WO2011030724A1 - 植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の利用 - Google Patents

植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の利用 Download PDF

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8259—Phytoremediation

Definitions

  • the present invention relates to the use of genes involved in cadmium accumulation in plants.
  • Cadmium is known as a causative agent of Itai-itai disease and is a highly toxic heavy metal.
  • Cadmium is a heavy metal that exists naturally in minerals and soils, and is present together with metals such as silver, copper, and zinc. Therefore, cadmium is discharged into the environment and accumulated in the soil as a by-product when mining and refining these metals. Is done.
  • Cadmium is taken into the human body through various crops such as vegetables and cereals grown in soil contaminated with cadmium, which adversely affects our health. For this reason, in order to limit the cadmium intake from agricultural products in Japan, the standard value of the cadmium concentration contained in agricultural products is defined by the Food Sanitation Law. For example, rice with a cadmium concentration of 0.4 ppm or more and less than 1.0 ppm in brown rice is banned from selling as edible, and rice with a cadmium concentration of 1 ppm or more is prohibited from being sold or processed, and incinerated as a matter of fact. ing.
  • Patent Document 1 In order to keep the cadmium concentration in crops such as rice below the standard value and to ensure food safety, attempts have been made to purify soil contaminated with cadmium by methods such as soil washing, land reclamation, and customer land. (For example, see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to identify a gene involved in cadmium accumulation in a plant and provide a method for using the gene.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, the present inventors discovered for the first time that the OsHMA3 gene seated on the chromosome 7 of rice is involved in cadmium transport in plants, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
  • the method for producing a transformed plant according to the present invention is a method for producing a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed, and any one of the following polynucleotides (a) to (d): It is characterized by introducing it into plants so that it can be expressed: (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the localization of cadmium accumulation A polynucleotide encoding the polypeptide; (C) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted,
  • the transformed plant according to the present invention is characterized by being produced by the method for producing a transformed plant according to the present invention.
  • the kit according to the present invention is a kit for producing a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed, and comprises any one of the following polynucleotides (a) to (d): It is characterized by: (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the localization of cadmium accumulation A polynucleotide encoding the polypeptide; (C) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the localization of
  • transformed plants According to the method for producing a transformed plant according to the present invention, there is an excellent effect that it is possible to produce a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed. Specifically, compared to wild-type plants, transformed plants that have changed the localization of cadmium accumulation to the roots or changed the localization of cadmium accumulation to plants other than the roots. Can be produced.
  • the transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed to roots can be cultivated in soil containing cadmium because cadmium is difficult to accumulate in the plant body excluding the roots.
  • transformed plants that have changed the localization of cadmium accumulation to plants excluding roots are cultivated in soil containing cadmium, thereby removing soil cadmium at low cost and easily. It can be suitably used as a plant for use.
  • kits according to the present invention a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed can be easily produced.
  • A, H, and B indicate the genotypes of markers in the vicinity where quantitative loci are detected, “A” is Anjana-Dahn type, “H” is heterozygous, “B” "Represents Nipponbare type. It is a figure showing the result of having performed PCR about the rice of seven lines with high cadmium concentration in a grain.
  • TM1 to TM8 indicate transmembrane domains. It is a graph showing the result of quantitative PCR. It is a figure showing the result of the functional analysis of OsHMA3 gene using yeast. It is a graph showing the result of having measured the cadmium density
  • FIG. 9 (a) shows the measurement result in the conduit fluid, (b) the above-ground part, and (c) the root measurement result. It is a graph showing the cadmium absorption ability of Anjana Daan and Nipponbare root.
  • FIG. 4 shows the results of functional analysis in yeast for metals, (a) galactose and 4 mM of ⁇ zrc1 yeast strain transduced with only pYES2 vector, OsHMA3n gene, OsHMA3a gene, or AtHMA3 gene as a positive control.
  • FIG. 1 Shows growth in the presence of ZnSO 4 , (b) galactose and 2.5 mM CoCl 2 of ⁇ cot1 yeast strain transduced with either pYES2 vector alone, OsHMA3n gene, OsHMA3a gene, or AtHMA3 gene as a positive control.
  • C shows the pYES2 vector only, OsHMA3a gene, OsHMA3aH80R gene, OsHMA3aV638A gene, OsHMA3aH 0R / V638A gene or wild-type yeast cells transduced with either OsHMA3n gene, shows the growth in the presence of galactose and 20 [mu] M CdSO 4.
  • the method for producing a transformed plant according to the present invention is a method for producing a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed, and any one of the following polynucleotides (a) to (d): It includes the steps of introducing into a plant such that it can be expressed: (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the localization of cadmium accumulation A polynucleotide encoding the polypeptide; (C) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or
  • the present inventor newly identified genes (OsHMA3n gene and OsHMA3a gene) involved in cadmium transport into cells from rice.
  • the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are translation products of the OsHMA3n gene and the OsHMA3a gene, respectively. That is, the polypeptide consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 is a protein newly identified from rice by the present inventors and involved in the transport of cadmium into cells. That is, it can be said that the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have the activity of changing the localization of cadmium accumulation.
  • OsHMA3n gene and the OsHMA3a gene may be simply referred to as “OsHMA3 gene”, and the OsHMA3n protein and the OsHMA3a protein may be simply referred to as “OsHMA3 protein”.
  • Examples of the polynucleotide (a) or (b) above include a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • examples of the polynucleotide (c) or (d) include a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the localization of cadmium accumulation has been changed is compared with a wild-type plant into which any one of the polynucleotides (a) to (d) is not introduced.
  • the localization of cadmium accumulation in the transformed plant is changed to the root, or the localization of cadmium accumulation in the transformed plant is changed to a plant excluding the root.
  • the above “plant body excluding roots” intends a part other than the roots of the plant body including, for example, stems, leaves, grains and the like.
  • the “plant excluding roots” may be referred to as “aboveground part”.
  • the change in the localization of cadmium accumulation means that wild-type plants and transformed plants are cultivated under the same conditions. This can be confirmed by comparing the amount of cadmium accumulated in.
  • the accumulated amount of cadmium can be measured, for example, by the method shown in the examples described later.
  • cadmium may be ionized or may form a salt.
  • cadmium indicates cadmium and a compound containing cadmium.
  • polypeptide can also be referred to as “peptide” or “protein”.
  • the above “one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added” means that substitution, deletion, or addition is performed by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis.
  • amino acids as possible (for example, 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 7 or less, even more preferably 5 or less, particularly preferably 3 or less) amino acids are substituted, deleted, and / or added.
  • Such a mutant polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, but is a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant polypeptide. It may be.
  • polynucleotide can also be referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”, and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • the “base sequence” can also be referred to as “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”, and is shown as a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T).
  • the “polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1” refers to a polynucleotide consisting of the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1.
  • the method for obtaining the polynucleotide is not particularly limited, but can be obtained by a known technique. For example, it can be obtained by a method using amplification means such as PCR. Specifically, for the polynucleotides (a) to (d), primers corresponding to the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences) are prepared, and genomic DNA ( Alternatively, a large amount of DNA fragments containing the above-described polynucleotide can be obtained by performing PCR or the like using a cDNA) as a template and amplifying a DNA region sandwiched between both primers.
  • amplification means such as PCR.
  • a primer capable of amplifying the OsHMA3 gene region is designed, and using that primer, the genomic DNA (or cDNA) or RT-PCR product is used as a template and the OsHMA3 gene region.
  • the polynucleotide can also be obtained by amplifying.
  • a polynucleotide can be obtained by a method of isolating and cloning a DNA fragment containing an oligonucleotide containing the polynucleotide or a partial sequence thereof.
  • a probe that specifically hybridizes with a part of the nucleotide sequence of the polynucleotides (a) to (d) above may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library may be screened.
  • those having any sequence and / or length can be used as long as they specifically hybridize with at least a part of the base sequence of the polynucleotide or its complementary sequence.
  • the source for obtaining the polynucleotide is not particularly limited, but the polypeptide consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (OsHMA3 protein) is derived from rice, Nihonbare. It is preferable to use a family plant (rice, corn, etc.).
  • RNA for example, mRNA
  • DNA for example, cDNA or genome
  • the “plant” into which the polynucleotide is introduced is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a grass family plant, a solanaceous plant, a legume plant, etc. can be mentioned.
  • Examples of the above “Poaceae plants” include rice, barley, wheat, corn, rye, sorghum and the like.
  • Examples of the above “Solanaceae plants” include eggplants and the like.
  • Examples of the “leguminous plant” include soybean.
  • the method for producing a transformed plant with altered localization of cadmium accumulation introduces the polynucleotide of any one of (a) to (d) above, or a recombinant expression vector containing the polynucleotide.
  • the polypeptide is not particularly limited as long as it expresses a polypeptide having an activity of changing the localization of cadmium accumulation.
  • the “activity for changing the localization of cadmium accumulation” means “compared with a wild-type plant into which any one of the polynucleotides (a) to (d) is not introduced”.
  • the activity of changing the localization of cadmium accumulation in the transformed plant to the root or the activity of changing the localization of cadmium accumulation in the transformed plant to the plant body excluding the root is intended.
  • the type of the “recombinant expression vector” is not particularly limited as long as it contains any of the polynucleotides (a) to (d).
  • a recombinant expression vector into which the cDNA shown in SEQ ID NO: 3 or 4 is inserted can be mentioned.
  • a plasmid, a cosmid or the like can be used, but the present invention is not limited to these.
  • the “recombinant expression vector” is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in plant cells (hereinafter also referred to as “host cells”).
  • host cells plant cells
  • a recombinant expression vector is introduced into a plant by a method using Agrobacterium (Agrobacterium infection method)
  • a binary vector such as pBI as the recombinant expression vector.
  • binary vectors include pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, and pBI221.
  • the “recombinant expression vector” is preferably a vector having a promoter capable of expressing a gene in cells of a plant to be introduced (plant to be introduced).
  • a known promoter can be preferably used as the promoter. Examples thereof include cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), ubiquitin promoter, actin promoter, and the like.
  • CaMV35S cauliflower mosaic virus 35S promoter
  • ubiquitin promoter ubiquitin promoter
  • actin promoter actin promoter
  • the introduced polynucleotide is suitably expressed in plant cells. Can do.
  • OsHMA3 protein is mainly expressed in plant roots. Therefore, from the viewpoint of suitably functioning the OsHMA3 protein in the transformed plant, it is preferable to introduce any one of the polynucleotides (a) to (d) so that they can be specifically expressed in the root of the plant.
  • the polynucleotide (a) to (d) above under the control of a promoter known to control a gene specifically expressed in roots, the above (a) Any of the polynucleotides (d) to (d) can be specifically expressed in the root of the plant.
  • a promoter for example, the OsHMA3 promoter can be used.
  • the method for introducing the polynucleotide or the recombinant expression vector into a plant is not particularly limited.
  • the polynucleotide or the recombinant expression vector may be integrated into a chromosome, or the polynucleotide may be integrated into a specific site of the chromosome by homologous recombination.
  • the polynucleotide or the recombinant expression vector may be transiently expressed in a plant.
  • a conventionally known genetic engineering technique (gene manipulation technique) can be used.
  • conventionally known methods such as Agrobacterium infection method, electroporation method (electroporation method), calcium phosphate method, protoplast method, lithium acetate method, and particle gun method can be suitably used.
  • Agrobacterium infection method the method described in Plant, J. 6: 271-282 (1994) can be used.
  • the polynucleotide or the recombinant expression vector is introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell can be confirmed using various markers.
  • a drug resistance gene that gives resistance to an antibiotic such as hygromycin is used as a marker
  • a plasmid containing this marker and any of the polynucleotides (a) to (d) above is used as an expression vector for host cells.
  • it can be confirmed by drug selection whether or not the introduced gene is reliably expressed in the host cell.
