WO2011048766A1 - 自己免疫疾患治療に用いる新規抗原としての炭酸脱水酵素ｉ - Google Patents

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英広 村上
浩文 山西
森一 恩地
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Definitions

  • the present invention relates to a method for treating an autoimmune disease using antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease and ulcerative colitis is a disease characterized by a breakdown of the immune system in the intestinal tract.
  • Immunomodulation in the microenvironment needs to be constantly fine-tuned to maintain local homeostasis. Such adjustments are specific to the site (eg, gastrointestinal environment) and are believed to be induced by chronic exposure to microorganisms.
  • Dendritic cells play a critical role in controlling this regulation (see Non-Patent Document 4). Dendritic cells are the most powerful and effective antigen presenting cells and are important for the induction of an initial immune response. Dendritic cells also play an important role in the formation of immune tolerance. It has been reported that dendritic cells induce antigen-specific immune tolerance in central and peripheral lymphoid organs in situ (see Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 7 For selective enhancement of the immunotolerogenicity of dendritic cells, use immature dendritic cells obtained by pharmacologically inhibiting dendritic cell maturation or genetically modified dendritic cells expressing immunosuppressive molecules (See Non-Patent Document 7).
  • studies using mouse models have shown that several types of tolerogenic or regulatory dendritic cells can improve antigen-specific pathology in a wide range of diseases such as autoimmunity, allergies, and rejection in transplantation. Have been reported (see Non-Patent Documents 6 and 8 to 11).
  • Cecal bacterial antigen (hereinafter referred to as “CBA”) is one of the substances that are assumed to be involved in the pathology of inflammatory bowel disease. It has been reported that severe enteritis develops by transplanting CBA-reactive interleukin (IL) -17-producing CD4 + T cells into severe combined immunodeficiency model mice (Non-patent Documents 12 to 14). reference). Although CBA is expected to be composed of several proteins, there is no report analyzing which protein is a specific antigen in inflammatory bowel disease.
  • IL interleukin
  • CA I carbonic anhydrase I
  • regulatory dendritic cells pulsed with CA I have a therapeutic effect on inflammatory bowel disease in an antigen-specific manner in a mouse model.
  • the present invention has been completed. Specifically, CBA was analyzed by two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS), and it was confirmed that the main protein of CBA was CAI. Further, when regulatory dendritic cells were pulsed using the confirmed CA I, it was found that an antigen-specific enteritis suppression action was induced in colitis model mice. Furthermore, it has been found that antigen-specific enteritis suppressing action is induced in colitis model mice also by directly administering CAI.
  • 2D-DIGE two-dimensional difference gel electrophoresis
  • TOF-MS time-of-flight mass spectrometry
  • the present invention relates to a method for treating autoimmune diseases using antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells, and in particular, using CA I as an antigen to produce antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells. It is related with the treatment method of the autoimmune disease (especially inflammatory bowel disease) characterized by this.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • the pharmaceutical composition according to (1), wherein the treatment or prevention of an autoimmune disease is cell therapy based on tolerogenic antigen-presenting cells.
  • the pharmaceutical composition according to (2), wherein the tolerogenic antigen-presenting cell is a regulatory dendritic cell.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a tolerogenic antigen-presenting cell specific for CA I for use in the treatment or prevention of an autoimmune disease.
  • the pharmaceutical composition according to (5), wherein the tolerogenic antigen-presenting cell is a regulatory dendritic cell.
  • the composition according to (9), wherein the tolerogenic antigen-presenting cell is a regulatory dendritic cell.
  • (11) A method for inducing immune tolerance in a patient, which comprises using CA I.
  • a method for treating or preventing an autoimmune disease which comprises using CA I.
  • the treatment or prevention method according to (17), wherein the treatment or prevention is based on tolerogenic antigen-presenting cells.
  • the treatment or prevention method according to (17) or (18), wherein the tolerogenic antigen-presenting cell is a regulatory dendritic cell.
  • the antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells are antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells for use in inducing immune tolerance or treating or preventing autoimmune diseases (24) to ( 26) The manufacturing method of any one of 26.
  • cell therapy means a method for treating a disease characterized by administration of cells.
  • the cell may be a cell obtained from a patient receiving administration or a cell obtained from a different individual.
  • cells obtained from a patient receiving administration are preferably used.
  • cell therapy includes the steps of harvesting and separating cells, treating the cells, and administering the treated cells to a patient.
  • Cell therapy may also include the step of growing cells.
  • “cell therapy based on tolerogenic antigen-presenting cells” means a method for treating a disease characterized by administration of tolerogenic antigen-presenting cells.
  • Carbonic anhydrase I (CA I) is a metalloenzyme generally present in the cytoplasm and reversibly catalyzing the hydration reaction of carbon dioxide.
  • CA I does not need to be full-length CA I, and includes a partial peptide as long as it can induce immunogenic antigen-presenting cells specific for CA I. .
  • CA I (including partial peptides thereof, the same applies hereinafter) in this specification is a part of the amino acid sequence (as long as it is possible to induce immunogenic antigen-presenting cells specific to CA I ( (Several) may be substituted, deleted, added, and / or inserted.
  • CA I in the present specification may be 50% or more, 60% or more, 75% or more with the amino acid sequence of CA I as long as it can induce immunogenic antigen-presenting cells specific for CA I. It may consist of an amino acid sequence having 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology.
  • CA I in this specification can induce immunogenic antigen-presenting cells specific for CA I, the CA I gene sequence and stringent conditions (Molecular Cloning, A Laboratory Manual) , Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)).
  • CA I may be appropriately modified in order to enhance immunological tolerance.
  • CA I may be a fusion protein with a substance that enhances immunological tolerance or another substance that has immunological tolerance.
  • CA I is an autoimmune disease (preferably, an immunogenic antigen presenting cell induced by the protein or peptide among the proteins or peptides included in CA I in the present specification induces immune tolerance. It is a protein or peptide that has a therapeutic or preventive effect on inflammatory bowel disease.
  • a “tolerogenic antigen-presenting cell” is an antigen-presenting cell that induces immune tolerance.
  • the tolerogenic antigen-presenting cell may be a cell derived from a patient to be treated or a cell derived from other than the patient, but is preferably a patient-derived cell.
  • Examples of tolerogenic antigen-presenting cells include regulatory dendritic cells.
  • the “regulatory dendritic cells” are not particularly limited as long as they are a subset of dendritic cells involved in immune tolerance, sometimes called tolerogenic dendritic cells.
  • Regulatory dendritic cells have the effect of generating dendritic cells and regulatory T cells (for example, CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatory T cells) that have the effect of causing immunosuppression through the production of cytokines such as interleukin-10. And / or dendritic cells having an action of controlling the function of T cells.
  • regulatory dendritic cells include dendritic cells that do not express costimulatory molecules such as CD40, CD80, and CD86 on the cell surface, and dendritic cells that express CCR9 on the cell surface (Hadeiba, H, et al. (2008) Nat. (1): 48-59), and dendritic cells (Sato, K et al. (2009) Blood., 1173: 4780-9) expressing CD200receptor3 on the surface.
  • Regulatory T cells are T cells that function to suppress the activity of T cells that can cause tissue damage.
  • the regulatory T cell may be a cell derived from a patient to be treated or a cell derived from other than the patient, but is preferably a patient-derived cell.
  • the regulatory T cell is a T cell expressing Foxp3, CD4 and CD25 molecules on the cell surface.
  • a “naive T cell” is a T cell that is not in contact with a specific antigen, and is preferably a CD4 + CD25 ⁇ naive T cell.
  • Immunotolerance means a decrease in the level of immune response, a delay in the occurrence or progression of the immune response, and / or a reduction in risk due to the immune response.
  • Antigen-specific immune tolerance refers to the occurrence of immune tolerance, particularly with respect to an antigen compared to other antigens.
  • autoimmune disease means a disease that develops when an immune response occurs against a self-antigen.
  • the autoimmune disease includes inflammatory bowel disease.
  • “Inflammatory bowel disease” is a disease characterized by chronic persistent enteritis, and includes ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • Cell therapy using CA I of the present invention as an antigen is useful as a method for treating or preventing autoimmune diseases because it improves the symptoms of autoimmune diseases, particularly inflammatory bowel diseases, which have been difficult to treat. It is.
  • FIG. 1 It is a dot plot figure which shows the result of having analyzed the expression of the cell surface molecule
  • “Mature DCs” indicates mature dendritic cells
  • “Reg-DCs” indicates regulatory dendritic cells.
  • the vertical axis indicates the expression level of CD11c
  • the horizontal axis indicates the expression levels of CD40, CD80, and CD86 in order from the left.
  • the vertical axis indicates the expression level of I-A / I-E
  • the horizontal axis indicates the expression level of the H-2K d.
  • the vertical axis represents Foxp3 expression
  • the horizontal axis represents CD25. Is shown. “Regulatory DC” shows the results of measuring flow cytometry of Foxp3 and CD25 expression when CD4 + CD25 ⁇ T cells were stimulated with regulatory dendritic cells.
  • the vertical axis represents Foxp3 expression
  • the horizontal axis represents Foxp3 expression.
  • CD25 expression is shown. It is a figure which shows the result of having calculated the ratio of the produced
  • CD4 + CD25 + Tcell indicates the percentage of the generated CD4 + CD25 + T cell numbers
  • CD4 + CD25 + Foxp3 + / CD4 + CD25 + Tcell is generated CD4 + CD25 + T The percentage of CD4 + CD25 + Foxp3 + T cells in the cells is shown. Error bars indicate SD. The asterisk indicates that P ⁇ 0.01 compared to the results for mature dendritic cells. It is a figure which shows the result of the experiment using the mouse
  • FIG. 5A is a graph showing the time course of weight change (%).
  • the vertical axis represents weight change (%), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after cell transplantation.
  • triangles indicate mice not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells; white circles indicate mice transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered PBS; black circles indicate CD4 + CD25 ⁇ T Mice transplanted with cells and administered regulatory dendritic cells not pulsed with antigen; open squares represent mice implanted with regulatory dendritic cells transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and pulsed with KLH Black squares indicate mice that received CD4 + CD25 ⁇ T cells transplanted and administered regulatory dendritic cells pulsed with CBA. Error bars indicate SD.
  • 5B is a photograph showing macroscopic findings of the large intestine 28 days after CD4 + CD25 ⁇ T cell transplantation.
  • SCID indicates a mouse not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells;
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + PBS was transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered PBS.
  • SCID + CD4 + CD25 - Tcells + Reg-DC indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 - T cells and administered with regulatory dendritic cells not pulsed with antigen
  • SCID + CD4 + CD25 - Tcells + Reg- indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered with regulatory dendritic cells pulsed with KLH
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + Reg-DC CBA indicates CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • Transplant and pulse with CBA 1 shows mice administered with the regulated regulatory dendritic cells. The lower right bar indicates 10 mm.
  • FIG. 5C It is a graph which shows the result of having measured the length of the large intestine of FIG. 5B.
  • the vertical axis represents the length (cm) of the large intestine
  • the horizontal axis represents the mouse used for measuring the length of the large intestine. Error bars indicate SD.
  • FIG. 5D is a photograph showing the results of staining the large intestine 28 days after CD4 + CD25 ⁇ T cell transplantation with hematoxylin and eosin (H & E).
  • the upper photograph shows a photograph magnified 40 times
  • the lower photograph shows a photograph magnified 200 times.
  • FIG. 5E It is a graph which shows the result of having calculated the histological score.
  • the vertical axis represents the histological score
  • the horizontal axis represents the mouse used for measurement of the histological score.
  • the horizontal line in the graph indicates the median value.
  • An asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice, and a double asterisk indicates that P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • PBS represents a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered PBS, and Reg-DC CBA transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and pulsed with CBA was controlled.
  • mouth which administered the dendritic cell is shown.
  • FIG. 6A is a graph showing the results of quantification of cytokine mRNA expression in the large intestine by real-time RT-PCR 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • the vertical axis represents the expression level of each cytokine mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA.
  • FIG. 6B The concentration of cytokine in the culture supernatant of colon cells collected 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells for 3 days ex vivo was measured by ELISA and cytometric bead array method (BD Biosciences Pharmingen).
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the expression of transcription factors and inflammatory cytokines in mesenteric lymphocytes (hereinafter referred to as “MLN”) of a mouse colitis model induced by CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • MNN mesenteric lymphocytes
  • the graph shows the mean value ⁇ SD.
  • PBS represents a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered PBS
  • mouth which administered the dendritic cell is shown.
  • FIG. 7A is a graph showing the results of quantification of transcription factor mRNA expression in MLN by real-time RT-PCR 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • the vertical axis represents the expression level of each transcription factor mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA.
  • FIG. 7B A graph showing the results of quantification of cytokine mRNA expression in MLN by real-time RT-PCR 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • the vertical axis represents the expression level of each cytokine mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA.
  • FIG. 7C ELISA, cytometric beads in cytokine concentration in culture supernatant of MLN collected 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells cultured for 72 hours in the presence of 25 ng / mL PMA and 1 ⁇ g / mL ionomycin It is a graph which shows the result measured by the array method (BD Biosciences Pharmingen). In the figure, the vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of each cytokine.
  • FIG. 8A is a dot plot showing the results of flow cytometry measurement of MLN collected one week after CD4 + CD25 ⁇ T cell transplantation.
  • the leftmost figure shows the results of measuring the expression of isotype control IgG and CD25 of BALB / C splenocytes by flow cytometry, the vertical axis shows the expression of isotype control IgG, and the horizontal axis shows the expression of CD25. .
  • FIG. 8B is a graph showing the ratio of Foxp3 + CD4 + CD25 + T cells in MLN collected 1, 3 and 5 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells. An asterisk indicates that P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • FIG. 8C is a diagram showing the results obtained by measuring the MLN collected 7 days after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells by flow cytometry in a dot plot.
