WO2010136617A1 - Conjugado polimérico para el tratamiento de infecciones bacterianas - Google Patents

Conjugado polimérico para el tratamiento de infecciones bacterianas Download PDF

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Definitions

  • the present invention refers to a pharmaceutical composition comprising the amphiphilic polymer conjugate of the present invention.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
  • Figure 6 shows the cell viability assays with MTT.

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Abstract

La presente invención se refiere a un conjugado polimérico amfifílico que comprende Ia fórmula general I, a Ia síntesis del mismo y al uso como medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas.

Description

CONJUGADO POLIMÉRICO PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES
BACTERIANAS
Campo de Ia invención
La presente invención se encuadra en general dentro del campo de Ia química médica y en particular se encuadra dentro del campo de los polímeros terapéuticos.
Antecedentes de Ia invención
Las endotoxinas ó lipopolisacáridos (LPS) son constituyentes de Ia membrana externa de bacterias Gram negativas. Cuando se liberan como resultado de Ia división celular o el tratamiento con antibióticos, los LPS son reconocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) por receptores tipo toll (TLR; siendo el TLR4 específico para LPS) (Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-2088 (1998); Poltorak, A., Ricciardi-Castagnoli, P., Citterio, S. & Beutler, B. Proc Nati Acad Scí U S A 97, 2163- 2167. (2000)). Estos receptores retransmiten Ia señal de los LPS a los núcleos de células inmunes innatas, dando como resultado su activación y Ia secreción subsiguiente de citoquinas proinflamatorias. La presencia continua de LPS en Ia corriente sanguínea de los mamíferos induce Ia desregulación de citoquinas, dando lugar al choque séptico (Heine, H., Rietschel, ET. & Ulmer, AJ. Mol Biotechnol 19, 279-296. (2001)), Ia causa principal de mortalidad en pacientes sépticos.
La sepsis es Ia décima causa principal de muerte en general, así como Ia causa más importante de muerte en las unidades de cuidados intensivos (Minino, A.M., Heron, M.P., Murphy, S.L. & Kochanek, K.D. Nati Vital Stat Rep 55, 1-119 (2007)). A pesar de Ia incidencia de Ia sepsis, solo se ha aprobado como tratamiento un agente, Ia drotrecogina alfa (Xigris®), (Vincent, J. L. Expert Opin Biol Ther. 7, 1763-1777. (2007)).
Recientemente, las investigaciones en este campo se han centrado en terapias extracorpóreas contra endotoxinas dirigidas a reducir los niveles en circulación de LPS (Burns, M.R. et al. J Med Chem 50, 877-888 (2007); Cruz, D.N. et al. Crit Care 11 , R47 (2007); Nguyen, T.B. et al. Bioorg Med Chem 15, 5694-5709 (2007) y Sil, D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51 , 2811-2819 (2007)).
La polimixina B, es un péptido que neutraliza LPS pero es demasiado tóxico para el uso sistémico, se ha desarrollado como un dispositivo médico de purificación de sangre basado en diálisis en el que se inmoviliza en fibras de poliestireno (PMX-F); este dispositivo ha sido utilizado desde 1994 por el programa de seguro sanitario nacional japonés (Shoji, H. Ther Apher Dial 7, 108-114 (2003)).
En investigaciones previas, los autores identificaron una molécula pequeña neutralizante de LPS, el peptoide 7 (PTD7) (Mora, P. et al. J Med Chem 48, 1265- 1268. (2005)) (Fig. 1 ). Sin embargo, el PTD7 tiene una escasa solubilidad en agua y una toxicidad no específica, de tal forma que su uso como terapia queda limitado.
Existe pues lina necesidad apremiante de desarrollar medicamentos efectivos contra las endotoxinas útiles en el tratamiento y prevención de las infecciones bacterianas y contra Ia sepsis.
Descripción de Ia invención
La presente invención se refiere a un conjugado polimérico amfifílico que neutraliza y promueve la eliminación sistémica de endotoxinas, siendo útil en el tratamiento de infecciones bacterianas y evitando Ia sepsis.
