WO2011024711A1 - 新規化合物アミコロース誘導体、並びにその製造方法及びその用途 - Google Patents

新規化合物アミコロース誘導体、並びにその製造方法及びその用途 Download PDF

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WO2011024711A1
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WO
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compound
salt
amicolamycin
producing
structural formula
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PCT/JP2010/064033
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茂広 遠山
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財団法人微生物化学研究会
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    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound amicorose derivative, its production method and its use.
  • cancer is a disease in which cells grow indefinitely due to abnormal cell growth control. Cancer is a problem that is one of the diseases that are difficult to treat and is the leading cause of death in the world.
  • the present invention provides a novel compound having excellent cell growth inhibitory activity and a salt thereof that can be easily produced, a production method thereof, and a pharmaceutical composition using the novel compound and the salt thereof. With the goal.
  • the present inventors have intensively studied.
  • the compound represented by the following structural formula (4) is hydrolyzed with an acidic aqueous solution, whereby a novel compound represented by the following structural formula (1).
  • a novel compound represented by at least one of the following structural formula (2) and the following structural formula (3) by solvolysis with an acidic alcohol solution, and cells in which these new compounds are excellent. It discovered that it had a growth inhibitory activity, and also analyzed the chemical structure of these novel compounds, It confirmed that these were novel compounds, and it came to this invention.
  • the present inventors named these novel compounds “amicolose derivatives”.
  • the compound represented by the structural formula (4) was previously found by the present applicants and was named “Amycolamycin”.
  • the amicolamycin is a compound having excellent antibacterial activity, produced by the amicolatopsis sp. MK575-fF5 strain (FERM P-21465).
  • This invention is based on the said knowledge by this inventor, and as a means for solving the said subject, it is as follows. That is, ⁇ 1> A compound represented by the following general formula (1) and a salt thereof.
  • R represents either a hydrogen atom or an alkyl group.
  • ⁇ 4> A method of producing a compound represented by the following general formula (1) and a salt thereof, which belongs to the genus Amycolatopsis and produces a compound represented by the following structural formula (4) and a salt thereof
  • “R” represents either a hydrogen atom or an alkyl group.
  • ⁇ 5> A method for producing a compound represented by the following structural formula (1) and a salt thereof, wherein the decomposition is hydrolysis with an acidic aqueous solution, and the method for producing the compound and the salt thereof according to ⁇ 4>. . ⁇ 6> The method for producing a compound and a salt thereof according to ⁇ 5>, wherein the acidic aqueous solution contains at least one of acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, and hydrogen chloride. ⁇ 7> A method for producing a compound represented by at least one of the following structural formula (2) and the following structural formula (3) and a salt thereof, wherein the decomposition is solvolysis with an alcohol solution ⁇ 4 > Is a method for producing a compound and a salt thereof.
  • ⁇ 8> The method according to ⁇ 7>, wherein the alcohol solution is an acidic alcohol solution containing at least one of acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, and hydrogen chloride.
  • ⁇ 9> The method for producing a compound and a salt thereof according to any one of ⁇ 4> to ⁇ 8>, wherein the microorganism is Amycolatopsis sp. MK575-fF5 strain having a deposit number of FERM P-21465 It is.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound represented by the following general formula (1) and a salt thereof.
  • “R” represents either a hydrogen atom or an alkyl group.
  • the present invention it is possible to solve the above-mentioned problems in the prior art, achieve the above-mentioned object, and easily produce a novel compound having excellent cell growth inhibitory activity and a salt thereof, and a production method thereof, And the pharmaceutical composition using the said novel compound and its salt can be provided.
  • FIG. 1 is a chart of an infrared absorption spectrum of amicolamycin measured by the KBr tablet method.
  • the vertical axis represents the transmittance (%), and the horizontal axis represents the wave number (cm ⁇ 1 ).
  • FIG. 2 is a chart of an ultraviolet absorption spectrum of amicolamycin in methanol. The vertical axis represents absorbance (Abs), and the horizontal axis represents wavelength (nm).
  • FIG. 3 is a chart of proton nuclear magnetic resonance spectrum at 600 MHz, measured at 30 ° C. in deuterated methanol of amicolamycin. The horizontal axis indicates ppm units.
  • FIG. 1 is a chart of an infrared absorption spectrum of amicolamycin measured by the KBr tablet method.
  • the vertical axis represents the transmittance (%), and the horizontal axis represents the wave number (cm ⁇ 1 ).
  • FIG. 2 is a chart of an ultraviolet absorption spectrum of amicolamycin in methanol.
  • FIG. 4 is a chart of carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum at 150 MHz measured in deuterated methanol of amicolamycin at 30 ° C.
  • the horizontal axis indicates ppm units.
  • FIG. 5 is a graph showing the cell growth inhibitory activity of the amicorose derivatives (Compound 1, Compound 2, and Compound 3).
  • the vertical axis represents the cell growth rate (%), and the horizontal axis represents the amicorose derivative concentration ( ⁇ g / mL).
  • the compound of the present invention is represented by the following general formula (1).
  • the compound represented by the following general formula (1) is a novel compound obtained by the present inventor, and may hereinafter be referred to as “amicolose derivative”.
  • “R” represents either a hydrogen atom or an alkyl group.
  • the method for confirming whether or not the compound 1 has the structure represented by the structural formula (1) is not particularly limited and can be appropriately selected from various analysis methods according to the purpose. And a method of confirming by analyzing the mass spectrum, the proton nuclear magnetic resonance spectrum, the carbon 13 nuclear magnetic resonance spectrum, the infrared absorption spectrum, and the like.
  • the compound 1 may be in a salt state.
  • the salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include inorganic acid addition salts with hydrochloric acid, sulfuric acid and the like; organic acid addition salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, tartaric acid and the like. Alkali metal salts with sodium, potassium, etc .; alkaline earth metal salts with calcium, magnesium, etc .; organic amine salts with methylamine, ethylamine, diethanolamine, etc.
  • the compound 1 has tautomerism, and therefore the compound 1 includes tautomers thereof.
  • the compound 1 and a salt thereof may be derived from a compound represented by the following structural formula (4) (hereinafter sometimes referred to as “amicolamycin”) or obtained by chemical synthesis. It may be. Among these, it is preferable that the said compound 1 and its salt are obtained by the manufacturing method of the compound and its salt of this invention mentioned later.
  • the method for confirming whether or not the compound 2 has the structure represented by the structural formula (2) is not particularly limited and can be appropriately selected from various analysis methods according to the purpose. And a method of confirming by analyzing the mass spectrum, the proton nuclear magnetic resonance spectrum, the carbon 13 nuclear magnetic resonance spectrum, the infrared absorption spectrum, and the like.
  • the compound 2 may be in a salt state.
  • the salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include inorganic acid addition salts with hydrochloric acid, sulfuric acid and the like; organic acid addition salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, tartaric acid and the like. Alkali metal salts with sodium, potassium, etc .; alkaline earth metal salts with calcium, magnesium, etc .; organic amine salts with methylamine, ethylamine, diethanolamine, etc.
  • the compound 2 and its salt may be derived from the amicolamycin or may be obtained by chemical synthesis. Among these, it is preferable that the said compound 2 and its salt are obtained by the manufacturing method of the compound and its salt of this invention mentioned later.
  • the method for confirming whether or not the compound 3 has the structure represented by the structural formula (3) is not particularly limited and can be appropriately selected from various analysis methods according to the purpose. And a method of confirming by analyzing the mass spectrum, the proton nuclear magnetic resonance spectrum, the carbon 13 nuclear magnetic resonance spectrum, the infrared absorption spectrum, and the like.
  • the compound 3 may be in a salt state.