  • the leftmost figure shows the results of measuring the expression of isotype control IgG and CD25 of BALB / C splenocytes by flow cytometry, the vertical axis shows the expression of isotype control IgG, and the horizontal axis shows the expression of CD25.
  • PBS shows the results of measuring the expression of IL-10 and CD25 by flow cytometry when PBS is administered, the vertical axis shows the expression of IL-10, and the horizontal axis shows the expression of CD25.
  • Regular-DC CBA shows the results of measurement of IL-10 and CD25 expression by flow cytometry when CBA-pulsed regulatory dendritic cells were administered, and the vertical axis represents IL-10 expression.
  • the horizontal axis shows the expression of CD25.
  • FIG. 8D is a graph showing the percentage of IL-10 + CD4 + CD25 + T cells in MLN collected 2, 4, 7 and 14 days after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • An asterisk indicates that P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • white circles indicate mice administered with regulatory dendritic cells pulsed with CBA, and white triangles indicate mice administered with PBS.
  • the vertical axis shows the percentage of IL-10 + CD4 + CD25 + T cells (%), and the horizontal axis shows the elapsed time (days) from transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells. It is a photograph which shows the result of having dye
  • the spots were labeled according to the numbers listed in Table 1.
  • the numerical value on the right in the figure indicates the molecular weight (kDa) of the marker.
  • the numerical value at the top of the figure indicates the pH of isoelectric focusing.
  • the upper photograph shows a photograph magnified 40 times
  • the lower photograph shows a photograph magnified 200 times.
  • SCID indicates a mouse not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + PBS transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered PBS
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + Reg ⁇ DC CBA denotes mice that have been implanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered regulatory dendritic cells pulsed with CBA.
  • CD4 + CD25 - mice colitis model induced by T cell is a graph showing the results of administration of regulatory dendritic cells pulsed with CA I. In the horizontal axis of FIGS.
  • SCID indicates a mouse not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + PBS transplants CD4 + CD25 ⁇ T cells and PBS
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + Reg ⁇ DC CBA indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered with regulatory dendritic cells pulsed with CBA
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ Tcells + Reg” -DC CA1-control is control in which the information was developed according to the cell-free protein synthesis system like the CA I in empty plasmid which does not incorporate the gene sequence of CA I and CA I-control thereby pulse It indicates mice treated with sex dendritic cells
  • SCID + CD4 + CD25 - Tcells + Reg-DC CA1 is, CD4 + CD25 - transplanted T cells, indicating the mice administered with the control dendritic cells pulsed with CA I.
  • FIG. 11A It is a graph which shows the time passage of a weight change (%). In the figure, the vertical axis represents weight change (%), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after cell transplantation.
  • triangles indicate mice not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells; white circles indicate mice transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells and administered with PBS; black squares indicate CD4 + CD25 ⁇ .
  • FIG. 11B is a graph showing the results of measuring the length of the large intestine 28 days after the transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • the vertical axis represents the length (cm) of the large intestine
  • the horizontal axis represents the mouse used for measuring the length of the large intestine. Error bars indicate SD.
  • Double asterisks indicate P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • FIG. 11C It is a graph which shows the result of having calculated the histological score.
  • FIG. 11D is a graph showing the results of quantifying inflammatory cytokine mRNA expression in the large intestine by real-time RT-PCR 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells. The graph shows the mean value ⁇ SD.
  • FIG. 11E is a graph showing the results of quantification of mRNA expression of transcription factors and inflammatory cytokines in MLN 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells, by real-time RT-PCR. The graph shows the mean value ⁇ SD.
  • the vertical axis represents the expression level of each transcription factor mRNA and each cytokine mRNA with respect to the amount of GAPDH mRNA.
  • FIG. 11F is a graph showing the results of measuring the cytokine concentration in the culture supernatant obtained by culturing the large intestine collected 4 weeks after the transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells for 3 days ex vivo by ELISA. The graph shows the mean value ⁇ SD.
  • the vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of each cytokine.
  • an asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice. Double asterisks indicate P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice. (FIG.
  • FIG. 12 shows the results of a CD4 + CD25 ⁇ T cell transfer enteritis model mouse in which enteritis was induced by transferring CD4 + CD25 ⁇ T cells after administration of PBS, mCA1-control, or mCA1 (FIGS. 12B to 12G are also shown). The same). It is a graph which shows the time passage of a weight change (%). In the figure, the vertical axis represents weight change (%), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after cell transplantation.
  • An asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the result of having measured the length of the large intestine 28 days after transplanting a CD4 + CD25 ⁇ T cell.
  • the vertical axis represents the length (cm) of the large intestine
  • the horizontal axis represents the mouse used for measuring the length of the large intestine.
  • SCID indicates a mouse not transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells
  • PBS + CD4 + CD25 ⁇ ⁇ SCID indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells after administration of PBS.
  • CA1-control + CD4 + CD25 ⁇ ⁇ SCID indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells after administration of a protein synthesized with empty plasmid (mCA1-control) not incorporating the CA I gene sequence.
  • CA1 + CD4 + CD25 ⁇ indicates a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells after administration of mCA1 (the same applies to FIG. 12C). Error bars indicate SD. In each group, 6-7 mice were used. An asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice, and a double asterisk indicates that P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of quantifying the expression of inflammatory cytokine mRNA in the large intestine by real-time RT-PCR 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells.
  • the graph shows the mean ⁇ SD of 5 mice.
  • the vertical axis represents the expression level of each cytokine mRNA relative to the amount of GAPDH mRNA.
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ + PBS represents a mouse transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells after administration of PBS;
  • SCID + CD4 + CD25 ⁇ + CA1 represents CD4 + CD25 ⁇ after administration of CA I. Mice transplanted with T cells are shown (the same applies to FIGS.
  • FIG. 12E to 12G an asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice.
  • 3 is a graph showing the results of quantifying mRNA expression of transcription factors and inflammatory cytokines in MLN 4 weeks after transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells by real-time RT-PCR. The graph shows the mean ⁇ SD of 5 mice.
  • the vertical axis represents the expression level of each transcription factor mRNA and each cytokine mRNA with respect to the amount of GAPDH mRNA.
  • an asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice.
  • the concentrations of IL-6, MCP-1, TNF ⁇ , and IL-17 secreted in the culture supernatant of the large intestine cultured ex vivo for 3 days were measured using the cytometric bead array method (BD Biosciences Pharmingen), ELISA (R & D Systems). It is a graph which shows the result measured by. The graph shows the mean value ⁇ SD. In the figure, the vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of each cytokine. In each group, 5-7 mice were used. In the figure, an asterisk indicates that P ⁇ 0.05 compared to PBS-administered mice. Double asterisks indicate P ⁇ 0.01 compared to PBS-administered mice.
  • CA I is designed with appropriate primers based on gene sequence information well known to those skilled in the art (for example, the mouse CA I gene sequence is shown in SEQ ID NO: 1 and the human CA I gene sequence is shown in SEQ ID NO: 3). It can be obtained by preparing and introducing it into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. and expressing them. Alternatively, CA I can be prepared according to a cell-free protein synthesis system using wheat germ ribosomal RNA (Madin K et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 559-64).
  • the partial peptide of CA I when using the partial peptide of CA I as CA I, it can manufacture using the method well-known to those skilled in the art used for amino acid synthesis.
  • the partial peptide of CA I can be prepared by chemical synthesis using the Fmoc method, the Boc method, or the like, or can be synthesized using an automatic peptide synthesizer.
  • a peptide synthesizer for example, PSSM-8 (Shimadzu Corporation); model 433A peptide synthesizer (Applied Biosystems, Inc.); ACT396 Apex (Advanced ChemTech Inc.) Etc. Mutation can be inserted into CA I (including its partial peptide) using methods well known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis.
  • the “method for inducing immune tolerance in a patient characterized by using CA I” of the present invention is a method for inducing immune tolerance including directly administering CA I to a patient, and tolerogenicity ex vivo. And a method of inducing immune tolerance comprising pulsing antigen-presenting cells with CA I.
  • the “method of treating or preventing an autoimmune disease characterized by using CA I” of the present invention is a method of treating or preventing an autoimmune disease comprising directly administering CA I to a patient, and ex A method of treating or preventing an autoimmune disease comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I in vivo.
  • the administration site is oral administration, intranasal administration, intratracheal administration, subcutaneous administration, intravascular (intravenous) ) Administration, etc., preferably oral administration.
  • the preparation include injections, capsules, tablets, syrups, granules, and sprays.
  • the administration method is not particularly limited as long as a desired therapeutic effect or preventive effect can be obtained, and preferably administered orally.
  • administration may be performed temporarily and may be performed continuously or intermittently. For example, as the administration frequency, for example, single administration, administration 1 to 4 times per week, or intermittent administration such as once every 1 to 3 months can be selected.
  • the dose is not particularly limited as long as the desired therapeutic effect or preventive effect is obtained, and can be appropriately determined depending on symptoms, sex, age and the like.
  • the dose can be determined using, for example, the degree of production of antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells or antigen-specific regulatory T cells, or the therapeutic or preventive effect of autoimmune disease as an index.
  • the dose of the antigen at one time is 0.01 ng / kg to 10 mg / kg, more preferably 0.1 ng / kg to 1 mg / kg, still more preferably 0.5 ng to 100 ⁇ g / kg. Most preferably, it is 1 ng to 10 ⁇ g / kg.
  • CA I may be administered together with other drugs such as immunosuppressive agents such as cyclosporine and tacrolimus.
  • CA I and the other drugs may be administered simultaneously or separately at different times. .
  • the method of inducing immune tolerance including pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed, for example, by the following steps: Preparing a tolerogenic antigen-presenting cell; Pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I; and Administering a pulsed tolerogenic antigen-presenting cell to a patient inducing immune tolerance.
  • the method of inducing immune tolerance including pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo of the present invention can be performed, for example, by the following steps. Preparing a regulatory dendritic cell derived from a patient; Pulsing regulatory dendritic cells with CA I; and Administering a pulsed regulatory dendritic cell to a patient inducing immune tolerance;
  • a method of treating or preventing an autoimmune disease comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed, for example, by the following steps: Preparing a tolerogenic antigen-presenting cell; Pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I; and Administering pulsed tolerogenic antigen-presenting cells to a patient with an autoimmune disease.
  • a method of treating or preventing autoimmune disease comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed by the following steps: Preparing a regulatory dendritic cell derived from a patient; Pulsing regulatory dendritic cells with CA I; and Administering pulsed regulatory dendritic cells to a patient with an autoimmune disease.
  • Regulatory dendritic cells that are tolerogenic antigen-presenting cells, for example, collect bone marrow cells from patients and in the presence of GM-CSF, IL-10, and human transforming growth factor- ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1) It can be prepared by culturing for 8 days and stimulating for 24 hours in the presence of ultra-high purity LPS. Alternatively, peripheral blood is collected, and the mononuclear cell fraction is separated and collected by a method well known to those skilled in the art, and in the presence of GM-CSF, IL-10, and human transforming growth factor- ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1). It can be prepared by culturing for 8 days and stimulating for 24 hours in the presence of ultra-high purity LPS. In addition, the purity of the prepared regulatory dendritic cells can be increased by removing the dendritic cells expressing the costimulatory molecule.
  • Pulses of tolerogenic antigen-presenting cells by CA I can be performed by culturing tolerogenic antigen-presenting cells in the presence of CA I.
  • the cells are administered intravascularly (intravenously).
  • administration may be performed temporarily and may be performed continuously or intermittently.
  • the administration frequency is preferably a single administration, 1 to 4 administrations per week, and more preferably a single administration or once a week administration.
  • intermittent administration such as once every 1 to 3 months can be selected.
  • the dose is not particularly limited as long as the desired therapeutic effect or preventive effect is obtained, and can be appropriately determined depending on symptoms, sex, age and the like.
  • the dose is determined using, for example, the degree of immune tolerance, the number of antigen-specific regulatory dendritic cells and / or regulatory T cells in the patient's blood, or the therapeutic or prophylactic effect of autoimmune disease as an index. be able to.
  • the dose of one cell is 1 ⁇ 10 6 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, more preferably 1 ⁇ 10 7 cells to 1 ⁇ 10 9 cells, and even more preferably 5 ⁇ 10 6 cells. 7 to 5 ⁇ 10 8 cells, most preferably 1 ⁇ 10 8 cells.
  • Pulsed tolerogenic antigen-presenting cells may be administered together with other drugs such as cyclosporine, tacrolimus and other immunosuppressive agents.
  • CA I and the other drugs may be administered simultaneously or separately at different times. May be administered.
  • a method for inducing immune tolerance including pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo, and an autoimmune disease including pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo.
  • the treatment or prevention method may further include a step of inducing regulatory T cells specific for CA I ex vivo.
  • a method of inducing immune tolerance comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed by the following steps: Preparing tolerogenic antigen-presenting cells and naive T cells; Pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I; Contacting the pulsed tolerogenic antigen-presenting cells with naive T cells to induce regulatory T cells; and Administering the induced regulatory T cells to a patient inducing immune tolerance.
  • the method of inducing immune tolerance comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed, for example, by the following steps: Preparing patient-derived regulatory dendritic cells and naive T cells; Pulsing regulatory dendritic cells with CA I; Inducing regulatory T cells by contacting pulsed regulatory dendritic cells with naive T cells; and Administering the induced regulatory T cells to a patient inducing immune tolerance.
  • a method for treating or preventing an autoimmune disease comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed by the following steps: Preparing tolerogenic antigen-presenting cells and naive T cells; Pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I; Contacting the pulsed tolerogenic antigen-presenting cells with naive T cells to induce regulatory T cells; and Administering induced regulatory T cells to a patient with an autoimmune disease.