Así pues, en un primer aspecto, Ia presente invención se refiere a conjugado polimérico amfifílico que comprende Ia fórmula general I:
PTD7-(L1 )n-(L2)m-(PEG)- (L2)m-(L1 )n-PTD7
donde:
L1 es una secuencia peptídica de entre uno a cinco aminoácidos cuyos aminoácidos son iguales o diferentes y son seleccionados de entre el grupo formado por GIy, Val,
Leu, Ne, Phe, Arg, Lys, Asp, GIu, preferentemente es GIy n = 1-5
L2 es ácido láctico m = 0-1
PTD7 comprende Ia siguiente fórmula general Il
Figure imgf000004_0001
En un aspecto más en particular, el conjugado polimérico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III, donde L1 es GIy , n = 2, L2 es ácido láctico , m = 0.
Figure imgf000004_0002
En otro aspecto en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV, donde L1 es GIy, n = 2, L2 es ácido láctico
Figure imgf000004_0003
En otro aspecto particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para su uso como medicamento. En un aspecto más en particular el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general I, en un aspecto más en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general Hh En otro aspecto en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general IV.
En otro aspecto en particular, Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para uso en diálisis intracorpórea. En un aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.
En Ia presente invención se entiende por diálisis intracorpórea Ia eliminación del torrente sanguíneo de contaminantes o toxinas que puedan desencadenar cuadros de enfermedad tales como infecciones graves e incluso inducir shock séptico. Los nanoconjugados descritos actúan como 'scavengers'.
Esto es posible debido a Ia farmacocinética asociada a los conjugados polímero- fármaco como los conjugados de PEG descritos en Ia presenta invención. Estos nanoconjugados son administrados de forma intravenosa, distribuidos por el torrente sangíneo y eliminados de forma renal (Duncan, R. Nat. Rev. Cáncer 6, 688-701 (2006); Webster, R. et al Drug Metabol. Disp. 35, 9-16 (2007)) una vez han ejercido su actividad, en este caso Ia interacción con Ia endotoxina LPS.
En un aspecto más en particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para el tratamiento de infecciones bacterianas, en otro aspecto más en particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico de Ia presente invención para el tratamiento de las infecciones bacterianas producidas por endotoxinas de bacterias Gram negativas, en particular sé refiere a las infecciones producidas por endotoxinas bacterianas de naturaleza lipídica, más en particular a infecciones producidas por LPS. En un aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.
En otro aspecto más en particular, Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para el tratamiento de Ia sepsis bacteriana. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.
En Ia presente invención se entiende por sepsis al síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) provocado por una infección causada por Ia presencia de microorganismos en sangre o por Ia presencia de sus toxinas.
En un segundo aspecto, Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.
En un tercer aspecto, Ia presente invención se refiere a un procedimiento para Ia síntesis de un conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención, que comprende las siguientes reacciones: a) Incorporar mediante síntesis en fase sólida de al menos dos aminoácidos al PTD7 unido a una resina para dar lugar al compuesto PTD7-(L1)n, donde los aminoácidos (L1 ) son iguales o diferentes y son seleccionados de entre el grupo formado por GIy, Val, Leu, Ne, Phe, Arg, Asp, GIu b) Eliminar Ia resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con - COOH En otro aspecto en particular, en el procedimiento de Ia presente invención entre Ia etapa a) y Ia etapa b) hay otra etapa que comprende Ia incorporación de un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD7-2GLact
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra Ia estructura química y características de los nanoconjugados sintetizados a partir de Peptoide 7 (PTD7). a: PTD7, b: PEG-2G-PTD7, c: PEG- Lact2G-PTD7, d: PGA-4G-PTD7 y e: PGA-Lact4G-PTD7.
La figura 2 muetra Ia síntesis de los conjugados PEG-PTD7. a: petoidil-resina, b: PTD7-2GLact, c: PTD7-2G, d: PEG-COOH, e: conjugados PEG-PTD7.
