JP2022542372A - ピレノイド様構造 - Google Patents

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Abstract

本開示の態様は、改変されたRubiscoを有し、改変されたRubiscoとEPYC1ポリペプチドとの集合体を形成するために改変された必須ピレノイドコンポーネント1（EPYC1）をさらに有する、遺伝子改変植物に関する。本開示の他の態様は、そのような植物の製造方法、およびこれらの遺伝子改変植物の栽培に関するものである。

Description

［関連出願への相互参照
本出願は、2019年8月2日に出願されたU.K. Application No1911068.3.の利益を主張するものであり、その内容は参照により全体が組み込まれる。
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以下の提出物のASCIIテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。シーケンスリストのコンピュータ可読形式（CRF）（ファイル名：794542000841SEQLIST.TXT、記録日：2020年7月15日、サイズ：175KB）。
本開示は、遺伝子組換え植物に関する。特に、本開示は、改変されたルビスコおよびEPYC1ポリペプチドの集合体を形成するための改変されたエッセンシャル・ピレノイド・コンポーネント1（EPYC1）を有する遺伝子改変植物に関するものである。
シアノバクテリア、藻類、ツノゼミなどの光合成生物は、リブロース1,5-ビリン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ（ルビスコ）周辺のCO2濃度を積極的に上昇させる生物物理学的なCO2濃度上昇機構（CCM）を進化させてきた。ルビスコは比較的CO2 との親和性が低く、回転速度も遅いため、CCMはルビスコの効率を向上させる。藻類のCCMは、細胞膜と葉緑体外膜に存在する無機炭素（Ci）トランスポーターで構成されており、これらのトランスポーターが連携して、常温以上のCO2 を葉緑体の液体状の小器官であるピレノイド内のルビスコに供給する。
イネ、コムギ、ダイズなどの高等植物では、C3型光合成が最も一般的なCO2 の吸収方法である。C3型光合成では、葉緑体へのCO2の供給は受動的な拡散によって行われるため、光合成効率が制限される。さらに、ルビスコが触媒するO2との競合的な副反応（光呼吸）により、C3型植物では生産性が最大50％低下すると推定されている（South, et al.、JIPB (2018) 60: 1217-1230）。藻類のCCM機構を高等植物に移植すれば、大規模な形態や遺伝子の変更を必要とせずに、C3型光合成の非効率性の多くに対応できる。実際、藻類のCCMの主要な構成要素は、高等植物において正しく局在することが示されている（Atkinson, et al.、Plant Biotech.J. (2016) 14: 1302-1315)。
CCMでCO2 を効率的に濃縮するためには、Rubiscoを凝集させる必要がある。緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiのピレノイドには、ピレノイド内でRubiscoを会合させる働きをするRubiscoリンカータンパク質であるEssential Pyrenoid Component 1 (EPYC1)が含まれている（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）。C. reinhardtii由来のRubiscoとEPYC1は、ピレノイドに特徴的な液液相分離を誘導するのに必要かつ十分であることが示されている（Wunder, et al., Nat.Commun.(2018) 9: 5076)。C. reinhardtiiのRubiscoスモールサブユニット（SSU、rbcS核遺伝子ファミリーによってコードされる）は、重度のSSU欠損A. thaliana変異体を補完することができる（Atkinson, et al., New Phyt.(2017) 214: 655-667)。C. reinhardtii SSUを発現する植物は、高等植物のRubisco large subunits (LSU)とC. reinhardtii Rubisco SSUを含むハイブリッドRubiscoを組み立てることができ、このハイブリッドRubiscoは、内在性のA. thaliana Rubiscoと比較してRubisco機能がわずかに損なわれているだけであった。さらに、ハイブリッドRubiscoを導入した植物は、野生型の植物と同等の植物成長を示す。さらに、ハイブリッド・ルビスコを持つ植物は、SSUを補完した重度のSSU欠損A. thaliana変異体と同等のルビスコレベルを持つ。一方、タバコのルビスコをシアノバクテリアのルビスコで置換すると、CO2濃度を大幅に高めて栽培しても、シアノバクテリアのルビスコのCO2に対する親和性が低く、発現量も少ないため、成長の悪いトランスプラストミック植物ができる(Lin, et al., Nature (2014) 513:547-550; Occhialini, et al., Plant J. (2016) 85: 148-160; Long, et al., Nat.Commun.(2018) 9: 3570)。
これまで、植物にハイブリッド型ルビスコを合成することには成功してきたが、高等植物にルビスコを集約する試みは成功していない。C. reinhardtii EPYC1は、これまでに検証された藻類のCCMコンポーネントとは異なり、高等植物で発現させても葉緑体に局在することができなかった。さらに、ハイブリッドルビスコを持つ植物でEPYC1を発現させても、凝集は見られなかった。EPYC1に高等植物の葉緑体を標的とするペプチドを加えると、EPYC1は正しく局在化したが、EPYC1が葉緑体に局在化してもRubisco凝集体は観察されなかった。
驚くべきことに、内在性のEPYC1リーダー配列を除去し、このリーダー配列をより処理の良い異種のリーダー配列に置き換えることで、高等植物において観察可能なEPYC1の凝集体が得られることがわかった。さらに、ダブルターミネーターの使用などの追加的な改変によりEPYC1の発現が増加すると、EPYC1の凝集体はさらに改善された。さらに、高等植物でEPYC1の凝集体を観察するためには、C. reinhardtiiのRubisco SSUのα-ヘリックス、およびオプションとしてβ-シートとβA-βBループが必要かつ十分であることも驚くべきことに判明した。本発明者らによって特定された驚くべき新しい改変されたEPYC1、および必要なC. reinhardtii Rubisco SSU構造モチーフは、本開示の多くの側面およびそれらの様々な実施形態の基礎となるものである。
本開示の一態様は、改変されたルビスコおよびEssential Pyrenoid Component 1（EPYC1）ポリペプチドの集合体を形成するための改変されたルビスコを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部を含む。この局面の追加の実施形態は、改変されたルビスコが、藻類ルビスコスモールサブユニット（SSU）ポリペプチド、または高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された改変された高等植物ルビスコSSUポリペプチドであることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらなる実施形態では、遺伝子改変された高等植物またはその一部は、EPYC1ポリペプチドおよびその集合体をさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、凝集体が、共焦点顕微鏡検査、透過型電子顕微鏡検査（TEM）、低温電子顕微鏡検査（cryo-EM）、または液液相分離アッセイによって検出可能であることを含む。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、内因性ルビスコSSUポリペプチドを含む、改変された高等植物ルビスコポリペプチドを含む。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態では、改変された高等植物ルビスコSSUポリペプチドは、1つまたは複数の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つまたは複数の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換することによって改変された。1つまたは複数の高等植物Rubisco SSU β-strandsを1つまたは複数の藻類Rubisco SSU β-strandsで置換すること、および／または、高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することによって、Rubisco SSUポリペプチドを改変する。この局面の追加の実施形態は、高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、2つの高等植物Rubisco SSU α-ヘリックスを2つの藻類Rubisco SSU α-ヘリックスで置換することによって改変されることを含む。この態様のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：1のアミノ酸23-35およびアミノ酸80-93に対応する2つの高等植物Rubisco SSU αヘリックスと、SEQ ID NO：2のアミノ酸23-35およびアミノ酸86-99に対応する2つの藻類Rubisco SSU αヘリックスとを含む。さらに、2つの高等植物Rubisco SSU α-ヘリックスが2つの藻類Rubisco SSU α-ヘリックスで置換されており、高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、4つの高等植物Rubisco SSU β-ストランドを4つの藻類Rubisco SSU β-ストランドで置換することによって、また、高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することによって、さらに修飾されている、先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の別の実施形態である。この局面の追加の実施形態は、SEQ ID NO.1のアミノ酸39-45、アミノ酸68-70、アミノ酸98-105、およびアミノ酸110-118に対応する4つの高等植物Rubisco SSU β-ストランドを含む。SEQ ID NO:1のアミノ酸39-45、アミノ酸74-76、アミノ酸104-111、およびアミノ酸116-124に対応する4つの藻類Rubisco SSU β-strands、SEQ ID NO:1のアミノ酸46-67に対応する高等植物Rubisco SSU βA-βBループ、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸46-73に対応する藻類Rubisco SSU βA-βBループを含む。
改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態は、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、またはSEQ ID NO:156に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有する高等植物ルビスコSSUポリペプチドを含む。修飾された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの態様のさらに別の実施形態は、藻類ルビスコSSUポリペプチドが、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有することを含む。この局面の追加の実施形態では、藻類Rubisco SSUポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ30、 ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164である。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらなる実施形態は、改変された高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、改変されていない高等植物ルビスコSSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する増加した親和性を有することを含む。
本開示の追加の態様は、改変されたルビスコとEPYC1ポリペプチドの集合体を形成するためのEPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部を含む。先行する局面のいずれかのさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが藻類のEPYC1ポリペプチドであることを含む。この側面の追加の実施形態は、藻類EPYC1ポリペプチドが、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、またはSEQ ID NO：167に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを含む。この局面のさらに別の実施形態では、藻類EPYC1ポリペプチドは、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、またはSEQ ID NO：167である。先行するいずれかの態様のさらに別の実施形態は、EPYC1ポリペプチドが修飾されたEPYC1ポリペプチドであることを含む。この側面のさらなる実施形態は、修飾されたEPYC1ポリペプチドが、第1藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、または8つのタンデムコピーを含むことを含む。この局面の追加の実施形態は、第1藻類EPYC1反復領域の4つのタンデムコピーまたは8つのタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む。第1の藻類EPYC1反復領域のタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第1の藻類EPYC1反復領域が、SEQ ID NO：36に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1の藻類EPYC1反復領域がSEQ ID NO：36であることを含む。 修飾されたEPYC1を含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態は、修飾されたEPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現され、および／またはC末端キャップを含むことを含む。この局面のさらに別の実施形態は、ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO.42に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含むことを含む。C末端キャップは、SEQ ID NO：41に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである。この局面のさらなる実施形態は、C末端キャップがSEQ ID NO：41であることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、修飾EPYC1を含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよく、修飾EPYC1ポリペプチドが、対応する非修飾EPYC1ポリペプチドと比較してRubisco SSUポリペプチドに対する増加した親和性を有することを含む。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、凝集体は、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在する。この局面のさらなる実施形態は、植物細胞が葉のメソフィル細胞であることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、植物は、ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、大豆、小麦、または他のC3作物植物の群から選択される。
本開示のさらなる態様は、EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、改変されたルビスコをコードする第2の核酸配列とを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部を含む。この局面の追加の実施形態は、第1の核酸配列が第1のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択されることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、第1のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターのグループから選択される構成的プロモーターであることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていないことを含む。この局面の追加の実施形態は、葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：63であることを含む。ネイティブEPYC1リーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、ネイティブEPYC1リーダー配列は、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60-137に対応する。 先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第1の核酸配列は、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結される。この局面のさらなる実施形態は、1つ2つのターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせのグループから選択されることを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態では、第2のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この局面の追加の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA.thaliana UBQ10プロモーターのグループから選択される構成的プロモーターである。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列は藻類ルビスコSSUポリペプチドをコードする。この局面の追加の実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物細胞で機能する葉緑体トランジットペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列は、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードせず、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていない。この局面のさらなる実施形態では、葉緑体移行ペプチドは、SEQ ID NO：64に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体通過ペプチドはSEQ ID NO：64である。ネイティブ藻類SSUリーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、ネイティブ藻類SSUリーダー配列は、SEQ ID NO：32のアミノ酸1-45に対応する。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、第2の核酸配列はターミネーターに動作可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、またはアクチンスターミネーターの群から選択される。第2の核酸配列が第2のプロモーターに作動可能に連結されている先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換されている修飾高等植物ルビスコSSUポリペプチドをコードする。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この局面のさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのEPYC1ポリペプチドであることを含む。この局面の追加の実施形態は、ルビスコSSUポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのルビスコSSUポリペプチドであることを含む。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、植物またはその一部の少なくとも1つの細胞が、ルビスコポリペプチドおよびEPYC1ポリペプチドの集合体を含むことを含む。この局面のさらなる実施形態は、凝集体が、少なくとも1つの植物細胞の少なくとも1つの葉緑体のストロマに局在することを含む。この態様のさらなる実施形態は、植物細胞が葉のメソフィル細胞であることを含む。ルビスコポリペプチドおよびEPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物またはその一部を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態では、凝集体は、共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、または液液相分離アッセイによって検出可能である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、植物は、ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、コムギ、または他のC3作物植物の群から選択される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態は、先行する実施形態のいずれか1つの植物または植物の一部から生産された遺伝子改変高等植物細胞を含む。
本開示の別の態様は、a）EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入すること、b）植物細胞、組織、または他の摘出物を遺伝子改変された小植物に再生すること、およびc）遺伝子改変された小植物を、EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する遺伝子改変された植物に成長させることを含む、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変された高等植物を製造する方法を含む。この局面の追加的な実施形態は、ステップ（a）の前に、またはステップ（a）と同時に、修飾Rubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入することをさらに含み、ステップ（c）の遺伝子改変植物は、修飾Rubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸をさらに含む、方法である。この態様の追加の実施形態は、ステップ（b）の前に植物細胞、組織、または他の摘出物をスクリーニングまたは選択すること、ステップ（b）と（c）の間に植物体をスクリーニングまたは選択すること、またはステップ（c）の後に植物をスクリーニングまたは選択することによって、第1の核酸配列および任意に第2の核酸配列の導入の成功を識別することをさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、粒子ボンバードメント（すなわち、バイオリスティック、ジーンガン）、アグロバクテリウム媒介形質転換、リゾビウム媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションもしくは形質転換の群から選択される形質転換法を用いて形質転換が行われる。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が第1のベクターで導入されること、および第2の核酸配列が第2のベクターで導入されることを含む。この局面のさらなる実施形態では、第1の核酸配列は、第1のプロモーターに動作可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、第1プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この局面のさらに別の実施形態では、第1のプロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA.thaliana UBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、第1の核酸配列は、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列は、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていないことを特徴とする。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体通過ペプチドは、SEQ ID NO：63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この局面のさらに別の実施形態では、内因性の葉緑体移行ペプチドはSEQ ID NO：63である。ネイティブEPYC1リーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60-137に対応するネイティブEPYC1リーダー配列を含む。 先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、第1の核酸配列は、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、1つまたは2つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせの群から選択される。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態は、第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第2のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択されることを含む。さらにこの局面の別の実施形態は、第2のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターであることを含む。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、藻類SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含む。この局面の追加の実施形態は、第2の核酸配列が高等植物細胞で機能する葉緑体トランジットペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列がネイティブSSUリーダー配列をコードしておらず、ネイティブSSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていないことを含む。この局面のさらなる実施形態は、葉緑体トランジットペプチドが、SEQ ID NO：64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：64であることを含む。ネイティブSSUリーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態は、SEQ ID NO：32のアミノ酸1から45に対応するネイティブSSUリーダー配列を含む。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、第2の核酸配列がターミネーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態では、ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、またはアクチンスターミネーターの群から選択されることを含む。第2の核酸配列が第2のプロモーターに作動可能に連結されている先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換されている修飾高等植物ルビスコSSUポリペプチドをコードする。
第2のベクターを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態では、第2のベクターは、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結された核ゲノム配列を標的とする1つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。この局面のさらなる実施形態は、1つ以上の遺伝子編集コンポーネントが、核ゲノム配列を標的とするリボヌクレオタンパク質複合体、TALENタンパク質コード化配列を含むベクターであって、TALENタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、ZFNタンパク質のコード化配列を含むベクターであって、ZFNタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、オリゴヌクレオチドドナー（ODN）であって、ODNが核ゲノム配列を標的とするベクター、またはCRISPR/Cas酵素のコード化配列とターゲティング配列を含むベクターであって、ターゲティング配列が核ゲノム配列を標的とするベクターの群から選択されることを含む。遺伝子編集を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、遺伝子編集の結果が、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部と置換されていることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この局面のさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのEPYC1ポリペプチドであることを含む。この局面の追加の実施形態は、ルビスコSSUポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのルビスコSSUポリペプチドであることを含む。
高等植物細胞で機能する葉緑体移行ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されている第1の核酸配列を有し、第1の核酸配列がネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない、先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が1つまたは2つのターミネーターに作動可能に連結されていることを含みネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない第1の核酸配列を含み、かつ、第1の核酸配列が1つまたは2つのターミネーターに作動可能に連結されている第1の核酸配列の第1のコピーを含む第1のベクターであって、第1の核酸配列がネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、かつ、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない第1のベクターとを含む。前記第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が第1のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が1つのターミネーターに作動可能に連結されている、ことを特徴とする。および、第1のベクターが、第1の核酸配列の第2のコピーをさらに含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体移行ペプチドをコードする第3の核酸配列に動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、第3のプロモーターに動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、2つのターミネーターに動作可能に連結されている、ことを特徴とする。この局面のさらなる実施形態は、第1のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、またはメソフィル細胞特異的プロモーターの群から選択されること、第3のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、またはメソフィル細胞特異的プロモーターの群から選択されること、および、第1および第3のプロモーターが同一ではないことを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、SEQ ID NO: 65のヌクレオチド60から137に対応するネイティブEPYC1リーダー配列を含む。この局面のさらなる実施形態は、ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせのグループから選択されることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態は、先行する実施形態のいずれか1つの方法によって生産された植物または植物の一部を含む。
本開示のさらなる態様は、遺伝的に改変された植物を有する先行する実施形態のいずれかの遺伝的に改変された植物を栽培する方法であって、a) 遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物体、遺伝子改変された挿し木、遺伝子改変された塊茎、遺伝子改変された根、または遺伝子改変された種子を土壌に植えて、遺伝子改変された植物を生産するか、または遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物体、または遺伝子改変された挿し木を、土壌で栽培されている根株または第2の植物に接ぎ木して、遺伝子改変された植物を生産するステップ、b) 植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を生産するステップと収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切り口、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を収穫するステップ、およびc）収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切り口、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を収穫するステップを含む。
列挙された実施形態
1.エッセンシャル・ピレノイド・コンポーネント1（EPYC1）ポリペプチドの集合体を形成するための改変ルビスコと、改変ルビスコとを含む、遺伝子改変高等植物またはその一部であって、改変ルビスコが、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチドまたは高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された改変高等植物ルビスコSSUポリペプチドからなることを特徴とする遺伝子改変高等植物またはその一部。
2.EPYC1ポリペプチドおよびその集合体をさらに含む、実施形態1に記載の植物またはその一部。
3.藻類ルビスコSSUポリペプチドを含む改変ルビスコが、未改変ルビスコと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加している、実施形態1に記載の植物またはその一部。
4.修飾された高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、1つ以上の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つ以上の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換すること、1つ以上の高等植物ルビスコSSUβ-ストランドを1つ以上の藻類ルビスコSSUβ-ストランドで置換すること、および／または、高等植物ルビスコSSUβA-βBループを藻類ルビスコSSUβA-βBループで置換することによって修飾された、実施形態1に記載の植物またはその一部。
5.改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、改変されていない高等植物Rubisco SSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加している、実施形態1に記載の植物またはその一部。
6.EPYC1ポリペプチドの集合体を形成するためのEPYC1ポリペプチドと、改変されたルビスコを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
7.EPYC1ポリペプチドが、藻類EPYC1ポリペプチド、または第1藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、もしくは8つのタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドである、実施形態6に記載の植物またはその一部。
8.藻類のEPYC1ポリペプチドが、切断された成熟EPYC1ポリペプチドである、実施形態7に記載の植物またはその一部。
9.切断された成熟EPYC1ポリペプチドが、切断されていないEPYC1ポリペプチドと比較して、修飾されたルビスコに対する親和性が増加している、実施形態8に記載の植物またはその一部。
10.修飾されたEPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現され、かつ／またはC末端キャップを含んでいる、実施形態7に記載の植物またはその一部。
11.改変された修飾されたEPYC1ポリペプチドは、対応する非修飾EPYC1ポリペプチドと比較して、修飾されたルビスコに対する親和性が増加している実施形態10に記載の植物またはその一部。
12.凝集体が、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在しており、植物細胞が葉のメソフィル細胞である、実施形態6に記載の植物またはその一部。
13.EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、改変されたRubiscoポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
14.第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、かつ、第1の核酸配列が、ネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない、および、第2の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体移行ペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、かつ、第2の核酸配列が、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードしておらず、かつ、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていないことを特徴とする、実施形態13に記載の植物またはその一部。
15.EPYC1ポリペプチドが、切断された成熟EPYC1ポリペプチド、または第1藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、もしくは8つのタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドである、実施形態13に記載の植物またはその一部。
16.修飾されたルビスコポリペプチドが、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド、または高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された修飾高等植物ルビスコSSUポリペプチドからなる、実施形態13に記載の植物またはその一部。
17.前記植物またはその一部が、改変されたRubiscoポリペプチドおよびEPYC1ポリペプチドの集合体をさらに含む、実施形態13に記載の植物またはその一部。
18.a)EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列を、植物の細胞、組織、または他の摘出物に導入するステップと
b)植物細胞、組織、またはその他の摘出物を、遺伝子的に改変された小植物に再生すること、および
c)EPYC1ポリペプチドをコードする第一の核酸を用いて、遺伝子改変されたプラントレットを遺伝子改変された植物に成長させること
を含む実施形態1の遺伝子改変高等植物を生産する方法。
19.ステップ（a）の前に、またはステップ（a）と同時に、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入することをさらに含み、ステップ（c）の遺伝子改変された植物が、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸をさらに含む、実施形態18の方法。
20.第1の核酸配列が第1のベクターを用いて導入され、第1のベクターが第1の核酸配列の第1のコピーを含み、第1の核酸配列がネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されておらず、前記第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が第1のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が1つのターミネーターに作動可能に連結されておりおよび、第1のベクターが、第1の核酸配列の第2のコピーをさらに含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、第3のプロモーターに動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、2つのターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態18の方法。
21.改良型ルビスコとEssential Pyrenoid Component 1（EPYC1）ポリペプチドの会合体を形成するための改良型ルビスコを含む、遺伝子組換え高等植物またはその一部。
22.修飾されたルビスコが、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド、または高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された、修飾された高等植物ルビスコSSUポリペプチドを含む、実施形態21に記載の植物またはその一部。
23.EPYC1ポリペプチドおよびその集合体をさらに含む、実施形態21または実施形態22に記載の植物またはその一部。
24.凝集体が、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡（TEM）、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）、または液液相分離アッセイによって検出可能である、実施形態21-23のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
25.修飾された高等植物ルビスコポリペプチドが、内在性ルビスコSSUポリペプチドを含む、実施形態22-24のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
26.修飾された高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、1つまたは複数の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つまたは複数の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換すること、1つまたは複数の高等植物ルビスコSSUβ-ストランドを1つまたは複数の藻類ルビスコSSUβ-ストランドで置換すること、および／または高等植物ルビスコSSUβA-βBループを藻類ルビスコSSUβA-βBループで置換することによって修飾された、実施形態22-25のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
27.高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、2つの高等植物Rubisco SSUα-ヘリックスを2つの藻類Rubisco SSUα-ヘリックスで置換することによって改変されている、実施形態26に記載の植物またはその一部。
28.2つの高等植物Rubisco SSU α-helixが、SEQ ID NO: 1のアミノ酸23-35およびアミノ酸80-93に対応し、2つの藻類Rubisco SSU α-helixが、SEQ ID NO: 2のアミノ酸23-35およびアミノ酸86-99に対応する、実施形態27に記載の植物またはその一部。
29.高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、4つの高等植物ルビスコSSUβ鎖を4つの藻類ルビスコSSUβ鎖で置換し、高等植物ルビスコSSUβA-βBループを藻類ルビスコSSUβA-βBループで置換することにより、さらに修飾されている、実施形態27または実施形態28に記載の植物またはその一部。
30. 4つの高等植物Rubisco SSU β-strandsが、SEQ ID NO：1のアミノ酸39-45、アミノ酸68-70、アミノ酸98-105、およびアミノ酸110-118に対応する。1に対応し、4つの藻類Rubisco SSU β-strandsは、SEQ ID NO:2のアミノ酸39-45、アミノ酸74-76、アミノ酸104-111、およびアミノ酸116-124に対応し、高等植物Rubisco SSU βA-βBループは、SEQ ID NO:1のアミノ酸46-67に対応し、藻類Rubisco SSU βA-βBループは、SEQ ID NO:2のアミノ酸46-73に対応している、実施形態29に記載の植物またはその一部。
31.高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、またはSEQ ID NO:156。に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有していた、実施形態22-30のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
32.藻類Rubisco SSUポリペプチドが、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：SEQ30、 ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有する、実施形態22-31のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
33.藻類Rubisco SSUポリペプチドが、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164 である、実施形態32に記載の植物またはその一部。
34.改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、改変されていない高等植物Rubisco SSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加している、実施形態22-31のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
35.改変されたルビスコの集合体を形成するためのEPYC1ポリペプチドと、該EPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
36.EPYC1ポリペプチドが藻類のEPYC1ポリペプチドである、実施形態21-35のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
37.藻類EPYC1ポリペプチドが、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、またはSEQ ID NO：167に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態35または実施形態36に記載の植物またはその一部。
38.藻類EPYC1ポリペプチドが、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、またはSEQ ID NO:167である、実施形態37に記載の植物またはその一部。
39.EPYC1ポリペプチドが修飾されたEPYC1ポリペプチドである、実施形態21-37のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
40.修飾されたEPYC1ポリペプチドが、第1の藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、または8つのタンデムコピーを含む、実施形態39に記載の植物またはその一部。
41.修飾されたEPYC1ポリペプチドが、第1藻類EPYC1反復領域の4つのタンデムコピーまたは8つのタンデムコピーからなる、実施形態40に記載の植物またはその一部。
42.第1の藻類EPYC1反復領域が、SEQ ID NO：36に対して 少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態40または実施形態41に記載の植物またはその一部。
43.第1の藻類EPYC1リピート領域がSEQ ID NO：36である、実施形態42に記載の植物またはその一部。
44.修飾されたEPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現され、および／またはC末端キャップを含んでいる、実施形態39-43 のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
45.ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO：42に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドからなる、また、C末端キャップが、SEQ ID NO: 42に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドからなることを特徴とする、実施形態44に記載の植物またはその一部。
46.C末端キャップがSEQ ID NO：41である、実施形態45に記載の植物またはその一部。
47.修飾されたEPYC1ポリペプチドが、対応する未修飾のEPYC1ポリペプチドと比較して、Rubisco SSUポリペプチドに対する親和性が増加している、実施形態39-46のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
48.凝集体が、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在している、実施形態21-47のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
49.植物細胞が葉のメソフィル細胞である、実施形態48の植物。
50.植物が、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、大豆、小麦、および他のC3作物植物からなる群から選択される、実施形態21-49のいずれか1つに記載の植物。
51.EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、改変されたRubiscoをコードする第2の核酸配列とを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
52.第1の核酸配列が、第1のプロモーターに動作可能に連結されている、実施形態51に記載の植物またはその一部。
53.前記第1プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態52に記載の植物またはその一部。
54.第1プロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態53に記載の植物またはその一部。
55.第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない、実施形態51-54のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
56.葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態55に記載の植物またはその一部。
57.葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：63である、実施形態56に記載の植物またはその一部。
58.ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60-137に対応する、実施形態55-57のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
59.第1の核酸配列が、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態51-58のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
60.前記1つの2つのターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態59に記載の植物またはその一部。
61.第2の核酸配列が、第2のプロモーターに動作可能に連結されている、実施形態51-60のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
62.前記第2プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態61に記載の植物またはその一部。
63.前記第2のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態62に記載の植物またはその一部。
64.第2の核酸配列が藻類のRubisco SSUポリペプチドをコードする、実施形態61-63のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
65.第2の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列が、在来の藻類SSUリーダー配列をコードしておらず、在来の藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていない、実施形態64に記載の植物またはその一部。
66.葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態65 に記載の植物またはその一部。
67.葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：64である、実施形態66に記載の植物またはその一部。
68.ネイティブSSUリーダー配列がSEQ ID NO:32のアミノ酸1-45に相当する、実施形態65-67のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
69.第2の核酸配列が、ターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態61-68のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
70.ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、およびアクチンスターミネーターからなる群から選択される、実施形態69に記載の植物またはその一部である。
71.第2の核酸配列が、高等植物Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された、改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドをコードする、実施形態61-63のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
72.EPYC1ポリペプチドが、実施形態36-47のいずれか1つに記載のEPYC1ポリペプチドである、実施形態51-71のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
73.ルビスコSSUポリペプチドが、実施形態25-34のいずれか1つに記載のルビスコSSUポリペプチドである、実施形態51-72のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
74.植物またはその一部の少なくとも1つの細胞が、ルビスコポリペプチドとEPYC1ポリペプチドの集合体を含む、実施形態51-73のいずれか1つに記載の植物またはその一部。
75.凝集体が、少なくとも1つの植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在している、実施形態74に記載の植物またはその一部。
76.植物細胞が葉のメソフィル細胞である、実施形態75の植物。
77.凝集体が、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡（TEM）、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）、または液液相分離アッセイによって検出可能である、実施形態74-76 のいずれか1つに記載の植物。
78.植物が、ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、コムギ、および他のC3作物植物からなる群から選択される、実施形態71-77のいずれか1つに記載の植物。
79.実施形態21-78のいずれか1つに記載の植物または植物の一部から得られる、遺伝子改変された高等植物細胞。
80.d)EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列を、植物の細胞、組織、または他の摘出物に導入するステップと
e)植物細胞、組織、またはその他の摘出物を、遺伝子的に改変された小植物に再生すること、および
f)EPYC1ポリペプチドをコードする第一の核酸を用いて、遺伝子改変されたプラントレットを遺伝子改変された植物に成長させること
をふくむ実施形態21-79のいずれか1つに記載の遺伝子改変高等植物を製造する方法。
81.ステップ（a）の前に、またはステップ（a）と同時に、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入することをさらに含み、ステップ（c）の遺伝子改変された植物が、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸をさらに含む、実施形態80に記載の方法。
82.ステップ（b）の前に植物細胞、組織、または他の摘出物をスクリーニングまたは選択すること、ステップ（b）と（c）の間に植物体をスクリーニングまたは選択すること、またはステップ（c）の後に植物をスクリーニングまたは選択することによって、第1の核酸配列および任意に第2の核酸配列の導入が成功したことを識別することをさらに含む、実施形態80または実施形態81に記載の方法。
83.粒子ボンバードメント（すなわち、バイオリスティック、ジーンガン）、アグロバクテリウム媒介形質転換、リゾビウム媒介形質転換、およびプロトプラストトランスフェクションまたは形質転換からなる群から選択される形質転換方法を用いて形質転換を行う、実施形態80-82のいずれか1つに記載の方法。
84.第1の核酸配列が第1のベクターで導入され、第2の核酸配列が第2のベクターで導入される、実施形態81-83のいずれか1つに記載の方法。
85.第1の核酸配列が第1のプロモーターに動作可能に連結されている、実施形態84 に記載の方法。
86.第1プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態85に記載の方法。
87.第1のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態86に記載の方法。
88.第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列が、ネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない、実施形態80-87のいずれか1つに記載の方法。
89.葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態88に記載の方法。
90.内因性の葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：63である、実施形態89に記載の方法。
91.ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60から137に対応する、実施形態88-90のいずれか1つに記載の方法。
92.第1の核酸配列が、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態80-91のいずれか1つに記載の方法。
93.前記1つまたは2つのターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態92に記載の方法。
94.第2の核酸配列が、第2のプロモーターに動作可能に連結されている、実施形態81-93のいずれか1つに記載の方法。
95.第2のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態94に記載の方法。
96.第2のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態95に記載の方法。
97.第2の核酸配列が藻類のSSUポリペプチドをコードする、実施形態94-96のいずれか1つに記載の方法。
98.第2の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列が、在来の藻類SSUリーダー配列をコードしておらず、在来の藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていない、実施形態97に記載の方法。
99.葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：64に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態98に記載の方法。
100.葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：64である、実施形態99に記載の方法。
101.ネイティブ藻類SSUリーダー配列が、SEQ ID NO：32のアミノ酸1から45に対応する、実施形態98-100のいずれか1つに記載の方法。
102.第2の核酸配列が、ターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態94-101のいずれか1つに記載の方法。
103.ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、およびアクチンスターミネーターからなる群から選択される、実施形態102に記載の方法。
104.第2の核酸配列が、高等植物Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された、改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドをコードする、実施形態94-96のいずれか1つに記載の方法。
105.第2のベクターが、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された核ゲノム配列を標的とする1つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む、実施形態104に記載の方法。
106.1つまたは複数の遺伝子編集構成要素が、核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体、TALENタンパク質をコードする配列を含むベクターであって、TALENタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、ZFNタンパク質をコードする配列を含むベクターであって、ZFNタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、オリゴヌクレオチド供与体（ODN）であって、ODNが核ゲノム配列を標的とするベクター、およびCRISPR／Cas酵素のコード化配列とターゲティング配列を含むベクターであって、ターゲティング配列が核ゲノム配列を標的とするベクターからなる群から選択される。実施形態105に記載の方法。
107.遺伝子編集の結果が、高等植物Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部と置換されることである、実施形態105または実施形態106に記載の方法。
108.EPYC1ポリペプチドが、実施形態36-47のいずれか1つに記載のEPYC1ポリペプチドである、実施形態80-107 のいずれか1つに記載の方法。
109.ルビスコSSUポリペプチドが、実施形態25-34のいずれか1つに記載のルビスコSSUポリペプチドである、実施形態81-108のいずれか1つに記載の方法。
110.第1のベクターが、第1の核酸配列の第1のコピーを含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、前記第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が第1のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が1つのターミネーターに作動可能に連結されておりおよび、第1のベクターが、第1の核酸配列の第2のコピーをさらに含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、第3のプロモーターに動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、2つのターミネーターに動作可能に連結されている、実施形態88または実施形態92に記載の方法。
111.第1のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択され、第3のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択され、そして第1および第3のプロモーターが同一ではない、実施形態110に記載の方法。
112.葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO：63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態111に記載の方法。
113.ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60から137に対応する、実施形態112に記載の方法。
114.ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態113に記載の方法。
115.実施形態80-114のいずれか1つに記載の方法で生産された植物または植物の一部。
116.a)遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物、遺伝子改変された挿し木、遺伝子改変された塊茎、遺伝子改変された根、または遺伝子改変された種子を土壌に植えて、遺伝子改変された植物を生産すること、または、遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物、または遺伝子改変された挿し木を、土壌で栽培された根株または第2の植物に接ぎ木して、遺伝子改変された植物を生産すること、
b)植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を生産すること、および
c)収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を収穫すること、
を含む実施形態21-79および115のいずれか1つに記載の遺伝子組換え植物を栽培する方法。
特許または出願ファイルには、少なくとも1つのカラー図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開の写しは、請求して必要な手数料を支払えば、国内で提供される。