  • the salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include inorganic acid addition salts with hydrochloric acid, sulfuric acid and the like; organic acid addition salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, tartaric acid and the like. Alkali metal salts with sodium, potassium, etc .; alkaline earth metal salts with calcium, magnesium, etc .; organic amine salts with methylamine, ethylamine, diethanolamine, etc.
  • the compound 3 and its salt may be derived from the amicolamycin or may be obtained by chemical synthesis. Among these, it is preferable that the said compound 3 and its salt are obtained by the manufacturing method of the compound and its salt of this invention mentioned later.
  • the above-mentioned amicorose derivatives and salts thereof have excellent cell growth inhibitory activity as shown in Test Example 1 described later. Therefore, the above-mentioned amicorose derivatives and salts thereof can be suitably used, for example, as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention described later.
  • the method of producing the compounds of the present invention is obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Amycolatopsis and having the ability to produce the above-described amicolamycin and salts thereof.
  • the amicolamycin and a salt thereof are collected, and the amicolamycin and a salt thereof are decomposed.
  • Physiologically active substances produced by microorganisms generally have complex structures and are difficult to produce by organic synthetic chemistry techniques, but by imitating partial structures essential for the expression of biological activity of these compounds.
  • the obtained derivative is advantageous in that it can be easily obtained and a compound having a higher cell growth inhibitory activity can be created.
  • the amicolamycin is inoculated in a nutrient medium with a producing bacterium that produces the amicolamycin (hereinafter sometimes referred to as “amicolamycin producing bacterium”), and cultured at a temperature suitable for the production of amicolamycin. Whereby a culture containing said amicolamycin is obtained.
  • a nutrient medium used for such a purpose a medium that can be used for culturing actinomycetes is used.
  • the nutrient source for example, commercially available nitrogen sources such as soybean flour, peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, ammonium sulfate and the like can be used.
  • carbon sources such as tomato paste, glycerin, starch, carbohydrates such as glucose, galactose and dextrin, and fats can be used.
  • inorganic salts such as sodium chloride and calcium carbonate can be added to the medium for use.
  • a trace amount of metal salt can be added to the medium and used. Any of these materials may be used as long as they are used by the amicolamycin-producing bacteria and are useful for the production of the amicolamycin, and all known actinomycete culture materials can be used.
  • amicolatopsis sp. MK575-fF5 strain (FERM P-21465) can produce the amicolamycin.
  • other strains capable of producing the amicolamycin can be isolated from the natural world by a conventional method for isolating the producing bacteria.
  • the production ability of the amicolamycin can be enhanced by subjecting the amicolamycin-producing bacterium, including the amicolatopsis sp. MK575-fF5 strain, to irradiation or other mutation treatment.
  • the seed culture medium for producing amicolamycin for example, a growth obtained from slant culture of amicolamycin-producing bacteria on an agar medium can be used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the growth of the amicolamycin-producing bacterium is not substantially inhibited and can produce the amicolamycin, and can be appropriately selected depending on the bacterium used. However, among these, a temperature within the range of 25 ° C. to 35 ° C. is preferable.
  • the production of the amicolamycin by the amicolatopsis sp. MK575-fF5 strain usually reaches its maximum in 3 to 9 days.
  • the time-dependent change in the titer of amicolamycin in this culture solution can be measured by, for example, the HPLC method or the cylindrical plate method using Staphylococcus aureus or the like as a test bacterium.
  • the amicolamycin is collected from the obtained culture, and as the collection method, means used for collecting a metabolite produced by a microorganism can be appropriately used.
  • extraction means using a solvent that is not mixed with water means utilizing differences in adsorption affinity for various adsorbents, gel filtration, chromatography utilizing countercurrent distribution, etc. are used alone or in combination, and the amicolamycin is used.
  • extract the amicolamycin from the cells by solvent extraction using an appropriate organic solvent or elution by cell disruption, and isolate and purify in the same manner as above. Can do.
  • the amicolamycin can be obtained.
  • the amicolamycin has tautomerism, and therefore the amicolamycin includes tautomers thereof.
  • the amicolamycin is an acidic substance
  • the amicolamycin and its salt are, for example, various metals such as pharmaceutically acceptable alkali metals, or organic bases such as quaternary ammonium salts, and generally known methods. Can be used.
  • the microorganism belongs to the genus Amycolatopsis and has the ability to produce Amycolamycin and a salt thereof.
  • the microorganism belongs to the genus Amycolatopsis and has the ability to produce the amicolamycin and salts thereof. Therefore, the microorganism can be used as an amicolamycin-producing bacterium in the method for producing amicolamycin and salts thereof. If there is no restriction
  • microorganisms in particular, at the Microbial Chemistry Research Center of the Foundation for Microbial Chemistry, in May 1996, it was an actinomycete isolated from soil in Sendai City, Miyagi Prefecture and was assigned the strain number MK575-fF5. It is preferable to use microorganisms.
  • the mycological properties of the MK575-fF5 strain are as follows.
  • the mycelium is well divided and has a zigzag shape. There is also a split. Air hyphae may or may not settle. When settled, the aerial hyphae are relatively long, and are divided into cylindrical spores in a straight or irregular shape. Its surface is smooth and the size is about 0.4 ⁇ m to 0.6 ⁇ m ⁇ 0.8 ⁇ m to 2.2 ⁇ m. In addition, air hyphae may be entangled to form a spherical shape. Ring production, fungus bundles, spore capsules and motile spores are not observed.
  • Glucose / asparagine agar medium (glucose 1.0% by mass, L-asparagine 0.05% by mass, dipotassium hydrogen phosphate 0.05% by mass, string agar 3.0% by mass, pH 7.0) and tested at 10 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 27 ° C, 30 ° C, 37 ° C, 45 ° C, and 50 ° C. No growth was observed, and it grew in the range of 20 ° C to 37 ° C. The optimum temperature for growth is around 30 ° C.
  • Starch hydrolysis starch / inorganic salt agar medium, ISP-medium 4, 27 ° C.
  • Cellular component (1) Cell wall composition Contains meso-type 2,6-diaminopimelic acid. (2) Reducing sugar in the whole cell body It contains arabinose and galactose and is type A. (3) Isoprenoid quinone It contains MK-9 (H 4 ) and a small amount of MK-10 (H 4 ) as the main menaquinone. (4) Phospholipid type PII (including phosphatidylethanolamine, not including phosphatidylcholine and unknown glucosamine-containing phospholipid). (5) Mycolic acid does not contain.
  • 16S rRNA gene A partial base sequence (1455nt) of 16S rRNA gene was determined, and homology search was performed using an international base sequence database (GenBank / DDBJ / EMBL). As a result, the base sequence of the MK575-fF5 strain was highly homologous to the 16S rRNA gene of the actinomycetes of the genus Amycolatopsis as shown below. Amycolatopsis kentuckyensis (99.1%), Amycolatopsis rifamycinica (99.03%), Amycolatopsis mediterranei (98.9%), Amycolatopsis balhimycetica . In addition, the homologous value of the base sequence is shown in parentheses.
  • the basic mycelium of the MK575-fF5 strain has a zigzag shape and is divided.
  • the aerial hyphae are straight or irregularly curved, and are divided into cylindrical spores. Ring production, fungus bundles, spore capsules and motile spores are not observed. In various media, the growth is colorless to yellowish. There are cases where white to light aerial hyphae are grown or not. No soluble dye is observed.
  • the optimum growth temperature is around 30 ° C. Formation of melanin-like pigments and starch hydrolyzability are negative, and nitrate reduction is positive.
  • the cell component of MK575-fF5 strain contains meso-type 2,6-diaminopimelic acid, arabinose, and galactose in the whole cell hydrolyzate, cell wall type IV type, and all cell reducing sugars are type A Indicated. Further, it did not contain mycolic acid, the phospholipid was PII type (containing phosphatidylethanolamine, not containing phosphatidylcholine and unknown glucosamine-containing phospholipid), and the main menaquinone was MK-9 (H 4 ). When the partial base sequence of 16S rRNA gene was compared with the data of known strains, it showed high homology with the base sequence of Amycolatopsis actinomycetes.