  • a method of treating or preventing an autoimmune disease comprising pulsing tolerogenic antigen-presenting cells with CA I ex vivo can be performed by the following steps: Preparing patient-derived regulatory dendritic cells and naive T cells; Pulsing regulatory dendritic cells with CA I; Contacting the pulsed regulatory dendritic cells with naive T cells to induce regulatory T cells; and Administering induced regulatory T cells to a patient with an autoimmune disease.
  • naive T cells can be isolated from peripheral blood or spleen cells using a CD4 + CD25 + regulatory T cell isolation kit and AutoMACS (Miltenyi Biotech) according to the manufacturer's manual. .
  • the purity of naive T cells can be confirmed by FACS analysis using peridinin chlorophyll protein (PerCP) labeled anti-CD4 monoclonal antibody and phycoerythrin (PE) labeled anti-CD25 monoclonal antibody.
  • PerCP peridinin chlorophyll protein
  • PE phycoerythrin
  • Induction of regulatory T cells by pulsed regulatory dendritic cells can be achieved by, for example, culturing 5 ⁇ 10 6 naive T cells together with 5 ⁇ 10 5 regulatory dendritic cells for 7 days in 1 mL of RPMI medium. You can get it.
  • the administration of the induced regulatory T cells to the patient can be performed in the same manner as the administration of the pulsed tolerogenic antigen-presenting cells to the patient.
  • the “pharmaceutical composition containing CA I as an active ingredient for use in the treatment or prevention of autoimmune disease” of the present invention may be directly administered to a patient for the purpose of inducing immune tolerance. Or ex vivo, used to prepare antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells. In addition, when used to prepare antigen-specific tolerogenic antigen-presenting cells, the prepared tolerogenic antigen-presenting cells or regulatory T cells stimulated by the antigen-presenting cells are transferred to the patient according to the above method. Be administered.
  • “Pharmaceutical composition containing CAI-specific tolerogenic antigen-presenting cells for use in the treatment or prevention of autoimmune diseases as an active ingredient” is directly administered to patients for the purpose of inducing immune tolerance May be used, or may be used to prepare antigen-specific regulatory T cells ex vivo.
  • Tolerogenic antigen-presenting cells specific for CA I can be obtained by preparing a tolerogenic antigen-presenting cell according to the above method and pulsing the tolerogenic antigen-presenting cell with CA I.
  • the prepared tolerogenic antigen-presenting cells or regulatory T cells stimulated by the antigen-presenting cells are administered to the patient according to the method described above.
  • a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, regulatory T cells specific for CA I for use in the treatment or prevention of autoimmune diseases is directly administered to patients for the purpose of inducing immune tolerance. is there.
  • Regulatory T cells specific for CA I are collected tolerogenic antigen-presenting cells and naive T cells according to the above method, pulsed with CA I, and tolerogenic antigen-presenting cells are pulsed. It can be obtained by bringing cells into contact with naive T cells.
  • the prepared regulatory T cells are administered to the patient according to the method described above.
  • the composition containing CA I is an additive such as a stabilizer as appropriate in addition to CA I (see, for example, “Pharmaceutical Additives Encyclopedia” Yakuji Nippo, “Handbook of Pharmaceutical Excipients” APHA Publications) May be included.
  • other drugs such as immunosuppressants such as cyclosporine and tacrolimus may be further included.
  • the composition containing a tolerogenic antigen-presenting cell or regulatory T cell contains, in addition to the tolerogenic antigen-presenting cell or regulatory T cell, an additive suitable for cell therapy as appropriate. It may be.
  • Example 1 Detection of dendritic cell marker (1) Mice
  • B-17 SCID mice and BALB / c (H-2d) female mice were used (CLEA Japan, Tokyo, Japan). All mice were 8-12 weeks of age, and were maintained and maintained at 22 ° C., 55% humidity, 12 hours day / night rhythm with regular laboratory animal feed. All animals were housed according to good laboratory practice guidelines. This study was conducted with the approval of Ehime University Animal Experiment Committee.
  • Regulatory dendritic cells consisted of 2 ⁇ 10 6 bone marrow cells obtained from BALB / c mice, 20 ng / mL mouse GM-CSF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), mouse interleukin-10 (IL-10). (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and human transforming growth factor- ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were cultured for 8 days, and 1 ⁇ g / mL ultra-high purity LPS (InvivoGen) was present. Prepared by stimulation under 24 hours.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Dendritic cells were washed and resuspended in PBS containing 1% FBS and 0.2% sodium azide. After blocking Fc receptors with purified rat anti-mouse CD16 / CD32 monoclonal antibody (clone 2.4G2, BD Pharmingen), dendritic cells were treated with FITC-labeled anti-CD11c monoclonal antibody (clone HL3, BD Pharmingen), anti-CD80 monoclonal.
  • Bone marrow-derived mature dendritic cells expressed high levels of MHC molecules (H-2kd and IA / IE), CD11c, and costimulatory molecules (CD40, CD80, and CD86). In contrast, regulatory dendritic cells expressed moderate MHC molecules and very low levels of CD11c and costimulatory molecules.
  • Example 2 Comparison of Cytokines Expressed by Toll-like Receptor Ligand Stimulation 2 ⁇ 10 5 dendritic cells prepared in the same manner as in Example 1 were treated with 1 ⁇ g / mL polyinosinic acid-polycytidylic acid (polyI: C). ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 1 ⁇ g / mL ultrapure LPS, 1 ⁇ g / mL R848 (InvivoGen), or cytosine phosphorothiolate guanine oligonucleotide (CpG-ODN) (TCCATGACGTCTCGATGCT: sequence No.
  • polyI polyinosinic acid-polycytidylic acid
  • CpG-ODN cytosine phosphorothiolate guanine oligonucleotide
  • IL-10 and IL-6 in the culture supernatant were measured using a cytometric bead array kit (BD Biosciences Pharmingen) according to the manufacturer's manual.
  • CD4 + CD25 - T cell purification CD4 + CD25 - T cells from the spleen cells of BALB / c mice, with CD4 + CD25 + regulatory T cell isolation kit and AutoMACS the (Miltenyi Biotec) Isolated according to manufacturer's manual. FACS analysis using peridinin chlorophyll protein (PerCP) labeled anti-CD4 monoclonal antibody (BD Pharmingen) and phycoerythrin (PE) labeled anti-CD25 monoclonal antibody (Miltenyi Biotech) confirmed that the purity was 98% or higher. .
  • PerCP peridinin chlorophyll protein
  • PE phycoerythrin
  • CD4 + CD25 + T cells isolated from / c mice were cultured for 7 days with mature or regulatory dendritic cells isolated from 5 ⁇ 10 5 BALB / c mice.
  • PE-labeled anti-Foxp3 monoclonal antibody (clone FJK-16s, eBioscience, San Diego, CA, USA), allophycocyanin (APC) -labeled anti-CD25 monoclonal antibody (clone PC61, BD Pharmingen), and PerPC-labeled anti-CD4 Cells were stained with a monoclonal antibody (clone RM4-5, BD Pharmingen) according to the manufacturer's manual. Fluorescent staining was analyzed by flow cytometry using FloJo software.
  • Example 4 Treatment of colitis with CBA pulse-regulating dendritic cells Whether or not administration of regulatory dendritic cells has a therapeutic effect on colitis was examined by the following method.
  • BALB / c mice were euthanized and the cecum was removed. Five cecums were opened and added to 10 mL of phosphate buffered saline (PBS) containing 1.0 mm silica sepharose (Lysing Matrix C, MP Biomedicals, Solon, Ohio, USA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • silica sepharose and undissolved cells were removed by centrifugation at 5000 g for 5 minutes at 4 ° C. Subsequently, the supernatant was centrifuged at 18,000 g for 30 minutes at 4 ° C., and the lysate was sterilized by passing through a syringe filter having a pore size of 0.2 ⁇ m. The protein concentration of the lysate was measured using a DC protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • Controlling dendritic cells prepared by the same method as in Example 1 were prepared using 50 ⁇ g / mL CBA or 50 ⁇ g / mL keyhole limpet hemocyanin (KLH) ( Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA) was pulsed for 24 hours to generate CBA-pulsed dendritic cells (Reg-DCs CBA ) or KLH-pulsed dendritic cells (Reg-DCs KLH ), respectively.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • enterocolitis model was prepared according to a previously reported method (Kjellev S et al. (2006) Int. Immunopharmacol., 6: 1341-54).
  • the histology was scored according to the following: 1) Severity of inflammation: 0 None; 1 Mild lymphocyte infiltration; 2 Moderate lymphocyte infiltration or local crypt degeneration; 3 Severe inflammation or multiple locations 2) Degree of inflammation: 0 none; 1 mucosa; 2 submucosa; 3 transmurality; 3) mucus volume: 0 normal; 1 trace mucus reduction; 2 moderate mucus Reduced or localized mucus loss; 3 severe mucus loss; 4 complete mucus loss; and 4) degree of epithelial cell proliferation: 0 none; 1 moderate increase in cell number or crypt length; 2 moderate or Significant increase in local area; 3 Significant increase-in all parts of the section.
  • the histological score was calculated as the sum of four individual parameters.
  • mice treated with Reg-DCs CBA were significantly increased compared to mice receiving PBS (P ⁇ 0.01) (FIG. 5A).
  • the colon wall was thick and the colon length was short in the mice administered with PBS.
  • the length of the large intestine was significantly longer compared to mice administered with PBS (P ⁇ 0.01) (FIG. 5B, FIG. 5C).
  • colitis is characterized by severe epithelial hyperproliferation, mucus reduction, inflammatory cell infiltration, crypt degeneration, reduced goblet cell count, and erosion.
  • C. not receiving dendritic cells In B-17SCID mice, severe epithelial hyperproliferation, mucus reduction, inflammatory cell infiltration, crypt degeneration, and a decrease in the number of goblet cells were observed, and severe colitis was developed. Mice administered with regulatory dendritic cells that were not pulsed with antigen or Reg-DCs KLH also showed histological changes in the large intestine similar to those administered with PBS.
  • Example 5 Inflammatory cytokine expression in colon of enterocolitis model
  • the transverse colon of CBA- administered mice and PBS-administered mice was homogenized using TissueLyser (Qiagen, Tokyo, Japan).
  • Total RNA was extracted with the RNAeasy plus mini kit (Qiagen).
  • Complementary DNA (cDNA) was generated from 10 ⁇ g of RNA using a high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA).
  • IL-10, IL-6, and IL-17A mRNA in the large intestine obtained from enteritis mice was measured by real-time RT-PCR using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) expression as a control. Relative expression levels were calculated according to previously reported methods (Tokumoto Y et al. (2007) J. Med. Virol., 79: 1120-7).
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • IL-17, IL-10, IL-6, tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) in the culture supernatant were assayed by ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA), cytometric bead array kit (BD Biosciences Pharmingen).
  • Example 6 Expression of Transcription Factors and Inflammatory Cytokines in Mesenteric Lymph Node (MLN) Cells of Enteritis Model
  • MN Mesenteric Lymph Node
  • cDNA Complementary DNA
  • RNA was generated from 10 ⁇ g of RNA using a high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems).
  • MLN Foxp3 collected from enteritis mice and mRNA of retinoic acid-related orphan receptor gamma t (ROR ⁇ T) was measured by real-time RT-PCR using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) expression as a control. did.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • IL-6, interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in the culture supernatant were cytometric bead array kit ( BD Biosciences Pharmingen) according to the manufacturer's manual.
  • IL-17 in the supernatant was measured using an ELISA kit (R & D Systems).
  • Peripheral induction Reg-DCs CBA is in vivo of Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatory T cells and IL-10-producing CD4 + CD25 + T cells by Reg-DCs CBA in In vivo, Foxp3 - CD4 + CD25 - T cells from Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatory T cells and IL-10-producing CD4 + CD25 + T cells by the following method to see if it is possible to induce Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatory T The number of cells and IL-10 producing CD4 + CD25 + T cells was measured.
  • mice and MLN From Reg-DCs CBA- administered mice and PBS-administered mice transplanted with CD4 + CD25 ⁇ T cells prepared in the same manner as in Example 4, from the transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells, After 3 and 5 weeks, MLN was collected and cultured in 200 ⁇ L of RPMI 1640 medium for 72 hours in the presence of 25 ng / mL PMA (Sigma Chemical) and 1 ⁇ g / mL ionomycin (Sigma Chemical).
  • the cultured cells were stained with a PE-labeled anti-Foxp3 monoclonal antibody, an APC-labeled anti-CD25 monoclonal antibody, and a PerCP-labeled anti-CD4 monoclonal antibody according to the method recommended by the manufacturer. Fluorescent staining was analyzed by flow cytometry.
  • IL-10 producing CD4 + CD25 + regulatory T cell measurement To examine the proportion of IL-10 producing CD4 + CD25 + T cells in MLN, 2, 4, 7 and 14 from the transplantation of CD4 + CD25 ⁇ T cells. After days, MLN was collected and cultured in a U-bottom 96-well plate in 200 ⁇ L of RPMI 1640 medium in the presence of 25 ng / mL PMA (Sigma Chemical Co.) and 1 ⁇ g / mL ionomycin (Sigma Chemical Co.). GolgiStop (BD Pharmingen) was added for the last 3 hours.
  • the cells were then allowed to stand with PerCP-labeled anti-CD4 monoclonal antibody and APC-labeled anti-CD25 monoclonal antibody for 15 minutes at room temperature in the dark, fixed and permeabilized using FIX & PERM kit (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA). Processed. The cells were stained with PE-labeled rat anti-mouse IL-10 monoclonal antibody (clone JES5-16E3, D Pharmingen) for 20 minutes at room temperature. Fluorescent staining was analyzed by flow cytometry.
  • Example 8 Proteomic analysis of CBA (1) Preparation of CBA CBA was prepared according to the method described in Example 4. (2) 2D Gel Electrophoresis and Imaging Prior to isoelectric focusing, a 2-D cleanup kit (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, USA) was used on CBA samples. The resulting pellet was resuspended in lysis buffer (30 mM Tris-HCl, pH 8.5, 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, and PlusOne protease inhibitor mix). Dissolve the sample in swelling buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 0.5% IPG buffer pH 3-10, and 1% DTT) and immobiline at 24 ° C.