図1A-1Dは、Essential Pyrenoid Component 1（EPYC1）とRubisco small subunit（SSU）の構造を示す図である。図1Aは、EPYC1の模式図であり、4つの繰り返し領域を薄い灰色（第1繰り返し領域）、灰色（第2繰り返し領域）、濃い灰色（第3繰り返し領域）、最も濃い灰色（第4繰り返し領域）で示し、各繰り返し領域に予測されるαヘリックスを黒で示し、N末端とC末端を白で示している。図1Bは、EPYC1（SEQ ID NO：34）の配列を示しており、4つのリピート領域が整列しており（薄いグレー（SEQ ID NO：36）、グレー（SEQ ID NO：69）、濃いグレー（SEQ ID NO：70）、および濃いグレー（SEQ ID NO：71）で強調されており、各リピート領域における予測されるα-helix（SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170）が太字および下線で示されている。N末端（SEQ ID NO: 68）およびC末端（SEQ ID NO: 41）は灰色で示し、26（V）と27（A）の間にある葉緑体移行ペプチドの予測される切断部位は黒の矢じりで示した。図1Cは、シロイヌナズナ（1AAt）由来のルビスコSSU 1Aの予測モデルを示しており、4つのβシート（薄いグレーで示し、ラベルを付けてある）、2つのαヘリカル領域（濃いグレーで示し、ラベルを付けてある）、および1つのβA-βBループ（上部にグレーで示し、ラベルを付けてある）を有する。図1Dは、成熟したA. thaliana SSU 1A (1AAt; SEQ ID NO: 1)および成熟したChlamydomonas reinhardtii SSU 1 (S1Cr; SEQ ID NO: 2)のアミノ酸配列を示しており、α-へリックスは濃い灰色で、β-シートは薄い灰色で、βA-βBループは灰色で強調されている。2つのC. reinhardtii SSU（S1CrとS2Cr）の間で異なる4つのアミノ酸を太字で示している（図のS1Crは、これらの位置にT、A、T、Fがあり、図のないS2Crは、これらの位置にそれぞれS、S、S、Wがある）。 図2A-2Cは、EPYC1と異なるSSUとの間の相互作用を測定するためのイースト・ツー・ハイブリッド（Y2H）実験の結果を示す図である。図2Aは、ロイシン（L）およびトリプトファン（W）を欠いた酵母合成最小培地（SD培地）（SD-L-W）およびL、Wおよびヒスチジン（H）を欠いた酵母合成最小培地（SD培地）（SD-L-W-H）でのY2H相互作用を示しており、相互作用の強さは、阻害剤である3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT；10mM 3-ATでの成長＝強い相互作用）の濃度を増加させながら成長させることで示されている（EPYC1＝C. reinhardtii EPYC1；S1Cr＝C. reinhardtii SSU 1；S2Cr＝C. reinhardtii SSU 2；1AAt＝A. thaliana SSU 1A；および1AAtMOD＝C. reinhardtiiの2つのα-ヘリカル領域を有する改変1AAt）。図2Bは、ポジティブコントロール（BD＋およびAD＋）、ネガティブコントロール（BD-およびAD-）、異なるベクターでの目的の遺伝子の発現、および自己相互作用のテスト（LSUCr＝C. reinhardtii Rubisco large subunit）を含む、Y2Hコントロールを示す。図2Cは、追加のY2Hコントロール（AtCP12＝A. thaliana CP12-2（遺伝子ID：AT3G62410）；CAH3＝C. reinhardtii carbonic anhydrase 3（遺伝子ID：Cre09.g415700.t1.2）；LCIB＝C.reinhardtii low-CO2 inducible protein B (遺伝子 ID: Cre10.g452800.t1.2); LCIC = C. reinhardtii low-CO2 inducible protein C (遺伝子ID: Cre06.g307500.t1.1); LSUAt = A. thaliana Rubisco large subunit)である。図2A-2Cについて、BD＝結合ドメイン（すなわち、記載の遺伝子がpGBKT7ベクターで発現されている）、AD＝活性化ドメイン（すなわち、記載の遺伝子がpGADT7ベクターで発現されている）、およびOD＝600nmでの光学濃度（OD600）によって測定された、酵母細胞をプレーティングした細胞密度である。 図3A-3Cは、A. thalianaおよびC. reinhardtiiのSSUのネイティブおよび修飾、ならびにEPYC1との相互作用を示す図である。図3Aは、A. thaliana（1AAt（At1g67090）；SEQ ID NO：1）およびC. reinhardtii（S1Cr（Cre02.g120100.t1.；2SEQ ID NO：30）；およびS2Cr（Cre02.g120150.t1.2；SEQ ID NO：2））の成熟SSUのペプチド配列のアライメントを示す。図3Bは、ペプチド配列1AAt（At1g67090；SEQ ID NO：1）、S1Cr（Cre02.g120100.t1.2；SEQ ID NO：30）およびS2 Cr（Cre02.g120150.t1.2；SEQ ID NO：2）を、S1Cr とS2Crとで異なる残基を太字で示している。改変版の1A At（1AAtMod（βシート）＝A. thalianaのβシートをC. reinhardtiiのβシートに置き換えたもの（SEQ ID NO: 23）、1AAtMod（ループ）＝A. thalianaのβA-βBループをC. reinhardtiiのβA-βBループに置き換えたもの、reinhardtii βA-βBループ（SEQ ID NO: 24）、1AAtMod（βシートおよびループ）＝A. thaliana βシートおよびβA-βBループをC. reinhardtii βシートおよびβA-βBループに置き換えたもの（SEQ ID NO: 25）、1AAtMod（A. thaliana α-ヘリックス）＝α-ヘリックスをC. reinhardtii α-ヘリックスに置き換えたもの（SEQ ID NO: 25）、1AAtMod（A. thaliana α-ヘリックス）＝α-ヘリックスをC. reinhardtii α-ヘリックスに置き換えたもの（SEQ ID NO: 25）、1AMod（A. thaliana α-helix）＝α-helixをC. reinhardtii α-helixおよびβ-sheetに置き換えたもの（SEQ ID NO: 26）、1AAtMod（α-helixおよびβ-sheet）＝A. thaliana α-helixおよびβ-sheetをC. reinhardtii α-helixおよびβ-sheetに置き換えたもの（SEQ ID NO: 27）、1AAtMod（α-helix, β-sheet and loop）＝A.thalianaのα-ヘリックス、β-シート、およびβA-βBループをC.reinhardtiiのα-ヘリックス、β-シート、およびβA-βBループに置き換えたもの（SEQ ID NO：28）、植物の形質転換に用いられる1AAt-TPを用いた1AAtMod（Atkinson et al,2017）＝A. thaliana Rubisco small subunit 1A transit peptide（1AAt-TP；下線付き）（SEQ ID NO: 33）を有する1AAtMod（α-helices））およびS2Cr（植物の形質転換に用いられる1AAt-TPを用いたS2Cr (Atkinson et al., 2017)（下線付き）（SEQ ID NO: 22））も示されている。図3A-3Bにおいて、A.thalianaのα-ヘリックスは最も薄い灰色で強調表示され（SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4）、C.reinhardtiiのα-ヘリックスは濃い灰色で強調表示され（SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12）、A.thalianaのβ-シートは薄い灰色で強調表示され（SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8）、C.reinhardtiiのβシートはグレーでハイライトされている（SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14）（ただし、残基TMWを持つβシート（SEQ ID NO: 6）はA. thalianaとC. reinhardtiiで同じである）。A. thalianaのβA-βBループは薄いグレーで強調表示され（SEQ ID NO: 9）、C. reinhardtiiのβA-βBループは最も濃いグレーで強調表示されている（SEQ ID NO: 15）。図3Cは、異なる濃度の3-ATを用いたY2H実験の結果を示しており、EPYC1と、1AAtの異なる構成要素（α-ヘリックス、β-シート、βA-βBループ）をS1Crの構成要素で置き換えた改変版1AAt（1AAtMOD）との間の相互作用強度を測定している（1AAtMODバージョンのペプチド配列は図3Bに示されている）。相互作用の強さはヒートマップで示した（右側のキーは成長が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）。生物学的複製を2回行い、実験はそれぞれ少なくとも2回繰り返した。偽陽性／偽陰性を排除するために、適切なコントロールを行った。 図4A-4Kは、C. reinhardtii EPYC1のネイティブバージョンおよび改変バージョンと、S1Crとの相互作用を示す図である。EPYC1の4つのリピート領域は、最も明るいグレー（第1リピート領域）、グレー（第2リピート領域）、暗いグレー（第3リピート領域）、および最も暗いグレー（第4リピート領域）で強調されている。図4A-4Bは、完全長のネイティブEPYC1（Cre10.g436550.t1.2；（SEQ ID NO:34））と、N末端から異なるトランケーションを有する改変EPYC1のペプチド配列を示す。図4Aでは、N-ter＝N-末端（SEQ ID NO：68）、N-ter＋1rep＝N-末端＋第1リピート領域（SEQ ID NO：43）、N-ter＋2reps＝N-末端、第1リピート領域、および第2リピート領域（SEQ ID NO:44）、N-ter+3reps＝N-terminus、第1リピート領域、第2リピート領域、および第3リピート領域（SEQ ID NO: 45）、およびN-ter+4reps＝N-terminus、第1リピート領域、第2リピート領域、第3リピート領域、および第4リピート領域（SEQ ID NO: 46）である。図4Bでは、4reps＋C-ter／mEPYC1＝第1リピート領域、第2リピート領域、第3リピート領域、第4リピート領域、およびC-末端（SEQ ID NO：47）、3reps＋C-ter＝第2リピート領域、第3リピート領域、第4リピート領域、およびC-末端（SEQ ID NO:48）、2reps+C-ter＝第3リピート領域、第4リピート領域、およびC-末端（SEQ ID NO: 49）、1rep+C-ter＝第4リピート領域およびC-末端（SEQ ID NO: 50）、およびC-ter＝C-末端（SEQ ID NO: 41）である。図4C-4Dは、ネイティブなEPYC1タンパク質と、N末端からの異なるトランケーションを有するバリアントEPYC1タンパク質（図4A-4Bに示すペプチド配列）のアライメントを示す。図4Cは、ネイティブなEPYC1タンパク質および切断されたEPYC1タンパク質のN末端部分のア系統メントを示す。図4Dは、ネイティブおよびトランケートされたEPYC1タンパク質のC末端部分のア系統メントを示す。図4E-4Fは、完全長のネイティブEPYC1のペプチド配列（Cre10.g436550.t1.2; SEQ ID NO:34）と、αヘリックスに点変異を持つ第1リピート領域（EPYC1-α1）、αヘリックスに点変異を持つ第2リピート領域（EPYC1-α2）、αヘリックスに点変異を持つ第3リピート領域（EPYC1-α2）の異なる組み合わせでリピート領域を置換した改変EPYC1を示す。図4Eは、EPYC1（Cre10.g436550.t1.2）＝完全長ネイティブEPYC1（SEQ ID NO：34）、EPYC1-α1＝第1リピート領域をEPYC1-α1に置き換えた完全長EPYC1（SEQ ID NO：51）、」EPYC1-α1,2＝第1リピート領域をEPYC1-α1に、第2リピート領域をEPYC1-α2に置き換えた完全長EPYC1（SEQ ID NO:52）、およびEPYC1-α1,2,3＝第1リピート領域がEPYC1-α1に、第2リピート領域がEPYC1-α2に、第3リピート領域がEPYC1-α3に置き換えられた完全長のEPYC1（SEQ ID NO: 53）である。図4Fでは、EPYC1-α1,2,3,4＝第1リピート領域がEPYC1-α1に、第2リピート領域がEPYC1-α2に、第3リピート領域がEPYC1-α3に、第4リピート領域がEPYC1-α4に置換された完全長のEPYC1（SEQ ID NO:54）、EPYC1-α3,4＝3番目のリピート領域をEPYC1-α3に、4番目のリピート領域をEPYC1-α4に置き換えた完全長のEPYC1（SEQ ID NO: 55）、およびEPYC1-α4＝4番目のリピート領域をEPYC1-α4に置き換えた完全長のEPYC1（SEQ ID NO: 56）である。図4G-4Hは、ネイティブEPYC1タンパク質と、αヘリックス点変異リピート領域でリピート領域を置換したバリアントEPYC1タンパク質（図4E-4Fに示すペプチド配列）とのアライメントを示す。図4Gは、ネイティブなEPYC1タンパク質とトランケートされたEPYC1タンパク質のN末端部分のア系統メントを示す。図4Hは、ネイティブおよびトランケートされたEPYC1タンパク質のC末端部分のア系統メントを示す。図4Iは、酵母におけるネイティブなEPYC1およびN末端切断修飾版EPYC1のイムノブロットを示す。図4Jは、S1Crと修飾バージョンのEPYC1の間の、Y2H実験によって測定された相互作用強度を示す（このパネルで試験された修飾バージョンのEPYC1のペプチド配列は、図4A-4Bに示されている）。図4Kは、Y2H実験によって測定された、S1Crと追加の修飾バージョンのEPYC1との間の相互作用強度を示す（このパネルで試験された修飾バージョンのEPYC1のペプチド配列は、図4E-4Fに示されている）。図4J-4Kでは、相互作用の強さをヒートマップで示し（右側のキー、増殖が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）、EPYC1の4つの繰り返し領域を左から右にブロック図で示した（N末端を白、第1繰り返し領域を薄い灰色、第2繰り返し領域を灰色、第3繰り返し領域を灰色、第4繰り返し領域を黒、C末端を白）。αヘリックス点変異繰り返し領域での領域置換をブロック内の黒または濃い灰色の縦棒で示した。生物学的複製を2回行い、実験はそれぞれ2回以上繰り返した。 図5A-5Fは、SSUとの相互作用強度を高めるために行ったEPYC1の改造と、EPYC1の改造を検証するための実験結果を示す図である。図5Aは、第1リピート領域の1、2、4、または8回のタンデムリピートのペプチド配列（合成EPYC1 1reps（SEQ ID NO：36）、合成EPYC1 2reps（SEQ ID NO：37）、合成EPYC1 4reps（SEQ ID NO:38)、および合成EPYC1 8reps(SEQ ID NO: 39)）、追加のαヘリックスが挿入された第1リピート領域のペプチド配列（太字および下線で示す）（合成EPYC1 2αヘリックス1reps(SEQ ID NO:57））、それぞれ追加のαヘリックスが挿入された第1リピート領域の4つのコピー（太字と下線で示す）（合成EPYC1 2 α-helix 4 reps（SEQ ID NO:58)）、および第1リピート領域の3つのバージョンは、それぞれ第1リピートのαヘリックスに点変異（太字で大きく示す）を含んでいる（それぞれ、合成EPYC1修正αヘリックス1reps（SEQ ID NO: 59）、合成EPYC1αヘリックスノックアウトA（SEQ ID NO: 60）、および合成EPYC1αヘリックスノックアウトB（SEQ ID NO: 61））。図5B-5Dは、ネイティブなEPYC1タンパク質と、タンデムリピートの数が異なる合成EPYC1タンパク質（図5Aに示すペプチド配列）のアライメントを示す。図5Bは、ネイティブなEPYC1タンパク質および合成EPYC1タンパク質のN-末端部分のア系統メントを示す。図5Cは、ネイティブおよび合成のEPYC1タンパク質の中央部分のア系統メントを示す。図5Dは、ネイティブおよびトランケートされたEPYC1タンパク質のC末端部分のア系統メントを示す。図5Eは、相互作用の強さを示す。5Eは、Y2H実験によって測定された、EPYC1のS1Crと合成変異体の間の、第1リピート領域（最も薄い灰色）および予測されるαヘリックス（αヘリックスは最も濃い灰色、改変αヘリックスは最も薄い灰色、αヘリックスノックアウトAはより薄い灰色、またはαヘリックスノックアウトBはより薄い灰色で満たされた縦棒で示される）に基づく相互作用強度を示す（このパネルで試験されたEPYC1の合成変異体のペプチド配列は、図5Aに示されている）。相互作用の強さはヒートマップで示されている（右側のキー、成長が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）。図5Fは、バイオインフォマティクスツールPCOILSを用いて、EPYC1の第1リピート領域およびEPYC1の第1リピート領域の合成変異体について予測されたコイルドコインドメインの確率を示したものである。一致する色分けされたアミノ酸配列をグラフの下に示し、野生型の配列と異なる残基は太字と下線で示した。上がEPYC1 1 rep（野生型）の配列（SEQ ID NO：36）、上から2番目がαヘリックスノックアウトBの配列（SEQ ID NO：60）、上から3番目がαヘリックスノックアウトAの配列（SEQ ID NO：61）、上から4番目が修飾αヘリックスの配列（SEQ ID NO：59）、下が2αヘリックスの配列（SEQ ID NO：57）である。斜線のグラフは、全長EPYC1のコイルドクールドメイン確率を示している。 図6A-6Cは、C. reinhardtii由来の成熟EPYC1の免疫沈降およびインタクトタンパク質の質量分析を示す図である。図6Aは、C. reinhardtii細胞溶解物（入力）、免疫沈降プロセス中の洗浄の内容（洗浄）、および溶出した免疫沈降EPYC1（IP）を含む、コーマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。図6Bは、EPYC1のエレクトロスプレーイオン化（ESI）電荷状態分布を示す図である。図6Cは、EPYC1のダルトン（Da）単位のデコンボリュート中性分子量を示す。 図7A-7Cは、高等植物でEPYC1を発現させるために使用したバイナリーベクターのマップ、および高等植物でのEPYC1の発現を示すアッセイ結果を示す図である。図7Aは、植物の形質転換に用いられた1AAt-TP::EPYC1（SEQ ID NO: 67）を有するバイナリーベクターの地図であり、A. thaliana Rubisco small subunit 1A transit peptide（1AtA-TP）を灰色で、EPYC1を薄い灰色で、35S constitutive promoter（35S）とオクトピンシンターゼターミネーター（ocs）を共に灰色で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（oriV）の低コピープラスミドの複製を可能にするプラスミドpVS1の複製起点を最も薄い灰色で示し、スペクチノマイシン耐性を付与するアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（SmR）の発現カセット（濃いグレー）、コピー数の多いColE1/pMB1/pBR322/pUCの複製起点（ori）（薄いグレー）、oriVに結合して活性化するトランスアクティングレプリケーションタンパク質（trfA）（濃いグレー）、pFAST-R選択カセット（E. quadricolor由来のモノメリックタグRFPをコード化して融合したもの）（薄いグレー）quadricolor由来のモノメリックタグRFPをオレオシン1（OLE1、A. thaliana）のコード配列に融合させたもの（Shimada, et al,Plant J.(2010) 61:519-528-667）白がオレシン1プロモーター（Olesin pro）、グレーがオレシン1の5'UTR（Olesin 5'UTR）、暗灰色の点線が入った暗灰色が改変されたオレシン1遺伝子（Olesin）、暗灰色が蛍光タグ（TagRFP）白のオレシン1ターミネーター（Olesin term）、グレーのT-DNAの植物細胞ゲノムへの組み込みに必要な右境界配列（RB T-DNAリピート）、グレーのT-DNAの植物細胞ゲノムへの組み込みに必要な左境界配列（LB T-DNAリピート）を示す。図7Bは、以下の構築物のN. benthamianaにおける一過性の発現を示す。図7Bは、1AAt葉緑体通過ペプチドを含まない緑色蛍光タンパク質（GFP）と融合したEPYC1（EPYC1::GFP、上段）、1AAt葉緑体通過ペプチドを含むGFPと融合したEPYC1（1AAt-TP::EPYC1::GFP、中段）、およびGFPと融合したA. thaliana 1Aルビスコのスモールサブユニット（RbcS1A::GFP、下段）のコンストラクトのN. benthamianaにおける一過性の発現を示す。図7Cは、以下の構築物のA. thalianaにおける安定した発現を示す。EPYC1は、1AAt葉緑体移行ペプチドを含まないGFPと融合したもの（EPYC1::GFP、上段）、および1AAt葉緑体移行ペプチドを含むGFPと融合したもの（1AAt-TP::EPYC1::GFP、下段）である。図7B-7Cについては、GFPチャネルを左列に、クロロフィル自家蛍光チャネルを中列に、GFPとクロロフィルのオーバーレイを右列に、オーバーラップするシグナルを白で示し、スケールバーは10μmを表す。 図8A-8Eは、EPYC1を発現する高等植物のタンパク質発現および成長データを示す図である。図8Aは、野生型（EPYC1、上段）、S2Crで補完されたRubiscoスモールサブユニット変異体1a3b変異体（S2Cr_EPYC1、中段）、および1AAtMODで補完された1a3b（1AAtMOD_EPYC1、下段）の3つのバックグラウンドで1AAt-TP::EPYC1を発現するA.thaliana植物株から抽出したタンパク質からの1AAt-TP::EPYC1に対するイムノブロットを示す図である。免疫ブロットは、EPYC1を欠いている対応する分離体（Seg 1、Seg 2、Seg 3）と比較して、バックグラウンドごとに3つの独立して形質転換されたホモ接合T3系統（Line 1、Line 2、Line 3）における相対的なEPYC1発現レベルを表示している。図8Bは、図8Aの系統の植物から31日目に収穫された植物の新鮮重量および乾燥重量を示す図である。バックグラウンド（EPYC1、S2Cr_EPYC1、1AAtMOD_EPYC1）ごとに3つの独立して形質転換されたホモ接合T3系統（「_1」、「_2」、「_3」で示す）からのデータを白棒で示し、各系統のEPYC1を欠く対応する分離種からのデータを黒棒で示す。値は、12個のロゼットについて行われた測定の平均値±標準誤差であり、アスタリスクは、スチューデントのペアサンプルt検定によって決定される、形質転換された系統と分離種との間の有意差（P＜0.05）を示す。図8Cは、図8A-8Bに記載の9つの形質転換株のロゼット成長を示す。ロゼット成長は、面積（mm2）で測定され、値は、16個のロゼットで行われた測定の平均値±標準誤差であり、背景ごとに3つの独立して形質転換されたホモ接合T3系統（EPYC1、S2Cr＿EPYC1、1AAtMOD＿EPYC1）からのデータは黒丸で示され、各系統についてEPYC1を欠く対応する分離種からのデータは白丸で示されている。図8Dは、異なる発現系から抽出したEPYC1のバンディングパターンを比較したイムノブロットである。レーン1：A. thaliana安定発現株EPYC1_1のタンパク質を、200mM DTTを含むサンプルローディングバッファーで抽出したものである。レーン2:プロテアーゼ阻害剤を含む免疫沈降（IP）抽出バッファーで抽出したEPYC1_1株由来のタンパク質である。レーン3:IP抽出バッファーで抽出したC. reinhardtii (strain CC-1690m)のタンパク質である。レーン4：EPYC1::GAL4結合ドメインを発現している酵母から、酵母の溶解バッファーで抽出したタンパク質である。ブロットは、Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963の抗1EPYC抗体でプローブされた。図8Eは、C. reinhardtii（左）およびA. thaliana系統S2Cr_EPYC1（右）におけるEPYC1（上）とRubiscoラージサブユニット（LSU；下）の存在量のレシオメトリックな比較を示すイムノブロットである。レーンごとに積み込まれた可溶性タンパク質の量をμg単位で各ブロットの上に表示し、3つの独立した生物学的複製をアッセイした。 図9A-9Eは、高等植物におけるEPYC1とRubiscoの間の相互作用を特徴づける方法の結果を示す図である。図9Aは、抗EPYC1抗体を架橋したProtein-Aコーティングビーズを用いて行った、4つの異なるトランスジェニックA. thaliana株からのルビスコとEPYC1の共免疫沈降の結果を示す。一番上の行は、S2Crで補完されたRubiscoスモールサブユニット変異体1a3b変異体と、1AAtTPと融合したEPYC1を発現させた場合のデータである。2段目は1AAtMODで相補し、1AAtTPと融合したEPYC1を発現させた1a3b変異体のデータを示す。3段目は、1AAtTPと融合したEPYC1を発現させた野生型（WT）植物のデータである。下段は、EPYC1を持たないS2Crで補完した1a3bのデータである。左側のブロット（EPYC1 IP）は、抗EPYC1抗体（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963より）でプロービングした場合の結果を示し、右側のブロット（Co-IP）は、Rubisco large subunit（LSU）に対する抗体でプロービングした場合の結果を示す。左から右のレーン（列）には、入力（Input）、フロースルー（F-T）、4回目の洗浄（Wash）、沸騰溶出（Elute）の結果が表示されている。ネガティブコントロール（Neg.）は異なる。Neg.(*)はProtein-Aビーズ上の抗EPYC1抗体を抗HA抗体に置き換え、IPを以前と同様に継続したコントロール、Neg.(**)はProtein-Aビーズ上の抗EPYC1抗体を無抗体に置き換え、IPを前と同様に続けたコントロールである（いずれも、溶出したサンプルのみを示している）。トリプルアスタリスク（***）は、EPYC1を発現していないコントロール系統（S2Cr）を含む全てのサンプルにおいて、抗EPYC1抗体で観察された非特異的なバンドを示す。図9Bは、YFPNまたはYFPCのいずれかにC末端で融合したタンパク質を一過性に発現させた3つのN. benthamiana株における二分子蛍光相補性アッセイを示す。上段は、C. reinhardtiiのRubiscoスモールサブユニット2（S2Cr）をYFP Nに融合させたもの（S2Cr::YFPN）と、EPYC1をYFPCに融合させたもの（EPYC1::YFPC）を発現させた植物のデータである。中段は、EPYC1をYFP Nに融合させたもの（EPYC1::YFPN）とS2CrをYFP Cに融合させたもの（SCr2::YFPC）を発現させた植物のデータである。下段は、C. reinhardtii由来の2つのα-ヘリカル領域を有する改変1AAt（1AAtMOD）をYFP Nに融合させたもの（1AAtMOD::YFPN）と、EPYC1をYFP Cに融合させたもの（EPYC1::YFPC）を発現する植物からのデータを示す。図9Cは、C末端にYFPNまたはYFPCのいずれかに融合したタンパク質を一過性に発現させた3つの追加のN. benthamiana系統における二分子蛍光相補性アッセイを示す。上段は、EPYC1にYFP Nを融合させたもの（EPCY1::YFPN）と1AtAMODにYFP Cを融合させたもの（1AAtMOD::YFPC）を発現させた株のデータを示す。中段は、A. thaliana SSU 1A（1AAt）にYFP Nを融合させたもの（1AAt::YFPN）とEPYC1にYFP Cを融合させたもの（EPYC1::YFPC）を発現させた植物からのデータを示す。下段は、YFP Nに融合したEPYC1（EPYC1::YFPN）およびYFPCに融合した1AAt （1AAt::YFPC）を発現する植物からのデータを表示している。図9Dは、C末端にYFPNまたはYFP Cのいずれかに融合したタンパク質を一過性に発現させた3つのN. benthamiana系統における、ネガティブコントロールの二分子蛍光相補性アッセイを示す図である。上段は、YFP Nに融合したAtCP12（AtCP12::YFPN）とYFP Cに融合したEPYC1（EPYC1::YFPC）を発現させた植物からのデータである。中段は、YFPに融合したEPYC1N（EPYC1::YFPN）とYFP Cに融合したAtCP12（AtCP12::YFPC）を発現している植物のデータを示す。下段は、YFPに融合したAtCP12N（AtCP12::YFPN）およびYFP Cに融合した1AAt（1AtA::YFPC）を発現する植物からのデータを表示している。図9Eは、2つの追加のN. benthamiana系統における追加のネガティブコントロール二分子蛍光相補性アッセイを示す。上段は、YFPNに融合した1AAt（1AAt::YFPN）およびYFP Cに融合したAtCP12（AtCP12::YFPC）を一過性に発現させた植物からのデータを示す。下段は、形質転換していない植物のデータである。図9B-9Dにおいて、左列の信号は再構成されたYFP蛍光であり、中列の信号はクロロフィル自家蛍光であり、YFPチャンネルとクロロフィルチャンネルのオーバーレイが右列にあり、オーバーラップする信号は白で示されており、スケールバーは10μmを表している。 図10A-10Eは、RubiscoとEPYC1の混合物のin vitro相分離データである。図10Aは、15μMのRubisco（C. reinhardtiiから抽出したもの（Cr）、A. thalianaの野生型植物から抽出したもの（At）、A. thalianaのS2Cr植物から抽出したもの（S2C）、またはRubiscoを含まないもの（-））と10μMのEPYC1（右の4つのチューブに入っている、左の3つのチューブにはEPYC1を加えなかった）を含むチューブを、室温で混合してから約3分後の画像である。図10Bは、示したように、異なる濃度および比率のEPYC1およびRubiscoを含むin vitroサンプルの微分干渉コントラスト（DIC）およびエピ蛍光（GFP）顕微鏡画像を示す。EPYC1を含むサンプルの蛍光は、EPYC1::GFP（EPYC1の最終濃度は0.25μMのEPYC1::GFPを含む）を含んでいることによる。左端の2列はC. reinhardtiiからルビスコを精製したもの、中央の2列はA. thaliana S2Cr植物（S2Cr）からルビスコを精製したもの、右端の2列は野生型A. thaliana植物（シロイヌナズナ）からルビスコを精製したものである。スケールバーは15μmを表す。図10Cは、15μMの単離されたS2Crルビスコおよび10μMのEPYC1を含むインビトロサンプルにおける液滴融合の時間経過顕微鏡画像を示す。上段は、微分干渉コントラスト（DIC）チャネルを表示し、下段は、蛍光エピ（GFP）チャネルを表示する。上部には、シリーズの各画像の最初の画像からの経過時間（秒）が表示されている。スケールバーは5μmを表している。図10Dは、40μMのRubisco（Rubiscoは、C. reinhardtii（Cr）、A. thaliana S 2Crplants（S2Cr）、または野生型A. thaliana植物（At）から抽出され、Rubiscoを含まないサンプルを-で示す）と、示された異なるμM濃度のEPYC1（0μM、3.75μM、または10μM）を含むサンプルのSDS-PAGEによる液滴沈降分析を示す。図10Eは、15μMのルビスコを含むサンプル（ルビスコは、C. reinhardtii（Cr）、A. thaliana S 2Crplants（S2Cr）、または野生型A. thaliana植物（At）から抽出した）、および示された異なるμM濃度のEPYC1（3.75μMまたは10μM）についてのSDS-PAGEによる追加の液滴沈降分析を示す。図10D-10Eでは、RubiscoとEPYC1を分解した液滴を遠心分離し、上清画分（バルク溶液；S）と再懸濁したペレット画分（液滴；P）の両方をゲル上に走らせた（Mはマーカーレーンを表し、左にサイズキーをkDaで表示し、右にRubiscoラージサブユニット（LSU）、EPYC1、Rubiscoスモールサブユニット（SSU）に対応するバンドの位置を示した）。 図11A-11Bは、高等植物の葉緑体におけるRubiscoの局在データである。図11Aは、EPYC1を発現させたA. thaliana S2Cr系統の葉緑体におけるRubiscoの免疫金ラベル化の透過型電子顕微鏡像である（スケールバーは0.5μm）。図11Bは、EPYC1を発現していないS2Crで補完したA. thaliana 1a3b変異体の葉緑体におけるRubiscoの免疫金標識の透過型電子顕微鏡像である（スケールバーは0.5μm）。 図12A-12Lは、TobiEPYC1遺伝子発現カセット、高等植物でTobiEPYC1を発現させるために使用したバイナリーベクターの地図、およびTobiEPYC1を発現させた植物およびプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す図である。図12Aは、EPYC1のN末端を切断したネイティブおよび合成EPYC1の変種（TobiEPYC1変種）のための6つの異なる遺伝子発現カセットを示す。各カセットには、左から順に、35Sプロモーター（35s pro；灰色）、A. thaliana Rubisco SSU 1A由来の57残基の葉緑体シグナルペプチド、A. thaliana Rubisco SSU 1A由来の57残基の葉緑体シグナルペプチドが含まれている。各カセットには、左から順に、35Sプロモーター（35s pro；灰色）、A. thaliana Rubisco SSU 1A（SP1A；黒色）由来の57残基の葉緑体シグナルペプチド、EPYC1 N末端の切断バージョン（非標識；最も薄い灰色）、EPYC1リピート領域（第1リピート領域：最も薄い灰色、第2リピート領域：灰色、第3リピート領域：灰色、第4リピート領域：黒色）、各リピート領域に予測されるαヘリックス（黒色）、EPYC1 C末端（非標識；最も薄い灰色）、ダブルターミネーターHSP（濃い灰色）およびnos（灰色）が含まれている。カセット2、4、6は、ターミネーターの前に、C末端の緑色蛍光タンパク質タグ（GFP；薄い灰色）も含んでいる。図12Bは、ベクター内のTobiEPYC1遺伝子発現カセットの配置を示しており、互いに向かい合っている。第1カセット（時計回り）は、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV pro）、熱ショックタンパク質（A. thaliana）ターミネーター（HSP term）およびノパリン合成酵素（A. tumefaciens）ターミネーター（Nos term）によって駆動される。第2のカセット（反時計回り）は、35Sプロモーター（35S prom）と、単一のターミネーター-オクトピン合成酵素ターミネーター（OCS term）のみによって駆動される。図12Cは、植物の形質転換に用いたTobiEPYC1::GFP（図12Aのカセット2、図12Bのベクターにおけるカセット2の配置）を有するバイナリーベクター（SEQ ID NO: 168）の地図であり、A. thaliana Rubisco small subunit 1A transit peptide (1AtA-TP)をグレー、TobiEPYC1をライトグレー、35S constitutive promoter (35S pro)とCsVMV constitutive promoter (CsVMV pro)を共に白、6xHAタグをグレー、eGFPをライトグレー、コドン最適化ターボGFP（tGFP）を濃いグレーの点線で示したもの、HSPターミネーター（HSP term）をグレーで示したもの、Nosターミネーター（Nos term）を白で示したもの、OCSターミネーター（OCS term）を白で示したもの、A.tumefaciensの低コピープラスミドの複製を可能にするプラスミドpVS1の複製起点（oriVi）を示したものであり、tumefaciensの低コピープラスミドの複製を可能にするプラスミドpVS1の複製起点（oriV）を最も薄い灰色で、高コピー数のColE1/pMB1/pBR322/pUCの複製起点（ori）を最も薄い灰色で、カナマイシン耐性を付与するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼの発現カセット（KanR）を最も薄い灰色で示し、プラスミドpVS1の安定性タンパク質（pVS1 StaA）を濃いグレーで、プラスミドpVS1の複製タンパク質（pVS1 RepA）を濃いグレーで、pFAST-R選択カセット（E. quadricolor由来のモノメリックタグRFPをコード化したもの）を濃いグレーで示し、quadricolor由来の単量体タグRFPをオレオシン1（OLE1、A. thaliana）のコード配列に融合させたもの（Shimada, et al,Plant J.(2010) 61:519-528-667）であり、オレシン1のプロモーター（Olesin pro）を白で、オレシン1の5'UTR（Olesin 5'UTR）を灰色で、改変されたオレシン1遺伝子（Olesin）を暗灰色の点線で、蛍光タグ（TagRFP）を暗灰色で、オレシン1のターミネーター（Olesin term）を白で示している。T-DNAの植物細胞ゲノムへの組み込みに必要な右境界配列（RB T-DNAリピート）を最も明るいグレーで、T-DNAの植物細胞ゲノムへの組み込みに必要な左境界配列（LB T-DNAリピート）を最も明るいグレーで示している。図12Dは、N. benthamianaにおけるTobiEPYC1::GFPの一過性発現の蛍光顕微鏡画像を示す（左のGFPチャネルは、ゲイン25および2%のレーザーで撮像されたものであり、中央のクロロフィル自家蛍光チャネルは、右のGFPチャネルおよびクロロフィルチャネルのオーバーレイであり、オーバーラップする領域は白で示されている）。図12Eは、N. benthamianaにおけるTobiEPYC1::GFPの一過性の発現の蛍光顕微鏡画像を示す（GFPチャンネル、利得10および1%レーザーで撮像）。図12Fは、A. thaliana S2Cr系統におけるTobiEPYC1::GFPの安定発現の蛍光顕微鏡画像を示す（左にGFPチャネル、中央にクロロフィル自家蛍光チャネル、右にGFPチャネルとクロロフィルチャネルのオーバーレイ、オーバーラップする領域は白で示す）。図12Gは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現しているA. thaliana S 2Crlinesからのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す（左にGFPチャネル、左から2番目にクロロフィル自家蛍光チャネル、右から2番目に明視野画像、右にGFP、クロロフィル、および明視野画像のオーバーレイ、蛍光が重なっている領域は白色で示す）。図12Hは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現しているA. thaliana S 2Crlinesからの別のセットのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す（左にGFPチャネル、中央にクロロフィル自家蛍光チャネル、右にGFPチャネルとクロロフィルチャネルのオーバーレイ）。図12Iは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現しているA. thaliana S 2Crlinesからの別のセットのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示しており、矢印はTobiEPYC1凝集体の領域を示している（左のGFPチャネル、中央のクロロフィル自家蛍光チャネル、右のGFPチャネルとクロロフィルチャネルのオーバーレイ）。図12Jは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現するA. thaliana S2 Cr linesからのプロトプラストの別のセットの蛍光顕微鏡画像を示す（左のGFPチャネル、左から2番目のクロロフィル自家蛍光チャネル、右から2番目の明視野画像、右のGFP、クロロフィル、および明視野画像のオーバーレイ）。図12Kは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現しているA. thaliana植物から最近破裂したプロトプラストからの葉緑体を示しており、破線の矢印は葉緑体の外側にあるEPYC1凝集体を示している（左のGFPチャネル、左から2番目のクロロフィル自家蛍光チャネル、右から2番目の明視野画像、右のGFP、クロロフィル、および明視野画像のオーバーレイ）。図12Lは、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現している野生型A. thalianaからのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像である（左にGFPチャネル、中央にクロロフィル自家蛍光チャネル、右にGFPチャネルとクロロフィルチャネルのオーバーレイ、蛍光が重なっている領域は白で示している）。図12D-12Lについては、スケールバーは10μmであり、画像は代表的な画像である。 図13A-13Eは、フォトブリーチング（FRAP）実験後の蛍光回復の結果を示す図である。図13Aは、A. thaliana S2Cr組織におけるTobiEPYC1::GFP凝集体の2つのサンプル（それぞれ上と下に渡って示されている）における光漂白後の蛍光回復（FRAP）のタイムコースからの画像を示している（スケールバー＝5μm）。左端の画像は漂白前の集合体を示しており、漂白前の画像に重ねた白丸は漂白の対象となった領域を示している。右側の画像は、漂白イベント後の様々な時点での集合体を示しており、漂白後の経過時間が秒単位で表示されている（0.6秒、2.6秒、7.4秒、9秒、16秒、24秒）。図13Bは、信号が分析された円形の関心領域（ROI）を示すオーバーレイを備えた、イメージングのタイムコース（図13Aの0.6秒の時点）からの例示的な画像を示す（漂白された領域は上に丸で囲み、漂白されていない領域は下に丸で囲み、スケールバー＝2.5μm）。図13Cは，図13Bに示したROIのFRAP曲線である。時間経過中のROIからの生の蛍光信号強度（データは、図13Aの上部のデータセットに対応する）が表示され、漂白イベントの時間が黒い縦線で示されている。漂白されたROIからのデータは、灰色で表示されている。漂白されていないROIからのデータは、濃い灰色でプロットされている。図13Dは、図13Bに示したROIのFRAP曲線を、各時点の非漂白信号に正規化した後に示したものである（データは図13Aの一番上のデータセットに対応する）。データは、図13Cのように陰影を付けている。図13Eは、TobiEPYC1を安定的に発現しているA. thaliana S2Cr植物からのタンパク質抽出物をプローブするためのα-EPYC1を用いたウェスタンブロットを示す。左端の3つのレーンのそれぞれは、TobiEPYC1遺伝子発現カセット（図12Aに示す）を発現する異なる植物（TobiEPYC1 1、TobiEPYC1 2、およびTobiEPYC1 3）からのタンパク質抽出物を含み、左から4番目のレーンおよび右のレーンは、A. thaliana S2Cr系統からのタンパク質抽出物を含む。thaliana S2Cr系統のTobiEPYC1を発現していないタンパク質抽出液、右から2番目のレーンには4 repsのTobiEPYC1遺伝子発現カセット（図12Aに示す）を発現する植物からのタンパク質抽出液が含まれている（タンパク質の重量（kDa）は白で重ねて表示、右の灰色の矢印はEPYC1に対応するバンドの位置を示す、黒矢印は非特異的なバンドを示す）。 図14A-14Cは、C. reinhardtii RbcS1と、藻類種Volvox carteriおよびGonium pectorale由来のRubisco SSUとのアミノ酸ア系統メントを示す図である。図14A-14Bは、C. reinhardtii S1Cr（SEQ ID NO:30）とV. carteri由来のRubisco SSU（SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163））とのアライメントを示す。図14Aは、C. reinhardtii RbcS1とV. carteri RubiscoのSSUのN末端部分のアライメントを示す。図14Bは、C. reinhardtii RbcS1のC末端部分とV. carteri Rubisco SSUの位置関係を示す。図14Cは、C. reinhardtii SCr1（SEQ ID NO：30）とG. pectorale SSU（SEQ ID NO：164）のアライメントを示す。 図14A-14Cについて、α-ヘリックスのアライメントは太字で示されている。 図15は、C. reinhardtii EPYC1（SEQ ID NO: 34）と、藻類のV. carteri（SEQ ID NO: 166）、G. pectorale（SEQ ID NO: 167）、Tetrabaena socialis（SEQ ID NO: 168）のEPYC1ホモログとのアミノ酸配列を示しており、α-ヘリックスの配列を太字で示す図である。 図16は、デュアルGFP発現用のバイナリーベクター（EPYC1-dGFP）の模式図である。このベクターは、2つのコンストラクトを反対方向にコードしている。EPYC1はC末端でturboGFP（tGFP、左側）と融合しており、EPYC1はC末端でenhanced GFP（eGFP、右側）と融合している。いずれの場合も、EPYC1はアミノ酸残基27で切断され（下向きの小さな三角形で示す）、N末端には葉緑体のA. thaliana Rubisco small subunit 1A transit peptide (RbcS1A TP)が融合されている。EPYC1-tGFPの発現は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35S prom、左向きの三角形）によって駆動される。EPYC1-eGFPは、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV prom、右向きの三角形）で駆動される。eGFPの発現カセットでは、熱ショックタンパク質ターミネーター（HSP ter）とノパリン合成酵素ターミネーター（nos ter）からなるデュアルターミネーターシステムを用いて発現量を増加させた。tGFPの発現カセットでは、オクトピン合成酵素ターミネーター（ocs ter）を1つ使用した。 図17は、A. thalianaトランスジェニック植物およびコントロールにおけるEPYC1タンパク質レベルを示すイムノブロットである。上の2つのイムノブロットは、抗EPYC1抗体で作られた。下の2つのイムノブロットは、抗アクチン抗体を用いたローディングコントロールである。各列は異なる植物からの可溶性タンパク質抽出物を含む。左側の8つの列はすべて、C. reinhardtii由来のSSUで補完されたA. thaliana 1a3b Rubisco変異体バックグラウンドのトランスジェニック植物からのものである（S2Cr）。右側の2列は、野生型バックグランド（WT）のトランスジェニック植物からのものである。S2Crでは、EPYC1-dGFPを発現する3種類のT2トランスジェニック植物からの抽出物を、Ep1、Ep2、Ep3とラベル付けした列にそれぞれ示した。これらの植物の接合体からの抽出物は、それぞれAz1、Az2、Az3とラベルされた列に示されている。EPYC1::eGFPのみ、またはEPYC1::tGFPのみで形質転換したS2Cr植物からの抽出液を、それぞれeGFP、tGFPとラベルした列に示した。EpWTおよびEpAzとラベルされた列は、それぞれT2 EPYC1-dGFP WT形質転換体およびアジーゴス・セグレガントからの抽出物を示す。EPYC1::eGFP（63.9kDa）、EPYC1::tGFP（55.4kDa）、アクチンの重さと一致するバンドの位置を右端に示した。 図18A-18Lは、EPYC1を発現させたトランスジェニックA. thalianaの葉緑体における凝縮物の形成を示す図である。図18Aは、3つの異なる背景を持つA. thaliana植物におけるEPYC1-dGFPの発現の共焦点顕微鏡画像を示す。1a3b Rubisco変異体にC. reinhardtii Rubiscoスモールサブユニットを補完したもの（S2Cr、中段）、およびA. thaliana Rubiscoスモールサブユニットにピレノイド形成に必要な2つのC. reinhardtiiスモールサブユニットのα-へリックスを含むように改変したものを補完した1a3b Rubisco変異体（1AAtMOD、下段）である。左列の画像は、GFPチャネルを示す。右列の画像は、GFPチャネルとクロロフィル自家蛍光を重ね合わせたものである。スケールバーは10μmを表している。図18Bは、EPYC1-dGFPで形質転換されていない21日目のS2Cr植物（左）と、EPYC1-dGFPを発現している21日目のS2Crトランスジェニック系統（右）の葉緑体の透過型電子顕微鏡画像である。スケールバーは0.5μmを表す。矢印は、右のEPYC1を発現している葉緑体のストロマ内の凝縮物を指している。図18Cは、EPYC1-dGFPを発現するA. thaliana S2Crの葉緑体の共焦点顕微鏡画像の2つのチャンネルを示す。左側の画像はクロロフィルの自家蛍光を示している。右の画像は、GFPチャネルとクロロフィル自家蛍光を重ね合わせたものである。矢印は、1つの葉緑体のクロロフィル自家蛍光にある暗いスポットを指しており、EPYC1-dGFPの集積部位でクロロフィル自家蛍光が減少していることを示している。スケールバーは5μmを表している。図18Dは、EPYC1-dGFPを発現するA. thaliana S2Crの葉緑体内部のEPYC1-dGFP凝縮物の超解像構造化照明顕微鏡（SIM）画像のZ投影図である。画像は、GFPとクロロフィル自家蛍光のチャンネルを重ね合わせたものである。矢印はGFPのシグナルが高い丸い領域を示す。スケールバーは2μmを表す。図18Eは、図18Dに示したのと同じクロロプラストを回転させて奥行き（z）方向を表示した三次元投影図である。この画像は、GFPおよびクロロフィル自家蛍光チャネルのオーバーレイである。破線の矢印は、画像ボリュームの相対的なx、y、z軸を示す。実線の矢印は、GFPのシグナルが高い円形の領域を示す。スケールバーは1μmを表す。図18Fは、EPYC1-dGFPを発現するA. thaliana S2Cr植物の葉緑体のSIM画像（左）における凝縮物のサイズと、C. reinhardtii細胞の透過型電子顕微鏡（TEM）画像におけるピレノイドのサイズ（右）との例示的な比較を示す図である。TEM像のスケールバーは0.5μmを表す。A. thalianaの葉緑体（左）とC. reinhardtiiのピレノイド（右）のGFP発現領域の幅をそれぞれ2μmのラベル付きバーで示している。図18G-18Hは、EPYC1-dGFPを発現させたトランスジェニックA. thaliana S2Crの葉組織の共焦点蛍光顕微鏡画像である。左側のパネルはGFPのチャンネルを示している。中央のパネルはクロロフィルの自家蛍光を示す。右側のパネルは、GFPチャネルとクロロフィルチャネルのオーバーレイを示す。 図18Gは、単一細胞のZスタックの最大投影図であり、すべての葉緑体に凝縮物が見られる。スケールバーは5μmを表している。図18Hは、EPYC1-dGFPの異なる発現レベルを有する（図17に示す）トランスジェニックA.thaliana S2Cr系統Ep1-3の画像を示す。スケールバーは10μmを表している。図18Iは、tGFP（EPYC1::tGFP;上段）またはeGFP（EPYC1::eGFP;下段）にC末端で融合したEPYC1の単一のEPYC1発現カセットを発現するトランスジェニックA.thaliana S2Cr植物における凝縮物の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。左の画像はGFPチャネルを示す。真ん中の画像は、クロロフィルの自家蛍光を示す。右の画像は、GFPとクロロフィルのチャンネルを重ね合わせたものを示す。スケールバーは10μmを示す。図18J-18Lは、C. reinhardtiiのピレノイド（n=55）および3つのEPYC1-dGFPを発現するトランスジェニックA. thaliana S2Crトランスジェニック系統（Ep1-3；n=42）の葉緑体の共焦点画像から得られたデータの散布図である。図18Jは、ピレノイド（C. reinhardtii細胞の場合）または凝縮物（トランスジェニックA. thalianaの場合）の直径をμmで示しており、平均直径は幅広の水平線で表され、平均の標準誤差（SEM）はエラーバーで表されている。図18Kは、凝縮物の体積（μm）を、それぞれの葉緑体の推定体積（μm）に対してプロットしたものであり、Ep1-3のそれぞれからのデータは、異なる陰影でプロットされている。図18Lは、A. thaliana S2Crのトランスジェニック系統Ep1-3（各系統についてn＝27個のクロロプラスト）について、凝縮物によって占められるクロロプラスト体積の推定パーセントをプロットしたものである。幅の広い横棒は各系統の平均値を表し、エラーバーはSEMを表す。 図19A-19Cは、A. thalianaの葉緑体におけるEPYC1-dGFP凝縮体の液-液相分離特性のインプランタ蛍光顕微鏡分析を示す図である。図19Aは、EPYC1-dGFPを発現させた28個のWT（左）、17個のS2Cr（中）、および22個の1AAtMODの葉緑体の断面におけるGFP蛍光強度分布のプロットである。各プロット線は異なる葉緑体からのデータを示す。Y軸には正規化したGFPの蛍光を示す。葉緑体間の正規化された相対距離をx軸に示す。図19B-19Cは、EPYC1-dGFPを発現するS2CrトランスジェニックA. thaliana株における光退色後の蛍光回復（FRAP）アッセイを示す。図19Bは、生きている葉（上）および固定された葉（下）の凝縮物の代表的なFRAP時間経過におけるGFPチャネルからの静止画像を示す。一番左の画像は、漂白イベントの前のGFPの分布を示している。右側の画像は、白化現象後の時間経過に伴うGFPの分布を示している。漂白イベントからの経過時間は画像の上に秒単位で示されている。スケールバーは1μmを表している。図19Cは、13-16個の葉緑体における凝縮物の蛍光回復量をプロットしたものである。y軸は、漂白されていない領域に対する漂白された領域のGFP信号を示しており、その中で、漂白されていない領域からの信号は1と定義されている（破線の水平線）。X軸は経過時間（秒）を示し、漂白イベントの時刻を矢印で示している。薄い灰色で示したデータは生きた組織の凝縮物からのもので、濃い灰色で示したデータは固定された組織からのものである。実線は各データセットの平均値、斜線部分は平均値の標準誤差を示す。 図20A-20Fは、凝縮液中のタンパク質の局在に関する免疫学的および分画学的データを示す図である。図20Aは、全葉組織（入力）、凝縮液抽出・遠心分離後の上清（上清）、不溶性ペレット（ペレット）に対する、抗EPYC1（上段）、抗Rubiscoラージサブユニット（LSU、2段目）、抗Rubiscoスモールサブユニット（SSU、3段目）、抗C. reinhardtii Rubiscoスモールサブユニット2（CrRbcS2、下段）のイムノブロットを示す。抗SSU抗体および抗LSU抗体は、C. reinhardtii Rubiscoよりも高等植物のRubiscoに対する特異性が高いポリクローナルRubisco抗体である。カラムには、EPYC1を発現していないA. thaliana野生型植物（WT）、C. reinhardtii Rubisco small subunitで補完され、EPYC1を発現していないA. thaliana 1a3b Rubisco変異体植物（S2Cr）、およびEPYC1-dGFPを発現しているS2Cr植物（S2Cr_EPYC1）のサンプルが含まれている。WTサンプルについては、入力のみを示した。矢印は、C. reinhardtii Rubisco small subunit 2 (CrRbcS2; 15.5 kD)、A. thaliana Rubisco small subunits 1B、 2B、 3B (AtRbcS1B、 AtRbcS2B、 AtRbcS3B、 それぞれ14.8 kD)、A. thaliana Rubisco small subunit 1A (AtRbcS1A; 14.7 kD)の予想される分子量に一致するバンドを示す。図20Bは、ペレット化されたコンデンセートの組成を示すコーマシー染色SDS-PAGEゲルである。カラムは、図20Aのようにラベル付けされている。矢印は、EPYC1-GFP融合タンパク質（EPYC1：：GFP）の予想される分子量に一致するバンドを示し、EPYC1：：GFPラベルの隣の2つの矢印は、EPYC1の2つのタグ付きバージョン、EPYC1：eGFPおよびEPY1：tGFP；Rubisco大サブユニット（LSU；55kD）；C.reinhardtii Rubisco small subunit 2 (CrRbcS2; 15.5 kD); A. thaliana Rubisco small subunits (AtRbcS)である。図20Cは、EPYC1-GFPで形質転換したS2Cr植物（S2Cr_EPYC1 pellet、上の画像）およびEPYC1-GFPで形質転換していないS2植物（S2Cr pellet、下の画像）のペレットからの凝縮物からのGFPシグナルの蛍光顕微鏡画像である。スケールバーは50μmを表している。図20Dは、ポリクローナル抗ルビスコ（左）または抗CrRbcS2（右）でプローブしたEPYC1-dGFPを発現するS2Cr A. thaliana植物の葉緑体の代表的な免疫金電子顕微鏡（EM）画像である。右の画像では、イムノゴールドで標識した部分を丸で囲んでいる。スケールバーは0.5μmを示す。図20Eは、EPYC1-dGFPを発現しているS2Cr A. thaliana植物の免疫金EM画像において、葉緑体の残りの部分と比較して、凝縮物の内部にあった免疫金粒子の割合の散布図である。データは、ポリクローナル抗ルビスコ抗体（Rubisco抗体）または抗C. reinhardtiiルビスコ小サブユニット2抗体（CrRbcS2抗体）のいずれかでプローブしたときの37-39個の葉緑体のデータである。散布図に重ねた線は、平均値とSEMを表している。図20Fは，EPYC1-dGFPを発現させたトランスジェニックA. thaliana S2Cr植物のメソフィラ細胞の断面における凝縮物を有する葉緑体の代表的なTEM画像である。この断面は、抗ルビスコ抗体を用いた免疫金ラベリング（1つの葉緑体に矢印で示した小さな黒い点）で検査した。スケールバーは1μmを表す。 図21A-21Kは、EPYC1によるルビスコの縮合がトランスジェニックA. thaliana植物の成長と光合成に与える影響を示す図である。図21Aは、EPYC1-dGFPを発現するトランスジェニックA. thaliana植物のWT（黒棒）および各系統の白棒のそれぞれの接合体の新鮮重量（FW（mg））を、200μmol photons m-2 s-1の光で成長させたものである。図21Bは、EPYC1-dGFP WTを発現するトランスジェニックA. thaliana植物（黒棒）および各系統のそれぞれの接合体（白棒）を200μmol photons m-2s-1の光で育てた場合の乾燥重量（DW(mg)）を示す。図21Cは、EPYC1-dGFP WTを発現するトランスジェニックA. thaliana植物（黒棒）および各系統のそれぞれの接合分離体（白棒）を900μmol photons m-2s-1の光で成長させたときの新鮮重量（FW（mg））を示す。図21Dは、EPYC1-dGFP WTを発現するトランスジェニックA. thaliana植物（黒棒）、および各系統のそれぞれの接合分離体（白棒）を900μmol photons m-2s-1の光の中で成長させた場合のミリグラム単位の乾燥重量（DW（mg））を示す。図21A-21Dでは、3つのT2 EPYC1-dGFP S2Crトランスジェニック系統（それぞれEP1、EP2、EP3）、EPYC1-dGFP WT形質転換体（EpWT）、およびそれらのそれぞれの接合分離体のデータを表示している。植物は生育32日後に測定した。棒グラフは各系統の12個以上の植物の平均値、エラーバーはSEMを表す。アスタリスクは、ANOVAによりS2CrバックグラウンドとWTバックグラウンドの間で成長に有意な差（P<0.05）があることを示す。図21E-21Gは、図21A-21Dに重量が表示されているのと同じ8つのS2Crトランスジェニック形質転換体および接合分離体について、ロゼット面積（単位：mm2）を経時的に（発芽後の日数で）プロットしたものである。トランスジェニック系統は、図21A-21Dのようにラベル付けされている。トランスジェニック系統EP1-3の接合分離体は、それぞれAz1-3と表示されている。EpWTの接合分離体はAzWTと表示されている。X軸は発芽後の日数を示す。データポイントは、各系統で12個以上の個体の平均値を示す。エラーバーはSEMを表す。図21E21-Fは、200μmol photons-2 msの-1光の下で成長した植物からのデータを示す。図21Eは、図21Fにプロットしたのと同じデータのオーバーレイを示す。図21Gは、900μmol photons m-2s-1の光の下で成長した植物からのデータを示す。図21Hは、図21A-Gに記載された同じ8つのA. thaliana系統について、μmol CO2 m-2s-1単位の正味CO2同化（A）をプロットしたものである。X軸は、飽和光（1500μmol photons m-2s-1）下での細胞間CO2濃度（Ci）を示す。植物の系統は、図21Cのようにラベル付けされている。データポイントおよびエラーバーは、10個以上の個々のロゼットから個々の葉で行われた測定の、それぞれ平均およびSEMを示す。図21I-21Kは、図21A-21Dに含まれる同じ8つのA. thaliana系統からのガス交換データから得られた光合成パラメータを示す。植物の系統は、図21A21-Bと同様にラベル付けされている。プロットは、15-24個のロゼット全体で行った測定の平均値とSEMを表示している。アスタリスクは、ANOVAによって決定された有意差（P＜0.05）を示す。図21Iは、周囲の細胞外濃度のCO2において、ルビスコ部位のμmolで正規化した1秒当たりのμmol CO2 の純CO2同化率（A Rubisco）のプロットである。図21Jは、ルビスコのカルボキシル化の最大速度（Vcmax）をμmol CO2 m-2 s-1の単位でプロットしたものである。図21Kは、最大電子輸送速度（Jmax）をμmol電子（e-）m-2s-1でプロットしたものである。
以下の説明では、例示的な方法、パラメータなどを示す。しかし、このような説明は、本開示の範囲を限定するものではなく、例示的な実施形態の説明として提供されるものであることを認識すべきである。
遺伝子組み換え植物
本開示の一態様は、改変されたRubiscoとEssential Pyrenoid Component 1（EPYC1）ポリペプチドの集合体を形成するための改変されたRubiscoを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部を含む。変性ルビスコとEPYC1の会合体は、変性ルビスコとEPYC1の縮合体とも呼ばれることがある。この局面の追加の実施形態は、改変されたRubiscoが、藻類Rubiscoスモールサブユニット（SSU）ポリペプチド、または高等植物Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類Rubisco SSUポリペプチドの少なくとも一部で置き換えられている改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドであることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらなる実施形態では、遺伝子改変された高等植物またはその一部は、EPYC1ポリペプチドおよびその集合体をさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、凝集体が、共焦点顕微鏡検査、透過型電子顕微鏡検査（TEM）、低温電子顕微鏡検査（cryo-EM）、液液相分離アッセイ、または相分離アッセイによって検出可能であることを含む。この態様のさらに別の実施形態は、凝集体が、クロロフィル自家蛍光をアッセイし、凝集体が存在するときのクロロフィル自家蛍光の変位を観察することによって検出可能であることを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる好ましい実施形態は、凝集体がin vivoで共焦点顕微鏡により検出可能であることを含む。 この局面のさらなる実施形態は、凝集体が内部混合を受けることを含む。この局面の追加の実施形態は、凝集体が葉緑体のチラコイド膜を変位させることを含む。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、内因性ルビスコSSUポリペプチドを含む改変された高等植物ルビスコポリペプチドを含む。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態では、改変された高等植物ルビスコSSUポリペプチドは、1つまたは複数の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つまたは複数の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換することによって改変された。1つまたは複数の高等植物Rubisco SSU β-strandsを1つまたは複数の藻類Rubisco SSU β-strandsで置換すること、および／または、高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することによって、Rubisco SSUポリペプチドを改変する。この局面の追加の実施形態は、高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、2つの高等植物Rubisco SSU α-ヘリックスを2つの藻類Rubisco SSU α-ヘリックスで置換することによって改変されることを含む。この態様のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：1のアミノ酸23-35およびアミノ酸80-93に対応する2つの高等植物Rubisco SSU αヘリックスと、SEQ ID NO：2のアミノ酸23-35およびアミノ酸86-99に対応する2つの藻類Rubisco SSU αヘリックスを含む。さらに、2つの高等植物Rubisco SSU α-ヘリックスが2つの藻類Rubisco SSU α-ヘリックスで置換されており、高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、4つの高等植物Rubisco SSU β-ストランドを4つの藻類Rubisco SSU β-ストランドで置換することによって、および高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することによって、さらに修飾されている、先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の別の実施形態である。この局面の追加の実施形態は、SEQ ID NO.1のアミノ酸39-45、アミノ酸68-70、アミノ酸98-105、およびアミノ酸110-118に対応する4つの高等植物Rubisco SSU β-ストランドを含む。SEQ ID NO:1のアミノ酸39-45、アミノ酸74-76、アミノ酸104-111、およびアミノ酸116-124に対応する4つの藻類Rubisco SSU β-strands、SEQ ID NO:1のアミノ酸46-67に対応する高等植物Rubisco SSU βA-βBループ、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸46-73に対応する藻類Rubisco SSU βA-βBループを含む。
改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するSEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、またはSEQ ID NO:156を有する高等植物ルビスコSSUポリペプチドを含む。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性を有する藻類ルビスコSSUポリペプチドを含む。少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するSEQ ID NO:2、SEQ30, ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164に対する配列同一性である。この局面の追加の実施形態では、藻類Rubisco SSUポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164である。改変された高等植物ルビスコを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらなる実施形態は、改変された高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、改変されていない高等植物ルビスコSSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性の増加または変更を有することを含む。
本開示の追加の態様は、改変されたルビスコとEPYC1のポリペプチドの集合体を形成するための、EPYC1ポリペプチドを含む遺伝子改変高等植物またはその一部を含む。修飾されたルビスコとEPYC1の集合体は、修飾されたルビスコとEPYC1の凝縮物とも呼ばれることがある。先行する局面のいずれかのさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが藻類のEPYC1ポリペプチドであることを含む。この側面の追加の実施形態は、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するSEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、またはSEQ ID NO:167を有するアミノ酸配列を有する藻類EPYC1ポリペプチドを含む。この局面のさらに別の実施形態では、藻類EPYC1ポリペプチドは、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、またはSEQ ID NO:167である。この局面の追加の実施形態は、EPYC1がSEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟型または切断型であることを含む。この態様のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：34に対応するEPYC1の完全長形態が、残基26（V）と27（A）の間で切断されて、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟したネイティブ形態を形成することを含む。先行するいずれかの態様のさらに別の実施形態は、EPYC1ポリペプチドが修飾EPYC1ポリペプチドであることを含む。この側面のさらなる実施形態は、修飾されたEPYC1ポリペプチドが、第1藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、または8つのタンデムコピーを含むことを含む。この局面の追加の実施形態は、第1藻類EPYC1反復領域の4つのタンデムコピーまたは8つのタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む。第1の藻類EPYC1反復領域のタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第1の藻類EPYC1反復領域が、SEQ ID NO.36に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1の藻類EPYC1反復領域がSEQ ID NO：36であることを含む。 修飾されたEPYC1を含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態は、修飾されたEPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現されること、および／またはC末端キャップを含むことを含む。この局面のさらに別の実施形態は、ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO:42に対する、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドと、SEQ ID NO.41に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性を有するポリペプチドを含むC末端キャップとを有する。この局面のさらなる実施形態は、C末端キャップがSEQ ID NO：41であることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、修飾EPYC1を含む先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよく、修飾EPYC1ポリペプチドが、対応する非修飾EPYC1ポリペプチドと比較してRubisco SSUポリペプチドに対する増加した親和性を有することを含む。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、凝集体は、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在する。凝集体は、凝縮物とも呼ばれることがある。この局面のさらなる実施形態は、植物細胞が葉のメソフィル細胞であることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、植物は、ササゲ（例えば、黒目豆、ネコジャラシ、ヤドカリ、Vigna unguiculata）、大豆（例えば、大豆、ソイビーン、Glycine max、Glycine soja）、キャッサバ（例えば、マニオック、ユッカ、Manihot esculenta）、米（例えば、インディカ米、ジャポニカ米、芳香米、もち米、Oryza sativa、Oryza glaberrima）、小麦（例えば、普通の小麦、普通の小麦、スペルト、デュラム、エインコーン、エマー、カムート、Triticum aestivum、Triticum spelta、Triticum durum、Triticum urartu、Triticum monococcum、Triticum turanicum、Triticum spp.）、大麦（例えば、Hordeum vulgare）、ライ麦（例えば、Secale cereale）、オート麦（例えば、Avena sativa）、トマト（例えば、Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（例えば、ラセットポテト、イエローポテト、レッドポテト、Solanum tuberosum）、カノーラ（例えば、Brassica rapa、Brassica napus、Brassica juncea）、または他のC3作物植物のグループから選択される。いくつかの実施形態では、植物は、タバコ（すなわち、Nicotiana tabacum、Nicotiana edwardsonii、Nicotiana plumbagnifolia、Nicotiana longiflora、Nicotiana benthamiana）またはシロイヌナズナ（すなわち、rockcress、thale cress、Arabidopsis thaliana）である。
本開示のさらなる態様は、EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、改変されたルビスコをコードする第2の核酸配列とを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部を含む。この局面の追加の実施形態は、EPYC1が、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟型または切断型であることを含む。この局面のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：34に対応するEPYC1の完全長形態が、残基26（V）と27（A）の間で切断されて、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟したネイティブ形態を形成することを含む。この局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が、2つの別々の発現カセットを含むバイナリーベクターで導入され、各発現カセットが第1の核酸配列を含むことを含む。この局面の追加の実施形態は、第1の核酸配列が第1のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択されることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、第1のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、およびA.thaliana UBQ10プロモーターのグループから選択される構成的プロモーターであることを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていないことを含む。この態様の追加の実施形態は、葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO.63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：63であることを含む。ネイティブEPYC1リーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、ネイティブEPYC1リーダー配列は、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60-137に対応する。 先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第1の核酸配列は、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結される。この局面のさらなる実施形態は、1つ2つのターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせのグループから選択されることを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態では、第2のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この局面の追加の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA.thaliana UBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列は藻類ルビスコSSUポリペプチドをコードする。この局面の追加の実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物細胞で機能する葉緑体トランジットペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列は、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードせず、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていない。この態様のさらなる実施形態では、葉緑体移行ペプチドは、SEQ ID NO.64に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体通過ペプチドはSEQ ID NO：64である。ネイティブ藻類SSUリーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、ネイティブ藻類SSUリーダー配列は、SEQ ID NO：32のアミノ酸1-45に対応する。ネイティブ藻類SSUリーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、ネイティブ藻類SSUリーダー配列は、SEQ ID NO：31のアミノ酸1-45に対応する。 第2のプロモーターに作動可能に連結されている第2の核酸配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列は、ターミネーターに作動可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、またはアクチンスターミネーターの群から選択される。第2の核酸配列が第2のプロモーターに作動可能に連結されている先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換されている修飾高等植物ルビスコSSUポリペプチドをコードする。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この局面のさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのEPYC1ポリペプチドであることを含む。この局面の追加の実施形態は、EPYC1が、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟型または切断型であることを含む。この局面のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：34に対応するEPYC1の完全長形態が、残基26（V）と27（A）の間で切断されて、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟したネイティブ形態を形成することを含む。この局面の追加の実施形態は、ルビスコSSUポリペプチドが、先行する実施形態のいずれか1つに記載のルビスコSSUポリペプチドであることを含む。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態は、植物またはその一部の少なくとも1つの細胞が、ルビスコポリペプチドおよびEPYC1ポリペプチドの集合体を含むことを含む。この局面のさらなる実施形態は、凝集体が、少なくとも1つの植物細胞の少なくとも1つの葉緑体のストロマに局在することを含む。この態様のさらなる実施形態は、植物細胞が葉のメソフィル細胞であることを含む。ルビスコポリペプチドおよびEPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物またはその一部を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいこの局面のさらに別の実施形態では、凝集体は、共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、または液液相分離アッセイによって検出可能である。この態様のさらに別の実施形態は、凝集体が、クロロフィル自家蛍光をアッセイし、凝集体が存在するときのクロロフィル自家蛍光の変位を観察することによって検出可能であることを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる好ましい実施形態は、凝集体がin vivoで共焦点顕微鏡により検出可能であることを含む。 この局面のさらなる実施形態は、凝集体が内部混合を受けることを含む。この局面の追加の実施形態は、凝集体が葉緑体のチラコイド膜を変位させることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、植物は、ササゲ（例えば、黒目豆、ネコジャラシ、ヤドカリ、Vigna unguiculata）、大豆（例えば、大豆、ソイビーン、Glycine max、Glycine soja）、キャッサバ（例えば、マニオック、ユッカ、Manihot esculenta）、米（例えば、インディカ米、ジャポニカ米、芳香米、もち米、Oryza sativa、Oryza glaberrima）、小麦（例えば、普通の小麦、スペルト、デュラム、エインコーン、エマー、カムート、Triticum aestivum、Triticum spelta、Triticum durum、Triticum urartu、Triticum monococcum、Triticum turanicum、Triticum spp.）、大麦（例えば、Hordeum vulgare）、ライ麦（例えば、Secale cereale）、オート麦（例えば、Avena sativa）、トマト（例えば、Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（例えば、ラセットポテト、イエローポテト、レッドポテト、Solanum tuberosum）、カノーラ（例えば、Brassica rapa、Brassica napus、Brassica juncea）、または他のC3作物植物の群から選択される。いくつかの実施形態では、植物は、タバコ（すなわち、Nicotiana tabacum、Nicotiana edwardsonii、Nicotiana plumbagnifolia、Nicotiana longiflora、Nicotiana benthamiana）、またはシロイヌナズナ（すなわち、rockcress、thale cress、Arabidopsis thaliana）である。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態は、先行する実施形態のいずれか1つの植物または植物の一部から生成された遺伝子改変高等植物細胞を含む。植物部分に関して先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、植物部分が、葉、茎、根、塊茎、花、種子、穀粒、果実、細胞、またはそれらの一部であり、遺伝子改変された植物部分が、1つ以上の遺伝子改変を含むことを含む。この局面のさらなる実施形態は、植物部分が、果実、塊茎、穀粒、または穀物であることを含む。花粉粒または卵巣に関して先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、先行するいずれかの実施形態の植物の遺伝子改変された花粉粒または遺伝子改変された卵巣を含み、遺伝子改変された花粉粒または遺伝子改変された卵巣は、1つ以上の遺伝子改変体を含むものである。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態は、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変された植物から産生された遺伝子改変されたプロトプラストを含み、遺伝子改変されたプロトプラストは、1つ以上の遺伝子改変体を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態は、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変された植物からのプロトプラストまたは細胞から産生される遺伝子改変された組織培養物を含み、細胞またはプロトプラストは、葉のグループから選択される植物の部分から産生される。葉の葉肉細胞、葯、雌しべ、茎、葉柄、根、根端、塊茎、果実、種子、穀粒、花、子葉、胚、または分裂細胞のグループから選択された植物の部分から細胞またはプロトプラストが生成され、遺伝子改変組織培養物が1つまたは複数の遺伝子改変を含む。この局面の追加の実施形態は、1つ以上の遺伝子改変体を含む遺伝子改変組織培養物から再生された遺伝子改変植物を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、先行する実施形態のいずれか1つの遺伝子改変された植物から生産された遺伝子改変された植物の種子を含む。