La figura 3 muestra el perfil de liberación de PTD7 a partir de conjugados PEG-PTD7 tras Ia incubación con catepsina B y en condiciones hidrolíticas.
La figura 4 muestra Ia liberación del PTD7 del conjugado en plasma después de 1 y 24 h de incubación a 37 0C.
La figura 5 muestra el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) de los nanoconjugados a: PEG-2G-PTD7 y b: PEG-Lact2G-PTD7 en presencia o ausencia de LPS.
La figura 6 muestra los ensayos de viabilidad celular con MTT.
La figura 7 muestra Ia inhibición de TNF-σ inducida por LPS.
La figura 8 muestra los efectos de los nanoconjugados PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G- PTD7 en Ia supervivencia y en los niveles de citoquinas inducidas por LPS en un modelo murino de sepsis.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un nanoconjugado polimérico amfifílico que supera las desventajas de toxicidad e insolubilidad del PTD7 de tal forma que se proporciona un medicamento útil en el tratamiento y prevención de las infecciones bacterianas y contra Ia sepsis. Ejemplo 1: Síntesis de nanoconjugados
El conector polímero-fármaco fue clave para controlar Ia cinética de liberación del fármaco de los nanoconjugados. Las moléculas de carga pueden conjugarse a través de conectores de amida hidrolíticamente estables o a través de conectores de éster hidrolíticamente lábiles. Los autores sintetizaron cuatro conjugados de polímero-PTD7 (Fig. 1 ), dos basados en poli-(ácido L-glutámico) (PGA) (resultados no mostrados): PGA-4G-PTD7 (PTD7 unido a través de enlaces de amida al polímero) y PGA-Lact4G- PTD7 (PTD7 unido a través de un enlace éster), que enmascaran Ia actividad de PTD7 hasta Ia liberación intracelular lisosomotrópica; y dos basados en Polietilenglicol (PEG): PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7, que permiten Ia actividad de PTD7 prolongada en Ia corriente sanguínea.
En primer lugar se realizó Ia síntesis de derivados de PTD7, (Fig. 2) para ello se usó Ia síntesis de péptidos en fase sólida con Fmoc se incorporaron dos y cuatro residuos de glicina (G) en Ia peptoidil 7-resina preensamblada (una resina de poliestireno funcionalizada con peptoide 7 (PTD7) (f = 0,71 mmol/g). Para Lact-derivados, se introdujo ácido L-láctico en Ia última etapa usando las mismas condiciones. El derivado de PTD7 se segmentó de Ia resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA, 95%) y se purificó mediante una RP-HPLC preparativa (Lichrospher® 100 C18, 250 x 10 mm) usando un gradiente de acetonitrilo en TFA acuoso al 0,1% (de 30 a 90% de acetonitrilo en 25 min). La identidad y Ia pureza (90-95%) se confirmaron mediante HPLC y espectrometría de masas de desorción/ionización lasérica asistida por matriz-tiempo de vuelo que dieron los siguientes resultados:
PTD7-2G : 1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.80 (1H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H), 6.70 (d, J=9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH2N), 3.99 (m, 1H, CHPh2(Nt)), 3.93 (m, 1H, CHPh2(Ct)), 3.82-3.66 (m, 4H, COCH2N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCH2), 3.48 (m, 2H, NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.82 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.56 (m, 2H, NCH2CH2), 2.33 (m, 2H, CH2CHPh2 (Nt)), 1.94 (m, 2H, CH2CHPh2 (Q)). 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 169.1 , 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 55.12, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5. MALDI-TOF MS: m/z 825,4 [M]