  • IPG gel was then equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue, 0.5% DTT for 15 minutes. After that, it was alkylated in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue, 4.5% iodoacetamide for 15 minutes.
  • the strip was applied to a 12.5% SDS-PAGE gel, and electrophoresed in an EttanDALTsix electrophoresis system (GE Healthcare Bioscience) at 2 W and 30 ° C. for 16 hours.
  • Gel staining was performed using Deep Purple Total Protein Stain (GE Healthcare Bioscience) according to a general protocol. After staining, the gel was scanned using an Ettan DIGE Imager (GE Healthcare Bioscience) and the image was analyzed using ImageMaster 2D Platinum (GE Healthcare Bioscience). Spots were quantified based on their relative volumes (spot volume divided by the total volume of all gel spots).
  • Example 9 CA I expressed CD4 + CD25 in colon - T cells not administered SCID mice, according to the method described in Example 4 CD4 + CD25 - T SCID mice who developed enterocolitis by cells and, Expression of CA I in the large intestine of SCID mice administered with CD4 + CD25 ⁇ T cells and Reg-DCs CBA was examined by immunohistochemical staining.
  • (1) Immunohistochemical staining A 5 ⁇ m frozen tissue section of the large intestine was fixed with acetone. Endogenous peroxidase activity was inactivated by treatment with methanol containing 1% hydrogen peroxide for 20 minutes followed by treatment with PBS containing 0.1% Tween-20 for 10 minutes.
  • Sections inactivated with endogenous avidin / biotin blocking kit were pretreated with rabbit serum (Nichirei, Inc.), and 1:50 diluted biotinylated goat anti-human CA I antibody (Rockland) , Philadelphia, Pennsylvania, USA) at 4 ° C. overnight. Thereafter, the sections were treated with horseradish fusion streptavidin (Nichirei Co., Ltd.) and allowed to stand with a simple stain DAB solution (Nichirei Co., Ltd.). Finally, the sections were counterstained with hematoxylin, dried and used as specimens.
  • Example 10 Treatment effect of colitis by CA I pulse-regulated dendritic cells Whether regulatory dendritic cells pulsed with CA I improve enteritis in CD4 + CD25 ⁇ T cell-transferred inflammatory bowel disease model mice Therefore, regulatory dendritic cells pulsed with CA I were administered to CD4 + CD25 ⁇ T cell-administered mice, and their effects were examined.
  • (1) Preparation of mouse CA I Since mouse CA I has no risk of LPS contamination, it was prepared according to a cell-free protein synthesis system using wheat germ ribosomal RNA (Madin K et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 559-64).
  • An expression plasmid (pEU-mCA1-His) was prepared according to the following procedure.
  • the mouse CA1 gene was prepared using the following primers mCA1F and mCA1R, each 0.3 ⁇ M, using KOD-Plus-Ver. Amplification was performed using 2 kits (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan).
  • mCA1F 5′-AATAAGATACATGGGCAGAGGCAGACTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • mCA1R 5′-TGCTGGACTAGTAAAATGAGGCTCTGACTGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • CA I was synthesized as previously reported (Sawasaki T et al.
  • CA I-control was prepared according to the cell-free protein synthesis system in the same manner as the above CA I preparation using empty plasmid that did not incorporate the CA I gene sequence.
  • Regulatory dendritic cells were prepared according to the method described in Example 1. The prepared regulatory dendritic cells were pulsed with 6 ⁇ g / mL of CA I or CA I-control for 24 hours, and CA I pulse-control dendritic cells (Reg-DCs CA1 ) or CA I-control pulse-controlling trees, respectively. Dendritic cells (Reg-DCs CA1-control ) were generated.
  • enteritis model was prepared according to the method described in Example 4.
  • MLN mRNA expression of transcription factors and inflammatory cytokines in MLN The expression of MLN mRNA of IL-17, IL-10, TGF- ⁇ , Foxp3, and ROR ⁇ T was measured according to the method described in Example 6.
  • mice administered Reg-DCs CA1 had significantly increased Foxp3 expression compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 11E).
  • ROR ⁇ T mRNA expression was reduced in mice administered Reg-DCs CA1 compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 11E).
  • Analysis of the culture supernatant of the large intestine revealed that IL-17, IFN- ⁇ and TNF- ⁇ production was significantly lower in the large intestine of mice administered with Reg-DCs CA1 than in mice administered with PBS. (P ⁇ 0.05) (FIG. 11F).
  • Reg-DCs CA1 significantly reduced the production of IL-6, IL-17, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and MCP-1 in MLN cells of enterocolitis mice (P ⁇ 0. 01) (FIG. 11G).
  • mCA1 Mouse CA I cDNA
  • mCA1 was amplified using the following primers. Forward: ATGGCAAGTGCAGAACTGGGGGA (SEQ ID NO: 8) Reverse: CCTTGCGGATCCTCAAAATGAGGCTCTGAACTG (SEQ ID NO: 9)
  • the amplified DNA was inserted into the plasmid pET45b (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at the PshAI and BamHI sites to construct a pET-mCA1-His6 construct that expresses mCA1 having a 6 His tag at the N-terminus. did.
  • the constructed construct was confirmed by a cycle sequencing method.
  • His-CA1 was expressed in E. coli BL21 (DE3), purified by metal (Ni2 +) affinity chromatography, and dialyzed in PBS to remove imidazole. Endotoxin was removed using an EndTrap® red column (Hygros GmbH, Regensburg, Germany). After SDS-PAGE, the gel was stained with Deep Purple Total Protein Stain (GE Healthcare). Gel images were analyzed with ImageQuant TL (GE Healthcare) and protein purity was calculated. A control protein adjusted in the same manner as mCA1 using the empty plasmid pET45b was designated as CAI-control.
  • Bottles containing mCA1 in PBS were changed twice a day to avoid contamination. Continuous intake continued for 5 days.
  • PBS or CAI-control was administered for 5 days.
  • mice administered mCA1 were significantly increased compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 12A). Further, in macroscopic observation 4 weeks after transplantation, the colon length of the mice administered with mCA1 was significantly longer than that of mice administered with PBS (P ⁇ 0.001) (FIG. 12B). In histological scores, mice administered mCA1 showed significantly lower scores compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 12C).
  • IL-10 mRNA expression in the large intestine of inflammatory bowel disease model mice was significantly increased in mice administered mCA1 compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 12D).
  • IL-17 and ROR ⁇ T mRNA expression in MLN was significantly reduced in mice administered mCA1 compared to mice administered PBS (P ⁇ 0.05) (FIG. 12E).
  • MCA1 administration significantly decreased (P ⁇ 0.05) (FIG. 12F).
  • oral administration of mCA1 significantly reduced the production of IL-6, IL-17, MCP-1, and TNF ⁇ by MLN and increased the production of IFN ⁇ (P ⁇ 0.05) (FIG. 12G).
  • regulatory dendritic cells pulsed with CBA suppress the progression of CD4 + CD25 ⁇ T cell transfer enteritis
  • CA I the main antigen of CBA
  • CD4 + CD25 + T cell transfer enteritis the main antigen of CBA
  • CA I the main antigen of CBA
  • regulatory dendritic cells pulsed with CA I induce Foxp3 + regulatory T cells in MLN, decrease T-helper 17 cells
  • control pulsed with CBA It has been shown that sex dendritic cells induce Foxp3 + CD4 + CD25 + T cells and IL-10 producing CD4 + CD25 + T cells in vivo.
  • the results of this experiment also show that treatment with Reg-DCs CBA improves the clinical and histopathological severity of enteritis.

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Abstract

【課題】　本発明は、自己免疫疾患の治療方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を利用した自己免疫疾患の治療方法等に関し、特には、炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の製造方法、炭酸脱水酵素Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞、炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を使用することを特徴とする自己免疫疾患（特には、炎症性腸疾患）の治療方法等に関する。

Description

自己免疫疾患治療に用いる新規抗原としての炭酸脱水酵素Ｉ
　本発明は抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を利用した自己免疫疾患の治療方法に関する。
　クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管における免疫機構の破綻により特徴づけられる疾患である。詳細な病因等は未だ明らかとされていないが、共生細菌、様々な微生物生産物、及び食品に対する過剰な自然免疫及び獲得免疫反応が原因の一つではないかと想定されている（非特許文献１～３参照）。
　微小環境における免疫調節は、局所のホメオスタシスを維持するために定常的に微調整される必要がある。このような調整は、部位（例えば消化管環境）に特異的であり、微生物への慢性的な曝露により誘導されると考えられている。樹状細胞は、この調節を制御する上で重大な役割を担っている（非特許文献４参照）。樹状細胞は、最も強力でかつ効果的な抗原提示細胞であり、初期免疫反応の誘導に重要である。また、樹状細胞は免疫寛容の形成にも重要な役割を果たしている。樹状細胞が、中枢及び末梢リンパ系器官における抗原特異的な免疫寛容をｉｎ　ｓｉｔｕで誘導していることが報告されている（非特許文献５参照）。免疫寛容のメカニズムは完全には解明されていないが、樹状細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞に分化させることにより、末梢においてＴ細胞による免疫寛容を誘導することが報告されている（非特許文献６参照）。
　樹状細胞の免疫寛容原性の選択的な増強は、樹状細胞の成熟を薬理的に阻害し得られた未熟樹状細胞、又は免疫抑制分子を発現する遺伝子組換樹状細胞を用いることにより行われてきた（非特許文献７参照）。また、マウスモデルを用いた研究により、自己免疫、アレルギー、移植における拒絶反応等の幅広い疾患において、いくつかのタイプの寛容原性又は制御性樹状細胞が抗原特異的に病態を改善することが報告されている（非特許文献６及び８～１１参照）。
　盲腸細菌抗原（Ｃｅｃａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａl　ａｎｔｉｇｅｎ：以下、「ＣＢＡ」という）は、炎症性腸疾患の病態への関与が想定されている物質の一つである。重症複合型免疫不全症モデルマウスに、ＣＢＡ反応性のインターロイキン（ＩＬ）－１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植することで、重症腸炎を発症することが報告されている（非特許文献１２～１４参照）。ＣＢＡは幾つかのタンパク質から構成されていると予想されるが、いずれのタンパク質が炎症性腸疾患における特異抗原であるか解析した報告はない。
Ｍａｃｄｏｎａｌｄ　ＴＴら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：１９２０－５ Ｓａｒｔｏｒ　ＲＢ．ら（２００８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３４：５７７－９４ Ｂａｕｍｇａｒｔ　ＤＣら（２００７）Ｌａｎｃｅｔ，３６９：１６２７－４０ Ｂｅｌｋａｉｄ　Ｙら（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２６：３６２－７１ Ｓｔｅｎｍａｎ　ＲＭら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：６８５－７１１ Ｆｕｊｉｔａ　Ｓら（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：３７９３－８０３ Ｈａｃｋｓｔｅｉｎ　Ｈら（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：２４－３４ Ｍｅｎｇｅｓ　Ｍら（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５：１５－２１ Ｔｏｒｉｓｕ　Ｍら（２００８）Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，４３：１００－７ Ｆｕｊｉｔａ　Ｓら（２００８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１：９５－１０４　ｅ７ Ｓａｔｏ　Ｋら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１８：３６７－７９ Ｃｏｎｇ　Ｙら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：８５５－６４ Ａｌｓｏｎ　ＣＯら（２００７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２：２３５９－７０ Ｂｒｉｍｎｅｓ　Ｊら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：２３－３１
　現在の治療戦略では効果的に炎症性腸疾患を治療することができず、新規のより優れた治療方法が求められている。
　本発明者らは、マウスモデルにおいて炭酸脱水酵素Ｉ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　Ｉ：ＣＡ　Ｉ）、及びＣＡ　Ｉによりパルスした制御性樹状細胞が抗原特異的に炎症性腸疾患に対する治療効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。具体的には、ＣＢＡを二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ－ＤＩＧＥ）及び飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）により分析し、ＣＢＡの主要タンパク質がＣＡ　Ｉであることを確認した。また、確認されたＣＡ　Ｉを用いて制御性樹状細胞をパルスしたところ、大腸炎モデルマウスにおいて抗原特異的な腸炎抑制作用を誘導することを見出した。更に、ＣＡ　Ｉを直接投与することによっても、大腸炎モデルマウスにおいて抗原特異的な腸炎抑制作用が誘導されることを見出した。
　よって、本発明は抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を利用した自己免疫疾患の治療方法に関し、特には、ＣＡ　Ｉを抗原として利用し、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を産生させることを特徴とする自己免疫疾患（特には、炎症性腸疾患）の治療方法に関する。
　より具体的には、本発明は、以下の発明に関する。
（１）　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉを有効成分として含有する医薬組成物。
（２）　自己免疫疾患の治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２）に記載の医薬組成物。
（４）　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（５）　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
（６）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（５）に記載の医薬組成物。
（７）　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
（８）　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（５）～（７）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（９）　抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の調製に使用するためのＣＡ　Ｉを含有する組成物。
（１０）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（９）に記載の組成物。
（１１）　ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする、患者における免疫寛容の誘導方法。
（１２）　寛容原性抗原提示細胞に基づくことを特徴とする、（１１）に記載の方法。
（１３）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（１２）に記載の方法。
（１４）　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（１１）～（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）　患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、（１１）～（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）　患者にＣＡ　Ｉを投与するステップを備える、（１１）～（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）　ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする自己免疫疾患の治療又は予防方法。
（１８）　治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づくことを特徴とする、（１７）に記載の治療又は予防方法。
（１９）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（１７）又は（１８）に記載の治療又は予防方法。
（２０）　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（１７）～（１９）のいずれか１項に記載の自己免疫疾患の治療又は予防方法。
