WO2010136617A1 - Polymeric conjugate for treating bacterial infections - Google Patents

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WO2010136617A1
WO2010136617A1 PCT/ES2010/000211 ES2010000211W WO2010136617A1 WO 2010136617 A1 WO2010136617 A1 WO 2010136617A1 ES 2010000211 W ES2010000211 W ES 2010000211W WO 2010136617 A1 WO2010136617 A1 WO 2010136617A1
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polymeric
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María Jesús VICENTE DOCON
Laura CASCALES BOLAÑO
Enrique Perez Paya
Angel Ramon Messeguer Peupoch
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Definitions

  • the present invention refers to a pharmaceutical composition comprising the amphiphilic polymer conjugate of the present invention.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III.
  • the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
  • Figure 6 shows the cell viability assays with MTT.

Abstract

The present invention relates to an amphiphilic polymeric conjugate that comprises general formula I, to the synthesis thereof and to the use of same as a drug for treating bacterial infections.

Description

CONJUGADO POLIMÉRICO PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POLYMER CONJUGATE FOR INFECTION TREATMENT
BACTERIANASBACTERIALS
Campo de Ia invenciónField of the invention
La presente invención se encuadra en general dentro del campo de Ia química médica y en particular se encuadra dentro del campo de los polímeros terapéuticos.The present invention falls in general within the field of medical chemistry and in particular falls within the field of therapeutic polymers.
Antecedentes de Ia invenciónBackground of the invention
Las endotoxinas ó lipopolisacáridos (LPS) son constituyentes de Ia membrana externa de bacterias Gram negativas. Cuando se liberan como resultado de Ia división celular o el tratamiento con antibióticos, los LPS son reconocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) por receptores tipo toll (TLR; siendo el TLR4 específico para LPS) (Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-2088 (1998); Poltorak, A., Ricciardi-Castagnoli, P., Citterio, S. & Beutler, B. Proc Nati Acad Scí U S A 97, 2163- 2167. (2000)). Estos receptores retransmiten Ia señal de los LPS a los núcleos de células inmunes innatas, dando como resultado su activación y Ia secreción subsiguiente de citoquinas proinflamatorias. La presencia continua de LPS en Ia corriente sanguínea de los mamíferos induce Ia desregulación de citoquinas, dando lugar al choque séptico (Heine, H., Rietschel, ET. & Ulmer, AJ. Mol Biotechnol 19, 279-296. (2001)), Ia causa principal de mortalidad en pacientes sépticos.The endotoxins or lipopolysaccharides (LPS) are constituents of the outer membrane of Gram negative bacteria. When released as a result of cell division or antibiotic treatment, LPS are recognized as pathogen-associated molecular patterns (PAMP) by toll-like receptors (TLR; TLR4 being specific for LPS) (Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-2088 (1998); Poltorak, A., Ricciardi-Castagnoli, P., Citterio, S. & Beutler, B. Proc Nati Acad Scí USA 97, 2163-2177. (2000)). These receptors relay the signal of the LPS to the nuclei of innate immune cells, resulting in their activation and subsequent secretion of pro-inflammatory cytokines. The continuous presence of LPS in the mammalian blood stream induces cytokine deregulation, leading to septic shock (Heine, H., Rietschel, ET. & Ulmer, AJ. Mol Biotechnol 19, 279-296. (2001)) , The main cause of mortality in septic patients.
La sepsis es Ia décima causa principal de muerte en general, así como Ia causa más importante de muerte en las unidades de cuidados intensivos (Minino, A.M., Heron, M.P., Murphy, S.L. & Kochanek, K.D. Nati Vital Stat Rep 55, 1-119 (2007)). A pesar de Ia incidencia de Ia sepsis, solo se ha aprobado como tratamiento un agente, Ia drotrecogina alfa (Xigris®), (Vincent, J. L. Expert Opin Biol Ther. 7, 1763-1777. (2007)).Sepsis is the tenth leading cause of death in general, as well as the most important cause of death in intensive care units (Minino, AM, Heron, MP, Murphy, SL & Kochanek, KD Nati Vital Stat Rep 55, 1- 119 (2007)). Despite the incidence of sepsis, only one agent, drotrecogin alfa (Xigris®), has been approved as treatment (Vincent, J. L. Expert Opin Biol Ther. 7, 1763-1777. (2007)).