PTD7-2GLact : 1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.80 (2H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H), 6.70 (d, J=9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH2N), 3.99 (m, 1H, CHPh2(N4)), 3.93 (m, 1H, SHPh2(Ct)), 3.88 (m, 1H, CH3-CH-OH), 3-82-3.66 (m, 4H, COCH2N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCJH2), 3.48 (m, 2H, NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H, NChI2CH2CH), 2.82 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.56 (m, 2H, NCH2CH2), 2.33 (m, 2H, CH2CHPh2 (N1)), 1.94 (m, 2H, CH2CHPh2 (C1)), 1.30 (dd, 3H, CHCH3). 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 171.4, 169.1 , 158.7, 143.4, 143.3, 130.1 , 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 68.2, 55.2, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5, 20.2. MALDI-TOF MS: 919,4 [M + Na]+
A continuación se realizó Ia funcionalización con Polietilenglicol (PEG), para ello se preparó un compuesto de PEG bifuncional (Mw 4000 Da) que contenía grupos extremos carboxilo (PEG-COOH). En primer lugar, PEG-OH (320 mg, 0,08 mmol) se destiló en tolueno, a continuación, se añadió una solución 1 M de terc-butóxido potásico en alcohol terc-butílico y Ia mezcla de reacción se dejó reposar durante 1 ñ a 5O0C y durante Ia noche a 370C. La mezcla de reacción en bruto se filtró y se trató con TFA al 45,4%/ CH2CI2 al 54,5 %/H20 al 0,1% durante 3 h a temperatura ambiente. El compuesto carboxilado esperado se precipitó en terc-butil-metil-éter frío y se filtró. 1H NMR (δ, CDCI3): 10,9 ppm (s, COOH) y FT-IR (u, cm"1): 1710 (s, COOH) confirmaban Ia presencia de Ia funcionalidad -COOH. ,
Posteriormente se realizó Ia síntesis del conjugado de PEG-2G-PTD7, para ello a una solución de PEG-COOH (65 mg, Mw 4000 Da) en DMF anhidra (4 mi) se añadió DIC (10 μl, 0,064 mmol) y, después de 5 min, HOBt (8,8 mg, 0,064 mmol) y Ia mezcla se agitó durante 15 min. A continuación, se añadió el 2G-PTD7 (26,8 mg, 0,032 mmol, relación molar PEG/peptoide = 2) y el pH se ajustó hasta 8 con DIEA. Se dejó que Ia reacción avanzara durante 24 h a temperatura ambiente. La verificación mediante cromatografía en capa fina (TLC, gel de sílice) mostraba Ia conversión completa de PTD7-2G (Rf = 0,4) en conjugado de polímero (Rf = 0, CH2CI2/Me0H = 90:10). Para detener Ia reacción, Ia DMF se retiró bajo vacío; el residuo se almacenó a -2O0C hasta Ia purificación, se redisolvió en agua, se centrifugó para retirar Ia urea y el sobrenadante se purificó a través de una columna G10. Las fracciones recogidas se liofilizaron a continuación para dar un polvo blanco (70%). El producto purificado se caracterizó mediante 1H NMR, cuyos resultados fueron los siguientes.
1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar), 4.80 (m, 2H, COCJH2N), 4.60-4.03 (2H, COCH2N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH2N+ CHPh2 + COCJH2N (2G) + OCH3 +,NCH2CH2+ NCH2CH2CH), 2.99 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.53 (m, PEG, -CH2CO- + NCH2CH2 + CH2CHPh2 (N1)), 1.94 (ca, 2H, CH2CHPh2 (Ct)]. 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1 , 130.1 , 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1 , 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.47, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1, 26.6.