遺伝子組換え植物の生産・栽培方法
本開示の別の態様は、a）EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入すること、b）植物細胞、組織、または他の摘出物を遺伝子改変された植物体に再生すること、およびc）遺伝子改変された植物体を、EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸を有する遺伝子改変された植物体に成長させることを含む、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変された高等植物を製造する方法を含む。この局面の追加の実施形態は、EPYC1が、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟型または切断型であることを含む。この局面のさらなる実施形態は、SEQ ID NO：34に対応するEPYC1の完全長形態が、残基26（V）と27（A）の間で切断されて、SEQ ID NO：35に対応するEPYC1の成熟したネイティブ形態を形成することを含む。この態様の追加の実施形態は、ステップ（a）の前に、またはステップ（a）と同時に、修飾Rubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を植物細胞、組織、または他の摘出物に導入することをさらに含み、ステップ（c）の遺伝子改変植物は、修飾Rubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸をさらに含む。この態様の追加の実施形態は、ステップ（b）の前に植物細胞、組織、または他の摘出物をスクリーニングまたは選択すること、ステップ（b）と（c）の間に植物体をスクリーニングまたは選択すること、またはステップ（c）の後に植物をスクリーニングまたは選択することによって、第1の核酸配列および任意に第2の核酸配列の導入の成功を識別することをさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよい、この局面のさらに別の実施形態では、粒子ボンバードメント（すなわち、バイオリスティック、ジーンガン）、アグロバクテリウム媒介形質転換、リゾビウム媒介形質転換、またはプロトプラストトランスフェクションもしくは形質転換の群から選択される形質転換法を用いて形質転換が行われる。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が第1のベクターで導入され、第2の核酸配列が第2のベクターで導入されることを含む。この局面の追加の実施形態は、第1の核酸配列が、2つの別々の発現カセットを含むバイナリーベクターで導入され、各発現カセットが第1の核酸配列を含むことを含む。この局面のさらなる実施形態では、第1の核酸配列は、第1のプロモーターに動作可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、第1のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、または葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この局面のさらに別の実施形態では、第1プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA. thaliana UBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、第1の核酸配列は、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、第1の核酸配列は、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていないことを特徴とする。この局面のさらに別の実施形態では、葉緑体トランジットペプチドは、SEQ ID NO.63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この局面のさらに別の実施形態では、内因性の葉緑体移行ペプチドはSEQ ID NO：63である。ネイティブEPYC1リーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、SEQ ID NO：65のヌクレオチド60-137に対応するネイティブEPYC1リーダー配列を含む。 先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、第1の核酸配列は、1つまたは2つのターミネーターに動作可能に連結されている。この局面の追加の実施形態では、1つまたは2つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンスターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせのグループから選択される。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態は、第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第2のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、および葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択されることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、第2のプロモーターが、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、またはA.thaliana UBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターであることを含む。第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、藻類SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含む。この局面の追加の実施形態は、第2の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、第2の核酸配列が、ネイティブSSUリーダー配列をコードしておらず、ネイティブSSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていないことを含む。この態様のさらなる実施形態は、葉緑体通過ペプチドが、SEQ ID NO.64に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：64であることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、ネイティブSSUリーダー配列を有するこの局面の追加の実施形態には、SEQ ID NO：32のアミノ酸1-45に対応するネイティブSSUリーダー配列が含まれる。ネイティブ藻類SSUリーダー配列を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、ネイティブ藻類SSUリーダー配列は、SEQ ID NO：31のアミノ酸1-45に対応する。 第2の核酸配列が第2のプロモーターに動作可能に連結されている先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、第2の核酸配列がターミネーターに動作可能に連結されていることを含む。この局面のさらなる実施形態では、ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、またはアクチンスターミネーターの群から選択されることを含む。第2の核酸配列が第2のプロモーターに作動可能に連結されている先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態では、第2の核酸配列は、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換されている修飾高等植物ルビスコSSUポリペプチドをコードする。
第2のベクターを有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面の追加の実施形態では、第2のベクターは、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結された核ゲノム配列を標的とする1つ以上の遺伝子編集コンポーネントを含む。この局面のさらなる実施形態は、1つ以上の遺伝子編集コンポーネントが、核ゲノム配列を標的とするリボヌクレオタンパク質複合体；TALENタンパク質コード化配列を含むベクターであって、TALENタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、ZFNタンパク質のコード化配列を含むベクターであって、ZFNタンパク質が核ゲノム配列を標的とするベクター、オリゴヌクレオチドドナー（ODN）であって、ODNが核ゲノム配列を標的とするベクター、またはCRISPR/Cas酵素のコード化配列とターゲティング配列を含むベクターであって、ターゲティング配列が核ゲノム配列を標的とするベクター。の群から選択されることを含む。遺伝子編集を有する先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、遺伝子編集の結果が、高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部と置換されていることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この局面のさらなる実施形態は、EPYC1ポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのEPYC1ポリペプチドであることを含む。この局面の追加の実施形態は、ルビスコSSUポリペプチドが先行する実施形態のいずれか1つのルビスコSSUポリペプチドであることを含む。
高等植物細胞で機能する葉緑体移行ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されている第1の核酸配列を有し、第1の核酸配列がネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない、先行するいずれかの実施形態と組み合わせることができるこの局面のさらに別の実施形態は、第1の核酸配列が1つまたは2つのターミネーターに作動可能に連結されていることを含みネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない第1の核酸配列を含み、かつ、第1の核酸配列が1つまたは2つのターミネーターに作動可能に連結されている第1の核酸配列の第1のコピーを含む第1のベクターであって、第1の核酸配列がネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、かつ、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されていない第1のベクターとを含み、前記第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が第1のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が1つのターミネーターに作動可能に連結され、および、第1のベクターが、第1の核酸配列の第2のコピーをさらに含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、第3のプロモーターに動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、2つのターミネーターに動作可能に連結されている。この局面のさらなる実施形態は、第1のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、またはメソフィル細胞特異的プロモーターの群から選択されること、第3のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、またはメソフィル細胞特異的プロモーターの群から選択されること、および、第1および第3のプロモーターが同一ではないことを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体トランジットペプチドが、SEQ ID NO.63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するを有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、SEQ ID NO: 65のヌクレオチド60から137に対応するネイティブEPYC1リーダー配列を含む。この局面のさらなる実施形態は、ターミネーターが、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンスターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、またはそれらの任意の組み合わせのグループから選択されることを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの局面のさらなる実施形態は、先行する実施形態のいずれか1つの方法によって生産された植物または植物の一部を含む。
本開示のさらなる態様は、遺伝的に改変された植物を有する先行する実施形態のいずれかの遺伝的に改変された植物を栽培する方法であって、a) 遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物体、遺伝子改変された挿し木、遺伝子改変された塊茎、遺伝子改変された根、または遺伝子改変された種子を土壌に植えて、遺伝子改変された植物を生産するか、または遺伝子改変された苗、遺伝子改変された小植物体、または遺伝子改変された挿し木を、土壌で栽培された根株または第2の植物に接ぎ木して、遺伝子改変された植物を生産するステップ、b) 植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な挿し木、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を生産するステップと収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切り口、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、および／または収穫可能な穀物を収穫することと、c）収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切り口、収穫可能な木、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、および／または収穫可能な穀物を収穫するステップを含む。この局面の追加の実施形態は、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変植物の植物成長率および／または光合成効率が、WT植物の植物成長率および／または光合成効率と同等であることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変植物の植物成長率および／または光合成効率が、WT植物の植物成長率および／または光合成効率と比較して改善されていることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、先行する実施形態のいずれかの遺伝子改変植物の収量が、WT植物の収量と比較して改善されることを含む。この態様のさらなる実施形態は、収量が、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも100％改善されることを含む。
遺伝子組換え植物や植物細胞を作る分子生物学的手法
本発明の一実施形態は、改変されたルビスコおよびEPYC1ポリペプチドの凝集体または凝縮体の形成のために、改変されたルビスコおよびEssential Pyrenoid Component 1（EPYC1）を含む遺伝子改変された植物または植物細胞を提供するものである。例えば、本開示は、EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、修飾ルビスコをコードする第2の核酸配列とを有する植物を提供する。さらに、本開示は、藻類のEPYC1ポリペプチド、改変されたEPYC1ポリペプチド、藻類のRubiscoスモールサブユニット（SSU）ポリペプチド、および改変されたRubisco SSUポリペプチドを有する植物を提供する。
本発明のある態様は、C.reinhardtiiタンパク質EPYC1（C.reinhardtii EPYC1ゲノム配列＝SEQ ID NO：66、C.reinhardtii EPYC1転写配列＝SEQ ID NO：65、C.reinhardtii EPYC1全長タンパク質＝SEQ ID NO：34、C.reinhardtii成熟EPYC1タンパク質＝SEQ ID NO：35）に関するものである。EPYC1は、類似性の高い4つの繰り返し領域と、それを挟む短い末端領域からなるモジュール型のタンパク質である（図1A-1B）。4つの類似した繰り返し領域のそれぞれは、予測される無秩序なドメインと、予測されるαヘリックスを含む、より短い無秩序でないドメインから構成されている。本発明のさらなる態様は、EPYC1のホモログまたはオルソログに関するものである。いくつかの実施形態では、EPYC1のホモログまたはオルソログは、C. reinhardtii EPYC1と構造的に類似している。図15に示すように、他の3つの近縁の藻類種、すなわち、Volvox carteri、Gonium pectorale、およびTetrabaena socialisは、C. reinhardtii EPYC1と同様に、予測されるα-ヘリックス領域を含む同じリピート領域を有する、C. reinhardtii EPYC1に相同なタンパク質（SEQ ID NO: 166 (V. carteri)、 SEQ ID NO: 167 (G. pectorale)、 SEQ ID NO: 165 (T. socialis)）を有する。
C. reinhardtiiのEPYC1のN末端には、SEQ ID NO: 34のアミノ酸26にある切断部位（図1Bの黒矢印で示す）により、SEQ ID NO: 35の成熟EPYC1タンパク質のN末端が切断されている。好ましくは、高等植物におけるEPYC1の発現は、産生されるEPYC1タンパク質が切断されたN-末端を有するようなコード配列を使用する。この態様の追加の実施形態には、切断されたN-末端（即ち、成熟したEPYC1タンパク質のN-末端）が、SEQ ID NO.40に対する、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この態様のさらなる実施形態は、切断されたN末端（すなわち、成熟EPYC1タンパク質のN末端）がSEQ ID NO：40であることを含む。
本発明の修飾EPYC1ポリペプチドは、第1のEPYC1反復領域のタンデムコピーを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1藻類EPYC1反復領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、または8つのタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む。この局面の追加の実施形態は、第一藻類EPYC1反復領域の4つのタンデムコピーまたは8つのタンデムコピーを含む修飾EPYC1ポリペプチドを含む。例示的な修飾EPYC1配列を図5Aに示す。この局面のいくつかの実施形態は、第1藻類EPYC1反復領域が、SEQ ID NO.36に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらなる実施形態は、第1の藻類EPYC1反復領域がSEQ ID NO：36であることを含む。 この局面のさらに別の実施形態は、修飾EPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現され、および／またはC末端キャップを含むことを含む。この態様のさらに別の実施形態は、ネイティブEPYC1リーダー配列が、SEQ ID NO.42に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含み、C末端キャップが、SEQ ID NO.41に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを示している。この局面のさらに別の実施形態は、C末端キャップがSEQ ID NO：41であることを含む。この態様のさらなる実施形態は、ネイティブなEPYC1リーダー配列の代わりに、切断されたN末端（すなわち、成熟したEPYC1タンパク質のN末端）が使用されることを含む。この局面の追加の実施形態は、切断されたN-末端（すなわち、成熟EPYC1タンパク質のN末端）が、SEQ ID NO.40に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることが含まれる。この態様のさらなる実施形態は、切断されたN末端（すなわち、成熟EPYC1タンパク質のN末端）がSEQ ID NO：40であることを含む。ネイティブEPYC1リーダー配列を含まない、切断されたN末端（すなわち、成熟したEPYC1タンパク質のN末端）を有する、およびC末端キャップを有する修飾EPYC1配列を含む例示的な遺伝子発現カセットを、図12A-12Bに示す。
高等植物におけるEPYC1の正しいターゲティングのために、高等植物の葉緑体ターゲティング配列がEPYC1配列に結合される。いくつかの実施形態では、この葉緑体ターゲティング配列は、1AAt葉緑体トランジットペプチドである。さらなる実施形態では、この葉緑体ターゲティング配列は、1BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 18）、2BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 19）、または3BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 20）である。追加の実施形態では、葉緑体ターゲティング配列は、クロロフィルa／b結合タンパク質、ルビスコアクチナーゼ、フェレドキシン、またはデンプン合成酵素タンパク質から得られる。追加の実施形態では、葉緑体移行配列は、切断された葉緑体移行配列（例えば、1AAt葉緑体移行ペプチドの55残基）である。この局面のさらなる実施形態は、葉緑体移行ペプチドが、SEQ ID NO.64に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：64であることを含む。EPYC1配列（成熟EPYC1および改変EPYC1）に付着した55残基1AAtクロロプラスティックトランジットペプチドを含む例示的な遺伝子発現カセットを図12A-12Bに示す。当技術分野で知られている手段を用いて、EPYC1ターゲティングへの適合性について葉緑体ターゲティング配列を試験し、葉緑体ターゲティング配列の長さを最適化することができる（例えば、Shen, et al.、Sci. Rep. (2017): 46231）。
本発明の追加の態様は、藻類Rubisco SSUタンパク質に関するものである。いくつかの実施形態では、藻類Rubisco SSUタンパク質は、C.reinhardtii Rubisco SSUタンパク質、S1Cr（SEQ ID NO：30）またはS 2Cr（SEQ ID NO：2）である（図1Dおよび3D）。本発明のさらなる態様は、C. reinhardtii Rubisco SSUの藻類のホモログまたはオルソログに関するものである。この局面の追加の実施形態では、藻類Rubisco SSUタンパク質は、V.carteriまたはG.pectorale Rubisco SSUタンパク質である（図14A-14C、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、およびSEQ ID NO:164）。この側面の別の実施形態では、藻類のホモログまたはオルソログであるC.reinhardtii Rubisco SSUの藻類ホモログまたはオルソログは、アミノ酸配列が、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％が、SEQ ID NO:30またはSEQ ID NO:2と同一である。本発明のさらなる態様は、藻類Rubisco SSUリーダー配列を持たない藻類Rubisco SSUタンパク質に関するものである。この局面のいくつかの実施形態では、藻類Rubisco SSUリーダー配列は、SEQ ID NO:29と少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％，、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも75％，少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。この局面のさらなる実施形態では、藻類Rubisco SSUリーダー配列はSEQ ID NO: 29である。
本発明の改変されたルビスコSSUは、1つ以上の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つ以上の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換し、1つ以上の高等植物ルビスコSSUβ-ストランドを1つ以上の藻類ルビスコSSUβ-ストランドで置換し、および／または、高等植物ルビスコSSUβA-βBループを藻類ルビスコSSUβA-βBループで置換することによって改変された高等植物ルビスコSSUを含む。いくつかの実施形態では、高等植物Rubisco SSUポリペプチドは、2つの高等植物Rubisco SSUα-ヘリックスを2つの藻類Rubisco SSUα-ヘリックスで置換することによって改変される。追加の実施形態では、高等植物Rubisco SSUポリペプチドは、4つの高等植物Rubisco SSU β-strandsを4つの藻類Rubisco SSU β-strandsで置換することにより、また、高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することにより、さらに修飾される。本発明の高等植物Rubisco SSUポリペプチドには、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、またはSEQ ID NO:156と同一の少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。本発明のAlgal Rubisco SSUポリペプチドには、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164に対する少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。この局面の追加の実施形態では、藻類Rubisco SSUポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、またはSEQ ID NO：164である。この態様のさらなる実施形態には、SEQ ID NO：1のアミノ酸23-35（すなわち、SEQ ID NO：3）およびアミノ酸80-93（すなわち、SEQ ID NO：4）に対応する2つの高等植物Rubisco SSU αヘリックスと、SEQ ID NO：10のアミノ酸23-35（すなわち、SEQ ID NO：10）およびアミノ酸86-99（すなわち、SEQ ID NO：12）に対応する2つの藻類Rubisco SSU αヘリックスが含まれる。2つの高等植物Rubisco SSU α-ヘリックスが2つの藻類Rubisco SSU α-ヘリックスで置換されており、高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、4つの高等植物Rubisco SSU β-ストランドを4つの藻類Rubisco SSU β-ストランドで置換することによって、および高等植物Rubisco SSU βA-βBループを藻類Rubisco SSU βA-βBループで置換することによって、さらに修飾されている、先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができる、この局面のさらに別の実施形態である。この態様の追加の実施形態には、SEQ ID NO: 1のアミノ酸39-45（すなわち、SEQ ID NO：5）、アミノ酸68-70（すなわち、SEQ ID NO：6）、アミノ酸98-105（すなわち、SEQ ID NO: 7）、アミノ酸110-118（すなわち、SEQ ID NO: 8）、アミノ酸39-45（すなわち、SEQ ID NO: 11）に対応する4つの藻類Rubisco SSUのβストランド、アミノ酸74-76（すなわちSEQ ID NO: 2のアミノ酸39-45（すなわち、SEQ ID NO: 11）、アミノ酸74-76（すなわち、SEQ ID NO: 6）、アミノ酸104-111（すなわち、SEQ ID NO: 13）、およびアミノ酸116-124（すなわち、SEQ ID NO: 14）に対応する高等植物Rubisco SSU βA-βBループ、アミノ酸46-67（すなわち、SEQ ID NO: 9）に対応する高等植物Rubisco SSU βA-βBループが含まれる。さらなる実施形態では、藻類Rubisco SSU βA-βBループは、SEQ ID NO：1のアミノ酸46-73（すなわち、SEQ ID NO：15）に対応している。
高等植物の葉緑体ターゲティング配列が、藻類のRubisco SSUまたは改変Rubisco SSUに結合されている。いくつかの実施形態では、この葉緑体ターゲティング配列は、1AAt葉緑体トランジットペプチドである。さらなる実施形態では、この葉緑体ターゲティング配列は、1BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 18）、2BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 19）、または3BAt葉緑体トランジットペプチド（SEQ ID NO: 20）である。追加の実施形態では、葉緑体ターゲティング配列は、クロロフィルa／b結合タンパク質、ルビスコアクチナーゼ、フェレドキシン、またはデンプン合成酵素タンパク質から得られる。追加の実施形態では、葉緑体移行配列は、切断された葉緑体移行配列（例えば、1AAt葉緑体移行ペプチドの57残基）である。この局面のさらなる実施形態は、葉緑体移行ペプチドが、SEQ ID NO.63に対して、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであることを含む。この局面のさらに別の実施形態は、葉緑体通過ペプチドがSEQ ID NO：63であることを含む。SSU配列に付着した57残基の1AAtクロロプラスティックトランジットペプチドを含む例示的な配列（1AAt-TPを有するS2Cr（SEQ ID NO：22）および1AAt-TPを有する1AatMOD（SEQ ID NO：33））は、図3Bに示されている。 当技術分野で知られている手段は、改変されたRubiscoのSSUターゲティングへの適合性についてクロロプラストターゲティング配列を試験し、クロロプラストターゲティング配列の長さを最適化するために使用することができる（例えば、Shen、他、Sci.Rep.（2017）：46231）。
遺伝的に改変された単子葉植物および双子葉植物の細胞を形質転換して生成することは、当技術分野でよく知られている。例えば、Weising, et al., Ann.Rev. Genet.22:421-477(1988)、米国特許5,679,558、Agrobacterium Protocols, ed:Gartland, Humana Press Inc.(1995)、およびWang, et al. Acta Hort.461:401-408 (1998)を参照されたい。方法の選択は、形質転換されるべき植物の種類、特定の用途および／または所望の結果によって異なる。適切な形質転換技術は、当業者であれば容易に選択することができる。
本明細書に記載されている発明を実施する際には、細胞DNA（例えば、ゲノムDNAおよびオルガネラDNA）を削除、挿入、またはその他の方法で改変するための当技術分野で知られている任意の方法論を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの、標的遺伝子の欠失または挿入のための遺伝子構築物を含む、武装解除されたTiプラスミドを使用して、植物細胞を形質転換することができ、その後、例えば、EP 0116718、EP 0270822、PCT公開WO 84/02913および公開欧州特許出願（「EP」）0242246に記載されている手順を使用して、形質転換された植物細胞から形質転換された植物を再生することができる。Ti-プラスミドベクターはそれぞれ、Ti-プラスミドのT-DNAのボーダー配列の間、または少なくとも右のボーダー配列の左側に位置する遺伝子を含む。もちろん、植物細胞を形質転換するために、他のタイプのベクターを使用することができ、そのような手順としては、直接遺伝子導入（例えば、EP 0233247に記載されている）、花粉媒介形質転換（例えば、EP 0270356、PCT公開WO 85/01856、および米国特許4,684,611に記載されている）、植物RNAウイルス媒介形質転換（例えば、EP 0067 553および米国特許4,407,956に記載されている）、リポソーム媒介形質転換（例えば、米国特許4,536,475に記載されている）など、特定の系統のトウモロコシを形質転換する方法（例えば、米国特許6,140,553；Frommら、Bio/Technology (1990) 8, 833-839）；Gordon-Kammら、The Plant Cell, (1990) 2, 603-618）およびイネ（Shimamotoら、Nature, (1989) 338, 274-276；Dattaら、Bio/Technology, (1990) 8, 736-740）の特定の系統を形質転換する方法、および一般的に単子葉植物を形質転換する方法（PCT公開WO 92/09696）などが挙げられる。綿の形質転換には、PCT特許公開WO 00/71733に記載されている方法を用いることができる。大豆の形質転換については、当該技術分野で知られている方法、例えば、Hincheeら（Bio/Technology, (1988) 6, 915）およびChristouら（Trends Biotech, (1990) 8, 145）、またはWO 00/42207の方法を参照することができる。
本発明の遺伝子改変植物は、従来の植物育種法を用いて、同じ特性を持つ遺伝子改変植物をより多く生産したり、同じ植物種や関連植物種の他の品種に遺伝子改変を導入したりすることができる。改変された植物から得られる種子は、好ましくは、核DNAに安定的に挿入された遺伝子改変体、または内在性遺伝子もしくはプロモーターの改変体として遺伝子改変体を含む。本発明に係る遺伝子改変体を含む植物には、本発明に係る遺伝子改変体を含む植物の根株からなる、またはそれに由来する植物、例えば、果樹または観賞用植物が含まれる。したがって、形質転換された植物または植物部分に挿入された非遺伝子導入の接ぎ木植物部分も本発明に含まれる。
導入された遺伝子の発現をもたらす導入遺伝要素は、発現ベクターまたは発現カセットのいずれであっても、典型的には植物発現可能なプロモーターを利用する。本明細書で使用する「植物発現性プロモーター」とは、植物細胞内で本発明の遺伝子改変体（複数可）の発現を確実にするプロモーターを指す。植物において構成的な発現を指示するプロモーターの例は、当技術分野で知られており、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の強力な構成的35Sプロモーター（「35Sプロモーター」）、例えば、単離されたCM1841（Gardnerら、Nucleic Acids Res、（1981）9、2871-2887）、CabbB S（Franckら、Cell（1980）21、285294-；Kayら、Science, (1987) 236, 4805）およびCabbB JI（Hull and Howell, Virology, (1987) 86, 482-493）、キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV）、ユビキチンファミリーからのプロモーター（例えば、Christensenらのトウモロコシユビキチンプロモーター、Plant Mol Biol, (1992) 18, 675-689、またはNorrisらのA. thaliana UBQ10プロモーター、Plant Mol.Biol.(1993) 21, 895-906）、gos2プロモーター（de Paterら、The Plant J (1992) 2, 834-844）、emuプロモーター（Last et al,Theor Appl Genet, (1990) 81, 581-588）、Anらが記載したプロモーター（The Plant J, (1996) 10, 107）、Zhangらが記載したイネアクチンプロモーター（The Plant Cell, (1991) 3, 1155-1165）などのアクチンプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター（WO 97/48819, Verdaguer et al.(Plant Mol Biol, (1998) 37, 1055-1067）、Subterranean Clover Stunt VirusのpPLEXシリーズのプロモーター（WO 96/06932、特にS4またはS7プロモーター）、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター、例えば、pAdh1S（GenBankアクセッション番号X04049、X00581）、T DNAの1'および2'遺伝子の発現をそれぞれ駆動するTR1'プロモーターおよびTR2'プロモーター（それぞれ、「TR1'プロモーター」および「TR2'プロモーター」）（Veltenら、EMBO J、（1984）3、2723 2730）などが挙げられる。
あるいは、植物発現性プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、植物のいくつかの細胞または組織、例えば、葉のメソフィル細胞において、より高いレベルの発現を指示するプロモーターであってもよい。好ましい実施形態では、葉のメソフィル特異的プロモーターまたは葉のガードセル特異的プロモーターが使用される。非限定的な例としては、葉特異的なRbcs1Aプロモーター（A. thaliana RuBisCO small subunit 1A (AT1G67090) Promoter）、GAPA-1プロモーター（A.thaliana Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A subunit 1 (AT3G26650)プロモーター）、およびFBA2プロモーター（A. thaliana Fructose-bisphosphate aldolase 2 317 (AT4G38970)プロモーター）（Kromdijk et al,Science, 2016）がある。さらに非限定的な例としては、葉のメソフィル特異的なFBPaseプロモーター（Pelegetら、Plant J、2007）、トウモロコシまたはイネのrbcSプロモーター（Nomuraら、Plant Mol Biol、2000）、葉のガードセル特異的なA. thaliana KAT1プロモーター（Nakamuraら、Plant Phys, 1995）、A. thaliana Myrosinase-Thioglucoside glucohydrolase 1 (TGG1)プロモーター（Husebyeら、Plant Phys, 2002）、A. thaliana rha1プロモーター（Terrynら、Plant Cell, 1993）、A. thaliana AtCHX20プロモーター（Padmanabanら、Plant Phys, 2007）、A. thaliana HIC (High carbon dioxide)プロモーター（Grayら、Nature, 2000）、A. thaliana HIC (High carbon dioxide)プロモーター（Grayら、Nature, 2000）、A. thaliana AtCHX20プロモーター（Padmanabanら、Plant Phys, 2007）、A. thaliana HIC (High carbon dioxide)プロモーター（Grayら、Nature, 2000）、A. thaliana CYTOCHROME P450 86A2 (CYP86A2) mono-oxygenase promoter (pCYP) (Francia et al., Plant Signal & Behav, 2008; Galbiati et al,The Plant Journal, 2008）、ジャガイモのADP-グルコースピロホスホリラーゼ（AGPase）プロモーター（Muller-Roberら、The Plant Cell 1994）、ブドウのR2R3 MYB60転写因子プロモーター（Galbiatiら、BMC Plant Bio, 2011）、A. thaliana AtMYB60プロモーター（Cominelli et al., Current Bio, 2005; Cominelli et al., BMC Plant Bio, 2011）、A. thaliana At1g22690-プロモーター（pGC1）（Yang et al., Plant Methods, 2008）、A. thaliana AtMYB 61プロモーター（Liang et al., Curr Biol, 2005）などが挙げられる。これらの植物プロモーターは、エンハンサー要素と組み合わせることもできるし、最小限のプロモーター要素と組み合わせることもできるし、所望の発現プロファイルを確保するために繰り返し要素を構成することもできる。
いくつかの実施形態では、植物細胞での発現を高めるための遺伝的要素を利用することができる。例えば、導入された遺伝子の5'末端または3'末端にあるイントロン、または導入された遺伝子のコーディング配列にあるイントロン、例えば、hsp70イントロンなどが挙げられる。その他のこのような遺伝的要素としては、プロモーター・エンハンサー要素、重複したまたは3重になったプロモーター領域、別の導入遺伝子とは異なるまたは内在性（植物宿主）遺伝子リーダー配列とは異なる5'リーダー配列、同じ植物で使用される別の導入遺伝子とは異なるまたは内在性（植物宿主）トレーラー配列とは異なる3'トレーラー配列などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の導入遺伝子は、挿入された遺伝子部分が適当な3'末端転写調節シグナル（例えば、転写産物形成シグナルやポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、5'）に位置するように、宿主細胞DNAに挿入することができる。これは、好ましくは、植物細胞ゲノム（核または葉緑体）に遺伝子を挿入することによって達成される。好ましいポリアデニル化シグナルおよび転写産物形成シグナルとしては、A. tumefaciensのノパリン合成酵素遺伝子（Nosターミネーター；Depickerら、J. Molec Appl Gen, (1982) 1, 561-573）、オクトピン合成酵素遺伝子（OCSターミネーター；Gielenら。EMBO J, (1984) 3:835 845）、A. thaliana熱ショックタンパク質ターミネーター（HSPターミネーター）；SCSVまたはMalic酵素ターミネーター（Schunmann et al., Plant Funct Biol, (2003) 30:453-460）、およびT DNA遺伝子7（Velten and Schell, Nucleic Acids Res, (1985) 13, 6981 6998）は、形質転換された植物細胞内の3'非翻訳DNA配列として作用するものである。いくつかの実施形態では、導入された遺伝子の1つまたは複数が核ゲノムに安定的に統合される。安定的な統合は、核酸配列が核ゲノムに統合されたままであり、後続の植物世代を通して発現し続ける（例えば、検出可能なmRNA転写物またはタンパク質が産生される）場合に存在する。核ゲノムへの安定的な組み込みおよび／または核ゲノムの編集は、当技術分野で知られている任意の方法（例えば、微粒子ボンバードメント、アグロバクテリウム媒介形質転換、CRISPR／Cas9、プロトプラストのエレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）によって達成することができる。
組換え核酸または修飾核酸とは、分離されたポリヌクレオチドのセグメントを遺伝子工学技術または化学合成によって人工的に操作することにより、分離された2つの配列セグメントを組み合わせて作られたポリヌクレオチドのことである。このようにして、所望の機能を持つポリヌクレオチドセグメントを結合して、所望の機能の組み合わせを生成することができる。
本明細書で使用される「過剰発現」および「アップレギュレーション」という用語は、遺伝子改変の結果として野生型生物（例えば、植物）における発現と比較して増加した発現（例えば、mRNA、ポリペプチドなどの）を指す。いくつかの実施形態では、発現の増加は、野生型における発現よりも約10％以上のわずかな増加である。いくつかの実施形態では、発現の増加は、野生型での発現に対して50％以上（例えば、60％、70％、80％、100％など）の増加である。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子が過剰発現される。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子は、発現されることによって過剰発現される。植物における遺伝子の過剰発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、高発現プロモーター、エンハンサー、転写および／または翻訳制御配列、コドン最適化、改変された転写因子、および／または過剰発現される遺伝子の発現を制御する変異遺伝子もしくは改変遺伝子の使用を含むがこれらに限定されない、当技術分野における任意の既知の方法によって達成することができる。
組換え核酸が特定の配列の発現、クローニング、または複製を意図している場合、宿主細胞への導入のために調製されたDNA構築物は、典型的には、所望のポリペプチドをコードする意図されたDNA断片を含む、宿主によって認識される複製システム（例えば、ベクター）を含み、また、ポリペプチドコード化セグメントに動作可能に連結された転写および翻訳開始制御配列を含むことができる。さらに、そのような構築物は、細胞局在化シグナル（例えば、細胞膜局在化シグナル）を含むことができる。好ましい実施形態では、そのようなDNA構築物は、宿主細胞のゲノムDNA、葉緑体DNAまたはミトコンドリアDNAに導入される。
いくつかの実施形態では、1つ以上の導入遺伝子の発現を誘導するために、非統合的な発現系を使用することができる。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製起点または自律複製配列（ARS）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、および必要な処理情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびmRNA安定化配列を含むことができる。シグナルペプチドは、同じ種または関連種の分泌ポリペプチドから必要に応じて含まれることもあり、これによりタンパク質が細胞膜や細胞壁を通過したり、滞留したり、あるいは細胞から分泌されたりする。
本明細書に開示された本発明の方法論を実施するのに有用な選択マーカーは、陽性選択マーカーであることができる。一般的に、陽性選択とは、遺伝子改変された細胞が、毒性物質の存在下で、目的の組換えポリヌクレオチドが細胞内に存在する場合にのみ生存できる場合を指す。負の選択可能なマーカーやスクリーニング可能なマーカーも当技術分野ではよく知られており、本発明によって意図されている。当業者であれば、本明細書に開示されている発明を実施する際に、利用可能な任意の関連マーカーを利用できることを認識するであろう。
本発明の組換え株のスクリーニングおよび分子解析は、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して行うことができる。ハイブリダイゼーション手順は、本明細書に記載されている技術を用いて改変されたものなど、本明細書で教示されているように有用な対象の調節配列に対して十分な相同性を有するポリヌクレオチドを同定するのに有用である。特定のハイブリダイゼーション技術は、対象の発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術に改良が加えられると、それらは当業者によって容易に適用することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に知られている任意の適切なラベルで標識することができる。ハイブリダイゼーション条件や洗浄条件、例えば温度や塩濃度などを変更することで、検出閾値のストリンジェンシーを変えることができる。ハイブリダイゼーション条件の詳細については、例えば、Sambrookら（1989）vide infra、またはAusubelら（1995）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, N.Y.を参照のこと。
さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、遺伝子改変株のスクリーニングや分子解析、目的とする分離核酸の作成を行うことができる。PCRは、核酸配列の反復的、酵素的、プリム的合成である。この手順は、当業者にはよく知られており、一般的に使用されている（Mullis, U.S. Pat.第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号、Saikiら（1985）Science 230：1350-1354を参照のこと）。PCRは、標的配列の反対側の鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーに挟まれた目的のDNA断片を酵素で増幅することに基づいている。プライマーは、3′末端が互いに向き合うように配置されている。鋳型の熱変性、プライマーの相補的な配列へのアニーリング、アニーリングしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰り返すことで、PCRプライマーの5'末端で定義されるセグメントが増幅される。各プライマーの伸長産物は他のプライマーの鋳型となるため、1サイクルごとに、前のサイクルで生成されたDNA鋳型の量が実質的に2倍になる。この結果、特定のターゲットフラグメントが指数関数的に蓄積され、数時間後には数百万倍にもなる。好熱性細菌Thermus aquaticusから単離されたTaqポリメラーゼのような耐熱性DNAポリメラーゼを使用することで、増幅プロセスを完全に自動化することができる。その他の酵素は当業者に知られている。
本発明の核酸およびタンパク質は、具体的に開示された配列の相同性をも包含することができる。相同性（例えば、配列の同一性）は、50％-100％であり得る。いくつかの例では、そのような相同性は80％以上、85％以上、90％以上、または95％以上である。意図された配列の使用に必要な相同性または同一性の程度は、当業者であれば容易に識別できる。本明細書では、2つの核酸の配列同一性の割合は、Karlin and Altschul (1990) Proc.Natl. Acad.Sci. USA 87:2264-2268に開示されているもの、Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5877のように修正した。このようなアルゴリズムは、Altschulら（1990）のBLASTN、BLASTP、およびBLASTX、Biol.215:402-410のプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、所望の配列同一性パーセントを有するヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラムを用いて、score＝100、wordlength＝12で実行される。比較目的でギャップ付きア系統メントを得るために、Gapped BLASTを、Altschulら（1997）Nucl.Acids.Res. 25:3389-3402に記載されているように、Gapped BLASTを使用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する際には、それぞれのプログラム（BLASTNおよびBLASTX）のデフォルトパラメータが使用される。www.ncbi.nih.gov を参照されたい。当業者であれば、適切なBLASTプログラムをデフォルト設定（例えば、BLASTPの場合：Gap opening penalty:11、ギャップ拡張ペナルティ：1、Expectation value: 10、Word size: 3、Max scores: 25、Max alignments:15、BLASTNの場合：Gap opening penalty:5、ギャップ拡張ペナルティ:2、核酸一致：1、核酸ミスマッチ-3、期待値：10、ワードサイズ：11、最大スコア：25、最大ア系統メント数15)で使用して、目的の配列と参照配列を整列させることにより、参照配列中のアミノ酸または核酸に対応する位置が、目的の配列中のどこにあるかを容易に決定することができる。
好ましい宿主細胞は植物細胞である。本文脈における組換え宿主細胞とは、単離された核分子を含むように遺伝子組み換えされたもの、宿主細胞に通常存在し機能する1つ以上の欠失した遺伝子もしくはその他の非機能的な遺伝子を含むもの、または少なくとも1つの組換えタンパク質を産生する1つ以上の遺伝子を含むものをいう。本発明のタンパク質をコードする核酸は、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーション、または当業者に知られている他の方法論を含むがこれらに限定されない、特定のタイプの細胞に適切な当業者に知られている任意の手段によって導入することができる。
植物の育種法
植物の育種は、まず現在の生殖細胞の分析、問題点や弱点の定義、プログラム目標の設定、具体的な育種目標の定義から始まる。次のステップは、プログラム目標を達成するための形質を持った生殖細胞の選択である。選抜された生殖質は、希望する形質を再結合させるために交配され、選抜によって品種や親系統が開発される。目標は、親の生殖質から望ましい形質の改良された組み合わせを1つの品種またはハイブリッドに組み合わせることである。これらの重要な形質には、高収量、圃場性能、果実および農学的品質の向上、病虫害などの生物学的ストレスへの耐性、干ばつや暑さなどの環境ストレスへの耐性などが含まれる。
各育種プログラムでは、育種手順の効率性を定期的に客観的に評価する必要がある。評価基準は目標や目的によって異なるが、適切な基準との比較に基づく1年あたりの選抜による利益、先進的な育種系統の全体的な価値、単位投入量（例えば、1年あたり、1ドルあたりの支出など）あたりの成功した栽培品種の数などが含まれるべきである。有望な先進的育種系統は、少なくとも3年間、商業対象地域を代表する環境で徹底的に試験され、適切な基準と比較される。最良の系統は新しい商業品種の候補となり、まだいくつかの形質が不足している系統は、さらなる選択のために新しい集団を作り出す親として使用される。このようなプロセスを経て、最終的にはマーケティングや流通の段階に至るが、最初の交配や選抜から5-10年はかかると言われている。
育種・選抜方法の選択は、植物の繁殖様式、改善しようとする形質の遺伝率、商業的に使用される品種の種類（F1ハイブリッド品種、インブリード品種など）によって異なる。遺伝性の高い形質では、1カ所で評価した優れた個体を選択することが効果的であるが、遺伝性の低い形質では、近縁の植物のファミリーを繰り返し評価して得られた平均値に基づいて選択する必要がある。また、遺伝の複雑さは育種法の選択にも影響する。遺伝性の高い形質の遺伝子を1つまたは数個を望ましい品種に導入するためには戻し交配育種が用いられ（例えば、病気に強い品種の育種）、多数の遺伝子によって支配される量的な遺伝形質にはリカレント選抜技術が用いられ、様々なリカレント選抜技術が用いられる。一般的に用いられる選抜方法としては、血統選抜、改良血統選抜、大量選抜、リカレント選抜などがある。
血統選択は、一般的に自家受粉の作物や交雑作物の近親交配の改良に用いられる。有利で相補的な形質を持つ2つの親を交配してF1を作る。F2集団は、1つまたは複数のF1を自家受精させるか、2つのF1を交配させることで作られる（シブ交配）。最良の個体の選抜は、通常、F2集団から始められ、次に、F3から始めて、最良の家族の最良の個体が選抜される。遺伝率の低い形質に対する選抜の効果を高めるために、F4世代では、ファミリーや、ファミリーの個体を含むハイブリッドの組み合わせを繰り返しテストすることが多い。近親交配が進んだ段階（すなわち、F6とF7）では、最高の系統または表現型が類似した系統の混合物が、新しい品種としてリリースされる可能性を考慮して試験される。
大量選抜や反復選抜は、自家受粉または他家受粉する作物の集団を改良するために用いることができる。遺伝的に変化するヘテロ接合体の集団は、複数の異なる親を交配することで特定または作成される。個体の優秀性、優れた子孫、または優れた結合能力に基づいて、最良の植物が選択される。選択された植物は、新しい集団を作るために交配され、さらに選択のサイクルが続けられる。
戻し交配（リカレントセレクション）は、単純に継承される遺伝性の高い形質の遺伝子を、戻し交配親であるホモ接合の望ましい品種や系統に移すために使用されることがある。移入される形質の源をドナーペアレントと呼ぶ。結果として得られる植物は、継代親（例えば、栽培品種）の属性と、ドナー親から移入された望ましい形質を持つことが期待される。最初の交配の後、ドナーペアレントの表現型を持つ個体を選択し、反復して再帰性ペアレントに交配する（戻し交配）。結果として得られる植物は、再帰性親（例えば、栽培品種）の属性と、ドナー親から移入された望ましい形質を有することが期待される。
厳密な意味での単一種子法とは、分離した集団を植え、一株につき一粒の種子を採取し、その一粒の種子を使って次の世代を植えることである。集団がF2から望ましい近親交配のレベルにまで進むと、系統の元となる植物はそれぞれ異なるF2の個体につながる。集団内の植物の数は、一部の種子が発芽しなかったり、一部の植物が少なくとも1つの種子を生産しなかったりするため、世代ごとに減少する。その結果、世代が進んだ時点で、もともと集団内に存在していたF2株のすべてが子孫となるわけではない。
表現型の観察に加えて、植物の遺伝子型も調べることができる。植物の遺伝子型を分析し、比較し、特徴づけるための実験室ベースの技術は数多くある。その中には、アイソザイム電気泳動、制限酵素長多型（RFLP）、ランダム増幅多型DNA（RAPD）、任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（AP-PCR）、DNA増幅フィンガープリント（DAF）、Sequence Characterized Amplified Regions (SCARs)、Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs)、Simple Sequence Repeats (SSRs)、Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)などがある。
分子マーカー（「マーカー」）は、質的形質の選択のための育種プロセスにおいても使用することができる。例えば、対立遺伝子に密接に結びついたマーカーや、実際に目的とする対立遺伝子内の配列を含むマーカーを用いて、目的とする対立遺伝子を含む植物を選抜することができる。このようなマーカーを用いた選抜方法は、遺伝子マーカー強化選抜やマーカーアシスト選抜と呼ばれている。マーカー分析を行う方法は、当業者には一般的に知られている。
変異育種は、植物の品種に新しい形質を導入するためにも用いられることがある。自然に発生した変異や人為的に誘発された変異は、植物育種家にとって有用な可変性の源となる。人為的な変異誘発の目的は、所望の特性に対する変異率を高めることである。突然変異率は、温度、種子の長期保存、組織培養条件、放射線（X線、ガンマ線、中性子、ベータ線、紫外線など）、化学的突然変異誘発物質（塩基配列など）など、さまざまな方法で高めることができる。化学的変異原（5-ブロモウラシルなどの塩基類）、抗生物質、アルキル化剤（硫黄マスタード、窒素マスタード、エポキシド、エチレンアミン、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン、ラクトンなど）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、アクリジン類などがある。変異導入により所望の形質が得られれば、従来の育種技術により既存の生殖細胞に組み込むことができる。変異育種の詳細については、Principles of Cultivar Development:Theory and Technique, Walter Fehr (1991), Agronomy Books, 1 (https://lib.dr.iastate.edu/agron_books/1)に記載されている。
また、二重ハプロイドの生産は、育種プログラムにおいてホモ接合の系統を開発するためにも利用できる。二重ハプロイドは、ヘテロ接合の植物から一組の染色体を二重にすることで、完全にホモ接合の個体を生産する。例えば、Wan, et al., Theor.Appl.Genet., 77:889-892, 1989を参照されたい。
使用することができる育種方法の追加の非限定的な例としては、限定されるものではないが、Principles of Plant Breeding, John Wiley and Son, pp.115-161 (1960); Principles of Cultivar Development:Theory and Technique, Walter Fehr (1991), Agronomy Books, 1 (https://lib.dr.iastate.edu/agron_books/1)に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を概説してきましたが、特定の具体的な実施例を参照することで、同じことがよりよく理解されるでしょう。これらの実施例は、本発明をさらに説明するために本明細書に含まれており、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを意図していません。
本開示は、請求項に記載された本開示の範囲を制限することを何ら意図していない以下の実施例でさらに詳細に説明される。添付の図は、本明細書および本開示の説明の不可欠な部分として考慮されることを意図している。以下の実施例は、請求される開示を限定するものではなく、例示するために提供される。
（実施例1）ルビスコとEPYC1は相互作用し、その相互作用の強さを高めるように設計することができる
以下の例では、EPYC1の異なるバリアントとRubisco Small Subunit (SSU)の異なるバリアントの開発とエンジニアリングについて説明している。また、EPYC1の変異体とRubisco SSUの変異体との間の相互作用を調べる酵母ツーハイブリッド実験についても説明する。
材料と方法
クラミドモナス・リンハードティおよびシロイヌナズナのルビスコスモールサブユニット（SSU）とC. reinhardtiiのタンパク質Essential Pyrenoid Component 1（EPYC1）について
C. reinhardtiiには，Rubisco SSUのホモログとしてS1Cr(SEQ ID NO: 30)とS Cr2(SEQ ID NO: 2)があり、これらは同じ大きさで，同一のα-ヘリックスとβ-シートを持っている。S1CrとS2Crはタンパク質レベルで97.1%の同一性を持ち、アミノ酸配列ではわずか4残基の違いしかない（図1Dでは太字で表示）。この4残基のうち1残基はβA-βBループにあり、S1CrとS2Crではこのループに1残基の違い（A47S）があることになる。成熟したA. thaliana SSU 1A（1AAt; SEQ ID NO: 1; 図1Cに示す構造）とC. reinhardtii SSUは、構造的には類似しているが、タンパク質レベルでは45.0%の同一性しかない。C. reinhardtiiのS1CrおよびS2Cr（140アミノ酸）は、1AAt （125aa）よりも全体的に長く、1AAtよりもβA-βBループ（6aa）およびC末端（9aa）が長くなっている。図3Aに示すように、SSUのα-ヘリックス、β-ストランド、βA-βBループ領域は、A. thalianaとC. reinhardtiiの間で実質的に異なっている。
C. reinhardtiiのタンパク質EPYC1は、類似性の高い4つの繰り返し領域とそれを挟む短い末端領域からなるモジュール型のタンパク質である（図1A-1B）（全長EPYC1＝SEQ ID NO: 34、成熟EPYC1（すなわち、切断部位処理後）＝SEQ ID NO: 35）。4つの類似した繰り返し領域のそれぞれは、予測された無秩序なドメインと、予測されたα-helixを含む、より短くて無秩序ではないドメインから構成されている。EPYC1タンパク質は、他の3つの近縁種の藻類、すなわちVolvox carteri（VOLCADRAFT_103023、63.5%の同一性）、Gonium pectorale（GPECTOR_43g955、42.2%の同一性）、およびTetrabaena socialis（A1O1_04388、44.9%の同一性）のタンパク質とBLASTで整列する。図15に示すように、3つのホモログはすべて、（EPYC1のように）予測されるα-ヘリックス領域を持つリピート領域も持っている。EPYC1のホモログを持つこれらの藻類のうち、V. carteriとG. pectoraleの2種のRubisco SSUは、C. reinhardtii S1Cr のものとほとんど同一のα-へリックスを持つ（図14A-14Cの太字参照）。このことは、これらの種においてEPYC1とSSUが同様の方法で相互作用していることを強く示唆している。
イースト・ツー・ハイブリット（Y2H）
酵母2ハイブリッドプラスミドベクターpGBKT7（結合ドメインベクター）およびpGADT7（活性化ドメインベクター）を用いて，目的のタンパク質間の相互作用を検出した。遺伝子の増幅には，Q5 DNAポリメラーゼ（NEB）と表1に示すプライマーを用いた。S1CrとS2 Crの両方を最初のイースト・ツー・ハイブリッド実験に使用したが、C. reinhardtiiではS2 Crの方が高発現しているため、後の実験ではS2を使用した。EPYC1のコーディング配列は、オン系統ツール(www.idtdna.com/CodonOpt)を用いて高等植物での発現に向けてコドン最適化を行った。EPYC1のすべての変異体は、Gblockフラグメント（IDT）として合成し、表1に示すプライマーを用いて増幅した。増幅した遺伝子を、マルチプルクローニングサイトを用いて各ベクターにクローニングし、GAL4のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインとの融合体をそれぞれ作成した。
[表1]
カナマイシン（50μgml-1）を添加したYPDA培地で培養した50mlの培養液から、コンピテント酵母細胞（Y2H Gold，Clontech社）を調製した。細胞をddH2Oと酢酸リチウム/TE溶液（100mM LiAc、 10mM Tris-HCl [pH7.5]、1mM EDTA）で洗浄した後、酢酸リチウム/TE溶液に再懸濁した。次に、50μlのコンピテントセルに1μgの各プラスミドベクターとPEG溶液（100mM LiAc、 10mM Tris-HCl [pH7.5]、1mM EDTA、 40% [v/v] PEG 4000）を混合して、結合ドメインベクターおよび活性化ドメインベクターで細胞を共形質転換した。細胞を30℃で30分間インキュベートした後、42℃の熱ショックを20分間与えた。細胞を遠心分離し、500μlのYPDAに再懸濁し、30℃で約90分間インキュベートした後、遠心分離し、TE（10mM Tris-HCl［pH7.5］、1mM EDTA）で洗浄した。ペレットを200μlのTEに再懸濁し、SD-L-W（ロイシンとトリプトファンを欠いた標準デキストロース培地（minimal yeast medium）、Anachem社製）に撒き、30℃で3日間培養した。得られたコロニーのうち10-15個を共形質転換ごとにプールし、1つの培養液で24時間培養した。翌日、1mlの培養液を採取して細胞密度（OD600）を測定し、遠心分離した後、TEで希釈して最終的なOD600を0.5または0.1にした。
酵母の培養は、SD-L-W（ロイシン（L）とトリプトファン（W）を欠く酵母合成最小培地）およびSD-L-W-H（L、W、ヒスチジン（H）を欠く酵母合成最小培地）にプレーティングした(Anachem社)。結合ドメインと活性化ドメインの両方を発現させた酵母をSD-L-Wで培養し、両プラスミドの存在を確認した。相互作用の強さを評価するため、HIS3阻害剤である3-アミノトリアゾール（3-AT）の濃度を変えたSD-L-W-H上に酵母をプレーティングした。次に、これらのプレートを3日間インキュベートしてから、増殖の有無を評価し、van Nues and Beggs（van Nues and Beggs, Genetics (2000) 157: 1451-1467)のように半定量的酵母ツーハイブリッドアッセイを実施した。各相互作用研究には、同じ酵母の形質転換を用いた。同じ酵母形質転換プレート上の異なるコロニーは、独立した生物学的複製とみなした（E. coliの場合と同様）。2つの生物学的複製（各相互作用の上段と下段）は、異なる液体培養濃度（0.5 ODと0.1 OD）からスポッティングした。各相互作用実験は少なくとも2回行った。酵母の相互作用研究の概要図を、図3C、4J-4K、および5Eに示す。
表2は、酵母ツーハイブリッドアッセイで使用されたベクターの説明を示している。図2A-2Bは、表2に記載された最初の7つのベクター（pGBKT7_EPYC1-pGADT7_LSUCr）を用いたアッセイからの例示的な結果を示しており、各相互作用実験は、2つの生物学的複製を有し、少なくとも2回行われた。図3C、4J-4K、および5Eは、中間の31個のベクター（pGADT7_1AAtMOD(β-sheets)-pGBKT7_synthEPYC1 α-helix knockout 2）を用いたアッセイからの結果の概要図である。図2B-2Cは、最後の10個のベクター（pGBKT7_ LSU Cr-pGADT7_LSUAt）を用いたアッセイからの例示的な結果を示しており、各相互作用実験は2つの生物学的複製を持ち、少なくとも2回行われた。
[表2]
タンパク質の抽出は、溶解バッファー（50mM Tris HCl [pH 233 6]、4% [v/v] SDS、8 M尿素、30% [v/v] グリセロール、0.1 M DTT、0.005% [w/v] Bromophenol blue）に酵母細胞を一晩の液体培養からOD6001になるように再懸濁し、65℃で30分間インキュベートし、10% (w/v) Bis-Trisタンパク質ゲル（Expedeon）に直接ロードすることによって行った。図4Iに示すイムノブロットでは、EPYC1::GAL4結合ドメインのN末端切断バージョンを発現する酵母からタンパク質を抽出し、抗EPYC1でイムノブロットした。
液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）
細胞ライセートは、Mackinderら（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）に従って、C. reinhardtii細胞から調製した。2%(w/v)ジギトニンによる膜の可溶化に続いて、清澄化したライセートを、20μgの抗EPYC1抗体とインキュベートした150μlのプロテインAダイナビーズに適用した。Dynabead-cell lysateを4℃で回転させながら1.5時間インキュベートした。その後、ビーズを0.1%(w/v)ジギトニンを含むIPバッファー（50mM HEPES、 50mM KOAc, 2mM Mg(OAc2).42HO、 1mM CaCl2、 200mM Sorbitol、 1mM NaF、 0.3mM NA3VO4、 Roche cOmplete EDTA-free protease inhibitor）で4回洗浄した。EPYC1は、溶出緩衝液（50mM Tris-HCl, 0.2M glycine [pH 2.6]）中で10分間インキュベートすることでビーズから溶出され、溶出液は直ちに1:10 (v/v) Tris-HCl (pH 8.5)で中和された。少量の溶出液をSDS-PAGEゲルにかけ、クーマシーで染色し（図6A）、残りのサンプルはLC-MSに使用した。
インタクト蛋白質のLC-MS実験は、エレクトロスプレーイオン化（エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）、Waters Corp.、Manchester、UK）を備えたSynapt G2 Q-ToF装置を用いて行った。LC分離は、逆相C4 Aeris Widepore 50 × 2.1 mm HPLCカラム（Phenomenex、 CA、 USA）を装備したAcquity UPLCを用い、10分かけて5-95％アセトニトリル（0.1％ギ酸）のグラジエントを採用した。データ解析にはMassLynx v4.1を、デコンボリューションにはMaxEntを使用した。
EPYC1のPCOILS分析
PCOILSは、提出されたタンパク質配列中にコイルドクールドメインが存在する確率を（0-1の範囲で）予測するオン系統ツール（
202203091602187540______________________2GB2020051853___APH_0
ある。投稿後の直接出力を図5Fに示す。
結果
EPYC1は、Y2Hアッセイにおいて、C. reinhardtii SSUおよびmodified A. thaliana SSUと相互作用する
C. reinhardtii SSUの2つのα-ヘリックス（図1C-1D）は、以前、EPYC1（図1A-1B）の潜在的な結合部位であると提案された（Meyer, et al., PNAS (2012) 109: 19474-19479; Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）。この仮説を、半定量的なY2H法を用いて検証した。Y2Hアッセイでは、EPYC1は、C. reinhardtiiのSSUホモログであるS1CrおよびS2Crの両方と比較的強いタンパク質-タンパク質相互作用（すなわち、10mM 3-ATでの成長）を示した（図2A）。一方、EPYC1は、A. thaliana由来の1A SSUとは相互作用しなかったが（1AAt）、C. reinhardtii由来のα-へリックスを持つハイブリッド1A SSU（1AAtMOD；Atkinson, et al., New Phyt, (2017) 214: 655-667に記載）とは弱い相互作用を示した。