  • the MK575-fF5 strain was considered to belong to the genus Amycolatopsis (literature, International Journal of Systematic Bacteriology, 36, 29-37, 1986). Therefore, the MK575-fF5 strain was designated as Amycolatopsis sp. MK575-fF5 strain.
  • the MK575-fF5 strain was applied for deposit at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary and was deposited on December 12, 2007 as FERM P-21465.
  • the decomposition method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Examples thereof include a hydrolysis method and a solvolysis method.
  • a hydrolysis method when obtaining the said compound 1 and its salt, it is preferable to use the said hydrolysis method, and when obtaining at least any one of the said compound 2 and the compound 3, and those salts, the said solvolysis method is used. It is preferable to use it.
  • the method of hydrolyzing with acidic aqueous solution is preferable.
  • the said acidic aqueous solution may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the temperature for the hydrolysis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0 ° C.
  • the time for the hydrolysis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.5 hours to 24 hours, and more preferably 1 hour to 3 hours.
  • the reaction solution subjected to the hydrolysis is preferably subjected to solvent extraction from the viewpoint that a high concentration of the compound 1 and a salt thereof can be obtained.
  • a high concentration of the compound 1 and a salt thereof can be obtained.
  • limiting in particular as said solvent According to the objective, it can select suitably, For example, ethyl acetate, diethyl ether, chloroform, a dichloromethane etc. are mentioned.
  • the method for purifying the compound 1 after the extraction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, a method utilizing a difference in adsorption affinity for various adsorbents, a gel filtration method, a suitable method. A chromatographic method using flow distribution, a method of combining these methods singly or in combination, and the like can be mentioned.
  • the method for performing the solvolysis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the method for performing solvolysis with an alcohol solution is preferable, and the method for performing solvolysis with an acidic alcohol solution. More preferred.
  • limiting in particular as said alcohol solution According to the objective, it can select suitably, For example, methanol, ethanol, n-propyl alcohol, i-propyl alcohol, n-butanol etc. are mentioned.
  • the said alcohol solution may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • an acid in the said acidic alcohol solution there is no restriction
  • the said acid may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the temperature for performing the solvolysis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0 ° C. to 100 ° C., more preferably 20 ° C. to 40 ° C.
  • the time for performing the solvolysis is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. It is preferably 0.5 hours to 24 hours, and more preferably 1 hour to 3 hours.
  • limiting in particular as the method of stopping the said solvolysis According to the objective, it can select suitably, For example, saturated sodium hydrogen carbonate aqueous solution, various buffer solutions, etc. are mentioned.
  • the reaction solution subjected to the solvolysis is preferably subjected to solvent extraction from the viewpoint that a high concentration of at least one of the compound 2 and the compound 3 and salts thereof can be obtained.
  • a high concentration of at least one of the compound 2 and the compound 3 and salts thereof can be obtained.
  • limiting in particular as said solvent According to the objective, it can select suitably, For example, ethyl acetate, diethyl ether, chloroform, a dichloromethane etc. are mentioned.
  • the method for purifying at least one of compound 2 and compound 3 after extraction and their salts is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the adsorption affinity for various adsorbents Examples include a method using a difference, a gel filtration method, a chromatography method using countercurrent distribution, and a method in which these methods are used alone or in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the above-mentioned amicorose derivative (at least one of Compound 1, Compound 2, and Compound 3) and salts thereof, and further contains other components as necessary.
  • the content of the amicorose derivative (at least one of Compound 1, Compound 2, and Compound 3) and a salt thereof in the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. .
  • the said pharmaceutical composition may be the said amicorose derivative
  • the other components are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose from among pharmacologically acceptable carriers. Specific examples include ethanol, water, starch, and the like. . There is no restriction
  • ⁇ Dosage form> There is no restriction
  • a binder for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid, etc.
  • a disintegrating agent for example, a lubricant for lubricating a coloring agent for a flavoring / flavoring agent etc.
  • the binder is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples include propyl starch, methyl cellulose, ethyl cellulose, shellac, calcium phosphate, and polyvinyl pyrrolidone.
  • the disintegrant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose. Is mentioned.
  • the lubricant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Examples thereof include purified talc, stearate, borax, and polyethylene glycol.
  • the colorant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include titanium oxide and iron oxide.
  • the flavoring / flavoring agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sucrose, orange peel, citric acid, and tartaric acid.
  • the flavoring / flavoring agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sucrose, orange peel, citric acid, and tartaric acid. There is no restriction
  • the pH regulator and said buffer there is no restriction
  • the stabilizer According to the objective, it can select suitably, For example, sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid etc. are mentioned.
  • the tonicity agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • administering There is no restriction
  • the dosage is not particularly limited and may be appropriately selected in consideration of various factors such as the age, weight, constitution, symptom, and presence / absence of administration of a drug containing other ingredients as active ingredients. it can.
  • the animal species to be administered is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, human, monkey, pig, cow, sheep, goat, dog, cat, mouse, rat, bird, etc. Among these, it is preferably used for humans.
  • the said pharmaceutical composition may be used individually by 1 type, and may be used together with the pharmaceutical which uses another component as an active ingredient. Moreover, the said pharmaceutical composition may be used in the state mix
  • the pharmaceutical composition contains the amicolose derivative (at least one of Compound 1, Compound 2, and Compound 3) and a salt thereof as an active ingredient, as shown in Test Example 1 described below, excellent cells It has growth inhibitory activity. Therefore, the pharmaceutical composition can be suitably used as a cell growth inhibitor and is useful for the prevention or treatment of cancer.
  • the culture solution thus obtained was centrifuged to separate 80 L of culture filtrate and 2.5 kg of bacterial cells.
  • 12 L of methanol was added to the cells and stirred well, and a compound represented by the following structural formula (4) (hereinafter sometimes referred to as “amicolamycin”) was extracted from the cells with methanol. From this, methanol was removed under reduced pressure to obtain 2 L of a cell extract containing amicolamycin.
  • 6 L of ethyl acetate was added to 2 L of the bacterial cell extract, and the mixture was sufficiently stirred, and amicolamycin was extracted with ethyl acetate.
  • the obtained ethyl acetate 6L was dried over anhydrous sodium sulfate and then concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 18 g of a crude product containing amicolamycin.
  • 200 g of hexane was added to 18 g of this crude product containing amicolamycin, and hexane-soluble components were removed to obtain 3.3 g of a hexane-insoluble fraction containing amicolamycin.
  • This hexane-insoluble fraction (3.3 g) was dissolved in methanol and applied to a Sephadex LH-20 (inner diameter 28 mm ⁇ 450 mm, Pharmacia Biotech Co., Ltd.) column for chromatography.
  • chloroform: methanol: water 100: 0: 0 (200 mL), 95: 5: 0 (450 mL), 1: 95: 5: 0.25 (450 mL), 1: 90: 10: 0.5 ( 450 mL).
  • amicolamycin was eluted in fraction numbers 76 to 103, which were collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 827 mg of pure amicolamycin.
  • amicolamycin was a compound having a structure represented by the following structural formula (4). It was. This amicolamycin had tautomerism.
  • the appearance is white powder.
  • the molecular formula is represented by C 44 H 60 Cl 2 N 4 O 14 .
  • the experimental value by high resolution mass spectrometry (HRESIMS: negative ion mode) is m / z 937.3386 (MH) ⁇ , and the calculated value is m / z 937.3405 (C 44 H 59 Cl 2 N 4 O 14 ).