Recientemente, las investigaciones en este campo se han centrado en terapias extracorpóreas contra endotoxinas dirigidas a reducir los niveles en circulación de LPS (Burns, M.R. et al. J Med Chem 50, 877-888 (2007); Cruz, D.N. et al. Crit Care 11 , R47 (2007); Nguyen, T.B. et al. Bioorg Med Chem 15, 5694-5709 (2007) y Sil, D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51 , 2811-2819 (2007)).Recently, research in this field has focused on extracorporeal therapies against endotoxins aimed at reducing circulating levels of LPS (Burns, MR et al. J Med Chem 50, 877-888 (2007); Cruz, DN et al. Crit Care 11, R47 (2007); Nguyen, TB et al. Bioorg Med Chem 15, 5694-5709 (2007) and Sil, D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811-2819 (2007)).
La polimixina B, es un péptido que neutraliza LPS pero es demasiado tóxico para el uso sistémico, se ha desarrollado como un dispositivo médico de purificación de sangre basado en diálisis en el que se inmoviliza en fibras de poliestireno (PMX-F); este dispositivo ha sido utilizado desde 1994 por el programa de seguro sanitario nacional japonés (Shoji, H. Ther Apher Dial 7, 108-114 (2003)).Polymyxin B, a peptide that neutralizes LPS but is too toxic for systemic use, has been developed as a medical purification device for dialysis-based blood in which it is immobilized in polystyrene fibers (PMX-F); This device has been used since 1994 by the Japanese National Health Insurance Program (Shoji, H. Ther Apher Dial 7, 108-114 (2003)).
En investigaciones previas, los autores identificaron una molécula pequeña neutralizante de LPS, el peptoide 7 (PTD7) (Mora, P. et al. J Med Chem 48, 1265- 1268. (2005)) (Fig. 1 ). Sin embargo, el PTD7 tiene una escasa solubilidad en agua y una toxicidad no específica, de tal forma que su uso como terapia queda limitado.In previous research, the authors identified a small neutralizing molecule of LPS, peptoid 7 (PTD7) (Mora, P. et al. J Med Chem 48, 1265-1268. (2005)) (Fig. 1). However, PTD7 has poor water solubility and non-specific toxicity, so that its use as therapy is limited.
Existe pues lina necesidad apremiante de desarrollar medicamentos efectivos contra las endotoxinas útiles en el tratamiento y prevención de las infecciones bacterianas y contra Ia sepsis.There is therefore a pressing need to develop effective drugs against endotoxins useful in the treatment and prevention of bacterial infections and against sepsis.
Descripción de Ia invenciónDescription of the invention
La presente invención se refiere a un conjugado polimérico amfifílico que neutraliza y promueve la eliminación sistémica de endotoxinas, siendo útil en el tratamiento de infecciones bacterianas y evitando Ia sepsis.The present invention relates to an amphiphilic polymer conjugate that neutralizes and promotes the systemic elimination of endotoxins, being useful in the treatment of bacterial infections and avoiding sepsis.
Así pues, en un primer aspecto, Ia presente invención se refiere a conjugado polimérico amfifílico que comprende Ia fórmula general I:Thus, in a first aspect, the present invention relates to amphiphilic polymer conjugate comprising the general formula I:
PTD7-(L1 )n-(L2)m-(PEG)- (L2)m-(L1 )n-PTD7PTD7- (L1) n- (L2) m- (PEG) - (L2) m- (L1) n-PTD7
donde:where:
L1 es una secuencia peptídica de entre uno a cinco aminoácidos cuyos aminoácidos son iguales o diferentes y son seleccionados de entre el grupo formado por GIy, Val,L1 is a peptide sequence of one to five amino acids whose amino acids are the same or different and are selected from the group consisting of GIy, Val,
Leu, Ne, Phe, Arg, Lys, Asp, GIu, preferentemente es GIy n = 1-5Leu, Ne, Phe, Arg, Lys, Asp, GIu, preferably it is GIy n = 1-5
L2 es ácido láctico m = 0-1L2 is lactic acid m = 0-1
PTD7 comprende Ia siguiente fórmula general Il
Figure imgf000004_0001
PTD7 comprises the following general formula Il
Figure imgf000004_0001
En un aspecto más en particular, el conjugado polimérico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III, donde L1 es GIy , n = 2, L2 es ácido láctico , m = 0.In a more particular aspect, the polymeric conjugate of the present invention comprises the general formula III, where L1 is GIy, n = 2, L2 is lactic acid, m = 0.