（２１）　患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、（１７）～（２０）のいずれか１項に記載の治療又は予防方法。
（２２）　患者にＣＡ　Ｉを投与するステップを備える、（１７）～（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２３）　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（１７）～（２２）のいずれか１項に記載の治療又は予防方法。
（２４）　ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の製造方法。
（２５）　寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、及び、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、（２４）に記載の製造方法。
（２６）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２４）又は（２５）に記載の製造方法。
（２７）　抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞が、免疫寛容の誘導又は自己免疫疾患の治療又は予防に使用するための抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞である、（２４）～（２６）のいずれか１項に記載の製造方法。
（２８）　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（２７）に記載の製造方法。
（２９）　ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な制御性Ｔ細胞の製造方法。
（３０）　寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させるステップを備える、（２９）に記載の製造方法。
（３１）　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、（２９）又は（３０）に記載の製造方法。
（３２）　抗原特異的な制御性Ｔ細胞が、免疫寛容の誘導又は自己免疫疾患の治療又は予防に使用するための抗原特異的な制御性Ｔ細胞である、（２９）～（３１）のいずれか１項に記載の製造方法。
（３３）　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、（３２）に記載の製造方法。
（３４）　ＣＡ　Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞。
（３５）　免疫原性抗原提示細胞が制御性樹状細胞である（３４）に記載の細胞。
（３６）　ＣＡ　Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞。
　本明細書において、「細胞治療」とは、細胞の投与を特徴とする疾患の治療方法を意味する。細胞は、投与を受ける患者から得た細胞であってもよいし、異なる個体から得た細胞であってもよい。本発明においては、好ましくは投与を受ける患者から得た細胞を使用する。一般的には、細胞治療は、細胞を採取及び分離するステップ、細胞を処理するステップ、及び、処理した細胞を患者に投与するステップを含む。また、細胞治療は、細胞を増殖させるステップを含んでいてもよい。また、「寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療」とは、寛容原性抗原提示細胞の投与を特徴とする疾患の治療方法を意味する。
　「炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡ　Ｉ）」は、一般的には、細胞質に存在し、二酸化炭素の水和反応を可逆的に触媒する金属酵素である。本明細書において、「ＣＡ　Ｉ」は、完全長のＣＡ　Ｉである必要はなく、ＣＡ　Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能であればその部分ペプチドをも含むものである。また、本明細書におけるＣＡ　Ｉ（その部分ペプチドを含む。以下同じ。）は、ＣＡ　Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、そのアミノ酸配列の一部（例えば、数個）が、置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたものであってもよい。又は、本明細書におけるＣＡ　Ｉは、ＣＡ　Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、ＣＡ　Ｉのアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。あるいは、本明細書におけるＣＡ　Ｉは、ＣＡ　Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞を誘導することが可能である限り、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列とストリンジェントな条件下（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））でハイブリダイズする遺伝子配列によりコードされたタンパク質であってもよい。ＣＡ　Ｉは、免疫寛容能を高めるため、適宜修飾されていてもよい。また、ＣＡ　Ｉは、免疫寛容能を高める物質、又は免疫寛容能を有する他の物質等との融合タンパク質であってもよい。好ましくは、ＣＡ　Ｉは、前記本明細書におけるＣＡ　Ｉに含まれるタンパク質又はペプチドのうち、該タンパク質又はペプチドにより誘導された免疫原性抗原提示細胞が免疫寛容を誘導し、自己免疫疾患（好ましくは炎症性腸炎）の治療又は予防効果を奏するタンパク質又はペプチドである。
　「寛容原性抗原提示細胞」とは、免疫寛容を誘導する抗原提示細胞のことである。寛容原性抗原提示細胞は、治療の対象となる患者由来の細胞であってもよいし、患者以外の由来の細胞であってもよいが、好ましくは患者由来の細胞である。寛容原性抗原提示細胞としては、例えば、制御性樹状細胞を挙げることができる。「制御性樹状細胞」は、寛容原性樹状細胞と呼ばれることもある、免疫寛容にかかわる樹状細胞のサブセットであれば特に限定されない。制御性樹状細胞は、インターロイキン１０等のサイトカインの産生を通じて免疫抑制を引き起こす作用を有する樹状細胞、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞）を生成させる作用を有する樹状細胞、及び／又はＴ細胞の機能を制御する作用を有する樹状細胞を含む。例として、制御性樹状細胞としては、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６等の共刺激分子を細胞表面に発現していない樹状細胞、及び、ＣＣＲ９を細胞表面に発現している樹状細胞（Ｈａｄｅｉｂａ、Ｈら（２００８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９（１１）：１２５３－６０）、ｍｉＲ－１５５を細胞表面に発現している樹状細胞（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ＡＷら（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７（１）：４８－５９）、ＣＤ２００ｒｅｃｅｐｔｏｒ３を表面に発現している樹状細胞（Ｓａｔｏ，Ｋら（２００９）Ｂｌｏｏｄ．，１１７３：４７８０－９）を挙げることができる。
　「制御性Ｔ細胞」とは、組織障害を起こし得るＴ細胞の活性を抑制する働きのあるＴ細胞のことである。制御性Ｔ細胞は、治療の対象となる患者由来の細胞であってもよいし、患者以外の由来の細胞であってもよいが、好ましくは患者由来の細胞である。好ましくは、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４及びＣＤ２５分子を細胞表面に発現しているＴ細胞である。
　「ナイーブＴ細胞」とは、特異抗原と接触していないＴ細胞のことであり、好ましくは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ナイーブＴ細胞である。
　「免疫寛容」とは、免疫反応レベルの減少、免疫反応の発生又は進行の遅れ、及び／又は免疫反応によるリスクの減少を意味する。抗原特異的な免疫寛容とは、他の抗原と比較してある抗原に対して特に免疫寛容が起きることをいう。
　本明細書において、「自己免疫疾患」とは、自己抗原に対して免疫応答が起こることにより発症する疾患を意味する。本発明において、自己免疫疾患は炎症性腸疾患を含む。「炎症性腸疾患」は、慢性の持続性の腸炎を特徴とする疾患であり、潰瘍性大腸炎及びクローン病等を含む。
　本発明のＣＡ　Ｉを抗原として利用する細胞治療は、これまで治療が困難であった自己免疫疾患、特には炎症性腸疾患の症状を改善することから、自己免疫疾患の治療又は予防方法として有用である。
成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞の細胞表面分子の発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示すドットプロット図である。図中、「Ｍａｔｕｒｅ　ＤＣｓ」は成熟樹状細胞を示し、「Ｒｅｇ－ＤＣｓ」は制御性樹状細胞を示す。それぞれの左側の３つのデータにおいて、縦軸は、ＣＤ１１ｃの発現レベルを示し、横軸は、左から順に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現レベルを示す。一番右の図において、縦軸は、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現レベルを示し、横軸はＨ－２Ｋｄの発現レベルを示す。 成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞を、ポリイノシンＰｏｌｙ：Ｉ－Ｃ、超高純度ＬＰＳ、Ｒ８４８、又はＣｐＧ－ＯＤＮで２４時間刺激した後の培養上清におけるＩＬ－６及びＩＬ－１０の産生をサイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）により測定した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差（以下、「ＳＤ」という）を示す。図中、縦軸はそれぞれのサイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は測定したサイトカインを示す。星印は、成熟樹状細胞の結果と比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、成熟樹状細胞又は制御性樹状細胞を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を誘導し、フローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わしたグラフである。一番左の図は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を制御性樹状細胞で刺激した場合のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｍａｔｕｒｅ　ＤＣ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を成熟樹状細胞で刺激した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＤＣ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を制御性樹状細胞で刺激した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。 図３のフローサイトメトリーの結果から、生成したＴ細胞サブセットの割合を計算した結果を示す図である。図中、縦軸は割合を示す。横軸において、「ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｃｅｌｌ」は、生成したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞数の割合を示し、「ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋／ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｃｅｌｌ」は、生成したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞における、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合を示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印は、成熟樹状細胞の結果と比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルを用いた実験の結果を示す図である。（図５Ａ）体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；白丸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；黒丸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、抗原をパルスしていない制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；白四角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＫＬＨでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；黒四角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。（図５Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移植より２８日後の大腸の肉眼的所見を示す写真である。写真中、上から順に、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、抗原をパルスしていない制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＫＬＨ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＫＬＨでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。右下の棒は１０ｍｍを示す。（図５Ｃ）図５Ｂの大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。（図５Ｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移植より２８日後の大腸をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した結果示す写真である。図中、上の写真は４０倍に拡大した写真を、下の写真は２００倍に拡大した写真を示す。図中、左の写真は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの大腸組織を示し、右の写真は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスの大腸組織を示す。（図５Ｅ）組織学的スコアを計算した結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルの大腸における炎症性サイトカインの発現を測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、横軸において、ＰＢＳは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し、Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図６Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に大腸におけるサイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。（図６Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に採取した大腸細胞をｅｘ　ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルの腸間膜リンパ球（以下、「ＭＬＮ」という）における転写因子及び炎症性サイトカインの発現を測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、横軸において、ＰＢＳは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し、Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図７Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡの発現量を示す。（図７Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおけるサイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。（図７Ｃ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に採取したＭＬＮを２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞再構成マウスに対して、ＰＢＳ又はＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の誘導について測定した結果を示す図である。（図８Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から１週間後に採取したＭＬＮをフローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わした図である。一番左の図は、ＢＡＬＢ／Ｃの脾細胞のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡ」は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与した場合のＦｏｘｐ３及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＦｏｘｐ３の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。（図８Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後に採取したＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。図中、白丸印は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し、白三角印は、ＰＢＳを投与したマウスを示す。縦軸は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合（％）を示し、横軸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植からの経過期間（週）を示す。（図８Ｃ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から７日後に採取したＭＬＮをフローサイトメトリーで測定した結果をドットプロットで表わした図である。一番左の図は、ＢＡＬＢ／Ｃの脾細胞のアイソタイプコントロールＩｇＧ及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はアイソタイプコントロールＩｇＧの発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与した場合のＩＬ－１０及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＩＬ－１０の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。「Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡ」は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与した場合のＩＬ－１０及びＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示し、縦軸はＩＬ－１０の発現を、横軸はＣＤ２５の発現を示す。（図８Ｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から２、４、７及び１４日後に採取したＭＬＮにおけるＩＬ－１０＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。図中、白丸印は、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し、白三角印は、ＰＢＳを投与したマウスを示す。縦軸は、ＩＬ－１０＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合（％）を示し、横軸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植からの経過期間（日）を示す。 ＣＢＡの２次元電気泳動ゲルをディープパープルで染色した結果を示す写真である。スポットは、表１に記載の番号に従ってラベルした。図中右の数値はマーカーの分子量（ｋＤａ）を示す。また、図上部の数値は、等電点電気泳動のｐＨを示す。 マウス大腸組織におけるＣＡ　Ｉ発現を免疫組織化学染色により検出した結果を示す写真である。図中、上の写真は４０倍に拡大した写真を、下の写真は２００倍に拡大した写真を示す。写真中、左から順に、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞により誘導したマウス大腸炎モデルにＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与した結果を示す図である。図１１Ｂ及び１１Ｃの横軸において、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋ＰＢＳ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＣＢＡ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄでＣＡ　Ｉと同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ　Ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌとしこれによりパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｅｌｌｓ＋Ｒｅｇ－ＤＣＣＡ１」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。また、図１１Ｄ～図１１Ｇの横軸において、「ＰＢＳ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；「Ｒｅｇ－ＤＣＣＡ１」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。（図１１Ａ）体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；白丸は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスを示し；黒四角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；ひし形は、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄでＣＡ　Ｉと同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ　Ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌとしこれでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示し；黒ひし形は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植し、ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与したマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から２８日後の大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。エラーバーは、ＳＤを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｃ）組織学的スコアを計算した結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示し、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に大腸における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図１１Ｅ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡ及び各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。（図１１Ｆ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に採取した大腸をｅｘ　ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。（図１１Ｇ）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に採取したＭＬＮを２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 ＰＢＳ、ｍＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ、又はｍＣＡ１を投与した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移入し腸炎を誘導したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎モデルマウスの結果を示す図である（図１２Ｂ～図１２Ｇも同様）。体重変化（％）の時間経過を示すグラフである。図中、縦軸は体重変化（％）を示し、横軸は、細胞移植後の経過日数を示す。図中、三角は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）を示し；白丸は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示し；四角は、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄで合成したタンパク質（ｍＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示し；黒四角は、ｍＣＡ１を投与した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）を示す。