  • Example 2 Production of Compound 2 and Compound 3
  • Solvent decomposition was performed by mixing 1 mL of 5 mass% hydrogen chloride methanol solution with 1 mL of methanol solution of amicolamycin (19.5 mg, 20.7 nmol) and stirring at room temperature for 3 hours. The reaction was stopped with 10 mL of a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and extracted three times with ethyl acetate. The obtained organic layer was washed with saturated brine, dehydrated with magnesium sulfate, magnesium sulfate was removed by filtration, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) (manufactured by Sigma) prepared to 5 mg / mL with phosphate buffer was added to each well for 4 hours.
  • Absorbance at 570 nm was measured with an absorptiometer (hereinafter sometimes referred to as “amicorose derivative added sample absorbance”).
  • FIG. 5 shows that the amicorose derivatives (Compound 1, Compound 2, and Compound 3) were found to have cell growth inhibitory activity, and particularly Compound 1 was found to have significant cell growth inhibitory activity.
  • amicorose derivatives and salts thereof of the present invention have excellent cell growth inhibitory activity, they can be suitably used as active ingredients of pharmaceutical compositions that suppress cell growth such as cancer.

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Abstract

　本発明の新規化合物及びその塩は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属する微生物より得られたアミコラマイシン及びその塩を酸性条件下で分解することにより得られ、細胞増殖抑制活性を有する下記一般式（１）で表される。下記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。　

Description

新規化合物アミコロース誘導体、並びにその製造方法及びその用途
　本発明は、新規化合物アミコロース誘導体、並びにその製造方法及びその用途に関する。
　生物は、その発生から死まで、細胞の増殖、分化、アポトーシスなどを繰り返しながら生命を維持している。この細胞制御機構が破綻すると、種々の疾患を発症する。これらの中でも、癌は、細胞増殖の制御が異常になることで無制限に細胞が増殖する疾患である。癌は、治療が困難な病気のひとつであり、世界の人々の死亡原因の上位となっている点で問題である。
　近年の癌治療は進歩しているものの、腫瘍細胞の成長を阻害することのできる十分な細胞増殖抑制活性を有する治療薬は未だ提供されておらず、優れた細胞増殖抑制活性を有する新規化合物の速やかな提供が望まれているのが現状である。
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、簡単に製造可能な、優れた細胞増殖抑制活性を有する新規化合物及びその塩、並びにそれらの製造方法、及び、前記新規化合物及びその塩を利用した医薬組成物を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するため、本発明者は鋭意検討した結果、下記構造式（４）で表される化合物を、酸性水溶液で加水分解することで、下記構造式（１）で表される新規化合物を製造できること、酸性アルコール溶液で加溶媒分解することで、下記構造式（２）及び下記構造式（３）の少なくともいずれかで表される新規化合物を製造できること、これらの新規化合物が優れた細胞増殖抑制活性を有することを見出し、更に、これらの新規化合物の化学構造を分析することで、これらが新規化合物であることを確認し、本発明に至った。なお、本発明者らは、これらの新規化合物を「アミコロース誘導体」と命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　なお、前記構造式（４）で表される化合物は、以前本出願人らにより見出された化合物であり、「アミコラマイシン（Ａｍｙｃｏｌａｍｉｃｉｎ）」と命名された。前記アミコラマイシンは、アミコラトプシス・エスピーＭＫ５７５－ｆＦ５株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１４６５）により生産される、優れた抗菌活性を有する化合物である。
　本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　下記一般式（１）で表されることを特徴とする化合物及びその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
　＜２＞　「Ｒ」が水素原子である前記＜１＞に記載の化合物及びその塩である。
　＜３＞　「Ｒ」がメチル基である前記＜１＞に記載の化合物及びその塩である。
　＜４＞　下記一般式（１）で表される化合物及びその塩の製造方法であって、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属し、下記構造式（４）で表される化合物及びその塩を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物から該構造式（４）で表される化合物及びその塩を採取し、該構造式（４）で表される化合物及びその塩を分解することを特徴とする化合物及びその塩の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　＜５＞　下記構造式（１）で表される化合物及びその塩の製造方法であって、分解が、酸性水溶液による加水分解である前記＜４＞に記載の化合物及びその塩の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　＜６＞　酸性水溶液が、酢酸、硫酸、硝酸、及び塩化水素の少なくともいずれかを含有する前記＜５＞に記載の化合物及びその塩の製造方法である。
　＜７＞　下記構造式（２）及び下記構造式（３）の少なくともいずれかで表される化合物及びそれらの塩の製造方法であって、分解が、アルコール溶液による加溶媒分解である前記＜４＞に記載の化合物及びその塩の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　＜８＞　アルコール溶液が、酢酸、硫酸、硝酸、及び塩化水素の少なくともいずれかを含有する酸性アルコール溶液である前記＜７＞に記載の方法である。
　＜９＞　微生物が、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１４６５のアミコラトプシス・エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）ＭＫ５７５－ｆＦ５株である前記＜４＞から＜８＞のいずれかに記載の化合物及びその塩の製造方法である。
　＜１０＞　下記一般式（１）で表される化合物及びその塩を含有することを特徴とする医薬組成物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
　＜１１＞　細胞増殖抑制剤である前記＜１０＞に記載の医薬組成物である。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、簡単に製造可能な、優れた細胞増殖抑制活性を有する新規化合物及びその塩、並びにそれらの製造方法、及び、前記新規化合物及びその塩を利用した医薬組成物を提供することができる。
図１は、アミコラマイシンのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ－１）を示す。 図２は、アミコラマイシンのメタノール中での紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸は吸光度（Ａｂｓ）、横軸は波長（ｎｍ）を示す。 図３は、アミコラマイシンの重メタノール中で３０℃にて測定した６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸はｐｐｍ単位を示す。 図４は、アミコラマイシンの重メタノール中で３０℃にて測定した１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸はｐｐｍ単位を示す。 図５は、アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３）による細胞増殖抑制活性を示した図である。縦軸は細胞増殖率（％）、横軸はアミコロース誘導体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
（化合物及びその塩）
　本発明の化合物は、下記一般式（１）で表されることを特徴とする。下記一般式（１）で表される化合物は、本発明者が得た新規化合物であり、以下、「アミコロース誘導体」と称することがある。
　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
＜化合物１＞
　前記一般式（１）中、「Ｒ」が水素原子であるアミコロース誘導体は、下記構造式（１）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　前記構造式（１）で表される化合物（以下、「化合物１」と称することがある。）の物理化学的性状としては、次の通りである。即ち、
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１４Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　３８９．０６４０（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　３８９．０６４１（Ｃ１４Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝＋１５°（ｃ０．５１、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
－化合物１のα体－
　δｐｍ：１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８，１４．１Ｈｚ），１．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，１４．１Ｈｚ），２．２３（３Ｈ，ｓ），３．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，），３．８８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．２，６．２Ｈｚ），４．３２（１Ｈ，ｐｅｎｔ．，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｓ），５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，８．０Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１０．２０（１Ｈ，ｂｒｓ）
－化合物１のβ体－
　δｐｍ：１．１９(３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ)，１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，１３．１Ｈｚ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１３．１Ｈｚ），２．２３（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．１１（１Ｈ，ｔ，８．９Ｈｚ，），３．５８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８．９，６．２Ｈｚ），３．９２（１Ｈ，ｓ），４．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｐｅｎｔ．，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．１，６．２，９．３Ｈｚ），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１０．２０（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
－化合物１のα体－