Y2Hアッセイでは、EPYC1が自身とは相互作用しないことがさらに示された（図2A-2B）。図2B-2Cに示すように、EPYC1はまた、ピレノイドに関連する他のC. reinhardtii CCMコンポーネント（すなわち、LCIB、LCIC、およびCAH3）、または、葉緑体ストロマに見出される別の本質的に不規則なタンパク質（AtCP12、Lopez-Calcagno, et al., Front.Plant Sci. (2014) 5:9)に記載されている。これらの結果は、EPYC1がY2Hアッセイにおいてタンパク質-タンパク質相互作用の偽陽性になりにくいことを示していた。
高等植物のルビスコSSUは、EPYC1との親和性を高めるように設計できる
次に、EPYC1との相互作用に必要なC. reinhardtii SSUの主要ドメインを特定した。SSUの構造要素を分離するために、3つの異なるβシート（βA、βC、βD）、βA-βBループ、および2つのαへリックス（αA、αB）に関連するS1Crの残基を持つ、合計6種類のキメラバージョンの1AAtを作成した（Spreitzer, Arch.Biochem.Biophys, (2003) 414: 141-149）を生成した（図3B）。
Y2Hアッセイでテストしたところ、以前と同様、EPYC1は1 A Atと相互作用しなかった（図3C）。また、S1CrのβシートやβA-βBループを持つキメラ1AAt、あるいはその両方を合わせても、相互作用は認められなかった。EPYC1と、C. reinhardtii SSUの2つのα-ヘリックスとのキメラ1AAtの間でのみ、相互作用が観察された（図3C）。S1Crのαへリックスのみを有するS1 Cr1AAtは、最小限の相互作用しか示さなかったが（すなわち、0mM 3-ATで）、SCr1のβシートとβA-βBループを組み込むことで強化された。特に、C. reinhardtii由来のα-ヘリックス、β-シート、βA-βBループを含む改変1AAt変異体（S1Crと79%の配列同一性）は、S1 Crと比較してより強い相互作用を示した（図3C）。これらの結果から、高等植物のルビスコSSUは、C. reinhardtiiのSSUの構造要素を含むことで、EPYC1との親和性を高めるように設計できることがわかった。
EPYC1は、ルビスコSSUとの相互作用の強さを高めるように設計することができる
ルビスコSSUとの相互作用に必要なEPYC1の主要領域を明らかにするために、さまざまな切断型EPYC1バリアントを作製した。EPYC1は、非常に類似した4つの繰り返し配列がN末端とC末端の短い末端領域に挟まれたモジュール式のタンパク質であるため、N末端またはC末端のいずれかの方向から各領域を順次除去する切断を行った（図4A-4B、図4C-4Dにこれらの配列とネイティブのEPYC1タンパク質のアライメントを示す）。切断されたEPYC1変異体は、酵母でよく発現した（図4I）。短縮型EPYC1バリアントを用いたY2Hアッセイの結果を図4Jに示す。EPYC1のN末端のみ（N-ter）はS1Crと相互作用しなかったが、最初のEPYC1リピート領域を加えることで相互作用を検出することができた。これは、EPYC1がモジュール化されたタンパク質であることと、各繰り返し領域がSSUとの相互作用に付加的な効果を持つことの両方を確認するものである。C末端を加えると、相互作用の強さはさらに増した。興味深いことに、C末端のみでもS1Crと相互作用したことから、SSUの結合部位はリピート領域に限定されないことが示唆された。
EPYC1とSSUの間の相互作用は、4つのリピートのそれぞれに予測された保存されたαヘリックスを介して行われる可能性があり、これらを組み合わせることでEPYC1は少なくとも4つのルビスコ複合体と結合することができるという仮説が立てられた（Mackinderら、PNAS（2016）113: 5958-5963; Freeman Rosenzweigら、Cell（2017）171: 148-162）。4つのドメインのそれぞれの相対的な貢献度は、最初のリピートの「RQELESL」（SEQ ID NO: 119）およびその後の3つのリピートの「KQELESL」（SEQ ID NO: 120）の残基を7つのアラニンに変異させて、予測されたα-ヘリカル構造を排除することによって分析された（図4E-4F、これらの配列とネイティブのEPYC1タンパク質とのア系統メントを図4G-4Hに示す）。図4Kに示すように、1つのヘリックスの変異は、Y2Hアッセイで試験した場合、相互作用の強さに影響を与えなかった。しかし、S1Crとの相互作用は、α-へリックス領域の変異を増やす（すなわち、追加する）と、順次弱くなることが観察された。4つのα-へリックスがすべて変異した場合でも、相互作用は完全には失われなかった。後者の結果は、C末端にSSU結合部位があるという証拠を裏付けるものであり、4つのαへリックスがすべてない場合、相互作用強度はC末端のみの相互作用強度と同じにまで低下した（図4J）。これらのデータから、EPYC1には少なくとも5つのSSU相互作用部位があり、それぞれが4つのリピート領域とC末端に位置していることが示唆された。
EPYC1をPCOILSで解析すると、EPYC1の推定αヘリックスはコイルドコイルドメインのように振る舞う可能性が示唆され、最初のリピートが最も高い予測値を示した（図5C）（Gruber, et al., J. Struct.(2006) 155:140-145; Zimmermann, et al., J. Mol.Bio.( 2017) 430: 2237-2243)。そこで、第1リピート領域は、SSU相互作用への親和性を高めた合成EPYC1を設計するための有用な標的足場になり得ると考えた。第1リピートのコピーを1、2、4または8個タンデムに含む4つの合成EPYC1バリアントを構築した（図5A；図5B-5Dに示すアライメント）。図5Eに示すように、第1リピートのコピーを4つ持つEPYC1（合成EPYC1 4 reps）は、Y2Hアッセイで試験した場合、ネイティブな成熟EPYC1と比較して、S1Crおよび1AAtMODとの強い相互作用強度を示した。最も強い相互作用は、試験した最大の3-AT濃度（80mM）で成長した、8つのリピートを有する変異体（合成EPYC1 8 reps）で観察された。
シングルコピーバリアント（合成EPYC1 1 rep）を用いて、PCOILSツールからの予測に基づくα-helix領域の改変（図5A）を行い、相互作用の強さを比較した（図5E）。α-helix領域の複製（SVLPANWRQELESLRNNWRQELESLRNGNGSS（SEQ ID NO: 121））またはα-helix付近のG-Q置換（WRQELESLRNQ（SEQ ID NO: 122））により、コイルドコイルの挙動の確率が高まると予測された（図5F）。PCOILSによる予測とは対照的に、前者の修飾は相互作用を消失させたが、後者はネイティブの1 repバリアントと比較して相互作用の強さに変化はなかった。最後に、α-helix内のL-R置換（WRQELESRRNG（SEQ ID NO: 123））またはα-helix内のE-W R置換（WRQWLESLRNG（SEQ ID NO: 124））をそれぞれ行い，相互作用の消失を試みた。その結果、いずれの置換基も相互作用を消失させた。これらの結果から、EPYC1のα-helixは従来のコイルドコイルドメインのようには振る舞わず、α-helix内の1点変異でも相互作用に影響を与えることが示唆された。これらの結果は、図4Kに示した結果を裏付けるものであった。
EPYC1のN末端には切断部位がある
これは、N末端が葉緑体への輸送ペプチドとしての役割を果たし、葉緑体への輸送中に切断されると予測されていることと一致する（Mackinderら、PNAS (2016) 113: 5958-5963）。予測ツールChloroPとPredAlgoは、それぞれ78残基と170残基での切断を示唆した(Emanuelsson, et al., Nat.Protoc.(2007) 2: 953-971)。しかし、どちらの予測も、EPYC1の機能に必要なリピート領域内で切断されることになり、納得がいかなかった。そこで、C. reinhardtiiのEPYC1を免疫沈降させ、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）を用いて解析した。ESI-MSで分析したところ、成熟したEPYC1には、29622-30621 Daの範囲でいくつかのプロテオフォームが存在することがわかった（図6C）。プロテオフォーム間の分子量差は80 Daであり、リン酸化の状態が異なることが示唆された。この観察結果は、EPYC1が高度にリン酸化されていることを強調した過去の報告（Turkina, et al., Proteomics (2006) 6: 2693-2704; Wang, et al., MCP (2014) 13: 2337-2353）と一致する。EPYC1は翻訳後に高度に修飾されているため、成熟タンパク質の正確な分子量を決定することは困難であった。しかし、同定された最小のプロテオフォームの分子量は29.6kDaであり、EPYC1の理論上の質量に基づいて、26残基（V）と27残基（A）の間に切断部位があることが示された（図1B）。
（実施例2）EPYC1は高等植物の葉緑体にターゲティングすることができ、EPYC1はプランタでRubiscoと相互作用する
以下の実施例は、EPYC1の発現を高等植物の葉緑体（例えば、N. benthamianaおよびA. thaliana）にうまく標的化することができたEPYC1コンストラクトのエンジニアリングを説明する。高等植物の葉緑体で発現させた場合、EPYC1はプランタでRubiscoと相互作用することが示された。
材料と方法
植物素材と生育条件
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana、 Col-0）の種子をコンポストに播き、4℃で3日間成育させた後、20℃、常温CO2、相対湿度70％、150μmol photons m-2s-1の12時間（h）明暗条件で生育させました。異なる遺伝子型を比較するために、同じ年齢と保存歴の種子から植物を育て、同じ環境条件で育てた植物から収穫した。N. benthamianaは、20℃で150μmol photons m-2 s-1、12時間（h）明暗の条件で栽培した。
コンストラクトの設計と変換
EPYC1のコーディング配列は、オン系統ツール(www.idtdna.com/CodonOpt)を用いて高等植物での発現のためにコドン最適化された。EPYC1のすべての変異体は、Gblockフラグメント（IDT）として合成され、Plant MoCloシステムのレベル0アクセプターベクターpAGM1299およびpICH41264に直接クローニングされた（Engler, et al., ACS Synth.Bio.( 2014) 3: 839-843)、またはC-またはN-末端YFPを含むpB7WG2,0ベクターに直接挿入した。表3は、植物の形質転換に使用されたベクターの説明を示す。図7B-7C、8A-8C、および9Aは、最初の5つのベクター（pICH47742_EPYC1::GFP-pAGM8031_EPYC1::GFP_pFast）を用いたアッセイからの例示的な結果を示す。図8D-8Eは、最後の11個のベクター（pB7_S2Cr::YFPN-pB7_S2 Cr::YFPN）を用いたアッセイからの例示的な結果を示す。
[表3]
融合タンパク質を生成するために、遺伝子発現コンストラクトをバイナリのレベルMアクセプターベクターに組み入れた。レベルMベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1）に形質転換し、N. benthamianaにおける一過性の遺伝子発現（Schob, et al., Mol. and Gen. Genetics (1997) 256: 581-585）、またはフローラルディッピングによるA. thaliana植物への安定挿入（Clough and Bent, Plant J. (1998) 16: 735-743）を行った。ホモ接合挿入系統は、pFAST-R選択カセットを用いてT3世代で同定した（Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528）。
DNAと葉のタンパク質の分析
PCR反応は、表4に示した遺伝子特異的プライマーを用いて、McCormick and Kruger（McCormick and Kruger, Plant J. ()2015 81: 570-683）に準じて行った。
[表4]
21日目の植物（第6葉、第7葉）の凍結した葉材から、200mM DTTを含む5×Bolt LDS sample buffer（ThermoFisher Scientific）を用いて、70℃で15分間、可溶性タンパク質を抽出した。抽出液を遠心分離し、上清を4-12%(w/v)ポリアクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行い、ニトロセルロース膜に転写した。膜は、コムギRubiscoに対して1:10,000の希釈で上げたウサギ血清（Howe, et al., PNAS (1982) 79: 6903-6907）、またはEPYC1に対して1:2,000の希釈で上げたウサギ血清（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）でプローブし、続いてHRP結合ヤギ抗ウサギIgG（Abcam）を1:10,000の希釈で上げ、Pierce ECL Western Blotting Substrate（Life Technologies）を用いて視覚化した。
成長解析と光合成測定
1AAtTPと融合したEPYC1（1AAt-TP::EPYC1）をWT、S2Cr、または1AAtMODのいずれかのバックグラウンドで発現するA. thaliana植物株を試験した。バックグラウンド（WT、SCr2または1AAtMOD）ごとに独立して形質転換した3つのT3系統（系統1、系統2、系統3）を測定し、EPYC1を欠く対応する分離系統（系統1 Seg、系統2 Seg、系統3 Seg）と比較した。
生育解析では，31日目に植物を収穫し，新鮮重（FW）と乾燥重（DW）を測定した。図8B-8Cの値は、12本のロゼット（FWおよびDWの測定用）または16本のロゼット（生育アッセイ用）で行った測定の平均値±SEである。アスタリスクは、Student's paired sample t-testによって決定された、形質転換株と分離株との間のFWまたはDWの有意差（P<0.05）を示す。ロゼットの成長率は、社内のイメージングシステムを用いて定量化した（Dobrescu, et al., Plant Methods (2017) 13: 95）。
光合成の測定では，生育解析に用いたのと同じ植物を31日目（収穫前）に測定した。12株の各葉で行った測定の平均値±SEを下記の表5に示す。光化学系II（PSII）の最大量子収量（暗順応葉蛍光；Fv／Fm）は、Hansatech Handy PEA連続励起クロロフィル蛍光計（Hansatech Instruments Ltd.）を用いて測定した（Maxwell and Johnson, J. of Exp.Bot.(2000) 51: 659-668)。
共免疫沈降とイムノブロッティング
ルビスコ変異体（S2Cr、1AAtMOD、1AAt）でEPYC1を発現させた35日齢のA. thaliana植物のロゼットをスナップ凍結し、リキッドN2で粉砕した。同量のIP抽出バッファー（100mM HEPES [pH7.5]、150mM NaCl、4mM EDTA、5mM DTT、0.4 mM PMSF、10% [v/v] Glycerol、 0.1% [v/v] Triton-X-100、 Roche cOmplete EDTA-free protease inhibitor tablet per 10 ml）を加え、サンプルを4℃で15分間回転させ、4℃で遠心分離し、2層のMiracloth（Merck）でろ過した。各抽出液（2ml）を、IPバッファーで予め平衡化した50μlのProtein A Dynabeads（ThermoFisher Scientific）と4℃で1時間インキュベートしてプレクリアーした後、ビーズを捨てた。抗体コートビーズは、3.5μgの抗EPYC1抗体を50μlのProtein A Dynabeadsに塗布した後、4℃で30分間回転させて生成した。抗体はPierce BS3架橋剤（Thermo Scientific社）を用いてビーズに架橋した。各タンパク質抽出液を、抗体をコーティングしたビーズとインキュベートし、4℃で2時間回転させた。結合していないサンプル（フロースルー）を捨て、ビーズを洗浄バッファー（20 mM Tris-HCl [pH 8]、 150 147 mM NaCl, 0.1% [w/v] SDS、 1% [v/v] Triton-X-100、 2 mM EDTA）で4回洗浄した。50μlの溶出バッファー（2x LDSサンプルバッファー、200mM DTT）を加え、70℃で15分間加熱して免疫複合体を溶出させた後、ビーズを捨てた。
溶出した免疫複合体をSDS-PAGEおよびイムノブロッティングに供した。1AAt-TP::EPYC1抗体血清は、EPYC1のC末端を標的とする（Emanuelsson, et al., Nat.Protoc.(2007) 2: 953-971)。イムノブロッティングには、Mackinder, et al., PNAS (2016) 171: 133-147の抗EPYC1、および抗Rubisco（Mackinder 2016で使用され、Howe, et al., PNAS (1982) 79: 6903-6907で初出されたRubisco抗体）の2つの抗体を使用した。図8Eでは、デンシトメトリーを用いて、A.thalianaタンパク質抽出物中のEPYC1の比率をC.reinhardtii抽出物中の比率と比較した。これにより、EPYC1とRubisco LSUの化学量論が推定された。図9Aでは、右側のブロット（Co-IP）は、Rubiscoのラージサブユニット（LSU）に対する抗体でプローブした場合の結果を示している。左から右のレーンは、それぞれ、入力（Input）、流水（F-T）、第4洗浄（Wash）、沸騰溶出（Elute）からの結果を示しており、SDS-ページゲル上で実行し、ニトロセルロース膜に転写し、抗Rubisco抗体または抗EPYC1抗体でプローブした。ネガティブコントロール(Neg.)は、Protein-Aビーズ上の抗EPYC1抗体を抗HA抗体(*)または無抗体(**)のいずれかに置き換え、従来通りIP処理を行った(溶出サンプルのみを示す)。トリプルアスタリスク（***）は、EPYC1を発現していないコントロール系統（S2Cr）を含むすべてのサンプルにおいて、抗EPYC1抗体で観察された非特異的なバンドを示す。
バイモレキュラー蛍光コンプリメンテーション分析（BiFC）
生体内でのEPYC1とRubiscoの相互作用に関する追加情報を得るために、二分子蛍光相補分析（BiFC）を行った。3種類のRubisco SSU（1AAt、S2Cr、1AAtMOD）とEPYC1を、それぞれC末端にYFPNまたはYFPCを融合させて、N. benthamianaで一過性に共発現させた（Walter, et al., Plant J. (2004) 40: 428-438）。
共焦点レーザー走査型顕微鏡
葉は、ライカTCS SP2レーザー走査型共焦点顕微鏡またはライカTCS SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、アトキンソンらと同様に画像化した（Atkinson, et al.Plant Biotech.J. (2016) 14: 1302-1315)。
結果
EPYC1は高等植物の葉緑体をターゲットにすることができる
EPYC1は高等植物の核内で発現するようにコドン最適化されており（図7A）、EPYC1をGFPにC-末端融合させ、35S構成プロモーターの制御下で発現させることで、二重発現ベクターを構築した。プラスミドの組み立てには、レベルMアクセプターpAGM8031を用いた。上記表3に記載のベクターを用いて、N. benthamiana植物の葉をアグロインフィルトレーションし、A. thaliana植物を安定的に形質転換した。次に、EPYC1::GFPの局在を、N. benthamianaの葉（図7B）および安定的に形質転換されたA. thalianaの植物（図7C）において可視化した。これまでに植物で発現した他の葉緑体CCMコンポーネントとは異なり（アトキンソンら、Plant Biotech.J. (2016) 14: 1302-1315)、EPYC1は、N. benthamianaおよびA. thalianaのいずれにおいても、葉緑体に局在することができず、蛍光シグナルは葉緑体に存在しなかった（図5A-5Bのオーバーレイ画像を参照）。そこで、全長のEPYC1::GFPのN末端に、1AAt葉緑体通過ペプチド（1AAt-TP）を付加した。1AAt-TPとの融合により、N. benthamiana（図7Bの1列目対2列目）とA. thaliana（図7Cの1列目対2列目）の両方で、EPYC1::GFPが葉緑体ストロマに再局在化した。
植物の葉緑体におけるEPYC1の発現は、植物の成長や光合成の効率を妨げない
野生型A.thaliana植物、およびAtkinsonらによって以前に作られたS2Crまたは1AAtMODで補完された2つのRubiscoスモールサブユニット（1a3b）変異株（Atkinson，et al.，New Phytol．(2017) 214: 655-667)（図3A）を、1AAt-TP::EPYC1（GFPタグを欠く）で形質転換した（プラスミドマップは図7A参照）。各バックグラウンドから3つのホモ接合のT3系統を選択して、さらなる分析を行った（EPYC1_1-3；S2Cr_EPYC1_1-3および1AAtMOD_EPYC1_1-3）。
生育解析の結果、1AAt-TP::EPYC1を発現するいくつかの植物では、対応する分離個体と比較して、生育表現型（すなわち、面積、FW、DW）がわずかに減少したが、観察された減少は一貫して有意ではなかった（図8B-8C）。
表5は、EPYC1を発現させたA. thaliana植物のPSIIの最大量子収量（Fv/Fm）の測定結果である。3つの遺伝的背景（WT、S2Cr、1AAtMOD）のそれぞれについて、3つの独立して形質転換したT3系統（Line 1、Line 2、Line 3）を測定し、EPYC1を欠く対応する分離体（Line 1 Seg、Line 2 Seg、Line 3 Seg）と比較した。遺伝的背景にかかわらず、1AAt-TP::EPYC1の添加は、暗順応した葉の蛍光（Fv/Fm）で測定した光合成効率に影響を与えなかった。
[表5]
A. thalianaの1AAt-TP::EPYC1に対するイムノブロットでは、約34kDaの優勢なバンド（C. reinhardtiiの成熟したネイティブなアイソフォーム[35kDa]よりもわずかに小さい）が得られ、1AAt-TPとEPYC1のN末端領域の両方の切断が示唆された（抗体血清はEPYC1のC末端を標的としていた）（Emanuelsson, et al.Protoc.( 2007) 2:953-971）（図8Dおよび9A）。デンシトメトリー分析によると、最高発現しているA. thaliana系統のEPYC1のタンパク質レベルは、Rubisco LSUに関連してC. reinhardtiiのEPYC1のタンパク質レベルよりもおよそ14倍低いことが示された（図8E）。低CO2条件下で生育したC. reinhardtiiにおけるEPYC1とRubisco LSUの比率が約1:6であるという報告（Mackinder, et al., PNAS (2016) 171: 133-147）に基づき、トランスジェニック系統におけるEPYC1とA. thaliana LSUの化学量論は、1:84と推定された。この比率は、in vitroで再構成されたピレノイドシステムの相分離した物質中に、ルビスコ1個（すなわち、8個のLSU）あたり1-4個のEPYC1ペプチドが出現するという観察結果よりも低いものであった（Wunder, et al.Commun.(2018) 9: 5076)。A. thalianaのEPYC1では、29kDaの非特異的なバンドに加えて、いくつかの小さなバンドも明らかになった（図8A）。C. reinhardtiiや酵母から抽出したEPYC1では追加のバンドは観察されなかった（図8D）ことから、EPYC1は植物プロテアーゼの標的となっている可能性が示唆された。
以上の結果から、EPYC1を葉緑体で構成的に発現させても、試験した条件下での植物の成長には影響がないことがわかった。さらに、EPYC1を葉緑体で構成的に発現させても、Fv/Fmで測定した植物の光合成効率に影響を与えなかった。
高等植物のルビスコと相互作用するEPYC1
酵母2ハイブリッドシステムで、特定のSSUがEPYC1と相互作用することが示されたため、次に、ルビスコとの相互作用が植物で起こるかどうかを調べた。具体的には、EPYC1を発現している2つの相補的な1a3b変異株と1つの野生型株（それぞれS2Cr_EPYC1_1、1AAtMOD_EPYC1_1、EPYC1_1）を用いた。プロテインAを塗布したビーズに抗EPYC1抗体をつけて、これらの系統からEPYC1を免疫沈降させ、EPYC1またはRubiscoに対する抗体を用いて、溶出液をイムノブロットで分析した（図9A）。その結果、S2Cr_EPYC1、1AAtMOD_EPYC1、およびEPYC1を発現する野生型の溶出物にLSUが検出された。観察された共免疫沈降（co-IP）がRubiscoのプロミスキュイティやビーズや抗体への非特異的結合の結果ではないことを確認するために、いくつかのネガティブコントロールを行った。ルビスコは、抗HAコーティングしたビーズや抗体を含まないビーズを用いたプルダウンの溶出液や、EPYC1で形質転換していないS2Cr植物からの溶出液には検出されなかった。以上の結果から、EPYC1は、C. reinhardtiiまたはC. reinhardtiiに類似したSSUが存在しない形質転換植物においてRubiscoと相互作用することができた。しかし、この相互作用は、ピレノイドのような液体状の相分離のような目に見える集合体を促進するには十分ではなかった。EPYC1の発現量は、実験した3つの系統間で固有のばらつきがあるため、相互作用の相対的な強さを完全に定量化することはできなかった。しかし、EPYC1 IPアッセイで溶出したEPYC1の量は同程度であったが、1AAtMOD_EPYC1およびS2Cr_EPYC1 co-IPアッセイで溶出したRubiscoの量が多かったことから、これらの系統では野生型バックグランドよりもEPYC1との相互作用が強いことが示唆された。
図9Aに示した免疫沈降の結果と同様に、EPYC1と3つのSSUのそれぞれを共発現させた植物では、どのタンパク質をどのようにYFPNに融合させても、再構成されたYFP蛍光のBiFCシグナルが観察された（図9B-9E）。しかし、実施例3に記載の結果から、EPYC1と1At ASSUの間に観察された見かけ上の相互作用は、真の相互作用ではないことがわかった。代わりに、この相互作用は、分割されたYFPハーフの自己組織化の傾向の結果として観察されたと考えられる（Waadt, et al., Plant J. (2008) 56: 506-516）。同様に、ネガティブコントロールであるAtCP12::YFPCは、予期せず1AAt::YFPNとのBiFCシグナルを生成したが、1AAt::YFPCとAtCP12::YFP Nの間には相互作用が観察されなかったため、この相互作用は人工的なものであると考えられる。EPYC1と1A At SSUの間に観察された見かけ上の相互作用は、相分離を促進するのに十分な真の相互作用ではないという解釈は、以下の実施例3で示される実験結果によって確認された。
（実施例3）EPYC1は異種混合系で液体状の凝集体を示すように設計することができ、TobiEPYC1コンストラクトを発現させると高等植物の葉緑体で球状の凝集体が得られる。
以下の例では、in vitroシステムを用いた、EPYC1の液体状の凝集体の検出について説明している。さらに、以下の例では、高等植物の葉緑体におけるTobiEPYC1::GFPコンストラクトの球状凝集体の検出について説明している。
材料と方法
タンパク質の生成、液滴沈降アッセイ、および顕微鏡観察
ルビスコは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を組み合わせて、生後25日から30日のA. thalianaロゼット（野生型植物およびS2Cr系統）から精製した（Shivhare and Mueller-Cajar, Plant Phys. (2017) 1505-1516）。S2Cr系統のハイブリッドルビスコ複合体は、A.thaliana LSUと、A.thaliana SSUとS2Crの混合集団（およそ1：1）で構成されていた（Atkinson, et al., New Phytol.(2017) 214: 655-667).また、ルビスコは、C. reinhardtii細胞（CC-2677）から精製した。EPYC1およびEPYC1::GFPは、大腸菌で生産され、Wunderらに記載されているように精製された（Wunder, et al, Nature Commun.( 2018) 9: 5076)。
EPYC1-Rubisco液滴は、室温で10μlの反応物を緩衝液A（20mM Tris-HCl［pH8.0］、50mM NaCl）中で5分間再構成し、4℃で21,100×gで4分間遠心分離することでバルク溶液から分離した。 EPYC1による液相分離は、Wunderらが開発したインビトロアッセイを用いて試験した（Wunder, et al.(2018) 9: 5076)。ペレット（液滴）および上澄み（バルク溶液）の画分をSDS-PAGEおよびクーマシー染色に供した。
光・蛍光顕微鏡検査では，Nikon Eclipse Ti 倒立顕微鏡を用い、微分干渉コントラストの設定で反応溶液（5 μl）を，カバースリップの表面に焦点を合わせた100倍の油浸対物レンズを用いて、エピ蛍光顕微鏡検査（フルオレセインイソチオシアネートフィルターの設定を使用）を行い、3-5分後に画像を撮影した。使用したカバースリップは22×22mm（Superior Marienfeld, Germany）で、22×22カバースリップ用のワンウェルChamlide CMSチャンバー（Live Cell Instrument, South Korea）に固定した。全ての画像の仮着色にはImageJを使用した。
免疫金ラベリングと電子顕微鏡
21日齢のS2CrおよびS2Cr_EPYC1植物から葉のサンプルを採取し、4%(v/v)パラホルムアルデヒド、0.5%(v/v)グルタルアルデヒド、0.05Mカコジル酸ナトリウム[pH7.2]で固定した。リーフストリップ（1mm幅）を固定液で15分間3回真空浸漬した後、4℃で一晩回転させた。サンプルをPBSで3回洗浄した後、50％、70％、80％、90％エタノール（v/v）をそれぞれ1時間ずつ真空浸透させ、その後100％エタノールで3回脱水した。エタノールと混合したLRホワイトレジン（30％、50％、70％[w/v]）を濃度を上げながら各1時間浸漬した後、100％レジンを3回浸漬した。樹脂は50℃で一晩かけてカプセル内で重合させた。ライカ社製ウルトラミクロトーム（Ultracut）で切片（厚さ1μm）を切り、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察して、調査に適した部位を選択した。選択した部位から超薄切片（厚さ60nm）を切り出し、プラスチックコートされた銅製のグリッドにマウントした。グリッドをTBSTT（Tris-buffered saline with 0.05% [v/v] Triton X-100 and 0.05% [v/v] Tween 20）中の1% (w/v) BSAでブロッキングし、TBSTT中の抗Rubisco抗体を1:250希釈で一晩インキュベートし、TBSTTと水で2回ずつ洗浄した。TBSTT中の15nm金粒子結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Abcam）を1:200希釈で1時間インキュベートした後、前と同様に洗浄した。グリッドを2% (w/v) 酢酸ウラニルで染色した後、JEOL JEM-1400 Plus TEMで観察した。画像はGATAN OneViewカメラで収集した。
TobiEPYC1のコンストラクトデザインと植物の形質転換とデータの集約
TobiEPYC1遺伝子発現カセットを図12Aに示す。カセット1（TobiEPYC1）は、ネイティブEPYC1の切り詰められたバージョンを含み、これは、切り詰められたN末端ドメイン（SEQ ID NO：40）の全長の第1-第4リピート領域（最も薄いグレー（SEQ ID NO：36）、グレー（SEQ ID NO：69）、グレー（SEQ ID NO：70）、および黒（SEQ ID NO：71））、ならびに全長のC末端ドメイン（SEQ ID NO：41）を含む。カセット2（TobiEPYC1::GFP）は、GFPと融合したネイティブEPYC1の同じトランケートバージョンを含む。カセット3（4 reps TobiEPYC1）は、第1リピート領域（SEQ ID NO：38）の4つのコピーを有するEPYC1の合成バージョンを含む。カセット4 GFP（4 reps TobiEPYC1::GFP）は、GFPと融合した第1リピート領域の4コピーを有するEPYC1の同じ合成バージョンを含む。カセット5（8 reps TobiEPYC1）は、第1リピート領域（SEQ ID NO：39）のコピーを8個有するEPYC1の合成バージョンを含む。カセット6（8 reps TobiEPYC1::GFP）は、GFPと融合した第1リピート領域の8コピーを有するEPYC1の同じ合成バージョンを含む。
バイナリープラスミドコンストラクトは、Golden Gate MoCloシステム（Engler, et al, ACS Synth.Bio.(2014) 3: 839-843)によって組み立てられた。プラスミドは、図12B-12Cに示すように、2つのTobiEPYC1発現カセットを含んでいた。以下の表6は、TobiEPYC1遺伝子カセットを用いた植物の形質転換に使用されたベクターの説明を示している
[表6]
ベクターのA.thalianaへの形質転換は、実施例2に記載したようにフローラルディッピング法を用いて行った。表6のベクターのそれぞれについて、少なくとも3つの別々の植物株を生成した。
TobiEPYC1::GFP植物株の集合体の検出
TobiEPYC1::GFPトランスジェニック植物株の組織を、実施例2に記載したように、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。共焦点画像は、無傷の葉組織（図12D-F、12L、13A-B）または葉組織から抽出した葉肉プロトプラスト（図12G-K）からのものであった。各TobiEPYC1::GFPバリアント（表6に示す）の少なくとも2つの別々の植物系統からの少なくとも1つの複製を画像化した。
凝集体の特性は、FRAP（fluorescence recovery after photobleaching）によって分析した。FRAPは、Leica SP8共焦点顕微鏡と63倍の水浸対物レンズ、PMT検出器を用いて実施した。GFPの蛍光は、488 nmで励起し、504-532 nmで発光させて画像化した。ブリーチ前後の画像では、レーザー出力を2％に設定し、ブリーチ自体は56％のレーザー出力で行った。ブリーチ前の画像は189ms間隔で撮影し（計6枚）、ブリーチ後の画像は400ms間隔で撮影した（計150枚）。フォトブリーチは、葉緑体に存在するTobiEPYC1::GFPの集合体の一部にレーザーを照射して行った。光漂白後の回復時間は、漂白した部分と漂白していない部分のGFP発現量を比較して算出した。
EPYC1とC. reinhardtii Rubisco SSUの存在は、実施例2に記載されているように、イムノブロットによって確認された。
結果
高等植物のラージサブユニット（LSU）を含むハイブリッドルビスコと、高等植物とC. reinhardtiiのSSUの混合集団がEPYC1で相分離したもの
現在のピレノイド形成のモデルは、液体のような相分離を促進する特定の弱い多価の相互作用に基づいている（Hyman, et al.Rev. Cell Biol.(2014) 30: 39-58; Freeman Rosenzweig, et al., Cell (2017) 171: 148-162)。このような相互作用がハイブリッド植物由来のルビスコで起こりうるかどうかを観察するために、Wunderらが開発したin vitroのアッセイを用いて、S2Crで補完されたA. thalian 1a3b変異体のルビスコがEPYC1との液液相分離を促進できるかどうかを調べた（Wunder, et al., Nature Commun.( 2018) 9: 5076)。C. reinhardtii Rubiscoと同様に、ハイブリッド植物Rubisco（S2Cr系統由来）もEPYC1と脱相でき、EPYC1：Rubiscoの比率がわずかに高いにもかかわらず、同等の大きさの液体状の液滴を形成した（図10A-10B；時間経過を図10Cに示す）。一方、野生型のA. thaliana Rubiscoは、同様の条件下で相分離を起こさず、S2Crの存在が凝集に不可欠であることが示された。C. reinhardtiiやハイブリッド植物のRubiscoを含む溶液では、液滴が融合して大きな均一な液滴になり（合体）、液体であることが裏付けられた（図8C）（Hyman, et al, Annu.Rev. Cell Biol.( 2014) 30: 39-58)。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析により、EPYC1とRubiscoの両方が液滴に入ったことが確認された（図10D-10E）。
EPYC1は高等植物の葉緑体で凝集体を形成するように設計することができる
EPYC1がRubiscoの凝集に及ぼす影響を調べるために、最高レベルのEPYC1を発現するA. thalian 1a3b変異体（S2 Cr _EPYC1_1）のS2Cr相補体の葉緑体におけるRubiscoの局在を調べた。ルビスコの免疫金標識をTEMで可視化すると、葉緑体全体に金粒子が均一に分布しており、EPYC1を発現していないS2Crコントロールと同様であった（図11A-11B）。このことから、EPYC1とC. reinhardtii SSUを共発現させても、これらの形質転換体では検出可能なRubiscoの硬い凝集体は誘導されないことがわかった。
TobiEPYC1で形質転換した植物の高等植物の葉緑体では、球状の集合体が観察される。
最初に、2つのバージョンのEPYC1を植物で発現させるテストを行った。1つ目は、EPYC1のN末端を78残基切り詰め（ChloroPオン系統ツールで予測される葉緑体移行ペプチド）、A. thaliana Rubisco SSU 1Aの葉緑体シグナルペプチドのロングバージョンと融合させたものである。thaliana Rubisco SSU 1Aの葉緑体シグナルペプチドのロングバージョン（80残基、MASSMLSSATMVASPAQATMVAPFNGLKSSAAFPATRKANNDITSNGGRVNCMQVWPPIGKKKFETLSYLPDLTDSE（SEQ ID NO: 62））と融合させた。これらの2つ目のバージョンは、全長のEPYC1（317残基、SEQ ID NO: 34）に、A. thaliana Rubisco SSU 1Aのクロロプラストシグナルペプチドの長いバージョン（80残基、SEQ ID NO: 62）を融合させたものであった。これらの2つのバージョンのいずれも、野生型の植物でも、C. reinhardtii SSUを発現する安定したトランスジェニックA. thaliana株でも、集合体の証拠は得られなかった。
これらの2つの前バージョンと比較して、TobiEPYC1コンストラクトは3つの方法で最適化された（TobiEPYC1遺伝子発現カセットを図12Aに示す）。第一に、EPYC1の新しいN-末端切断体（26残基、SEQ ID NO：40）を用いた。第二に、切断されたEPYC1を、A. thaliana Rubisco SSU 1Aのより短い葉緑体シグナルペプチド（57残基、SEQ ID NO：63）に融合させた。長いトランジットペプチドを用いた以前のバージョンでは成功しなかったことから、トランジットペプチドの長さが重要である可能性が示された。
第3に、発現レベルを高めるために、EPYC1発現カセットの2つのコピーをバイナリー・プラスミドに含めた。さらに、1つのコピーは2つのターミネーターを有していたが（図12B参照）、これは発現量を25倍程度に増加させたと報告されている戦略である（Diamos and Mason, Plant Biotech.J. (2018) 16: 1971-1982)。GFPの発現レベルが低い系統では依然として凝集体が観察されたが、それらの系統の凝集体はより小さく、EPYC1発現カセットのコピーが2つ必要である可能性が示された。以上の結果から、凝集体の観察にはRubisco SSUとEPYC1の量が重要である可能性が示された。C. reinhardtii SSUの発現に用いたA. thaliana 1a3b変異体では、ネイティブなSSUの量が減少していた（Izumi, et al., J. Exp Bot.(2012) 63(5): 2159-2170)。そのため、これまでは、トランスジェニック系統が50％のネイティブSSUと40％のC. reinhardtii SSUを発現していると推定していた（Atkinson, et al. , New Phytol.(2017) 214, 655-667)。ルビスコ含有量測定とイムノブロット分析から、トランスジェニック系統には60mg m-2のC. reinhardtii SSUが存在すると推定された（Supp.Table S3 in Atkinson, et al., New Phytol.(2017) 214, 655-667)。16kDの重量を基準にすると、60mg m -2C. reinhardtii SSUは3.75μmol m-2 C. reinhardtii SSUに相当した。C. reinhardtiiで報告されているEPYC1とRubiscoの比率は、Rubiscoのラージサブユニットが1：6、スモールサブユニットが1：1（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）からスモールサブユニットが1：8（Hammel, et al., Front.Plant Sci. (2018) 9: 1265）である。Wunder, et al. (Wunder, et a., Nat.Commun.(2018) 9: 5076）は、7.5μMのEPYC1が30μMのルビスコ活性部位を完全に脱離させることができ、これはルビスコ1つにつき2つのEPYC1分子の比率に相当することを見出した。しかし、EPYC1とルビスコの正確な比率は、まだ解明されていない。しかし、上記の結果は、シングルターミネーターおよびダブルターミネーターを持つ構成的プロモーターで2コピーのEPYC1をそれぞれ発現させた場合、SSUプール全体の40%のC. reinhardtii SSUが集合体として十分であることを示している。
図12Dは、ゲイン25、レーザー2％で撮影したN. benthamianaにおけるEPYC1::GFPの一過性の発現を示し、図12Eは、ゲイン10、レーザー1％で撮影したN. benthamianaにおけるTobiEPYC1::GFPの一過性の発現を示す。これらの画像は、N. benthamianaにおけるTobiEPYC1::GFPの一過性の発現レベルが非常に高いことを示している。図12Fは、A. thaliana S2Cr系統におけるTobiEPYC1::GFPの安定発現の蛍光顕微鏡画像である。オーバーレイ画像は、TobiEPYC1::GFPが葉緑体で凝集していることを明確に示している。これらの凝集体は球形度が高いように見え、相分離体であることを示していた。図12G-12Iは、A. thalianaプロトプラストにおけるTobiEPYC1::GFPの安定発現の蛍光顕微鏡画像を示す。図12Iは、TobiEPYC1凝集体の位置で低いクロロフィルが観察されたことを示している（矢印で示す）。このことは、図12Jの画像（中段は図12Iと同じ画像であることに注意）でも観察され、GFP、クロロフィル、明視野の画像を重ね合わせても、蛍光が重なっている領域がないことがわかった。これらの結果から、葉緑体のチラコイドがEPYC1の集合体から排除されていることが示唆された。図12Kに示す画像は、EPYC1凝集体が葉緑体から離れる画像であった（矢印で示す）。これらの葉緑体外のEPYC1凝集体は、観察期間中、培地内で凝集したままであった。図12Lに示す画像は、TobiEPYC1::GFPを安定的に発現させた野生型A. thalianaのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像である。GFPとクロロフィル自家蛍光のチャンネルを重ね合わせたところ、蛍光が重なっている領域が白く表示された。これは、A. thaliana S2Cr系統とは異なり、野生型のA. thaliana系統では、EPYC1は凝集体を形成することができず、葉緑体全体に拡散して発現するのみであることを示していた。これらの結果から、EPYC1の凝集体を観察するためには、C. reinhardtii SSUの構造的特徴が必要であることが示された。
図13A-13Dは、A. thaliana組織におけるEPYC1::GFP凝集体を特徴付けるためのFRAPイメージングのタイムコースの結果を示す。光退色後の回復時間は、Wunderらのインビトロでの脱混合液滴について観察されたものと同様であった（Wunder，et al．Commun.(2018) 9: 5076)。図13Eに示すウエスタンブロットの結果から、TobiEPYC1遺伝子発現カセットは、N末端切断およびより高いレベルの発現にもかかわらず、分解を示すいくつかのバンドをプランタで依然として生成していることが示された。以上の結果から、C. reinhardtii SSUの構造的特徴を発現する高等植物（例えば、A. thaliana）でTobiEPYC1遺伝子発現コンストラクトを発現させると、高等植物の葉緑体で球状の凝集体が形成されることが示された。
（実施例4）EPYC1の切断された成熟型の発現を増加させると、高等植物の葉緑体においてRubiscoが相分離した液体状の凝縮構造に安定して凝集する。
以下の実施例では、バイナリー発現ベクターから切断された成熟型のEPYC1を植物と藻類のハイブリッド型ルビスコと一緒に高レベルで発現させたシロイヌナズナの植物株における、EPYC1-ルビスコ葉緑体凝縮体の分子および細胞の特性について説明する。さらに、異なる光量下で植物を栽培した場合に、凝縮物が植物の代謝に与える影響についても説明している。
本実施例では、実施例3で上述した「TobiEPYC1::GFP」と呼ばれる、図12Cおよび図12Bの2行目に示す同じ構築物を使用する。ただし、本実施例および対応する図では、構築物を「TobiEPYC1::GFP」ではなく「EPYC1-dGFP」として参照している。
材料と方法
植物素材と生育条件
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, Col-0 background）の種子をコンポストに播き、4℃で3日間層別した後、20℃、周囲CO2、相対湿度70％の環境下で、クールホワイトLEDライト（Percival SE-41AR3cLED, CLF PlantClimatics GmbH, Wertingen, Germany）により200または900μmol photons m -2s-1を供給して，12時間明暗で栽培した。異なる遺伝子型を比較するために、同じ環境条件で栽培された植物から収穫された同一年齢、同一保存歴の種子から植物を栽培した。
S2CrA. thaliana背景株（C. reinhardtii由来のSSUで補完された1a3b Rubisco変異体）は、Atkinsonら（New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）に記載されている。1AAtMOD A. thaliana背景株は、Meyerら（PNAS, 109, 19474-19479, doi:10.1073/pnas.1210993109 (2012)）およびAtkinsonら（New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）に記載されている。
コンストラクトの設計と変換
EPYC1のコード配列は、Atkinsonらと同様に高等植物での発現のためにコドン最適化されたものである（J. Exp. Bot.70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019))。切断された成熟EPYC1を、Plant MoCloシステムのレベル0アクセプターベクターpAGM1299に直接クローニングした（Engler, C. et al. A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants.Acs Synth Biol 3, 839-843, doi:10.1021/sb4001504 (2014))。融合タンパク質を生成するために、遺伝子発現コンストラクトをバイナリのレベル2アクセプターベクターに組み入れた。レベル2ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1）に形質転換し、実施例2に記載したようにフローラルディッピングによりA.thaliana植物に安定的に挿入した。pFAST-R選択カセット（Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528）を用いて、T2世代でホモ接合型トランスジェニック系統およびアジーグス系統を同定した。
デュアルGFP発現用バイナリーベクター（EPYC1-dGFP）の模式図を図16に示す。EPYC1発現カセットの注釈付き全配列は、SEQ ID NO：171に記載されている。
タンパク質の分析
21日齢の植物の凍結した葉材（第6葉および第7葉）から、タンパク質抽出緩衝液（50mM HEPES-KOH pH7.5に17.4%のグリセロール、2%のTriton X-100およびcOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail（Roche, Basel, Switzerland）を加えたもの）で可溶性タンパク質を抽出した。サンプルは、1 x Bolt LDSサンプルバッファー（ThermoFisher Scientific, UK）と200 mM DTTを用いて、70℃で15分間加熱した。抽出液を遠心分離し、上清を12%(w/v)ポリアクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行い、ニトロセルロース膜に転写した。
膜を次のものでプローブした：1:10,000希釈の小麦Rubiscoに対して上げたウサギ血清（Howe, et al,PNAS (1982) 79: 6903-6907）、C. reinhardtii由来のSSU RbcS2（CrRbcS2）（Eurogentec, 205 Southampton, UKによるSSUのC末端領域（KSARDWQPANKRSV (SEQ ID NO: 172)）に対して上げたもの）に対して上げたウサギ血清を1:1,000希釈で、抗アクチン抗体（Proteintech, UKによるbeta Actin Antibody 60008-1-Ig）を1:1,000希釈で、および／または抗EPYC1抗体を1:2,000希釈で使用し（Mackinder, et al,PNAS (2016) 113: 5958-5963 doi:10.1073/pnas.1522866113）、続いてIRDye 800CWヤギ抗ウサギIgG（LI-COR Biotechnology, Cambridge, UK）を1:10,000希釈で使用し、Odyssey CLxイメージングシステム（LI-COR Biotechnology）を用いて視覚化した。
コンデンセート抽出
可溶性タンパク質を上記の「タンパク質分析」の項に記載したように抽出した後、Mackinderら（PNAS 113: 5958-5963 (2016)）と同様に、Miracloth（Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA）でろ過し、4℃で3分間、500gで遠心分離した。ペレットを廃棄し、抽出液を再び12分間遠心分離した。得られたペレットをタンパク質抽出緩衝液で1回洗浄した後、少量の緩衝液に再懸濁し、再び5分間遠心分離した。最後に、ペレットを25μlの抽出バッファーに再懸濁し、後述の共焦点分析またはSDS-PAGE電気泳動に使用した。
成長解析と光合成測定
ロゼットの成長速度は、Dobrescuら（Plant methods 13, 95 (2017)）に記載のイメージングシステムを用いて定量化した。光化学系II（PSII）の最大量子収量（Fv/Fm）は、Hansatech Handy PEA連続励起クロロフィル蛍光計（Hansatech Instruments Ltd, King's 222 Lynn, UK）を用いて、32日目の植物で測定した（Maxwell and Johnson, J Exp Bot 412 51, 659-668 (2000)）。ガス交換とクロロフィル蛍光は、6400-40リーフチャンバーを備えたLI-COR LI-6400（LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA）ポータブル赤外線ガスアナライザーを用いて、200μmol photons m -2s-1の環境下で大型ポットで栽培された35日から45日齢の非開花ロゼットの第6葉または第7葉を用いて、Flexらにおけるようにガス交換測定に十分な葉面積を確保した(New Phytologist 175, 501-511, doi:10.1111/j.1469-8137.2007.02111.x (2007))。細胞間CO2濃度（Ci）に対する正味CO2同化量（A）の応答は、飽和光（1,500μmol photons m -2s-1）の下、50、100、150、200、250、300、350、400、600、800、1000、1200μmol mol CO2で測定した。すべてのガス交換実験において、流量は200μmol mol-1、葉温は25℃に制御し、チャンバー内の相対湿度は約70％に維持した。測定は、純同化作用と気孔コンダクタンスが定常状態に達した後に行った。ガス交換データは、Bellasioら（Plant Cell Environ 39, 1180-1197, doi:10.1111/pce.12560 (2015)）のように、測定チャンバーからのCO2拡散を補正した。以下の表 7に示す平均値±平均の標準誤差（SEM）は、ガス交換変数については35-45日齢のロゼット7個で、Fv/Fmについては32日齢のロゼット12個で行った測定から得られたものである。以下の表7に示すFv/Fm値は、蛍光測定の前に45分間暗順応させた付着葉の値である。
ルビスコの最大カルボキシル化速度（Vcmax）、最大電子輸送速度（Jmax）、ルビスコを基準としたCO2周囲濃度における正味のCO2同化速度（ARubisco）、CO2補償点（Γ）、およびメソフィラのCO2コンダクタンス（細胞間空隙から葉緑体ストロマまでの経路におけるCO2のコンダクタンス、gm）を推定するために、A/CiデータをEthier and Livingston（Plant Cell Environ 27, 137-153, doi:10.1111/j.1365-3040.2004.01140.x (2004)）を用いて、25℃における野生型A.thalianaルビスコの触媒パラメータKc airおよびO2に対する親和性（Ko）の値と、WTおよびS2Cr系統のルビスコ含有量（Atkinson, N. et al. New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414(2017））を求めた。 gmは、Ethier and Livingston（Plant Cell Environ 27, 137-153, doi:10.1111/j.1365-3040.2004.01140.x (2004)）およびDiamos, et al.（Plant Biotech J 16, 1971-1982, doi:10.1111/pbi.12931 (2018)）のように測定した。
共焦点レーザースキャンと超解像イメージ顕微鏡
葉は、Atkinsonら（Plant Biotech J 14, 1302-1315, doi:10.1111/pbi.12497 (2016)）と同様に、Leica TCS SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica Microsystems, Milton Keynes, UK）で画像化した。画像処理は、Leica LAS AF Liteソフトウェアで行った。コンデンセートおよび葉緑体の寸法は、Fiji（ImageJ, v1.52n）を用いて共焦点画像から測定した（Schindelin et al., Nature Methods 9, 676-682, doi:10.1038/nmeth.2019 (2012)）。凝縮液の体積は、球体として計算した。葉緑体の体積は、深さを測定された幅の25％として推定される楕円体として計算された。葉緑体体積は24-102μm3の間で変化し、これはA. thalianaの葉緑体の予想されるサイズ範囲と分布の範囲内であった（Crumpton-Taylorら、Plant Phys 158, 905-916, doi:10.1104/pp.111.186957 (2012)）。比較ピレノイド面積の測定は、Itakuraら（PNAS 116, 18445-18454, doi:10.1073/pnas.1904587116 (2019)）に記載されているように、WT C. reinhardtii細胞（cMJ030）のTEM断面画像にFijiを用いて行った。
構造化照明顕微鏡を用いて超解像画像を取得した。試料は高精度カバーガラス（Zeiss, Jena, Germany）上に作成した。3D SIM画像は、N-SIM (Nikon Instruments, UK)で、100x 1.49NAレンズと屈折率を合わせた浸漬油（Nikon Instruments）を用いて取得した。試料は、Nikon Plan Apo TIRF対物レンズ（NA 1.49，油浸）とAndor DU-897X-5254カメラを用いて、488nmのレーザー光を照射して撮影した。ZスタックのZステップサイズは，メーカーのソフトウェアの要求に従い、0.120μmに設定した。各焦点面について、15枚の画像（5フェーズ、3アングル）をNIS-Elementsソフトウェアで撮影した。SIM画像の処理、再構成、および分析は、NIS-Elements Advanced ResearchソフトウェアのN-SIMモジュールを用いて行った。画像はSIMcheckソフトウェア(http://www.micron.ox.ac.uk/software/SIMCheck.php)を用いてアーティファクトをチェックした。画像は，NiS Elements software v4.6 (Nikon Instruments)を用いて，1μm以上の光学的断面からなるzスタックから再構成した。すべてのSIM画像再構成において、ウィーナーフィルターとアポダイゼーションフィルターのパラメーターは一定にした。
免疫金ラベリングと電子顕微鏡
21日齢のS2Cr植物およびEPYC1-dGFPを発現するS2Crトランスジェニック系統から葉のサンプルを採取し、上記実施例3に記載の方法で固定、調製、および切片化した。ブロックしたグリッドを、1:250希釈のTBSTT中の抗Rubisco抗体または1:50希釈の抗CrRbcS2抗体とともに一晩インキュベートし、TBSTTおよび水でそれぞれ2回洗浄した。TBSTT中の15nm金粒子結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Abcam, Cambridge, UK）とのインキュベーションを、Rubisco標識の場合は1:200希釈、CrRbcS2標識の場合は1:10希釈で1時間実施した後、上記実施例3と同様に洗浄した。染色、表示、および画像収集は、実施例3で上述したように行った。
統計解析
結果は分散分析（ANOVA）を行い、サンプル群間の差の有意性を判定した。ANOVAを行った際には、Tukeyの正直な有意差（HSD）の事後検定を行い、個々の処理間の差を判定した（IBM SPSS Statistics Ver.26.0, Chicago, IL, USA）。
結果
S2Crトランスジェニック植物で発現させたデュアルGFPタグ付きトランケート型EPYC1は、タンパク質分解が少ない。
EPYC1は、残基26（V）と27（A）の間の予測されるトランジットペプチド切断部位に従って切断した（Atkinsonら、J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）。高レベルのEPYC1の発現およびRubiscoとの好ましい化学量論を達成するために、デュアルGFP発現システム（図16）を開発した。これは、2つの遺伝子発現カセットを含むバイナリーベクターからなり、それぞれがA.thaliana葉緑体シグナルペプチドを有する切断型EPYC1をコードし、組換えイベントの変化を減らすために異なるバージョンのGFP（ターボGFP（tGFP）または強化GFP（eGFP））に融合されている。EPYC1発現カセットの注釈付き全配列は、SEQ ID NO: 171に記載されている。
この二重GFP構造体（EPYC1-dGFP）を、WT植物またはC. reinhardtii由来のRubisco SSUで補完したA. thalian 1a3b Rubisco変異体に形質転換した（S2Cr）。その結果、EPYC1::eGFPとEPYC1::tGFPの両方を発現するトランスジェニック植物（3系統、それぞれEp1、Ep2、Ep3と呼ぶ）が得られたが、後者の方が概して高発現であった（図17）。
上記の実施例2およびAtkinsonら（J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）では、S2CrまたはWT植物において他の構築物を用いて発現させた全長EPYC1に対する免疫ブロットは、タンパク質分解を示す追加の低分子量バンドを示した（図8A）。対照的に、成熟したEPYC1を発現させると、EPYC1-dGFPコンストラクトをS2Crで発現させた場合、WT植物と比較して分解産物のレベルが低下した（低分子量バンドで示される）（図17）。
S2Crおよび1AAtMODのA. thalianaバックグラウンドでEPYC1-dGFPを発現させると、葉緑体のストロマにコンデンスが形成された
WT植物のEPYC1-dGFPの蛍光シグナルは、葉緑体全体に均一に分布していた（図18A、上段；図19A、左パネル）。対照的に、ハイブリッドS2Cr植物におけるEPYC1-dGFPは、単一の高密度の葉緑体シグナルのみを示した（図18A、中段、図19A、中段）。透過型電子顕微鏡により、葉緑体ストロマに1つの顕著な凝縮した複合体の存在が確認された（図18B）。凝縮体は球状で、生来のクロロフィル自家蛍光を消しており（図18C-18E）、チラコイド膜マトリックスが凝縮体から除外されていることがわかった。葉の葉肉細胞のプロトプラストでは、各クロロプラストに凝縮物が見え（図18G）、凝縮物の平均サイズはEPYC1-dGFPの発現レベルに関連していた（図17、18H、18J-18L）。
凝縮物の平均直径は1.6±0.1μm（n=126；3つの個別のS2Crトランスジェニック系統から各42個）であり（図18F、18J）、これは、C. reinhardtiiのピレノイドの測定されたサイズ範囲（1.4±0.1μm；n=55）と同等であった（Itakuraら、PNAS 116, 18445-18454, doi:10.1073/pnas.1904587116 (2019)）。凝縮物の推定体積は2.7±0.2μm3（葉緑体体積の約5％）であった（図18K18-L）。個々のS2CrトランスジェニックEp系統内でのコンデンセート体積の変動は、葉緑体体積とは相関しなかった（図18K-18L）ことから、コンデンセートの形成とサイズの制御は、葉緑体の形態とはほぼ無関係であることが示唆された。
EPYC1-dGFPは、C. reinhardtii由来のRubiscoスモールサブユニットからピレノイド形成に必要な2つのαへリックスを含むように改変したA. thaliana3b Rubisco変異体（1AAtMOD）で補完して発現させた場合にもコンデンスが観察された（図18A、下段）。しかし、1AAtMODバックグラウンドのコンデンセートは、パンク性が低く（図19A、右パネル）、これは、酵母ツーハイブリッド実験で観察されたEPYC1に対する改変されたネイティブRubisco SSUの低い親和性と一致した（図2A-2C-、3C、5E）（Atkinsonら、J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）。ハイブリッドルビスコの触媒特性がWTルビスコと区別できない1AAtMOD背景（図18A、19A）での凝縮物形成は、SSUが相分離、ルビスコ含有量および性能を最適化するためにさらにエンジニアリングできることを示した（Atkinsonら、New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
さらに、EPYC1::tGFPまたはEPYC1::eGFP発現カセットのいずれかをA. thalianaのS2Cr背景に個別に形質転換すると、目に見えるコンデンスが形成された（図18I）。
上記実施例2では、A. thalianaの葉緑体においてEPYC1-dGFPの全長（すなわち、非切断型）バリアントを発現させても相分離が起こらなかったが（図7C、Atkinsonら、J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）、これは、発現レベルが低く、EPYC1とRubiscoとの間の化学量論が両立せず、タンパク質分解の可能性があるためであると考えられた。これに対し、本実施例の結果は、コンデンセートの形成が、EPYC1の発現レベルそのものよりも、成熟したEPYC1バリアントの発現に依存している可能性を示している。また、本実施例では、コンデンセート形成に必要なEPYC1とRubiscoの間の化学量論が高等植物において達成可能であることを示した。さらに、本実施例の結果（図17）で観察されたEPYC1のタンパク質分解の見かけの減少は、相分離したコンパートメント内でのEPYC1の隔離によって引き起こされる可能性があり、これらのコンパートメントは、大きなプロテアーゼ複合体にアクセスしにくいという仮説が立てられているからである（van der Hoorn and Rivas, New Phytol 218, 879-881, doi:10.1111/nph.15156 (2018)）。
凝縮物は液体のような特性を示す
EPYC1-dGFPを発現させたA. thalianaのS2Cr葉細胞の凝縮物に対して、光照射後の蛍光回復（FRAP）アッセイを行い、ピレノイドの液体的な挙動と一致する内部混合特性の存在を調べた。コンデンセートは、光退色の20-40秒後に完全な蛍光を回復した（図19B-19C）。これは、A. thalianaの凝縮物中のEPYC1-dGFP分子が、以前のin vitro（Wunderら、Nat Commun 9, 5076, doi:10.1038/s41467-018-07624-w (2018)）およびin alga（Freeman Rosenzweigら、Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）の報告と比較して、同様または増加した速度で混合することを示した。C. reinhardtiiのピレノイドと比較して、トランスジェニックA. thalianaのコンデンセートにおけるより迅速な交換は、S2Cr植物-藻類ハイブリッドルビスコバックグラウンドにおけるルビスコ上のEPYC1結合部位の利用可能性がC. reinhardtiiのそれと比較して相対的に減少していることに起因すると考えられる（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963; Freeman Rosenzweig et al., Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）。一方、ホルムアルデヒドで化学的に架橋された葉の組織のコンデンセートは、フォトブリーチ後に回復が見られず（図19B-19C）、これはC. reinhardtiiのピレノイドで観察されたものと一致していた（Freeman Rosenzweigら、Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）。
さらに、EPYC1-dGFPを発現するS2Cr A. thaliana植物から抽出した凝縮物をin vitroで再懸濁したところ、より大きな液滴に合体した（図20C）。液滴形成は、in vitroでのEPYC1-Rubisco相互作用に関連することが知られている液体のような挙動である（Wunder et al., Nat Commun 9, 5076, doi:10.1038/s41467-018-07624-w (2018)）。
EPYC1-dGFPを発現させたA. thalianaの葉緑体の凝縮部には、EPYC1-dGFPとRubiscoが濃縮されている
ルビスコの存在を調べるために、A. thalianaの葉組織から穏やかな遠心分離によって凝縮物を抽出し、イムノブロットで調べた。EPYC1-dGFPを発現するS2Cr A. thaliana植物から分離した凝縮物（ペレット画分）は、EPYC1-dGFPおよびRubiscoのラージサブユニットとスモールサブユニットの両方に富むことが示された（図20A）。
ルビスコSSUについては、図20Aに示すウエスタンにより、A. thalianaのSSUと比較して、単離されたコンデンセートがC. reinhardtiiのSSUに濃縮されているという定性的な証拠が得られた(すなわち、C. reinhardtiiのSSU(CrRbcS)の増加対A. thalianaのSSU(AtRbcS)の減少)。続いて、変性したゲル分離抽出液のCoomasie染色を行い、S2Crの可溶性タンパク質の総抽出液と凝縮液で濃縮されたペレットとの間の定量的な差異（パーセンテージ）を生成した。これにより、最初の抽出液中のRubiscoのほぼ半分（49％）がC. reinhardtii SSUを含んでいるのに対し、ペレット化された凝縮液中のRubiscoの82％がC. reinhardtii SSUを含んでいることが明らかになった（図20B）。
Coomasie染色と同様に、EPYC1-dGFPを発現させたS2Crの葉緑体のTEM画像を免疫金分析したところ（図20D、 20F）、ルビスコの約半分（54%）が凝縮体に局在していた（高等植物のLSUおよびSSUに特異性の高いポリクローナルルビスコ抗体で評価した場合）、C. reinhardtiiのSSUの81%が凝縮体に局在していた（図20E）。このように、ルビスコの縮合は、C. reinhardtii SSUを持つルビスコ複合体と強く関連しており、A. thaliana S2Crバックグラウンドでは、ルビスコSSUプールの約50%を占めていた（図20A-20B）。後者は、S2Crにおける植物-藻類ハイブリッドルビスコの予想される発現レベルと一致する（Atkinsonら、New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
A. thalianaにおけるEPYC1-dGFPの発現は成長を損なわない
凝縮体の存在が確認された3つのT2 EPYC1-dGFP S2Crトランスジェニック株（Ep1-3）と、それぞれのT2接合体S2Cr株（Az1-3）について、生育の比較を行った。A. thalianaの成長に典型的な光レベル（200μmol photons m -2s-1）（図21A-21B、 21E-21F）と、典型的な光レベルよりも高い光レベル（900μmol photons m -2s-1）（図21C-21D、 21G）の2つの異なる光レベルで培養した後、成長を評価した。これまでの研究では、植物の成長は、200μmol photons m-2 s-1の場合よりも900μmol photons m -2s-1の場合の方がRubisco活性によって制限されることが示されている（Lauererら、Planta 190, 332-345, doi:10.1007/bf00196962 (1993)）。
生育条件にかかわらず、S2Cr形質転換体とその分離株との間で、ロゼットの拡大率やバイオマスの蓄積量に差はなかった（図21A-21G）。同様に、T2 EPYC1-dGFP WT植物（EpWT）は、T2分離株（AzWT）と比較して有意な差を示さなかった（図21A-21G）。S2Cr系統の性能はWT植物と比較してわずかに低下したが（図21A-21E）、これはS2Cr背景のRubisco含量が低下しているためと考えられた（Atkinsonら、New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。S2Cr系統とWT系統の間で観察された成長の違いは、EPYC1の非存在下でS2CrとWT植物について以前に報告されたものと一致していた（Atkinson et al.、New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
A. thalianaにおけるEPYC1-dGFPの発現は光合成を阻害しない
飽和光下での細胞間CO2濃度に対するCO2同化率の応答曲線から得られた光合成パラメータは、EPYC1-dGFPを発現させた系統と接合型の分離系統の間で同様であった（図21H-21K、表7）。凝縮体の存在は、達成可能なRubiscoカルボキシル化の最大速度（Vcmax、図21J、下記表7）に影響を与えなかった。
表7は，A. thalianaのS2CrおよびWTトランスジェニック系統のガス交換および蛍光測定から得られた光合成パラメータを示す。平均値と平均値の標準誤差（SEM）は、ガス交換変数については35日から45日齢の7つのロゼットについて、光化学系IIの最大ポテンシャル量子効率（Fv/Fm）については32日齢の12のロゼットについて示されている。Fv/mFは、蛍光測定の前に45分間暗順応させた付着葉で示した。SEMの後の文字は、ANOVAとTukey's HSD検定により、同一行のデータ間での有意差を示す（P <0.05）。同一行内で同じ文字が続く値は、互いに統計的に有意な差がないことを示す。用語は以下のように略記されている。Vcmaxはルビスコのカルボキシル化の最大速度で、μmol CO2 m-2 s-1で測定、Jmaxは最大電子輸送速度で、μmol e- m-2 s-1で測定）、ΓはCO2補償点で、μmol CO2m-2 s-1で測定し、Ci-Aとして計算、gsは水蒸気に対する気孔コンダクタンスで、mol2HO m-2 s-1で測定、gmはCO2に対するメソフィラコンダクタンス（すなわち、細胞間空隙から葉緑体ストロマまでの経路におけるCO2のコンダクタンス）であり、mol CO2 m-2 s-1で測定される。Fv/mFは光化学系IIの最大ポテンシャル量子効率であり、MLは中光（200μmol photons m -2s-1）下での測定を示す。HLは強光（900μmol photons m -2s-1）下での測定値を示し、Ep1、Ep2、Ep3は、本実施例の他の図に示した3つの同じT2 EPYC1-dGFP S2Cr形質転換体、Az1、Az2、Az3は、Ep1-3のそれぞれの接合分離体、EpWTは、EPYC1-dGFP WT形質転換体、AzWTは、EpWTの接合分離体である。
[表7]
注目すべきは、EPYC1-dGFPを発現させた株と接合体を持つ株のCO2濃度におけるCO2同化率は、ルビスコ量（ARubisco、図21I）で規格化するとWT株と同等であったことである。このことから、WT植物に比べてS2Crの植物と藻類のハイブリッドルビスコのルビスコ回転速度（kcat c）および特異性（SC/O）の既知の緩やかな減少は、光合成CO2同化の効率に軽度の影響しか与えず、観察された成長速度の違いは、S2Cr植物のルビスコのレベル低下により関連していることが示唆された（Atkinsonら、New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
メソフィルコンダクタンス（gm）レベルも、WT植物に比べてすべてのS2Cr系統で低下した（表7）。これは、トランスプラストミックタバコで観察されたルビスコ含有量の低下によるgmへの影響と一致していた（Galmes et al. Photosynth Res 115, 153-166, doi:10.1007/s11120-013-9848-8 (2013))。
また、光化学系IIの最大電子輸送速度（Jmax）と最大ポテンシャル量子効率（Fv/Fm）の測定結果も、形質転換体と分離体の間で区別されなかった（表7）。このように、凝縮体によるチラコイド膜のマトリックスの見かけ上の変位（図18C）は、光合成の光反応の効率に明らかな影響を与えなかった。
本実施例では、EPYC1とSSU上の特定の残基がRubiscoを単一のプロトピレノイド型凝縮体に凝集させるのに十分であり、この凝縮体が植物の成長に明らかな悪影響を及ぼさないことが示された。また、S2Cr遺伝子導入株の光合成性能は、この凝縮体の影響を受けていないことから、高等植物の葉緑体の中は、ピレノイド型の凝縮体が存在するのに適した環境であることが示唆された。このデータは、藻類の生物物理学的炭素濃縮機構（CCM）の構成要素を高等植物に追加して、「完全に組み立てられた」生物物理学的CCMを構築するための基盤となるものである。 今回発表されたデータは、ピレノイドをベースとしたCCMを植物に組み入れるための重要なステップであり、作物の収穫量のポテンシャルを60％以上向上させる可能性がある（McGrath and Long, Plant Phys 164, 2247-2261, doi:10.1104/pp.113.232611 (2014); Long et al. in Sustaining Global Food Security:The Nexus of Science and Policy.(ed R. S. Zeigler) Ch.9, (CSIRO Publishing, 2019); Price et al., Plant Phys 155, 20-26, doi:10.1104/pp.110.164681 (2011))に記載されている。シアノバクテリアのカルボキシソームベースのCCMをエンジニアリングするための以前に記載されたアプローチは、葉緑体にコードされたルビスコラージサブユニットのエンジニアリングを必要とし、このアプローチは、小麦や米などの主要な穀物作物では現在実行不可能である（Long et al., Nat Commun 9, doi:Artn 3570 10.1038/S41467-018-06044-0 (2018)）。本実施例の結果は、遺伝子改変の可能性が格段に高い核内コードのSSUを改変することで、Rubiscoの縮合を実現できることを示した。