エラーバーは、ＳＤを示す。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した２８日後の大腸の長さを測定した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、大腸の長さ（ｃｍ）を示し、横軸は大腸の長さの測定に用いたマウスを示す。横軸において、「ＳＣＩＤ」は、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスを示し；「ＰＢＳ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－→ＳＣＩＤ」は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－→ＳＣＩＤ」は、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄで合成したタンパク質（ｍＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＣＡ１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－」は、ｍＣＡ１を投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したマウスを示す（図１２Ｃにおいても同様）。エラーバーは、ＳＤを示す。それぞれの群において、６～７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 ＰＢＳ、ｍＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ、又はｍＣＡ１を投与したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎モデルマウスから得た大腸の組織学的スコアの結果を示すグラフである。図中、縦軸は組織学的スコアを示し、横軸は組織学的スコアの測定に用いたマウスを示す。グラフ中の水平線は、中央値を示す。それぞれの群において、６～７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後に、大腸における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、５匹のマウスの平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。横軸において、「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－＋ＰＢＳ」は、ＰＢＳを投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したマウスを示し；「ＳＣＩＤ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－＋ＣＡ１」は、ＣＡ　Ｉを投与後、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植したマウスを示す（図１２Ｅ～図１２Ｇにおいても同様）。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。 ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植４週間後にＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。グラフは、５匹のマウスの平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する各転写因子ｍＲＮＡ及び各サイトカインｍＲＮＡの発現量を示す。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。 大腸をｅｘ　ｖｉｖｏで３日間培養した培養上清中に分泌されたＩＬ－６，ＭＣＰ－１，ＴＮＦα、及びＩＬ－１７の濃度をサイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。それぞれの群において、５～７匹のマウスを用いた。図中、星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示す。二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。 ＭＬＮ（１×１０６細胞）を２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン存在下で７２時間培養した培養上清中に分泌されたＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ－１７の濃度を、サイトメトリックビーズアレイ法（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｔｅｍｓ）で測定した結果を示すグラフである。グラフは、平均値±ＳＤを示す。図中、縦軸は各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。それぞれの群において、５～７匹のマウスを用いた。星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０５となることを示し、二重の星印はＰＢＳ投与マウスと比較して、Ｐ＜０．０１となることを示す。
　ＣＡ　Ｉは、当業者に周知の遺伝子配列情報（例えば、マウスＣＡ　Ｉの遺伝子配列を配列番号１に、ヒトＣＡ　Ｉの遺伝子配列を配列番号３に示す）から適宜プライマーを設計し、発現ベクターを作製して、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。または、ＣＡ　Ｉは、小麦胚芽リボソームＲＮＡを用いたセルフリータンパク質合成システムに従って調製することができる（Ｍａｄｉｎ　Ｋら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９－６４）。
　また、ＣＡ　ＩとしてＣＡ　Ｉの部分ペプチドを使用する場合には、アミノ酸合成に用いられる当業者周知の方法を用いて製造することができる。例えば、ＣＡ　Ｉの部分ペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができ、または、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ－８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ,　Ｉｎｃ．））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ　Ｉｎｃ．））等が挙げられる。
　ＣＡ　Ｉ（その部分ペプチドを含む）への変異の挿入は、部位特異的変異導入法等、当業者周知の方法を用いて行うことができる。
　本発明の「ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする、患者における免疫寛容の誘導方法」は、患者にＣＡ　Ｉを直接投与することを含む免疫寛容の誘導方法、及び、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいて寛容原性抗原提示細胞をＣＡ　Ｉでパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法を含む。
　また、本発明の「ＣＡ　Ｉを使用することを特徴とする自己免疫疾患の治療又は予防方法」は、患者にＣＡ　Ｉを直接投与することを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法、及び、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法を含む。
　本発明において、ＣＡ　Ｉ又はＣＡ　Ｉを有効成分として含有する医薬組成物を患者に直接投与する場合、投与部位としては、経口投与、鼻腔内投与、気道内投与、皮下投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができ、好ましくは経口投与である。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、粉霧剤等を挙げることができる。また、投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、経口投与する。また、投与は、一時的に行われてもよいし、持続的又は断続的に行われてもよい。例えば、投与頻度として、例えば、単回投与、１週間に１～４回投与の他、１か月～３か月毎に１回などの間歇的投与も選択できる。投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。投与量は、例えば、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞若しくは抗原特異的な制御性Ｔ細胞の産生の程度、又は自己免疫疾患の治療効果若しくは予防効果を指標として決定することができる。例えば、１回の抗原の投与量は、０．０１ｎｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、０．１ｎｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、０．５ｎｇ～１００μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、１ｎｇ～１０μｇ／ｋｇである。また、ＣＡ　Ｉは、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤と共に投与されてもよく、例えば、ＣＡ　Ｉと該他の薬剤は、同時に又は時間をおいて別々に投与されてもよい。
　前記において、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
　寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。
　好ましくは、本発明のｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる。
　患者由来の制御性樹状細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした制御性樹状細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。
　ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
　寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。
　好ましくは、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
　患者由来の制御性樹状細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、及び、
　パルスした制御性樹状細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。
　寛容原性抗原提示細胞である制御性樹状細胞は、例えば、患者の骨髄細胞を採取し、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、及びヒト形質転換成長因子－β１（ＴＧＦ－β１）の存在下で８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で２４時間刺激することにより調製することができる。または、末梢血を採取し、当業者周知の方法で単核球画分を分離、採取し、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、及びヒト形質転換成長因子－β１（ＴＧＦ－β１）の存在下で８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で２４時間刺激することにより調製することができる。また、調製した制御性樹状細胞は、共刺激分子を発現している樹状細胞を除去することにより純度を高めることができる。
　ＣＡ　Ｉによる寛容原性抗原提示細胞のパルスは、ＣＡ　Ｉの存在下で寛容原性抗原提示細胞を培養することにより行うことができる。
　パルスした寛容原性抗原提示細胞の患者への投与は、免疫細胞を利用した細胞治療方法として当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、細胞は、血管内（静脈内）に投与される。また、投与は、一時的に行われてもよいし、持続的又は断続的に行われてもよい。例えば、投与頻度として、好ましくは、単回投与、１週間に１～４回投与であり、より好ましくは、単回または１週間に１回投与である。また、１か月～３か月毎に１回などの間歇的投与も選択できる。投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。投与量は、例えば、免疫寛容の程度、患者の血中における抗原特異的な制御性樹状細胞及び／又は制御性Ｔ細胞の数、あるいは自己免疫疾患の治療効果若しくは予防効果を指標として決定することができる。例えば、１回の細胞の投与量は、１×１０６細胞～１×１０１０細胞であり、より好ましくは、１×１０７細胞～１×１０９細胞であり、更に好ましくは、５×１０７細胞～５×１０８細胞であり、最も好ましくは、１×１０８細胞である。また、パルスした寛容原性抗原提示細胞は、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤と共に投与されてもよく、例えば、ＣＡ　Ｉと該他の薬剤は、同時に又は時間をおいて別々に投与されてもよい。
　また、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法、及び、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、更に、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいて、ＣＡ　Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を誘導するステップを含んでいてもよい。
　例えば、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、以下のステップにより行うことができる：
　寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
　誘導した制御性Ｔ細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。
　好ましくは、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む免疫寛容の誘導方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
　患者由来の制御性樹状細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、
　パルスした制御性樹状細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ及び、
　誘導した制御性Ｔ細胞を、免疫寛容を誘導する患者に投与するステップ。
　また、例えば、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
　寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
　パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
　誘導した制御性Ｔ細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。
　また、好ましくは、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む自己免疫疾患の治療又は予防方法は、以下のステップにより行うことができる：
　患者由来の制御性樹状細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
　ＣＡ　Ｉで制御性樹状細胞をパルスするステップ、
　パルスした制御性樹状細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導するステップ、及び、
　誘導した制御性Ｔ細胞を自己免疫疾患の患者に投与するステップ。
　以上において、ナイーブＴ細胞は、末梢血または、脾臓細胞から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、製造者のマニュアルに従って単離することができる。ナイーブＴ細胞の純度は、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）ラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体及びフィコエリトリン（ＰＥ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析により確認することができる。
　パルスした制御性樹状細胞による制御性Ｔ細胞の誘導は、例えば、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中、５×１０６個のナイーブＴ細胞を、５×１０５個の制御性樹状細胞と共に７日間培養することで得ることができる。
　誘導した制御性Ｔ細胞の患者への投与は、上記パルスした寛容原性抗原提示細胞の患者への投与と同様に行うことができる。
　本発明の「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉを有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものであってもよいし、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいて抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を調製するために使用されるものであってもよい。また、抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞を調製するために使用される場合、調製された寛容原性抗原提示細胞又は当該抗原提示細胞により刺激された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。
　「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものであってもよいし、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいて抗原特異的な制御性Ｔ細胞を調製するために使用されるものであってもよい。ＣＡ　Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞は、前記方法に従って、寛容原性抗原提示細胞を調製し、ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることにより得ることができる。調製された寛容原性抗原提示細胞又は当該抗原提示細胞により刺激された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。
　「自己免疫疾患の治療又は予防において使用するためのＣＡ　Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物」は、免疫寛容を誘導する目的で患者に直接投与されるものである。ＣＡ　Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞は、前記方法に従って、寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を採取し、ＣＡ　Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスし、パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させることにより得ることができる。調製された制御性Ｔ細胞は前記方法に従って患者に投与される。
　本発明において、ＣＡ　Ｉを含有する組成物は、ＣＡ　Ｉ以外に、適宜、安定剤等の添加物（例えば、「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」ＡＰｈＡ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を含んでいてもよい。また、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤を更に含んでいてもよい。また、本発明において、寛容原性抗原提示細胞又は制御性Ｔ細胞を含有する組成物は、寛容原性抗原提示細胞又は制御性Ｔ細胞以外に、適宜、細胞治療に適した添加材を含有していてもよい。
　以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は日本国特許出願２００９－２４２４９１の優先権を主張して出願されたものであり、当該日本国特許出願２００９－２４２４９１に記載の内容はその全てが参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（統計解析）
　全ての個別の実験において、データは平均値±ＳＤで示した。データは、スチューデントのｔ－テスト又はマンホイットニーのＵテストにより分析した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとした。統計計算は、ＳｔａｔＶｉｅｗ　バージョン５．０統計プログラムを用いて行った。
（実施例１）樹状細胞マーカーの検出
（１）マウス
　以下の全ての実験において、特定病原体未感染条件下で交配したＣ．Ｂ－１７ＳＣＩＤマウス及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）メスマウスを使用した（日本クレア株式会社、東京、日本）。全てのマウスは８～１２週令であり、２２℃、湿度５５％、１２時間昼／夜のリズムで、通常の実験動物飼料を与えて維持管理を行った。全ての動物は、グッドラボラトリープラクティスガイドラインに従って飼育した。本研究は、愛媛大学動物実験委員会の承認を得て行われた。
（２）樹状細胞の調製
　成熟樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た２×１０６個の骨髄細胞を２０ｎｇ／ｍＬのマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（和光純薬株式会社、大阪、日本）存在下で８日間培養した後、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）の存在下で２４時間刺激して調製した。
　制御性樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た２×１０６個の骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ（和光純薬株式会社）、マウスインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）（和光純薬株式会社）及びヒト形質転換成長因子－β１（ＴＧＦ－β１）（和光純薬株式会社）の存在下で８日間培養し、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）の存在下で２４時間刺激することにより調製した。制御性樹状細胞は、その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（クローン３／２３、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体（クローン１６－１０ＡＩ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体（クローンＧＬ１、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて４℃で３０分間染色した。抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）により細胞をラベルした後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、ＣＤ４０＋ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋細胞（調製した全細胞の約２０％）を排除し、共刺激分子を発現している樹状細胞を除去した。
（３）樹状細胞マーカーの検出
　樹状細胞は、洗浄後、１％ＦＢＳ、０．２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁させた。精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）でＦｃレセプターをブロッキングした後、樹状細胞を、ＦＩＴＣラベル抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体（クローンＨＬ３、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体、及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、並びに、ＰＥラベル抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅモノクローナル抗体（クローン２Ｇ９、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、及び抗Ｈ－２Ｋｄモノクローナル抗体（クローンＡＭＳ－３２．１、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて４℃の暗室で３０分間染色した。アイソタイプ適合のモノクローナル抗体をコントロールとして使用した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。
（４）結果
　結果を図１に示す。骨髄由来の成熟樹状細胞は、高レベルのＭＨＣ分子（Ｈ－２ｋｄ及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ）、ＣＤ１１ｃ、及び共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）を発現していた。対照的に制御性樹状細胞は、中程度のＭＨＣ分子と非常に低いレベルのＣＤ１１ｃ及び共刺激分子を発現していた。
（実施例２）Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体リガンド刺激により発現するサイトカインの比較
　実施例１と同様に調整した２×１０５個の樹状細胞を、１μｇ／ｍＬのポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）、１μｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ、１μｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）、又はシトシンホスホロチオラートグアニンオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ：配列番号５）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２－メルカプトエタノール、ペニシリン、及びストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ－１６４０培地）中、Ｕ底９６穴プレートで２４時間培養した。培養上清中のＩＬ－１０及びＩＬ－６をサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。