Para Ia síntesis del conjugado PEG-Lact2G-PTD7, a una solución de PEG-COOH (55 mg, Mw 4000 Da) en DMF anhidra (4 mi) se añadió DIC (9 μl, 0,055 mmol) y, después de 5 min, HOBt (7,4 mg, 0,055 mmol) y Ia mezcla se agitó durante 15 min. A continuación, se añadió el PTD7-2GLact (24,5 mg, 0,027 mmol, relación molar PEG/peptoide = 2) y el pH se ajustó hasta 8 con DIEA. Se dejó que Ia reacción avanzara durante 24 h a temperatura ambiente. La verificación por cromatografía en capa fina (TLC, gel de sílice) mostraba Ia conversión completa de PTD7-2GLact (Rf = 0,5) en conjugado de polímero (Rf = 0, CH2CI2/Me0H = 90:10). La mezcla de reacción en bruto se trató y se purificó según se describe anteriormente. Las fracciones se liofilizaron a continuación para dar un polvo blanco (60%). El producto purificado se caracterizó mediante 1H NMR, cuyos resultados fueron los siguientes:
1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar), 5.29 (m, 2H, CH3-CH-O-), 4.80 (m, 2H, COCH2N), 4.60-4.03 (ca, 2H, COCH2N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH2N+ CHPh2 + COCH2N (2G) + OCÍI3 + NCjH2CH2+ NCH2CH2CH), 2.99 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.53 (m, PEG, -CJH2CO- + NCH2CJH2 + CH2CHPh2 (N4)), 1.94 (2H, CH2CHPh2 (Q)), 1.30 (m, 6H, CHCjH3J. 73C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 174.4, 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1 , 130.1 , 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1 , 90.4, 83.8, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.4, 41.2, 38,2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1 , 26.6, 18.1 , 15.3.
Ejemplo 2: Evaluación de Ia estabilidad y Ia biosensibilidad de los nanoconiugados en diferentes ambientes fisiológicos (plasma, condiciones hidrolíticas y condiciones lisosómicas). .
Estabilidad de los conjugados en presencia de catepsina B.
Se añadió catepsina B (5 U) a una solución de 3 mg de conjugado en 1 mi de un tampón de pH 6 compuesto por acetato sódico 20 mM, EDTA 2 mM y DTT 5 mM y Ia mezcla se incubó a 37°C. Se tomaron alícuotas (150 μl) en tiempos de hasta 72 h, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron congeladas en Ia oscuridad hasta que se ensayaban mediante HPLC (análisis de alícuotas de 100 μl después del procedimiento de extracción) y/o SEC (análisis directo de alícuotas de 50 μl). En experimentos de control, los polímeros se incubaron en tampón solo (sin adición de catepsina B) para determinar Ia segmentación hidrolítica no enzimática.
Estabilidad de los conjugados en condiciones hidrolíticas (diferentes valores de pH) Los conjugados (3 mg/ml) se incubaron a 370C en solución tamponadora de fosfato (PBS) a pH 5,5 y 7,4 durante 72 horas. Se recogieron muestras de 100 μl en tiempos predeterminados y se analizaron mediante RP-HPLC, usando una columna C18 LiChroSpher 100 (5 μm), con el detector UV a 480 nm. Qomo eluyente A se utilizó agua y como eluyente B se utilizó acetonitrilo, conteniendo ambos TFA al 0,1 %. La elución se realizó mediante el siguiente gradiente: de 25% de B a 30% de B durante 10 min, de 30% de B a 80% de B durante 5 min, de 80% de B a 90% de B durante 5 minutos y de 90% de B a 25% de B durante 5 min. El caudal fue de 1 ml/min.
Los resultados (Fig.3) mostraron que los conjugados de PGA eran estables en tampones acuosos. Los dos nanoconjugados se degradaban en presencia de enzimas lisosómicas (catepsina B), permitiendo Ia liberación del fármaco de un modo dependiente del tiempo.