（実施例5）TobiEPYC1は、N. benthamianaの葉緑体において、Rubiscoをピレノイド様構造に安定的に会合させる。
以下の実施例では、TobiEPYC1 N. benthamiana株における葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特性評価について説明する。さらに、植物を異なる光レベルの下で成長させたときに、EPYC1凝集体が植物の代謝に与える影響についても説明する。
材料と方法
TobiEPYC1 N. benthamiana株の特性評価のための材料と方法
実施例2、3、および4に記載の材料および方法を用いて、TobiEPYC1 N. benthamiana系統を特徴づける。
TobiEPYC1 N. benthamiana株のEPYC1凝集体の特徴を明らかにした。特に、凝集体中に存在するルビスコの種類（すなわち、ネイティブSSUに対するC. reinhardtii SSUの比率）を特徴づける。さらに、凝集体の液体-液体のような挙動が特徴的である（例えば、FRAP分析を使用する）。さらに、凝集体の物理的特性（例えば、形状／アーキテクチャ／密度）が特徴付けられる（例えば、TEM／CryoEMによる）。さらに、凝集体が単離され、単離された凝集体において、EPYC1の切断／分解が特徴づけられ、Rubiscoの含有量および活性が測定される。実施例2で説明したBiFC実験は、TobiEPYC1株の特性評価にも用いられる。実施例2で使用したBiFCシステムの代わりに、三分割GFPに基づくより厳格なシステム（Liuら、2018 Plant Journal）を使用する。
EPYC1凝集体の影響は、中程度の光レベルと高（すなわちルビスコ制限）の光レベルで育てたTobiEPYC1 N. benthamiana系統の植物で特徴づけられる。具体的には、葉面積、新鮮重量、乾燥重量を測定する。さらに、クロロフィル含量、タンパク質含量、および総ルビスコ含量が測定される。さらに、光合成パラメータは、蛍光（例えば、Fv／Fm）およびガス交換分析（例えば、A：Ci曲線）を用いて測定される。ガス交換と蛍光はLICOR 6400を用いて行う。
結果
イムノゴールドおよび／または蛍光共局在化のデータは、EPYC1の葉緑体の集合体におけるRubiscoの存在を示すだろう。
免疫金および/または蛍光共焦点データは、葉緑体のRubisco凝集体と間質全体のRubisco凝集体の相対的な分布を推定し、葉緑体に多くのRubisco凝集体があることを示す。
蛍光局在データは、TobiEPYC1をRubisco SSU（例えば、C. reinhardtii RbcS2全体、C. reinhardtii α-ヘリックスを有する改変A. thaliana SSU、C. reinhardtii α-ヘリックスおよびβ-シートを有する改変A. thaliana SSU、C. reinhardtii α-ヘリックス、β-シートおよびβA-βBループを有する改変A. thaliana SSUなどで補完されたA. thaliana SSU変異体バックグラウンド）の異なる組み合わせを持つ高等植物で発現させたときに、凝集体が形成されることを示す。
イムノブロットデータは、TobiEPYC1およびTobiEPYC1::GFPが高等植物で発現したときに安定していることを示すだろう。
高等植物の葉緑体では、蛍光タグ付きのEPYC1とRubiscoが凝集体の中で液体のように混合していることが、FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）データによって示される。
植物の成長データ（新鮮重量、乾燥重量、ロゼット面積など）を見ると、Rubiscoが凝集した植物の成長は、形質転換されていない植物と同等であることがわかる。クロロフィル量、タンパク質量、総ルビスコ量も、形質転換していない植物と同等になる。
光合成の測定（Fv/mF、A:Ci曲線など）により、凝集したRubiscoを持つ植物が、形質転換していない植物と同等の効率で光合成を行うことが示される。
生化学的データ（例えば、単離された凝集体から得られたデータ）は、凝集したRubiscoが触媒的に活性であることを示す。さらに、生化学的データは、EPYC1が凝集体中に存在することを示し、凝集体中のEPYC1が切断／分解されていることを特徴づけるだろう。
TEM/cryo-EMデータは、EPYC1凝集体の存在を示し、EPYC1凝集体の物理的特性を明らかにするものである。
（実施例6）ピレノイド様のEPYC1-Rubisco凝集体を葉緑体の間質に発現するように、他の様々な高等植物を設計する。
以下の例では、TobiEPYC1ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、およびタバコの系統における葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特徴付けについて説明する。さらに、以下の例では、TobiEPYC1ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、およびタバコの系統における葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特徴付けについて説明する。
材料と方法
EPYC1-Rubisco凝集体を持つ作物のエンジニアリングに関連する材料と方法
実施例3、4、5の中で最も有望なコンストラクトを用いて、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、タバコ（N. tabacum, Petite Havana）でEPYC1を発現させるためのコンストラクトを設計する。葉緑体シグナルペプチドの種特異的な最適化は必要に応じて行われる。また、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、タバコの内因性SSUは、（CRISPRノックアウト法などを用いて）減少させている。C. reinhardtii SSUまたはC. reinhardtii SSUモチーフを有する改変された内在性SSUが導入される。核変換アプローチを用いて植物を形質転換する。
形質転換された植物株は、実施例3-4に記載されているように特徴づけられる。
結果
TobiEPYC1をササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、タバコに形質転換し、その後のイムノブロットデータにより、生成された系統がEPYC1を安定的に発現できることが示される。
上記系統のイムノゴールド顕微鏡／その他の凝集体検出法により、葉緑体ストロマでEPYC1とRubiscoの凝集体を形成していることがわかる。
植物の成長データ（新鮮重量、乾燥重量、収量など）を見ると、Rubiscoが凝集した植物の成長は、形質転換されていない植物と同等であることがわかる。クロロフィル含量、タンパク質含量、総ルビスコ含量についても、形質転換していない植物と同等の結果が得られる。
光合成の測定（Fv/Fm、A:Ci曲線など）により、凝集したRubiscoを持つ植物が、形質転換していない植物と同等の効率で光合成を行うことが示される。
関連出願の相互参照
本出願は、2019年8月2日に出願された英国特許出願第1911068.3号の優先権を主張するものであり、この先の出願の開示全体をここに参照のために取り込む。
ASCIIテキストファイルとしてのシーケンスリストの提出
ASCIIテキストファイルに関する以下の提出物の内容は、参照によりその全体をここに参照のために取り込む：配列表のコンピュータ可読形式（CRF）（ファイル名：794542000841SEQLIST.TXT、記録日：2020年7月15日、サイズ：175 KB）。
本開示は、遺伝子改変（変形）植物に関する。特に、本開示は、改変ルビスコとEPYC1ポリペプチドの凝集体の形成のための改変ルビスコ及び改変必須ピレノイド成分１（EPYC1）を有する遺伝子改変植物に関する。
シアノバクテリア、藻類、及びツノゴケ類と呼ばれる陸上植物の群を含むいくつかの光合成生物は、リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）周辺のCO2濃度をアクティブに増加させる生物物理学的CO2濃縮メカニズム（CCM）を進化させた。ルビスコはCO2に対する親和性が比較的低く、また回転率が遅いため、CCMはルビスコの効率を向上させる。藻類のCCMは、原形質膜と葉緑体エンベロープにおける無機炭素（Ci）トランスポーターで構成されており、これらが連携して、葉緑体内の液体のような細胞小器官であるピレノイド内のルビスコに周囲濃度を超えるCO2を供給する。
イネ、コムギ、及びダイズなどの主食作物を含む高等植物におけるCO2同化の最も一般的な形態は、C3光合成である。C3光合成では、葉緑体へのCO2供給が受動拡散によって起こり、これが光合成効率を制限する。さらに、ルビスコ（光呼吸）によって触媒されるO2との競合的副反応は、C3植物で最大50％の生産性の損失をもたらす可能性があると推定されている（South, et al., JIPB (2018) 60: 1217-1230）。藻類のCCMメカニズムを高等植物に移すことは、広範な形態学的又は遺伝的変化を必要とせずに、C3光合成の非効率性の多くに対処するであろう。実際、藻類のCCMの主要成分は、高等植物に正しく局在することが示されている（Atkinson, et al., Plant Biotech. J. (2016) 14: 1302-1315）。
CO2がCCMに効果的に濃縮されるために、ルビスコが凝集される必要がある。コナミドリムシ（緑藻クラミドモナス、Chlamydomonas reinhardtii）のピレノイドには、ピレノイド中のルビスコを凝集させるように作用するルビスコリンカータンパク質である必須ピレノイド成分1（EPYC1）が含まれる（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）。コナミドリムシ（C. reinhardtii）からのルビスコ及びEPYC1は、ピレノイドの液液相分離特性を誘発するために必要かつ十分であることが示されている（Wunder, et al., Nat. Commun. (2018) 9: 5076）。コナミドリムシのルビスコ小サブユニット（ルビスコスモールサブユニット）（SSU、rbcS核遺伝子ファミリーによってコードされる）は、SSUが著しく欠損しているシロイヌナズナ（A.thaliana）変異体を補完することができる（Atkinson, et al., New Phyt. (2017) 214: 655-667）。コナミドリムシSSUを発現する植物は、高等植物のルビスコ大サブユニット（ルビスコラージサブユニット）（LSU）及びコナミドリムシのルビスコSSUを含むハイブリッドルビスコを組み立てることができ、このハイブリッドルビスコは、内因性シロイヌナズナルビスコと比較してルビスコ機能がわずかに損なわれているだけである。さらに、ハイブリッドルビスコを有する植物は、野生型植物に匹敵する植物成長を示す。さらに、ハイブリッドルビスコを有する植物は、シロイヌナズナSSUで補完された重度のSSU欠損シロイヌナズナ変異体と同様の全体的なルビスコレベルを有する。対照的に、タバコのルビスコをシアノバクテリアのルビスコに置換すると、CO2に対するシアノバクテリアのルビスコの親和性が低く、発現レベルが低いため、非常に高いCO2濃度で成長した場合でも、成長の遅いトランスプラストミック植物が生産された（Lin, et al., Nature (2014) 513: 547-550；Occhialini, et al., Plant J. (2016) 85: 148-160；Long, et al., Nat. Commun. (2018) 9: 3570）。
ハイブリッドルビスコを有するように植物を操作することの成功にもかかわらず、高等植物においてルビスコを凝集させる試みは成功していない。以前にテストされた藻類のCCMコンポーネントとは異なり、コナミドリムシEPYC1は、高等植物で発現した場合、葉緑体に局在することができなかった。さらに、ハイブリッドルビスコを有する植物でEPYC1を発現させた場合、凝集体は観察されなかった。高等植物の葉緑体標的ペプチドをEPYC1に添加すると、正しく局在化したEPYC1が得らたが、EPYC1が葉緑体に局在化した場合でも、ルビスコ凝集体は観察されなかった。
驚くべきことに、内因性EPYC1リーダー配列の除去及びこのリーダー配列をよりよく処理された異種リーダー配列で置換することは、高等植物において観察可能なEPYC1凝集体をもたらすことが見出された。ダブルターミネーターの使用などの追加的改変によるEPYC1の発現の増加は、EPYC1凝集体をさらに改善した。さらに、驚くべきことに、コナミドリムシのルビスコSSUαヘリックス、及び任意でβシート及びβA-βBループが必要且つ高等植物でEPYC1凝集体を観察するために十分であることがわかった。本発明者らによって同定された、驚くべき新規の改変EPYC1、及び必要なコナミドリムシのルビスコSSU構造モチーフは、本開示の多くの態様及びそれらの様々な実施形態の基礎として役立つ。
本開示の一態様は、改変ルビスコと必須ピレノイド成分1（EPYC1）ポリペプチドの凝集体を形成するための改変ルビスコを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。この態様の追加の実施形態は、藻類のルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチドである前記改変ルビスコ、又は前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記遺伝子改変高等植物又はその一部は、前記EPYC1ポリペプチド及び前記凝集体をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、又は液液相分離アッセイによって検出可能な前記凝集体を含む。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、内因性ルビスコSSUポリペプチドを含む前記改変高等植物のルビスコポリペプチドを含む。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態において、前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、１つ以上の高等植物のルビスコSSUαヘリックスを１つ以上の藻類のルビスコSSUαヘリックスと置換することによって；１つ以上の高等植物のルビスコSSUβストランドを１つ以上の藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって；及び／又は、高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、改変された。この態様の追加の実施形態は、２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスを２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって改変された前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号1のアミノ酸23～35及びアミノ酸80～93に対応する２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックス、並びに配列番号2のアミノ酸23～35及びアミノ酸86～99に対応する２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスを含む。２つの高等植物のルビスコSSUα-ヘリックスが２つの藻類のルビスコSSUα-ヘリックスに置換された前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、４つの高等植物のルビスコSSUβストランドを４つの藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって、及び高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、さらに改変される。この態様の追加の実施形態は、配列番号1のアミノ酸39～45、アミノ酸68～70、アミノ酸98～105及びアミノ酸110～118に対応する４つの高等植物のルビスコSSUβストランド、配列番号2のアミノ酸39～45、アミノ酸74～76、アミノ酸104～111及びアミノ酸116～124に対応する４つの藻類のルビスコSSUβストランド、配列番号1のアミノ酸46～67に対応する前記高等植物のルビスコSSUβA-βBループ、並びに配列番号2のアミノ酸46～73に対応する藻類のルビスコSSUβA-βBループを含む。
改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有する高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有する藻類のルビスコSSUポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態では、前記藻類のルビスコSSUポリペプチドは配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164である。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、改変されていない高等植物のルビスコSSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対して増加した親和性を有する改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。
本開示の追加の態様は、改変ルビスコスとEPYC1ポリペプチドの凝集体を形成するためのEPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。前述の態様のいずれかのさらなる実施形態は、藻類EPYC1ポリペプチドであるEPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記藻類EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態では、前記藻類EPYC1ポリペプチドは、配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167である。前述の態様のいずれかのさらに別の実施形態は、改変EPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらなる実施形態は、第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、前記第１藻類EPYC1リピート領域の４つのタンデムコピー又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。第１藻類EPYC1リピート領域のタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドを含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号36に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記第１藻類EPYC1リピート領域を含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号36である前記第１藻類EPYC1リピート領域を含む。改変EPYC1を含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記天然EPYC1リーダー配列なしで発現される、及び／又はC末端キャップを含む、改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号42に対して少なくとも少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む前記天然EPYC1リーダー配列、及び配列番号41に対して少なくとも少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む前記C末端キャップを含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号41である前記C末端キャップを含む。改変EPYC1を含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、対応する非改変EPYC1ポリペプチドと比較してルビスコSSUポリペプチドに対して増加した親和性を有する前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記凝集体は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在化する。この態様のさらなる実施形態は、葉の葉肉細胞である前記植物細胞を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記植物は、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、又は他のC3作物植物の群から選択される。
本開示のさらなる態様は、EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列及び改変ルビスコをコードする第２核酸配列を含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。この態様の追加の実施形態は、第１プロモーターに操作可能に連結されている前記第１核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される前記第１プロモーターを含む。この態様のさらに別の実施形態は、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである前記第１プロモーターを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３の核酸配列に操作可能に連結されている前記第１核酸配列を含む、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない。この態様の追加の実施形態は、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号63である前記葉緑体輸送ペプチドを含む。天然EPYC1リーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記天然EPYC1リーダー配列は、配列番号65のヌクレオチド60～137に対応する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第１核酸配列は、１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様のさらなる実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される前記１つ又は２つのターミネーターを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態では、前記第２プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この態様の追加の実施形態において、前記第２プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第２核酸配列は藻類のルビスコSSUポリペプチドをコードする。この態様の追加の実施形態では、前記第２核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている、及び前記第２核酸配列は、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードせず、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない。この態様のさらなる実施形態において、前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この態様のさらに別の実施形態において、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号64である。天然藻類SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記天然の藻類SSUリーダー配列は、配列番号32のアミノ酸1から45に対応する。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記第２核酸配列はターミネーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、又はアクチンターミネーターの群から選択される。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第２核酸配列は、改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである前記ルビスコSSUポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、ルビスコポリペプチドとEPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物又はその一部の少なくとも１つの細胞を含む。この態様のさらなる実施形態は、少なくとも１つの植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在化した前記凝集体を含む。この態様の追加の実施形態は、葉の葉肉細胞である植物細胞を含む。ルビスコポリペプチドとEPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物又はその一部を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記凝集体は、共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、又は液液相分離アッセイによって検出可能である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記植物は、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、又は他のC3作物植物の群から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの前記植物又は植物部分から生産された遺伝子改変高等植物細胞を含む。
本開示の別の態様は、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変高等植物を生産する方法を含む、前記方法は、：ａ）EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入すること；ｂ）前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片を遺伝子改変小植物に再生すること；及び、ｃ）前記遺伝子改変小植物を、EPYC1ポリペプチドをコードする前記第１核酸を有する遺伝子改変植物に成長させること、を含む。この態様の追加の実施形態は、改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする第２核酸配列を、ステップ（ａ）の前に、又はステップ（ａ）と同時に、植物細胞、組織、又は他の外植片に導入することをさらに含む、ここで、ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物は、前記改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする前記第２核酸をさらに含む。この態様の追加の実施形態はさらに、：ステップ（ｂ）の前に前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片をスクリーニング又は選択することによって、前記第１核酸配列、及び任意選択で前記第２核酸配列の成功した導入を特定すること；ステップ（ｂ）と（ｃ）の間で小植物をスクリーニング又は選択すること；又は、ステップ（ｃ）の後で植物をスクリーニング又は選択すること、を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、粒子衝撃（すなわち、微粒子銃、遺伝子銃）、アグロバクテリウム媒介形質転換、根粒菌媒介形質転換、若しくはプロトプラストトランスフェクション又は形質転換の群から選択される形質転換法を使用して形質転換が行われる。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、第１ベクターで導入されている前記第１核酸配列、及び第２ベクターで導入されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態では、前記第１核酸配列は、第１プロモーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記第１プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この態様のさらに別の実施形態では、前記第１プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第１核酸配列は、高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、前記第１核酸配列は、前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に機能的に連結されていない。この態様のさらに別の実施形態において、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この態様のさらに別の実施形態では、前記内因性葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63である。天然EPYC1リーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する前記天然EPYC1リーダー配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態において、前記第１核酸配列は、１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記１つ又は２つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態は、第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される前記第２プロモーターを含む。この態様のさらに別の実施形態は、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群より選択される構成的プロモーターである前記第２プロモーターを含む。第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、藻類SSUポリペプチドをコードする前記第２核酸配列を含む。この態様の追加の実施形態は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む、前記第２核酸配列は前記天然SSUリーダー配列をコードせず、前記天然SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない。この態様のさらなる実施形態は、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号64である前記葉緑体輸送ペプチドを含む。天然SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態は、配列番号32のアミノ酸1から45に対応する前記天然SSUリーダー配列を含む。第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、ターミネーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、又はアクチンターミネーターの群から選択される前記ターミネーターを含む。第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態において、前記第２核酸配列は、改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。
第２ベクターを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態では、前記第２ベクターは、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結された核ゲノム配列を標的とする１つ以上の遺伝子編集成分を含む。この態様のさらなる実施形態は、前記核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体；TALENタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記TALENタンパク質は前記核ゲノム配列を標的とする；ZFNタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記ZFNタンパク質は前記核ゲノム配列を標的とする；オリゴヌクレオチドドナー（ODN）、ここで、前記ODNは前記核ゲノム配列を標的とする；又は、CRISPR／Cas酵素コード配列及び標的配列を含むベクター、ここで、前記標的配列は前記核ゲノム配列を標的とする、の群から選択される１つ以上の遺伝子編集成分を含む。遺伝子編集を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換される遺伝子編集の結果を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである前記ルビスコSSUポリペプチドを含む。
前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３の核酸配列に操作可能に連結されている第１核酸配列を有する、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、及び１つ又は２つのターミネーターに動作可能に連結されている前記第１核酸配列を有する、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記第１核酸配列の第１のコピーを含む第１ベクターを含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に動作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は、前記第１プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は、１つのターミネーターに操作可能に連結されている；及びここで、前記第１ベクターは、前記第１核酸配列の第２コピーをさらに含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は、第３プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される第１プロモーターを含む；ここで、前記第３プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される；及びここで、前記第１プロモーター及び前記第３プロモーターは同一ではない。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する前記天然EPYC1リーダー配列を含む。この態様の追加の実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される前記ターミネーターを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの方法によって生産された植物又は植物部分を含む。
本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物を栽培する方法を含む、前記方法は、：ａ）遺伝子改変実生、遺伝子改変小植物、遺伝子改変切穂、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、又は遺伝子改変種子を土壌に植えて、遺伝子改変植物を生産するか、又は前記遺伝子改変実生、前記遺伝子改変小植物、又は前記遺伝子改変切穂を台木又は土壌で育てられた第２の植物に接ぎ木して、前記遺伝子改変植物を生産すること；ｂ）前記植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を生産すること；及び、前記収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果物、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を収穫すること、並びにｃ）前記収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を収穫すること、を含む。
＜実施形態の列挙＞
１．必須ピレノイド成分1（EPYC1）ポリペプチドと改変ルビスコの凝集体を形成するための改変ルビスコを含む遺伝子改変高等植物又はその一部、ここで、前記改変ルビスコは、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド又は改変高等植物ルビスコSSUポリペプチドを含む、ここで、前記高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。
２．前記EPYC1ポリペプチド及び前記凝集体をさらに含む、実施形態１の植物又はその一部。
３．前記藻類のルビスコSSUポリペプチドを含む改変ルビスコは、非改変ルビスコと比較して、前記EPYC1ポリペプチドに対して増加した親和性を有する、実施形態１の植物又はその一部。
４．前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、１つ以上の高等植物のルビスコSSUαヘリックスを１つ以上の藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換すること；１つ以上の高等植物のルビスコSSUβストランドを１つ以上の藻類のルビスコSSUβストランドに置換すること；及び／又は、高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換すること、によって改変された、実施形態１の植物又はその一部。
５．前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、非改変されていない高等植物のルビスコSSUポリペプチドと比較して、前記EPYC1ポリペプチドに対して増加した親和性を有する、実施形態１の植物又はその一部。
６．前記EPYC1ポリペプチドと改変ルビスコスの凝集体を形成するためのEPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部。
７．前記EPYC1ポリペプチドは藻類EPYC1ポリペプチドである、又は第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドである、実施形態６の植物又はその一部。
８．前記藻類EPYC1ポリペプチドは、トランケート成熟型EPYC1ポリペプチドである、実施形態７の植物又はその一部。
９．前記トランケート成熟型EPYC1ポリペプチドは、非トランケート型EPYC1ポリペプチドと比較して、前記改変ルビスコスに対して増加した親和性を有する、実施形態８の植物又はその一部。
１０．前記改変EPYC1ポリペプチドは、前記天然EPYC1リーダー配列なしで発現される、及び／又はC末端キャップを含む、実施形態７の植物又はその一部。
１１．前記改変EPYC1ポリペプチドは、対応する非改変EPYC1ポリペプチドと比較して、前記改変ルビスコスに対して増加した親和性を有する、実施形態１０の植物又はその一部。
１２．前記凝集体は植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在する、及びここで、前記植物細胞は葉葉肉細胞である、実施形態６の植物又はその一部。
１３．EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列、及び改変ルビスコポリペプチドをコードする第２核酸配列を含む、遺伝子改変高等植物又はその一部。
１４．前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダーを含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、及びここで、前記第２核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第２核酸配列は、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードせず、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない、実施形態１３の植物又はその一部。
１５．前記EPYC1ポリペプチドは、トランケート成熟型EPYC1ポリペプチド、又は第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドである、実施形態１３の植物又はその一部。
１６．前記改変ルビスコポリペプチドは、藻類のルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド又は改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む、実施形態１３の植物又はその一部、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。
１７．前記植物又はその一部は、前記改変ルビスコポリペプチドと前記EPYC1ポリペプチドの凝集体をさらに含む、実施形態１３の植物又はその一部。
１８．実施形態１の前記遺伝子改変高等植物を生産する方法であって、
ａ）EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入すること；
ｂ）前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片を、遺伝子改変小植物に再生すること；及び
ｃ）前記遺伝子改変小植物を、前記EPYC1ポリペプチドをコードする前記第１核酸を有する遺伝子改変植物に成長させること、
を含む前記方法。
１９．前記ステップ（ａ）の前に、又は前記ステップ（ａ）と同時に、改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする第２核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入することをさらに含む、ここで、前記ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物は、前記改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする前記第２核酸をさらに含む、
実施形態１８の方法。
２０．前記第１核酸配列は第１ベクターで導入される、及びここで、前記第１ベクターは前記第１核酸配列の第１コピーを含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は前記第１プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は、１つのターミネーターに操作可能に連結されている；及びここで、前記第１ベクターは、前記第１核酸配列の第２コピーをさらに含む、ここで、前記第１核酸配列は、前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は第３プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は２つのターミネーターに操作可能に連結されている、実施形態１８の方法。
２１．改変ルビスコと必須ピレノイド成分1（EPYC1）ポリペプチドの凝集体を形成するための改変ルビスコを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部。
２２．前記改変ルビスコは藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド又は改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている、実施形態２１の植物又はその一部。
２３．前記EPYC1ポリペプチド及び前記凝集体をさらに含む、実施形態２１又は実施形態２２の植物又はその一部。
２４．前記凝集体は共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、又は液液相分離アッセイによって検出可能である、実施形態２１～２３のいずれか１つの植物又はその一部。
２５．前記改変高等植物のルビスコポリペプチドは、内因性ルビスコSSUポリペプチドを含む、実施形態２２～２４のいずれか１つの植物又はその一部。
２６．前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、１つ以上の高等植物のルビスコSSUαヘリックスを１つ以上の藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって；１つ以上の高等植物のルビスコSSUβストランドを１つ以上の藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって；及び／又は、高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって改変された、実施形態２２～２５のいずれか１つの植物又はその一部。
２７．前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスを２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって改変される、実施形態２６の植物又はその一部。
２８．前記２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスは配列番号1のアミノ酸23～35及びアミノ酸80～93に対応する、及び前記２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスは配列番号2のアミノ酸23～35及びアミノ酸86～99に対応する、実施形態２７の植物又はその一部。
２９．前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、４つの高等植物のルビスコSSUβストランドを４つの藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって、及び高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、さらに改変される、実施形態２７又は実施形態２８の植物又はその一部。
３０．前記４つの高等植物のルビスコSSUβストランドは、配列番号1のアミノ酸39～45、アミノ酸68～70、アミノ酸98～105及びアミノ酸110～118に対応する、前記４つの藻類のルビスコSSUβストランドは、配列番号2のアミノ酸39～45、アミノ酸74～76、アミノ酸104～111及びアミノ酸116～124に対応する、前記高等植物のルビスコSSUβA-βBループは配列番号1のアミノ酸46～67に対応する、並びに前記藻類のルビスコSSUβA-βBループは配列番号2のアミノ酸46～73に対応する、実施形態２９の植物又はその一部。
３１．前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号：149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有していた、実施形態２２～３０のいずれか１つの植物又はその一部。
３２．前記藻類のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有する、実施形態２２～３１のいずれか１つの植物又はその一部。
３３．前記藻類のルビスコSSUポリペプチドは配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164である、実施形態３２の植物又はその一部。
３４．前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、改変されていない前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドと比較して、前記EPYC1ポリペプチドに対して増加した親和性を有する、実施形態２２～３１のいずれか１つの植物又はその一部。
３５．改変ルビスコスと前記EPYC1ポリペプチドの凝集体を形成するためのEPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部。
３６．前記EPYC1ポリペプチドは藻類EPYC1ポリペプチドである、実施形態２１～３５のいずれか１つの植物又はその一部。
３７．前記藻類EPYC1ポリペプチドは、配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３５又は実施形態３６の植物又はその一部。
３８．前記藻類EPYC1ポリペプチドは配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167である、実施形態３７の植物又はその一部。
３９．前記EPYC1ポリペプチドは改変EPYC1ポリペプチドである、実施形態２１～３７のいずれか１つの植物又はその一部。
４０．前記改変EPYC1ポリペプチドは、第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む、実施形態３９の植物又はその一部。
４１．前記改変EPYC1ポリペプチドは、前記第１藻類EPYC1リピート領域の４つのタンデムコピー又は８つのタンデムコピーを含む、実施形態４０の植物又はその一部。
４２．前記第１藻類EPYC1リピート領域は、配列番号36に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態４０又は実施形態４１の植物又はその一部。
４３．前記第１藻類EPYC1リピート領域は配列番号36である、実施形態４２の植物又はその一部。
４４．前記改変EPYC1ポリペプチドは、前記天然EPYC1リーダー配列なしで発現される、及び／又はC末端キャップを含む、実施形態３９～４３のいずれか１つの植物又はその一部。
４５．前記天然EPYC1リーダー配列は、配列番号42に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％配列同一性、少なくとも95％配列同一性、少なくとも96％配列同一性、少なくとも97％配列同一性、少なくとも98％配列同一性、又は少なくとも99％配列同一性を有するポリペプチドを含む、及びここで、前記C末端キャップは、配列番号41に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態４４の植物又はその一部。
４６．前記C末端キャップは配列番号41である、実施形態４５の植物又はその一部。
４７．前記改変EPYC1ポリペプチドは、対応する非改変EPYC1ポリペプチドと比較して、ルビスコSSUポリペプチドに対して増加した親和性を有する、実施形態３９～４６のいずれか１つの植物又はその一部。
４８．前記凝集体は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在する、実施形態２１～４７のいずれか１つの植物又はその一部。
４９．前記植物細胞は葉葉肉細胞である、実施形態４８の植物。
５０．前記植物はササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、ダイズ、コムギ、及び他のC3作物植物からなる群から選択される、実施形態２１～４９のいずれか１つの植物。
５１．EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列及び改変ルビスコをコードする第２核酸配列を含む、遺伝子改変高等植物又はその一部。
５２．前記第１核酸配列は第１プロモーターに操作可能に連結されている、実施形態５１の植物又はその一部。
５３．前記第１プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態５２の植物又はその一部。
５４．前記第１プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態５３の植物又はその一部。
５５．前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、実施形態５１～５４のいずれか１つの植物又はその一部。
５６．前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態５５の植物又はその一部。
５７．前記葉緑体輸送ペプチドは配列番号63である、実施形態５６の植物又はその一部。
５８．前記天然EPYC1リーダー配列は配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する、実施形態５５～５７のいずれか１つの植物又はその一部。
５９．前記第１核酸配列は１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている、実施形態５１～５８のいずれか１つの植物又はその一部。
６０．前記１つ又は２つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５９の植物又はその一部。
６１．前記第２核酸配列は第２プロモーターに操作可能に連結されている、実施形態５１～６０のいずれか１つの植物又はその一部。
６２．前記第２プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態６１の植物又はその一部。
６３．前記第２プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態６２の植物又はその一部。
６４．前記第２核酸配列は藻類のルビスコSSUポリペプチドをコードする、実施形態６１～６３のいずれか１つの植物又はその一部。
６５．前記第２核酸配列は前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第２核酸配列は前記天然藻類SSUリーダー配列をコードせず、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない、実施形態６４の植物又はその一部。
６６．前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態６５の植物又はその一部。
６７．前記葉緑体輸送ペプチドは配列番号64である、実施形態６６の植物又はその一部。
６８．前記天然SSUリーダー配列は配列番号32のアミノ酸1から45に対応する、実施形態６５～６７のいずれか１つの植物又はその一部。
６９．前記第２核酸配列はターミネーターに操作可能に連結されている、実施形態６１～６８のいずれか１つの植物又はその一部。
７０．前記ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、及びアクチンターミネーターからなる群から選択される、実施形態６９の植物又はその一部。
７１．前記第２核酸配列は改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている、実施形態６１～６３のいずれか１つの植物又はその一部。
７２．前記EPYC1ポリペプチドは実施形態３６～４７のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである、実施形態５１～７１のいずれか１つの植物又はその一部。
７３．前記ルビスコSSUポリペプチドは実施形態２５～３４のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである、実施形態５１～７２のいずれか１つの植物又はその一部。
７４．前記植物又はその一部の少なくとも１つの細胞は、ルビスコポリペプチドとEPYC1ポリペプチドの凝集体を含む、実施形態５１～７３のいずれか１つの植物又はその一部。
７５．前記凝集体は、少なくとも１つの植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在化する、実施形態７４の植物又はその一部。
７６．前記植物細胞は葉葉肉細胞である、実施形態７５の植物。
７７．前記凝集体は共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、又は液液相分離アッセイによって検出可能である、実施形態７４～７６のいずれか１つの植物
７８．前記植物はササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、及び他のC3作物植物からなる群から選択される、実施形態７１～７７のいずれか１つの植物。
７９．実施形態２１～７８のいずれか１つの植物又は植物部分から得られる遺伝子改変高等植物細胞。
８０．実施形態２１～７９のいずれか１つの遺伝子改変高等植物を生産する方法であって、
ｄ）EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入すること；
ｅ）前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片を、遺伝子改変小植物に再生すること；及び
ｆ）前記遺伝子改変小植物を、前記EPYC1ポリペプチドをコードする前記第１核酸を有する遺伝子改変植物に成長させること、
を含む、前記方法。
８１．ステップ（ａ）の前に、又はステップ（ａ）と同時に、改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする第２核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入することをさらに含む、ここで、前記ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物は、前記改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする前記第２核酸をさらに含む、実施形態８０の方法。
８２．ステップ（ｂ）の前に、前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片をスクリーニング又は選択することによって、前記第１核酸配列、及び任意選択で前記第２核酸配列の導入の成功を特定すること；ステップ（ｂ）と（ｃ）の間で小植物をスクリーニング又は選択すること；又はステップ（ｃ）の後で植物をスクリーニング又は選択すること、をさらに含む、実施形態８０又は実施形態８１の方法。
８３．粒子衝撃（すなわち、微粒子銃、遺伝子銃）、アグロバクテリウム媒介形質転換、根粒菌媒介形質転換、及びプロトプラストトランスフェクション又は形質転換からなる群から選択される形質転換法を使用して形質転換が行われる、実施形態８０～８２のいずれか１つの方法。
８４．前記第１核酸配列は第１ベクターで導入される、及びここで、前記第２核酸配列は第２ベクターで導入される、実施形態８１～８３のいずれか１つの方法。
８５．前記第１核酸配列は第１プロモーターに操作可能に連結されている、実施形態８４の方法。
８６．前記第１プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態８５の方法。
８７．前記第１プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態８６の方法。
８８．前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、実施形態８０～８７のいずれか１つの方法。
８９．前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態８８の方法。
９０．前記内因性葉緑体輸送ペプチドは配列番号63である、実施形態８９の方法。
９１．前記天然EPYC1リーダー配列は、配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する、実施形態８８～９０のいずれか１つの方法。
９２．前記第１核酸配列は１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている、実施形態８０～９１のいずれか１つの方法。
９３．前記１つ又は２つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態９２の方法。
９４．前記第２核酸配列は第２プロモーターに操作可能に連結されている、実施形態８１～９３のいずれか１つの方法。
９５．前記第２プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、実施形態９４の方法。
９６．前記第２プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、実施形態９５の方法。
９７．前記第２核酸配列は藻類SSUポリペプチドをコードする、実施形態９４～９６のいずれか１つの方法。
９８．前記第２核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている、及びここで、前記第２核酸配列は前記天然藻類SSUリーダー配列をコードせず、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない、実施形態９７の方法。
９９．前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号64に対して少なくとも少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態９８の方法。
１００．前記葉緑体輸送ペプチドは配列番号64である、実施形態９９の方法。
１０１．前記天然藻類SSUリーダー配列は配列番号32のアミノ酸1～45に対応する、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
１０２．前記第２核酸配列はターミネーターに操作可能に連結されている、実施形態９４～１０１のいずれか１つの方法。
１０３．前記ターミネーターはHSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、及びアクチンターミネーターからなる群から選択される、実施形態１０２の方法。
１０４．前記第２核酸配列は、改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている、実施形態９４～９６のいずれか１つの方法。
１０５．前記第２ベクターは、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結された核ゲノム配列を標的とする１つ以上の遺伝子編集成分を含む、実施形態１０４の方法。
１０６．１つ以上の遺伝子編集成分は、核ゲノム配列を標的とするリボヌクレオプロテイン複合体；TALENタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記TALENタンパク質は核ゲノム配列を標的とする；ZFNタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記ZFNタンパク質は核ゲノム配列を標的とする；オリゴヌクレオチドドナー（ODN）、ここで、前記ODNは核ゲノム配列を標的とする；及びCRISPR／Cas酵素コード配列及び標的配列を含むベクター、ここで、前記標的配列は核ゲノム配列を標的とする、からなる群から選択される、実施形態１０５の方法。
１０７．前記遺伝子編集の結果として、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換される、実施形態１０５又は実施形態１０６の方法。
１０８．前記EPYC1ポリペプチドは実施形態３６～４７のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである、実施形態８０～１０７のいずれか１つの方法。
１０９．前記ルビスコSSUポリペプチドは、実施形態２５～３４のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである、実施形態８１～１０８のいずれか１つの方法。
１１０．前記第１ベクターは前記第１核酸配列の第１コピーを含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は、前記第１プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は、１つのターミネーターに操作可能に連結されている；及びここで、前記第１ベクターは、前記第１核酸配列の第２コピーをさらに含む、ここで、前記第１核酸配列は、前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は第３プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は２つのターミネーターに操作可能に連結されている、
実施形態８８又は実施形態９２の方法。
１１１．前記第１プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、ここで、前記第３プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される；及びここで、前記第１プロモーター及び前記第３プロモーターは同一ではない、実施形態１１０の方法。
１１２．前記葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである、実施形態１１１の方法。
１１３．前記天然EPYC1リーダー配列は、配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する、実施形態１１２の方法。
１１４．前記ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１１３の方法。
１１５．実施形態８０～１１４のいずれか１つの方法によって生産された植物又は植物部分。
１１６．実施形態２１～７９及び１１５のいずれか１つの遺伝子改変植物を栽培する方法であって、
ａ）遺伝子改変実生、遺伝子改変小植物、遺伝子改変切穂、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、又は遺伝子改変種子を土壌に植えて前記遺伝子改変植物を生産するか、又は前記遺伝子改変実生、前記遺伝子改変小植物、又は前記遺伝子改変切穂を根茎又は土壌で成長した第２植物に接ぎ木して前記遺伝子改変植物を生産すること；
ｂ）前記植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を生産すること；及び
ｃ）収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を収穫すること、
を含む、前記方法。
本特許又は出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、請求及び必要料金の支払いに応じて特許庁より提供されるであろう。
