, 각각의 프로모터 또는 인트론 부위에 대해 파이로시퀀싱을 수행하였다.
바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 장암 세포주 Caco-2 (한국세포주은행 (KCLB No. 30037.1)와 HCT116 (한국세포주은행 (KCLB No. 10247)으로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.
상기 7개의 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2 및 표 3과 같다.
표 2
Figure PCTKR2010007030-appb-T000001
a Y = C 또는 T, R = A 또는 G
b전사 개시점 (+1)으로부터의 거리(nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치
표 3
Figure PCTKR2010007030-appb-T000002
상기의 바이파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.
상기 바이오마커 후보 유전자의 장암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 3A에서 나타난 바와 같이, 상기 7개의 바이오 마커 유전자 모두가 최소 1개 이상의 세포주에서 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 상기 7개의 유전자는 장암 세포주에서 높은 메틸화 수준을 나타냄으로써, 장암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 가질 가능성을 보여주었다. 이에 다음과 같이, 이를 검증하기 위하여 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 추가로 진행하였다.
실시예 3: 정상인 장 조직에서의 바이오마커 후보유전자의 메틸화 측정
실시예 1의 7개의 바이오마커 후보유전자가 장암 진단용 마커로서의 유용성을 가지려면, 환자가 아닌 정상인의 장조직에서는 낮은 메틸화 수준을 나타내어야 하고, 반면에 장암 조직에서는 높은 메틸화 수준을 나타내어야 한다.
따라서, 이를 검증하기 위하여, 1차적으로 환자가 아닌 정상인 2명의 장조직(Biochain사)으로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.
상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. 이때, 실시예 2와 동일하게 표 2의 PCR 프라이머와 표 3의 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 7개의 유전자중 IRX1, IRX5, KCNA1 및 CHST11은 정상조직에서 40% 이상의 높은 메틸화 수준을 나타내어, 바이오마커로서의 유용성이 없는 것으로 판단되었으며, 따라서 바이오마커 후보에서 제외시켰다. 반면에 SIM1, SDC2 및 SORCS3는 상대적으로 낮은 메틸화 정도를 나타내었다. 따라서, 이들 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자의 바이오마커로서의 유용성을 다음과 같이, 장암환자 조직을 대상으로 검증하였다.
실시예 4: 장암환자 조직에서의 바이오 마커 유전자의 메틸화 측정
정상인 장조직에서 낮은 메틸화 수준을 보이는 것으로 나타난 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자의 장암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위하여 12명의 장암환자 수술조직(보건복지가족부 지정 연세대학교 국가지정 바이오칩 센터)으로부터 확보한 장암조직과 이와 연접하는 정상소견조직으로 게놈 DNA를 분리하였다.
상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.
상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. 이때, 실시예 2와 동일하게 표 2의 PCR 프라이머와 표 3의 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
상기 3개 유전자의 메틸화 정도를 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, SDC2와 SIM1 유전자는 12명의 환자 전부(100%)에서 장암조직에서 이와 연접하는 정상소견 조직에 비하여 높은 메틸화 수준을 나타내었다. 그리고 SORCS3 유전자는 12명의 환자중 10명(83.3%)의 장암 조직에서 높은 수준의 메틸화를 나타내어 3개의 유전자 전부가 장암 진단용 메틸화 바이오마커로서의 유용성이 매우 높은 것을 확인하였다. 표 4는 3개 바이오마커 유전자의 장암조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직에서의 메틸화 평균값을 나타낸 것이다. 장암조직과 정상소견조직의 메틸화 수준이 통계적으로 유의하게 차이나는지를 확인하기 위하여 카이스퀘어 테스트를 수행하였고, 그 결과, 3개 유전자 전부가 p 값이 0.01 이하로 높은 유의수준을 나타내는 것을 확이할 수 있었다 (표 4).
표 4
Figure PCTKR2010007030-appb-T000003
a 카이스퀘어 테스트 결과 얻은 p 값
실시예 5: 3개 바이오 마커 유전자의 장암 진단능력 평가
실시예 4에서 장암 마커로서의 유용성을 확인한 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자에 대하여, 추가적으로 장암 진단에 대한 능력을 평가하기 위하여 MedCalc 프로그램 (MEDCALC, 벨기에)을 이용한 ROC 커브 (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 100%, SIM1 유전자는 83.3%, 100% 그리고 SORCS3 유전자는 83.3% 및 100%를 나타내어 장암 진단에 대한 능력이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
이에 추가적으로 상기 3개의 바이오마커 중 장암 조직에서 진단능력이 가장 우수한 SDC2 유전자를 이용하여 대변시료에서의 장암 진단능력을 평가하였다.
이를 위하여 nested methylation-specific PCR(MSP) 기법을 이용하여 4명의 정상인 및 10명의 장암환자의 대변시료 (보건복지부 지정 연세대학교 바이오칩 연구센터)로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA 4㎍에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 nested MSP 실험에 사용하였다. Nested MSP 실험에 사용한 프라이머 서열은 표 5와 같다.
표 5
Figure PCTKR2010007030-appb-T000004
상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 1ug을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 1ug, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), Outer PCR 프라이머 2㎕(5pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 30회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물 1/2을 취하여 동일한 방법으로 45회 PCR을 수행하고, PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 4명의 정상인에서는 전혀 메틸화가 관찰되지 않은 반면, 10명의 장암환자중 6명 (60%)에서 메틸화가 관찰되어 대변을 이용한 장암진단에도 유용한 것을 확인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 장암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 장암을 진단할 수 있어 유용하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (17)

  1. 다음 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법:
    (a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 임상샘플의 DNA로부터 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 단계:
    (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
    (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
    (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 SDC2 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 SIM1 유전자의 프로모터 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 SORCS3 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물:
    (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
    (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
    (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
  9. 제8항에 있어서, 상기 CpG섬은 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 장암 진단용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 CpG 섬은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 SDC2 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 장암 진단용 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 CpG 섬은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 SIM1 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 장암 진단용 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 CpG 섬은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 SORCS3 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 장암 진단용 조성물.
  13. 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트:
    (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
    (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
    (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
  14. 제13항에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 12 및 13; 서열번호 14 및 15; 및 서열번호 16 및 17로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  15. 제13항에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 22 내지 24로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 진단용 키트.
  16. 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩:
    (i) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);
    (ii) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및
    (iii) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).
  17. 제16항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 33 내지 44로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 핵산 칩.
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