　δｐｍ：１１．１（ｑ），１６．２（ｑ），１８．５（ｑ），３８．８（ｔ），５２．３（ｄ），７１．１（ｄ），７４．３（ｄ），７６．３（ｓ），９２．７（ｄ），１１０．３（ｓ），１１１．５（ｓ），１１９．８（ｓ），１２９．７（ｓ），１６１．０（ｓ）
－化合物１のβ体－
　δｐｍ：１１．１（ｑ），１６．２（ｑ），１８．６（ｑ），３４．８（ｔ），５２．３（ｄ），６５．１（ｄ），７４．５（ｄ），７７．２（ｓ），９３．３（ｄ），１１０．２（ｓ），１１１．７（ｓ），１１９．６（ｓ），１２９．５（ｓ），１６１．２（ｓ）
　前記化合物１が、前記構造式（１）で表される構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、各種の分析方法から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記マススペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、赤外部吸収スペクトルなどの分析を行なうことにより確認する方法が挙げられる。
　また、前記化合物１は、塩の状態であってもよい。前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、硫酸等との無機酸付加塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸等との有機酸付加塩；ナトリウム、カリウム等とのアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等とのアルカリ土類金属塩；メチルアミン、エチルアミン、ジエタノールアミン等との有機アミン塩；などが挙げられる。
　なお、前記化合物１は互変異性を有しており、したがって、前記化合物１にはその互変異性体も含まれる。
　前記化合物１及びその塩は、下記構造式（４）で表される化合物（以下、「アミコラマイシン」と称することがある。）から誘導されたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよい。これらの中でも、前記化合物１及びその塩は、後述する本発明の、化合物及びその塩の製造方法により得られることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
＜化合物２及び化合物３＞
　前記一般式（１）の「Ｒ」がアルキル基である化合物としては、「Ｒ」がアルキル基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、「Ｒ」がメチル基である化合物が好ましく、下記構造式（２）及び下記構造式（３）の少なくともいずれかで表される化合物がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
＜＜化合物２＞＞
　前記構造式（２）で表される化合物（以下、「化合物２」と称することがある。）の物理化学的性状としては、次の通りである。即ち、
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　４０３．０７８８（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　４０３．０７９８（Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝－１１３°（ｃ０．２４、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，１３．１Ｈｚ），１．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１３．１Ｈｚ），２．２８（３Ｈ，ｓ），２．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．１７（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），３．４８（３Ｈ，ｓ），３．６４（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．３，６．２，Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝７．３，６．２Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，９．３Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），９．５－９．６（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１１．４（ｑ），１６．１（ｑ），１８．０（ｑ），３６．３（ｔ），５２．６（ｄ），５５．６（ｑ），７０．４（ｄ），７４．２（ｓ），７６．２（ｄ），９９．７（ｄ），１１１．１（ｓ），１１２．４（ｓ），１１７．４（ｓ），１２８．７（ｓ），１６１．３（ｓ）
　前記化合物２が、前記構造式（２）で表される構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、各種の分析方法から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記マススペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、赤外部吸収スペクトルなどの分析を行なうことにより確認する方法が挙げられる。
　また、前記化合物２は、塩の状態であってもよい。前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、硫酸等との無機酸付加塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸等との有機酸付加塩；ナトリウム、カリウム等とのアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等とのアルカリ土類金属塩；メチルアミン、エチルアミン、ジエタノールアミン等との有機アミン塩；などが挙げられる。
　前記化合物２及びその塩は、前記アミコラマイシンから誘導されたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよい。これらの中でも、前記化合物２及びその塩は、後述する本発明の、化合物及びその塩の製造方法により得られることが好ましい。
＜＜化合物３＞＞
　前記構造式（３）で表される化合物（以下、「化合物３」と称することがある。）の物理化学的性状としては、次の通りである。即ち、
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　４０３．０７８８（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　４０３．０７９８（Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝＋８３°（ｃ０．１３、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８，１４．４Ｈｚ），１．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．１，１４．４Ｈｚ），２．２７（３Ｈ，ｓ），２．３０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．２４（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．６８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．４，６．５，Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４２（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），９．７４（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１１．３（ｑ），１６．３（ｑ），１７．９（ｑ），３５．０（ｔ），５０．６（ｄ），５５．２（ｑ），６５．３（ｄ），７３．４（ｓ），７４．２（ｄ），９８．２（ｄ），１１０．３（ｓ），１１０．９（ｓ），１１８．７（ｓ），１２７．６（ｓ），１５９．３（ｓ）
　前記化合物３が、前記構造式（３）で表される構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、各種の分析方法から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記マススペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、赤外部吸収スペクトルなどの分析を行なうことにより確認する方法が挙げられる。
　また、前記化合物３は、塩の状態であってもよい。前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、硫酸等との無機酸付加塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸等との有機酸付加塩；ナトリウム、カリウム等とのアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等とのアルカリ土類金属塩；メチルアミン、エチルアミン、ジエタノールアミン等との有機アミン塩；などが挙げられる。
　前記化合物３及びその塩は、前記アミコラマイシンから誘導されたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよい。これらの中でも、前記化合物３及びその塩は、後述する本発明の、化合物及びその塩の製造方法により得られることが好ましい。
＜用途＞
　前記アミコロース誘導体及びそれらの塩は、後述する試験例１に示されるように、優れた細胞増殖抑制活性を有するものである。そのため、前記アミコロース誘導体及びそれらの塩は、例えば、後述する本発明の医薬組成物の有効成分として、好適に利用可能である。
（化合物及びその塩の製造方法）
　本発明の化合物、即ちアミコロース誘導体及びそれらの塩の製造方法は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属し、前記アミコラマイシン及びその塩を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物から前記アミコラマイシン及びその塩を採取し、前記アミコラマイシン及びその塩を分解することを特徴とする。
　微生物の生産する生理活性物質は、一般に複雑な構造を有しているため有機合成化学的手法による生産は困難であるが、それらの化合物の生理活性の発現に必須な部分構造を模倣することにより得られた誘導体は、簡便に入手でき、より細胞増殖抑制活性の高い化合物を創製できる点で有利である。
＜アミコラマイシンの製造方法＞
　前記アミコラマイシンは、前記アミコラマイシンを生産する生産菌（以下、「アミコラマイシン生産菌」と称することがある。）を栄養培地中に接種し、前記アミコラマイシンの生産に良好な温度で培養することによって行われ、これにより前記アミコラマイシンを含む培養物が得られる。
　このような目的に用いる栄養培地としては、放線菌の培養に利用しうるものが使用される。栄養源としては、例えば、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどの窒素源が使用できる。また、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン等の炭水化物、あるいは脂肪等の炭素源が使用できる。更に食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することができる。その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することができる。これらの材料は、前記アミコラマイシンの生産菌が利用し、前記アミコラマイシンの生産に役に立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
　前記アミコラマイシンの生産には、アミコラトプシス属に属し、前記アミコラマイシンの生産能を有する微生物が使用される。具体的には、アミコラトプシス・エスピーＭＫ５７５－ｆＦ５株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１４６５）が、前記アミコラマイシンを生産できる。また、前記アミコラマイシンを生産できるその他の菌株についても、前記生産菌の単離の常法によって、自然界より分離することが可能である。また、前記アミコラトプシス・エスピーＭＫ５７５－ｆＦ５株を含め、前記アミコラマイシンの生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、前記アミコラマイシンの生産能を高めることも可能である。更に、遺伝子工学的手法による前記アミコラマイシンの生産も可能である。
　前記アミコラマイシン生産のための種母培地としては、例えば、寒天培地上、アミコラマイシン生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。前記アミコラマイシンの製造に当たっては、アミコラマイシン生産菌を適当な培地で好気的に培養することが好ましく、その培養液から目的のものを採取するためには、常用の手段を用いることができる。培養温度としては、アミコラマイシン生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記アミコラマイシンを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、これらの中でも、２５℃～３５℃の範囲内の温度が好ましい。