Estabilidad de los conjugados en plasma
Los conjugados (3 mg/ml) se incubaron durante 1 y 24 horas a 37°C en plasma de ratón obtenido después de Ia centrifugación de sangre a 1500 x g durante 10 minutos a 4°C. Se extrajeron muestras de 100 μl en tiempos predeterminados y se añadieron
300 μl de acetonitrilo para precipitar las proteínas. Las muestras se centrifugaron a
15000 x g y el sobrenadante se secó. El residuo se redisolvió con 100 μl de acetonitrilo y se analizó mediante RP-HPLC según se ha descrito anteriormente. '
Los resultados (Fig. 4) mostraron que los nanoconjugados eran estables en plasma y que Ia liberación de PEG-Lact2G-PTD7 fue más rápida que Ia de PEG-2G-PTD7, sin embargo, existía alguna liberación de PTD7 desde PEG-Lact2G-PTD7 en plasma
(40% de liberación de fármaco en 24 h)
Ejemplo 3: Caracterización biofísica detallada de conjugados de polímero-PTD7. Estudios de NMR Los experimentos homonucleares incluían 2D 1H, 1H NOESY y TOCSY con anchuras espectrales de 8 kHz en ambas dimensiones, usando un esquema WATERGATE para suprimir Ia señal de agua para el H2O. Los tiempos de mezcladura eran 400 y 80 ms para los experimentos de NOESY y TOCSY, respectivamente. La espectroscopia de NMR ordenada por difusión bidimensional (DOSY) (Barjat, H., Morris, G. A., Smart, S., Swanson, A. G., Williams, S. C. R. J. Magn. Reson, Ser. B 108, 170-172 (1995)), se realizó con una ecosecuencia estimulada usando impulsos de gradiente bipolares (Brand, T.; Cabrita, E. J.; Berger, S. Prog. NMR Spectrosc. 46, 159-196 (2005)) y con un esquema WATERGATE para suprimir Ia señal del agua. Las longitudes de los impulsos y los retrasos se mantuvieron constantes y se adquirieron 16 espectros de 24 exploraciones cada uno con Ia fuerza del gradiente de difusión variando entre '5% y 100%. Las longitudes del gradiente de difusión y el eco estimulado se optimizaron para cada muestra. Valores típicos eran δ = 6-7 ms, Δ = 160-170 ms. El procesamiento y el análisis de los datos se realizaron con el protocolo de DOSY incluido en el paquete de software Topspin.
Estudios de dispersión dinámica de luz (DLS)
Las medidas de DLS se realizaron a 250C usando un instrumento Malvern Zetasizer NanoZS, equipado con un láser de 532 nm con un ángulo de dispersión fijo de 90°. Se prepararon por duplicado soluciones micelares acuosas de LPS (E. CoIi 0111 :B4; 1 ,2 mg/ml de solución de reserva) y cada polímero (1 mg/ml) usando agua destilada y una solución de tampón de fosfato (PBS) 0,1 M a pH 7,4 (Na2HPO4, KH2PO4, NaCI). Las soluciones micelares se sometieron a ultrasonidos durante 10 min a 40C y se filtraron a través de un filtro de membrana de celulosa de 0,45 μm antes del análisis. No se observaban diferencias significativas en las diferentes soluciones. La distribución del tamaño de las micelas por volumen se midió (diámetro, nm) para cada polímero en ausencia o presencia de una concentración creciente de solución micelar de LPS (0,02-0,1 mg/ml) (n >3).
Los análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) mostraron que las micelas de LPS en de 0,2 a 0,1 mg/ml (muy por encima de Ia concentración micelar crítica, CMC (Santos, N. C, Silva, A.C., Castanho, M., Martins-Silva, J. & Saldanha, C. Chembiochem 4, 96- 100 (2003)) tenían un tamaño promedio de 6 nm (figura 4: Fig. 1c), mientras que los conjugados de PEG-PTD7 producían micelas de diferentes tamaños, dependiendo del conector polímero-fármaco (Fig. 5). De forma interesante, cuando PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7, que tienen diámetros micelares promedio de 12 nm y 6 nm, respectivamente, se valoraban con concentraciones crecientes de LPS micelar, el tamaño promedio de las micelas se incrementaba hasta 20 nm, Por tanto, los conjugados PEG-PTD7 producen Ia estabilización de complejos comicelares disminuyendo de este modo Ia toxicidad del LPS al evitar su interacción con receptores celulares específicos y facilitando su eliminación del torrente sanguíneo de forma renal, por tanto los nanόconjugados PEG-PTD7 sirven para Ia diálisis intracorpórea.
Ejemplo 4: Viabilidad celular
Evaluación biológica de conjupados de PTD7 en cultivo celular.
Se obtuvieron macrófagos de ratón (RAW 264.7) de ATCC (American Type Culture
Collection, EE. UU. de A). Las células se hicieron crecer en Medio de Eagle
Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRI) complementado con suero bovino fetal
(FBS - Gibco' BRI) al 10% y L-glutamina al 1 %. Los cultivos se incubaron a 370C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%-aire al 95%. Se prepararon subcultivos de macrófagos cada 2-3 días raspando las células en medio reciente.