  • a transformed plant produced by the method for producing a transformed plant according to the present invention is introduced with the polynucleotide of any one of (a) to (d) above, or the above-described recombinant expression vector, and cadmium It expresses a polypeptide having an activity that changes the localization of accumulation. That is, a transformed plant produced by the method for producing a transformed plant according to the present invention is compared with a wild-type plant into which any of the polynucleotides (OsHMA3 gene) described in (a) to (d) above is not introduced. Thus, the localization of cadmium accumulation has changed.
  • the polynucleotide (a) or (b) corresponds to the OsHMA3n gene derived from Nipponbare. For this reason, in the transformed plant into which the polynucleotide of (a) or (b) is introduced, the accumulation of cadmium in the root is improved as compared with the wild type plant into which these polynucleotides are not introduced. In addition, it is considered that the accumulation of cadmium in a plant body (for example, a grain or the like) excluding the root is lowered.
  • the polynucleotide (c) or (d) corresponds to the OsHMA3a gene derived from Anjana Daan. For this reason, in the transformed plant into which the polynucleotide (c) or (d) is introduced, the accumulation of cadmium in the root is reduced as compared with the wild type plant into which these polynucleotides are not introduced. And it is thought that the accumulation
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed can be easily produced.
  • the plant is preferably a gramineous plant.
  • the transformed plant according to the present invention is characterized by being produced by the method for producing a transformed plant according to the present invention.
  • the category of transformed plants according to the present invention includes not only plant bodies but also various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus. Moreover, once a transformed plant in which the polynucleotide of any one of the above (a) to (d) is incorporated into the plant chromosome is obtained by the production method of the transformed plant according to the present invention, it is obtained from the plant. The above polynucleotide is also introduced into seeds. Accordingly, the present invention also includes seeds obtained from transformed plants.
  • the transformed plant according to the present invention can be used for various purposes because the localization of cadmium accumulation is changed.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed to roots can be cultivated even in soil containing cadmium because cadmium is difficult to accumulate in a plant body other than the roots.
  • cultivating a transformed plant that has changed the localization of cadmium accumulation to a plant body excluding the roots in soil containing cadmium can efficiently accumulate cadmium in the soil in the transformed plant. it can.
  • the transformed plant provided with this property can be used to remove cadmium from soil containing cadmium.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed to a plant body excluding roots is cultivated in soil containing cadmium, and the cultivated transformed plant is harvested and disposed of by incineration or the like.
  • cadmium contained in the soil can be efficiently removed.
  • the kit according to the present invention is a kit for producing a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed, and comprises any one of the following polynucleotides (a) to (d): It is characterized by: (A) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the localization of cadmium accumulation A polynucleotide encoding the polypeptide; (C) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added, and has an activity of changing the
  • polynucleotide is the same as that described in the section “1. Method for producing transformed plant”, and is omitted here.
  • the kit according to the present invention may contain components other than the polynucleotide described above.
  • a plasmid for preparing a recombinant expression vector containing the above polynucleotide a reagent necessary for preparing the recombinant expression vector, a buffer, a reagent necessary for transforming a plant, etc. Also good.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed can be easily produced.
  • FIG. 1 is a graph showing the cadmium concentration in 131 grains of rice cultivated in a field not contaminated with cadmium. As shown in FIG. 1, it became clear that the density
  • FIG. 2 is a graph showing the cadmium concentration in the above-ground part and brown rice for Anjana Daan and Nipponbare grown in a field not contaminated with cadmium.
  • the above-mentioned “terrestrial part” refers to a part on the ground, that is, a part including rice stems and leaves, and grain is not included in the above-mentioned part.
  • the cadmium concentration contained in the above-ground part of Anjana Daan was 28 times higher and the cadmium concentration contained in brown rice was 15 times higher than that of Nipponbare.
  • FIG. 3 is a graph showing the cadmium concentration in the above-ground part and brown rice for Anjana Daan and Nipponbare cultivated in cadmium-contaminated soil. As shown in FIG. 3, it was revealed that the cadmium concentration contained in the above-ground part of Anjana Daan was 6 times higher and the cadmium concentration contained in brown rice was 8 times higher than that of Nipponbare.
  • F 2 population obtained was examined quantitative traits involved in the accumulation of cadmium. Specifically, F 2 population obtained using the 1/2 Kimura B solution containing 50 nM cadmium was cultivated for 10 days, and the cadmium concentration in the above-ground part was measured.
  • 1/2 Kimura B solution is macronutrient (mM): MgSO 4 (0.28), (NH 4 ) 2 SO 4 (0.18), Ca (NO 3 ) 2 (0.18), KNO 3 (0.09), KH 2 PO 4 (0.09), and micronutrients (mM): Fe (II) SO 4 (10), H 3 BO 3 (3), MnCl 2 (0.5), A culture medium containing CuSO 4 (0.2), ZnSO 4 (0.4), (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 (1).
  • the 1/2 Kimura B solution was adjusted to pH 5.4 with 1N NaOH.
  • FIG. 4 is a graph showing the relative value of the cadmium concentration contained in the above-ground part of the F 2 population when the cadmium concentration contained in the above-ground part of Anjana Daan is set to 100.
  • A, H, and B indicate the genotypes of markers in the vicinity where the quantitative locus (QTL) is detected, “A” is the Anjana-Dahn type, and “H” is the heterozygous type. , “B” represents Nipponbare type.
  • the cadmium concentration in the above-ground part in the F 2 population was separated into 3: 1. From this result, it became clear that the difference in the cadmium concentration in the above-ground part between Anjana Daan and Nipponbare is caused by the difference of one gene.
  • QTL analysis was performed in order to detect a gene locus that defines the amount of cadmium accumulated in the above-ground part of the F 2 population.
  • the QTL analysis was performed using qtl cartographer version 2.5 (provided by North Carolina State University Bioinformatics Research Center, http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm).
  • qtl cartographer version 2.5 provided by North Carolina State University Bioinformatics Research Center, http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm.
  • the candidate region where QTL involved in the accumulation of cadmium on the ground is located is sandwiched between the markers RM21251 and RM21275. It was possible to narrow it down to a range of 500 kb. Genes present in this region were searched using RAP-DB (http://rapdb.dna.affrc.go.jp/), a database that records and discloses rice genome annotation information. As a result, it was revealed that 32 predicted genes exist between the markers RM21251 and RM21275. Among them, OsHMA3, in which a base sequence difference was recognized between Anjana Daan and Nipponbare, was considered to be a gene involved in cadmium transport.
  • cDNA was prepared from 6 lines shown in Table 1 with high cadmium concentration contained in the grain and Nipponbare, and PCR was performed using the cDNA as a template.
  • primers were designed at the C-terminal side of OsHMA3, that is, in the region where the PCR amplification product in Nipponbare was 848 bp, and PCR was performed.
  • a PCR reaction solution was prepared using Ex Taq (product name, manufactured by TaKaRa), and amplification was performed using a Mastercycler (product name, manufactured by Eppendorf).
  • the reaction conditions for PCR were initial denaturation 94 ° C. 20 seconds, denaturation 98 ° C. 10 seconds, annealing 62 ° C. 30 seconds, extension 72 ° C. 60 seconds, and the process of denaturation to extension was repeated 35 times.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of performing PCR on seven lines of rice having a high cadmium concentration in the grain.
  • Jarjan and Anjana Daan which are the top two varieties with the highest cadmium concentration in the grain, have a short PCR amplification product.
  • the OsHMA3 gene was isolated from each of Anjana Daan and Nipponbare by the following method. Specifically, for the ORF of the OsHMA3n gene derived from Nipponbare, primers were designed for the N-terminus and C-terminus based on the information in the database (RAP-DB), and the gene was amplified by PCR. The OsHMA3a gene derived from Anjana Daan was subjected to 5′-RACE and 3′-RACE using a SMART RACE cDNA Amplification kit (product name, manufactured by Clontech) to isolate the ORF.
  • SMART RACE cDNA Amplification kit product name, manufactured by Clontech
  • OsHMA3 protein The amino acid sequence of OsHMA3 protein (OsHMA3n protein) derived from Nipponbare is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of the OsHMA3 gene (OsHMA3n gene) derived from Nipponbare is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the OsHMA3 protein (OsHMA3a protein) derived from Anjana Daan is shown in SEQ ID NO: 2
  • the base sequence of the OsHMA3 gene (OsHMA3a gene) derived from Anjana Daan is shown in SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of comparing the amino acid sequences of OsHMA3a protein and OsHMA3n protein in Nipponbare and Anjana Daan.
  • TM1 to TM8 indicate transmembrane domains.
  • a deletion of 53 amino acids was observed in the C-terminal region as compared to the OsHMA3n protein derived from Nipponbare. From the above, it was considered that the OsHMA3a protein derived from Anjana Daan may not function normally.
  • the homology between the OsHMA3a protein and the OsHMA3n protein was 91.4%.
  • a PCR reaction solution was prepared using Thunderbridge SYBR qPCR Mix (product name, manufactured by Toyobo), and amplification was performed using Mastercycler ep Realplex real-time PCR (product name, manufactured by Eppendorf). PCR reaction conditions were initial denaturation 95 ° C. for 30 seconds, denaturation 95 ° C. for 30 seconds, annealing 62 ° C. for 20 seconds, extension at 72 ° C. for 35 seconds, and the process of denaturation to extension was repeated 40 times.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of quantitative PCR. As shown in FIG. 7, it was revealed that the OsHMA3 gene is mainly expressed in roots. The addition of cadmium did not affect the expression level of the OsHMA3 gene. Also, no significant difference was observed in the expression level of the OsHMA3 gene between Anjana Daan and Nipponbare regardless of the presence or absence of cadmium. From this result, it is clear that the factor causing the difference in the cadmium concentration contained in the above-ground part between Anjana Daan and Nipponbare is not the difference in the expression level of the OsHMA3 gene but the difference in the function of the OsHMA3 protein. Became.
  • OsHMA3 gene isolated from Anjana Daan and Nipponbare was expressed in yeast, and the cadmium transport activity of the OsHMA3 protein was analyzed.
  • OsHMA3 derived from each of Nipponbare and Anjana Daan was introduced into yeast (BY4741 strain, purchased from Euroscarf) using expression vector pYES2 (manufactured by Invitrogen) by a conventionally known lithium acetate method. Only pYES2 vector was introduced as a negative control.
  • the obtained transformed yeast was inoculated on an agar medium containing 0 ⁇ M, 10 ⁇ M or 20 ⁇ M cadmium and cultured at 30 ° C. for 42 hours. Specifically, first, the transformed yeast was cultured in a logarithmic growth phase (OD 0.5 to 1.0) using a liquid SC medium containing 2% glucose and not containing uracil. Based on the measured OD, the density of each strain is kept constant, the transformed yeast is washed three times with sterilized water, and then a 10-fold dilution series of 5 steps is made, and the transformed yeast is spotted on an agar medium by 5 ⁇ L each. did. SC medium from which uracil was removed was used as the agar medium. In order to induce the expression of the OsHMA3 gene by the GAL1 promoter, galactose was used as the carbon source.
  • OsHMA3 protein is an excretory transporter.
  • yeast that expresses OsHMA3 protein, cadmium in the cytoplasm is concentrated in specific organelles. Therefore, growth is suppressed by the toxicity of cadmium. The presence or absence of cadmium transport activity was determined.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of functional analysis of OsHMA3 protein using yeast.
  • the yeast expressing the OsHMA3n protein derived from Nipponbare was inhibited from growing in a cadmium-containing medium as compared to the yeast introduced with the pYES2 vector as a negative control. From this result, it was revealed that Nipponbare-derived OsHMA3n protein has cadmium transport activity.
  • the growth of the yeast expressing the OsHMA3a protein derived from Anjana Daan was the same as the yeast introduced with the pYES2 vector as a negative control. From this result, it was revealed that the OsHMA3a protein derived from Anjana Daan has no cadmium transport activity.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the cadmium concentration in the conduit fluid, the above-ground part, and the roots over time for Anjana Daan and Nipponbare.