　結果を図２に示す。Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体リガンドで刺激することにより、制御性樹状細胞は、成熟樹状細胞と比較して顕著に低レベルのＩＬ－６を産生し、高レベルのＩＬ－１０を産生していた。
（実施例３）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける樹状細胞によるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の誘導
　Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、様々な免疫反応の調節において中心的な役割を果たしていることが明らかとなってきている（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ　ＪＤら（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３３１－７；Ｖｉｇｎａｌｉ　ＤＡら（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：５２３－３２；Ｈｏｒｉ　Ｓら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：１０５７－６１）。制御性樹状細胞及び免疫寛容原性樹状細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を誘導し、マウス及びヒトにおける寛容誘導において働くことが報告されている（Ｆｕｊｉｔａ　Ｓら（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：３７９３－８０３；Ｔｏｒｉｓｕ　Ｍら（２００８）Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，４３：１００－７；Ｄｕｍｉｔｒｉｕ　ＩＥら（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２：２７９５－８０７）。そこで、制御性樹状細胞がＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を誘導するか否かを調べた。
（１）ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の精製
　ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、製造者のマニュアルに従って単離した。ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）ラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）及びフィコエリトリン（ＰＥ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ミルテニーバイオテク社）を用いたＦＡＣＳ分析により純度が９８％以上であることを確認した。
（２）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の誘導
　３５×１０ｍｍスタイル細胞培養皿（コーニング社、ホースヘッズ、ニューヨーク、米国）を用いて、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中、５×１０６個のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を、５×１０５個のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した成熟樹状細胞又は制御性樹状細胞と共に７日間培養した。培養後、ＰＥラベル抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体（クローンＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（クローンＰＣ６１、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、及びＰｅｒＰＣラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体（クローンＲＭ４－５、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って細胞を染色した。蛍光染色は、ＦｌｏＪｏソフトウェアを用いたフローサイトメトリーにより分析した。
（３）結果
　結果を図３及び図４に示す。成熟樹状細胞及び制御性樹状細胞のいずれも同数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を生成させていた。しかし、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は制御性樹状細胞により誘導されるのに対し、成熟樹状細胞では誘導されなかった。
（実施例４）ＣＢＡパルス制御性樹状細胞による大腸炎の治療
　制御性樹状細胞の投与が大腸炎に対して治療効果をもたらすか否かを以下の方法により調べた。
（１）ＣＢＡの調製
　ＣＢＡは、以前報告された方法（Ｃｏｎｇ　Ｙら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：８５５－６４）に従って調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させ、盲腸を摘出した。５個の盲腸を開き、１．０ｍｍシリカセファロース（Ｌｙｓｉｎｇ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｃ、ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、ソロン、オハイオ州、米国）を含む１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。５分間攪拌後、４℃、５０００ｇで５分間遠心してシリカセファロースと未溶解の細胞を除去した。続いて、上清を４℃、１８，０００ｇで３０分間遠心し、溶解物をポアサイズ０．２μｍのシリンジフィルタに通して滅菌した。溶解物のタンパク質濃度はＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いて測定した。
（２）ＣＢＡ又はＫＬＨパルス制御性樹状細胞の調製
　実施例１と同様の方法により調製した制御性樹状細胞を５０μｇ／ｍＬのＣＢＡ、又は５０μｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）で２４時間パルスし、それぞれＣＢＡパルス樹状細胞（Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ）又はＫＬＨパルス樹状細胞（Ｒｅｇ－ＤＣｓＫＬＨ）を生成させた。
（３）腸炎モデルの作成及び樹状細胞による治療
　腸炎モデルは、以前報告された方法に従って作成した（Ｋｊｅｌｌｅｖ　Ｓら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６：１３４１－５４）。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得たＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を、３×１０５細胞／０．２ｍＬ／マウスとなるようにＰＢＳで調整し、腹腔内投与によりＣ．Ｂ－１７ＳＣＩＤマウスに移植した。移植日を０日目とした。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植していないマウスをＣｏｎｔｒｏｌ群とした（ｎ＝６）。０日目にＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞と共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た、制御性樹状細胞（ｎ＝７）、Ｒｅｇ－ＤＣｓＫＬＨ（ｎ＝６）、又は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ（ｎ＝８）を、それぞれ１×１０６細胞／０．２ｍＬ／マウスとなるようにＰＢＳで調整し、腹腔内投与した。樹状細胞の代わりに０．２ｍＬのＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群とした（ｎ＝１０）。マウスの体重を毎週測定した。細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した大腸の長さを測定した。
（４）大腸炎の組織学的評価
　大腸は、細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した。横行結腸を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片をＨ＆Ｅ又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。組織切片中の炎症の程度は、報告されている方法に従って評価した（Ｋｊｅｌｌｅｖ　Ｓら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６：１３４１－５４）。組織像は、以下に従ってスコア付けした：１）炎症の重症度：０　無し；１　軽度のリンパ球浸潤；２　中等度のリンパ球浸潤、又は局所の陰窩変性；３　重度の炎症、又は複数個所の陰窩変性、及び／又はびらん；２）炎症の程度：０　無し；１　粘膜；２　粘膜下層；３　貫壁性；３）粘液量：０　通常；１　微量の粘液減少；２　中等度の粘液減少、又は局所的な粘液欠如；３　重度の粘液減少；４　完全な粘液欠如；及び、４）上皮細胞増殖の程度：０　無し；１　細胞数又は陰窩長の穏やかな増加；２　中等度又は局所の顕著な増加；３　顕著な増加－切片の全ての部分における。組織学的スコアは、４つの個別のパラメータの総和として計算した。
（５）結果
　結果を図５及び図６に示す。移植４週間後、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡで治療したマウスの体重が有意に増加していた（Ｐ＜０．０１）（図５Ａ）。移植４週間後の肉眼的所見では、ＰＢＳを投与されたマウスでは大腸壁は厚くかつ大腸の長さは短くなっていた。一方、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、制御性樹状細胞、又はＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与されたマウスにおいては、大腸の長さが有意に長かった（Ｐ＜０．０１）（図５Ｂ、図５Ｃ）。組織学的所見では、大腸炎は重度の上皮の過剰増殖、粘液減少、炎症細胞浸潤、陰窩変性、杯細胞数の減少、及びびらんにより特徴づけられる。樹状細胞を投与されていないＣ．Ｂ－１７ＳＣＩＤマウスでは、重度の上皮の過剰増殖、粘液減少、炎症細胞浸潤、陰窩変性及び杯細胞数の減少が認められ、重症の大腸炎を発症していた。抗原をパルスしていない制御性樹状細胞又はＲｅｇ－ＤＣｓＫＬＨを投与されたマウスにおいても、ＰＢＳを投与されたマウスと類似した大腸の組織学的変化を示していた。対照的に、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡによる治療は、これらの組織的変化は軽度であり、炎症細胞浸潤を顕著に減少させ、杯細胞の減少は軽度であった（図５Ｄ）。
　組織学的スコアは、炎症の重症度、炎症細胞浸潤の程度、粘液量、及び上皮増殖の程度に基づき決定した。組織学的スコアは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与されたマウスにおいて有意に低下していた（図５Ｅ）。制御性樹状細胞で治療したマウスは、中等度の体重減少と軽度の大腸長の短縮を示したが、組織学的所見では、制御性樹状細胞で治療したマウスにおいても中等度から重度の大腸炎を発症していた。
（実施例５）腸炎モデルの大腸における炎症性サイトカイン発現
（１）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
　実施例４と同様にして作製したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した、それぞれ４匹のＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ投与マウス及びＰＢＳ投与マウスの横行結腸をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社、東京、日本）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ　ｐｌｕｓ　ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州、米国）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成した。腸炎マウスから得た大腸のＩＬ－１０、ＩＬ－６、及びＩＬ－１７ＡのｍＲＮＡの発現を、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ　Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０－７）。
（２）Ｅｘ　Ｖｉｖｏ培養大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定
　横行結腸より１ｃｍ切片を採取し、便を除去し、滅菌されたＰＢＳで３回洗浄した。大腸切片をＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２－メルカプトエタノール、ペニシリン、及びストレプトマイシン）に加え、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養３日後に上清を回収した。培養上清中のＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、及びインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）、サイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて測定した。
　サイトカインｍＲＮＡ発現解析の結果、Ｒｅｇ－ＤｃｓＣＢＡを投与されたマウスの大腸において、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの発現が減少し、ＩＬ－１０の発現が上昇していた（図６Ａ）。大腸の培養上清を解析したところ、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウスの大腸において、炎症性サイトカインであるＩＬ－１７及びＴＮＦ－αの産生はＰＢＳを投与されたマウスと比べ有意に低かったが（Ｐ＜０．０５）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６及びＩＬ－１０については有意な差は見られなかった（図６Ｂ）。
（実施例６）腸炎モデルの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞における転写因子及び炎症性サイトカイン発現
　Ｒｅｇ－ＤｃｓＣＢＡによる腸炎抑制のメカニズムを解明するため、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞における転写因子及びサイトカインを測定した。
（１）転写因子のｍＲＮＡ発現測定
　実施例４と同様にして作製したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与されたマウス及びＰＢＳを投与されたマウスより採取したＭＬＮをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ　ｐｌｕｓ　ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成した。腸炎マウスから採取したＭＬＮのＦｏｘｐ３、及びレチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲγＴ）のｍＲＮＡの発現は、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ　Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０－７）。
（２）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
　実施例４と同様にして作製したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスから採取したＭＬＮをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（キアゲン社）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ　ｐｌｕｓ　ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成させた。大腸炎マウスから採取したＭＬＮのＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－βのｍＲＮＡの発現は、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ　Ｙら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１２０－７）。
（３）ＥＬＩＳＡによる炎症性サイトカイン産生量の測定
　実施例４と同様にして作製したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスから得た１×１０６個のＭＬＮ細胞を、２５ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、７２時間培養した。培養上清中のＩＬ－６、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、及び単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）をサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。また、上清中のＩＬ－１７をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。
（４）結果
　結果を図７に示す。Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウスはＰＢＳを投与したマウスと比較して、ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３の発現が有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。ＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウスにおいて、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。また、ＭＬＮ中のＩＬ－１０及びＴＧＦ－βのｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウスにおいて、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０５）（図７Ｂ）。ＭＬＮにおけるＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの発現は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ投与したマウスとＰＢＳ投与したマウスの間で有意な差は見られなかった（図７Ｂ）。しかし、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したマウスのＭＬＮ細胞のＩＬ－６産生は、ＰＢＳを投与したマウスのＭＬＮ細胞と比較して有意に低かった（図７Ｃ）。更に、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡの投与は、腸炎マウスのＭＬＮからのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＭＣＰ－１の産生を有意に減少させた（Ｐ＜０.０１）（図７Ｃ）。
（実施例７）Ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡによるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の誘導
　Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡがｉｎ　ｖｉｖｏの末梢において、Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞からＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を誘導することができるかを調べるため以下の方法によりＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を測定した。
（１）マウス及びＭＬＮの調製
　実施例４と同様にして作製したＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植した、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ投与マウス及びＰＢＳ投与マウスより、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で７２時間培養した。
（２）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞測定
　ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の割合を調べるため、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から１、３及び５週間後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中、Ｕ底９６穴プレートで７２時間培養した。その後、ＰＥラベル抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体、ＡＰＣラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体、及びＰｅｒＣＰラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いて、製造者の推奨する方法に従って、培養細胞を染色した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。
（３）ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞測定
　ＭＬＮにおけるＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合を調べるため、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から２、４、７及び１４日後にＭＬＮを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中、Ｕ底９６穴プレートで２４時間培養した。最後の３時間はＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を添加した。その後、細胞をＰｅｒＣＰラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体及びＡＰＣラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体と共に室温、暗室で１５分間静置し、ＦＩＸ＆ＰＥＲＭキット（Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を用いて、固定化し、透過処理した。細胞は、ＰＥラベルラット抗マウスＩＬ－１０モノクローナル抗体（クローンＪＥＳ５－１６Ｅ３、Ｄ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、室温で２０分間染色した。蛍光染色は、フローサイトメトリーにより分析した。
（４）結果
　結果を図８に示す。フローサイトメトリーの結果から、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の移植から７日後において、ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較してＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与されたマウスにおいて有意に高いことが示された。
（実施例８）ＣＢＡのプロテオーム解析
（１）ＣＢＡの調製
　ＣＢＡは、実施例４に記載の方法に従って調製した。
（２）２Ｄゲル電気泳動及びイメージング
　等電点電気泳動前に、ＣＢＡサンプルに対して２－Ｄクリーンアップキット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）を使用した。得られたペレットを溶解緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、及びＰｌｕｓＯｎｅプロテアーゼインヒビターミックス）に再懸濁させた。膨潤緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．５％　ＩＰＧ緩衝液　ｐＨ３－１０、及び１％ＤＴＴ）にサンプルを溶解させ、２０℃で１０時間、ｐＨ３－１０、２４ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）中に膨潤させた。等電点電気泳動は、ＩＰＧｐｈｏｒ　ＩＩを用いて、２０℃で、トータルで４５ｋＶｈ行った。その後、ＩＰＧゲルを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、０．５％ＤＴＴで１５分間平衡化させた。その後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー、４．５％ヨードアセトアミド含有緩衝液中で１５分間アルキル化させた。その後すぐストリップを１２．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにアプライし、ＥｔｔａｎＤＡＬＴｓｉｘ電気泳動システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）中、２Ｗ、３０℃の条件で１６時間泳動した。ゲル染色は、Ｄｅｅｐ　Ｐｕｒｐｌｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｉｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、一般的なプロトコールに従って行った。染色後、Ｅｔｔａｎ　ＤＩＧＥ　Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　２Ｄ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて画像を分析した。スポットはその相対体積を基準として定量した（全てのゲルスポット総体積で割ったスポット体積）。
（３）マススペクトル