Ensayos de viabilidad celular con MTT
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetil-2- tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). Células RAW 264.7 se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocilios estériles a una densidad de siembra de 6 x 104 células/ml en DMEM complementado con FBS al 10% y se dejaron sedimentar durante 24 h. Diversas concentraciones de los compuestos se añadieron a las placas y las células se incubaron durante 24 h. Después de Ia retirada del medio, los cristales de formazano precipitados se disolvieron en DMSO de calidad óptica (100 μl) y las placas se leyeron a 570 nm usando una Wallac 1420 Workstation.
Los conjugados de PGA-PTD7 eran algo menos tóxicos que el PTD7 solo en un ensayo basado en líneas celulares de macrófagos RAW 264.722: los valores de IC50 eran 10 μM eqüiv. de fármaco para PGA-4G-PTD7 y 2 μM equiv. de fármaco para PTD7(resultados no mostrados). En contraste, ni PEG-2G-PTD7 ni PEG-Lact2G-PTD7 mostraban (Fig6) toxicidad celular hasta 30 μM equiv. de fármaco, más de 20 veces menos tóxicos que el fármaco libre original.
Evaluación de Ia expresión de TNP-g Se sembraron células RAW 264.7 en placas de 96 pocilios a una densidad de 100.000 células/ml en DMEM complementado con SBF al 1% y se dejaron sedimentar durante 24 h. A continuación, se añadió LPS (E. CoIi 055:B5; 0,5 ng/ml) en ausencia o presencia de PTD 7 y los conjugados a diferentes concentraciones. Después de 24 h, los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron durante 10 min a 400 x g y se almacenaron a -2O0C hasta Ia determinación del contenido de citoquina. El contenido de TNF-α en el sobrenadante celular se determinó usando un kit ELISA comercial (BD Bioscience) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se diluyeron 10 veces con tampón. Los cambios de color a 450 nm se midieron usando un lector dé placas de microvaloración. Los niveles de citoquinas se expresaron como picogramos por mililitro. El intervalo de detección del kit de ELISA era 0-1000 pg/ml. EI contenido de TNF-α de cada muestra se ensayó tres veces.
Los resultados mostraron que Ia presencia de PEG-2G-PTD7 o PEG-Lact2G-PTD7 disminuía casi cuantitativamente Ia producción de TNF-α inducida por LPS (Fig 7).
Ejemplo 5: Estudios in vivo
Grupos de ratones BALB-c de 8-10 semanas de edad fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 500 μg de LPS (E. CoIi 055:B5) en PBS solo o en combinación con PTD7 (60 μg), conjugados de PEG-PTD7 (60 μg, equiv. de fármaco) o 100 μg de polimixina B (PMB). Se analizó un total de 11 grupos. El LPS se inyectó en el lado izquierdo de Ia cavidad peritoneal mientras que el PTD7 (disuelto en PEG200), los conjugados de PEG-PTD7 (en PBS) o Ia PMB se inyectaron en el lado derecho de Ia cavidad peritoneal. Se extrajo sangre de los animales 90 min y 180 min después de Ia inyección de LPS desde Ia vena safena. Se llevó a cabo un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier usando el software GraphPad. ' .
Se obtuvo suero de cada muestra recogida después de Ia centrifugación de sangre a 1500 x g durante 10 min a 4°C. Los niveles de citoquinas inducidos por LPS en suero se examinaron a los 90 y 180 min después de tratamientos en diferentes diluciones (1 :0, 1 :10, 1 :40) mediante un ensayo múltiple de citoquinas LINCOplex de ratón, incluyendo interferón-γ (IFN-γ), intérleuquina-1β (IL-1β), interleuquina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleuquina-12(p70) (IL-12(p70)). El ensayo múltiple se llevó a cabo por duplicado en dos ocasiones diferentes de acuerdo con las especificaciones de! fabricante. Se generaron curvas estándar para cada citoquina usando las concentraciones de citoquinas de referencia suministradas por el fabricante. Se analizaron datos aleatorios (intensidad de fluorescencia media) mediante el MasterPlex Quantification Software para obtener valores de concentración. Los datos de las gráficas se expresan en pg/ml como media ± E.E.M. (n >>3).