  • (a) shows the measurement result in the conduit fluid
  • (b) the above-ground part shows the root measurement result.
  • the concentration of cadmium in the conduit fluid and above-ground part of Anjana Daan on the fifth day of culture is 6 times in the conduit liquid and 3 times in the above-ground part compared to the cadmium concentration of each part in Nipponbare. It became clear that it was expensive.
  • FIG. 10 is a graph showing the cadmium absorption ability of Anjana Daan and Nipponbare root. When exposed to culture medium of any cadmium concentration, Nipponbare with low cadmium accumulation showed higher cadmium absorption capacity than roots with high accumulation, Anjana Daan. This result shows that the cause of high cadmium accumulation in the above-ground part and grains of Anjana Daan is not due to the high ability to absorb cadmium from the outside.
  • the concentration of cadmium in the conduit fluids of Nipponbare and Anjana Daan was analyzed. Specifically, in 1/2 Kimura B solution containing 0 ⁇ M to 5 ⁇ M cadmium, the roots of Anjana Daan and Nihonbare seedlings on the 33rd day after seeding were cultured for 3 days, The cadmium concentration of was measured.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the concentration of cadmium contained in the conduit fluid of Anjana Daan and Nipponbare.
  • the cadmium concentration in the conduit fluid was saturated when the cadmium concentration in the culture solution was 0.5 ⁇ M.
  • Anjana Daan's duct fluid contained 8.5 times higher concentration of cadmium than Nipponbare.
  • Nipponbare genomic DNA was used as a template, and a 6.8 kb DNA fragment having a 2.1 kb promoter and a full-length OsHMA3n gene was amplified by PCR.
  • the primer pairs used to amplify the two DNA fragments were 5′-atctagaAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-GGATGCGTCAATCAGTTTACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 6); 5′-GGCACAATGAACTTTGACGGT-3 ′, respectively. (SEQ ID NO: 7) and 5′-CTCTTCTGGACAAGCTTCCTTAATC-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • the two DNA fragments were cloned into the pTA2 vector and then ligated using the restriction enzyme site AflII.
  • the fused 6.8 kb DNA was then inserted into the binary vector pPZP2H-lac.
  • the prepared construct was transformed into callus derived from Anjana Daan by a method using Agrobacterium tumefaciens (EHA101 strain).
  • the transformed plants were pre-cultured on gel for approximately 100 days.
  • the transformed seedlings were cultivated in a nutrient solution for 1 to 3 weeks and then subjected to cadmium treatment.
  • seedlings were exposed for 10 days to a nutrient solution containing 50 nM CdSO 4 .
  • the treatment solution was changed every 2 days.
  • FIG. 12 is a diagram showing the result of complementarity test.
  • the concentration of other micronutrients and macronutrients in the root and above-ground parts was not different between the control and the transformed strain.
  • RNAi strain (4. Functional analysis of RNAi strain) The accumulation of cadmium in an RNAi strain in which expression of the OsHMA3 gene was knocked down by RNAi in Nipponbare was examined.
  • RNAi construct a 511 bp fragment of OsHMA3n cDNA (893 bp to 1407 bp from the start of transcription) was cloned into the pANDA vector under the control of the maize ubiquitin promoter as an inverted repeat. did.
  • the primer set 5′-AGGATCCATGGCCGGAAAGGATGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-TGGATCCGCAACATCATCCTTTCACTTCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 10) was used to generate the OsHMA3n gene from the OsHMA3n cDNA by PCR.
  • the NOS terminator was amplified. The amplified fragment was cloned into the pANDA vector, then excised with the maize ubiquitin promoter and subcloned into the pPZP2H-lac binary vector.
  • the prepared construct was introduced into rice callus derived from Nipponbare by the Agrobacterium method.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the amount of cadmium accumulated in the RNAi strain in which the expression of the OsHMA3 gene was knocked down by RNAi in Nipponbare and the control strain into which an empty vector was introduced.
  • (A) of FIG. 15 shows the cadmium concentration in the above-ground part of three types of RNAi strains and control strains in Nipponbare, and (b) shows the cadmium concentration in the roots.
  • Statistical analysis was performed using Dunnett's test.
  • the cadmium concentration in the above-ground part of the RNAi strain was significantly 2.1 to 2.5 times that of the control strain. (P ⁇ 0.05).
  • the cadmium concentration in the roots of the RNAi strain was significantly reduced to 74-60% compared to the control strain (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 16 is a diagram showing the concentration of micronutrients in the RNAi strain in which expression of the OsHMA3 gene was knocked down by RNAi in Nipponbare and the control strain into which an empty vector was introduced.
  • (A) of FIG. 16 shows the expression levels of the OsHMA3 gene in three types of RNAi strains and control strains in Nipponbare, and (b) shows the concentration of micronutrients in the above-ground part and roots of the RNAi strains and control strains.
  • FIG. 16 (a) shows the expression level of the OsHMA3 gene in the RNAi strain relative to the expression level of the OsHMA3 gene in the control strain.
  • the expression level of the OsHMA3 gene was significantly decreased in the RNAi strain compared to the control strain. Further, as shown in FIG. 16 (b), there was no difference between the RNAi strain and the control strain in the concentration of other micronutrients including zinc, copper, manganese and iron in the root and above-ground parts.
  • OsHMA3 gene is a gene involved in the difference in cadmium accumulation between the two varieties of Nipponbare and Anjana Daan.
  • FIG. 17 shows the expression pattern of the OsHMA3 gene.
  • FIG. 17 (a) shows the expression of two alleles of OsHMA3 gene in the roots and aerial parts of Nipponbare and Anjana Daan, and (b) shows the two alleles in different parts of the roots of Nipponbare and Anjana Daan. The expression of is shown.
  • Expression levels were determined by quantitative real-time RT-PCT method.
  • the OsHMA3 gene was expressed at the same level mainly in the roots in two varieties contrasting with respect to cadmium accumulation. Moreover, as shown in FIG. 17 (b), it was shown by spatial analysis that there is no difference in the expression of the OsHMA3 gene between different root parts. Furthermore, it was revealed that OsHMA3 gene expression was not affected by exposure to cadmium. This result indicates that the OsHMA3 gene is constitutively expressed in the two varieties.
  • a rabbit was immunized with a synthetic peptide at positions 993 to 1004 of the amino acid sequence of the OsHMA3n protein (SEQ ID NO: 1), and an antibody against the OsHMA3 protein was obtained. Prior to use, the obtained antiserum was purified through a peptide affinity column. Immunostaining of OsHMA3 protein was performed using the roots of Nipponbare and Anjana Daan (10 days of age each). The fluorescence of the secondary antibody (Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG; Molecular Probes) was observed with a confocal laser microscope (LSM700; manufactured by Carl Zeiss).
  • LSM700 confocal laser microscope
  • the primer set 5′-ATCTAGAAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and 5′-ATCTAGAATGCAAGTGGGGATCAAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) was used by the PCR method.
  • the 2 kb upstream region of the OsHMA3 gene (from -34 bp to -2094 bp from the translation initiation codon) was amplified from Nipponbare genomic DNA.
  • the promoter was cloned into the XbaI site of the GFP and NOS terminators in the pUC18 vector (Takara).
  • the construct with pOsHMA3n-GFP and NOS terminator was subcloned into the pPZP2H-lac binary vector.
  • the prepared construct was introduced into rice callus derived from Nipponbare by the Agrobacterium method.
  • the GFP signal was observed with a confocal laser microscope (LSM700; manufactured by Carl Zeiss).
  • FIG. 18 is a diagram showing the localization of OsHMA3 protein in rice roots.
  • (A) of FIG. 18 shows the result of immunostaining in the root of Anjana Daan, and (b) shows the result of immunostaining in the root of Nipponbare.
  • the scale bar in the figure corresponds to 100 ⁇ m.
  • FIG. 18 (c) shows the fluorescence of GFP protein in Nipponbare root transformed with pOsHMA3n-GFP
  • FIG. 18 (d) shows the fluorescence of GFP protein in wild-type Nipponbare root.
  • the scale bar in the figure corresponds to 100 ⁇ m.
  • the OsHMA3 protein signal was observed outside the nucleus. This revealed that the OsHMA3 protein was localized in the vacuolar membrane.
  • the ORF of the OsHMA3n gene and the OsHMA3a cDNA fragment were amplified using primer sets 5′-ATCCGGAATGGCCGGAAAGGATGAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 17) and 5′-TTCCGGATCCTTTCACTTCACCGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 18).
  • the OsHMA3 fragment was ligated to the 3 ′ end of GFP with a linker sequence (SGGGGGG) and placed in pUC18 (Takara) under the control of the CaMV 35S promoter.
  • the resulting plasmid (pGFP-OsHMA3) or GFP alone was used for particle collision (PDS-1000 / He particle delivery system, Bio-Rad, http : //www.bio-rad.com/) and introduced into onion epidermal cells.
  • the GFP signal was observed with a confocal laser microscope (LSM700; manufactured by Carl Zeiss).
  • FIG. 19 is a diagram showing the intracellular localization of the OsHMA3n protein.
  • FIG. 19 (a) shows GFP fluorescence in onion epidermal cells expressing GFP-OsHMA3n protein
  • FIG. 19 (b) shows GFP fluorescence in onion epidermal cells expressing only GFP protein. ing.
  • the scale bar in the figure corresponds to 100 ⁇ m.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of Western blot analysis.
  • Microsomes were extracted from all of the roots of the overexpressing OsHMA3n protein produced from Nipponbare (137 days of age) and subjected to Western blot analysis using an anti-OsHMA3n antibody.
  • the microsomal fraction was fractionated by a sucrose density gradient.
  • primary antibodies anti-OsHMA3 polyclonal antibody (100-fold dilution), anti- ⁇ -TIP polyclonal antibody (vacuum membrane marker, 1000-fold dilution) and anti-H + -ATPase polyclonal antibody (cell membrane marker) were used.
  • an ECL peroxidase-labeled anti-rabbit antibody (10000-fold dilution, manufactured by GE Healthcare) was used, and a signal was detected using an ECL Plus western blotting detection system (manufactured by GE Healthcare).
  • FIG. 20 shows the specificity of the anti-OsHMA3n antibody, and (b) shows the result of sucrose density gradient analysis.
  • the Western blot analysis using an antibody against OsHMA3 protein confirmed a single band at the predicted size, confirming the specificity of this antibody.
  • sucrose density gradient analysis revealed that OsHMA3 protein is present in the same fraction as ⁇ -TIP, which is a vacuolar membrane marker. From these results, it was revealed that OsHMA3 protein is localized in the vacuolar membrane in rice root cells.
  • Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain (Mat a; his3 ⁇ 1; leu2 ⁇ 0; met15 ⁇ 0; ura3 ⁇ 0) and mutants ⁇ zrc1 strain (Mat a; his3 ⁇ 1; leu2 ⁇ 0; a; his3 ⁇ 1; leu2 ⁇ 0; met15 ⁇ 0; ura3 ⁇ 0; YOR316c :: kanMX4) were purchased from Euroscarf (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html).
  • the OsHMA3a gene and the OsHMA3n gene were amplified by the PCR method.
  • the fragment containing ORF was inserted into pYES2 which is a yeast expression vector.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of functional analysis in yeast for cadmium.
  • FIG. 21 (a) shows the growth in the presence of glucose of wild-type yeast cells (BY4741 strain) transduced with only the pYES2 vector, the OsHMA3n gene, the OsHMA3a gene, the AtHMA3 gene, or two types of chimeric genes.
  • N-OsHMA3n-C-OsHMA3a (OsHMA3na) and N-OsHMA3a-C-OsHMA3n (OsHMA3an) are OsHMA3n protein and OsHMA3a protein at position 501 of the amino acid sequence of OsHMA protein (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2). Is a transformed strain expressing a chimeric protein (see FIG. 22).