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0002
En otro aspecto en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV, donde L1 es GIy, n = 2, L2 es ácido lácticoIn another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV, where L1 is GIy, n = 2, L2 is lactic acid
Figure imgf000004_0003
En otro aspecto particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para su uso como medicamento. En un aspecto más en particular el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general I, en un aspecto más en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general Hh En otro aspecto en particular, el medicamento comprende el conjugado polimérico descrito en Ia fórmula general IV.
Figure imgf000004_0003
In another particular aspect, the present invention relates to the amphiphilic polymer conjugate of the present invention for use as a medicament. In a more particular aspect the medicament comprises the polymeric conjugate described in the general formula I, in a more particular aspect, the medicament comprises the polymeric conjugate described in the general formula Hh In another aspect in particular, the medicament comprises the polymeric conjugate described in the general formula IV.
En otro aspecto en particular, Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para uso en diálisis intracorpórea. En un aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.In another aspect in particular, the present invention relates to the amphiphilic polymer conjugate of the present invention for use in intracorporeal dialysis. In a more particular aspect the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I. In another aspect in particular the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
En Ia presente invención se entiende por diálisis intracorpórea Ia eliminación del torrente sanguíneo de contaminantes o toxinas que puedan desencadenar cuadros de enfermedad tales como infecciones graves e incluso inducir shock séptico. Los nanoconjugados descritos actúan como 'scavengers'.In the present invention, intracorporeal dialysis is understood as the elimination of the bloodstream from contaminants or toxins that can trigger disease conditions such as serious infections and even induce septic shock. The nanoconjugates described act as 'scavengers'.
Esto es posible debido a Ia farmacocinética asociada a los conjugados polímero- fármaco como los conjugados de PEG descritos en Ia presenta invención. Estos nanoconjugados son administrados de forma intravenosa, distribuidos por el torrente sangíneo y eliminados de forma renal (Duncan, R. Nat. Rev. Cáncer 6, 688-701 (2006); Webster, R. et al Drug Metabol. Disp. 35, 9-16 (2007)) una vez han ejercido su actividad, en este caso Ia interacción con Ia endotoxina LPS.This is possible due to the pharmacokinetics associated with the polymer-drug conjugates such as the PEG conjugates described in the present invention. These nanoconjugates are administered intravenously, distributed through the bloodstream and eliminated renally (Duncan, R. Nat. Rev. Cancer 6, 688-701 (2006); Webster, R. et al Drug Metabol. Disp. 35, 9-16 (2007)) once they have exercised their activity, in this case the interaction with the LPS endotoxin.
En un aspecto más en particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para el tratamiento de infecciones bacterianas, en otro aspecto más en particular Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico de Ia presente invención para el tratamiento de las infecciones bacterianas producidas por endotoxinas de bacterias Gram negativas, en particular sé refiere a las infecciones producidas por endotoxinas bacterianas de naturaleza lipídica, más en particular a infecciones producidas por LPS. En un aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.In a more particular aspect the present invention refers to the amphiphilic polymer conjugate of the present invention for the treatment of bacterial infections, in another aspect more particularly the present invention refers to the polymeric conjugate of the present invention for the treatment of infections Bacterial produced by endotoxins of Gram negative bacteria, in particular refers to infections caused by bacterial endotoxins of a lipid nature, more particularly to infections caused by LPS. In a more particular aspect the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I. In another aspect in particular the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III. In another aspect in In particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
En otro aspecto más en particular, Ia presente invención se refiere al conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención para el tratamiento de Ia sepsis bacteriana. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.In another aspect in particular, the present invention relates to the amphiphilic polymer conjugate of the present invention for the treatment of bacterial sepsis. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
En Ia presente invención se entiende por sepsis al síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) provocado por una infección causada por Ia presencia de microorganismos en sangre o por Ia presencia de sus toxinas.In the present invention, sepsis is understood as the systemic inflammatory response syndrome (SRIS) caused by an infection caused by the presence of microorganisms in the blood or by the presence of its toxins.