図１Ａ～１Ｄは、必須ピレノイドコンポーネント1（EPYC1）及びルビスコ小サブユニット（SSU）の構造を示す。図１Ａは、EPYC1の概略図を示しており、４つのリピート領域を、薄い灰色（第１リピート領域）、灰色（第２リピート領域）、濃い灰色（第３のリピート領域）、及び最も濃い灰色（第４リピート領域）で示しており、各リピート領域の予測されるαヘリックスを黒で示し、N末端及びC末端を白で示している。図１Ｂは、整列した４つのリピート領域（薄い灰色（配列番号36）、灰色（配列番号69）、濃い灰色（配列番号70）、及びより濃い灰色（配列番号71）で強調表示されている）並びに、太字及び下線で示された各リピート領域における予測されるαヘリックス（配列番号169、配列番号170）を有するEPYC1（配列番号34）の配列を示す。N末端（配列番号68）及びC末端（配列番号41）を灰色で示しており、26（V）と27（A）の間の葉緑体輸送ペプチドの予測切断部位を黒い矢じりで示す。図１Ｃは、４つのβシート（薄い灰色で表示され、ラベル付けされている）、２つのαヘリックス領域（濃い灰色で表示され、ラベル付けされている）、及び１つのβA-βBループ（上部に灰色で表示され、ラベル付けされている）を有するシロイヌナズナ（1AAt）からのルビスコSSU 1Aの予測モデルを示す。図１Ｄは、成熟したシロイヌナズナSSU 1A（1AAt；配列番号1）及び成熟したコナミドリムシSSU 1（S1Cr；配列番号2）のアミノ酸配列を示しており、αヘリックスが濃い灰色で強調表示されており、βシートは薄い灰色で強調表示されており、βA-βBループは灰色で強調表示されている。２つのコナミドリムシSSU（S1Cr及びS2Cr）の間で異なる４つのアミノ酸は太字で表示されている（図示のS1Crは、これらの位置にT、A、T、及びFを有する、一方でS2Cr（非表示）はこれらの位置にそれぞれS、S、S、及びWを有する）。 図２Ａ～２Ｃは、EPYC1と異なるSSUとの間の相互作用を測定するための酵母ツーハイブリッド（Y2H）実験の結果を示す。図２Ａは、ロイシン（L）及びトリプトファン（W）を欠く酵母合成最小培地（SD培地）（SD-L-W）並びにL、W及びヒスチジン（H）を欠く酵母合成最小培地（SD培地）（SD-L-W-H）におけるY2H相互作用を示す、ここで、相互作用の強さを、阻害剤3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT；10 mMの3-ATでの成長 = 強い相互作用）（EPYC1 = コナミドリムシEPYC1；S1Cr = コナミドリムシSSU1；S2Cr = コナミドリムシSSU2；1AAt = シロイヌナズナSSU1A；及び1AAtMOD = コナミドリムシからの２つのαヘリカル領域を運ぶ改変1AAt）の濃度の増加での成長によって証明する。図２Ｂは、ポジティブコントロール（BD+及びAD+）、ネガティブコントロール（BD-及びAD-）、さまざまなベクターでの対象の遺伝子の発現、及び自己相互作用試験（LSUCr= コナミドリムシルビスコ大サブユニット）を含むY2Hコントロールを示す。図２Ｃは、追加のY2Hコントロールを示す（AtCP12 = シロイヌナズナCP12-2（遺伝子ID：AT3G62410）；CAH3 = コナミドリムシ炭酸脱水酵素3（遺伝子ID：Cre09.g415700.t1.2）；LCIB = コナミドリムシ低CO2誘導性タンパク質B（遺伝子ID：Cre10.g452800.t1.2）；LCIC = コナミドリムシ低CO2誘導性タンパク質C（遺伝子ID：Cre06.g307500.t1.1）；及びLSUAt = シロイヌナズナルビスコ大サブユニット）。図２Ａ～２Ｃについて、BD = 結合ドメイン（すなわち、リストされた遺伝子はpGBKT7ベクターで発現される）、AD = 活性化ドメイン（すなわち、リストされた遺伝子はpGADT7ベクターで発現される）、及びOD = 酵母細胞を播種した細胞密度、600 nmでの光学密度（OD600）で測定。 図３Ａ～３Ｃは、天然及び改変シロイヌナズナSSU、天然及び改変コナミドリムシSSU、並びにそれらのEPYC1との相互作用を示す。図３Ａは、シロイヌナズナ（1AAt（At1g67090）；配列番号1）及びコナミドリムシ（S1Cr（Cre02.g120100.t1.2；配列番号30））からの成熟SSU、並びにS2Cr (Cre02.g120150.t1.2；配列番号2))のペプチド配列のアラインメントを示す。図３Ｂは、ペプチド配列1AAt（At1g67090；配列番号1）、S1Cr（Cre02.g120100.t1.2；配列番号30）及びS2Cr（Cre02.g120150.t1.2；配列番号2）を示し、S1CrとS2Crの間で異なる残基を太字で示す。1AAtの改変バージョン（1AAtMod（βシート）=コナミドリムシβシートに置換されたシロイヌナズナβシート（配列番号23）；1AAtMod（ループ）= コナミドリムシβA-βBループに置換されたシロイヌナズナβA-βBループ（配列番号24）；1AAtMod（βシート及びループ）=コナミドリムシβシート及びコナミドリムシβA-βBループに置換されたシロイヌナズナβシート及びシロイヌナズナβA-βBループ（配列番号：25）；1AAtMod（シロイヌナズナαヘリックス）= コナミドリムシαヘリックスに置換されたαヘリックス（配列番号26）；1AAtMod（αヘリックス及びβシート）= コナミドリムシαヘリックス及びコナミドリムシβシートに置換されたシロイヌナズナαヘリックス及びシロイヌナズナβシート（配列番号27）；1AAtMod（αヘリックス、βシート及びループ）= コナミドリムシαヘリックス、βシート、及びβA-βBループに置換されたシロイヌナズナαヘリックス、βシート、及びβA-βBループ（配列番号28）；植物の形質転換に使用される1AAt-TPを有する1AAtMod（Atkinson et al., 2017）= シロイヌナズナルビスコ小サブユニット1A輸送ペプチドを有する1AAtMod（αヘリックス）（1AAt-TP；下線付き）（配列番号33））、及びS2Cr（植物の形質転換に使用される1AAt-TPを有するS2Cr（Atkinson et al., 2017）= 1AAt-TPを有するS2Cr（下線付き）（配列番号22））を示す。図３Ａ～３Ｂにおいて、シロイヌナズナαヘリックスは最も薄い灰色で強調表示されている（配列番号3、配列番号4）、コナミドリムシαヘリックスは濃い灰色で強調表示されている（配列番号10、配列番号：12）、シロイヌナズナβシートは薄い灰色で強調表示されている（配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8）、コナミドリムシβシートは灰色で強調表示されている（配列番号11、配列番号6、配列番号13、配列番号14）（残基TMW（配列番号6）を有するβシートを除く、これはシロイヌナズナとコナミドリムシとで同一である）、シロイヌナズナβA-βBループは薄い灰色で強調表示されている（配列番号9）、及びコナミドリムシβA-βBループは最も濃い灰色で強調表示されている（配列番号15）。図３Ｃは、異なる濃度の3-ATを使用してEPYC1と1AAtの改変バージョン（1AAtMOD）の間の相互作用強度を測定した、Y2H実験の結果を示す、ここで、異なる1AAtコンポーネント（αヘリックス、βシート、及びβA-βBループ）は、図示されているように、S1Crからのものに置換されている（1AAtMODバージョンのペプチド配列は図３Ｂに示す）。相互作用の強さをヒートマップで示す（右側のキー；成長が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）。２つの生物学的複製を行い、実験をそれぞれ少なくとも２回繰り返した。適切なコントロールを含んで、偽陽性／偽陰性を確実に排除した。 図４Ａ～４Ｋは、コナミドリムシEPYC1の天然バージョン及び改変バージョン、並びにそれらのS1Crとの相互作用を示す。EPYC1の4つのリピート領域は、最も薄い灰色（第１リピート領域）、灰色（第２リピート領域）、濃い灰色（第３リピート領域）、及び最も濃い灰色（第４リピート領域）で強調表示されている。図４Ａ～４Ｂは、完全長天然EPYC1（Cre10.g436550.t1.2；（配列番号34））のペプチド配列、及びN末端からの異なるトランケーションを伴う改変EPYC1を示す。図４Ａにおいて、N-ter = N末端（配列番号68）；N-ter + 1rep = N末端及び第１リピート領域（配列番号43）；N-ter + 2reps = N末端、第１リピート領域及び第２リピート領域（配列番号44）；N-ter + 3reps = N末端、第１リピート領域、第２リピート領域及び第３リピート領域（配列番号45）；並びにN-ter + 4reps = N末端、第１リピート領域、第２リピート領域、第３リピート領域、及び第４リピート領域（配列番号46）である。図４Ｂにおいて、4reps + C-ter / mEPYC1 = 第1リピート領域、第２リピート領域、第３リピート領域、第４リピート領域及びC末端（配列番号47）；3reps + C-ter = 第２リピート領域、第３リピート領域、第４リピート領域及びC末端（配列番号48）；2reps + C-ter = 第３リピート領域、第４リピート領域及びC末端（配列番号49）；1rep + C-ter = 第４リピート領域及びC末端（配列番号50）；並びにC-ter = C末端（配列番号41）である。図４Ｃ～４Ｄは、N末端からの異なるトランケーションを有する天然EPYC1タンパク質及び変異体EPYC1タンパク質の配列を示す（図４Ａ～４Ｂに示すペプチド配列）。図４Ｃは、天然及びトランケート型EPYC1タンパク質のN末端部分の配列を示す。図４Ｄは、天然及びトランケート型EPYC1タンパク質のC末端部分の配列を示す。図４Ｅ～４Ｆは、完全長天然EPYC1（Cre10.g436550.t1.2；配列番号34）、並びにリピート領域がαヘリックスに点突然変異（太字で表示）がある第１リピート領域（EPYC1-α1）、αヘリックスに点突然変異（太字で表示）がある第２リピート領域（EPYC1-α2）、αヘリックスに点突然変異（太字で表示）がある第３リピート領域（EPYC1-α3）、及びαヘリックスに点突然変異（太字で表示）がある第４リピート領域（EPYC1-α4）、の異なる組み合わせに置換された改変EPYC1のペプチド配列を示す。図４Ｅにおいて、EPYC1（Cre10.g436550.t1.2）= 完全長天然EPYC1（配列番号34）；EPYC1-α1 = 第１リピート領域がEPYC1-α1に置換された完全長EPYC1（配列番号51）；EPYC1-α1,2 = 第１リピート領域がEPYC1-α1に置換され、第２リピート領域がEPYC1-α2に置換された完全長EPYC1（配列番号52）；及び、EPYC1-α1,2,3 = 第１リピート領域がEPYC1-α1に置換され、第２リピート領域がEPYC1-α2に置換され、第３リピート領域がEPYC1-α3に置換された完全長EPYC1（配列番号53）である。図４Ｆにおいて、EPYC1-α1,2,3,4 = 第１リピート領域がEPYC1-α1に置換され、第２リピート領域がEPYC1-α2に置換され、第３リピート領域がEPYC1-α3に置換され、第４リピート領域がEPYC1-α4に置換された完全長EPYC1（配列番号54）；EPYC1-α3,4 =第３リピート領域がEPYC1-α3に置換され、第４リピート領域がEPYC1-α4に置換された完全長EPYC1（配列番号55）；及び、EPYC1-α4 = 第４リピート領域がEPYC1-α4に置換された完全長EPYC1（配列番号56）。図４Ｇ～４Ｈは、αヘリックス点突然変異リピート領域によるリピート領域置換を伴う、天然EPYC1タンパク質及び変異体EPYC1タンパク質の配列を示す（図４Ｅ～４Ｆに示すペプチド配列）。図４Ｇは、天然及びトランケート型EPYC1タンパク質のN末端部分の配列を示す。図４Ｈは、天然及びトランケート型EPYC1タンパク質のC末端部分の配列を示す。図４Ｉは、酵母における天然EPYC1及びEPYC1のN末端トランケート改変バージョンの免疫ブロット示す。図４Ｊは、Y2H実験によって測定したS1CrとEPYC1の改変バージョンとの間の相互作用強度を示す（このパネルでテストしたEPYC1の改変バージョンのペプチド配列を、図４Ａ～４Ｂに示す）。図４Ｋは、Y2H実験によって測定したS1CrとEPYC1の追加の改変バージョンとの間の相互作用強度を示す（このパネルでテストしたEPYC1の改変バージョンのペプチド配列を、図４Ｅ～４Ｆに示す）。図４Ｊ～４Ｋにおいて、相互作用の強さをヒートマップで示す（右側のキー；成長が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）、及びEPYC1の４つのリピート領域を、ブロック図の左から右に示す（N末端は白色、第１リピート領域は最も薄い灰色、第２リピート領域は灰色、第３リピート領域は灰色、第４リピート領域は黒色、及びC末端は白色）、αヘリックス点突然変異リピート領域による領域置換をブロック内の黒又は濃い灰色の垂直バーで示す。２つの生物学的複製を行い、実験をそれぞれ少なくとも２回繰り返した。 図５Ａ～５Ｆは、SSUとの相互作用強度を増加させるために行われたEPYC1改変、及びEPYC1改変をテストするための実験からの結果を示す。図５Ａは、第１リピート領域の１、２、４、又は８タンデムリピートのペプチド配列（合成EPYC1 1rep（配列番号36）、合成EPYC1 2reps（配列番号37）、合成EPYC1 4reps（配列番号38）、及び合成EPYC1 8reps（配列番号39））、追加のαヘリックスが挿入された第１リピート領域のペプチド配列（太字及び下線付き）（合成EPYC1 2αヘリックス1rep（配列番号57））、それぞれに追加のαヘリックスが挿入された第１リピート領域の4つのコピー（太字及び下線付き）（合成EPYC1 2αヘリックス 4reps（配列番号58））、並びに第１リピートのαヘリックスに点変異（太字及び大きなフォントで示す）をそれぞれ含む第１リピート領域の３つのバージョン（それぞれ、合成EPYC1改変αヘリックス1rep（配列番号59））、合成EPYC1αヘリックスノックアウトA（配列番号60）、及び合成EPYC1αヘリックスノックアウトB（配列番号61））を示す。図５Ｂ～５Ｄは、異なる数のタンデムリピートを有する天然EPYC1タンパク質及び合成EPYC1タンパク質の配列（図５Ａに示すペプチド配列）を示す。図５Ｂは、天然及び合成EPYC1タンパク質のN末端部分の配列を示す。図５Ｃは、天然及び合成EPYC1タンパク質の中央部分の配列を示す。図５Ｄは、天然及びトランケート型EPYC1タンパク質のC末端部分の配列を示す。図５Ｅは、Y2H実験で測定した、第１リピート領域（最も薄い灰色）及び予測されるαヘリックスに基づくS1CrとEPYC1の合成変異体間の相互作用の強さを示す（αヘリックスは最も濃い灰色、改変αヘリックスは最も薄い灰色、αヘリックスノックアウトＡはより薄い灰色、又はαヘリックスノックアウトＢは薄い灰色でそれぞれ塗りつぶされた垂直バーで示す）（このパネルでテストされたEPYC1の合成変異体のペプチド配列を図５Ａに示す）。相互作用の強さをヒートマップで示す（右側のキー；成長が観察された3-ATの濃度が高いほど、相互作用が強い）。図５Ｆは、PCOILS生物情報学ツールを使用した、EPYC1の第１リピート領域及びEPYC1の第１リピート領域の合成変異体についての予測コイルドコイルドメイン確率を示す。一致する色分けされたアミノ酸配列をグラフの下に示し、野生型配列とは異なる残基を下線付き太字で示す。一番上はEPYC1 1rep（野生型）配列（配列番号36）である；上から２番目はαヘリックスノックアウトＢ配列（配列番号60）である；上から３番目はαヘリックスノックアウトＡ配列（配列番号61）である；上から４番目は改変αヘリックス配列（配列番号59）である；及び、一番下は2αヘリックス配列（配列番号57）である。はめ込みグラフは、完全長EPYC1のコイルドコイルドメイン確率を示す。 図６Ａ～６Ｃは、コナミドリムシからの成熟型EPYC1の免疫沈降及びインタクトタンパク質質量分析を示す。図６Ａは、コナミドリムシ細胞溶解物（入力）、免疫沈降プロセス中の洗浄物（洗浄物）及び溶出された免疫沈降物EPYC1（IP）を含むクーマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。図６Ｂは、EPYC1のエレクトロスプレーイオン化（ESI）電荷状態分布を示す。図６Ｃは、EPYC1のダルトン（Da）でのデコンボリューションされた中性分子量を示す。 図７Ａ～７Ｃは、高等植物でEPYC1を発現するために使用されるバイナリーベクターのマップ、及び高等植物におけるEPYC1発現を示すアッセイ結果を示す。図７Ａは、植物の形質転換に使用される1AAt-TP :: EPYC1（配列番号67）を運ぶバイナリーベクターのマップを示し、シロイヌナズナ小サブユニット1A輸送ペプチド（1AAt-TP）は灰色で示す、EPYC1は薄い灰色で示す、35S構成的プロモーター（35S）及びオクトピンシンターゼターミネーター（ocs）はいずれも灰色で示す、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（oriV）における低コピープラスミドの複製を可能にするプラスミドpVS1からの複製起点を最も薄い灰色で示す、スペクチノマイシン（SmR）に対する耐性を付与するアミノグリコシドアデニリルトランスフェラーゼの発現カセットを最も濃い灰色で示す、高コピー数ColE1 / pMB1 / pBR322 / pUC複製起点（ori）を最も薄い灰色で示す、oriV（trfA）に結合して活性化するトランス作用性複製タンパク質を最も濃い灰色で示す、olesin1プロモーター（Olesin pro）を示すpFAST-R選択カセット（オレオシン1（OLE1、シロイヌナズナ）のコード配列に融合したユーセレオンクアドリカラーの単量体tagRFP）（Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528-667）を白色で示す、olesin1 5'UTR（Olesin 5'UTR）を灰色で示す、改変olesin1遺伝子（Olesin）を最も濃い灰色の点線が付いた最も濃い灰色で示す、蛍光タグ（TagRFP）を最も濃い灰色で示す、olesin1ターミネーター（Olesin term）を白色で示す、T-DNAを植物細胞ゲノムに組み込むために必要な右境界配列（RB T-DNAリピート）を灰色で示す、及びT-DNAを植物細胞ゲノムに組み込むために必要な左側の境界配列（LB T-DNAリピート）を灰色で示す。図７Ｂは、次の構築物のニコチアナベンサミアナにおける一過性発現を示す：1AAt葉緑体輸送ペプチドを有さない緑色蛍光タンパク質（GFP）と融合したEPYC1（EPYC1：：GFP、上段）、1AAt葉緑体輸送ペプチドを有するGFPと融合したEPYC1（1AAt-TP :: EPYC1 :: GFP、中央段）、及びGFPと融合したルビスコのシロイヌナズナ1A小サブユニット（RbcS1A :: GFP、下段）。図７Ｃは、次の構成物のシロイヌナズナでの安定した発現を示す：1AAt葉緑体輸送ペプチドを有さないGFPと融合したEPYC1（EPYC1 :: GFP、上段）、及び1AAt葉緑体輸送ペプチドを有するGFPと融合したEPYC1（1AAt-TP :: EPYC1 :: GFP、下段）。図７Ｂ～７Ｃでは、GFPチャネルを左の列に示し、葉緑素自己蛍光チャネルを中央の列に示し、GFPと葉緑素（クロロフィル）のオーバーレイを右の列に示す、信号の重複を白色で示す、及びスケールバーは10μmを表す。 図８Ａ～８Ｅは、EPYC1を発現する高等植物からのタンパク質発現及び成長データを示す。図８Ａは、次の3つのバックグラウンドで1AAt-TP :: EPYC1を発現するシロイヌナズナ植物系統から抽出されたタンパク質からの1AAt-TP :: EPYC1に対する免疫ブロットを示す：野生型（EPYC1、上段）、S2Crで補完されたルビスコ小サブユニット変異体1a3b変異体（S2Cr_EPYC1、中段）、及び1AAtMODで補完された1a3b（1AAtMOD_EPYC1、下の行）。免疫ブロットは、バックグラウンドごとに３つの独立して形質転換されたホモ接合T3系統（系統（Line）１、系統２、系統３）で、EPYC1を欠くそれらの対応する分離株（分離体）（Seg（セグメント） 1、Seg 2、Seg 3）と比較して、相対的なEPYC1発現レベルを示す。図８Ｂは、図８Ａの系統の植物から３１日目に収穫された植物の新鮮重量及び乾燥重量を示す。バックグラウンド（EPYC1、S2Cr_EPYC1、1AAtMOD_EPYC1）ごとに３つの独立して転換されたホモ接合T3系統（「_1」、「_ 2」、「_ 3」で示す）からのデータを白いバーで表示し、各系統のEPYC1を欠いた対応する分離体からのデータを黒いバーで表示する。値は、１２個のロゼットで行われた測定の平均±標準誤差である、及びアスタリスクは、スチューデントの対応ありt検定（Student's paired sample t-tests）によって決定された転換された系統と分離体の有意差（P <0.05）を示す。図８Ｃは、図８Ａ～８Ｂに記載された９つの形質転換された系統のロゼット成長を示す。ロゼットの成長はmm2単位の面積で測定し、値は16個のロゼットで行われた測定の平均±標準誤差であり、バックグラウンドごとに３つの独立して転換されたホモ接合T3系統（EPYC1、S2Cr_EPYC1、1AAtMOD_EPYC1）からのデータを黒丸で表示し、一方で各系統のEPYC1を欠いた対応する分離体からのデータを、白い円で表示する。図８Ｄは、異なる発現系から抽出されたEPYC1のバンドパターンを比較する免疫ブロットを示す。レーン１は、200mMのDTTを用いたサンプルロード（load）バッファーで抽出されたシロイヌナズナ安定発現系統EPYC1_1からのタンパク質である。レーン２は、プロテアーゼ阻害剤を含む免疫沈降（IP）抽出バッファーで抽出されたEPYC1_1からのタンパク質である。レーン３は、IP抽出バッファーで抽出されたコナミドリムシ（CC-1690m株）からのタンパク質である。レーン４は、酵母溶解バッファーで抽出されたEPYC1 :: GAL4結合ドメインを発現する酵母からのタンパク質である。ブロットは、Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963からの抗EPYC1抗体でプローブした。図８Ｅは、コナミドリムシ（左）及びシロイヌナズナ系統S2Cr_EPYC1（右）におけるルビスコ大サブユニット（LSU；下）に対するEPYC1（上）の存在量のレシオメトリック比較を示す免疫ブロットを示す。レーンごとにロードされた可溶性タンパク質の量を各ブロット上にμgで示す、及び３つの独立生物学的複製をアッセイした。 図９Ａ～９Ｅは、高等植物におけるEPYC1とルビスコとの間の相互作用を特徴付ける方法の結果を示す。図９Ａは、抗EPYC1抗体に架橋されたプロテインＡコーティングされたビーズを使用して実施した、４つの異なるトランスジェニックシロイヌナズナ系統からのEPYC1とのルビスコの共免疫沈降の結果を示す。最上行は、S2Crで補完されて、1AAtTPと融合したEPYC1を発現するルビスコ小サブユニット変異体1a3b変異体からのデータを示す。２行目は、1AAtMODで補完されて、1AAtTPと融合したEPYC1を発現する1a3b変異体からのデータを示す。３行目は、1AAtTPと融合したEPYC1を発現する野生型（WT）植物からのデータを示す。最下行は、EPYC1なしでS2Crで補完された1a3bからのデータを示す。左側のブロット（EPYC1 IP）は、抗EPYC1抗体でプローブした場合の結果（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963より）を示す、一方で右側のブロット（Co-IP）はルビスコ大サブユニット（LSU）に対する抗体でプローブした場合の結果を示す。左から右へのレーン（列）は、入力（入力）、フロースルー（F-T）、４回目の洗浄（洗浄）、及び沸騰溶出（溶出）の結果を示す。ネガティブコントロール（Neg.）の違い：Neg.（*）は、プロテインAビーズ上の抗EPYC1抗体を抗HA抗体に置き換え、IPを以前と同様に継続したコントロールである、Neg.（**）は、プロテインAビーズ上の抗EPYC1抗体を抗体なしに置き換え、IPを以前と同様に継続したコントロールである（両方とも、溶出したサンプルのみを示す）。三重のアスタリスク（***）は、EPYC1（S2Cr）を発現していないコントロール系統を含むすべてのサンプルにおいて抗EPYC1抗体で観察された非特異的バンドを示す。図９Ｂは、C末端でYFPN又はYFPCのいずれかに融合したタンパク質を一時的に発現する３つのニコチアナベンサミアナ系統における二分子蛍光補完アッセイを示す。上段は、YFPNに融合したコナミドリムシルビスコ小サブユニット2（S2Cr）（S2Cr :: YFPN）及びYFPCに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。中段は、YFPNに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPN）及びYFPCに融合したS2Cr（S2Cr :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。下段は、YFPNに融合したコナミドリムシ（1AAtMOD）（1AAtMOD :: YFPN）及びYFPCに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPC）からの2つのαヘリックス領域を運ぶ改変1AAtを発現する植物からのデータを示す。図９Ｃは、C末端でYFPN又はYFPCのいずれかに融合したタンパク質を一時的に発現する３つの追加のニコチアナベンサミアナ系統における二分子蛍光補完アッセイを示す。上段は、YFPNに融合したEPYC1（EPCY1 :: YFPN）及びYFPCに融合した1AAtMOD（1AAtMOD :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。中段は、YFPNに融合したシロイヌナズナSSU 1A（1AAt）（1AAt :: YFPN）及びYFPCに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。下段は、YFPNに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPN）及びYFPCに融合した1AAt（1AAt :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。図９Ｄは、C末端でYFPN又はYFPCのいずれかに融合したタンパク質を一時的に発現する３つのニコチアナベンサミアナ系統におけるネガティブコントロール二分子蛍光補完アッセイを示す。上段は、YFPNに融合したAtCP12（AtCP12 :: YFPN）及びYFPCに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。中段は、YFPNに融合したEPYC1（EPYC1 :: YFPN）及びYFPCに融合したAtCP12（AtCP12 :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。下段は、YFPNに融合したAtCP12（AtCP12 :: YFPN）及びYFPCに融合した1AAt（1AAt :: YFPC）を発現する植物からのデータを示す。図９Ｅは、２つの追加のニコチアナベンサミアナ系統における追加のネガティブコントロール二分子蛍光補完アッセイを示す。上段は、YFPNに融合した1AAt（1AAt :: YFPN）及びYFPCに融合したAtCP12（AtCP12 :: YFPC）を一時的に発現する植物からのデータを示す。下段は、形質転換されていない植物からのデータを示す。図９Ｂ～９Ｄでは、左の列の信号は再構成されたYFP蛍光である、中央の列の信号は葉緑素自己蛍光である、YFPと葉緑素チャネルのオーバーレイは右の列にある、重複する信号は白で示す、及びスケールバー10μmを表す。 図１０Ａ～１０Ｅは、ルビスコ及びEPYC1の混合物のインビトロ相分離データを示す。図１０Ａは、室温で混合してから約３分後における15μMのルビスコ（コナミドリムシ（Cr）、シロイヌナズナ野生型植物（At）、シロイヌナズナS2Cr植物（S2C）から抽出、又はルビスコなし（-））及び10μMのEPYC1（右側に４本のチューブ、左側３本のチューブにはEPYC1を添加せず）を含むチューブの画像を示す。図１０Ｂは、図示されるように、異なる濃度及び比率のEPYC1及びルビスコを含むインビトロサンプルの微分干渉コントラスト（DIC）及び落射蛍光（GFP）顕微鏡画像を示す。EPYC1を含むサンプルの蛍光は、EPYC1 :: GFPが含まれているためである（最終的なEPYC1濃度には0.25μMのEPYC1 :: GFPが含まれる）。左端の２つの列では、ルビスコはコナミドリムシから精製された；中央２つの列では、ルビスコはシロイヌナズナS2Cr植物（S2Cr）から精製された；及び右端の２つの列では、ルビスコは野生型シロイヌナズナ植物（Arabidopsis）から精製された。スケールバーは15μmを表す。図１０Ｃは、15μMの単離されたS2Crルビスコ及び10μMのEPYC1を含むインビトロサンプルにおける液滴融合の経時的顕微鏡画像を示す。最上行は微分干渉コントラスト（DIC）チャネルを示し、最下行は落射蛍光（GFP）チャネルを示す。シリーズの各画像の最初の画像に対する経過時間（秒）を上部に表示している。スケールバーは5μmを表す。図１０Ｄは、40μMのルビスコを含むサンプルのSDS-PAGEによる液滴沈降分析を示す（ルビスコはコナミドリムシ（Cr）、シロイヌナズナS2Cr植物（S2Cr）、又は野生型シロイヌナズナ植物（At）から抽出された；ルビスコなしのサンプルは-で示す）、及びEPYC1の異なるμM濃度を（0μM、3.75μM又は10μM）で示す。図１０Ｅは、15μMのルビスコ（ルビスコはコナミドリムシ（Cr）、シロイヌナズナS2Cr植物（S2Cr）、又は野生型シロイヌナズナ植物（At）から抽出）を含むサンプルのSDS-PAGEによる追加の液滴沈降分析を示す、及びEPYC1の異なるμM濃度を（3.75μM又は10μM）で示す。図１０Ｄ～１０Ｅについて、サンプルは、遠心分離によって回収された、分離されたルビスコとEPYC1の液滴であり、上澄み画分（バルク溶液；S）及び再懸濁されたペレット画分（液滴；P）の両方がゲル上で実行された（Mは左側に沿ってサイズキーがkDaで表示されたマーカーレーンを示す；ルビスコ大サブユニット（LSU）、EPYC1、及びルビスコ小サブユニット（SSU）に対応するバンドの位置を右側に沿って示す）。 図１１Ａ～１１Ｂは、高等植物の葉緑体におけるルビスコの局在化データを示す。 図１１Ａは、EPYC1を発現するシロイヌナズナS2Cr系統の葉緑体におけるルビスコの免疫金標識の透過型電子顕微鏡画像を示す（スケールバーは0.5μm）。図１１Ｂは、EPYC1を含まずS2Crで補完されたシロイヌナズナ1a3b変異植物の葉緑体におけるルビスコの免疫金標識の透過型電子顕微鏡画像を示す（スケールバーは0.5μm）。 図１２Ａ～１２Ｌは、TobiEPYC1遺伝子発現カセット、高等植物においてTobiEPYC1を発現するために使用されるバイナリーベクターのマップ、及びTobiEPYC1を発現する植物及びプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す。図１２Ａは、EPYC1 N末端のトランケート型（TobiEPYC1変異体）を有する天然及び合成EPYC1の変異体のための６つの異なる遺伝子発現カセットを示す。各カセットには、左から右に次のものが含まれる：35Sプロモーター（35sプロ；灰色）；シロイヌナズナルビスコSSU1Aからの57残基の葉緑体シグナルペプチド（SP1A；黒色）；EPYC1のN末端のトランケート型（ラベルなし、最も薄い灰色）；EPYC1リピート領域（第１リピート領域は最も薄い灰色、第２リピート領域は灰色、第３リピート領域は灰色、及び第４リピート領域は黒色）、各リピート領域の予測されるαヘリックス（黒色）；EPYC1 C末端（ラベルなし；最も薄い灰色）；並びにダブルターミネーターHSP（濃い灰色）及びnos（灰色）。カセット２、４及び６はまた、ターミネーターの前にC末端緑色蛍光タンパク質タグ（GFP；薄い灰色）も含む。図１２Ｂは、ベクター内のTobiEPYC1遺伝子発現カセットの配置を示しており、これらは互いに反対を向いている。第１カセット（時計回り）は、キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV pro）、熱ショックタンパク質（シロイヌナズナ）ターミネーター（HSPターミネーター）及びノパリンシンターゼ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）ターミネーター（Nos term）によって駆動される。第２カセット（反時計回り）は、35Sプロモーター（35S prom）及び単一のターミネーター（オクトピンシンターゼターミネーター（OCS term））のみによって駆動される。図１２Ｃは、植物形質転換（配列番号168）に使用される、TobiEPYC1 :: GFP（図１２Ａからのカセット２；図１２Ｂのベクターにおけるカセット２の配置）を運ぶバイナリーベクターのマップを示し、シロイヌナズナルビスコ小サブユニット1A輸送ペプチド（1AAt-TP）を灰色で示す、TobiEPYC1は薄い灰色で示す、35S構成的プロモーター（35S pro）及びCsVMV構成的プロモーター（CsVMV pro）をいずれも白色で示す、6xHAタグを灰色で示す、eGFPを薄い灰色で示す、コドン最適化ターボGFP（tGFP）を濃い灰色の点線を有する最も濃い灰色で示す、HSPターミネーター（HSPターミネーター）を灰色で示す、Nosターミネーター（Nos term）を白で示す、OCSターミネーター（OCS term）を白色で示す、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの低コピープラスミドの複製を可能にするプラスミドpVS1からの複製起点（oriV）を最も薄い灰色で示す、高コピー数ColE1／pMB1／pBR322／pUC複製起点（ori）を最も薄い灰色で示す、カナマイシンに対する耐性（KanR）を付与するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼの発現カセットを元も薄い灰色で示す、シュードモナスプラスミドpVS1からの安定性タンパク質（pVS1 StaA）を最も濃い灰色で示す、プラスミドpVS1からの複製タンパク質（pVS1 RepA）を最も濃い灰色で示す、Olesin 1プロモーター（Olesin pro）を示すpFAST-R選択カセット（オレオシン1のコード配列に融合したユーセレオンクアドリカラーの単量体tagRFP）(OLE1, A. thaliana)（Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528-667）を白色で示す、Olesin 1 5'UTR（Olesin 5'UTR）を灰色で示す、改変olesin1遺伝子（Olesin）を濃い灰色の点線が付いた最も濃い灰色で示す、蛍光タグ（TagRFP）を最も濃い灰色で示す、olesin1ターミネーター（Olesin term）を白色で示す、T-DNAの植物細胞ゲノムへの統合に必要な右境界配列（RB T-DNAリピート）を最も薄い灰色で示す、及びT-DNAの植物細胞ゲノムへの統合に必要な左境界配列（LB T-DNAリピート）を最も薄い灰色で示す。図１２Ｄは、ニコチアナベンサミアナにおけるTobiEPYC1 :: GFPの一過性発現の蛍光顕微鏡画像を示している。（左側はGFPチャネル、ゲイン25及び2％レーザーで撮像；中央は葉緑素自己蛍光チャネル、右側はGFPと葉緑素チャネルのオーバーレイ、重複領域を白で示す）。図１２Ｅは、ニコチアナベンサミアナにおけるTobiEPYC1 :: GFPの一過性発現の蛍光顕微鏡画像を示す（GFPチャネル、ゲイン10及び1％レーザーで撮像）。図１２Ｆは、シロイヌナズナS2Cr系統におけるTobiEPYC1 :: GFPの安定した発現の蛍光顕微鏡画像を示す（左側はGFPチャネル、中央は葉緑素自己蛍光チャネル、右側はGFPと葉緑素チャネルのオーバーレイである、重複領域を白で示す）。図１２Ｇは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現するシロイヌナズナS2Cr系統からのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す（左側はGFPチャネル、左から２番目は葉緑素自己蛍光チャネル、右から２番目は明視野画像、右側はGFP、葉緑素及び明視野のオーバーレイの画像である、重複する蛍光領域を白で示す）。図１２Ｈは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現するシロイヌナズナS2Cr系統からのプロトプラストの別のセットの蛍光顕微鏡画像を示す（左側はGFPチャネル、中央は葉緑素自己蛍光チャネル、右側はGFPと葉緑素チャネルのオーバーレイである）。図１２Ｉは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現するシロイヌナズナS2Cr系統からのプロトプラストの別のセットの蛍光顕微鏡画像を示しており、矢印はTobiEPYC1凝集体の領域を示す（左側はGFPチャネル、中央は葉緑素自己蛍光チャネル、右側はGFPと葉緑素チャネルのオーバーレイである）。図１２Ｊは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現するシロイヌナズナS2Cr系統からのプロトプラストの別のセットの蛍光顕微鏡画像を示す（左側はGFPチャネル、左側から２番目は葉緑素自己蛍光チャネル、右から２番目は明視野画像、右側はGFP、葉緑素及び明視野画像のオーバーレイである）。図１２Ｋは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現するシロイヌナズナ植物から最近破壊されたプロトプラストからの葉緑体を示す、破線の矢印は葉緑体の外側にEPYC1が凝集していることを示す（左側はGFPチャネル、左から２番目は葉緑素自己蛍光チャネル、右から２番目は明視野画像、右側はGFP、葉緑素及び明視野画像のオーバーレイである）。図１２Ｌは、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現する野生型シロイヌナズナからのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像を示す（左側はGFPチャネル、中央は葉緑素自己蛍光チャネル、右側はGFPと葉緑素チャネルのオーバーレイ、重複する蛍光領域を白で示す）。図１２Ｄ～１２Ｌについて、スケールバーは10μmであり、画像は代表的な画像である。 図１３Ａ～１３Ｅは、光退色（FRAP）実験後の蛍光回復の結果を示す。図１３Ａは、シロイヌナズナS2Cr組織（スケールバー = 5μm）のTobiEPYC1 :: GFP凝集体の２つのサンプル（それぞれ上部と下部に表示）の光退色（FRAP）時間経過後の蛍光回復からの画像を示す。左端の画像は、ブリーチイベント（ブリーチ前）前の凝集体を示し、ブリーチ（漂白）前の画像に重ねられた白い円は、ブリーチの対象となった領域を示す。右側の画像は、ブリーチイベント後のさまざまな時点での凝集体を示し、ブリーチ後の経過時間を秒単位で示す（0.6秒、2.6秒、7.4秒、9秒、16秒、及び24秒）。図１３Ｂは、信号が分析された対象円形領域（ROI）を示すオーバーレイを有する撮像時間経過（図１３Ａの時点は0.6秒）からの例示的な画像を示す（上は丸で囲まれたブリーチ領域；下は丸で囲まれた非ブリーチ領域；スケールバーは2.5μm）。図１３Ｃは、図１３Ｂに示すROIのFRAP曲線を示す。時間経過中のROIからの未加工の蛍光シグナル強度（データは図１３Ａの一番上のデータセットに対応）を示し、ブリーチイベントの時間を黒い縦線で示す。ブリーチしたROIからのデータを、灰色でプロットする。ブリーチしていないROIからのデータを、濃い灰色でプロットする。図１３Ｄは、各時点での非ブリーチ信号への正規化後の図１３に示すROIのFRAP曲線を示す（データは図１３Ａの一番上のデータセットに対応）。データは図１３Ｃに示すように陰影が付けられている。図１３Ｅは、TobiEPYC1を安定して発現するシロイヌナズナS2Cr植物からのタンパク質抽出物をプローブするためにα-EPYC1を使用したウエスタンブロットを示す。左端の３つのレーンのそれぞれは、TobiEPYC1遺伝子発現カセット（図１２Ａに示す）を発現する異なる植物（TobiEPYC1 1、TobiEPYC1 2、及びTobiEPYC1 3）からのタンパク質抽出物を含む、左から４番目のレーン及び右のレーンは、TobiEPYC1を発現していないシロイヌナズナS2Cr系統からのタンパク質抽出物を含む、及び右レーンから２番目は、4リピートのTobiEPYC1遺伝子発現カセット（図１２Ａに示す）を発現する植物からのタンパク質抽出物を含む（kDaのタンパク質重量は白でオーバーレイされている；右側の灰色の矢印は、EPYC1に対応するバンドの位置を示す；黒い矢印は非特定のバンドを示す）。 図１４Ａ～１４Ｃは、藻類種オオヒゲマワリ（Volvox carteri）及びゴニウム（Gonium pectorale）からのルビスコSSUを有するコナミドリムシRbcS1のアミノ酸配列を示す。図１４Ａ～１４Ｂは、オオヒゲマワリ由来のルビスコSSUを有するコナミドリムシS1Cr（配列番号30）の配列を示す（配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163）。図１４Ａは、コナミドリムシRbcS1のN末端部分の配列及びオオヒゲマワリルビスコSSUを示す。図１４Ｂは、コナミドリムシRbcS1のC末端部分の配列及びオオヒゲマワリルビスコSSUを示す。図１４Ｃは、オオヒゲマワリSSU（配列番号164）と共にコナミドリムシS1Cr（配列番号30）の配列を示す。図１４Ａ～１４Ｃでは、αヘリックスの配列を太字で示す。 図１５は、藻類種オオヒゲマワリ（配列番号166）、ゴニウム（配列番号167）、及びシアワセモ（配列番号187）からのEPYC1ホモログを有するコナミドリムシEPYC1（配列番号34）のアミノ酸配列を示し、αヘリックスの配列を太字で示す。 図１６は、デュアルGFP発現（EPYC1-dGFP）のためのバイナリーベクターの概略図を示す。このベクターは、反対方向に２つの構成をコードする：C末端でturboGFPに融合したEPYC1（tGFP；左側）、及びC末端で強化されたGFPに融合したEPYC1（eGFP；右側）。両構成において、EPYC1はアミノ酸残基27でトランケートされ（下向きの小さな三角形で表示）、N末端で葉緑体シロイヌナズナルビスコ小サブユニット1A輸送ペプチド（RbcS1A TP）に融合する。EPYC1-tGFP発現は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35Sプロム；左向きの三角形で表示）によって駆動される。EPYC1-eGFPは、キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMVプロム；右向きの三角形で表示）によって駆動される。eGFP発現カセットには、ヒートショックタンパク質ターミネーター（HSP ter）及びノパリンシンターゼターミネーター（nos ter）を含むデュアルターミネーターシステムを使用して発現を増加させた。tGFP発現カセットには、単一のオクトピンシンターゼターミネーター（oc ter）を使用した。 図１７は、シロイヌナズナのトランスジェニック植物及びコントロールにおけるEPYC1タンパク質レベルを示す免疫ブロットを示す。上２つの免疫ブロットは抗EPYC1抗体で作成された。下２つの免疫ブロットは、抗アクチン抗体で作られたローディング（loading）コントロールである。各列には、異なる植物からの可溶性タンパク質抽出物が含まれている。左側の８つの列はすべて、コナミドリムシ（S2Cr）からのSSUで補完されたシロイヌナズナ1a3bルビスコ変異体バックグラウンドのトランスジェニック植物からのものである。右側の２つの列は、野生型バックグラウンド（WT）のトランスジェニック植物のものである。S2Crバックグラウンドでは、EPYC1-dGFPを発現する３つの異なるT2トランスジェニック植物からの抽出物を、それぞれEp1、Ep2、及びEp3とラベル付けされた列に示す。それらの植物の単一セグメント（Azygous segregant）からの抽出物を、それぞれAz1、Az2、及びAz3とラベル付けされた列に示す。EPYC1 :: eGFPのみ又はEPYC1 :: tGFPのみで形質転換されたS2Cr植物からの抽出物を、それぞれeGFP及びtGFPとラベル付けされた列に示す。EpWT及びEpAzとラベル付けされた列は、それぞれT2 EPYC1-dGFPWT形質転換体及び単一セグメントからの抽出物を示す。EPYC1 :: eGFP（63.9 kDa）、EPYC1 :: tGFP（55.4 kDa）、及びアクチンの重量に一致するバンドの位置を右側に沿ってマークする。 図１８Ａ～１８Ｌは、EPYC1を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ葉緑体における凝縮物形成を示す。図１８Ａは、野生型（WT；上段）、コナミドリムシルビスコ小サブユニットで補完された1a3bルビスコ変異体（S2Cr；中段）、及びピレノイド形成に必要な２つのコナミドリムシ小サブユニットαヘリックスを含むように改変された天然シロイヌナズナルビスコ小サブユニットで補完された1a3bルビスコ変異体（1AAtMOD；下段）、の３つの異なるバックグラウンドのシロイヌナズナ植物におけるEPYC1-dGFPの発現の共焦点顕微鏡画像を示す。左の列の画像はGFPチャネルを示す。右の列の画像は、葉緑素自己蛍光を伴うGFPチャネルのオーバーレイを示す。スケールバーは10μmを表す。図１８Ｂは、EPYC1-dGFPで形質転換されていない２１日齢のS2Cr植物の葉緑体（左）及びEPYC1-dGFPを発現する２１日齢のS2Crトランスジェニック系統（右）の透過型電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは0.5μmを表す。矢印は、右側のEPYC1を発現する葉緑体のストローマの凝縮物を指す。図１８Ｃは、EPYC1-dGFPを発現するシロイヌナズナS2Cr葉緑体の共焦点顕微鏡画像の２つのチャネルを示す。左の画像は葉緑素自己蛍光を示す。右の画像は、葉緑素自己蛍光を伴うGFPチャネルのオーバーレイを示す。矢印は、１つの葉緑体の葉緑素自己蛍光の暗いスポットを指しており、EPYC1-dGFPの蓄積部位で葉緑素自己蛍光が減少していることを示している。スケールバーは5μmを表す。図１８Ｄは、EPYC1-dGFPを発現するシロイヌナズナ葉緑体の内部のEPYC1-dGFP凝縮物の超解像構造化照明顕微鏡（SIM）画像のz投影を示す。画像は、GFPと葉緑素自己蛍光チャネルのオーバーレイである。矢印は、高GFPシグナルの円形領域を示す。スケールバーは2μmを表す。図１８Ｅは、深さ（z）寸法を表示するために回転された、図１８Ｄに示すものと同じ葉緑体の３次元投影を示す。画像は、GFPと葉緑素自己蛍光チャネルのオーバーレイである。破線の矢印は、イメージボリュームの相対的なx、y、及びz軸を示す。実線の矢印は、高GFPシグナルの円形領域を示す。スケールバーは1μmを表す。図１８Ｆは、EPYC1-dGFP（左側）を発現するシロイヌナズナS2Cr植物の葉緑体のSIM画像における凝縮物サイズと、コナミドリムシ細胞（右側）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像におけるピレノイドの凝縮物サイズとの例示的な比較を示す。TEM画像のスケールバーは0.5μmを表す。2μmのラベル付きバーは、シロイヌナズナ葉緑体（左側）とコナミドリムシピレノイド（右側）それぞれのGFP発現領域の幅にまたがる。図１８Ｇ～１８Ｈは、EPYC1-dGFPを発現するトランスジェニックシロイヌナズナS2Cr葉組織の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。左側のパネルはGFPチャネルを示す。中央のパネルは葉緑素自己蛍光を示す。右側のパネルは、GFPチャネルと葉緑素チャネルのオーバーレイを示す。図１８Ｇは、単一細胞のzスタックの最大投影を示しており、すべての葉緑体に凝縮物が見られる。スケールバーは5μmを表す。図１８Ｈは、EPYC1-dGFPの異なる発現レベル（図１７に図示）を有するトランスジェニックシロイヌナズナS2Cr系統Ep1-3の画像を示す。スケールバーは10μmを表す。図１８Ｉは、tGFP（EPYC1 :: tGFP；上段）又はeGFP（EPYC1 :: eGFP；下段）のいずれかにC末端で融合したEPYC1の単一EPYC1発現カセットを発現するトランスジェニックシロイヌナズナS2Cr植物における凝縮物の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。左の画像はGFPチャネルを示す。中央の画像は葉緑素自己蛍光を示す。右の画像は、GFPチャネルと葉緑素チャネルのオーバーレイを示す。スケールバーは10μmを表す。図１８Ｊ～１８Ｌは、コナミドリムシピレノイド（n = 55）及び３つのEPYC1-dGFP発現トランスジェニックシロイヌナズナS2Crトランスジェニック系統（Ep1-3；n = 42）の葉緑体の共焦点画像由来のデータの散布図を示す。図１８Ｊは、ピレノイド（コナミドリムシ細胞の場合）又は凝縮物（トランスジェニックシロイヌナズナの場合）の直径をμmで示し、平均直径を太い水平線で示し、平均の標準誤差（SEM）をエラーバーで示す。図１８Ｋは、それぞれの葉緑体のμmで表す推定体積に対してプロットされたμmで表す凝縮物の体積を示し、Ep1～3のそれぞれからのデータを異なる色合いでプロットしている。図１８Ｌは、トランスジェニックシロイヌナズナS2Crトランスジェニック系統Ep1-3（各系統でn = 27葉緑体）の凝縮物が占める葉緑体体積の推定パーセントのプロットを示す。幅広の横棒は各系統の平均値を表し、エラーバーはSEMを表す。 図１９Ａ～１９Ｃは、シロイヌナズナ葉緑体におけるEPYC1-dGFP凝縮物の液液相分離特性の植物内蛍光顕微鏡分析を示す。図１９Ａは、EPYC1-dGFPを発現する２８個のWT（左）、１７個のS2Cr（中央）、及び２２個の1AAtMOD葉緑体の断面にわたるGFP蛍光強度分布プロットを示す。各プロットラインは、異なる葉緑体からのデータを示す。正規化されたGFP蛍光を、y軸に示す。葉緑体を横切る正規化された相対距離を、x軸に示す。図１９Ｂ～１９Ｃは、EPYC1-dGFPを発現するS2Crトランスジェニックシロイヌナズナ系統における光退色（FRAP）アッセイ後の蛍光回復を示す。図１９Ｂは、生きている（上）及び固定された（下）葉組織における凝縮物の代表的なFRAP時間経過におけるGFPチャネルからの静止画像を示す。左端の画像は、ブリーチイベント前のGFP分布を示す。右の画像は、ブリーチイベント後の経時的なGFP分布を示す。ブリーチイベントからの経過時間を、画像の上に秒単位で表示する。スケールバーは1μmを表す。図１９Ｃは、１３～１６個の葉緑体における凝縮物の蛍光回復のプロットを示す。y軸は、非ブリーチ領域からの信号が1（水平の破線）として定義された、非ブリーチ領域に対するブリーチ領域のGFP信号を示す。x軸は経過時間を秒単位で示し、ブリーチイベントの時間を矢印で示す。薄い灰色で示すデータは生きている組織内の凝縮物からのものであり、濃い灰色で示すデータは固定された組織からのものである。実線は各データセットの平均を表し、影付きの領域は平均の標準誤差を表す。 図２０Ａ～２０Ｆは、凝縮液中のタンパク質の局在に関する免疫学的及び分画データを示す。図２０Ａは、全葉組織（入力）に対する抗EPYC1（最上列）、抗ルビスコ大サブユニット（LSU；２列目）、抗ルビスコ小サブユニット（SSU、３列目）及び抗コナミドリムシルビスコ小サブユニット2（CrRbcS2；最下列）免疫ブロット、凝縮液の抽出と遠心分離後の上清（上清）、及び不溶性ペレット（ペレット）を示す。抗SSU及び抗LSU抗体は、コナミドリムシルビスコに対するよりも高等植物ルビスコに対してより高い特異性を持つポリクローナルルビスコ抗体である。列には、EPYC1（WT）を発現しない野生型シロイヌナズナ植物、コナミドリムシルビスコ小サブユニットで補完されてEPYC1（S2Cr）を発現しないシロイヌナズナ1a3bルビスコ変異植物、及びEPYC1-dGFP（S2Cr_EPYC1）を発現するS2Cr植物からのサンプルが含まれる。WTサンプルには、入力のみが表示される。矢印は、コナミドリムシルビスコ小サブユニット2（CrRbcS2；15.5 kD）；シロイヌナズナルビスコ小サブユニット1B、2B、及び3B（AtRbcS1B、AtRbcS2B、及びAtRbcS3B；それぞれ14.8 kD）；及びシロイヌナズナルビスコ小サブユニット1A（AtRbcS1A；14.7kD）の予想分子量に一致するバンドを示す。図２０Ｂは、ペレット化された凝縮物の組成を示すクーマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。列は図２０Ａのようにラベル付けされている。矢印は、EPYC1、EPYC1：eGFP、及びEPY1：tGFPの２つのタグ付きバージョンを示すEPYC1 :: GFPラベルの横にある２つの矢印を有するEPYC1-GFP融合タンパク質（EPYC1 :: GFP）；Rubisco大サブユニット（LSU; 55 kD）；コナミドリムシルビスコ小サブユニット2（CrRbcS2; 15.5 kD）；及びシロイヌナズナルビスコ小サブユニット（AtRbcS）の予想分子量に一致するバンドを示す。図２０Ｃは、EPYC1-GFPで形質転換されたS2Cr植物のペレット（S2Cr_EPYC1ペレット、上の画像）及びEPYC1-GFPで形質転換されていないペレット（S2Crペレット、下の画像）からの凝縮物からのGFPシグナルの蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバーは50μmを表す。図２０Ｄは、ポリクローナル抗ルビスコ（左側）又は抗CrRbcS2（右側）でプローブされたEPYC1-dGFPを発現するS2Crシロイヌナズナ植物の葉緑体の代表的な免疫金電子顕微鏡（EM）画像を示す。右の画像内の免疫金でラベル付けされた切片を丸で囲む。スケールバーは0.5μmを表す。図２０Ｅは、EPYC1-dGFPを発現するS2Crシロイヌナズナ植物の免疫金EM画像における、葉緑体の残りの部分と比較した、凝縮液内にあった免疫金粒子の割合の散布図を示す。データは、ポリクローナル抗ルビスコ抗体（ルビスコ抗体）又は抗コナミドリムシルビスコ小サブユニット2抗体（CrRbcS2抗体）のいずれかでプローブした場合の37-39葉緑体からのものである。散布図に重なる線は、平均及びSEMを表す。図２０Ｆは、EPYC1-dGFPを発現するトランスジェニックシロイヌナズナS2Cr植物からの葉肉細胞の断面における凝縮物を伴う葉緑体の代表的なTEM画像を示す。切片は、抗ルビスコ抗体を用いた免疫金ラベリング（１つの葉緑体で矢印で示される小さな黒い点）によってプローブした。スケールバーは1μmを表す。 図２１Ａ～２１Ｋは、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の成長と光合成に対するEPYC1を介したルビスコの凝縮の影響を示す。図２１Ａは、200μmolのフォトン（光子）m-2s-1の光で成長したEPYC1-dGFP WT（黒いバー）を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物及び各系統のそれぞれの単一セグメント（白いバー）の新鮮重量をミリグラム（FW（mg））で示す。図２１Ｂは、200μmolのフォトンm-2s-1の光で成長したEPYC1-dGFP WTを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物（黒いバー）及び各系統のそれぞれの単一セグメント（白いバー）の乾燥重量をミリグラム（DW（mg））で示す。図２１Ｃは、900μmolのフォトンm-2s-1の光で成長したEPYC1-dGFPWTを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物（黒いバー）及び各系統のそれぞれの単一セグメント（白いバー）の新鮮重量をミリグラム（FW（mg））で示す。図２１Ｄは、900μmolのフォトンm-2s-1の光で成長したEPYC1-dGFP WTを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物（黒いバー）及び各系統のそれぞれの単一セグメント（白いバー）の乾燥重量をミリグラム（DW（mg））で示す。図２１Ａ～２１Ｄにおいて、表示されたデータは、３つのT2 EPYC1-dGFP S2Crトランスジェニック系統（それぞれEP1、EP2、及びEP3）及びEPYC1-dGFP WT形質転換体（EpWT）及びそれぞれの単一セグメントからのものである。植物を成長の３２日後に測定した。バーは平均を表し、エラーバーは各系統の１２個以上の個々の植物のSEMを表す。アスタリスクは、ANOVAによって判断されたS2CrバックグラウンドとWTバックグラウンドの間の成長の有意差（P <0.05）を示す；同じバックグラウンド（すなわち、S2Cr又はWT）のトランスジェニック／コントロール系統は、成長に有意差がなかった。図２１Ｅ～２１Ｇは、その重量を図２１Ａ～２１Ｄに示す同じ８つのS2Crトランスジェニック形質転換体及び単一セグメントについての経時的（発芽後の日数）にわたるロゼット面積（mm2）のプロットを示す。トランスジェニック系統は、図２１Ａ～２１Ｄに示すように標識される。トランスジェニック系統EP1-3の単一セグメントはそれぞれAz1-3とラベル付けされている。EpWTの単一セグメントはAzWTとラベル付けされている。x軸は発芽後の日数を示す。データポイントは、各系統の１２個以上の個別の植物の平均を表す。エラーバーはSEMを表す。図２１Ｅ～２１Ｆは、200μmolフォトンm-2s-1光の下で成長した植物からのデータを示す。図２１Ｅは、図２１Ｆにプロットされたものと同じデータのオーバーレイを示す。図２１Ｇは、900μmolフォトンm-2s-1光の下で成長した植物からのデータを示す。図２１Ｈは、図２１Ａ～Ｇに記載されたものと同じ８つのシロイヌナズナ系統についてのμモルCO2 m-2s-1での正味CO2同化（Ａ）のプロットを示す。x軸は、飽和光（1500μmolフォトンm-2s-1）下での細胞間CO2濃度（Ci）を示す。植物系統は、図２１Ｃのようにラベル付けされている。データポイント及びエラーバーは、１０個以上の個々のロゼットからの個々の葉で行われた測定の平均とSEMをそれぞれ示す。図２１Ｉ～２１Ｋは、図２１Ａ～２１Ｄに含まれるものと同じ８つのシロイヌナズナ系統からのガス交換データから得られた光合成パラメーターを示す。植物系統は、図２１Ａ～２１Ｂに示すようにラベル付けされている。プロットは、15～24個のロゼット全体で行われた測定の平均及びSEMを示す。アスタリスクは、ANOVAによって決定された有意差（P <0.05）を示す。図２１Ｉは、ルビスコ部位のμモルに正規化された、周囲の細胞外濃度のCO2での、毎秒のμモルのCO2で表した正味のCO2同化率（ARubisco）のプロットを示す。図２１Ｊは、μmol CO2 m-2s-1で表したルビスコカルボキシル化の最大速度（Vcmax）のプロットを示す。図２１Ｋは、μmol電子（e-）m-2s-1で表した最大電子伝達速度（Jmax）のプロットを示す。
以下の説明は、例示的な方法、パラメーター等を示す。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。
＜遺伝子改変植物＞
本開示の一態様は、改変ルビスコと必須ピレノイド成分1（EPYC1）ポリペプチドの凝集体を形成するための改変ルビスコを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。改変ルビスコとEPYC1の凝集体はまた、改変ルビスコとEPYC1の凝縮物とも呼ばれる。この態様の追加の実施形態は、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチドである前記改変ルビスコ、又は前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記遺伝子改変高等植物又はその一部は、前記EPYC1ポリペプチド及び前記凝集体をさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、共焦点顕微鏡法、透過電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、液液相分離アッセイ、又は相分離アッセイによって検出可能な前記凝集体を含む。この態様のさらに別の実施形態は、葉緑素自己蛍光をアッセイし、前記凝集体が存在する場合の葉緑素自己蛍光の置換を観察することによって検出可能である前記凝集体を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる好ましい実施形態は、インビボでの共焦点顕微鏡法によって検出可能な前記凝集体を含む。この態様のさらなる実施形態は、内部混合を受ける前記凝集体を含む。この態様の追加の実施形態は、葉緑体チラコイド膜を置換させる前記凝集体を含む。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、内因性ルビスコSSUポリペプチドを含む前記改変高等植物のルビスコポリペプチドを含む。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態において、前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、１つ以上の高等植物のルビスコSSUαヘリックスを１つ以上の藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって；１つ以上の高等植物のルビスコSSUβストランドを１つ以上の藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって；及び／又は、高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、改変された。この態様の追加の実施形態は、２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスを２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって改変された、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号1のアミノ酸23～35及びアミノ酸80～93に対応する前記２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックス、並びに配列番号2のアミノ酸23～35及びアミノ酸86～99に対応する前記２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスを含む。２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスが２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換されている前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態において、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、４つの高等植物のルビスコSSUβストランドを４つの藻類のルビスコSSUβストランドで置換すること、及び高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、さらに改変される。この態様の追加の実施形態は、配列番号1のアミノ酸39～45、アミノ酸68～70、アミノ酸98～105及びアミノ酸110～118に対応する前記４つの高等植物のルビスコSSUβストランド、配列番号2のアミノ酸39～45、アミノ酸74～76、アミノ酸104～111及びアミノ酸116～124に対応する前記４つの藻類のルビスコSSUβストランド、配列番号1のアミノ酸46～67に対応する前記高等植物のルビスコSSUβA-βBループ、並びに配列番号2のアミノ酸46～73に対応する前記藻類のルビスコSSUβA-βBループを含む。
改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有する前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。改変高等植物ルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有する前記藻類のルビスコSSUポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態において、前記藻類のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、 配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164である。改変高等植物のルビスコを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、改変されていない高等植物のルビスコSSUポリペプチドと比較して、前記EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加又は変化した前記改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドを含む。
本開示の追加の態様は、改変ルビスコスと前記EPYC1ポリペプチドの凝集体を形成するためのEPYC1ポリペプチドを含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。改変ルビスコとEPYC1の集合体は、改変ルビスコとEPYC1の凝縮物と呼ばれることもある。前述の態様のいずれかのさらなる実施形態は、藻類EPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する藻類EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらに他の実施形態において、前記藻類EPYC1ポリペプチドは、配列番号34、配列番号35、配列番号165、配列番号166、又は配列番号167である。この態様の追加の実施形態は、配列番号35に対応する成熟型又はトランケート型EPYC1であるEPYC1を含む。この態様のさらなる実施形態は、残基26（V）と27（A）の間でトランケートされて配列番号35に対応する成熟天然型EPYC1を形成する、配列番号34に対応する完全長型EPYC1を含む。前述の態様のいずれかのさらに別の実施形態は、改変EPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらなる実施形態は、第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、前記第１藻類EPYC1リピート領域の４つのタンデムコピー又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。第１藻類EPYC1リピート領域のタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドを含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号36に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである第１藻類EPYC1リピート領域を含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号36である前記第１藻類EPYC1リピート領域を含む。改変EPYC1を含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに他の実施例は、前記天然EPYC1リーダー配列なしで発現される、及び／又はC末端キャップを含む、改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号42に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む天然EPYC1リーダー配列、及び配列番号41に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含むC末端キャップを含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号41であるC末端キャップを含む。改変EPYC1を含む前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の別の実施形態は、対応する非改変EPYC1ポリペプチドと比較してルビスコSSUポリペプチドに対して増加した親和性を有する前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記凝集体は、植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在化する。前記凝集体は、凝縮物と呼ばれることもある。この態様のさらなる実施形態は、葉の葉肉細胞である植物細胞を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記植物は、カウピー（例えば、黒目エンドウ、キャットジャン、ヤードロングビーン、ササゲ）、大豆（例えば、大豆（soybean）、大豆（soya bean）、グリシンマックス、グリシンソージャ）、キャッサバ（例えば、マニオック、ユッカ、マニホテスキュレンタ（Manihot esculenta））、イネ（例、インディカ米、ジャポニカ米、芳香性米、グルチナス米、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima））、小麦（例えば、普通小麦、スペルト、デュラム、ヒトツブコムギ（einkorn）、エンメル（emmer）、カムット（kamut）、Triticum aestivum、Triticum spelta、 デュラムコムギ（Triticum durum）、Triticum urartu、一粒小麦（Triticum monococcum）、Triticum turanicum、Triticum spp.）、大麦（例えば、Hordeum vulgare）、ライ麦（例えば、Secale cereale）、オート麦（例えば、エンバク（Avena sativa））、トマト（例えば、Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（例えば、ラセットポテト、イエローポテト、レッドポテト、Solanum tuberosum）、キャノーラ（例えば、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、カラシナ（Brassica juncea））、又は他のC3作物植物の群から選択される。いくつかの実施形態において、前記植物は、タバコ（すなわち、Nicotiana tabacum、Nicotiana edwardsonii、Nicotiana plumbagnifolia、Nicotiana longiflora、Nicotiana benthamiana）又はシロイヌナズナ（すなわち、rockcress、thale cress、Arabidopsis thaliana）である。
本開示のさらなる態様は、EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列及び改変ルビスコをコードする第２核酸配列を含む、遺伝子改変高等植物又はその一部を含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号35に対応する成熟型又はトランケート型EPYC1であるEPYC1を含む。この態様のさらなる実施形態は、残基26（Ｖ）と残基27（Ａ）との間でトランケートされて配列番号35に対応する成熟天然型EPYC1を形成する、配列番号34に対応する全長型EPYC1を含む。この態様のさらに別の実施形態は、２つの別個の発現カセットを含むバイナリーベクターで導入される第１核酸配列を含む、ここで、各発現カセットは、第１核酸配列を含む。この態様の追加の実施形態は、第１プロモーターに操作可能に連結されている第１核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される第１プロモーターを含む。この態様のさらに別の実施形態は、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、及びシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである第１プロモーターを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている前記第１核酸配列を含む、及び前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない。この態様の追加の実施形態は、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号63である葉緑体輸送ペプチドを含む。天然EPYC1リーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記天然EPYC1リーダー配列は、配列番号65のヌクレオチド60～137に対応する。前述のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第１核酸配列は、１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様のさらなる実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される前記１つ又は２つのターミネーターを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態では、前記第２プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この態様の追加の実施形態において、前記第２プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、第２核酸配列は藻類のルビスコSSUポリペプチドをコードする。この態様の追加の実施形態では、第２核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている、及び前記第２核酸配列は、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードせず、前記天然藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない。この態様のさらなる実施形態において、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この態様のさらに別の実施形態では、葉緑体輸送ペプチドは配列番号64である。天然藻類SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記天然藻類SSUリーダー配列は、配列番号32のアミノ酸1～45に対応する。天然藻類SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記天然藻類SSUリーダー配列は、配列番号31のアミノ酸1～45に対応する。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態では、前記第２核酸配列はターミネーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記ターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、又はアクチンターミネーターの群から選択される。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第２核酸配列は、改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号35に対応する成熟型又はトランケート型EPYC1であるEPYC1を含む。この態様のさらなる実施形態は、残基26（V）と27（A）との間でトランケートされて配列番号35に対応する成熟天然型EPYC1を形成する、配列番号34に対応する全長型EPYC1を含む。この態様の追加の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである前記ルビスコSSUポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記ルビスコポリペプチドと前記EPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物又はその一部の少なくとも１つの細胞を含む。この態様のさらなる実施形態は、少なくとも１つの植物細胞の少なくとも１つの葉緑体の葉緑体ストローマに局在化する前記凝集体を含む。この態様の追加の実施形態は、葉の葉肉細胞である前記植物細胞を含む。前記ルビスコポリペプチドと前記EPYC1ポリペプチドの凝集体を含む植物又はその一部を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記凝集体は、共焦点顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法（TEM）、低温電子顕微鏡（cryo-EM）、又は液液相分離アッセイによって検出可能である。この態様のさらに別の実施形態は、葉緑素自己蛍光をアッセイし、前記凝集体が存在する場合の葉緑素自己蛍光の置換を観察することによって検出可能である前記凝集体を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる好ましい実施形態は、インビボでの共焦点顕微鏡法によって検出可能な前記凝集体を含む。この態様のさらなる実施形態は、前記内部混合を受ける凝集体を含む。この態様の追加の実施形態は、葉緑体チラコイド膜を置換させる前記凝集体を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記植物は、カウピー（例えば、黒目エンドウ、キャットジャン、ヤードロングビーン、ササゲ）、大豆（例えば、大豆（soybean）、大豆（soya bean）、グリシンマックス、グリシンソージャ）、キャッサバ（例えば、マニオック、ユッカ、マニホテスキュレンタ（Manihot esculenta））、米（例、インディカ米、ジャポニカ米、芳香性米、グルチナス米、イネ（Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima））、小麦（例えば、普通小麦、スペルト、デュラム、ヒトツブコムギ（einkorn）、エンメル（emmer）、カムット（kamut）、Triticum aestivum、Triticum spelta、 デュラムコムギ（Triticum durum）、Triticum urartu、一粒小麦（Triticum monococcum）、Triticum turanicum、Triticum spp.）、大麦（例えば、Hordeum vulgare）、ライ麦（例えば、Secale cereale）、オート麦（例えば、エンバク（Avena sativa））、トマト（例えば、Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（例えば、ラセットポテト、イエローポテト、レッドポテト、Solanum tuberosum）、キャノーラ（例えば、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、カラシナ（Brassica juncea））、又は他のC3作物植物の群から選択される。いくつかの実施形態において、前記植物は、タバコ（すなわち、Nicotiana tabacum、Nicotiana edwardsonii、Nicotiana plumbagnifolia、Nicotiana longiflora、Nicotiana benthamiana）又はシロイヌナズナ（すなわち、rockcress、thale cress、Arabidopsis thaliana）である。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの前記植物又は植物部分から生産された遺伝子改変高等植物細胞を含む。植物部分に関して前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、葉、茎、根、塊茎、花、種子、穀粒、穀物、果実、細胞、又はその一部である前記植物部分、及び１つ以上の遺伝的変化を含む遺伝子改変植物部分を含む。この態様のさらなる実施形態は、果実、塊茎、穀粒、又は穀物である前記植物部分を含む。花粉粒又は胚珠に関して前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの植物の遺伝子改変花粉又は遺伝子改変胚珠を含む、ここで、前記遺伝子改変花粉又は前記遺伝子改変胚珠は、１つ以上の遺伝的改変を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物から生産される遺伝子改変プロトプラストを含む、ここで、前記遺伝子改変プロトプラストは、１つ以上の遺伝子改変を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの前記遺伝子改変植物からのプロトプラスト又は細胞から生産された遺伝子改変組織培養物を含む、ここで、前記細胞又はプロトプラストは、葉、葉葉肉細胞、葯、ピスチル、茎、葉柄、根、根端、塊茎、果実、種子、穀粒、穀物、花、子葉、胚軸、胚、又は子葉細胞の群から選択される植物部分から産生される、ここで、前記遺伝子改変組織培養は、１つ以上の遺伝的改変を含む。この態様の追加の実施形態は、前記１つ以上の遺伝子改変を含む前記遺伝子改変組織培養物から再生された遺伝子改変植物を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの前記遺伝子改変植物から生産された遺伝子改変植物種子を含む。
＜遺伝子改変植物の生産及び栽培の方法＞
本開示の別の態様は、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変高等植物を生産する方法を含む、前記方法は、ａ）EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列を植物細胞、組織、又は他の外植片に導入すること；ｂ）植物細胞、組織、又は他の外植片を遺伝子改変小植物に再生すること；及びｃ）前記遺伝子改変小植物を、前記EPYC1ポリペプチドをコードする前記第１核酸を有する遺伝子改変植物に成長させること、を含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号35に対応する成熟型又はトランケート型EPYC1であるEPYC1を含む。この態様のさらなる実施形態は、残基26（V）及び27（A）の間でトランケートされて配列番号35に対応する前記成熟天然型EPYC1を形成する、配列番号34に対応する完全長型EPYC1を含む。この態様の追加の実施形態は、ステップ（ａ）の前又はステップ（ａ）と同時に、改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする第２核酸配列を植物細胞、組織又は他の外植片に導入することをさらに含む、ここで、ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物は、前記改変ルビスコSSUポリペプチドをコードする前記第２核酸をさらに含む。この態様の追加の実施形態は、ステップ（ｂ）の前に前記植物細胞、前記組織、又は前記他の外植片をスクリーニング又は選択することによって、前記第１核酸配列、及び任意選択で前記第２核酸配列の成功した導入を特定すること；ステップ（ｂ）と（ｃ）の間で小植物をスクリーニング又は選択すること；又はステップ（ｃ）の後に植物をスクリーニング又は選択することをさらに含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、粒子衝撃（すなわち、微粒子銃、遺伝子銃）、アグロバクテリウム媒介形質転換、根粒菌媒介形質転換、若しくはプロトプラストトランスフェクション又は形質転換の群から選択される形質転換法を使用して形質転換が行われる。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、第１ベクターで導入される前記第１核酸配列、及び第２ベクターで導入される前記第２核酸配列を含む。この態様の追加の実施形態は、２つの別個の発現カセットを含むバイナリーベクターで導入される前記第１核酸配列を含む、ここで、各発現カセットは、前記第１核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態では、前記第１核酸配列は、第１プロモーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記第１プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される。この態様のさらに別の実施形態では、前記第１プロモーターは、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターの群から選択される構成的プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態では、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている、及び前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない。この態様のさらに別の実施形態において、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。この態様のさらに別の実施形態では、前記内因性葉緑体輸送ペプチドは配列番号63である。天然EPYC1リーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、配列番号65のヌクレオチド60～137に対応する前記天然EPYC1リーダー配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態において、前記第１核酸配列は、１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様の追加の実施形態では、前記１つ又は２つのターミネーターは、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される。
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態は、第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、及び葉肉細胞特異的プロモーターからなる群から選択される前記第２プロモーターを含む。この態様のさらに別の実施形態は、CaMV35Sプロモーター、CaMV35Sプロモーターの誘導体、CsVMVプロモーター、CsVMVプロモーターの誘導体、トウモロコシユビキチンプロモーター、トレフォイルプロモーター、静脈モザイクキャッサバウイルスプロモーター、又はシロイヌナズナUBQ10プロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである前記第２プロモーターを含む。第２プロモーターに操作可能に連結されている第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、藻類SSUポリペプチドをコードする前記第２核酸配列を含む。この態様の追加の実施形態は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第４核酸配列に操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む、及び前記第２核酸配列は前記天然SSUリーダー配列をコードせず、前記天然SSUリーダー配列をコードする核酸配列に操作可能に連結されていない。この態様のさらなる実施形態は、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号64である前記葉緑体輸送ペプチドを含む。天然SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態は、配列番号32のアミノ酸1～45に対応する前記天然SSUリーダー配列を含む。天然藻類SSUリーダー配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態において、前記天然藻類SSUリーダー配列は、配列番号31のアミノ酸1～45に対応する。第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、ターミネーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を含む。この態様のさらなる実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、又はアクチンターミネーターの群から選択されるターミネーターを含む。第２プロモーターに操作可能に連結されている前記第２核酸配列を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態において、前記第２核酸配列は、改変高等植物のルビスコSSUポリペプチドをコードする、ここで、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部は、藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換されている。