Para el análisis estadístico in vivo de citoquinas se usó el ANOVA bidirecccional para consignar Ia significación estadística. Se usó análisis retrospectivo de Bonferroni-Holm para corregir con respecto a múltiples comparaciones. En todos los casos, se consideraba que p < 0,05 representaba Ia significación estadística.
Los resultados mostraron que los niveles en plasma de IL-2, IL-4, IL-12 (p70) y GM- CSF no se incrementaban significativamente en respuesta a. LPS. Las concentraciones de TNF-α eran las más altas 90 min después de Ia estimulación con LPS, y PTD7 y PMB reducían los niveles en plasma de esta citoquina más eficazmente que PEG-2G- PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 (probablemente debido a Ia farmacocinética; Fig. 8). Sin embargo, los niveles de IL-1β, IL-6 e IFN-γ eran superiores 180 min después dé Ia inyección, y PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 reducían significativamente los niveles en plasma de IL-1β, IL-6 e IFN-γ. Estas tres citoquinas proinflamatorias median en muchas de las características inmunopatológicas del choque inducido por LPS (Cohén, J. Nature 420, 885-891 (2002)).Sus actividades biológicas se solapan y están notablemente incrementadas en pacientes que desarrollan choque séptico letal (Sil, D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811-2819 (2007); Hack, CE. et al. Blood 74, 1704-1710 (1989); Netea, M.G. et al. Eur JImmunol 31, 2529-2538 (2001); Yan, JJ. et al. Nαt Med 10, 161-167, (2004)). Los datos demuestran una supervivencia mejorada de ratones estimulados con LPS tratados con PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 que se debió, al menos en parte, a niveles en plasma significativamente reducidos de citoquinas proinflamatorias.

Claims

REIVINDICACIONES
1- Conjugado polimérico amfifílico que comprende Ia fórmula general I:
PTD7-(L1 )n-(L2)m-(PEG)- (L2)m-(L1 )n-PTD7 donde:
L1 es una secuencia peptídica de 1 a 5 aminoácidos donde dichos aminoácidos son seleccionados de entre GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Lys, Asp,
GIu. n = 1-5
L2 es ácido láctico m = 0-1
PTD7 comprende Ia siguiente fórmula general Il
Figure imgf000016_0001
2. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque
L1 es GIy n = 2
L2 es ácido láctico m = 0
3. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 , donde el conjugado polimérico comprende Ia fórmula general IV.
L1 es GIy n = 2
L2 es ácido láctico m = 1
4. Conjugado polimétrico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.
5. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en diálisis intracorpórea.
6. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de Ia reivindicaciones 1-3 para el tratamiento de infecciones bacterianas.
7. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 6 donde la infección bacteriana es producida por endotoxinas de bacterias Gram negativas.
8. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 7 donde las endotoxinas bacterianas son de naturaleza lipídica.
9. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 8 donde Ia endotoxina bacteriana es LPS.
10. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para el tratamiento de Ia sepsis bacteriana.
11. Composición farmacéutica que comprende un conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
12. Procedimiento para Ia síntesis de un conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 que comprende las siguientes reacciones: a) Incorporar mediante síntesis en fase sólida de al menos 1 aminoácido al PTD7 unido a una resina para dar lugar al compuesto PTD7-(L1 )n, donde L1 es una secuencia peptídica de 1 a 5 aminoácidos donde dichos aminoácidos son seleccionados de entre GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Asp, GIu b) Eliminar Ia resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con - COOH
13. Procedimiento según Ia reivindicación 12 donde entre Ia etapa a) y Ia etapa b) comprende Ia incorporación de un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD7-2GLact.
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