　例えば、前記アミコラトプシス・エスピーＭＫ５７５－ｆＦ５株による前記アミコラマイシンの生産は、通常は３日間～９日間で最高に達する。この培養液中の前記アミコラマイシンの力価の経時変化は、例えば、ＨＰＬＣ法や、スタフィロコッカス・アウレウス等を被検菌とする円筒平板法などにより測定することができる。
　前記製造方法においては、得られた培養物から前記アミコラマイシンを採取するが、採取法としては、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる手段を適宜利用することができる。例えば、水と混ざらない溶媒による抽出の手段、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて利用し、前記アミコラマイシンを採取することができる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により、前記アミコラマイシンを菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。
　以上のようにして、前記アミコラマイシンを得ることができる。なお、前記アミコラマイシンは互変異性を有しており、したがって前記アミコラマイシンにはその互変異性体も含まれる。
　また、前記アミコラマイシンは酸性物質であり、前記アミコラマイシン及びその塩は、例えば、製薬学的に許容できるアルカリ金属等の各種金属、若しくは第４級アンモニウム塩等の有機塩基と、通常公知の方法を用いて製造することができる。
－微生物－
　前記微生物は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属し、前記アミコラマイシン（Ａｍｙｃｏｌａｍｉｃｉｎ）及びその塩を生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、アミコラトプシス属に属し、前記アミコラマイシン及びその塩を生産する能力を有し、そのために、前記アミコラマイシン及びその塩の製造方法において、アミコラマイシン生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　このような微生物の中でも、特に、平成８年５月、財団法人微生物化学研究会　微生物化学研究センターにおいて、宮城県仙台市の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ５７５－ｆＦ５の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ５７５－ｆＦ５株の菌学的性状は、以下の通りである。
１．形態
　基生菌糸はよく分技し、ジグザグ状を呈する。また分断が認められる。気菌糸は着生する場合としない場合がある。着生した場合、気菌糸は比較的長く、直状或いは不規則な曲状で、円筒形の胞子状に分断する。その表面は平滑で、大きさは約０．４μｍ～０．６μｍ×０．８μｍ～２．２μｍである。また、気菌糸が絡まり合い球状を呈する場合がある。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
２．各種培地における生育状態
　色の記載について［　］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オプ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　の　ｃｏｌｏｒ　ｈａｒｍｏｎｙ　ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ－培地２、２７℃培養）
　発育はうす黄［２　ｇｃ，Ｂａｍｂｏｏ］を呈し、白の気菌糸をうっすら着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ－培地３、２７℃培養）
　発育はうす黄［２　ｇｃ，Ｂａｍｂｏｏ］を呈し、白の気菌糸をうっすら着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ－培地４、２７℃培養）
　発育はうす黄［２　ｅａ，Ｌｔ　Ｗｈｅａｔ］～にぶ黄［３　ｎｃ，Ａｍｂｅｒ］を呈し、白の気菌糸をわずかに着生する場合がある。溶解性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ－培地５、２７℃培養）
　発育はにぶ黄だいだい［３　ｌｃ，Ａｍｂｅｒ］を呈し、うすだいだい［４　ｅａ，Ｌｉｇｈｔ　Ａｐｒｉｃｏｔ］の気菌糸を着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ－培地７、２７℃培養）
　発育はうす黄［３　ｃａ，Ｐｅａｒｌ　Ｐｉｎｋ］～にぶ黄だいだい［３　ｌｃ，Ａｍｂｅｒ］を呈し、うすだいだい［４　ｃａ，Ｆｒｅｓｈ　Ｐｉｎｋ］の気菌糸を着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。
（６）スクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
　無色～うす黄だいだい［３　ｅａ，Ｌｔ　Ｍｅｌｏｎ　Ｙｅｌｌｏｗ］の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
　グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース１．０質量％、Ｌ－アスパラギン０．０５質量％、リン酸水素二カリウム０．０５質量％、ひも寒天３．０質量％、ｐＨ７．０）を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、４５℃、及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、４５℃、及び５０℃での生育は認められず、２０℃～３７℃の範囲で生育した。生育至適温度は３０℃付近である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ－培地４、２７℃培養）
　２１日間の培養で、陰性である。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・プロス、ＩＳＰ－培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ－培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ－培地７；いずれも２７℃培養）
　いずれの培地においても陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、ＩＳＰ－培地９；２７℃培養）
　Ｄ－グルコース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロース、Ｄ－フルクトース、スクロース、イノシトール、ラムノース、ラフィノース、及びＤ－マンニトールを利用して発育する。
（５）硝酸塩の還元反応（０．１質量％硝酸カリウム含有ペプトン水、ＩＳＰ－培地８、２７℃培養）
　陽性である。
４．菌体成分
（１）細胞壁組成
　メソ型の２，６－ジアミノピメリン酸を含有する。
（２）全菌体中の還元糖
　アラビノース、ガラクトースを含み、Ａ型である。
（３）イソプレノイド・キノン
　主要なメナキノンとしてＭＫ－９（Ｈ４）及び少量のＭＫ－１０（Ｈ４）を含有する。
（４）リン脂質
　ＰＩＩ型（ホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）。
（５）ミコール酸
　含有しない。
５．１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析
　１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１４５５ｎｔ）を決定し、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）による相同性検索を行った。その結果、ＭＫ５７５－ｆＦ５株の塩基配列は以下に示したとおり、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属放線菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｋｅｎｔｕｃｋｙｅｎｓｉｓ（９９．１％）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｒｉｆａｍｙｃｉｎｉｃａ（９９．０３％）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ（９８．９％）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｂａｌｈｉｍｙｃｅｔｉｃａ（９８．８２％）などである。なお、カッコ内は塩基配列の相同値を表記した。
　以上の性状を要約すると、ＭＫ５７５－ｆＦ５株の基生菌糸はジグザグ状を呈し、分断する。気菌糸は直状或いは不規則な曲状で、円筒形の胞子状に分断する。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。種々の培地で、発育は無色～黄だいだいを呈する。白～うすだいだいの気菌糸を着生する場合と着生しない場合がある。溶解性色素は認められない。生育至適温度は、３０℃付近である。メラニン様色素の生成及びスターチの水解性は陰性、硝酸塩の還元反応は陽性である。
　ＭＫ５７５－ｆＦ５株の菌体成分は、全菌体加水分解物中にメソ型の２，６－ジアミノピメリン酸、アラビノース、及びガラクトースを含み、細胞壁タイプＩＶ型、全菌体の還元糖はＡ型を示した。また、ミコール酸は含有せず、リン脂質はＰＩＩ型（ホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）、主要なメナキノンはＭＫ－９（Ｈ４）であった。
　１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を公知菌株のデータと比較したところ、アミコラトプシス属放線菌の塩基配列と高い相同性を示した。
　これらの性状により、前記ＭＫ５７５－ｆＦ５株はアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ，文献，Ｉｎｔｅｒｅｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３６巻，２９－３７頁，１９８６年）属に属すると考えられた。そこで、前記ＭＫ５７５－ｆＦ５株をアミコラトプシス・エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）ＭＫ５７５－ｆＦ５株とした。なお、前記ＭＫ５７５－ｆＦ５株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請し、平成１９年１２月１２日、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１４６５として受託された。
＜アミコロース誘導体の製造方法＞
　前記アミコロース誘導体及びそれらの塩の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アミコラマイシン及びその塩を分解することにより製造する方法が好ましい。
　前記分解する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加水分解法、加溶媒分解法などが挙げられる。これらの中でも、前記化合物１及びその塩を得る場合は、前記加水分解法を用いることが好ましく、前記化合物２及び化合物３の少なくともいずれか及びそれらの塩を得る場合は、前記加溶媒分解法を用いることが好ましい。
－加水分解法－
　前記加水分解を行う方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、酸性水溶液により加水分解を行う方法が好ましい。
　前記酸性水溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、塩化水素水溶液などが挙げられる。前記酸性水溶液は１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　前記加水分解を行う温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃～１００℃が好ましく、２０℃～４０℃がより好ましい。
　前記加水分解を行う時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５時間～２４時間が好ましく、１時間～３時間がより好ましい。
　前記加水分解反応を停止する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、飽和重曹水溶液、各種緩衝液などが挙げられる。
　前記加水分解を行なった反応液は、溶媒抽出を行なうことが、前記化合物１及びその塩を高濃度得ることができる点で好ましい。
　前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタンなどが挙げられる。
　前記抽出後の化合物１を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過法、向流分配を利用したクロマトグラフィー法、これらの方法を単独又は組み合わせる方法などが挙げられる。
－加溶媒分解法－
　前記加溶媒分解を行う方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アルコール溶液により加溶媒分解を行う方法が好ましく、酸性アルコール溶液により加溶媒分解を行う方法がより好ましい。