第２ベクターを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様の追加の実施形態では、前記第２ベクターは、内因性ルビスコSSUポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結された核ゲノム配列を標的とする１つ以上の遺伝子編集成分を含む。この態様のさらなる実施形態は、核ゲノム配列を標的とするリボ核タンパク質複合体；TALENタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記TALENタンパク質は核ゲノム配列を標的とする；ZFNタンパク質コード配列を含むベクター、ここで、前記ZFNタンパク質は核ゲノム配列を標的とする；オリゴヌクレオチドドナー（ODN）、ここで、前記ODNは核ゲノム配列を標的とする；又は、CRISPR／Cas酵素コード配列及び標的配列を含むベクター、ここで、前記標的配列は核ゲノム配列を標的とする、からなる群から選択される１つ以上の遺伝子編集成分を含む。遺伝子編集を有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部に置換された遺伝子編集の結果を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのEPYC1ポリペプチドである前記EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つのルビスコSSUポリペプチドである前記ルビスコSSUポリペプチドを含む。
前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に操作可能に連結されている第１核酸配列を含む、及び前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、及び前記第１核酸配列は１つ又は２つのターミネーターに操作可能に連結されている、前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態は、前記第１核酸配列の第１コピーを含む第１ベクターを含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする第３核酸配列に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は前記第１プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は１つのターミネーターに操作可能に連結されている；及びここで、前記第１ベクターは、前記第１核酸配列の第２コピーをさらに含む、ここで、前記第１核酸配列は前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、前記天然EPYC1リーダー配列に操作可能に連結されていない、ここで、前記第１核酸配列は、前記高等植物細胞で機能する葉緑体輸送ペプチドをコードする前記第３核酸配列に操作可能に連結されている、ここで、前記第１核酸配列は第３プロモーターに操作可能に連結されている、及びここで、前記第１核酸配列は２つのターミネーターに操作可能に連結されている。この態様のさらなる実施形態は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される前記第１プロモーターを含む；ここで、前記第３プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、葉特異的プロモーター、又は葉肉細胞特異的プロモーターの群から選択される；及びここで、前記第１プロモーターと前記第３プロモーターは同一ではない。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号65のヌクレオチド60から137に対応する前記天然EPYC1リーダー配列を含む。この態様の実施形態は、HSPターミネーター、NOSターミネーター、OCSターミネーター、イントロンレスエクステンシンターミネーター、35Sターミネーター、pinIIターミネーター、rbcSターミネーター、アクチンターミネーター、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択されるターミネーターを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらなる実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの方法によって生産された植物又は植物部分を含む。
本開示のさらなる態様は、遺伝子改変植物を有する前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物を栽培する方法を含む、前記方法は、ａ）遺伝子改変実生、遺伝子改変小植物、遺伝子改変切穂、遺伝子改変塊茎、遺伝子改変根、又は遺伝子改変種子を土壌に植えて遺伝子改変植物を生産すること、若しくは前記遺伝子改変実生、前記遺伝子改変小植物又は前記遺伝子改変切穂を根茎又は土壌で成長した第２植物に接ぎ木して前記遺伝子改変植物を生産すること；ｂ）前記植物を栽培して、収穫可能な種子、収穫可能な葉、収穫可能な根、収穫可能な切穂、収穫可能な木材、収穫可能な果実、収穫可能な穀粒、収穫可能な塊茎、及び／又は収穫可能な穀物を生産すること；及び前記収穫可能な種子、前記収穫可能な葉、前記収穫可能な根、前記収穫可能な切穂、前記収穫可能な木材、前記収穫可能な果実、前記収穫可能な穀粒、前記収穫可能な塊茎、及び／又は前記収穫可能な穀物を収穫すること；及びｃ）前記収穫可能な種子、前記収穫可能な葉、前記収穫可能な根、前記収穫可能な切穂、前記収穫可能な木材、前記収穫可能な果実、前記収穫可能な穀粒、前記収穫可能な塊茎、及び／又は前記収穫可能な穀物を収穫すること、を含む。この態様の追加の実施形態は、WT植物の植物成長速度及び／又は光合成効率に匹敵する、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物の植物成長速度及び／又は光合成効率を含む。この態様のさらに別の実施形態は、WT植物の前記植物成長速度及び／又は光合成効率と比較して改善された、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物の植物成長速度及び／又は光合成効率を含む。この態様のさらに別の実施形態は、WT植物の収量と比較して改善された、前述の実施形態のいずれかの前記遺伝子改変植物の収量を含む。この態様のさらなる実施形態は、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも100％改善された収率を含む。
＜遺伝子改変植物及び植物細胞を生産するための分子生物学的方法＞
本発明の一実施形態は、改変ルビスコとEPYC1ポリペプチドの凝集体又は凝縮物の形成のための改変ルビスコ及び必須ピレノイド成分１（EPYC1）を含む遺伝子改変植物又は植物細胞を提供する。例えば、本開示は、EPYC1ポリペプチドをコードする第１核酸配列及び改変ルビスコをコードする第２核酸配列を有する植物を提供する。さらに、本開示は、藻類EPYC1ポリペプチド、改変EPYC1ポリペプチド、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチド、及び改変ルビスコSSUポリペプチドを有する植物を提供する。
本発明の特定の態様は、コナミドリムシタンパク質EPYC1（コナミドリムシEPYC1ゲノム配列＝配列番号66；コナミドリムシEPYC1転写配列＝配列番号65；コナミドリムシEPYC1完全長タンパク質＝配列番号34；コナミドリムシ成熟型EPYC1タンパク質＝配列番号35）に関する。EPYC1は、より短い末端領域に隣接する４つの非常に類似したリピート領域からなるモジュラータンパク質である（図１Ａ～１Ｂ）。４つの類似したリピート領域のそれぞれは、予測された無秩序なドメイン、及び予測されたαヘリックスを含むより短く乱れの少ないドメインで構成されている。本発明のさらなる態様は、EPYC1のホモログ又はオーソルグに関する。いくつかの実施形態において、EPYC1のホモログ又はオーソルグは、コナミドリムシEPYC1と構造的に類似している。図１５に示すように、他の３つの密接に関連する藻類種、すなわちオオヒゲマワリ（Volvox carteri）、ゴニウム（Gonium pectorale）、及びシアワセモ（Tetrabaena socialis）は、コナミドリムシEPYC1と同じ、予測されるαヘリックス領域を含むリピート領域を有するコナミドリムシEPYC1（配列番号166（オオヒゲマワリ（Volvox carteri））；配列番号167（ゴニウム（Gonium pectorale））；配列番号165（シアワセモ（Tetrabaena socialis）））に相同なタンパク質を有する。
前記天然コナミドリムシタンパク質EPYC1のN末端で、配列番号34のアミノ酸26の切断部位（図１Ｂに黒い矢印で示す）は、配列番号35の成熟型EPYC1タンパク質のトランケート型N末端となる。好ましくは、高等植物におけるEPYC1の発現は、産生された前記EPYC1タンパク質がトランケート型N末端を有するようなコード配列を使用する。この態様の追加の実施形態は、配列番号40に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記トランケート型N末端（すなわち、成熟型EPYC1タンパク質のN末端）を含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号40の前記トランケート型N末端（すなわち、前記成熟型EPYC1タンパク質のN末端）を含む。
本発明の改変EPYC1ポリペプチドは、第１EPYC1リピートドメインのタンデムコピーを含む。この態様のさらなる実施形態は、第１藻類EPYC1リピート領域の１つ以上、２つ以上、４つ以上、又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態は、第１藻類EPYC1リピート領域の４つのタンデムコピー又は８つのタンデムコピーを含む前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。例示的な改変EPYC1配列を図５Ａに示す。この態様のいくつかの実施形態は、配列番号36に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記第１藻類EPYC1リピート領域を含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号36である前記第１藻類EPYC1リピート領域を含む。この態様のさらに別の実施形態は、前記天然EPYC1リーダー配列なしで発現される、及び／又はC末端キャップを含む、前記改変EPYC1ポリペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号42に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである前記天然EPYC1リーダー配列、及び配列番号41に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであるC末端キャップを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号41であるC末端キャップを含む。この態様のさらなる実施形態は、前記天然EPYC1リーダー配列の代わりに使用されるトランケート型N末端（すなわち、前記成熟型EPYC1タンパク質のN末端）を含む。この態様の追加の実施形態は、配列番号40に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドであるトランケート型N末端（すなわち、前記成熟型EPYC1タンパク質のN末端）を含む。この態様のさらなる実施形態は、配列番号40であるトランケート型N末端（すなわち、成熟EPYC1タンパク質のN末端）を含む。前記天然EPYC1リーダー配列を含まず、トランケート型N末端（すなわち、成熟型EPYC1タンパク質のN末端）を有し、C末端キャップを有する改変EPYC1配列を含む遺伝子発現カセットの例を図１２Ａ～１２Ｂに示す。
高等植物におけるEPYC1の正しい標的化のために、高等植物の葉緑体標的化配列がEPYC1配列に付加されている。いくつかの実施形態において、前記葉緑体標的化配列は、1AAt葉緑体輸送ペプチドである。さらなる実施形態において、前記葉緑体標的化配列は、1BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号18）、2BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号19）、又は3BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号20）である。追加の実施形態において、前記葉緑体標的化配列を、葉緑素a／b結合タンパク質、ルビスコアクチバーゼ、フェレドキシン、又はデンプンシンターゼタンパク質から得る。追加の実施形態において、前記葉緑体輸送配列は、トランケート型葉緑体輸送配列（例えば、1AAt葉緑体輸送ペプチドの55残基）である。この態様のさらなる実施形態は、配列番号64に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号64の葉緑体輸送ペプチドを含む。EPYC1配列（成熟型EPYC1及び改変EPYC1）に付着した55残基の1AAt葉緑体輸送ペプチドを含む遺伝子発現カセットの例を、図１２Ａ～１２Ｂに示す。当技術分野で知られている手段を使用して、葉緑体標的配列がEPYC1標的化に適しているかどうかをテストして、前記葉緑体標的配列の長さを最適化することができる（例えば、Shen, et al., Sci. Rep. (2017): 46231）。
本発明の追加の態様は、藻類のルビスコSSUタンパク質に関する。いくつかの実施形態において、前記藻類のルビスコSSUタンパク質は、コナミドリムシのルビスコSSUタンパク質、S1Cr（配列番号30）又はS2Cr（配列番号2）である（図１Ｄ及び３Ｄ）。本発明のさらなる態様は、コナミドリムシのルビスコSSUの藻類ホモログ又は藻類オーソルグに関する。この態様の追加の実施形態では、前記藻類のルビスコSSUタンパク質は、オオヒゲマワリ又はゴニウムのルビスコSSUタンパク質である（図１４Ａ～１４Ｃ；配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161；配列番号162；配列番号163、及び配列番号164）。この態様の別の実施形態では、コナミドリムシのルビスコSSUの前記藻類ホモログ又はオーソルグは、配列番号30又は配列番号2と少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。本発明のさらなる態様は、藻類のルビスコSSUリーダー配列を含まない藻類のルビスコSSUタンパク質に関する。この態様のいくつかの実施形態において、前記藻類のルビスコSSUリーダー配列は、配列番号29と少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。この態様のさらなる実施形態では、前記藻類のルビスコSSUリーダー配列は配列番号29である。
本発明の改変ルビスコSSUは、１つ以上の高等植物のルビスコSSUαヘリックスを１つ以上の藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換すること；１つ以上の高等植物のルビスコSSUβストランドを１つ以上の藻類のルビスコSSUβストランドに置換すること；及び／又は、高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換すること、によって改変された高等植物のルビスコSSUを含む。いくつかの実施形態において、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスを２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換することによって改変される。追加の実施形態において、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、４つの高等植物のルビスコSSUβストランドを４つの藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって、及び高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、さらに改変される。本発明の高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本発明の藻類のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。この態様の追加の実施形態において、前記藻類のルビスコSSUポリペプチドは、配列番号2、配列番号30、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、又は配列番号164である。この態様のさらなる実施形態は、配列番号1のアミノ酸23～35（すなわち、配列番号3）及びアミノ酸80～93（すなわち、配列番号4）に対応する前記２つの高等植物のルビスコSSUα-ヘリックス、並びに配列番号2のアミノ酸23～35（すなわち、配列番号10）及びアミノ酸86～99（すなわち、配列番号12）に対応する前記２つの藻類ルビスコSSUαヘリックスを含む。２つの藻類のルビスコSSUαヘリックスに置換されている２つの高等植物のルビスコSSUαヘリックスを有する前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができるこの態様のさらに別の実施形態において、前記高等植物のルビスコSSUポリペプチドは、４つの高等植物のルビスコSSUβストランドを４つの藻類のルビスコSSUβストランドに置換することによって、及び高等植物のルビスコSSUβA-βBループを藻類のルビスコSSUβA-βBループに置換することによって、さらに改変される。この態様の追加の実施形態は、配列番号1のアミノ酸39～45（すなわち、配列番号5）、アミノ酸68～70（すなわち、配列番号6）、アミノ酸98～105（すなわち、配列番号7）、及びアミノ酸110～118（すなわち、配列番号8）に対応する前記４つの高等植物のルビスコSSUβストランド、配列番号2のアミノ酸39～45（すなわち、配列番号11）、アミノ酸74～76（すなわち、配列番号6）、アミノ酸104～111（すなわち、配列番号13）、及びアミノ酸116～124（すなわち、配列番号14）に対応する前記４つの藻類のルビスコSSUβストランド、配列番号1のアミノ酸46～67（すなわち、配列番号9）に対応する前記高等植物のルビスコSSUβA-βBループ、並びに配列番号2のアミノ酸46～73（すなわち、配列番号15）に対応する前記藻類のルビスコSSUβA-βBループを含む。さらなる実施形態において、前記藻類のルビスコSSUβA-βBループは、配列番号16に対応する。
高等植物葉緑体標的化配列は、前記藻類のルビスコSSU又は前記改変ルビスコSSUに付着している。いくつかの実施形態において、前記葉緑体標的化配列は、前記1AAt葉緑体輸送ペプチドである。さらなる実施形態において、前記葉緑体標的化配列は、前記1BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号18）、2BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号19）、又は前記3BAt葉緑体輸送ペプチド（配列番号20）である。追加の実施形態において、前記葉緑体標的化配列は、葉緑素a／b結合タンパク質、ルビスコアクチバーゼ、フェレドキシン、又はデンプンシンターゼタンパク質から得る。追加の実施形態において、前記葉緑体輸送配列は、トランケート型葉緑体輸送配列（例えば、前記1AAt葉緑体輸送ペプチドの前記57残基）である。この態様のさらなる実施形態は、配列番号63に対して少なくとも70％の配列同一性、少なくとも71％の配列同一性、少なくとも72％の配列同一性、少なくとも73％の配列同一性、少なくとも74％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも76％の配列同一性、少なくとも77％の配列同一性、少なくとも78％の配列同一性、少なくとも79％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも81％の配列同一性、少なくとも82％の配列同一性、少なくとも83％の配列同一性、少なくとも84％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも86％の配列同一性、少なくとも87％の配列同一性、少なくとも88％の配列同一性、少なくとも89％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも91％の配列同一性、少なくとも92％の配列同一性、少なくとも93％の配列同一性、少なくとも94％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである葉緑体輸送ペプチドを含む。この態様のさらに別の実施形態は、配列番号63である前記葉緑体輸送ペプチドを含む。SSU配列に付着した前記57残基の1AAt葉緑体輸送ペプチド（1AAt-TPを有するS2Cr（配列番号22）及び1AAt-TPを有する1AatMOD（配列番号33））を含む配列の例を図３Ｂに示す。当技術分野で知られている手段を使用して、改変ルビスコSSU標的に対する葉緑体標的配列の適合性をテストして、前記葉緑体標的配列の長さを最適化することができる（例えば、Shen, et al., Sci. Rep. (2017): 46231）。
遺伝子改変単子葉植物及び二子葉植物の植物細胞の形質転換及び生産は、当技術分野でよく知られている。例えば、Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988)；米国特許第5,679,558号；Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995)；及びWang, et al. Acta Hort. 461:401-408 (1998)を参照。方法の選択は、形質転換する植物の種類、特定の用途及び／又は望ましい結果によって異なる。適切な転換技術は、熟練した専門家によって容易に選択される。
細胞DNA（例えば、ゲノムDNA及びオルガネラDNA）を削除、挿入又は他の方法で改変するための当技術分野で知られている任意の方法論を、本明細書に開示される発明を実施する際に使用することができる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにおける、標的遺伝子の削除又は挿入のための遺伝子構築物を含む武装解除されたTiプラスミドは、植物細胞を形質転換するために使用できる、その後、形質転換植物は、例えばEP0116718、EP0270822、PCT公開WO84/02913及び欧州特許出願公開（「EP」）0242246などの当技術分野で説明されている手順を使用して、形質転換植物細胞から再生することができる。Tiプラスミドベクターはそれぞれ、TiプラスミドのT-DNAの境界配列の間に、又は少なくとも右境界配列の左側に位置する遺伝子を含む。もちろん、植物細胞の形質転換には、遺伝子直接導入（例えば、EP 0233247に記載）、花粉媒介形質転換（例えば、EP 0270356、PCT公開WO85/01856、及び米国特許第4,684,611号に記載）、植物RNAウイルス媒介性形質転換（例えば、EP0067553及び米国特許第4,407,956号に記載）、リポソーム媒介性形質転換（例えば、米国特許第4,536,475号に記載）、及びトウモロコシの特定の系統を形質転換するための方法などの他の方法（例えば、米国特許第6,140,553号；Fromm et al., Bio/Technology (1990) 8, 833-839)；Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, (1990) 2, 603-618) 及びrice (Shimamoto et al., Nature, (1989) 338, 274-276；Datta et al., Bio/Technology, (1990) 8, 736-740）及び単子葉植物を一般的に形質転換するための方法（PCT公開WO92/09696）などの手順を使用して、他のタイプのベクターを使用することも可能である。綿の形質転換には、PCT特許公開WO00/71733に記載されている方法を使用することができる。大豆の形質転換については、当技術分野で知られている方法、例えば、Hinchee et al. (Bio/Technology, (1988) 6, 915)及びChristou et al. (Trends Biotech, (1990) 8, 145)又はWO00/42207の方法が参照される。
本発明の遺伝子改変植物を従来の植物育種スキームで使用して、同じ特徴を有してより遺伝子改変された植物を生産するか、若しくは同じ又は関連する植物種の他の品種に遺伝子改変を導入することができる。改変された植物から得た種子は、好ましくは、核DNAへの安定した挿入物として、又は内因性遺伝子又はプロモーターへの改変として、遺伝的改変を含む。本発明による遺伝子改変を含む植物には、例えば果樹又は観賞植物の、本発明の遺伝子改変を含む植物の根株を含む又はそれらに由来する植物が含まれる。したがって、形質転換された植物又は植物部分に挿入されたいかなる非遺伝子改変接ぎ木植物部分も、本発明に含まれる。
発現ベクターと発現カセットの如何を問わず、導入された遺伝子の発現をもたらす、導入された遺伝子要素は、典型的には、植物発現可能なプロモーターを利用する。本明細書で使用される「植物発現可能プロモーター」は、植物細胞における本発明の遺伝子変異の発現を確実にするプロモーターを指す。植物における構成的発現を指示するプロモーターの例は、当技術分野で知られており、以下を含む：例えば、分離株CM1841などのカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の強力な構成的35Sプロモーター（「35Sプロモーター」）（Gardner et al., Nucleic Acids Res, (1981) 9, 2871-2887）、CabbB S（(Franck et al., Cell (1980) 21, 285-294；Kay et al., Science, (1987) 236, 4805）及びCabbB JI（Hull and Howell, Virology, (1987) 86, 482-493）；キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV）；ユビキチンファミリーからのプロモーター（例えば、Christensen et al., Plant Mol Biol, (1992) 18, 675-689のトウモロコシユビキチンプロモーター、又はNorris et al. Plant Mol. Biol. (1993) 21, 895-906のシロイヌナズナUBQ10プロモーター）、gos2プロモーター（de Pater et al., The Plant J (1992) 2, 834-844）、emuプロモーター（Last et al., Theor Appl Genet, (1990) 81, 581-588）、An et al. (The Plant J, (1996) 10, 107)によって記載されたプロモーターなどのアクチンプロモーター、Zhang et al. (The Plant Cell, (1991) 3, 1155-1165)によって記載されたイネアクチンプロモーター；キャッサバ静脈モザイクウイルスのプロモーター（WO97/48819, Verdaguer et al. (Plant Mol Biol, (1998) 37, 1055-1067）、サブタレニアンクローバースタントウイルス（Subterranean Clover Stunt Virus)からのプロモーターのpPLEXシリーズ（WO96/06932、特にS4又はS7プロモーター）、例えばpAdh1Sなどのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（GenBank accession numbers X04049, X00581）、及びTDNAの1'及び2'遺伝子の発現をそれぞれ駆動するTR1'プロモーター及びTR2'プロモーター（それぞれ「TR1'プロモーター」及び「TR2'プロモーター」）（Velten et al., EMBO J, (1984) 3, 2723 2730）。
あるいは、植物発現性プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、植物のいくつかの細胞又は組織、例えば、葉葉肉細胞においてより高いレベルの発現を指示するプロモーターであってもよい。好ましい実施形態では、葉葉肉特異的プロモーター又は葉孔辺細胞特異的プロモーターが使用される。非限定的な例には、葉特異的Rbcs1Aプロモーター（シロイヌナズナルビスコ小サブユニット1A（AT1G67090）プロモーター）、GAPA-1プロモーター（シロイヌナズナグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼAサブユニット1（AT3G26650）プロモーター）、及びFBA2プロモーター（シロイヌナズナフルクトース-ビスホスフェートアルドラーゼ2 317（AT4G38970）プロモーター）が含まれる（Kromdijk et al., Science, 2016）。さらなる非限定的な例には、葉葉肉特異的FBPaseプロモーター（Peleget al., Plant J, 2007）、トウモロコシ又はイネのrbcSプロモーター（Nomura et al., Plant Mol Biol, 2000）、葉孔辺細胞特異的シロイヌナズナKAT1プロモーター（Nakamura et al., Plant Phys, 1995）、シロイヌナズナミロシナーゼ-チオグルコシドグルコヒドロラーゼ1（TGG1）プロモーター（Husebye et al., Plant Phys, 2002）、シロイヌナズナrha1プロモーター（Terryn et al., Plant Cell, 1993）、シロイヌナズナAtCHX20プロモーター（Padmanaban et al., Plant Phys, 2007）、シロイヌナズナHIC（高二酸化炭素）プロモーター（Gray et al., Nature, 2000）、シロイヌナズナCYTOCHROME P450 86A2（CYP86A2）モノオキシゲナーゼプロモーター（pCYP）（Francia et al., Plant Signal & Behav, 2008；Galbiati et al., The Plant Journal, 2008）、ジャガイモADP-グルコースピロホスホリラーゼ（AGPase）プロモーター（Muller-Rober et al., The Plant Cell 1994）、ブドウR2R3 MYB60転写因子プロモーター（Galbiati et al., BMC Plant Bio, 2011）、シロイヌナズナAtMYB60プロモーター（Cominelli et al., Current Bio, 2005；Cominelli et al., BMC Plant Bio, 2011）、シロイヌナズナAt1g22690-プロモーター（pGC1）（Yang et al., Plant Methods, 2008）、及びシロイヌナズナ AtMYB 61プロモーター（Liang et al., Curr Biol, 2005）が含まれる。これらの植物プロモーターは、エンハンサー要素と組み合わせることができる、これらは最小のプロモーター要素と組み合わせることができる、又は所望の発現プロファイルを確実にするためにリピート要素を含むことができる。
いくつかの実施形態において、植物細胞での発現を増加させる遺伝的要素を利用することができる。例えば、導入された遺伝子の5'末端又は3'末端にあるイントロン、又は例えば、hsp70イントロンなど導入された遺伝子のコード配列にあるイントロンである。他のそのような遺伝子要素には、プロモーターエンハンサー要素、二重又は三重のプロモーター領域、別の導入遺伝子とは異なる、又は内因性（植物宿主）遺伝子リーダー配列とは異なる5'リーダー配列、同じ植物で使用されている別の導入遺伝子とは異なる、又は内因性（植物宿主）トレーラー配列とは異なる3'トレーラー配列を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の導入された遺伝子は、挿入された遺伝子部分が適切な3'末端転写調節シグナル（例えば、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、5'）になるように、宿主細胞DNAに挿入することができる。これは、好ましくは、遺伝子を植物細胞ゲノム（核又は葉緑体）に挿入することによって達成される。好ましいポリアデニル化及び転写物形成シグナルには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子（Nosターミネーター；Depicker et al., J. Molec Appl Gen, (1982) 1, 561-573）、オクトピンシンターゼ遺伝子（OCSターミネーター; Gielen et al., EMBO J, (1984) 3:835 845）、シロイヌナズナヒートショックタンパク質ターミネーター（HSPターミネーター）、SCSV又はリンゴ酸酵素ターミネーター（Schunmann et al., Plant Funct Biol, (2003) 30:453-460）、及びT DNA遺伝子7（Velten and Schell, Nucleic Acids Res, (1985) 13, 6981 6998）のものが含まれる、これらは、形質転換された植物細胞で3'非翻訳DNA配列として機能する。いくつかの実施形態において、導入された遺伝子のうちの１つ以上は、核ゲノムに安定して組み込まれる。安定した組み込みは、核酸配列が核ゲノムに組み込まれたままであり、その後の植物世代を通して発現され続ける（例えば、検出可能なmRNA転写物又はタンパク質が生産される）ときに存在する。核ゲノムへの安定した統合及び／又は核ゲノムの編集は、当技術分野における任意の既知の方法（例えば、微粒子衝撃、アグロバクテリウム媒介形質転換、CRISPR／Cas9、プロトプラストのエレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）によって達成することができる。
組換え又は改変核酸という用語は、遺伝子工学技術又は化学合成によるポリヌクレオチドの単離されたセグメントの人工的な操作によって達成される、他の方法で分離された配列の２つのセグメントの組み合わせによって作られるポリヌクレオチドを指す。そうすることで、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを一緒に結合して、機能の所望の組み合わせを作成することができる。
本明細書で使用される場合、「過剰発現」及び「アップレギュレーション」という用語は、遺伝子改変の結果としての野生型生物（例えば、植物）における発現と比較して（例えば、mRNA、ポリペプチドなどの）増加した発現を指す。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現よりも約10％多いわずかな増加である。いくつかの実施形態において、発現の増加は、野生型における発現と比較して、50％以上（例えば、60％、70％、80％、100％など）の増加である。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子は過剰発現される。いくつかの実施形態において、外因性遺伝子は、発現のせいで過剰発現される。植物における遺伝子の過剰発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、高発現プロモーター、エンハンサー、転写及び／又は翻訳調節配列、コドン最適化、改変転写因子、及び／又は過剰発現される遺伝子の発現を制御する変異又は改変遺伝子の使用を含むがこれらに限定されない、当技術分野における任意の既知の方法によって達成することができる。
組換え核酸が特定の配列の発現、クローニング、又は複製を目的とする場合、宿主細胞への導入のために調製されたDNA構築物は、典型的には、所望のポリペプチドをコードする意図されたDNAフラグメントを含む、宿主によって認識される複製システム（例えば、ベクター）を含む、及びポリペプチドをコードするセグメントに操作可能に連結された転写及び翻訳開始調節配列を含むこともできる。さらに、そのような構築物は、細胞局在化シグナル（例えば、原形質膜局在化シグナル）を含むことができる。好ましい実施形態では、そのようなDNA構築物は、宿主細胞のゲノムDNA、葉緑体DNA又はミトコンドリアDNAに導入される。
いくつかの実施形態では、統合されていない発現系を使用して、１つ以上の導入された遺伝子の発現を誘導することができる。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製起点又は自律複製配列（ARS）及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、並びに、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列及びmRNA安定化配列などの必要な処理情報部位を含むことができる。シグナルペプチドはまた、タンパク質が細胞膜、細胞壁に交差及び／又は留まるか、又は細胞から分泌されることを可能にする、同一又は関連する種の分泌されたポリペプチドから適切な場合に含まれ得る。
本明細書に開示される本発明の方法論を実施するのに有用な選択可能マーカーは、ポジティブセレクションが可能なマーカーであり得る。典型的には、ポジティブセレクションとは、対象の組換えポリヌクレオチドが細胞内に存在する場合にのみ、遺伝子改変細胞が毒性物質の存在下で生き残ることができる場合を指す。ネガティブセレクションが可能なマーカー及びスクリーニング可能マーカーも当技術分野で周知であり、本発明によって企図されている。当業者は、利用可能な任意の関連するマーカーが、本明細書に開示される発明を実施する際に利用可能であることを認識するであろう。
本発明の組換え株のスクリーニング及び分子分析は、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して実施することができる。ハイブリダイゼーション手順は、本明細書に記載の技術を使用して改変されたものなどのポリヌクレオチドを、本明細書に教示されるように有用である対象の調節配列に対して十分な相同性をもって同定するために有用である。特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術が改善されると、それらは当業者によって容易に適用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に知られている任意の適切な標識で標識することができる。ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件、例えば温度及び塩濃度は、検出閾値の厳密性を変更するために変更することができる。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる案内には、例えば、Sambrook et al. (1989) vide infra or Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, N.Y.を参照。
さらに、遺伝子改変株のスクリーニング及び分子分析、並びに所望の単離された核酸の作成は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して実施することができる。PCRは、核酸配列の反復的な酵素的プライミング合成である。この手順はよく知られており、この分野の当業者によって一般的に使用されている（Mullis、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、及び第4,800,159号；Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354を参照）。PCRは、標的配列の反対側のストランドにハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する対象のDNAフラグメントの酵素増幅に基づいている。プライマーは、3'末端が互いに向き合うように配向されている。テンプレートの熱変性、プライマーの相補配列へのアニーリング、及びDNAポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長の繰り返しサイクルにより、PCRプライマーの5'末端によって定義されるセグメントが増幅される。各プライマーの伸長物は他のプライマーのテンプレートとして機能できるため、各サイクルは基本的に前のサイクルで生産されたDNAテンプレートの量を２倍にする。これにより、特定の対象フラグメントが指数関数的に蓄積され、数時間で最大数百万倍になる。好熱性細菌サーマス・アクアティカスから単離されたTaqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼを使用することにより、増幅プロセスを完全に自動化することができる。使用可能な他の酵素は、当業者に知られている。
本発明の核酸及びタンパク質はまた、具体的に開示された配列の相同体を包含することができる。相同性（例えば、配列同一性）は50％～100％であり得る。場合によっては、そのような相同性は、80％を超える、85％を超える、90％を超える、又は95％を超える。配列の任意の意図された使用に必要な相同性又は同一性の程度は、当業者によって容易に識別される。本明細書で使用される場合、２つの核酸のパーセント配列同一性は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877として変更されたKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268に開示されたものなどの、当技術分野で知られているアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:402-410のプログラムであるBLASTN、BLASTP、及びBLASTXに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて実行されて、所望のパーセント配列同一性を有するヌクレオチド配列を取得する。比較の目的でギャップのある配列を取得するために、Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402に記載されている通りにGapped BLASTを使用する。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（BLASTN及びBLASTX）のデフォルトパラメータが使用される。www.ncbi.nih.govを参照。当業者は、デフォルト設定で適切なBLASTプログラムを使用して、対象配列を参照配列と整列させることにより、参照配列中のアミノ酸又は核酸に対応する位置がどこで発生するかを対象の配列で容易に決定することができる（例えば、BLASTPの場合：ギャップオープニングペナルティ：11、ギャップ拡張ペナルティ：1、期待値：10、ワードサイズ：3、最大スコア：25、最大配列：15、及びマトリックス：blosum62；並びにBLASTNの場合：ギャップオープニングペナルティ：5、ギャップ拡張ペナルティ：2、核酸一致：1、核酸不一致-3、期待値：10、ワードサイズ：11、最大スコア：25、及び最大配列：15）。
好ましい宿主細胞は植物細胞である。本文脈において、組換え宿主細胞は、単離された核分子を含むように遺伝子改変されたもの、宿主細胞に通常存在し機能する１つ以上の欠失又は他の理由で機能しない遺伝子を含むもの、若しくは少なくとも１つの組換えタンパク質を生産するための１つ以上の遺伝子を含むものである。本発明のタンパク質をコードする核酸は、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーション、又は当業者に既知の他の方法を含むがこれらに限定されない、特定のタイプの細胞に適切である、当技術分野で知られている任意の手段によって導入することができる。
＜植物育種法＞
植物育種は、現在の生殖質の分析、現在の生殖質の問題及び弱点の定義、プログラム目標の確立、及び特定の育種目的の定義から始まる。次のステップは、プログラムの目標を達成するための形質を持つ生殖質の選択である。選択された生殖質は、所望の形質を再結合するために交配され、選択を通じて、品種又は親系統が開発される。目標は、単一の品種又はハイブリッドで、親生殖質からの望ましい形質の改善された組み合わせを組み合わせることである。これらの重要な形質には、より高い収量、フィールド性能、果実と農学的品質の向上、病気や害虫などの生物学的ストレスへの耐性、干ばつや暑さなどの環境ストレスへの耐性が含まれてもよい。
各育種プログラムは、育種手順の効率の定期的で客観的な評価を含むべきである。評価基準は、目標と目的によって異なるが、適切な基準との比較に基づく年間の選択からの利益、高度な育種系統の全体的な価値、及び投入単位あたりに生産された成功した品種の数（例えば、年間、消費された１ドルあたりなど）を含むべきである。有望で高度な育種系統は徹底的にテストされ、少なくとも３年間、商業的対象地域を代表する環境で適切な基準と比較される。最良の系統は、新しい商業栽培品種の候補である；いくつかの形質がまだ不足しているものは、さらなる選択のために新しい個体群を生産するための親として使用される。マーケティングと流通の最終段階につながるこれらのプロセスは、通常、最初の交配又は選択が行われてから５～１０年かかる。
育種又は選択方法の選択は、植物の再生様式、改善される形質の遺伝率、及び商業的に使用される栽培品種のタイプ（例えば、F1雑種栽培品種、近交系栽培品種など）に依存する。遺伝率の高い形質の場合、単一の場所で評価された優れた個々の植物の選択が効果的である一方で、遺伝率の低い形質の場合、関連する植物の科目の反復評価から得られた平均値に基づいて選択する必要がある。遺伝の複雑さも繁殖方法の選択に影響を与える。戻し交配育種は、遺伝性の高い形質の１つ又はいくつかの遺伝子を望ましい品種に移すために使用される（例えば、耐病性品種の育種のために）、一方で反復選択技術は、多数の遺伝子によって制御される定量的に継承された形質に使用され、さまざまな反復選択技術が使用される。一般的に使用される選択方法には、血統選択、改変血統選択、大量選択、及び反復選択が含まれる。
血統選択は、一般に、自家受粉作物又は近交系他家受粉作物の改良に使用される。有利で補完的な形質を有する２つの親は、F1を生産するために交配される。F2個体群は、１つ以上のF1を自家受粉させるか、２つのF1を交配することによって生産される（同胞交配）。最良の個体の選択は通常、F2個体群で開始される；次に、F3から始めて、最良の科目の中の最良の個体が選択される。科目の複製試験、又はこれらの科目の個体を含むハイブリッドの組み合わせは、F4世代で続いて遺伝率の低い形質の選択の有効性を改善することが多い。近親交配の進んだ段階（すなわち、F6及びF7）で、表現型が類似した系統の最良の系統又は混合物が、新しい栽培品種としての潜在的な発表についてテストされる。
大量及び反復選択は、自家受粉作物又は他家受粉作物のいずれかの個体群を改善するために使用することができる。ヘテロ接合体の個体の遺伝的に可変な個体群は、いくつかの異なる親を交配することによって識別又は作成される。最良の植物は、個々の優越性、優れた子孫、又は優れた組み合わせ能力に基づいて選択される。選択された植物は交配されて新しい個体群を生産し、そこでさらに選択のサイクルが続けられる。
戻し交配育種（すなわち、反復選択）を使用して、単純に遺伝した、遺伝性の高い形質の遺伝子を、反復親である望ましいホモ接合型品種又は系統に移すことができる。転送される形質のソースは、ドナー親と呼ばれる。得られた植物は、再発親（例えば、栽培品種）の属性及びドナー親から移された望ましい形質を持っていると予想される。最初の交配の後、ドナーの親の表現型を持っている個体が選択され、再発親と繰り返し交配（戻し交配）される。得られた植物は、再発親（例えば、栽培品種）の属性及びドナー親から移された望ましい形質を持っていることが予想される。
厳密な意味での単一種子降下手順は、分離個体群を植え、植物ごとに１つの種子のサンプルを収穫し、そして前記１つの種子のサンプルを使用して次世代を植えることを指す。個体群がF2から望ましいレベルの近親交配に進むと、系統が由来する植物はそれぞれ異なるF2個体にたどり着く。個体群の植物の数は、いくつかの種子が発芽しなかったり、いくつかの植物が少なくとも１つの種子を生産できなかったりするため、世代ごとに減少する。その結果、世代の進歩が完了したときに、最初に個体群でサンプリングされたF2植物のすべてが子孫によって表されるわけではない。
表現型の観察に加えて、植物の遺伝子型も調べることができる。植物の遺伝子型の分析、比較及び特性評価に利用できる実験室ベースの技術は数多くある；これらの中には、アイソザイム電気泳動、制限断片長多型（RFLP）、ランダム増幅多型DNA（RAPD）、任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（AP-PCR）、DNA増幅フィンガープリント（DAF）、配列特性増幅領域（SCAR）、増幅断片長多型（AFLP）、単純配列反復（SSR、マイクロサテライトとも呼ばれる）、及び一塩基多型（SNP）がある。
分子マーカー、又は「マーカー」はまた、定性的形質選択のための育種プロセス中に使用することができる。例えば、対立遺伝子に密接にリンクされたマーカー、又は実際の対象の対立遺伝子内の配列を含むマーカーを使用して、対象の対立遺伝子を含む植物を選択することができる。選択プロセスでのマーカーの使用はしばしば、遺伝子マーカー強化選択又はマーカー支援選択と呼ばれる。マーカー分析を実施する方法は、当業者に一般的に知られている。
突然変異育種はまた、植物品種に新しい形質を導入するために使用され得る。自発的に発生する、又は人工的に誘発される突然変異は、植物育種家にとって変異性の有用なソースとなる可能性がある。人工突然変異誘発の目標は、望ましい特性のための突然変異率を高めることである。変異率は、温度、長期種子貯蔵、組織培養条件、放射線（X線、ガンマ線、中性子、ベータ放射線、又は紫外線など）、化学変異原物質（5-ブロモウラシルなどの塩基類似体など）、抗生物質、アルキル化剤（硫黄マスタード、ナイトロジェンマスタード、エポキシド、エチレンアミン、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン、ラクトンなど）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンを含む多くの異なる手段によって増加させることができる。突然変異誘発によって所望の形質が観察されると、その形質は、従来の育種技術によって既存の生殖質に組み込まれてもよい。突然変異育種の詳細は、Principles of Cultivar Development: Theory and Technique, Walter Fehr (1991), Agronomy Books, 1 (https://lib.dr.iastate.edu/agron_books/1)に見出すことができる。
二重半数体の生産はまた、育種プログラムにおけるホモ接合型系統の開発に使用することができる。二重半数体は、ヘテロ接合植物からの染色体のセットを２倍にして、完全ホモ接合個体を生産することによって生産される。例えば、Wan, et al., Theor. Appl. Genet., 77:889-892, 1989を参照。
使用され得る育種方法の追加の非限定的な例には、Principles of Plant Breeding, John Wiley and Son, pp. 115-161 (1960)；Principles of Cultivar Development: Theory and Technique, Walter Fehr (1991), Agronomy Books, 1 (https://lib.dr.iastate.edu/agron_books/1)に見出されるものが含まれるが、これらに限定されない、これらを参照により本書に組み込む。
本発明を概して説明してきたが、特定の例を参照することで、本発明がよりよく理解されるであろう、これらは本発明をさらに説明するために本明細書に含まれ、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本開示は、以下の実施例においてさらに詳細に説明されるが、これらはいかなる方法でも請求された開示の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は、本開示の明細書及び開示の説明の必須部分と見なされることを意図している。以下の実施例を説明のために提供するが、これらは請求されている開示を限定するものではない。
実施例１：ルビスコとEPYC1は相互作用し、それらの相互作用の強さを高めるように操作可能である
以下の実施例は、EPYC1の異なる変異体及びルビスコ小サブユニット（SSU）の異なる変異体の開発及び操作を説明する。本実施例はまた、EPYC1変異体とルビスコSSU変異体間の相互作用をテストする酵母ツーハイブリッド実験についても説明する。
＜材料及び方法＞
コナミドリムシ及びシロイヌナズナのルビスコ小サブユニット（SSU）及びコナミドリムシタンパク質必須ピレノイドコンポーネント1（EPYC1）
コナミドリムシは、２つの類似したルビスコSSUホモログ、S1Cr（配列番号30）及びS2Cr（配列番号2）を有する、これらは同じサイズであり、同一のαヘリックス及びβシートを有する。S1CrとS2Crはタンパク質レベルで97.1％の同一性を共有し、アミノ酸配列が４残基のみ異なる（図１Ｄに太字で表示）。これらの４つの残基のうちの１つはβA-βBループにあり、このことは、このループにはS1CrとS2Crの間に１つの残基の違い（A47S）があることを意味している。成熟したシロイヌナズナSSU1A（1AAt；配列番号1；図１Ｃに示す構造）とコナミドリムシSSUは構造的に類似しているが、タンパク質レベルでは45.0％の同一性しかない。コナミドリムシS1Cr及びS2Cr（140アミノ酸（aa））は、全体的に1AAt（125 aa）より長く、1AAtよりも長いβA-βBループ（6 aaの分）及びC末端（9 aaの分）を有する。図３Ａに示すように、SSUのαヘリックス、βストランド、及びβA-βBループの領域は、シロイヌナズナとコナミドリムシとの間で実質的に異なっている。
コナミドリムシタンパク質EPYC1は、より短い末端領域（図１Ａ～１Ｂ）に隣接する４つの非常に類似したリピート領域からなるモジュラータンパク質である（完全長EPYC1＝配列番号34；成熟型EPYC1（すなわち、切断サイト処理後）＝配列番号35）。４つの類似したリピート領域はそれぞれ、予測された無秩序なドメインと、予測されたαヘリックスを含むより短く、より無秩序でないドメインで構成されている。EPYC1タンパク質は、BLASTで、３つのみの密接に関連する藻類種、すなわちオオヒゲマワリ（Volvox carteri）（VOLCADRAFT_103023、63.5％の同一性）、ゴニウム（Gonium pectorale）（GPECTOR_43g955、42.2％の同一性）、及びシアワセモ（Tetrabaena socialis）（A1O1_04388、44.9％の同一性）のタンパク質と整列する。図１５に示すように、３つのホモログはすべて、（EPYC1のように）予測されるαヘリックス領域を有するリピート領域も有する。EPYC1ホモログを持つこれらの藻類の２つの種であるオオヒゲマワリとゴニウムのルビスコSSUは、コナミドリムシS1Crのものとほとんど同じαヘリックスを有する。（図１４Ａ～１４Ｃの太字テキストを参照）。これは、EPYC1とSSUがこれらの種で同様に相互作用することを強く示している。
酵母ツーハイブリッド（Y2H）法
酵母ツーハイブリッドプラスミドベクターpGBKT7（結合ドメインベクター）及びpGADT7（活性化ドメインベクター）を使用して、対象のタンパク質間の相互作用を検出した。遺伝子を、Q5 DNAポリメラーゼ（NEB）及び表１にリストされているプライマーを使用して増幅した。S1CrとS2Crの両方を最初の酵母ツーハイブリッドテストで使用し、その後、S2Crは、コナミドリムシでより高度に発現されるために後の実験で使用した。EPYC1のコード配列を、オンラインツール（www.idtdna.com/CodonOpt）を使用して、高等植物での発現のためにコドン最適化した。EPYC1のすべての変異体をGblockフラグメント（IDT）として合成し、表１にリストされているプライマーを使用して増幅した。次に、増幅された遺伝子を、マルチクローニングサイトを使用して各ベクターにクローン化し、これによりGAL4 DNA結合又は活性化ドメインのいずれかとのそれぞれの融合を作成した。
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適格酵母細胞（Y2Hゴールド、Clontech Laboratories社製）を、カナマイシン（50μg ml-1）を補充したYPDA培地で増殖させた50mlの培養物から調製した。細胞をddH2O及び酢酸リチウム／TE溶液（100 mMのLiAc、10 mMのTris-HCl [pH 7.5]、1 mMのEDTA）で洗浄した後、酢酸リチウム／TE溶液に再懸濁した。次に、50μlのコンピテント細胞を1μgの各プラスミドベクター及びPEG溶液（100mMのLiAc、10 mMのTris-HCl [pH 7.5]、1mMのEDTA、40％[v/v] PEG 4000）と混合することにより、細胞を結合及び活性化ドメインベクターで同時形質転換した。細胞を30℃で３０分間インキュベートし、その後42℃の熱ショックに20分間さらした。細胞を遠心分離し、500μlのYPDAに再懸濁して、30℃で約９０分間インキュベートした後、遠心分離して、TE（10mMのTris-HCl [pH 7.5]、1mMのEDTA）で洗浄した。ペレットを200μlのTEに再懸濁して、SD-L-W（ロイシンとトリプトファンを含まない標準的なデキストロース培地（最小酵母培地）、Anachem社製）上に広げ、30℃で３日間増殖させた。得られたコロニーの１０～１５個を同時形質転換ごとにプールし、単一培養で２４時間増殖させた。翌日、1mlの培養物を回収し、細胞密度（OD600）を測定し、遠心分離して、TEで希釈して、0.5又は0.1の最終的なOD600を得た。
次に、酵母培養物を、SD-L-W（ロイシン（L）及びトリプトファン（W）を欠く酵母合成最小培地）及びSD-L-W-H（L、W、及びヒスチジン（H）を欠く酵母合成最小培地）（Anachem社製）にプレーティングした。結合ドメイン構成物及び活性化ドメイン構成物の両方を発現する酵母をSD-L-Wで成長させ、両方のプラスミドの存在を確認した。相互作用の強さを評価するために、酵母を、異なる濃度のHIS3阻害剤3-アミノトリアゾール（3-AT）でSD-L-W-Hにプレーティングした。次に、これらのプレートを３日間インキュベートしてから、成長の有無を評価して、van Nues and Beggs（van Nues and Beggs, Genetics (2000) 157: 1451-1467）に記載されている通りに半定量的酵母ツーハイブリッドアッセイを実行した。同じ酵母形質転換を各相互作用研究に使用した。同じ酵母形質転換プレート上の異なるコロニーは、独立した生物学的複製と見なされた（大腸菌の場合）。２つの生物学的複製（各相互作用の上部と下部の行）を、異なる液体培養濃度（0.5及び0.1 OD）からスポットした。各相互作用実験を少なくとも２回実行した。酵母相互作用研究の要約図を図３Ｃ、４Ｊ～４Ｋ、及び５Ｅに示す。
表２は、酵母ツーハイブリッドアッセイで使用されたベクターの説明を提供する。図２Ａ～２Ｂは、表２にリストされた最初の７つのベクター（pGBKT7_EPYC1からpGADT7_LSUCr）を使用したアッセイの結果の例を示す；各相互作用実験は２つの生物学的複製を有し、少なくとも２回実行した。図３Ｃ、４Ｊ～４Ｋ、及び５Ｅは、中央の３１個のベクター（pGADT7_1AAtMOD（βシート）からpGBKT7_synthEPYC1αヘリックスノックアウト2）を使用したアッセイからの結果の要約図を示す。図２Ｂ～２Ｃは、最後の10個のベクター（pGBKT7_LSUCrからpGADT7_LSUAt）を使用したアッセイの結果の例を示す；各相互作用実験は２つの生物学的複製を有し、少なくとも２回実行した。
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タンパク質抽出を、溶解バッファー（50mMのTris HCl [pH233 6]、4%[v/v] SDS、8M尿素、30％[v/v]グリセロール、0.1 M DTT、0.005％[w/v]ブロモフェノールブルー）における一晩おいた液体培養から１のOD600に酵母細胞を再懸濁し、65℃で30分間インキュベートし、10％（w/v）Bis-Trisタンパク質ゲル（エクスペデオン）に直接乗せることによって実施した。図４Ｉに示す免疫ブロットにおいて、EPYC1 :: GAL4結合ドメインのN末端トランケートバージョンを発現する酵母からタンパク質を抽出し、抗EPYC1で免疫ブロットした。
液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）
細胞溶解物を、Mackinderら(Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963)に従って、コナミドリムシ細胞から調製した。2％（w/v）ジギトニンで膜を可溶化した後、清澄化した溶解物を、20μgの抗EPYC1抗体でインキュベートした150μlのプロテインAダイナビーズに塗布した。ダイナビーズ細胞溶解物を4℃で回転させながら１．５時間インキュベートした。次に、ビーズを0.1％（w/v）ジギトニンを含むIPバッファー（50mMのHEPES、50mMのKOAc、2 mMのMg(OAc)2.4H2O、1mMのCaCl2、200mMのソルビトール、1mMのNaF、0.3mMのNA3VO4、Roche cOmplete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤）で4回洗浄した。EPYC1を、溶出バッファー（50mMのTris-HCl、0.2Mグリシン[pH2.6]）で10分間インキュベートすることによりビーズから溶出し、前記溶出液を直ちに1:10（v/v）Tris-HCl（pH8.5）で中和した。少量の溶出液をSDS-PAGEゲルで泳動し、クーマシーで染色して（図６Ａ）、残りのサンプルをLC-MSに使用した。
インタクトタンパク質LC-MS実験を、エレクトロスプレーイオン化（すなわち、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）；Waters Corp社製、Manchester、英国）を備えたSynapt G2 Q-ToF機器で実施した。LC分離を、逆相C4 Aeris Widepore 50×2.1mm HPLCカラム（Phenomenex社製、CA、米国）を備えたAcquity UPLCで達成し、5～95％アセトニトリル（0.1％ギ酸）のグラジエントを10分以上使用した。MassLynxv4.1を使用してデータ分析を実行して、デコンボリューションはMaxEntを使用して実行した。
EPYC1のPCOILS分析
PCOILSは、提出されたタンパク質配列におけるコイルドコイル（コイル状コイル）ドメインの存在の確率（０～１）を予測するオンラインツール（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/pcoils）である。提出後の直接出力を図５Ｆに示す。
＜結果＞
EPYC1は、Y2HアッセイでコナミドリムシSSU及び改変シロイヌナズナSSUと相互作用する
コナミドリムシSSUの２つのαヘリックス（図１Ｃ～１Ｄ）は、EPYC1の潜在的な結合部位であると以前に提案された（図１Ａ～１Ｂ）（Meyer, et al., PNAS (2012) 109: 19474-19479；Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）。この仮説は、半定量的Y2Hアプローチを使用してテストされた。Y2Hアッセイでは、EPYC1は、コナミドリムシSSUホモログ、S1Cr及びS2Crのいずれとも比較的強いタンパク質間相互作用（すなわち、10 mMの3-ATで増殖）を示した（図２Ａ）。対照的に、EPYC1はシロイヌナズナの1A SSU（1AAt）とは相互作用しなかったが、コナミドリムシのαヘリックスを持つハイブリッド1A SSUとは弱く相互作用した（1AAtMOD；Atkinson, et al., New Phyt. (2017) 214: 655-667に記載）。
Y2Hアッセイはさらに、EPYC1がそれ自体とは相互作用しないことを示した（図２Ａ～２Ｂ）。 図２Ｂ～２Ｃに示すように、EPYC1はまた、ピレノイドに関連する他のコナミドリムシCCMコンポーネント（すなわち、LCIB、LCIC、及びCAH3）、又は葉緑体ストローマに見られる別の天然変性タンパク質（AtCP12、Lopez-Calcagno, et al., Front. Plant Sci. (2014) 5:9に記載）と相互作用しなかった。これらの結果は、EPYC1がY2Hアッセイで偽陽性のタンパク質間相互作用を起こしやすくはないことを示している。
高等植物のルビスコSSUを、EPYC1への親和性を高めるように操作することができる
次に、EPYC1との相互作用に必要なコナミドリムシSSU上の主要なドメインを同定した。SSUの構造成分を分離するために、3つの異なるβシート（βA、βC、及びβD）、βA-βBループ、及び２つのαヘリックス（αA及びαB）に関連するS1Crからの1AAt含有残基の合計６つの異なるキメラバージョンを生産した（Spreitzer, Arch. Biochem. Biophys, (2003) 414: 141-149）（図３Ｂ）。
以前のように、Y2Hアッセイでテストした場合、EPYC1は1AAtと相互作用しなかった（図３Ｃ）。 S1Crからのβシート又はβA-βBループ、あるいはその両方を備えたキメラ1AAtも、相互作用を可能にしなかった。相互作用は、EPYC1とコナミドリムシSSUの2つのαヘリックスを有するキメラ1AAtの間でのみ観察された（図３Ｃ）。S1Crαヘリックスのみを有するS1Cr 1AAtは、最小限の相互作用（すなわち、0 mMの3-AT）を生み出し、これは、S1Crのβシート及びβA-βBループの組み込みによって強化された。特に、コナミドリムシのαヘリックス、βシート、及びβA-βBループを有する改変1AAt変異体（すなわち、S1Crに対して79％の配列同一性を有する）は、S1Crと比較してより強い相互作用を示した（図３Ｃ）。これらの結果は、コナミドリムシSSUの構造成分を含めることにより、高等植物のルビスコSSUのEPYC1への親和性を高めるように操作することができることを示している。
EPYC1は、ルビスコSSUとの相互作用の強さを高めるように操作することができる
ルビスコSSUとの相互作用に必要なEPYC1の主要な領域を特徴づけるために、様々なトランケート型EPYC1変異体を作成した。EPYC1は、N末端とC末端の短い末端領域に隣接する４つの非常に類似した反復配列からなるモジュラータンパク質であるため、N末端又はC末端のいずれかの方向から順次各領域を除去するためにトランケーションをした（図４Ａ～４Ｂ；図４Ｃ～４Ｄに示す天然EPYC1タンパク質を有するこれらの配列のアラインメント）。トランケーションされたEPYC1変異体は酵母でよく発現した（図４Ｉ）。トランケート型EPYC1変異体を使用したY2Hアッセイの結果を図４Ｊに示す。EPYC1のN末端（N-ter）のみ、S1Crと相互作用しなかったが、第１EPYC1リピート領域の追加は相互作用の検出に十分であった。後続の各リピート領域の追加は、3-ATの濃度の増加での成長と相関し、EPYC1がモジュラータンパク質であること、及び各リピートがSSUとの相互作用に相加効果を有することを確認した。C末端テールの追加は、相互作用の強さをさらに高めた。興味深いことに、C末端のみでもS1Crと相互作用し、このことはSSU結合部位がリピート領域に限定されなかったことを示唆している。
EPYC1とSSUとの間の相互作用は、４つのリピートのそれぞれにおいて予測保存αヘリックスを介して媒介され得、これらはともに、EPYC1が少なくとも４つのルビスコ複合体に結合することを可能にすると仮定された（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963；Freeman Rosenzweig, et al., Cell (2017) 171: 148-162）。前記４つのドメインのそれぞれの相対的な寄与を、予測されるα-ヘリックス構造を、第１リピート中の残基「RQELESL」（配列番号119）及び後続の３つのリピート中の「KQELESL」（配列番号120）の７つのアラニンへの変異を介して排除することによって分析した（図４Ｅ～４Ｆ；天然EPYC1プロテインを有するこれらの配列のアラインメントを図４Ｇ～４Ｈに示す）。図４Ｋに示すように、単一ヘリックスの変異は、Y2Hアッセイでテストした場合、相互作用の強さに影響を与えなかった。しかし、αヘリックス領域の変異が増加（つまり、追加）するにつれてS1Crとの相互作用が順次弱くなることが観察された。４つのαヘリックスすべてが変異した場合、相互作用は完全には根絶されなかった。後者の発見は、４つすべてのαヘリックスが存在しない場合、相互作用の強さがC末端のみの相互作用の強さと同じに減少したため、C末端に追加のSSU結合部位があるという証拠を裏付けた（図４Ｊ）。全体として、データは、EPYC1がその４つのリピート領域とC末端のそれぞれにそれぞれ位置する少なくとも５つのSSU相互作用部位を持っていることを示唆した。
PCOILSを用いたEPYC1の分析は、EPYC1の推定上のαヘリックスがコイルドコイルドメインのように振る舞い、第１リピートが最も高い予測値を示すことがあることを示唆した（図５Ｃ）（Gruber, et al., J. Struct. (2006) 155: 140-145；Zimmermann, et al., J. Mol. Bio. (2017) 430: 2237-2243）。したがって、第１リピート領域は、SSU相互作用に対する親和性が増加した合成EPYC1を操作するための有用な標的足場である可能性があるとの仮説が立てられた。タンデムに第１リピートの１、２、４又は８コピーを含む４つの合成EPYC1変異体を構築した（図５Ａ；配列を図５Ｂ～５Ｄに示す）。図５Ｅに示すように、第１リピートの４つのコピー（合成EPYC1 ４リピート）は、Y2Hアッセイでテストした場合、天然成熟型EPYC1と比較してS1Cr及び1AAtMODとのより強い相互作用強度を示した。最も強い相互作用は、８つのリピート（合成EPYC1 ８リピート）の変異体で観察され、これはテストした最大3-AT濃度（80mM）で成長した。
シングルコピー変異体（合成EPYC1 １リピート）を使用して、PCOILSツール（図５Ａ）からの予測に基づくαヘリックス領域の改変を、相互作用強度について比較した（図５Ｅ）。αヘリックス領域の複製（SVLPANWRQELESLRNNWRQELESLRNGNGSS（配列番号121））又はαヘリックス付近のG-Q置換（WRQELESLRNQ（配列番号122））は、コイルドコイル挙動の可能性の増加を予測した（図５Ｆ）。PCOILSによる予測とは対照的に、前者の改変は相互作用を根絶したが、後者は天然１リピート変異体と比較して相互作用の強さを変更しなかった。最後に、αヘリックス内のL-R置換（WRQELESRRNG（配列番号123））又はαヘリックス内のE-W R置換（WRQWLESLRNG（配列番号124））をそれぞれ行って、相互作用のノックアウトを試みた。いずれの置換も相互作用を根絶した。これらの結果は、EPYC1αヘリックスが従来のコイルドコイルドメインのように振る舞わなかったが、αヘリックス内の単一の点突然変異でも相互作用に影響を与える可能性があることを示唆した。これらの結果は、図４Ｋに提示された結果を裏付けた。
EPYC1のN末端は切断部位を含む
N末端の除去もまた相互作用強度を増加させ、このことは、葉緑体へのインポート中に切断されるであろう葉緑体輸送ペプチドとしてのN末端の予測される役割と一致した（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）。予測ツールChloroP及びPredAlgoは、それぞれ残基78及び残基170での切断を示唆した（Emanuelsson, et al., Nat. Protoc. (2007) 2: 953-971）。ただし、いずれの予測も、EPYC1機能に必要なリピート領域内での切断をもたらすため、説得力がなかった。潜在的な切断部位を同定するために、コナミドリムシのEPYC1を免疫沈降し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）を使用して分析した。インタクトタンパク質ESI-MS分析は、29622～30621 Daの範囲の成熟型EPYC1のいくつかのプロテオフォームを明らかにした（図６Ｃ）。プロテオフォーム間の分子量の差は80Daであり、様々なリン酸化状態を示唆している。この観察結果は、EPYC1の高度にリン酸化された性質を強調する以前の報告と一致した（Turkina, et al., Proteomics (2006) 6: 2693-2704；Wang, et al., MCP (2014) 13: 2337-2353）。EPYC1の翻訳後高度に改変された状態は、成熟タンパク質の正確な分子量の決定を困難にした。しかしながら、同定された最小のプロテオフォームは、分子量が29.6 kDaであり、これは、EPYC1の理論的質量に基づいて、残基26（V）と27（A）の間の切断部位を示した（図１Ｂ）。
実施例２：EPYC1は高等植物の葉緑体を標的にすることができ、EPYC1はルビスコと植物内で相互作用する
以下の実施例は、EPYC1発現を高等植物葉緑体（例えば、ニコチアナベンサミアナ及びシロイヌナズナ）に首尾よく標的化することができたEPYC1構築物の操作を説明する。高等植物の葉緑体で発現した場合、EPYC1は植物内でルビスコと相互作用することを示した。
＜材料及び方法＞
植物材料と成長条件
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana、Col-0）の種子を堆肥に播種し、4℃で３日間層状化し、20℃、周囲CO2、相対湿度70％及び150μmolフォトンm-2 s-1で１２時間の明期及び１２時間の暗期の条件で成長させた。異なる遺伝子型を比較するために、同一の環境条件で育てられた植物から収穫した、同一の年齢及び貯蔵履歴の種子から植物を育てた。ニコチアナベンサミアナを、20℃で150μmolのフォトンm-2s-1で１２時間の明期及び１２時間の暗期の条件で成長させた。
設計と形質転換の構築
EPYC1のコード配列を、オンラインツール（www.idtdna.com/CodonOpt）を使用して、高等植物における発現のためにコドン最適化した。EPYC1のすべての変異体をGblockフラグメント（IDT）として合成し、Plant MoCloシステムのレベル0アクセプターベクターpAGM1299及びpICH41264（Engler, et al., ACS Synth. Bio. (2014) 3: 839-843）、若しくはC末端又はN末端のYFPを含むpB7WG2,0ベクターに直接クローン化した。表３に、植物の形質転換に使用したベクターの説明を示す。図７Ｂ～７Ｃ、８Ａ～８Ｃ、及び９Ａは、最初の５つのベクター（pICH47742_EPYC1 :: GFPからpAGM8031_EPYC1 :: GFP_pFast）を使用したアッセイの結果の例を示す。図８Ｄ～８Ｅは、最後の１１個のベクター（pB7_S2Cr :: YFPNからpB7_S2Cr :: YFPN）を使用したアッセイの結果の例を示す。
Figure 2022542372000104
融合タンパク質を生産するために、遺伝子発現構築物をバイナリーレベルMアクセプターベクターに組み立てた。レベルMベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1）に形質転換して、ニコチアナベンサミアナでの一過性遺伝子発現（Schob, et al., Mol. and Gen. Genetics (1997) 256: 581-585）又はフローラルディッピングによるシロイヌナズナ植物への安定した挿入を行った（Clough and Bent、Plant J.（1998）16：735-743）。ホモ接合性挿入系統を、pFAST-R選択カセットを使用してT3世代で同定した（Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528）。
DNA及び葉のタンパク質分析
表４に列挙した遺伝子特異的プライマーを使用して、PCR反応を、McCormick及びKruger（McCormick and Kruger, Plant J. (2015) 81: 570-683）にあるように実施した。
Figure 2022542372000105
可溶性タンパク質を、２１日齢の植物（６番目及び７番目の葉）の凍結葉材料から、200mMのDTTを含む5xBolt LDSサンプルバッファー（Thermo Fisher Scientific社製）中で、70℃で15分間抽出した。抽出物を遠心分離し、その上清を4～12％（w/v）ポリアクリルアミドゲルでSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを、1：10,000希釈の小麦ルビスコ（Howe, et al., PNAS (1982) 79: 6903-6907）又は1：2,000希釈のEPYC1（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）に対して算出されたウサギ血清、続いて1：10,000希釈のHRP結合ヤギ抗ウサギIgG（Abcam社製）でプローブして、Pierce ECLウエスタンブロッティング基質（Life Technologies社製）を使用して視覚化した。