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of functional analysis in yeast concerning cadmium.
  • FIG. 23 (a) shows the growth of ⁇ ycf1 yeast cells transduced with either the pYES2 vector alone, the OsHMA3n gene, the OsHMA3a gene, or the AtHMA3 gene in the presence of glucose, and (b) the presence of galactose. Shows growth below. The yeast was cultured for 3 days in a medium containing 2 ⁇ M cadmium.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of functional analysis in yeast on metal.
  • FIG. 24 (a) shows the growth in the presence of galactose and 4 mM ZnSO 4 in a ⁇ zrc1 yeast strain transduced with either the pYES2 vector alone, the OsHMA3n gene, the OsHMA3a gene, or the AtHMA3 gene as a positive control.
  • OsHMA3aH80R, OsHMA3aV638A and OsHMA3aH80R / V638A are site-specific mutants at positions 80 and / or 638 of the base sequence of the OsHMA3a gene (SEQ ID NO: 4).
  • OsHMA3 protein is localized in the vacuolar membrane of rice roots ((a) and (b) of FIG. 19). If the localization of OsHMA3 protein is the same in yeast, functional OsHMA3 protein expression was considered to increase resistance to cadmium. However, the yeast expressing the OsHMA3n gene was strongly sensitive to cadmium ((b) of FIG. 21). This discrepancy was thought to be due to a mislocalization of the OsHMA3 protein in yeast. Specifically, the OsHMA3 protein was considered to be localized in the endoplasmic reticulum in yeast (not shown). Therefore, it was considered that the functional OsHMA3 protein transported cadmium to the endoplasmic reticulum, resulting in increased cadmium sensitivity (FIG. 21 (b)).
  • OsHMA3a protein In order to analyze the mechanism underlying the loss of function in the OsHMA3a gene, two types of chimeric proteins of OsHMA3a protein and OsHMA3n protein were prepared. The most different part between the OsHMA3a protein and the OsHMA3n protein is on the C-terminal side, and in the OsHMA3a protein, 53 amino acid residues are deleted within the repeat of the putative metal binding domain (OsHMA3n protein It has 9 repeats and the OsHMA3a protein has 6 repeats) (see FIG. 6).
  • the N-terminal form of the OsHMA3a protein is fused with the C-terminal form of the OsHMA3n protein, or the amino acid sequence of the OsHMA3n protein (SEQ ID NO: 1).
  • a chimeric protein in which the N-terminal form of the OsHMA3n protein was fused with the C-terminal form of the OsHMA3a protein was used to analyze the role of the metal binding domain repeat in transport activity.
  • the N-OsHMA3n-C-OsHMA3a chimeric protein was more sensitive to cadmium (FIG. 21 (b)).
  • the N-OsHMA3a-C-OsHMA3n chimeric protein had no change in cadmium sensitivity (FIG. 21 (b)).
  • the protein (H80R) in which histidine (His) at position 80 in the amino acid sequence of the OsHMA3a protein (SEQ ID NO: 2) is replaced with arginine (Arg) is highly sensitive to cadmium. It was. However, the cadmium sensitivity did not change in the protein (V638A) in which valine (Val) at position 638 was substituted with alanine (Ala). This result was consistent with the experimental result of the chimeric protein (8b in FIG. 23). In addition, the amino acid substitutions at positions 80 and 638 (H80R / V638A) also had increased sensitivity to cadmium ((c) of FIG. 24). From these results, it was suggested that the amino acid at position 80 of the amino acid sequence of the OsHMA3n protein (SEQ ID NO: 1) may be important for the function of the OsHMA3n protein.
  • FIG. 27 is a diagram showing the effect of overexpression of the OsHMA3n gene on the accumulation of cadmium and other metals, (a) shows the concentration of cadmium in the above-ground part, and (b) shows the concentration of zinc in the above-ground part. The density
  • concentration of the iron in an above-ground part. The data are shown as mean ⁇ standard deviation (n 3). Statistical analysis was performed using Dunnett's test. Note that “**” shown in the graph indicates that there is a significant difference between the vector control strain and the overexpression strain at a risk rate of less than 1%.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed can be used for various purposes.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation has been changed to roots can be cultivated in soil containing cadmium.
  • a transformed plant in which the localization of cadmium accumulation is changed to a plant body excluding roots can be used to purify soil containing cadmium. Therefore, the present invention can be suitably used in agriculture.

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Abstract

　植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供する。本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に発現可能に導入する。

Description

植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の利用
　本発明は植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の利用に関する。
　カドミウムはイタイイタイ病の原因物質として知られ、毒性の強い重金属である。カドミウムは、鉱物中や土壌中等に天然に存在する重金属で、銀・銅・亜鉛等の金属とともに存在することから、これらの金属を採掘、精錬する際の副産物として環境中へ排出され土壌に蓄積される。
　カドミウムに汚染された土壌で栽培された野菜、穀類等の様々な農作物を経由してカドミウムは人体内に取り込まれ、我々の健康に悪影響を与える。このため、我が国では農作物からのカドミウム摂取量を制限するため、食品衛生法によって、農作物に含まれるカドミウム濃度の基準値が定められている。例えば、玄米中におけるカドミウムの濃度が０．４ｐｐｍ以上１．０ｐｐｍ未満のコメは食用としての販売禁止され、カドミウムの濃度が１ｐｐｍ以上のコメは、販売や加工等が禁止され、実態として焼却処分されている。
　コメ等の農作物に含まれるカドミウム濃度を基準値以下とし、食の安全を確保するために、従来、土壌洗浄、埋め立て、客土等の手法によってカドミウムに汚染された土壌を浄化する試みがなされている（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照）。
国際公開第２００４／０３７４５３号パンフレット（２００４年５月６日公開）
Calmano W, Mangold S, Stichnothe H, Thoming J: Clean-up and assessment of metal contaminated soils; in Treatment of Contaminated soil, ed. R. Stegmann, G. Brunner, W. Calmano and G. Matz, p.471-490, Springer, Berlin(2001)
　しかしながら、上述のような土壌洗浄、埋め立て、および客土といった従来の方法は、コストが高い、埋め立てや客土に用いる未汚染土壌の確保が困難である等の問題を有している。また、化学的または物理的に土壌を処理するため生態系が乱れる可能性がある。このため、カドミウムによって汚染された農業用地は利用されずに放棄されている。
　カドミウムによって汚染された農業用地を有効に利用するという観点から、土壌に含有されているカドミウムを蓄積し難い植物を実現することができれば非常に有用であると考えられる。しかし、どのような遺伝子が、植物におけるカドミウムの蓄積に関与するのかは不明であった。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物におけるカドミウムの蓄積に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供することにある。
　本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、イネの７番染色体に座乗するＯｓＨＭＡ３遺伝子が、植物におけるカドミウムの輸送に関与することを本発明者が初めて発見し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
　本発明に係る形質転換植物の生産方法は、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入することを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　本発明に係る形質転換植物は、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴としている。
　本発明に係るキットは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
　本発明に係る形質転換植物の生産方法によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を生産することができるという優れた効果を奏する。具体的には、野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた、またはカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を生産することができる。
　カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、根を除く植物体にカドミウムが蓄積され難いため、カドミウムを含有する土壌においても栽培することができる。また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌において栽培することによって、土壌中のカドミウムを低コスト、且つ容易に除去する土壌浄化用の植物として好適に利用することができる。
　また、本発明に係るキットを用いれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培した１３１系統のイネの穀粒におけるカドミウム濃度を示すグラフである。 カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。 カドミウム汚染土壌において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。 アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度を１００とした場合のＦ２集団の地上部に含まれるカドミウム濃度の相対値を表すグラフである。図４中のＡ、Ｈ、およびＢは、それぞれ量的遺伝子座が検出された近傍のマーカーの遺伝子型を示しており、「Ａ」はアンジャナ・ダーン型、「Ｈ」はヘテロ型、「Ｂ」は日本晴型を表している。 穀粒中のカドミウム濃度が高い７系統のイネについてＰＣＲを行った結果を表す図である。１レーン目：Ｊａｒｊａｎ、２レーン目：アンジャナ・ダーン（Ａｎｊａｎａ　Ｄｈａｎ）、３レーン目：ＩＲ　５８、４レーン目：Ｂｌｅｉｙｏ、５レーン目：ＩＲ３６、６レーン目：ＰＩ３１２７７７である。 日本晴とアンジャナ・ダーンとにおいて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図６において、ＴＭ１～ＴＭ８は、膜貫通ドメインを示している。 定量的ＰＣＲの結果を表すグラフである。 酵母を用いたＯｓＨＭＡ３遺伝子の機能解析の結果を表す図である。 アンジャナ・ダーンおよび日本晴について、導管液、地上部、および根に含まれるカドミウム濃度を経時的に測定した結果を表すグラフである。図９の（ａ）は導管液、（ｂ）は地上部、（ｃ）は根における測定結果を表している。 アンジャナ・ダーンおよび日本晴の根のカドミウム吸収能を表すグラフである。 アンジャナ・ダーンおよび日本晴の導管液に含まれるカドミウムの濃度を測定した結果を表すグラフである。 相補性検定の結果を表す図であり、（ａ）はアンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎを導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。 アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図である。 アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における多量栄養素の濃度を示す図である。 日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株におけるカドミウムの蓄積量を測定した結果を示す図であり、（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。 日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図であり、（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルを示し、（ｂ）はＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部および根における微量栄養素の濃度を示している。 ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを示す図であり、（ａ）は、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根および地上部におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の２つの対立遺伝子の発現を示し、（ｂ）は日本晴およびアンジャナ・ダーンの根の異なる部分における２つの対立遺伝子の発現を示している。 イネの根におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を示す図であり、（ａ）はアンジャナ・ダーンの根における免疫染色の結果を示し、（ｂ）は日本晴の根における免疫染色の結果を示している。 ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の細胞内の局在を示す図であり、（ａ）は、ＧＦＰ－ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示し、（ｂ）はＧＦＰタンパク質のみを発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示している。 ウエスタンブロット解析の結果を示す図であり、（ａ）は、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体の特異性を示し、（ｂ）はショ糖密度勾配解析の結果を示している。 カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＡｔＨＭＡ３遺伝子または２種類のキメラ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型の酵母細胞（ＢＹ４７４１株）の、グルコース存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。 ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質とＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とのキメラタンパク質の概略を示す図である。 カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｙｃｆ１酵母細胞の、グルコースの存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。 金属に関する酵母における機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｚｒｃ１酵母株の、ガラクトースおよび４ｍＭ ＺｎＳＯ４の存在下における成長を示し、（ｂ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｃｏｔ１酵母株の、ガラクトースおよび２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２の存在下における成長を示し、（ｃ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８Ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ遺伝子、またはＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型酵母細胞の、ガラクトースおよび２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下における成長を示している。 カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、玄米におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は玄米における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は玄米における鉄の濃度を示している。 過剰発現株およびベクターコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の発現レベルを示す図である。 カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、地上部におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は地上部における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は地上部における鉄の濃度を示している。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。尚、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。
　〔１．形質転換植物の生産方法〕
　本発明に係る形質転換植物の生産方法は、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入する工程を含んでいる：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　本発明者は、細胞内へのカドミウムの輸送に関与する遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子）を、イネから新たに同定した。上記の配列番号１および２に示すポリペプチドは、それぞれＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子の翻訳産物である。すなわち、配列番号１および２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明者によってイネから新たに同定された、細胞内へのカドミウムの輸送に関与するタンパク質である。つまり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有しているといえる。尚、本明細書では、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を、単に「ＯｓＨＭＡ３遺伝子」と称し、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を、単に「ＯｓＨＭＡ３タンパク質」と称することがある。
　上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
　ここで、本明細書において、上記「カドミウムの蓄積の局在性を変化させた」とは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、形質転換植物におけるカドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた、または形質転換植物におけるカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させたことを意図している。また、上記「根を除く植物体」とは、例えば、茎、葉、穀粒等を含む、植物体の根以外の部分を意図している。尚、本明細書においては、上記「根を除く植物体」を「地上部」と称する場合がある。
　カドミウムの蓄積の局在性が変化したことは、野生型の植物と形質転換植物とを同じ条件で栽培し、栽培後の野生型の植物と形質転換植物とについて、根または根を除く植物体におけるカドミウムの蓄積量を比較することによって確認することができる。カドミウムの蓄積量は、例えば、後述する実施例に示す方法によって測定することができる。
　上記「カドミウム」は、イオン化されているものでも、塩を形成しているものであってもよい。また、上記「カドミウム」は、カドミウムおよびカドミウムを含む化合物を示すものとする。
　また、上記「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」とも換言できる。上記「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、または付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
　また、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図されている。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドを示している。
　上記ポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではないが、公知の技術によって取得することができる。例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法によって取得することができる。具体的には、上記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドについて５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に対応するプライマーをそれぞれ作製し、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することによって、上記のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
　また、公知の日本晴の配列情報に基づいて、ＯｓＨＭＡ３遺伝子領域を増幅できるようなプライマーを設計し、そのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）またはＲＴ－ＰＣＲ産物を鋳型にして、ＯｓＨＭＡ３遺伝子領域を増幅することによっても上記ポリヌクレオチドを取得することができる。
　また、上記ポリヌクレオチドまたはその一部の配列を含むオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法によってもポリヌクレオチドを取得することができる。例えば、上記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものも用いることができる。
　上記ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＯｓＨＭＡ３タンパク質）は、イネである日本晴に由来することから、イネ科植物（イネ、トウモロコシ等）を用いることが好ましい。
　植物に導入される上記「ポリヌクレオチド」の形態としては、植物に発現可能に導入することができる限り特に限定されず、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）であってもよい。
　上記ポリヌクレオチドが導入される上記「植物」としては、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、イネ科植物、ナス科植物、マメ科植物等を挙げることができる。上記「イネ科植物」としては、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソルガム等を挙げることができる。上記「ナス科植物」としては、例えば、ナス等を挙げることができる。上記「マメ科植物」としては、例えば、ダイズ等を挙げることができる。
　本発明に係るカドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法は、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されており、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドを発現させるものであれば、特に限定されるものではない。尚、本明細書において、上記「カドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性」とは、「上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、形質転換植物のカドミウムの蓄積の局在性を根に変化させる活性、または形質転換植物のカドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させる活性」を意図している。
　上記「組換え発現ベクター」は、（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであれば、その種類は特に限定されない。例えば、配列番号３または４に示すｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターを挙げることができる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、コスミド等を用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。
　また、上記「組換え発現ベクター」は、植物の細胞（以下、「ホスト細胞」とも言う）において挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。例えば、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム感染法）によって植物に組換え発現ベクターを導入する場合には、組換え発現ベクターとして、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
　また、上記「組換え発現ベクター」は、導入対象となる植物（導入対象植物）の細胞内において遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーター等を挙げることができる。これらのプロモーター配列と上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとをプラスミド等に組み込んだ組換え発現ベクターとして用いることによって、導入したポリヌクレオチドを植物の細胞内において好適に発現させることができる。中でも、ＯｓＨＭＡ３タンパク質を高発現させる観点から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いることが好ましい。例えば、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を高発現させることにより、カドミウムが地上部により蓄積され難い形質転換植物を生産することができる。また、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を高発現させることにより、カドミウムが地上部により蓄積され易い形質転換植物を生産することができる。
　また、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は主に植物の根に発現することが発明者によって明らかにされた。そこで、形質転換植物においてＯｓＨＭＡ３タンパク質を好適に機能させる観点から、上記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、上記植物の根において特異的に発現可能に導入することが好ましい。
　例えば、根において特異的に発現する遺伝子を制御することが知られているプロモーターの制御下に上記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを導入することによって、上記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、上記植物の根において特異的に発現させることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＯｓＨＭＡ３プロモーターを用いることができる。
　上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを植物に導入する方法、すなわち形質転換方法としては特に限定されるものではない。例えば、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを染色体に組み込ませてもよいし、相同組換えによって上記ポリヌクレオチドが染色体の特定の部位に組み込ませてもよい。また、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターを植物内で一過的に発現させてもよい。
　上記形質転換方法としては、従来公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）を用いることができる。例えば、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、上記「アグロバクテリウム感染法」としては、Plant, J. 6: 271-282 (1994)に記載された方法を用いることができる。
　また、上記ポリヌクレオチド、または上記組換え発現ベクターがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞内で確実に発現しているか否かについては、各種マーカーを用いて確認することができる。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する方法を挙げることができる。この方法を用いれば、薬剤選択によって、導入された遺伝子がホスト細胞内で確実に発現しているか否かを確認することができる。
　本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産された形質転換植物は、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド、または上記の組換え発現ベクターが導入されており、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドを発現しているものである。すなわち、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産された形質転換植物は、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＯｓＨＭＡ３遺伝子）が導入されていない野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性が変化している。
　具体的に説明すると、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドは、日本晴に由来するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子に対応している。このため、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、根におけるカドミウムの蓄積性が向上し、且つ根を除く植物体（例えば、穀粒等）におけるカドミウムの蓄積性が低下すると考えられる。
　一方、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドは、アンジャナ・ダーンに由来するＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子に対応している。このため、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、根におけるカドミウムの蓄積性が低下し、且つ根を除く植物体（例えば、穀粒等）におけるカドミウムの蓄積性が向上すると考えられる。
　従って、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換植物では、これらのポリヌクレオチドが導入されていない野生型の植物と比較して、カドミウムの蓄積の局在性が変化しているといえる。
　本発明に係る形質転換植物の生産方法によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
　本発明に係る形質転換植物の生産方法では、上記植物はイネ科植物であることが好ましい。
　〔２．形質転換植物〕
　本発明に係る形質転換植物は、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴としている。
　上記「本発明に係る形質転換植物の生産方法」については、上記「１．形質転換植物の生産方法」の項において説明した通りであるので、ここでは省略する。
　本発明に係る形質転換植物の範疇には、植物体のみならず、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等も含まれる。また、本発明に係る形質転換植物の生産方法によって、植物の染色体に上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが組み込まれた形質転換植物がいったん得られれば、当該植物から得られる種子にも上記ポリヌクレオチドが導入されている。従って、本発明には、形質転換植物から得られた種子も含まれる。
　本発明に係る形質転換植物は、カドミウムの蓄積の局在性が変化しているため、様々な用途に用いることができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、根を除く植物体にカドミウムが蓄積され難いため、カドミウムを含有する土壌においても栽培することができる。
　また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を、カドミウムを含有する土壌で栽培すれば、土壌中のカドミウムを形質転換植物内に効率よく蓄積させることができる。このため、かかる性質が付与された形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌からカドミウムを除去するために用いることができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物を、カドミウムを含有する土壌で栽培し、栽培した形質転換植物を収穫し、焼却等によって処分する工程を繰り返すことによって、土壌に含まれるカドミウムを効率よく除去することができる。
　〔３．キット〕
　本発明に係るキットは、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　上記「ポリヌクレオチド」については、上記「１．形質転換植物の生産方法」の項において説明した通りであるので、ここでは省略する。