　前記アルコール溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロピルアルコール、ｉ－プロピルアルコール、ｎ－ブタノールなどが挙げられる。前記アルコール溶液は１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　前記酸性アルコール溶液中の酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸、硫酸、硝酸、塩化水素などが挙げられる。前記酸は１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　前記加溶媒分解を行う温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃～１００℃が好ましく、２０℃～４０℃がより好ましい。
　前記加溶媒分解を行う時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５時間～２４時間が好ましく、１時間～３時間がより好ましい。
　前記加溶媒分解を停止する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、飽和重曹水溶液、各種緩衝液などが挙げられる。
　前記加溶媒分解を行なった反応液は、溶媒抽出を行なうことが、前記化合物２及び化合物３の少なくともいずれか、及びそれらの塩を高濃度得ることができる点で好ましい。
　前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタンなどが挙げられる。
　前記抽出後の化合物２及び化合物３の少なくともいずれか及びそれらの塩を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過法、向流分配を利用したクロマトグラフィー法、これらの方法を単独又は組み合わせる方法などが挙げられる。
（医薬組成物）
　本発明の医薬組成物は、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
＜アミコロース誘導体＞
　前記医薬組成物中の、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬組成物は、前記アミコロース誘導体及びそれらの塩そのものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、具体例としては、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記医薬組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤型＞
　前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
－経口固形剤－
　前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
　前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩に、賦形剤、及び必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
　前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
　前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
　前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
　前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
　前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
－経口液剤－
　前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
　前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩に、必要に応じて、前記その他の成分、添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
　前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
　前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
－注射剤－
　前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
　前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩に、必要に応じて、前記その他の成分、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
＜投与＞
　前記医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
　前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
　前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
＜使用＞
　前記医薬組成物は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
＜用途＞
　前記医薬組成物は、有効成分として前記アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３の少なくともいずれか）及びそれらの塩を含むことから、後述する試験例１に示されるように、優れた細胞増殖抑制活性を有するものである。したがって、前記医薬組成物は、細胞増殖抑制剤として好適に利用可能であり、癌の予防又は治療に有用である。
　以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１：化合物１の製造）
＜アミコラマイシン（Ａｍｙｃｏｌａｍｉｃｉｎ）の製造＞
　寒天斜面培地に培養したアミコラトプシス・エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）ＭＫ５７５－ｆＦ５株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１４６５として寄託）を、ガラクトース２質量％、デキストリン２質量％、グリセリン１質量％、バクトソイトン（ディフコ社製）１質量％、コーン・スティープ・リカー０．５質量％、硫酸アンモニウム０．２質量％、炭酸カルシウム０．２質量％を含む液体培地（ｐＨ７．４に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して常法により１２０℃で２０分間滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で４日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。
　グリセリン０．５質量％、デキストリン０．５質量％、バクトソイトン（ディフコ社製）０．２５質量％、酵母エキス（日本製薬株式会社製）０．０７５質量％、硫酸アンモニウム０．０５質量％、炭酸カルシウム０．０５質量％（ｐＨ７．４に調整）の組成の培地１００Ｌをタンク培養槽（２００Ｌ容）中に調製し、更に滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の２体積％量を接種し、２７℃、通気量１００Ｌ、２００ｒｐｍの培養条件で４日間タンク培養した。
　このようにして得られた培養液を遠心分離して、培養ろ液８０Ｌと菌体２．５ｋｇとを分離した。次いで、菌体に１２Ｌのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体から下記構造式（４）で表される化合物（以下、「アミコラマイシン」と称することがある。）をメタノールで抽出した。これを減圧下でメタノールを除き、アミコラマイシンを含む菌体抽出液２Ｌを得た。菌体抽出液２Ｌに酢酸エチル６Ｌを加え、十分撹拌し、アミコラマイシンを酢酸エチル抽出した。得られた酢酸エチル６Ｌは、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で濃縮乾固して、アミコラマイシンを含む粗精製物１８ｇを得た。このアミコラマイシンを含む粗精製物の１８ｇに、ヘキサンを２００ｍＬ加え、ヘキサン可溶成分を除去し、アミコラマイシンを含むヘキサン不溶画分を３．３ｇ得た。このヘキサン不溶画分３．３ｇをメタノールで溶解して、セファデックスＬＨ－２０（内径２８ｍｍ×４５０ｍｍ、ファルマシア　バイオテク株式会社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。１フラクションを８ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション番号１２から１５に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、１,５８４ｍｇのアミコラマイシンを含む粗精製物を得た。この粗精製物１,５８４ｍｇは、少量のメタノールに溶解し、その溶液にキーゼルグール（メルク社製）５０ｍＬを加え、溶媒を減圧下で濃縮乾固した。このキーゼルグールを、シリカゲルカラム（内径３２ｍｍ×長さ１７５ｍｍ、メルク社製）の上にのせ、クロマトグラフィーを行った。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：水＝１００：０：０（２００ｍＬ）、９５：５：０（４５０ｍＬ）、１：９５：５：０．２５（４５０ｍＬ）、１：９０：１０：０．５（４５０ｍＬ）で順次展開を行った。１フラクションを１８ｇずつ分画すると、アミコラマイシンはフラクション番号７６から１０３に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、８２７ｍｇの純粋なアミコラマイシンを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　得られたアミコラマイシンの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、アミコラマイシンが、下記構造式（４）で表される構造を有する化合物であることが確認された。また、このアミコラマイシンは互変異性を有していた。
（１）　外観は、白色パウダー状である。
（２）　分子式は、Ｃ４４Ｈ６０Ｃｌ２Ｎ４Ｏ１４で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：負イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　９３７．３３８６（Ｍ－Ｈ）－であり、計算値は、ｍ／ｚ　９３７．３４０５（Ｃ４４Ｈ５９Ｃｌ２Ｎ４Ｏ１４として）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝－２１．６°（ｃ０．５，メタノール）、である。
（５）　赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
（６）　紫外線吸収スペクトルは、図２に示す通りである。
（７）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルは、図３に示す通りである。
（８）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、図４に示す通りである。
（９）　薄層クロマトグラフィーとして、シリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）の薄層クロマトグラフィーでは、展開溶媒としてクロロホルム：メタノール（９０：１０、容量比）を用いて展開したときのＲｆ値は、０．３１である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
＜アミコラマイシンの加水分解＞
　アミコラマイシン（２．０５ｍｇ、２．１８ｎｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液０．５ｍＬに対し、４Ｍ塩酸を１ｍＬ混合し、室温にて２時間攪拌することにより加水分解を行った。飽和重曹水溶液１０ｍＬで反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出を行なった。得られた有機層は飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水を行い、濾過により硫酸マグネシウムを除いた後、溶媒を減圧留去した。残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒　酢酸エチル：メタノール（９０：１０、容量比））による精製を行い、加水分解体として化合物１を得た。化合物１の収量は０．７８ｍｇであり、そのモル収率は９７％であった。
　得られた化合物１の物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、化合物１は下記構造式（１）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。また、この化合物１は互変異性を有していた。
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１４Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　３８９．０６４０（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　３８９．０６４１（Ｃ１４Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝＋１５°（ｃ０．５１、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
－化合物１のα体－