En un segundo aspecto, Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención. En otro aspecto más en particular el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general I. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general III. En otro aspecto más en particular, el conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención comprende Ia fórmula general IV.In a second aspect, the present invention refers to a pharmaceutical composition comprising the amphiphilic polymer conjugate of the present invention. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula I. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula III. In another aspect in particular, the amphiphilic polymer conjugate of the present invention comprises the general formula IV.
En un tercer aspecto, Ia presente invención se refiere a un procedimiento para Ia síntesis de un conjugado polimérico amfifílico de Ia presente invención, que comprende las siguientes reacciones: a) Incorporar mediante síntesis en fase sólida de al menos dos aminoácidos al PTD7 unido a una resina para dar lugar al compuesto PTD7-(L1)n, donde los aminoácidos (L1 ) son iguales o diferentes y son seleccionados de entre el grupo formado por GIy, Val, Leu, Ne, Phe, Arg, Asp, GIu b) Eliminar Ia resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con - COOH En otro aspecto en particular, en el procedimiento de Ia presente invención entre Ia etapa a) y Ia etapa b) hay otra etapa que comprende Ia incorporación de un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD7-2GLactIn a third aspect, the present invention relates to a process for the synthesis of an amphiphilic polymer conjugate of the present invention, which comprises the following reactions: a) Incorporate by solid phase synthesis of at least two amino acids to PTD7 attached to a resin to give rise to compound PTD7- (L1) n , where amino acids (L1) are the same or different and are selected from the group consisting of GIy, Val, Leu, Ne, Phe, Arg, Asp, GIu b) Delete The resin bound to the compound obtained in the previous step c) Conjugation of the compound obtained in b) with PEG functionalized with - COOH In another aspect in particular, in the process of the present invention between stage a) and stage b) there is another stage comprising the incorporation of a lactic acid to the compound PTD7-2G to give rise to the compound PTD7-2GLact
Descripción de las figurasDescription of the figures
La figura 1 muestra Ia estructura química y características de los nanoconjugados sintetizados a partir de Peptoide 7 (PTD7). a: PTD7, b: PEG-2G-PTD7, c: PEG- Lact2G-PTD7, d: PGA-4G-PTD7 y e: PGA-Lact4G-PTD7.Figure 1 shows the chemical structure and characteristics of nanoconjugates synthesized from Peptoide 7 (PTD7). a: PTD7, b: PEG-2G-PTD7, c: PEG-Lact2G-PTD7, d: PGA-4G-PTD7 and e: PGA-Lact4G-PTD7.
La figura 2 muetra Ia síntesis de los conjugados PEG-PTD7. a: petoidil-resina, b: PTD7-2GLact, c: PTD7-2G, d: PEG-COOH, e: conjugados PEG-PTD7.Figure 2 shows the synthesis of the PEG-PTD7 conjugates. a: petoidyl resin, b: PTD7-2GLact, c: PTD7-2G, d: PEG-COOH, e: PEG-PTD7 conjugates.
La figura 3 muestra el perfil de liberación de PTD7 a partir de conjugados PEG-PTD7 tras Ia incubación con catepsina B y en condiciones hidrolíticas.Figure 3 shows the release profile of PTD7 from PEG-PTD7 conjugates after incubation with cathepsin B and under hydrolytic conditions.