成長分析と光合成測定
WT、S2Cr又は1AAtMODバックグラウンドのいずれかで1AAtTP（1AAt-TP :: EPYC1）と融合したEPYC1を発現するシロイヌナズナ植物系統をテストした。バックグラウンド（WT、S2Cr、又は1AAtMOD）ごとに３つの独立して転換されたT3系統（系統１、系統２、及び系統３）を測定し、EPYC1を欠くこれらの対応する分離系統（系統１セグメント、系統２セグメント、及び系統３セグメント）と比較した。
成長分析のために、植物を３１日目に収穫し、新鮮重量（FW）及び乾燥重量（DW）を測定した。 図８Ｂ～８Ｃの値は、１２個のロゼット（FW及びDW測定の場合）又は１６個のロゼット（成長アッセイの場合）で行われた測定の平均±SEである。アスタリスクは、スチューデントの対応有りt検定によって決定された、転換された系統と分離体の間のFW又はDWの有意差（P <0.05）を示す。ロゼットの成長率は、インハウスイメージングシステムを使用して定量化した（Dobrescu, et al., Plant Methods (2017) 13: 95）。
光合成測定のために、成長分析に使用されたものと同じ植物を３１日目（収穫前）に測定した。１２の植物のそれぞれからの単一の葉で行われた測定の平均±SEを以下の表５に示す。光化学系II（PSII）（暗順応葉蛍光；Fv/Fm）の最大量子収率を、Hansatech Handy PEA連続励起葉緑素蛍光光度計（Hansatech Instruments Ltd．社製）を使用して測定した（Maxwell and Johnson, J. of Exp. Bot. (2000) 51: 659-668）。
共免疫沈降と免疫ブロッティング
補完されたルビスコ変異体バックグラウンド（S2Cr、1AAtMOD又は1AAt）でEPYC1を発現する３５日齢のシロイヌナズナ植物のロゼットを液体窒素中で急速凍結及び粉砕した。等量のIP抽出バッファー（100mMのHEPES [pH 7.5]、150mMのNaCl、4mMのEDTA、5mMのDTT、0.4mMのPMSF、10％[v/v]グリセロール、0.1％[v/v] Triton- X-100、及び10mlあたり１つのRochecOmplete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤）を添加し、サンプルを4℃で15分間回転させ、4℃で遠心分離し、２層のMiracloth（Merck）でろ過した。ビーズを廃棄する前に、IPバッファーで事前に平衡化した50μlのプロテインAダイナビーズ（ThermoFisher Scientific社製）で4℃で１時間インキュベートすることにより、各抽出物（2 ml）を事前に清澄化した。3.5μgの抗EPYC1抗体を50μlのプロテインAダイナビーズに適用し、これを4℃で３０分間回転させることによって、抗体でコーティングされたビーズを作成した。前記抗体を、Pierce BS3架橋剤（Thermo Scientific社製）を使用して前記ビーズに架橋した。各タンパク質抽出物を抗体でコーティングされた前記ビーズでインキュベートし、4℃で２時間回転させた。未結合のサンプル（フロースルー）を廃棄し、前記ビーズを洗浄バッファー（20 mMのTris-HCl [pH 8]、150 147mMのNaCl、0.1％[w/v] SDS、1％[v/v] Triton-X-100、2mMのEDTA）で４回洗浄した。ビーズを廃棄する前に、50μlの溶出バッファー（2x LDSサンプルバッファー、200 mMのDTT）を添加して70℃で１５分間加熱することによって、免疫複合体を溶出した。
溶出された免疫複合体をSDS-PAGE及び免疫ブロッティングに供した。1AAt-TP :: EPYC1抗体血清は、EPYC1のC末端を標的とする（Emanuelsson, et al., Nat. Protoc. (2007) 2: 953-971）。免疫ブロッティングには、２つの抗体：Mackinder, et al., PNAS (2016) 171: 133-147の抗EPYC1及び抗ルビスコ（Mackinder 2016で使用され、Howe, et al., PNAS (1982) 79: 6903-6907で最初に公開されたルビスコ抗体）を使用した。図８Ｅにおいて、デンシトメトリーを使用して、シロイヌナズナタンパク質抽出物中のEPYC1の比率を、コナミドリムシ抽出物中のそれと比較した。ここから、EPYC1からルビスコLSUへの化学量論を推定した。図９Ａにおいて、右側のブロット（Co-IP）は、ルビスコ大サブユニット（LSU）に対する抗体でプローブされたときの結果を示す。左から右へのレーンは、それぞれ入力（Input）、フロースルー（F-T）、４回目の洗浄（Wash）、及び沸騰溶出液（Elute）の結果を示しており、これらはSDS-pageゲル上で実行されて、ニトロセルロースメンブレンに転写されて、抗ルビスコ又は抗EPYC1抗体のいずれかでプローブした。ネガティブコントロール（Neg.）を、プロテインAビーズ上の抗EPYC1抗体を抗HA抗体（*）又は抗体なし（**）に置き換えて、以前と同様にIPを続行することによって実行した（その溶出されたサンプルのみを図示）。三重のアスタリスク（***）は、EPYC1（S2Cr）を発現しないコントロール系統を含むすべてのサンプル内の抗EPYC1抗体で観察された非特異的なバンドを示す。
二分子蛍光補完分析（BiFC）
二分子蛍光補完分析（BiFC）を実施して、インビボでのEPYC1ルビスコ相互作用についての追加情報を提供した。それぞれC末端でYFPN又はYFPCのいずれかに融合した３つのルビスコSSU（1AAt、S2Cr、及び1AAtMOD）及びEPYC1は、ニコチアナベンサミアナで一過性に共発現した（Walter, et al., Plant J. (2004) 40: 428-438）。
共焦点レーザー走査顕微鏡
Atkinsonらにあるように、葉をLeicaTCS SP2レーザー走査型共焦点顕微鏡又はLeicaTCS SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮像した（Atkinson, et al., Plant Biotech. J. (2016) 14: 1302-1315）。
＜結果＞
EPYC1は高等植物の葉緑体を標的にすることができる
EPYC1は、高等植物における核発現のためにコドン最適化され（図７Ａ）、バイナリー発現ベクターが構築された、そしてそれにより、EPYC1がGFPにC末端で融合され、35S構成的プロモーターの制御下で発現された。レベルMアクセプターpAGM8031をプラスミドアセンブリーに使用した。上記の表３に記載されているベクターを使用して、ニコチアナベンサミアナの葉を農業浸透させた、及びシロイヌナズナ植物を安定して形質転換した。次に、EPYC1 :: GFPの局在化を、ニコチアナベンサミアナの葉（図７Ｂ）及び安定して形質転換されたシロイヌナズナ植物（図７Ｃ）で視覚化した。これまでに植物で発現した他の葉緑体CCM成分とは異なり（Atkinson, et al., Plant Biotech. J. (2016) 14: 1302-1315）、EPYC1は、葉緑体の存在しない蛍光シグナルでは、ニコチアナベンサミアナ又はシロイヌナズナ葉緑体に局在することができなかった（図５Ａ～５Ｂのオーバーレイ画像を参照）。したがって、1AAt葉緑体輸送ペプチド（1AAt-TP）を完全長EPYC1 :: GFPのN末端に付加した。1AAt-TPへの融合は、ニコチアナベンサミアナ（図７Ｂの行１対行２）及びシロイヌナズナ（図７Ｃの行１対行２）の両方で葉緑体ストローマへのEPYC1 :: GFPの再局在化をもたらした。
植物の葉緑体におけるEPYC1の発現は、植物の成長又は光合成効率を妨げない
野生型シロイヌナズナ植物及び以前にAtkinsonら（Atkinson, et al., New Phytol. (2017) 214: 655-667）（図３Ａ）によって作製された、S2Cr又は1AAtMODで補完した２つのルビスコ小サブユニット（1a3b）突然変異株を、1AAt-TP :: EPYC1（GFPタグを欠いている）で形質転換した（プラスミドマップについては図７Ａを参照）。各バックグラウンドからの３つのホモ接合T3系統を、さらなる分析のために選択した（EPYC1_1-3；S2Cr_EPYC1_1-3及び1AAtMOD_EPYC1_1-3）。
成長分析は、対応する分離体と比較して、1AAt-TP :: EPYC1を発現するいくつかの植物についてわずかに減少した成長表現型（すなわち、面積、FW及びDW）を示したが、観察された減少は一貫した有意なものではなかった（図８Ｂ～８Ｃ）。
表５は、シロイヌナズナ植物を発現するEPYC1についてのPSII（Fv/Fm）測定の最大量子収量を示す。３つの遺伝的バックグラウンド（WT、S2Cr、及び1AAtMOD）のそれぞれについて、３つの独立して形質転換されたT3系統（系統1、系統2及び系統3）を測定し、EPYC1を欠くそれぞれの対応する分離株（系統1セグメント、系統2セグメント及び系統3セグメント）と比較した。遺伝的バックグラウンドに関係なく、1AAt-TP :: EPYC1の添加は、暗順応した葉の蛍光；Fv/Fmによって測定されるように、光合成効率に影響を与えなかった。
Figure 2022542372000106
シロイヌナズナにおける1AAt-TP :: EPYC1に対する免疫ブロットは、約34kDa（成熟した天然コナミドリムシアイソフォーム［35kDa］よりわずかに小さい）の優性バンドを生産し、このことは、1AAt-TP及びEPYC1の一部のN末端領域（抗体血清はEPYC1のC末端を標的とした）の両方の切断を示唆した（Emanuelsson, et al., Nat. Protoc. (2007) 2:953-971）（図８Ｄ及び９Ａ）。デンシトメトリー分析は、最高発現のシロイヌナズナ系統におけるEPYC1のタンパク質レベルが、ルビスコLSUに関してコナミドリムシにおけるEPYC1のタンパク質レベルよりも約14倍低いことを示した（図８Ｅ）。低CO2条件下で成長したコナミドリムシのルビスコLSUに対するEPYC1のカルシウムの報告された割合１：６に基づいて（Mackinder, et al., PNAS (2016) 171: 133-147）、トランスジェニック系統のシロイヌナズナLSUに対するEPYC1の化学量論は従って１：８４と推定された。この比率はまた、インビトロで再構成されたピレノイドシステムの相分離物質におけるルビスコあたり１～４個のEPYC1ペプチド（すなわち、8個のLSU）の観察された発生よりも低かった（Wunder, et al., Nat. Commun. (2018) 9: 5076）。29kDaの非特異的バンドに加えて、シロイヌナズナのEPYC1でいくつかの小さなバンドも明らかであった（図８Ａ）。コナミドリムシ又は酵母から抽出されたEPYC1については、追加のバンドは観察されず（図８Ｄ）、このことは、EPYC1が植物プロテアーゼの標的となる可能性があることを示唆している。
上記の結果は、葉緑体におけるEPYC1の構成的発現が、テストされた条件下で植物成長に影響を及ぼさなかったことを示した。さらに、葉緑体におけるEPYC1の構成的発現は、Fv/Fmで測定したように、植物の光合成効率に影響を与えなかった。
EPYC1は高等植物でルビスコと相互作用する
特定のSSUが酵母ツーハイブリッドシステムにおいてEPYC1と相互作用できることを示したため、次に、ルビスコとの相互作用が植物内で起こるか否かを調査した。複数のシロイヌナズナ植物系統、具体的には２つの補完された1a3b変異系統及びEPYC1を発現する１つの野生型系統（それぞれS2Cr_EPYC1_1、1AAtMOD_EPYC1_1及びEPYC1_1）を評価した。EPYC1は、プロテインAコーティングビーズに付着した抗EPYC1抗体を使用してこれらの各系統から免疫沈降し、溶出液をEPYC1又はルビスコに対する抗体を使用した免疫ブロットによって分析した（図９Ａ）。予期せぬことに、S2Cr_EPYC1及び1AAtMOD_EPYC1系統の溶出液、並びにEPYC1を発現する野生型でLSUを検出した。観察された共免疫沈降（co-IP）が、ルビスコの無差別性又はビーズ又は抗体への非特異的結合の結果ではないことを確認するために、いくつかのネガティブコントロールを含んだ。ルビスコは、抗HAコーティングビーズ又は抗体を含まないビーズを使用したプルダウンの溶出液、又はEPYC1で形質転換されていないS2Cr植物からの溶出液では検出されなかった。したがって、これらの結果は、コナミドリムシ又はコナミドリムシ様のSSUの非存在下で、形質転換された植物系統内でEPYC1がルビスコと相互作用できることを示した。しかし、この相互作用は、ピレノイドの場合のように液体様相分離に似た目に見える凝集体を促進するのに十分ではなかった。テストした３つの系統間のEPYC1発現レベルの固有の変動のため、相互作用の相対的な強さを完全に定量化することはできなかった。それにもかかわらず、EPYC1 IPアッセイで溶出されたEPYC1のレベルは類似しており、その一方で1AAtMOD_EPYC1及びS2Cr_EPYC1 co-IPアッセイで溶出されたルビスコの量が多いことは、野生型バックグラウンドよりもこれらの系統でのEPYC1との強い相互作用を示唆している可能性がある。
図９Ａに示す免疫沈降の結果と一致して、どのタンパク質がYFPNに融合され、どのタンパク質がYFPCに融合したかに関係なく、EPYC1を共発現する植物及び３つのSSUのそれぞれにおいて、再構成されたYFP蛍光のBiFCシグナルが観察された（図９Ｂ～９Ｅ）。ただし、例３で説明した結果は、EPYC1と1AAtSSUの間で観察された見かけの相互作用は真の相互作用ではないことを示している。代わりに、この相互作用は、分割されたYFPの両半分の自己組織化の傾向の結果として観察された可能性がある（Waadt, et al., Plant J. (2008) 56: 506-516）。同様に、ネガティブコントロールであるAtCP12 :: YFPCは、予期せず1AAt:: YFPNでBiFCシグナルを生産したが、1AAt:: YFPCとAtCP12 :: YFPNの間に相互作用が観察されなかったため、この相互作用は人為的なものであった可能性が高いある。EPYC1と1AAtSSUの間で観察された見かけの相互作用は相分離を促進するのに十分な真の相互作用ではなかったという解釈は、以下の実施例３に示す実験結果によって確認された。
実施例３：EPYC1は、異種システムで液体様凝集体を示すように操作できる、及びTobiEPYC1構成物の発現は、高等植物の葉緑体に球状の凝集体をもたらす
以下の実施例は、インビトロシステムを使用した、EPYC1の液体様凝集体の検出について説明する。さらに、以下の実施例は、高等植物の葉緑体におけるTobiEPYC1 :: GFP構成物の球状凝集体の検出について説明する。
＜材料及び方法＞
タンパク質生産、液滴沈降アッセイ及び顕微鏡検査
ルビスコを、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル濾過の組み合わせを使用して、25～30日齢のシロイヌナズナロゼット（野生型植物及びS2Cr系統）から精製した（Shivhare and Mueller-Cajar, Plant Phys. (2017) 1505-1516）。S2Cr系統のハイブリッドルビスコ複合体は、シロイヌナズナLSU並びにシロイヌナズナSSUとS2Crの混合個体群（約1：1）で構成した（Atkinson, et al., New Phytol. (2017) 214: 655-667）。ルビスコはコナミドリムシ細胞（CC-2677）からも精製した。EPYC1及びEPYC1 :: GFPを、大腸菌で生産し、Wunderら（Wunder, et al., Nature Commun. (2018) 9: 5076）に記載されている通りに精製した。
EPYC1-ルビスコ液滴を、バッファーA（20mMのTris-HCl [pH8.0]及び50mMのNaCl）で５分間、10μlの反応で室温にて再構成し、21,100×gで４分間の遠心分離によってバルク溶液から4℃で分離した。EPYC1による液液相分離を、Wunderら（Wunder, et al., Nature Commun. (2018) 9: 5076）によって開発されたインビトロアッセイを使用してテストした。ペレット（液滴）及び上清（バルク溶液）画分をSDS-PAGE及びクーマシー染色にかけた。
光学及び蛍光顕微鏡では、反応溶液（5μl）を、微分干渉コントラストの設定を使用したNikon Eclipse Ti倒立顕微鏡、及びカバースリップ表面に焦点を合わせた100倍の油浸対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡（フルオレセインイソチオシアネートフィルター設定を使用）で３～５分後に撮像した。使用したカバースリップは22×22mm（Superior Marienfeld社製、ドイツ）で、22×22カバースリップ用の１ウェルChamlideCMSチャンバー（Live Cell Instrument社製、韓国）に固定した。ImageJを使用して、すべての画像を疑似カラー化した。
免疫金ラベリング及び電子顕微鏡
２１日齢のS2Cr及びS2Cr_EPYC1植物から葉のサンプルを採取し、4％（v/v）パラホルムアルデヒド、0.5％（v/v）グルタルアルデヒド及び0.05Mカコジル酸ナトリウム[pH7.2]で固定した。リーフストリップ（幅1mm）を固定液で１５分間３回真空浸透させた後、4℃で一晩回転させた。サンプルをPBSで３回すすぎ、次に50％、70％、80％、90％エタノール（v/v）で１時間、その後100％エタノールで３回、真空浸透させて順次乾燥させた。サンプルを、濃度を増やしてエタノールと混合したLRホワイトレジン（30％、50％、70％[w/v]）で１時間ずつ浸透させ、次に100％レジンで３回浸透させた。レジンをカプセル内で50℃で一晩重合させた。切片（厚さ1μm）をLeicaウルトラカットウルトラミクロトームで切断して、トルイジンブルーで染色して、光学顕微鏡で観察して、調査に適した領域を選択した。選択した領域から超薄切片（厚さ60 nm）を切り取り、プラスチックでコーティングされた銅グリッドに載せた。グリッドをTBSTT中の1％（w/v）BSA（0.05％[v/v] Triton X-100及び0.05％[v/v] Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水）でブロックし、1：250希釈のTBSTT内で抗ルビスコ抗体で一晩インキュベートし、それぞれTBSTT及び水で２回洗浄した。TBSTT中の15nmの金粒子結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Abcam）でのインキュベーションを、以前と同じように洗浄する前に、1：200希釈で１時間行った。グリッドを2％（w/v）酢酸ウラニルで染色し、JEOL JEM-1400 Plus TEMで観察した。画像をGATAN One Viewカメラで収集した。
TobiEPYC1は、設計と植物の形質転換を構築し、データを集約する
TobiEPYC1遺伝子発現カセットを図１２Ａに示す。カセット1（TobiEPYC1）は、天然EPYC1のトランケートバージョンを含む、これは、トランケートN末端ドメイン（配列番号40）の、完全長第１～第１４リピート領域（最も薄い灰色（配列番号36）、灰色（配列番号69）、灰色（配列番号70）、及び黒色（配列番号71））、及び完全長C末端ドメイン（配列番号41）を含む。カセット２（TobiEPYC1 :: GFP）は、GFPと融合した天然EPYC1の同じトランケートバージョンを含む。カセット３（４リピートTobiEPYC1）は、第１リピート領域（配列番号38）の４つのコピーを有するEPYC1の合成バージョンを含む。カセット４GFP（４リピートTobiEPYC1 :: GFP）は、GFPと融合した第１リピート領域の４つのコピーを有するEPYC1の同じ合成バージョンを含む。カセット５（８リピートTobiEPYC1）は、第１リピート領域（配列番号39）の８つのコピーを有するEPYC1の合成バージョンを含む。カセット６（８リピートTobiEPYC1 :: GFP）は、GFPと融合した第１リピート領域の８つのコピーを有するEPYC1の同じ合成バージョンを含む。
バイナリープラスミド構成物を、Golden Gate MoCloシステム（Engler, et al., ACS Synth. Bio. (2014) 3: 839-843）によって組み立てた。プラスミドは、図１２Ｂ～１２Ｃに示すように、２つのTobiEPYC1発現カセットを含んでいた。下の表６は、TobiEPYC1遺伝子カセットで植物の形質転換に使用されたベクターの説明である。
Figure 2022542372000107
ベクターのシロイヌナズナへの形質転換は、実施例２に記載されているフローラルディッピング法を使用して行った。表６のベクターごとに、少なくとも３つの別々の植物系統を作成した。
TobiEPYC1 :: GFP植物系統における凝集体の検出
TobiEPYC1 :: GFPトランスジェニック植物系統からの組織を、実施例２に記載されている通りに、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。共焦点画像はインタクト葉組織（図１２Ｄ～Ｆ，１２Ｌ，１３Ａ～Ｂ）又は葉組織から抽出された葉肉プロトプラスト（図１２Ｇ～Ｋ）からのものであった。各TobiEPYC1 :: GFPバリアント（表６に示す）の少なくとも２つの別個の植物系統からの少なくとも１つの複製を撮像した。
凝集体の特徴を、光退色後の蛍光回復（FRAP）によって分析した。FRAPを、LeicaSP8共焦点顕微鏡、及びPMT検出器を備えた63倍の水浸対物レンズを使用して実行した。GFP蛍光を、488nmでの励起と504-532nmでの発光によって撮像した。ブリーチ前後の画像には、レーザー出力を2％に設定した、一方でブリーチ自体は56％のレーザー出力で実行した。ブリーチ前の画像を189ミリ秒間隔（合計６）で撮影し、ブリーチ後の画像を400ミリ秒間隔（合計１５０）で撮影した。光退色を、１つの葉緑体内のTobiEPYC1 :: GFP凝集体の１つの小さな領域にレーザーを向けることによって葉のサンプルで実行した。光退色後の回復時間は、ブリーチ領域と非ブリーチ領域のGFP発現を比較することによって計算した。
実施例２に記載されている通り、EPYC1及びコナミドリムシルビスコSSUの存在が、免疫ブロットによって確認された。
＜結果＞
高等植物大サブユニット（LSU）及び高等植物とコナミドリムシSSUの混合集団を含むハイブリッドルビスコはEPYC1で相分離する
ピレノイド形成の現在のモデルは、液体様相分離を促進する特定の弱い多価相互作用に基づいている（Hyman, et al., Annu. Rev. Cell Biol. (2014) 30: 39-58；Freeman Rosenzweig, et al., Cell (2017) 171: 148-162）。このような相互作用がハイブリッド植物由来のルビスコで起こり得るかどうかを観察するために、S2Crで補完されたシロイヌナズナ1a3b変異体由来のルビスコが、Wunderら（Wunder, et al., Nature Commun. (2018) 9: 5076）によって開発されたインビトロアッセイを使用してEPYC1との液液相分離を促進できるかどうかを調べた。コナミドリムシルビスコと同様に、ハイブリッド植物ルビスコ（S2Cr系統由来）はEPYC1と分離でき、EPYC1：ルビスコの比率はわずかに高くなったが、同等サイズの液体様液滴を形成した（図１０Ａ～１０Ｂ；図１０Ｃに示す時間経過）。対照的に、野生型シロイヌナズナルビスコは同様の条件下で相分離せず、S2Crの存在が凝集体にとって緊要であることを示している。コナミドリムシ又はハイブリッド植物ルビスコを含む溶液では、液滴は大きな均質な液滴に融合し（合体）、その液体の性質をサポートする（図８Ｃ）（Hyman, et al., Annu. Rev. Cell Biol. (2014) 30: 39-58）。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析による分析は、EPYC1及びルビスコの両方が液滴に入ったことを確認した（図１０Ｄ～１０Ｅ）。
EPYC1は、高等植物の葉緑体で凝集体を形成するように操作することができる
植物内でのルビスコ凝集体に対するEPYC1の効果を調べるために、最高レベルのEPYC1を発現するS2Cr補完シロイヌナズナ1a3b変異体（S2Cr_EPYC1_1）の葉緑体におけるルビスコの局在化を調査した。ルビスコの免疫金標識は、TEMで可視化した場合、葉緑体全体に金粒子が均一に分布していることを明らかにしたが、これは、EPYC1を発現しないS2Crコントロールと同様であった（図１１Ａ～１１Ｂ）。このことは、EPYC1とコナミドリムシSSUの共発現が、これらの形質転換体においてルビスコの検出可能な厳密な凝集体を誘発しなかったことを示した。
TobiEPYC1で形質転換された植物の高等植物葉緑体で球状凝集体が観察される
最初に、２つのバージョンのEPYC1を植物における発現についてテストした。これらの最初のものは、N末端で78残基がトランケーションされて（ChloroPオンラインツールに基づく予測葉緑体輸送ペプチド）、シロイヌナズナルビスコSSU 1Aの葉緑体シグナルペプチドの長いバージョン（80残基、MASSMLSSATMVASPAQATMVAPFNGLKSSAAFPATRKANNDITSITSNGGRVNCMQVWPPIGKKKFETLSYLPDLTDSE（配列番号62））に融合したEPYC1であった。これらの２番目のものは、シロイヌナズナルビスコSSU 1A（80残基；配列番号62）の葉緑体シグナルペプチドの長いバージョンに融合した完全長EPYC1（317残基；配列番号34）であった。これらの２つのバージョンのいずれも、野生型植物、又はコナミドリムシSSUを発現する安定したトランスジェニックシロイヌナズナ系統のいずれかにおける凝集の証拠を提示しなかった。
これらの２つの以前のバージョンと比較して、TobiEPYC1構成物を３つの方法で最適化した（TobiEPYC1遺伝子発現カセットを図１２Ａに示す）。第一に、新たなEPYC1のN末端トランケート（26残基；配列番号40）を使用した。第二に、前記トランケート型EPYC1を、シロイヌナズナルビスコSSU1Aの、より短い葉緑体シグナルペプチド（57残基；配列番号63）に融合した。輸送ペプチドがより長い以前のバージョンは成功せず、このことは輸送ペプチドの長さが緊要である可能性があることを示している。
第三に、発現レベルを増加させることを目的として、EPYC1発現カセットの２つのコピーをバイナリープラスミドに含んだ。さらに、１つのコピーは２つのターミネーターを有し（図１２Ｂを参照）、報告によると約２５倍の発現を増加させた戦略である（Diamos and Mason, Plant Biotech. J. (2018) 16: 1971-1982）。GFP発現レベルのより低い系統では依然として凝集体が観察されたが、これらの系統の凝集体はより小さく、EPYC1発現カセットの２つのコピーが必要である可能性があることを示している。これらの結果は、ルビスコSSUとEPYC1の量が凝集体の観察に重要である可能性があることを示している。コナミドリムシSSUの発現に使用されたシロイヌナズナ1a3b変異体は、天然SSUの量が減少していた（Izumi, et al., J. Exp Bot. (2012) 63(5): 2159-2170）。したがって、トランスジェニック系統は、50％の天然SSU及び40％のコナミドリムシSSUを発現すると以前に推定されていた（Atkinson, et al., New Phytol. (2017) 214, 655-667）。60 mg m-2のコナミドリムシSSUがトランスジェニック系統に存在することが、ルビスコ含有量測定及び免疫ブロット分析に基づいて推定された（Supp. Table S3 in Atkinson, et al., New Phytol. (2017) 214, 655-667）。16 kDの重量に基づくと、60 mg m-2コナミドリムシSSUは3.75μmol m-2コナミドリムシSSUと同等であった。コナミドリムシで報告されたルビスコとEPYC1の比率は、ルビスコの大サブユニットで1：6及び小サブユニットで1：1（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963）から小サブユニットで1：8（Hammel, et al., Front. Plant Sci. (2018) 9: 1265）の範囲であった。ワンダー他（Wunder, et a., Nat. Commun. (2018) 9: 5076）は、7.5μMのEPYC1が30μMのルビスコ活性部位を完全に分離できることを発見した、これは、ルビスコあたり２つのEPYC1分子の比率に対応する。植物内で最適となるルビスコに対するEPYC1の正確な比率はまだ解明されていない。ただし、上記の結果は、EPYC1の２つのコピーがそれぞれシングルターミネーターとダブルターミネーターを有する構成的プロモーターの下で発現された場合、総SSUプールの40％コナミドリムシSSUが凝集に十分であることを示した。
図１２Ｄは、ゲイン25及びレーザー2％で撮像されたニコチアナベンサミアナにおけるEPYC1 :: GFPの一過性発現を示す、一方で図１２Ｅは、ゲイン10及びレーザー1％で撮像されたニコチアナベンサミアナにおけるTobiEPYC1 :: GFPの一過性発現を示す。これらの画像は、ニコチアナベンサミアナにおけるTobiEPYC1 :: GFPの一過性発現レベルが非常に高いことを示している。図１２Ｆは、シロイヌナズナS2Cr系統におけるTobiEPYC1 :: GFPの安定した発現の蛍光顕微鏡画像を示す。オーバーレイ画像は、TobiEPYC1 :: GFPが葉緑体に凝集したことを明確に示している。これらの凝集体は高度に球形であるように見え、このことは相分離体を示した。図１２Ｇ～１２Ｉは、シロイヌナズナプロトプラストにおけるTobiEPYC1 :: GFPの安定した発現の蛍光顕微鏡画像を示す。図１２Ｉは、TobiEPYC1凝集体の位置で下部葉緑素が観察されたことを示している。（矢印で表示）。これは、図１２Ｊの画像でも観察された。（中央の行は図１２Ｉと同じ画像であることに注意）、ここで、ＧＦＰ、葉緑素、及び明視野画像のオーバーレイは、重複する蛍光の領域を含まなかった。これらの結果は、葉緑体チラコイドがEPYC1凝集体から除外されていることを示唆した。図１２Ｋに示す画像は、葉緑体を離れるEPYC1凝集体のものである（矢印で表示）。これらの葉緑体-外部EPYC1凝集体は、観察期間中、培地内で凝集したままであった。図１２Ｌに示す画像は、TobiEPYC1 :: GFPを安定して発現する野生型シロイヌナズナのプロトプラストの蛍光顕微鏡画像である。GFPと葉緑素自己蛍光チャネルのオーバーレイは、重複する蛍光の領域を白色で示した。これは、シロイヌナズナS2Cr系統とは異なり、EPYC1が野生型シロイヌナズナ系統では凝集体を形成できず、その代わりに葉緑体全体に拡散した発現のみが観察されたことを示した。これらの結果は、コナミドリムシSSUの構造的特徴がEPYC1凝集体を観察するために必要であることを示した。
図１３Ａ～１３Ｄは、シロイヌナズナ組織内のEPYC1 :: GFP凝集体を特徴付けるFRAPイメージングの時間経過の結果を示す。光退色後の回復時間は、Wunder等（Wunder, et al., Nat. Commun. (2018) 9: 5076）においてインビトロで分離された液滴で観察されたものと同様であった。図１３Ｅに示すウエスタンブロットの結果は、TobiEPYC1遺伝子発現カセットが、N末端のトランケート及びより高いレベルの発現にもかかわらず、分解を示すいくつかのバンドを植物内でまだ生産したことを示した。全体として、これらの結果は、コナミドリムシSSUの構造的特徴を発現する高等植物（例えば、シロイヌナズナ）におけるTobiEPYC1遺伝子発現構築物の発現が、高等植物の葉緑体における球状凝集体の形成をもたらしたことを示した。
実施例４：トランケート成熟型EPYC1の発現の増加は、高等植物の葉緑体においてルビスコを相分離した液体様凝縮構造に安定的に凝集させる
下記の実施例では、植物-藻類ハイブリッドルビスコとともに、バイナリー発現ベクターから高レベルのトランケート成熟型EPYC1を発現する、シロイヌナズナの植物系統におけるEPYC1-ルビスコ葉緑体凝縮体の分子的及び細胞的特性を説明する。さらに、植物が異なる光レベルで成長する場合の、植物の代謝に対する凝縮物の影響について説明する。
本実施例は、上記の実施例３において「TobiEPYC1 :: GFP」と呼ばれる、図１２Ｃ及び図１２Ｂの第２行において示すものと同じ構成物を使用する。ただし、この実施例及び対応する図では、前記構成物を「TobiEPYC1 :: GFP」ではなく「EPYC1-dGFP」と呼ぶ。
＜材料及び方法＞
植物材料と成長条件
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana、Col-0バックグラウンド）の種子をコンポストに播種し、4℃で3日間層状化して、20℃、周囲CO2、相対湿度70％、クールホワイトLEDライト（Percival SE-41AR3cLED、CLF PlantClimatics GmbH社製、Wertingen、ドイツ）から供給された200又は900μmolフォトンm-2s-1の下で１２時間の明期及び１２時間の暗期で成長させた。異なる遺伝子型を比較するために、同じ環境条件で育てられた植物から収穫された、同一の年齢及び貯蔵履歴の種子から植物を育てた。
S2Crシロイヌナズナバックグラウンド系統（コナミドリムシからのSSUで補完された1a3bルビスコ変異体）は、Atkinsonら（New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）に記載されている。1AAtMODシロイヌナズナバックグラウンド系統は、Meyerら（PNAS, 109, 19474-19479, doi:10.1073/pnas.1210993109 (2012)）及びAtkinsonら（New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）に記載されている。
設計と形質転換の構築
EPYC1のコード配列を、Atkinsonら（J. Exp. Bot. 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）にあるように高等植物での発現のためにコドン最適化した。トランケート成熟型EPYC1を、Plant MoCloシステムのレベル0アクセプターベクターpAGM1299に直接クローン化した（Engler, C. et al. A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants. Acs Synth Biol 3, 839-843, doi:10.1021/sb4001504 (2014)）。融合タンパク質を生産するために、遺伝子発現構成物をバイナリーレベル２アクセプターベクターに構築した。実施例２に記載されている通りに、フローラルディッピングによるシロイヌナズナ植物への安定した挿入のため、レベル２ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGL1）に形質転換した。pFAST-R選択カセットを使用して、T2世代でホモ接合性のトランスジェニック系統及び単一セグメントを同定した(Shimada, et al., Plant J. (2010) 61: 519-528)。
デュアルGFP発現用のバイナリーベクター（EPYC1-dGFP）の概略図を図１６に示す。EPYC1発現カセットの注釈付き完全配列は、配列番号171に提供されている。
タンパク質分析
２１日齢の植物（６番目と７番目の葉）の凍結葉材料から可溶性タンパク質を、タンパク質抽出バッファー（17.4％グリセロール、2％Triton X-100及びcOmplete MiniEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50mのMHEPES-KOH pH 7.5（Roche社製、Basel、スイス））で抽出した。サンプルを1 x Bolt LDSサンプルバッファー（Thermo Fisher Scientific社製、英国）及び200mMのDTTを使用して70℃で15分間加熱した。抽出物を遠心分離し、その上清を12％（w/v）ポリアクリルアミドゲルでSDS-PAGEにかけて、ニトロセルロースメンブレンに転写した。
1：10,000希釈で小麦ルビスコに対して産生されたウサギ血清（Howe, et al., PNAS (1982) 79: 6903-6907）、コナミドリムシからのSSU RbcS2に対して産生されたウサギ血清（CrRbcS2）（205 Southampton、英国におけるEurogentec社製によってSSUのC末端領域（KSARDWQPANKRSV（配列番号172）に産生）の1：1,000希釈、抗アクチン抗体（英国Proteintech社製のベータアクチン抗体60008-1-Ig））の1：1000希釈、及び／又は抗EPYC1抗体の1：2,000希釈（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963 doi:10.1073/pnas.1522866113）、続いてIRDye800CWヤギ抗ウサギIgG（LI-COR Biotechnology社製、Cambridge、英国）の1：10,000希釈で膜をプローブして、Odyssey CLxイメージングシステム（LI-COR Biotechnology社製）を使用して視覚化した。
コンデンセート抽出
上記の「タンパク質分析」のセクションで説明したように可溶性タンパク質を抽出し、Miracloth（Merck Millipore、Burlington、Massachusetts、米国）でろ過して、Mackinderら（PNAS 113: 5958-5963 (2016)）にあるように、500gで4℃で３分間遠心分離した。ペレットを廃棄して、抽出物を再度１２分間遠心分離した。得られたペレットをタンパク質抽出バッファーで１回洗浄した後、少量のバッファーに再懸濁して、再度５分間遠心分離した。最後に、前記ペレットを25μlの抽出バッファーに再懸濁して、以下に説明するように共焦点分析又はSDS-PAGE電気泳動に使用した。
成長分析と光合成測定
ロゼットの成長率を、Dobrescuら（Plant methods 13, 95 (2017)）に記載されているイメージングシステムを使用して定量化した。光化学系II（PSII）の最大量子収率（Fv / Fm）を、Hansatech Handy PEA連続励起クロロフィル蛍光光度計（Hansatech Instruments Ltd社製、King's 222 Lynn、英国）を使用して、32日齢の植物で計測した（Maxwell and Johnson、J Exp Bot 412 51、659-668（2000））。200μmolフォトンm-2 s-1の下で大きな鉢で育てられた３５～４５日齢の非開花ロゼットの６番目又は７番目の葉のいずれかに対して、6400-40リーフチャンバーを備えたLI-COR LI-6400（LI-CO社製、Lincoln、Nebraska、米国）携帯用赤外線ガス分析装置を使用してガス交換及びクロロフィル蛍光を決定して、Flexasら（New Phytologist 175, 501-511, doi:10.1111/j.1469-8137.2007.02111.x (2007)）にあるように、ガス交換測定に十分な葉面積を生産した。細胞間CO2濃度（Ci）に対する正味CO2同化（A）の応答を、50、100、150、200、250、300、350、400、600、800、1000及び1200μmol mol-1CO2で飽和光（1,500μmolフォトンm-2 s-1）の下で測定した。すべてのガス交換実験で、流量を200μmol mol-1に維持して、葉の温度は25℃に制御して、チャンバー内の相対湿度は約70％に維持した。測定は、正味の同化と気孔コンダクタンスが定常状態に達した後に行った。Bellasioら（Plant Cell Environ 39, 1180-1197, doi:10.1111/pce.12560 (2015)）にあるように、ガス交換データを測定チャンバーからのCO2拡散について補正した。下の表７に示す平均値±平均値の標準誤差（SEM）は、ガス交換変数の場合は35～45日齢のロゼット7個、又はFv/Fmの場合は32日齢のロゼット12個で測定したものである。以下の表７に示すFv/Fm値は、蛍光測定の前に４５分間暗順応された付着葉の値である。
ルビスコのカルボキシル化の最大速度（Vcmax）、最大電子輸送速度（Jmax）、ルビスコに正規化されたCO2の周囲濃度での正味のCO2同化速度（ARubisco）、CO2補償点（Γ）、及びCO2に対する葉肉コンダクタンス（細胞間空域から葉緑体ストローマへの経路を横切るCO2のコンダクタンス；gm）を推定するために、Ethier及びLivingston（Plant Cell Environ 27, 137-153, doi:10.1111/j.1365-3040.2004.01140.x (2004)）にあるように、25℃での野生型シロイヌナズナルビスコに対する触媒パラメーターKc air及びO2（Ko）値に対する親和性、並びにWT系統及びS2Cr系統のルビスコ含有量を使用して、A/CiデータをC3光合成モデルに適合した（Atkinson, N. et al. New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。Ethier及びLivingston（Plant Cell Environ 27, 137-153, doi:10.1111/j.1365-3040.2004.01140.x (2004)）及びDiamosら（Plant Biotech J 16, 1971-1982, doi:10.1111/pbi.12931 (2018)） にあるように、gmを測定した。
共焦点レーザー走査と超解像画像顕微鏡
Atkinsonら（Plant Biotech J 14, 1302-1315, doi:10.1111/pbi.12497 (2016)）にあるように、レイカTCS SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica Microsystems社製, Milton Keynes, 英国）で葉を撮像した。画像処理は、レイカLAS AF Liteソフトウェアを使用して行った。凝縮物と葉緑体の寸法は、Fiji（ImageJ、v1.52n）を使用して共焦点画像から測定した（Schindelin et al., Nature Methods 9, 676-682, doi:10.1038/nmeth.2019 (2012)）。凝縮液の体積を、球として計算した。葉緑体の体積は、深さが測定された幅の25％と推定された楕円体として計算した。葉緑体の体積は24～102μm3の間で変動し、これはシロイヌナズナ葉緑体の予想サイズ範囲及び分布内であった（Crumpton-Taylor et al., Plant Phys 158, 905-916, doi:10.1104/pp.111.186957 (2012)）。Itakuraら（PNAS 116, 18445-18454, doi:10.1073/pnas.1904587116 (2019)）に記載されている通りに、Fijiを使用してWTコナミドリムシ細胞（cMJ030）のTEM断面画像に対して比較ピレノイド面積測定を実行した。
超解像画像を、構造化照明顕微鏡を使用して取得した。サンプルは高精度カバーガラス（Zeiss社製, Jena, ドイツ）上で準備した。3D SIM画像を、100x 1.49NAレンズ及び屈折率が一致した液浸油（Nikon Instruments社製）を使用してN-SIM（Nikon Instruments社製, 英国）で取得した。サンプルを、Plan Apo TIRF対物レンズ（NA 1.49、油浸）、及び488nmレーザーラインを使用したAndorDU-897X-5254カメラを使用して撮像した。zスタックのZステップサイズは、メーカーのソフトウェアの要求に応じて0.120μmに設定した。NIS-Elementsソフトウェアを使用して、焦点面ごとに１５枚の画像（５相、３角度）を撮影した。SIM画像処理、再構成及び分析は、NIS-Element AdvancedResearchソフトウェアのN-SIMモジュールを使用して実施した。SIMcheckソフトウェア（http://www.micron.ox.ac.uk/software/SIMCheck.php）を使用して、画像のアーティファクトをチェックした。画像は、NiS Elementsソフトウェアv4.6（Nikon Instruments社製）を使用して、1μm以上の光学セクションで構成されるzスタックから再構成した。すべてのSIM画像再構成において、Wiener and Apodizationフィルターパラメーターを一定に保った。
免疫金ラベリング及び電子顕微鏡
葉のサンプルを、２１日齢のS2Cr植物及びEPYC1-dGFPを発現するS2Crトランスジェニック系統から採取して、上記の実施例３に記載されている通りに固定、調製、及び切片化した。ブロックされたグリッドを、1：250希釈のTBSTT中の抗ルビスコ抗体又は1:50希釈の抗CrRbcS2抗体で一晩インキュベートして、TBSTTと水でそれぞれ２回洗浄した。TBSTT中の15nmの金粒子結合ヤギ抗ウサギ二次抗体(Abcam社製, Cambridge, 英国）を用いたインキュベーションを、上記の実施例３に記載されている通りに洗浄する前にルビスコ標識の場合は1：200希釈、CrRbcS2標識の場合は1:10で１時間実施した。染色、観察、及び画像収集を、上記の実施例３において記載するように実施した。
統計分析
結果を分散分析（ANOVA）にかけ、サンプル群間の差の有意性を判断した。ANOVA実行時に、Tukeyの正直有意差（HSD）事後検定を実行して、個々の処理間の差異を決定した（IBM SPSS Statistics Ver. 26.0, Chicago, IL, 米国）。
＜結果＞
S2Crトランスジェニックシロイヌナズナ植物で発現したデュアルGFPタグ付きトランケート型EPYC1は、タンパク質分解が少なかった
EPYC1を、残基26（V）と27（A）の間の予測輸送ペプチド切断部位に従ってトランケートした（Atkinson et al., J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）。デュアルGFP発現システム（図１６）を、高レベルのEPYC1発現及びルビスコによる良好な化学量論を達成するために開発した。これは、２つの遺伝子発現カセットを含むバイナリーベクターで構成され、それぞれがシロイヌナズナ葉緑体シグナルペプチドでトランケート型EPYC1をコードし、異なるバージョンのGFP（turboGFP（tGFP）又は拡張GFP（eGFP））に融合して、組換え事象の変化を低減した。EPYC1発現カセットの注釈付き完全配列は、配列番号171に提供されている。
デュアルGFP構成物（EPYC1-dGFP）を、WT植物、又はコナミドリムシ（S2Cr）のルビスコSSUで補完されたシロイヌナズナ1a3bルビスコ変異体に形質転換した。得られたトランスジェニック植物（それぞれEp1、Ep2、及びEp3と名付けられた３つの系統）は、EPYC1 :: eGFP及びEPYC1 :: tGFPの両方を発現し、このうち後者は概してより高度に発現した（図１７）。
上記の実施例２及びAtkinsonら（J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）では、S2Cr又はWT植物で他の構築物を使用して発現された完全長EPYC1に対する免疫ブロットは、タンパク質分解を示す追加の低分子量バンドを示した（図８Ａ）。対照的に、成熟型EPYC1の発現は、EPYC1-dGFP構成物がWT植物と比較してS2Crで発現した場合、分解産物のレベルの低下をもたらした（より低い重量のバンドによって示す）（図１７）。
S2Cr及び1AAtMODシロイヌナズナバックグラウンドでのEPYC1-dGFP発現は、葉緑体ストローマで凝縮液形成を引き起こした
WT植物におけるEPYC1-dGFPの蛍光シグナルは、葉緑体全体に均一に分布していた（図１８Ａ、上段；図１９Ａ、左パネル）。対照的に、ハイブリッドS2Cr植物のEPYC1-dGFPは、単一の高密度葉緑体シグナルのみを示した（図１８Ａ、中央の行；図１９Ａ、中央のパネル）。透過型電子顕微鏡法により、葉緑体ストローマに単一の顕著な凝縮複合体が存在することが確認された（図１８Ｂ）。この凝縮物は球形であり、天然葉緑素自己蛍光を置換しており（図１８Ｃ～１８Ｅ）、チラコイド膜マトリックスがコンデンセートから除外されたことを示している。葉の葉肉細胞のプロトプラストでは、各葉緑体に凝縮物が見られ（図１８Ｇ）、凝縮物の平均サイズはEPYC1-dGFPの発現レベルに関連していた（図１７、１８Ｈ、１８Ｊ～１８Ｌ）。
前記凝縮物の平均直径は1.6±0.1μm（n = 126；３つの個別のS2Crトランスジェニック系統からそれぞれ42）（図１８Ｆ、１８Ｊ）であり、これはコナミドリムシピレノイドの測定されたサイズ範囲（1.4±0.1μm；n = 55）（Itakura et al., PNAS 116, 18445-18454, doi:10.1073/pnas.1904587116 (2019)）に匹敵した。前記凝縮物の推定体積は2.7±0.2μm3（葉緑体体積の約5％）であった（図１８Ｋ～１８Ｌ）。個々のS2CrトランスジェニックEp系統内の凝縮液量の変動は、葉緑体量と相関しておらず（図１８Ｋ～１８Ｌ）、このことは、凝縮液の形成とサイズの調節が葉緑体の形態とはほとんど無関係であったことを示唆した。
EPYC1-dGFPが、コナミドリムシ（1AAtMOD）のルビスコ小サブユニットからのピレノイド形成に必要な2つのαヘリックスを含むように改変された天然シロイヌナズナSSUで補完されたシロイヌナズナ1a3bルビスコ変異体で発現した場合にも、凝縮物が観察された（図１８Ａ、下の行）。ただし、1AAtMODバックグラウンドの凝縮物は点状が少なく（図19A、右パネル）、これは、酵母ツーハイブリッド実験で観察されたEPYC1に対する改変天然ルビスコSSUの親和性が低いことと一致していた（図２Ａ～２Ｃ、３Ｃ、５Ｅ）（Atkinson et al., J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）。ハイブリッドルビスコの触媒特性がWTルビスコのそれと区別がつかなかった1AAtMODバックグラウンドでの凝縮物形成（Atkinson et al., New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）（図１８Ａ、１９Ａ）は、相分離、ルビスコ含有量及び性能を最適化するためにSSUをさらに操作できることを示した。
さらに、EPYC1 :: tGFP又はEPYC1 :: eGFP発現カセットのいずれかが個別にS2Crシロイヌナズナバックグラウンドに形質転換されたときに、目視可能な凝縮物が形成された（図１８Ｉ）。
上記の実施例２において、シロイヌナズナ葉緑体におけるEPYC1-dGFPの完全長（すなわち、トランケーションされていない）変異体の発現は、相分離をもたらさなかった（図７C；Atkinson et al., J Exp Bot 70, 5271-5285, doi:10.1093/jxb/erz275 (2019)）、これは、低レベルの発現、EPYC1とルビスコの間の互換性のない化学量論、及びタンパク質分解の可能性に起因していた。対照的に、この実施例の結果は、凝縮物形成が、EPYC1発現自体のレベルよりも成熟型EPYC1変異体の発現に依存している可能性があることを示す。この実施例はまた、凝縮物の形成に必要なEPYC1とルビスコの間の化学量論が高等植物で達成可能であったことも示した。さらに、本実施例の結果で観察されたEPYC1のタンパク質分解の見かけの減少（図１７）は、相分離区画内のEPYC1の隔離によって引き起こされる可能性があり、これは、これらの区画は大きなプロテアーゼ複合体にアクセスしにくいと仮定されているためである（van der Hoorn and Rivas, New Phytol 218, 879-881, doi:10.1111/nph.15156 (2018)）。
前記凝縮液は液体のような特性を示す
光退色後の蛍光回復（FRAP）アッセイを、ピレノイドの液体のような挙動と一致する内部混合特性の存在をテストするために、EPYC1-dGFPを発現する生きたS2Crシロイヌナズナ葉細胞の凝縮物で実施した。凝縮物は、光退色の２０～４０秒後に完全な蛍光を回復した（図１９Ｂ～１９Ｃ）。これは、シロイヌナズナ凝縮物中のEPYC1-dGFP分子が、以前のインビトロレポート（Wunder et al., Nat Commun 9, 5076, doi:10.1038/s41467-018-07624-w (2018)）及びインアルガレポート（Freeman Rosenzweig et al., Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）と比較して同様又は加速した速度で混合することを示している。コナミドリムシピレノイドと比較してトランスジェニックシロイヌナズナ凝縮物のより迅速な交換は、S2Cr植物-藻類ハイブリッドルビスコバックグラウンドのルビスコ上のEPYC1結合部位の利用可能性がコナミドリムシのものと比較して比較的低いためであると考えられる（Mackinder, et al., PNAS (2016) 113: 5958-5963; Freeman Rosenzweig et al., Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）。対照的に、ホルムアルデヒドで化学的に架橋された葉組織の凝縮物は、光退色後に回復を示さず（図１９Ｂ～１９Ｃ）、これは、コナミドリムシピレノイドで観察されたものと一致していた（Freeman Rosenzweig et al., Cell 171, 148-162, doi:10.1016/j.cell.2017.08.008 (2017)）。
さらに、EPYC1-dGFPを発現するS2Crシロイヌナズナ植物から抽出されて次にインビトロで再懸濁された凝縮物は、より大きな液滴に合体した（図２０Ｃ）。液滴形成は、インビトロでのEPYC1-ルビスコ相互作用に関連することが知られている液体のような挙動である（Wunder et al., Nat Commun 9, 5076, doi:10.1038/s41467-018-07624-w (2018)）。
EPYC1-dGFPを発現するシロイヌナズナ葉緑体の凝縮物は、EPYC1-dGFP及びルビスコに富む
ルビスコの存在をテストするために、緩やかな遠心分離によってシロイヌナズナの葉組織から凝縮物を抽出し、免疫ブロットで調べた。EPYC1-dGFPを発現するS2Crシロイヌナズナ植物からの単離された凝縮物（ペレット画分）は、EPYC1-dGFP及びルビスコの大小サブユニットの両方に富むことを示した（図２０Ａ）。
ルビスコSSUに関しては、図２０Ａに示すウエスタンは、単離された凝縮物が天然シロイヌナズナSSUと比較してコナミドリムシSSUに富むという定性的証拠を提供した（つまり、コナミドリムシSSU（CrRbcS）の増加対天然シロイヌナズナSSU（AtRbcS）の減少）。変性したゲル分離抽出物のその後のクーマシー染色を使用して、総S2Cr可溶性タンパク質抽出物と凝縮物に富むペレットとの間に定量的差異（パーセンテージ）を生成した。これは、最初の抽出物中のルビスコのほぼ半分（49％）がコナミドリムシSSUを含み、その一方でペレット状の凝縮液中のルビスコの82％がコナミドリムシSSUを含んでいたことを明らかにした（図２０Ｂ）。
クーマシー染色と一致して、EPYC1-dGFPを発現するS2Crからの葉緑体のTEM画像の免疫金分析（図２０Ｄ、２０Ｆ）は、ルビスコの約半分（54％）が凝縮液に局在する（コナミドリムシLSU及びSSUよりも高等植物LSU及びSSUに対してより高い特異性を持つポリクローナルルビスコ抗体で評価した場合）一方で、コナミドリムシSSUの81％が凝縮液に局在することを示した（図２０Ｅ）。したがって、ルビスコの凝縮は、シロイヌナズナS2CrバックグラウンドのルビスコSSUプールの約50％を構成するコナミドリムシSSUを有するルビスコ複合体と強く関連していた（図２０Ａ～２０Ｂ）。後者は、S2Crにおける植物-藻類ハイブリッドルビスコの予想される発現レベルと一致している（Atkinson et al., New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
シロイヌナズナのEPYC1-dGFP発現は成長を損なわない
成長の比較を、凝縮物の存在についてスクリーニングされた３つの別々のT2 EPYC1-dGFP S2Crトランスジェニック系統（Ep1-3）及びそれぞれのT2単一セグメント（単一分離株／azygous segregant）S2Cr系統（Az1-3）で行った。成長は、２つの異なる光レベルでの培養後に評価した：シロイヌナズナの成長に典型的な光レベル（200μmolフォトンm-2 s-1）（図２１Ａ～２１Ｂ、２１Ｅ～２１Ｆ）、及び典型的な光レベルよりも高いレベル（900μmolフォトンm-2 s-1）（図２１Ｃ～２１Ｄ、２１Ｇ）。以前の研究では、植物の成長は、200μmolフォトンm-2 s-1よりも900μmolフォトンm-2 s-1の下でルビスコ活性によって制限されることが示されている（Lauerer et al., Planta 190, 332-345, doi:10.1007/bf00196962 (1993)）。
成長条件に関係なく、ロゼット膨張率又はバイオマス蓄積は、S2Cr形質転換体とそれらの分離コントロールとの間で区別できなかった（図２１Ａ～２１Ｇ）。同様に、T2 EPYC1-dGFP WT植物（EpWT）は、T2分離系統（AzWT）と比較して有意差を示さなかった（図２１Ａ～２１Ｇ）。S2Cr系統の性能は、WT植物と比較してわずかに低下した（図２１Ａ～２１Ｅ）、これは、S2Crバックグラウンドのルビスコ含有量が減少したためと考えられた（Atkinson et al., New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。S2CrとWT系統の間で観察された成長の違いは、EPYC1の非存在下におけるS2Cr及びWT植物について以前に報告されたものと一致していた（Atkinson et al., New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
シロイヌナズナのEPYC1-dGFP発現は光合成を損なわない
飽和光下での細胞間CO2濃度に対するCO2同化率の応答曲線から得られた光合成パラメーターは、それぞれのEPYC1-dGFP発現株と単一セグメントの間で類似していた（図２１Ｈ～２１Ｋ；下の表７）。凝縮物の存在は、ルビスコのカルボキシル化の達成可能な最大速度に影響を与えなかった（Vcmax；図２１Ｊ；下の表７）。
表７は、シロイヌナズナのS2Crトランスジェニック系統及びWTトランスジェニック系統のガス交換及び蛍光測定から得られた光合成パラメーターを示す。平均と平均の標準誤差（SEM）は、ガス交換変数については３５～４５日齢のロゼット７個、及び光化学系II（Fv/Fm）の最大潜在的量子効率については３２日齢のロゼット１２個について示す。Fv/Fmは、蛍光測定の前に45分間暗順応した付着葉について示す。SEMの後の文字は、ANOVA及びそれに続くテューキーの範囲検定によって決定された、同じ行のデータ内の有意差（P <0.05）を示す。行内で同じ文字が後に続く値は、統計的に有意な差はない。用語は次のように省略される：Vcmaxは、μmol CO2 m-2s-1で測定されるルビスコのカルボキシル化の最大速度である；Jmaxは、μmol e- m-2s-1で測定される最大電子伝達速度である；Γはμmol CO2 m-2s-1で測定されてCi-Aとして計算されるCO2補償ポイントである；gsは、μmol H2O m-2s-1で測定されてCi-Aとして計算される水蒸気に対する気孔コンダクタンスである；gmは、mol CO2 m-2s-1で測定されるCO2に対する葉肉コンダクタンス（すなわち、細胞間空域から葉緑体ストローマへの経路を横切るCO2のコンダクタンス）である；Fv/Fmは、光化学系IIの最大潜在的量子効率である；MLは、中程度の光（200μmolフォトンm-2s-1）で行われた測定を示す；HLは、高光（900μmolフォトンm-2s-1）で行われた測定を示す；Ep1、Ep2、及びEp3は、本実施例の他の図に示されているものと同じ３つのT2 EPYC1-dGFPS2Crトランスジェニック系統である；Az1、Az2、Az3は、Ep1～3のそれぞれの単一セグメントである；EpWTはEPYC1-dGFP WT形質転換体である；AzWTはEpWTの単一セグメントである。
Figure 2022542372000108
特に、EPYC1-dGFP発現系統及び単一セグメントのCO2の周囲濃度でのCO2同化率は、ルビスコ含有量で正規化した場合、WT系統と同等であった（ARubisco；図２１Ｉ）。これは、WT植物と比較したS2Crの植物-藻類ハイブリッドルビスコのルビスコターンオーバー率（kcat c）及び特異性（SC/O）の既知の適度な低下は、光合成CO2同化の効率にわずかな影響しか及ぼさなかったことと、観察された成長率の違いは、S2Cr植物のルビスコレベルの低下とより関連していたことを示唆した（Atkinson et al., New Phytol 214, 655-667, doi:10.1111/nph.14414 (2017)）。
葉肉コンダクタンス（gm）レベルもまた、WT植物と比較してすべてのS2Cr系統で減少し（表７）、これはトランスプラストミックタバコで観察されたgmに対するルビスコ含有量の減少の影響と一致していた（Galmes et al., Photosynth Res 115, 153-166, doi:10.1007/s11120-013-9848-8 (2013)）。
光化学系IIの最大電子伝達系（Jmax）及び最大潜在的量子効率（Fv/Fm）の測定値も、形質転換系統と分離系統で区別不能であった（表７）。したがって、前記凝縮物によるチラコイド膜マトリックスの見かけの置換（図１８Ｃ）は、光合成の光反応の効率に明らかな影響を及ぼさなかった。
この実施例で説明した結果は、EPYC1及び前記SSUの特定の残基が、ルビスコを単一のプロトピレノイド凝縮物に凝集させるのに十分であり、この凝縮物が植物の成長に何ら明らかな影響を及ぼさなかったことを示している。S2Crトランスジェニック系統の全体的な光合成性能は、前記凝縮物の影響を受けていないように見えた、これは、高等植物の葉緑体内の条件がピレノイド型体の存在と高度に対応していることを示唆した。このデータは、「完全に組み立てられた」生物物理学的CCMを作成するために、藻類の生物物理学的炭素濃縮メカニズム（CCM）の追加コンポーネントを高等植物に追加するためのプラットフォームを提供する。ここに示すデータは、おそらくピレノイドベースのCCMを作物の収穫量の可能性を60％を超えて増やすことができる植物に組み立てるための重要なステップである（McGrath and Long, Plant Phys 164, 2247-2261, doi:10.1104/pp.113.232611 (2014)；Long et al. in Sustaining Global Food Security: The Nexus of Science and Policy. (ed R. S. Zeigler) Ch. 9, (CSIRO Publishing, 2019)；Price et al., Plant Phys 155, 20-26, doi:10.1104/pp.110.164681 (2011)）。シアノバクテリアカルボキシソームベースのCCMを操作するための前述のアプローチでは、葉緑体でエンコードされたルビスコ大サブユニットの操作が必要であり、このアプローチは、小麦や米などの主要な穀物では現在は実施可能ではない（Long et al., Nat Commun 9, doi:Artn 3570 10.1038/S41467-018-06044-0 (2018)）。本実施例の結果は、ルビスコの凝縮が、核にコードされたSSUの改変によって達成可能であることを示した、これは、遺伝子改変に対して著しくより影響を受けやすい。
実施例５：TobiEPYC1は、ニコチアナベンサミアナの葉緑体でルビスコをピレノイド様構造に安定的に凝集させる
次の実施例では、TobiEPYC1ニコチアナベンサミアナ系統の葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特性を説明する。さらに、植物が異なる光レベルで成長した場合の、EPYC1凝集体が植物の代謝に与える影響についても説明する。
＜材料及び方法＞
TobiEPYC1ニコチアナベンサミアナ系統を特徴づけるための材料及び方法
実施例２、３、及び４で説明する材料と方法を、TobiEPYC1ニコチアナベンサミアナ系統を特徴づけるために使用する。
TobiEPYC1ニコチアナベンサミアナ系統のEPYC1凝集体を特徴づける。具体的には、前記凝集体に存在するルビスコの種類（つまり、コナミドリムシSSUと天然SSUの比率）を特徴づける。さらに、前記凝集体の液液様挙動を特徴づける（例えば、FRAP分析を使用）。加えて、前記凝集体の物理的特性（例えば、形状／構造／密度）を特徴付ける（例えば、TEM/CryoEMによって）。さらに、前記凝集体を分離し、前記分離された凝集体でEPYC1の切断／分解を特徴づけ、ルビスコの含有量と活性を測定する。実施例２で説明したBiFC実験は、TobiEPYC1系統の特性評価にも使用される。実施例２で使用されるBiFCシステムの代わりに、３分割GFP（Liu et al., 2018 Plant Journal）に基づくより厳密なシステムを使用する。
前記EPYC1凝集体の影響は、中程度の光レベルと高い（つまり、ルビスコを制限する）光レベルの下で成長したTobiEPYC1ニコチアナベンサミアナ系統の植物で特徴づけられる。具体的には、葉面積、新鮮重量及び乾燥重量を測定する。加えて、葉緑素含有量、タンパク質含有量、及び総ルビスコ含有量を測定する。さらに、光合成パラメーターを、蛍光（例えば、Fv/Fm）及びガス交換分析（例えば、A：Ci曲線）を使用して測定する。ガス交換及び蛍光はLICOR6400で行われる。
＜結果＞
免疫金及び／又は蛍光共局在データは、前記EPYC1葉緑体凝集体におけるルビスコの存在を示すであろう。
免疫金及び／又は蛍光共局在データは、葉緑体におけるルビスコ凝集体対ストローマ全体のルビスコ凝集体の相対的分布を推定し、葉緑体により多くのルビスコ凝集体があることを示すであろう。
蛍光局在データは、TobiEPYC1がルビスコSSUの異なる置換を有する高等植物で発現されるときに凝集体が形成されることを示すであろう（例えば、コナミドリムシRbcS2全体で補完されたシロイヌナズナSSU変異体バックグラウンド；コナミドリムシαヘリックスを有する改変シロイヌナズナ SSU；コナミドリムシαヘリックス及びβシートを有する改変シロイヌナズナSSU；及びコナミドリムシαヘリックス、βシート及びβA-βBループを有する改変シロイヌナズナSSU；など）。
免疫ブロットデータは、TobiEPYC1及びTobiEPYC1 :: GFPが高等植物で発現した場合に安定していることを示すであろう。
光褪色後の蛍光回復（FRAP）データは、蛍光タグ付きEPYC1及びルビスコが、高等植物の葉緑体の凝集体で液体様混合を示すことを示すであろう。
植物の成長データ（例えば、新鮮重量、乾燥重量、ロゼット面積など）は、凝集したルビスコを含む植物の成長が、形質転換されていない植物に匹敵することを示すであろう。葉緑素含有量、タンパク質含有量、及び総ルビスコ含有量も、形質転換されていない植物に匹敵するであろう。
光合成測定（例えば、Fv/Fm、A：Ci曲線など）は、凝集したルビスコを含む植物が、形質転換されていない植物と比較して同様の効率で光合成を行うことを示すであろう。
生化学的データ（例えば、単離された凝集体からのもの）は、凝集したルビスコが触媒的に活性であることを示すであろう。さらに、生化学的データは、EPYC1が凝集体に存在することを示し、凝集体のEPYC1の切断／分解を特徴づけるであろう。
TEM/cryo-EMデータは、EPYC1凝集体の存在を示し、EPYC1凝集体の物理的特性を特徴づけるであろう。
実施例６：他のさまざまな高等植物を、葉緑体ストローマでピレノイド様EPYC1-ルビスコ凝集体を発現するように操作する
下記の実施例では、TobiEPYC1ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、小麦、及びタバコ系統における葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特徴を説明する。さらに、下記の実施例では、TobiEPYC1ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、小麦、及びタバコ系統における葉緑体EPYC1凝集体の分子特性の特徴を説明する。
＜材料及び方法＞
EPYC1-ルビスコ凝集体を使用した作物植物の操作に関連する材料と方法
実施例３、４及び５からの最も有望な構成物は、ササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、及びタバコ（N.tabacum, Petite Havana）におけるEPYC1の発現のための構成を設計するために使用される。葉緑体シグナルペプチドの種特異的最適化は、必要に応じて行われる。さらに、ササゲ、大豆、キャッサバ、イネ、小麦、タバコの内因性SSUを減少させる（例えば、CRISPRノックアウトアプローチを使用）。コナミドリムシSSU、又はコナミドリムシSSUモチーフを有する改変内因性SSUを導入する。核転換アプローチを使用して植物を形質転換する。
形質転換された植物系統は、実施例３～４に記載されるように特徴付けられる。
＜結果＞
TobiEPYC1のササゲ、ダイズ、キャッサバ、イネ、コムギ、タバコへの形質転換及びその後の免疫ブロットデータは、生産された系統がEPYC1を安定して発現できることを示すであろう。
上記の系統の免疫金顕微鏡／他の凝集体検出方法は、それらが葉緑体ストローマでEPYC1及びルビスコ凝集体を形成することを示すであろう。
植物の成長データ（例えば、新鮮重量、乾燥重量、収量など）は、凝集したルビスコを含む植物の成長が、形質転換されていない植物に匹敵することを示すであろう。葉緑素含有量、タンパク質含有量、及び総ルビスコ含有量もまた、形質転換されていない植物に匹敵するであろう。
光合成測定（例えば、Fv/Fm、A：Ci曲線など）は、凝集したルビスコを含む植物が、形質転換されていない植物と比較して同様の効率で光合成を行うことを示すであろう。

Claims (20)

  1. エッセンシャル・ピレノイド・コンポーネント1（EPYC1）ポリペプチドの集合体を形成するための改変ルビスコと、改変ルビスコとを含む、遺伝子改変高等植物またはその一部であって、改変ルビスコが、藻類ルビスコ小サブユニット（SSU）ポリペプチドまたは高等植物ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類ルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置換された改変高等植物ルビスコSSUポリペプチドからなることを特徴とする遺伝子改変高等植物またはその一部。
  2. さらに、EPYC1ポリペプチドとその集合体を含む、請求項1に記載の植物またはその一部。
  3. 藻類Rubisco SSUポリペプチドを含む改変Rubiscoが、未改変Rubiscoと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加している 、請求項1に記載の植物またはその一部。
  4. 修飾された高等植物ルビスコSSUポリペプチドが、1つ以上の高等植物ルビスコSSUα-ヘリックスを1つ以上の藻類ルビスコSSUα-ヘリックスで置換すること、1つ以上の高等植物ルビスコSSUβ-ストランドを1つ以上の藻類ルビスコSSUβ-ストランドで置換すること、および／または、高等植物ルビスコSSUβA-βBループを藻類ルビスコSSUβA-βBループで置換することによって修飾された、請求項1に記載の植物またはその一部。
  5. 改変された高等植物Rubisco SSUポリペプチドが、改変されていない高等植物Rubisco SSUポリペプチドと比較して、EPYC1ポリペプチドに対する親和性が増加している、請求項1に記載の植物またはその一部。
  6. EPYC1ポリペプチドの集合体を形成するためのEPYC1ポリペプチドと、改変されたルビスコを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
  7. EPYC1ポリペプチドが、藻類EPYC1ポリペプチドまたは第1藻類EPYC1リピート領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、もしくは8つのタンデムコピーからなる修飾EPYC1ポリペプチドであることを特徴とする請求6に記載の植物またはその一部。
  8. 藻類のEPYC1ポリペプチドが、トランケートされた成熟EPYC1ポリペプチドである、請求項7に記載の植物またはその一部。
  9. 切断された成熟EPYC1ポリペプチドが、切断されていないEPYC1ポリペプチドと比較して、修飾されたルビスコに対する親和性が増加している、請求項8に記載の植物またはその一部。
  10. 修飾されたEPYC1ポリペプチドが、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まずに発現され、かつ／またはC末端キャップを含んでいる、請求項7に記載の植物またはその一部。
  11. 前記修飾されたEPYC1ポリペプチドは、対応する非修飾EPYC1ポリペプチドと比較して、修飾されたルビスコに対する親和性が増加している、請求項10に記載の植物またはその一部。
  12. 凝集体が、植物細胞の少なくとも1つの葉緑体の葉緑体ストロマに局在しており、植物細胞が葉のメソフィル細胞である、請求項6に記載の植物またはその一部。
  13. EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、改変されたRubiscoポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含む、遺伝子改変された高等植物またはその一部。
  14. 第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、かつ、第1の核酸配列が、ネイティブEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されておらず、および、第2の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体移行ペプチドをコードする第4の核酸配列に作動可能に連結されており、かつ、第2の核酸配列が、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードしておらず、かつ、ネイティブな藻類SSUリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されていない、請求項13に記載の植物またはその一部。
  15. EPYC1ポリペプチドが、切断された成熟EPYC1ポリペプチド、または第1藻類EPYC1リピート領域の1つ以上、2つ以上、4つ以上、もしくは8つのタンデムコピーを含む改変EPYC1ポリペプチドである、請求項13に記載の植物またはその一部。
  16. 修飾されたルビスコポリペプチドが、藻類のルビスコスモールサブユニット（SSU）ポリペプチド、または高等植物のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部が藻類のルビスコSSUポリペプチドの少なくとも一部で置き換えられた、修飾された高等植物のルビスコSSUポリペプチドからなる、請求項13に記載の植物またはその一部。
  17. 該植物またはその一部が、改変されたRubiscoポリペプチドとEPYC1ポリペプチドの集合体をさらに含む、請求項13に記載の植物またはその一部。
  18. a)EPYC1ポリペプチドをコードする第1の核酸配列を、植物の細胞、組織、または他の摘出物に導入するステップと、
    b)植物細胞、組織、またはその他の摘出物を、遺伝子的に改変された小植物に再生するステップ、および、
    c)EPYC1ポリペプチドをコードする第一の核酸を用いて、遺伝子改変されたプラントレットを遺伝子改変された植物に成長させるステップ、
    を含む請求項1の遺伝子改変高等植物を生産する方法。
  19. ステップ（a）の前に、またはステップ（a）と同時に、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸配列を植物の細胞、組織、または他の摘出物に導入することをさらに含み、ステップ（c）の遺伝子改変された植物が、改変されたRubisco SSUポリペプチドをコードする第2の核酸をさらに含む、請求項18に記載の方法。
  20. 前記第1の核酸配列が第1のベクターで導入され、前記第1のベクターが前記第1の核酸配列の第1のコピーを含み、前記第1の核酸配列がネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、かつネイティブなEPYC1リーダー配列に作動可能に連結されておらず、前記第1の核酸配列が、高等植物細胞において機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が第1のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第1の核酸配列が1つのターミネーターに作動可能に連結されておりおよび、第1のベクターが、第1の核酸配列の第2のコピーをさらに含み、第1の核酸配列が、ネイティブなEPYC1リーダー配列を含まず、ネイティブなEPYC1リーダー配列に動作可能に連結されておらず、第1の核酸配列が、高等植物細胞で機能する葉緑体通過ペプチドをコードする第3の核酸配列に動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、第3のプロモーターに動作可能に連結されており、第1の核酸配列が、2つのターミネーターに動作可能に連結されている、請求項18に記載の方法。
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