　δｐｍ：１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８，１４．１Ｈｚ），１．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，１４．１Ｈｚ），２．２３（３Ｈ，ｓ），３．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，），３．８８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．２，６．２Ｈｚ），４．３２（１Ｈ，ｐｅｎｔ．，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｓ），５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，８．０Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１０．２０（１Ｈ，ｂｒｓ）
－化合物１のβ体－
　δｐｍ：１．１９(３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ)，１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，１３．１Ｈｚ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１３．１Ｈｚ），２．２３（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．１１（１Ｈ，ｔ，８．９Ｈｚ，），３．５８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８．９，６．２Ｈｚ），３．９２（１Ｈ，ｓ），４．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｐｅｎｔ．，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．１，６．２，９．３Ｈｚ），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１０．２０（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
－化合物１のα体－
　δｐｍ：１１．１（ｑ），１６．２（ｑ），１８．５（ｑ），３８．８（ｔ），５２．３（ｄ），７１．１（ｄ），７４．３（ｄ），７６．３（ｓ），９２．７（ｄ），１１０．３（ｓ），１１１．５（ｓ），１１９．８（ｓ），１２９．７（ｓ），１６１．０（ｓ）
－化合物１のβ体－
　δｐｍ：１１．１（ｑ），１６．２（ｑ），１８．６（ｑ），３４．８（ｔ），５２．３（ｄ），６５．１（ｄ），７４．５（ｄ），７７．２（ｓ），９３．３（ｄ），１１０．２（ｓ），１１１．７（ｓ），１１９．６（ｓ），１２９．５（ｓ），１６１．２（ｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（実施例２：化合物２及び化合物３の製造）
アミコラマイシン（１９．５ｍｇ、２０．７ｎｍｏｌ）のメタノール溶液１ｍＬに対し、５質量％塩化水素メタノール溶液１ｍＬを混合し、室温にて３時間攪拌することにより加溶媒分解を行った。飽和重曹水溶液１０ｍＬで反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出を行なった。得られた有機層は飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで脱水を行い、濾過により硫酸マグネシウムを除いた後、溶媒を減圧留去した。残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル：メタノール（９５：５、容量比））による精製を行い、βメチルグリコシド体（化合物２）及びαメチルグリコシド体（化合物３）を得た。化合物２は４．８ｍｇであり、そのモル収率は６４％であった。また、化合物３の収量は２．５ｍｇあり、そのモル収率は３３％であった。
　得られた化合物２の物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、化合物２は下記構造式（２）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　４０３．０７８８（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　４０３．０７９８（Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝－１１３°（ｃ０．２４、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，１３．１Ｈｚ），１．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１３．１Ｈｚ），２．２８（３Ｈ，ｓ），２．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．１７（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），３．４８（３Ｈ，ｓ），３．６４（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．３，６．２，Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝７．３，６．２Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，９．３Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），９．５－９．６（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１１．４（ｑ），１６．１（ｑ），１８．０（ｑ），３６．３（ｔ），５２．６（ｄ），５５．６（ｑ），７０．４（ｄ），７４．２（ｓ），７６．２（ｄ），９９．７（ｄ），１１１．１（ｓ），１１２．４（ｓ），１１７．４（ｓ），１２８．７（ｓ），１６１．３（ｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　得られた化合物３の物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、化合物３は下記構造式（３）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）　外観は、無色シロップ状である。
（２）　分子式は、Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５で表される。
（３）　高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ　４０３．０７８８（Ｍ＋Ｎａ）＋であり、計算値は、ｍ／ｚ　４０３．０７９８（Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｎａとして）である。
（４）　比旋光度は、［α］Ｄ ２３＝＋８３°（ｃ０．１３、クロロホルム）、である。
（５）　プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、６００ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８，１４．４Ｈｚ），１．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．１，１４．４Ｈｚ），２．２７（３Ｈ，ｓ），２．３０（１Ｈ，ｂｒｓ），３．２４（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．６８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．４，６．５，Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４２（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），９．７４（１Ｈ，ｂｒｓ）
（６）　炭素１３核磁気共鳴スペクトルとして、１５０ＭＨｚにおいて重クロロホルム中で３０℃にて測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りである。
　δｐｍ：１１．３（ｑ），１６．３（ｑ），１７．９（ｑ），３５．０（ｔ），５０．６（ｄ），５５．２（ｑ），６５．３（ｄ），７３．４（ｓ），７４．２（ｄ），９８．２（ｄ），１１０．３（ｓ），１１０．９（ｓ），１１８．７（ｓ），１２７．６（ｓ），１５９．３（ｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　得られたアミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３）の細胞増殖抑制活性を、以下の試験例１で確認した。
（試験例１：細胞増殖抑制活性）
　ヒト前立腺間質細胞ＰｒＳＣ（Ｂｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を１０質量％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を含むＤＭＥＭ（日水製薬株式会社製）で５×１０４細胞／ｍＬに調製し、９６穴プレートに０．１ｍＬずつ播種し、アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３）を、それぞれ終濃度が０．０２４μｇ／ｍＬ、０．０９８μｇ／ｍＬ、０．３９１μｇ／ｍＬ、１．５６３μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３日間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、インキュベーターにて培養した。リン酸緩衝液で５ｍｇ／ｍＬに調製したＭＴＴ（３－［４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ］－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）を１０μＬずつ各穴に加え、４時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、インキュベーターにて培養し、１０ｍＭ塩酸で調製した２０質量％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ）を１００μＬ加えて、１晩、３７℃に静置し、ＭＴＴによって生成されたフォルマザンを溶解させた。吸光光度計にて５７０ｎｍの吸光度を測定した（以下、「アミコロース誘導体添加サンプル吸光度」と称することがある。）。アミコロース誘導体無添加の場合の吸光度（以下、「コントロール吸光度」と称することがある。）を１００％とし、各濃度のアミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３）について、下記計算式（１）より細胞増殖率を算出した。その結果を図５に示す。
　　細胞増殖率（％）＝アミコロース誘導体添加サンプル吸光度／コントロール吸光度×１００　・・・計算式（１）
　図５より、アミコロース誘導体（化合物１、化合物２、及び化合物３）は細胞の増殖抑制活性が認められ、特に化合物１に顕著な細胞増殖抑制活性が認められた。
　本発明のアミコロース誘導体及びそれらの塩は、優れた細胞増殖抑制活性を有するため、癌などの細胞増殖を抑制する医薬組成物の有効成分として、好適に利用可能である。

Claims (9)

  1. 　下記一般式（１）で表されることを特徴とする化合物及びその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
  2. 　「Ｒ」が水素原子である請求項１に記載の化合物及びその塩。
  3. 　「Ｒ」がメチル基である請求項１に記載の化合物及びその塩。
  4. 　下記一般式（１）で表される化合物及びその塩の製造方法であって、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属に属し、下記構造式（４）で表される化合物及びその塩を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物から該構造式（４）で表される化合物及びその塩を採取し、該構造式（４）で表される化合物及びその塩を分解することを特徴とする化合物及びその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  5. 　下記構造式（１）で表される化合物及びその塩の製造方法であって、分解が、酸性水溶液による加水分解である請求項４に記載の化合物及びその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  6. 　酸性水溶液が、酢酸、硫酸、硝酸、及び塩化水素の少なくともいずれかを含有する請求項５に記載の化合物及びその塩の製造方法。
  7. 　下記構造式（２）及び下記構造式（３）の少なくともいずれかで表される化合物及びそれらの塩の製造方法であって、分解が、アルコール溶液による加溶媒分解である請求項４に記載の化合物及びその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  8. 　アルコール溶液が、酢酸、硫酸、硝酸、及び塩化水素の少なくともいずれかを含有する酸性アルコール溶液である請求項７に記載の化合物及びその塩の製造方法。
  9. 　下記一般式（１）で表される化合物及びその塩を含有することを特徴とする医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　前記一般式（１）中、「Ｒ」は水素原子及びアルキル基のいずれかを示す。
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