　本発明に係るキットは、上述したポリヌクレオチド以外の成分を含んでいてもよい。例えば、上記ポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを作製するためのプラスミド、当該組換え発現ベクターを作製するために必要な試薬、バッファー、植物の形質転換を行うために必要な試薬等が含まれていてもよい。
　本発明に係るキットを用いれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を容易に作製することができる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
　（カドミウム濃度の測定方法）
　本発明の実施例では、イネの根、地上部、および穀粒（玄米）におけるカドミウム濃度は、植物試料を全て濃硝酸（６０％）で分解し、原子吸光光度計を用いて吸光度を測定した。
　（１．地上部へのカドミウムの蓄積に関与する遺伝子の同定）
　まず、世界各国の様々な品種のイネ（計１３１系統）を用いて、各品種のイネについて穀粒におけるカドミウムの蓄積量を調べた。具体的には、カドミウムによって汚染されていない圃場（土壌中のカドミウム濃度１ｐｐｍ未満）においてイネを栽培し、得られた穀粒におけるカドミウム濃度を測定した。
　図１は、カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培した１３１系統のイネの穀粒におけるカドミウム濃度を示すグラフである。図１に示すように、穀粒に含まれるカドミウムの濃度は系統間で大きく異なることが明らかになった。中でも、インディカ米（Indica）の系統の一つであるアンジャナ・ダーン（Anjana Dhan）は、日本米（Japonica）の系統の一つである日本晴（Nipponbare）と比較して、穀粒に含まれるカドミウム濃度が４０倍以上高いことが明らかになった。
　そこで、カドミウム高蓄積品種としてアンジャナ・ダーンを、カドミウム低蓄積品種として日本晴を選び、アンジャナ・ダーンと日本晴について、カドミウムの蓄積量についてさらに詳しく解析を行った。図２は、カドミウムによって汚染されていない圃場において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。尚、本実施例においては、上記「地上部」は、地上に出ている部分、つまりイネの茎、葉を含む部分を指し、穀粒は地上部には含まない。図２に示すように、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度は２８倍、玄米に含まれるカドミウム濃度は１５倍高いことが明らかになった。
　次いで、人工のカドミウム汚染土壌において、１／５０００アールのワグネルポットを用いて１７９日間栽培した場合の、アンジャナ・ダーンおよび日本晴におけるカドミウム蓄積量を解析した。用いた人工カドミウム汚染土壌は、０．１Ｎ塩酸抽出画分において、カドミウム濃度７．６ｐｐｍであった。図３は、カドミウム汚染土壌において栽培したアンジャナ・ダーンと日本晴とについて、地上部および玄米におけるカドミウム濃度を表すグラフである。図３に示すように、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度は６倍、玄米に含まれるカドミウム濃度は８倍高いことが明らかになった。
　次いで、アンジャナ・ダーンと日本晴との交配を行い、得られたＦ２集団を用いて、カドミウムの蓄積に関与する量的形質を調べた。具体的には、５０ｎＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液を用いて得られたＦ２集団を１０日間栽培し、地上部におけるカドミウム濃度を測定した。尚、１／２木村Ｂ溶液は、多量栄養素（ｍＭ）：ＭｇＳＯ４（０．２８），（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．１８），Ｃａ（ＮＯ３）２（０．１８），ＫＮＯ３（０．０９），ＫＨ２ＰＯ４（０．０９）、および微量栄養素（ｍＭ）：Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４（１０），Ｈ３ＢＯ３（３），ＭｎＣｌ２（０．５），ＣｕＳＯ４（０．２），ＺｎＳＯ４（０．４），（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４（１）を含む培養培地である。１／２木村Ｂ溶液は、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．４に調整したものを用いた。
　図４は、アンジャナ・ダーンの地上部に含まれるカドミウム濃度を１００とした場合のＦ２集団の地上部に含まれるカドミウム濃度の相対値を表すグラフである。図４中のＡ、Ｈ、およびＢは、それぞれ量的遺伝子座（ＱＴＬ）が検出された近傍のマーカーの遺伝子型を示しており、「Ａ」はアンジャナ・ダーン型、「Ｈ」はヘテロ型、「Ｂ」は日本晴型を表している。図４に示すように、Ｆ２集団における地上部のカドミウム濃度は３：１に分離した。この結果から、アンジャナ・ダーンと日本晴とにおいて、地上部に含まれるカドミウム濃度に差があるのは、一つの遺伝子の違いによって生じていることが明らかになった。
　そこで、上記Ｆ２集団の地上部へのカドミウムの蓄積量を規定する遺伝子座を検出するために、ＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬ解析は、qtl cartographer version 2.5（ノースカロライナ州立大学のバイオインフォマティクスリサーチセンターから提供、http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm）を用いて行った。その結果、地上部へのカドミウムの蓄積に関与するＱＴＬは、座乗していることが明らかになった。このＱＴＬのＬＯＤ値は５３．１であり、寄与率は７２．５％であった。
　さらに、１０００株以上のＦ２集団を用いて、原因遺伝子のマッピングを行ったところ、地上部へのカドミウムの蓄積に関与するＱＴＬが座乗している候補領域を、マーカーＲＭ２１２５１とＲＭ２１２７５とに挟まれた５００ｋｂの範囲内に絞り込むことができた。この領域に存在する遺伝子を、イネゲノムの注釈情報を収録・公開するデータベースであるＲＡＰ-ＤＢ（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）を用いて検索した。その結果、マーカーＲＭ２１２５１とＲＭ２１２７５との間には、３２個の予測遺伝子が存在することが明らかになった。その内、アンジャナ・ダーンと日本晴との間に塩基配列の差が認められたＯｓＨＭＡ３が、カドミウムの輸送に関与する遺伝子と考えられた。
　ついで、表１に示した、穀粒に含まれるカドミウム濃度が高い６系統と、日本晴とからｃＤＮＡを作製し、かかるｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
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 　具体的には、ＯｓＨＭＡ３のＣ末端側、つまり日本晴におけるＰＣＲ増幅産物が８４８ｂｐとなる領域においてプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｅｘ　Ｔａｑ（製品名、ＴａＫａＲａ製）を用いてＰＣＲ反応液を作製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（製品名、エッペンドルフ社製）を用いて増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、初期変性９４℃　２０秒、変性９８℃　１０秒、アニーリング６２℃　３０秒、伸長７２℃　６０秒、変性から伸長の行程を３５回反復した。
　図５は、穀粒中のカドミウム濃度が高い７系統のイネについてＰＣＲを行った結果を表す図である。１レーン目：Ｊａｒｊａｎ、２レーン目：アンジャナ・ダーン（Ａｎｊａｎａ　Ｄｈａｎ）、３レーン目：ＩＲ　５８、４レーン目：Ｂｌｅｉｙｏ、５レーン目：ＩＲ３６、６レーン目：ＰＩ３１２７７７である。図５に示すように、穀粒に含まれるカドミウム濃度が高い上位２品種であるＪａｒｊａｎとアンジャナ・ダーンでは、ＰＣＲ増幅産物の長さが短いことが明らかになった。
　（２．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の単離）
　ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、以下の方法によってアンジャナ・ダーンおよび日本晴のそれぞれから単離した。具体的には、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のＯＲＦは、データベース（ＲＡＰ-ＤＢ）の情報を基に、Ｎ末端とＣ末端とについてプライマーを設計し、ＰＣＲによって遺伝子を増幅した。アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子は、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（製品名、クロンテック社製）を用いて５’-ＲＡＣＥ、および３’-ＲＡＣＥを行い、ＯＲＦを単離した。
　日本晴由来のＯｓＨＭＡ３タンパク質（ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号１に、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子）の塩基配列を配列番号３に示した。また、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３タンパク質（ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号２に、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３遺伝子（ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子）の塩基配列を配列番号４に示した。
　図６は、日本晴とアンジャナ・ダーンとにおいて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図６において、ＴＭ１～ＴＭ８は、膜貫通ドメインを示している。図６に示すように、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質には、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質と比較して、Ｃ末端側の領域に５３アミノ酸の欠失が認められた。以上のから、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質が正常に機能していない可能性が考えられた。尚、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質との相同性は、９１．４％であった。
　（３．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の機能解析）
　まず、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現に対するカドミウム添加の影響について解析した。具体的には、蒔種後１１日目の幼植物を５０ｎＭのカドミウムを含む１／２木村Ｂ溶液を用いて２４時間培養した。陰性対照として、カドミウムを含有しない１／２木村Ｂ溶液を用いて培養を行った。培養後、地上部および根からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲを行った。
　尚、キアゲンのＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（製品名、キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、インビトロジェンのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII逆転写酵素（製品名、インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲは、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｒｉｄ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（製品名、東洋紡製）を用いてＰＣＲ反応液を作製し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｅｐ　ＲｅａｌｐｒｅｘリアルタイムＰＣＲ（製品名、エッペンドルフ社製）を用いて増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、初期変性９５℃　３０秒、変性９５℃　３０秒、アニーリング６２℃　２０秒、伸長７２℃　３５秒、変性から伸長の行程を４０回反復した。
　図７は、定量的ＰＣＲの結果を表すグラフである。図７に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、主に根で発現していることが明らかになった。カドミウムの添加は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に影響を及ぼさなかった。また、アンジャナ・ダーンと日本晴との間においても、カドミウムの有無に関わらず、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に有意な差は認められなかった。この結果から、アンジャナ・ダーンと日本晴との地上部に含まれるカドミウム濃度の差をもたらす要因は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量の差によるものではなく、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の機能の違いによるものであることが明らかになった。
　次いで、アンジャナ・ダーンおよび日本晴のそれぞれから単離したＯｓＨＭＡ３遺伝子を、酵母に発現させ、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のカドミウムの輸送活性を解析した。具体的には、酵母（ＢＹ４７４１株、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から購入）に発現ベクターｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）を用いて日本晴およびアンジャナ・ダーンのそれぞれに由来するＯｓＨＭＡ３を、従来公知の酢酸リチウム法によって導入した。陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターのみを導入した。
　得られた形質転換酵母を、０μＭ、１０μＭ、または２０μＭのカドミウムを含有する寒天培地に播種し、３０℃で４２時間培養した。具体的には、まず、形質転換酵母を２％グルコースを含み、且つウラシルを含まない液体ＳＣ培地を用いて、対数増殖期（ＯＤ０．５～１．０）になるまで培養した。測定したＯＤを基に、各株の密度を一定にし、形質転換酵母を滅菌水で３回洗浄してから１０倍毎、５段階の希釈系列を作り、形質転換酵母を寒天培地に５μＬずつスポットした。上記寒天培地にはウラシルを除いたＳＣ培地を用いた。尚、ＧＡＬ１プロモーターによってＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現を誘導するために、炭素元としてガラクトースを用いた。
　ＯｓＨＭＡ３タンパク質は排出型の輸送体であり、ＯｓＨＭＡ３タンパク質を発現する酵母では、細胞質内のカドミウムが特定のオルガネラに集中するため、カドミウムの毒性によって増殖が抑制されると考え、酵母の増殖を指標として、カドミウムの輸送活性の有無を判断した。
　図８は、酵母を用いたＯｓＨＭＡ３タンパク質の機能解析の結果を表す図である。図８に示すように、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現させた酵母は、陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターを導入した酵母と比較して、カドミウムを含有する培地において増殖が抑制された。この結果から、日本晴由来のＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質はカドミウムの輸送活性を有することが明らかになった。一方、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質を発現させた酵母の増殖は、陰性対照としてｐＹＥＳ２ベクターを導入した酵母と同じであった。この結果から、アンジャナ・ダーン由来のＯｓＨＭＡ３ａタンパク質は、カドミウムの輸送活性を有さないことが明らかになった。
　さらに、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質についての生理学的な解析を行った。具体的には、蒔種後２８日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物を１μＭのカドミウムを含む１／２木村Ｂ溶液を用いて栽培し、経時的に導管液、地上部、および根を採取し、それぞれの部位に含まれるカドミウムの濃度を測定した。尚、導管液は、地上部と根の境目から上部３～４ｃｍの葉鞘をカミソリを用いて水平に切断し、切断面から滲出してくる液をマイクロピペットを用いて採取した。尚、切断後最初の１～２マイクロリットルは細胞質液のが混入する可能性があるため、導管液として採取しなかった。
　図９は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴について、導管液、地上部、および根に含まれるカドミウム濃度を経時的に測定した結果を表すグラフである。図９の（ａ）は導管液、（ｂ）は地上部、（ｃ）は根における測定結果を表している。図９に示すように、培養５日目におけるアンジャナ・ダーンの導管液および地上部におけるカドミウム濃度は、日本晴における各部位のカドミウム濃度と比較して、導管液中では６倍、地上部では３倍高いことが明らかになった。
　一方、根においては、日本晴の方が、アンジャナ・ダーンよりもカドミウム濃度が２倍高いことが明らかになった。この結果は、日本晴と比較して、アンジャナ・ダーンでは、吸収したカドミウムを根に留めておく能力が低いことを示している。
　そこで、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根におけるカドミウムの吸収能について解析した。具体的には、０μＭ～５μＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液に、蒔種後２１日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物の根を暴露し、暴露後３０分後に根に吸収されたカドミウムの濃度を測定した。
　図１０は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の根のカドミウム吸収能を表すグラフである。いずれのカドミウム濃度の培養液に暴露した場合も、カドミウム低蓄積性の日本晴の方が、高蓄積性のアンジャナ・ダーンよりも根のカドミウム吸収能が高かった。この結果は、アンジャナ・ダーンの地上部および穀粒におけるカドミウム高蓄積の要因は、外部からカドミウムを吸収する能力が高いためではないことを示している。
　そこで、日本晴およびアンジャナ・ダーンの導管液におけるカドミウムの濃度について解析した。具体的には、０μＭ～５μＭのカドミウムを含んだ１／２木村Ｂ溶液において、蒔種後３３日目のアンジャナ・ダーンおよび日本晴の幼植物の根を３日間培養し、培養後の導管液中のカドミウム濃度を測定した。
　図１１は、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の導管液に含まれるカドミウムの濃度を測定した結果を表すグラフである。日本晴およびアンジャナ・ダーンのどちらの品種においても、培養液に含まれるカドミウム濃度が０．５μＭのときに、導管液に含まれるカドミウムの濃度が飽和した。しかし、アンジャナ・ダーンの導管液には、日本晴と比較して、８．５倍高い濃度のカドミウムが含まれていた。