　タンパク質スポットをゲルから切り出し、洗浄後、ブタ由来のトリプシンプロテアーゼによりゲル内で消化した。トリプシンペプチドは、超音波処理により抽出した。ナノＬＣ－ＡｃｃｕＳｐｏｔ（島津製作所、京都、日本）を用いて、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩのサンプルの調製、並びにμＦＯＣＵＳ　ＭＡＬＤＩプレート（島津製作所）上へのスポッティングを行った。タンデム型ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトルは、Ａｘｉｍａ－ＴＯＦ２マススペクトルメータ（島津製作所）を用いて行った。タンパク質は、ＭＡＳＣＯＴ　ＭＳ／ＭＳイオンサーチエンジン（Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ロンドン、イギリス）及び国立生物工学情報センタータンパク質データベースを用いて同定した。
（４）結果
　結果を図９に示す。３回個別の実験において全て同様の結果が得られた。２Ｄ　ＤＩＧＥイメージによるプロテオーム解析の結果から、スポットマップ上に１４個のメインスポットが示された（図９Ａ）。これらのスポットをゲルから切り出し、マススペクトルにかけデータベースで照会した結果を表１に示す。プロテオーム解析の結果、マウスＣＡ　ＩがＣＢＡの主要なタンパク質抗原であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例９）大腸におけるＣＡ　Ｉ発現
　ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を投与していないＳＣＩＤマウス、実施例４に記載の方法に準じてＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞により腸炎を発症したＳＣＩＤマウス、及び、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞及び、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与したＳＣＩＤマウスの大腸におけるＣＡ　Ｉ発現を免疫組織化学染色により調べた。
（１）免疫組織化学染色
　大腸の５μｍの凍結組織切片をアセトンで固定した。１％過酸化水素を含むメタノールで２０分間処理後、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで１０分間処理することにより内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化させた。内因性アビジン／ビオチンブロッキングキット（株式会社ニチレイ、東京、日本）で不活化した切片をウサギ血清（株式会社ニチレイ）で前処理し、１：５０希釈ビオチン化ヤギ抗ヒトＣＡ　Ｉ抗体（ロックランド社、フィラデルフィア、ペンシルバニア、米国）の存在下４℃で一晩静置した。その後、切片を西洋ワサビ融合ストレプトアビジン（株式会社ニチレイ）で処理し、シンプルステインＤＡＢ溶液（株式会社ニチレイ）と共に静置した。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、乾燥させ、標本とした。
（２）結果
　結果を図１０に示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞のみ投与されたＳＣＩＤマウスの大腸では、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を投与されていないＳＣＩＤマウス又はＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞及びＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与されたＳＣＩＤマウスの大腸と比較して、ＣＡ　Ｉ発現が顕著に減少していた。
（実施例１０）ＣＡ　Ｉパルス制御性樹状細胞による大腸炎治療効果
　ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を改善するか否かを調べるため、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞投与マウスにＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞を投与し、その効果を調べた。
（１）マウスＣＡ　Ｉの調製
　マウスＣＡ　Ｉは、ＬＰＳ混入のリスクが無いため、小麦胚芽リボソームＲＮＡを用いたセルフリータンパク質合成システムに従って調製した（Ｍａｄｉｎ　Ｋら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９－６４）。発現プラスミド（ｐＥＵ－ｍＣＡ１－Ｈｉｓ）は、以下の手順に従って調製した。マウスＣＡ１遺伝子は、各０．３μＭの以下のプライマーｍＣＡ１Ｆ及びｍＣＡ１Ｒを用いて、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２キット（東洋紡株式会社、大阪、日本）により増幅させた。
　ｍＣＡ１Ｆ：５’－ＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧ－３’（配列番号６）
　ｍＣＡ１Ｒ：５’－ＴＧＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号７）
　ＣＡ　Ｉは、Ｒｏｂｏｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（登録商標）　ＤＴ（株式会社セルフリーサイエンス、松山、日本）を用いて、製造者のプロトコールに従って以前報告されている通りに合成した（Ｓａｗａｓａｋｉ　Ｔら（２００２）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，５１４：１０２－５）。合成したＨｉｓ融合ＣＡ　Ｉは、Ｎｉセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ＡｃＴＥＶ（登録商標）プロテアーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて融合タンパク質からＨｉｓタグを除去し、Ｍｉｎｉ　Ｄｉａｌｙｓｉｓキット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてＰＢＳに対して透析した。
　また、ＣＡ　Ｉの遺伝子配列を組み込んでいないｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄを用いて上記ＣＡ　Ｉの調製と同様にセルフリータンパク質合成システムに従って作成したものをＣＡ　Ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌとした。
（２）制御性樹状細胞の調製とパルス
　制御性樹状細胞は、実施例１に記載の方法に準じて調製した。調製した制御性樹状細胞を６μｇ／ｍＬのＣＡ　Ｉ又はＣＡ　Ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌで２４時間パルスし、それぞれ、ＣＡ　Ｉパルス制御性樹状細胞（Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１）又はＣＡ　Ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌパルス制御性樹状細胞（Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ）を生成した。
（３）腸炎モデルの作成及び樹状細胞による治療
　腸炎モデルは、実施例４に記載の方法に従って作成した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得たＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を、３×１０５細胞／マウス腹腔内投与しＣ．Ｂ－１７ＳＣＩＤマウスに移植した。移植日を０日目とした。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を投与されていないＣ．Ｂ－１７マウスをＣｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝５）とした。０日目にＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞と共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡ（ｎ＝７）、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１－ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝８）、又はＲｅｇ－ＤＣｓＣＡ１（ｎ＝１０）を、それぞれ１×１０６細胞／マウスとなるように、腹腔内投与した。樹状細胞の代わりにＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群（ｎ＝１３）とした。マウスの体重を毎週測定した。細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した大腸の長さを測定した。
（４）大腸炎の組織学的評価
　大腸は、細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した。横行結腸を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片をＨ＆Ｅ又はＰＡＳで染色した。組織切片中の炎症の程度は、実施例４に記載の方法に従って評価した。
（５）大腸における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
　大腸のＩＬ－１７、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－βのｍＲＮＡの発現を、実施例５に記載の方法に従って測定した。
（６）ＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現
　ＭＬＮのＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、Ｆｏｘｐ３、及びＲＯＲγＴのｍＲＮＡの発現は実施例６に記載の方法に従って測定した。
（７）Ｅｘ　Ｖｉｖｏ培養大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定
　大腸培養上清中のＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γは、実施例５に記載の方法に従って測定した。
（８）ＭＬＮ細胞の炎症性サイトカイン産生量の測定
　ＭＬＮ細胞の培養上清中のＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＭＣＰ－１は、実施例６に記載の方法に従って測定した。
　（９）結果を図１１に示す。移植の４週間後、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスの体重は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に増加していた（Ｐ＝０．００６）（図１１Ａ）。移植４週間後の肉眼的所見では、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスの大腸長は有意に長かった（Ｐ＜０．０００１）（図１１Ｂ）。組織学的スコアでは、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスでは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に低いスコアを示した（図１１Ｃ）。
　ｍＲＮＡ発現測定の結果、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスの大腸及びＭＬＮにおいて、ＩＬ－１７Ａの発現は減少しており、一方でＩＬ－１０及びＴＧＦ－βの発現は上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｄ、図１１Ｅ）。また、ＭＬＮにおいて、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して、Ｆｏｘｐ３の発現が有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｅ）。ＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスにおいて、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｅ）。
　大腸の培養上清を解析したところ、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与されたマウスの大腸において、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの産生がＰＢＳを投与されたマウスと比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図１１Ｆ）。また、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１を投与することで、腸炎マウスのＭＬＮ細胞のＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＭＣＰ－１の産生は顕著に減少した（Ｐ＜０.０１）（図１１Ｇ）。
（実施例１１）
（１）マウスＣＡ　Ｉの調製
　マウスＣＡ　ＩのｃＤＮＡ（以下、ｍＣＡ１という）を以下のプライマーを用いて増幅させた。
　　フォワード：ＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡ（配列番号８）
　　リバース　：ＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧ（配列番号９）
　増幅させたＤＮＡは、ＰｓｈＡＩ及びＢａｍＨＩサイトでプラスミドｐＥＴ４５ｂ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社，ダルムシュタット，ドイツ）に挿入し、Ｎ末端に６個のＨｉｓからなるタグを有するｍＣＡ１を発現するｐＥＴ－ｍＣＡ１－Ｈｉｓ６コンストラクトを構築した。構築したコンストラクトは、サイクルシークエンス法により確認した。Ｈｉｓ－ＣＡ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、金属（Ｎｉ２＋）アフィニティクロマトグラフィにより精製後、ＰＢＳ中で透析することによりイミダゾールを除去した。ＥｎｄＴｒａｐ（登録商標）ｒｅｄカラム（Ｈｙｇｌｏｓ　ＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いてエンドトキシンを除去した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後、ゲルをＤｅｅｐ　Ｐｕｒｐｌｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｉｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色した。ゲルイメージをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＴＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析し、タンパク質の純度を計算した。空のプラスミドｐＥＴ４５ｂを用いてｍＣＡ１と同様に調節したコントロールタンパク質をＣＡＩ－ｃｏｎｔｒｏｌとした。
（２）抗原及び投与レジメン
　ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎モデルにおいて、ｍＣＡ１の経口投与が腸炎を改善するか否かを評価するため、過去の報告（Ｆａｒｉａ　ＡＭ，ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ　２００３：２０：１３５－４５）に従い、Ｃ．Ｂ－１７　ＳＣＩＤマウス（日本クレア株式会社）に飲料水として０．６％ｍＣＡ１溶液を５日間（第－７日目から第－２日目まで）連日投与した。個別にケージに入れたマウスは、４．５±０．５ｍＬ／日のｍＣＡ１溶液を摂取し、一群のマウスの平均消費量は５．０±０．５ｍＬ／日であった。一日当りのｍＣＡ１投与量の合計は、平均消費量（５ｍＬ/日）を基礎として計算した。ＰＢＳ中のｍＣＡ１を含むボトルはコンタミネーションを避けるため一日に二回交換した。連続的摂取は５日間継続した。コントロール群はＰＢＳ、又は、ＣＡＩ－ｃｏｎｔｒｏｌを５日間投与した。ｍＣＡ１経口投与７日後（第０日目）に、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（３×１０５細胞／マウス）をSCIDマウスに腹腔内投与した。
（３）評価
　マウスの体重測定、マウスから採取した大腸の長さの測定、大腸炎の組織学的評価、大腸における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定、ＭＬＮにおける転写因子及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現、Ｅｘ　Ｖｉｖｏで培養した大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定、並びに、ＭＬＮ細胞の炎症性サイトカイン産生量の測定を、実施例１０と同様に行った。
（４）結果
　ＣＡ　Ｉの経口投与はＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を改善した。移植の４週間後、ｍＣＡ１を投与したマウスの体重は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ａ）。また、移植の４週間後の肉眼的観察において、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスの大腸長は有意に長かった（Ｐ＜０．００１）（図１２Ｂ）。組織学的スコアでは、ｍＣＡ１を投与したマウスは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して有意に低いスコアを示した（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｃ）。
　また、炎症性腸疾患モデルマウスの大腸におけるＩＬ－１０のｍＲＮＡ発現は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて有意に上昇していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。ＭＬＮにおけるＩＬ－１７及びＲＯＲγＴｍＲＮＡの発現は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて、有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｅ）。
　ＰＢＳ又はｍＣＡ１を投与した炎症性腸疾患モデルマウスから採取した大腸切片及びＭＬＮからのサイトカイン産生を測定した結果、大腸におけるＩＬ－６とＭＣＰ－１の産生は、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、ｍＣＡ１を投与したマウスにおいて有意に低下していた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｆ）。加えて、ｍＣＡ１経口投与は、ＭＬＮによるＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１、及びＴＮＦαの産生を著しく低下させ、ＩＦＮγの産生を上昇させた（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｇ）。
　以上の結果から、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎の進行を抑制すること、ＣＢＡの主要な抗原であるＣＡ　Ｉが制御性樹状細胞による大腸炎発症抑制に重要な役割を果たすこと、ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞が、ＭＬＮにおいて、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を誘導し、Ｔ－ヘルパー１７細胞を減少させること、及び、ＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞がｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＩＬ－１０産生ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を誘導することが示された。また、本実験の結果はＲｅｇ－ＤＣｓＣＢＡによる治療が、腸炎の臨床的及び病理組織学的な重症度を改善させることを示している。また、ＫＬＨではなくＣＢＡでパルスした制御性樹状細胞のみが腸炎を抑制した。更に、ＣＢＡの主要タンパク質がＣＡ　Ｉであることが示された。これらの結果から、制御性樹状細胞は、抗原特異的に腸炎を抑制しており、ＣＢＡ及びその主要抗原であるＣＡ　Ｉが炎症性腸疾患の主要な標的であることが示された。また、本実験において、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎で顕著に減少したＣＡ　Ｉの発現は、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＢＡを投与することにより維持された。また、Ｒｅｇ－ＤＣｓＣＡ１は、このマウスの腸炎モデルにおいて腸炎抑制効果を示した。これらの結果から、ＣＡ　Ｉが炎症性腸疾患における特異的な抗原であることが示された。更に、本実験において、ＣＡ　Ｉの経口投与は、前記の炎症性腸疾患モデルマウスにおいて腸炎抑制効果を示した。これらの結果から、ＣＡ　Ｉが炎症性腸疾患における特異的な抗原であることが示された。
　これらの結果から、ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞はＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＴｈ１７細胞のバランスをコントロールすることで、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞移入腸炎の進展を抑制することが明らかとなった。ＣＡ　Ｉでパルスした制御性樹状細胞による細胞療法が炎症性腸疾患に対して新しい治療法となることが示唆された。また、ＣＡ　Ｉが炎症性腸疾患の治療薬又は予防薬となることが示唆された。

Claims (30)

  1. 　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉを有効成分として含有する医薬組成物。
  2. 　自己免疫疾患の治療又は予防が、寛容原性抗原提示細胞に基づく細胞治療である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉに特異的な寛容原性抗原提示細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
  6. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　自己免疫疾患の治療又は予防において使用するための炭酸脱水酵素Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
  8. 　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項５～請求項７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の調製に使用するための炭酸脱水酵素Ｉを含有する組成物。
  10. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項９に記載の組成物。
  11. 　炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする、患者における免疫寛容の誘導方法。
  12. 　寛容原性抗原提示細胞に基づくことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、請求項１２に記載の方法。
  14. 　寛容原性抗原提示細胞を調製するステップ、
    　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
    　パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、請求項１１～請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項１１～請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする自己免疫疾患の治療又は予防方法。
  17. 　炭酸脱水酵素Ｉを患者に投与することを備える、請求項１７に記載の自己免疫疾患の治療又は予防方法。
  18. 　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを備える、請求項１７に記載の自己免疫疾患の治療又は予防方法。
  19. 　患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、
    　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、及び、
    　パルスした寛容原性抗原提示細胞を患者に投与するステップを備える、請求項１８に記載の治療又は予防方法。
  20. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項１８又は請求項１９に記載の治療又は予防方法。
  21. 　自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１６～請求項２０のいずれか１項に記載の治療又は予防方法。
  22. 　炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な寛容原性抗原提示細胞の製造方法。
  23. 　患者から寛容原性抗原提示細胞を採取するステップ、及び、
    　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップを備える、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項２２又は請求項２３に記載の製造方法。
  25. 　炭酸脱水酵素Ｉを使用することを特徴とする抗原特異的な制御性Ｔ細胞の製造方法。
  26. 　寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製するステップ、
    　炭酸脱水酵素Ｉで寛容原性抗原提示細胞をパルスするステップ、
    　パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させるステップを備える、請求項２５に記載の製造方法。
  27. 　寛容原性抗原提示細胞が、制御性樹状細胞である、請求項２５又は請求項２６に記載の製造方法。
  28. 　炭酸脱水酵素Ｉに特異的な免疫原性抗原提示細胞。
  29. 　免疫原性抗原提示細胞が制御性樹状細胞である請求項２８に記載の細胞。
  30. 　炭酸脱水酵素Ｉに特異的な制御性Ｔ細胞。
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