　以上の生理学的解析結果は、アンジャナ・ダーンのカドミウム高蓄積性は、カドミウムを根に留めておくことができなくなったことにより導管へ排出されるカドミウムの量が高くなったことに起因していることを示している。すなわち、アンジャナ・ダーンは、日本晴に比べて、根からカドミウムを吸収する活性と根から地上部へカドミウムを輸送する活性とが高いため、アンジャナ・ダーンの地上部および穀粒にカドミウムが高蓄積すると考えられた。
　（４．形質転換株の機能解析）
　アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株におけるカドミウムの蓄積を調べた。
　鋳型として日本晴のゲノムＤＮＡを用い、２．１ｋｂのプロモーターと全長ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子とを有する６．８ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅した。２つのＤＮＡ断片を増幅するために用いたプライマーペアは、それぞれ、5’-atctagaAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3’（配列番号５）および5’-GGATGCGTCAATCAGTTTACCA-3’（配列番号６）；5’-GGCACAATGAACTTTGACGGT-3’（配列番号７）および5’-CTCTTCTGGACAAGCTTCCTTAATC-3’（配列番号８）である。
　まず、２つのＤＮＡ断片を、ｐＴＡ２ベクターにクローニングし、その後、制限酵素サイトＡｆｌＩＩを用いて連結した。融合した６．８ｋｂのＤＮＡは、その後、バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ－ｌａｃに挿入した。
　作製したコンストラクトは、Agrobacterium tumefaciens（ＥＨＡ１０１株）を用いた方法によってアンジャナ・ダーン由来のカルスに形質転換した。
　プラスミドを導入した後、形質転換植物を、およそ１００日間ゲル上で前培養した。形質転換した幼植物体を、栄養溶液中で１～３週間栽培し、その後、カドミウム処理に供した。カドミウム処理は、５０ｎＭ ＣｄＳＯ４を含有している栄養溶液に、幼植物体を１０日間曝露した。処理溶液は、２日毎に交換した。
　図１２は、相補性検定の結果を表す図である。図１２の（ａ）はアンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎを導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株の地上部（Shoot）におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根（Root）におけるカドミウム濃度を示している。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定（Dunnett’s t-test）を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表す。
　図１２の（ａ）に示すように、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株は、地上部におけるカドミウムの蓄積が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。これに対して、図１２の（ｂ）に示すように、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した形質転換株は、根におけるカドミウムの蓄積が有意に増加した（ｐ＜０．０１）。
　図１３は、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素（micronutrient）の濃度を示す図である。形質転換株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝４）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株と形質転換株との間に有意差があることを表す。
　図１４は、アンジャナ・ダーンにＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を導入した３種類の形質転換株および空ベクターを導入したコントロール株における多量栄養素（macronutrient）の濃度を示す図である。形質転換株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝４）。
　図１３および図１４に示すように、根および地上部における他の微量栄養素や多量栄養素の濃度については、コントロールと形質転換株との間に差異がなかった。
　これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３遺伝子が、アンジャナ・ダーンおよび日本晴の品種間におけるカドミウム蓄積の違いに関与する遺伝子であることが確認できた。
　（４．ＲＮＡｉ株の機能解析）
　日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株におけるカドミウムの蓄積を調べた。
　ヘアピンＲＮＡｉコンストラクトを作製するために、逆方向反復（inverted repeat）として、ＯｓＨＭＡ３ｎ　ｃＤＮＡの５１１ｂｐ断片（転写開始点から８９３ｂｐ～１４０７ｂｐ）を、トウモロコシ（maize）のユビキチンプロモーターの制御下において、ｐＡＮＤＡベクターにクローニングした。ユビキチンプロモーターを有するコンストラクトを作製するために、プライマーセット5'-AGGATCCATGGCCGGAAAGGATGAGG-3'（配列番号９）および5'-TGGATCCGCAACATCATCCTTTCACTTCACC-3'（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲ法によってＯｓＨＭＡ３ｎ　ｃＤＮＡからＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＮＯＳターミネーターを増幅した。増幅した断片は、ｐＡＮＤＡベクターにクローニングし、その後、トウモロコシのユビキチンプロモーターと一緒に切り取り、ｐＰＺＰ２Ｈ－ｌａｃバイナリーベクターにサブクローニングした。
　作製したコンストラクトは、アグロバクテリウム法によって、日本晴由来のイネのカルスに導入した。
　図１５は、日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株におけるカドミウムの蓄積量を測定した結果を示す図である。図１５の（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部におけるカドミウム濃度を示し、（ｂ）は根におけるカドミウム濃度を示している。ＲＮＡｉ株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。
　図１５の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンすると、コントロール株と比較して、ＲＮＡｉ株の地上部におけるカドミウムの濃度が、２．１～２．５倍に有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。これに対して、ＲＮＡｉ株の根におけるカドミウム濃度は、コントロール株と比較して、７４～６０％まで有意に低下した（ｐ＜０．０５）。
　図１６は、日本晴においてＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによってノックダウンしたＲＮＡｉ株および空ベクターを導入したコントロール株における微量栄養素の濃度を示す図である。図１６の（ａ）は日本晴における３種類のＲＮＡｉ株およびコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルを示し、（ｂ）はＲＮＡｉ株およびコントロール株の地上部および根における微量栄養素の濃度を示している。
　ＲＮＡｉ株およびコントロール株を５０ｎＭカドミウムに１０日間にわたって曝露した。図１６の（ａ）は、コントロール株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量に対するＲＮＡｉ株におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量を示している。
　それぞれのデータは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表し、「＊＊」は、危険率１％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。
　図１６の（ａ）に示すように、コントロール株と比較して、ＲＮＡｉ株では、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現量が有意に減少していた。また、図１６の（ｂ）に示すように、根および地上部における亜鉛、銅、マンガンおよび鉄を含む他の微小栄養素の濃度については、ＲＮＡｉ株とコントロール株との間に差異はなかった。
　これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３遺伝子が、日本晴およびアンジャナ・ダーンの２種の品種間におけるカドミウムの蓄積の違いに関与する遺伝子であることがさらに確認できた。
　（５．ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターン解析）
　２つの品種の異なる組織における２つの対立遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＴ法を用いて解析した。
　発現レベルは、以下のプライマーペアを用い、ThunderbirdTM qPCR Mix（Toyobo製）を用いて分析した：
ＯｓＨＭＡ３解析用として、5'-TCCATCCAACCAAACCCGGAAA-3'（配列番号１１）および5'- TGCCAATGTCCTTCTGTTCCCA-3'（配列番号１２）；内部標準としてのヒストンＨ３解析用として、5'-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3'（配列番号１３）および5'-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3'（配列番号１４）。
　データは、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems製)に従って収集した。増幅産物の相対量を見積もるために、ΔＣｔ法を用いた。リアルタイムＰＣＲ法の増幅効率は、希釈したプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた標準曲線によって確認した。ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子の増幅効率は、共に１．９６であった。
　図１７は、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを示す図である。図１７の（ａ）は、日本晴およびアンジャナ・ダーンの根および地上部におけるＯｓＨＭＡ３遺伝子の２つの対立遺伝子の発現を示し、（ｂ）は日本晴およびアンジャナ・ダーンの根の異なる部分における２つの対立遺伝子の発現を示している。
　ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現パターンを調べるために、日本晴およびアンジャナ・ダーン（それぞれ１２日齢）の地上部および根からＲＮＡを抽出した。また、日本晴およびアンジャナ・ダーンの苗を、０μＭ ＣｄＳＯ４または１μＭ ＣｄＳＯ４に２４時間曝露し、その後、根を０～１ｃｍ、１～２ｃｍ、および２～３ｃｍの部分で切断し、ＲＮＡを抽出した。発現レベルは、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＴ法によって決定した。内部標準としてヒストンＨ３を用いた。発現は、ヒストンＨ３の発現レベルに対する発現量を示した。データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊」は、危険率５％未満において、コントロール株とＲＮＡｉ株との間に有意差があることを表す。
　図１７の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３遺伝子は、カドミウムの蓄積に関して対照的な２つの品種において、主として根において、同じレベルで発現していた。また、図１７の（ｂ）に示すように、根の異なる部分間ではＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現に差異がないことが空間的解析によって示された。さらに、カドミウムに対する曝露によってＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現が影響を受けないことが明らかになった。この結果は、２つの品種においてＯｓＨＭＡ３遺伝子が恒常的に発現していることを示すものである。
　（６．ＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在解析）
　免疫染色およびプロモーター－ＧＦＰ形質転換イネを用いて、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を確認した。
　ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の第９９３位～第１００４位合成ペプチドを用いてウサギを免疫し、ＯｓＨＭＡ３タンパク質に対する抗体を取得した。使用する前に、取得した抗血清を、ペプチドアフィニティーカラムを通して精製した。日本晴およびアンジャナ・ダーン（それぞれ１０日齢）の根を用いて、ＯｓＨＭＡ３タンパク質の免疫染色を行った。二次抗体（Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG; Molecular Probes）の蛍光は、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。
　トランスレーショナルなｐＯｓＨＭＡ３－ＧＦＰ融合遺伝子を作製するために、プライマーセット5'-ATCTAGAAGCATAAAAGAATAGAGCCGTGGAC-3'（配列番号１５）および5'-ATCTAGAATGCAAGTGGGGATCAAGGA-3'（配列番号１６）を用いて、ＰＣＲ法によって、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の２ｋｂ上流領域（翻訳開始コドンより－３４ｂｐ～－２０９４ｂｐ）を、日本晴のゲノムＤＮＡから増幅した。ｐＵＣ１８ベクター（Ｔａｋａｒａ）において、ＧＦＰおよびＮＯＳターミネーターのＸｂａＩサイトに、プロモーターをクローニングした。ｐＯｓＨＭＡ３ｎ－ＧＦＰおよびＮＯＳターミネーターを有しているコンストラクトは、ｐＰＺＰ２Ｈ－ｌａｃバイナリーベクターにサブクローニングした。
　作製したコンストラクトは、アグロバクテリウム法によって、日本晴由来のイネのカルスに導入した。ＧＦＰシグナルは、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。
　図１８は、イネの根におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在を示す図である。図１８の（ａ）はアンジャナ・ダーンの根における免疫染色の結果を示し、（ｂ）は日本晴の根における免疫染色の結果を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。
　図１８の（ａ）および（ｂ）に示すように、抗ＯｓＨＭＡ３ポリクローナル抗体を用いた免疫染色によって、ＯｓＨＭＡ３タンパク質が根の全ての細胞に局在していることが確認された。また、アンジャナ・ダーンと日本晴ではＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在に差異がないことが確認された。
　図１８の（ｃ）はｐＯｓＨＭＡ３ｎ－ＧＦＰを形質転換した日本晴の根におけるＧＦＰタンパク質の蛍光を示し、（ｄ）は野生型日本晴の根におけるＧＦＰタンパク質の蛍光を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。
　図１８の（ｃ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎプロモーターの制御下にＧＦＰをつないだｐＯｓＨＭＡ３ｎ－ＧＦＰを形質転換した日本晴は、根の全ての細胞においてＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質が発現していた。これに対して、図１８の（ｄ）に示すように、野生型の日本晴では、ＧＦＰシグナルは観察されなかった。
　図示しないが、抗ＯｓＨＭＡ３抗体を用いた過剰発現株の免疫染色では、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは非常に亢進していた。これに対して、抗ＯｓＨＭＡ３抗体を用いたＲＮＡｉ株の免疫染色では、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは、非常に低下していた。これらの結果から、免疫染色に用いた抗ＯｓＨＭＡ３抗体の特異性が確認された。
　図示しないが、ＯｓＨＭＡ３タンパク質のシグナルは、核の外側で観察された。このことから、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は液胞膜に局在していることが明らかになった。
　ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のＯＲＦおよびＯｓＨＭＡ３ａ　ｃＤＮＡ断片は、プライマーセット5'-ATCCGGAATGGCCGGAAAGGATGAGGC-3'（配列番号１７）および5'-TTCCGGATCCTTTCACTTCACCGGAG-3'（配列番号１８）を用いて増幅した。ＯｓＨＭＡ３断片を、リンカー配列（ＳＧＧＧＧＧＧ）を有しているＧＦＰの３’末端に連結し、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ）において、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの制御下に配置した。得られたプラスミド（ｐＧＦＰ－ＯｓＨＭＡ３）またはＧＦＰのみを、１１００プシープレッシャーディスクを用いた粒子衝突（PDS-1000/He particle delivery system, Bio-Rad, http
://www.bio-rad.com/）によってタマネギの表皮細胞に導入した。ＧＦＰシグナルは、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700；Carl Zeiss製）によって観察した。
　図１９は、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の細胞内の局在を示す図である。図１９の（ａ）は、ＧＦＰ－ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質を発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示し、（ｂ）はＧＦＰタンパク質のみを発現しているタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光を示している。図中のスケールバーは、１００μｍに相当する。
　図１９の（ａ）に示すように、タマネギの表皮細胞におけるＯｓＨＭＡ３ｎ－ＧＦＰ融合タンパク質の一過性の発現を観察することによって、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質が液胞膜に局在することが明らかになった。図示しないが、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質についても同様の結果が得られた。さらに、ＧＦＰ－ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質またはＧＦＰ－ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質と小胞体マーカーであるＤｓＲｅｄ－ＨＤＥＬとの共発現の結果から、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、小胞体ではなく、液胞膜に局在していることがさらに確認された（図示しない）。
　図２０は、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。日本晴（１３７日齢）から作出した、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の過剰発現株の根の全てからミクロソームを抽出し、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。ミクロソーム画分は、ショ糖密度勾配によって分画した。一次抗体として、抗ＯｓＨＭＡ３ポリクローナル抗体（１００倍希釈）、抗γ－ＴＩＰポリクローナル抗体（液胞膜マーカー、１０００倍希釈）および抗Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅポリクローナル抗体（細胞膜マーカー）を用いた。二次抗体として、ＥＣＬペルオキシダーゼ標識抗－ウサギ抗体（１００００倍希釈、GE Healthcare製）を用い、ECL Plus western blotting detection system（GE Healthcare製）を用いて、シグナルを検出した。
　図２０の（ａ）は、抗ＯｓＨＭＡ３ｎ抗体の特異性を示し、（ｂ）はショ糖密度勾配解析の結果を示している。
　図２０の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析によって、予測されたサイズに単一のバンドが確認されたことから、この抗体の特異性が確認された。また、図２０の（ｂ）に示すように、ショ糖密度勾配解析によって、ＯｓＨＭＡ３タンパク質が、液胞膜マーカーであるγ－ＴＩＰと同じ分画に存在することが明らかになった。これらの結果から、イネの根の細胞において、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、液胞膜に局在していることが明らかになった。
　（６．酵母における輸送活性の解析）
　アンジャナ・ダーンと日本晴との間のカドミウム蓄積における大きな違いを解析するために、酵母においてそれぞれの遺伝子を発現させた。
　サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＹ４７４１株（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）、並びに変異株であるΔｚｒｃ１株（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0;met15Δ0; ura3Δ0; YMR243c::kanMX4）およびΔｃｏｔ１（Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0;ura3Δ0; YOR316c::kanMX4）は、Euroscarf（http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html）から購入した。
　ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子は、ＰＣＲ法によって増幅した。ＯＲＦを含む断片を、酵母発現ベクターであるｐＹＥＳ２に挿入した。
　図２１は、カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２１の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＡｔＨＭＡ３遺伝子または２種類のキメラ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型の酵母細胞（ＢＹ４７４１株）の、グルコース存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。酵母は、２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下において培養した。
　なお、Ｎ－ＯｓＨＭＡ３ｎ－Ｃ－ＯｓＨＭＡ３ａ（ＯｓＨＭＡ３ｎａ）およびＮ－ＯｓＨＭＡ３ａ－Ｃ－ＯｓＨＭＡ３ｎ（ＯｓＨＭＡ３ａｎ）は、ＯｓＨＭＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１または配列番号２）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質とＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とを融合したキメラタンパク質（図２２を参照）を発現している形質転換株である。
　図２３は、カドミウムに関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２３の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｙｃｆ１酵母細胞の、グルコースの存在下における成長を示し、（ｂ）は、ガラクトースの存在下における成長を示している。酵母は、２μＭカドミウムを含む培地において、３日間にわたって培養した。
　ｐＹＥＳ２ベクターにおいて、ＧＡＬ１プロモーターからの遺伝子の発現は、ガラクトースの存在下において誘導され、グルコースの存在下において抑制されることが知られている。このため、形質導入した遺伝子の発現を抑制するためにグルコースを培地に添加し、形質導入した遺伝子の発現を誘導するためにガラクトースを培地に添加した。
　図２１の（ａ）に示すように、グルコースの存在下において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を含んでいるプラスミドを有する酵母、およびＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を含んでいるプラスミドを有する酵母において、カドミウムに対する感受性に差異はなかった。しかし、図２１の（ｂ）に示すように、ガラクトースの存在下において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現している酵母は、カドミウムに対する感受性が強くなっていた。一方、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を発現している酵母は、コントロールと同様の成長を示した。
　また、図２３の（ａ）および（ｂ）に示すように、カドミウム感受性変異体であるΔｙｃｆ１酵母においてＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子およびＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現させると、図２１と同じ結果を示した。これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子は、酵母においてカドミウム輸送体として機能し、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子は、カドミウム輸送体として機能しないと考えられた。
　図２４は、金属に関する酵母における機能解析の結果を示す図である。図２４の（ａ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｚｒｃ１酵母株の、ガラクトースおよび４ｍＭ ＺｎＳＯ４の存在下における成長を示し、（ｂ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、またはポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子のいずれかを形質導入したΔｃｏｔ１酵母株の、ガラクトースおよび２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２の存在下における成長を示し、（ｃ）は、ｐＹＥＳ２ベクターのみ、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８Ａ遺伝子、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ遺伝子、またはＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子のいずれかを形質導入した野生型酵母細胞の、ガラクトースおよび２０μＭ ＣｄＳＯ４の存在下における成長を示している。全ての酵母株は、３０℃で３日間培養した。
　なお、ＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ、ＯｓＨＭＡ３ａＶ６３８ＡおよびＯｓＨＭＡ３ａＨ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａは、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子（配列番号４）の塩基配列の第８０位および／または第６３８位における部位特異的突然変異体である。
　図２４の（ａ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を形質導入したΔｚｒｃ１酵母株と、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を形質導入したΔｚｒｃ１酵母株とでは、亜鉛に対する感受性に差異がなかった。また、図２４の（ｂ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株と、ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株とでは、コバルトに対する感受性に差異がなかった。これに対して、ポジティブコントロールとしてＡｔＨＭＡ３遺伝子を形質導入したΔｃｏｔ１酵母株では、コバルトに対する感受性が強くなっていた。
　ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、イネの根の液胞膜に局在している（図１９の（ａ）および（ｂ））。酵母においてもＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在が同じであれば、機能的なＯｓＨＭＡ３タンパク質の発現は、カドミウムに対する耐性を強くすると考えられた。しかし、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を発現する酵母は、カドミウムに対する感受性が強くなっていた（図２１の（ｂ））。この矛盾は、酵母におけるＯｓＨＭＡ３タンパク質の局在ミスに起因すると考えられた。具体的には、ＯｓＨＭＡ３タンパク質は、酵母では小胞体に局在していると考えられた（図示しない）。それゆえ、機能的なＯｓＨＭＡ３タンパク質は、カドミウムを小胞体へ輸送し、その結果、カドミウム感受性が強くなったと考えられた（図２１の（ｂ））。
　ＯｓＨＭＡ３ａ遺伝子における機能の欠失の基礎となる機構を分析するために、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質およびＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のキメラタンパク質を２種類作製した。ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質とＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質との間で最も異なる部分はＣ末端側にあり、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質では、推定された金属結合ドメインの繰り返し内で、５３個のアミノ酸残基が欠失している（ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質は９個の繰り返しを有し、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質は６個の繰り返しを有している）（図６を参照）。
　ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＮ末端型を、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のＣ末端型と融合させたキメラタンパク質、またはＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の第５０１位において、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のＮ末端型を、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＣ末端型と融合させたキメラタンパク質（図２２を参照）を用いて、輸送活性における金属結合ドメインの繰り返しの役割を解析した。
　ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質において観察されたように、Ｎ－ＯｓＨＭＡ３ｎ－Ｃ－ＯｓＨＭＡ３ａキメラタンパク質において、カドミウム感受性が強くなっていた（図２１の（ｂ））。しかし、Ｎ－ＯｓＨＭＡ３ａ－Ｃ－ＯｓＨＭＡ３ｎキメラタンパク質では、カドミウム感受性に変化が無かった（図２１の（ｂ））。これらの結果は、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のＣ末端における５３残基の欠失ではなく、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質におけるＮ末端領域が、カドミウム輸送機能に重要であることを示している。
　２つの対立遺伝子のＮ末端部をさらに比較した。膜貫通ドメイン予測プログラム（SOSUI; http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）を用いて、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第８０位および第６３８位におけるアミノ酸の変異が、予測された膜貫通ドメインの数の違いをもたらしていることを見出した。これらの変異がＯｓＨＭＡ３ａタンパク質の機能の欠失に関与することを調べるために、酵母発現系を用いて部位特異的突然変異解析を行った。
　図２４の（ｃ）に示すように、ＯｓＨＭＡ３ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第８０位におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）をアルギニン（Ａｒｇ）に置換したタンパク質（Ｈ８０Ｒ）では、カドミウムに対する感受性が強くなっていた。しかし、第６３８位のバリン（Ｖａｌ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したタンパク質（Ｖ６３８Ａ）では、カドミウム感受性は変化しなかった。この結果は、キメラタンパク質の実験結果（図２３の８ｂ））と一致していた。また、第８０位および第６３８位でのアミノ酸置換体（Ｈ８０Ｒ／Ｖ６３８Ａ）も、カドミウムに対する感受性が増加していた（図２４の（ｃ））。これらの結果から、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の第８０位におけるアミノ酸が、ＯｓＨＭＡ３ｎタンパク質の機能にとって重要である可能性が示唆された。
　（７．形質転換株の機能解析２）
　穀粒におけるカドミウムの蓄積が、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現レベルの操作によって低下する可能性を調べるために、カドミウム低蓄積性の品種である日本晴において、ＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子を、トウモロコシユビキチンプロモーターの制御下において過剰発現させた。
　図２６は、過剰発現株およびベクターコントロール株におけるＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の発現レベルを示す図である。発現レベルは、ベクターコントロール株に対する値として示した。データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。
　図２６に示すように、過剰発現株では、ベクターコントロール株と比較して、ＯｓＨＭＡ３遺伝子の発現が有意に増加していることが確認された。
　これらの過剰発現株、ベクターコントロール株および形質転換していない日本晴（非形質転換株）を、中程度にカドミウム汚染された土壌（1.5 mg Cd kg-1）において湛水することなく５ヶ月間栽培した。処理後、フレーム原子吸光分析（Ｚ－２０００；日立製作所製）によってカドミウムおよび他の金属を測定するために、葉身（leaf blade）および葉鞘を含む地上部、根、並びに玄米に分けて収穫した。
　結果を図２５に示す。図２５は、カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、玄米におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は玄米における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は玄米における鉄の濃度を示している。なお、データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。
　図２５の（ａ）に示すように、カドミウム汚染土壌において栽培すると、ベクターコントロール株および非形質転換株と比較して、過剰発現株では、玄米におけるカドミウム濃度が有意に低下していた（ｐ＜０．０１）。また、図２５の（ｂ）および（ｃ）に示すように、玄米における亜鉛および鉄の濃度は、ベクターコントロール株および過剰発現株の間で差異がなかった。
　図２７は、カドミウムの蓄積および他の金属の蓄積に関するＯｓＨＭＡ３ｎ遺伝子の過剰発現の作用を示す図であり、（ａ）は、地上部におけるカドミウムの濃度を示し、（ｂ）は地上部における亜鉛の濃度を示し、（ｃ）は地上部における鉄の濃度を示している。なお、データは、平均値±標準偏差として示した（ｎ＝３）。また、ダネットｔ検定を用いて統計解析を行った。なお、グラフ中に示す「＊＊」は、危険率１％未満において、ベクターコントロール株と過剰発現株との間に有意差があることを表す。
　図２７の（ａ）～（ｃ）に示すように、地上部においても、玄米と同じ傾向が観察された。
　本発明によれば、カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を生産することができる。かかる形質転換植物は、様々な用途に利用することができる。例えば、カドミウムの蓄積の局在性を根に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含む土壌においても栽培できる。また、カドミウムの蓄積の局在性を根を除く植物体に変化させた形質転換植物は、カドミウムを含有する土壌を浄化するために用いることができる。それゆえ、本発明は、農業において好適に利用することができる。

Claims (4)

  1. 　カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物の生産方法であって、
    　下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを、植物に発現可能に導入することを特徴とする、形質転換植物の生産方法：
    　（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 　上記植物はイネ科植物であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換植物の生産方法。
  3. 　請求項１または２に記載の形質転換植物の生産方法によって生産されたことを特徴とする形質転換植物。
  4. 　カドミウムの蓄積の局在性を変化させた形質転換植物を作製するためのキットであって、
    　下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット：
    　（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つカドミウムの蓄積の局在性を変化させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
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