La figura 4 muestra Ia liberación del PTD7 del conjugado en plasma después de 1 y 24 h de incubación a 37 0C.Figure 4 shows the release of PTD7 from the plasma conjugate after 1 and 24 h of incubation at 37 0 C.
La figura 5 muestra el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) de los nanoconjugados a: PEG-2G-PTD7 y b: PEG-Lact2G-PTD7 en presencia o ausencia de LPS.Figure 5 shows the dynamic light scattering analysis (DLS) of the nanoconjugates a: PEG-2G-PTD7 and b: PEG-Lact2G-PTD7 in the presence or absence of LPS.
La figura 6 muestra los ensayos de viabilidad celular con MTT.Figure 6 shows the cell viability assays with MTT.
La figura 7 muestra Ia inhibición de TNF-σ inducida por LPS.Figure 7 shows the inhibition of TNF-σ induced by LPS.
La figura 8 muestra los efectos de los nanoconjugados PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G- PTD7 en Ia supervivencia y en los niveles de citoquinas inducidas por LPS en un modelo murino de sepsis.Figure 8 shows the effects of the PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7 nanoconjugates on survival and on the levels of cytokines induced by LPS in a murine sepsis model.
Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention
La presente invención se refiere a un nanoconjugado polimérico amfifílico que supera las desventajas de toxicidad e insolubilidad del PTD7 de tal forma que se proporciona un medicamento útil en el tratamiento y prevención de las infecciones bacterianas y contra Ia sepsis. Ejemplo 1: Síntesis de nanoconjugadosThe present invention relates to an amphiphilic polymer nanoconjugate that overcomes the toxicity and insolubility disadvantages of PTD7 in such a way that a medicament useful in the treatment and prevention of bacterial infections and against sepsis is provided. Example 1: Synthesis of nanoconjugates
El conector polímero-fármaco fue clave para controlar Ia cinética de liberación del fármaco de los nanoconjugados. Las moléculas de carga pueden conjugarse a través de conectores de amida hidrolíticamente estables o a través de conectores de éster hidrolíticamente lábiles. Los autores sintetizaron cuatro conjugados de polímero-PTD7 (Fig. 1 ), dos basados en poli-(ácido L-glutámico) (PGA) (resultados no mostrados): PGA-4G-PTD7 (PTD7 unido a través de enlaces de amida al polímero) y PGA-Lact4G- PTD7 (PTD7 unido a través de un enlace éster), que enmascaran Ia actividad de PTD7 hasta Ia liberación intracelular lisosomotrópica; y dos basados en Polietilenglicol (PEG): PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7, que permiten Ia actividad de PTD7 prolongada en Ia corriente sanguínea.The polymer-drug connector was key to control the kinetics of drug release of the nanoconjugates. The charge molecules can be conjugated through hydrolytically stable amide connectors or through hydrolytically labile ester connectors. The authors synthesized four polymer-PTD7 conjugates (Fig. 1), two based on poly- (L-glutamic acid) (PGA) (results not shown): PGA-4G-PTD7 (PTD7 bound through amide bonds to polymer) and PGA-Lact4G-PTD7 (PTD7 attached through an ester bond), which mask the activity of PTD7 until lysosomotropic intracellular release; and two based on Polyethylene Glycol (PEG): PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7, which allow prolonged PTD7 activity in the blood stream.
En primer lugar se realizó Ia síntesis de derivados de PTD7, (Fig. 2) para ello se usó Ia síntesis de péptidos en fase sólida con Fmoc se incorporaron dos y cuatro residuos de glicina (G) en Ia peptoidil 7-resina preensamblada (una resina de poliestireno funcionalizada con peptoide 7 (PTD7) (f = 0,71 mmol/g). Para Lact-derivados, se introdujo ácido L-láctico en Ia última etapa usando las mismas condiciones. El derivado de PTD7 se segmentó de Ia resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA, 95%) y se purificó mediante una RP-HPLC preparativa (Lichrospher® 100 C18, 250 x 10 mm) usando un gradiente de acetonitrilo en TFA acuoso al 0,1% (de 30 a 90% de acetonitrilo en 25 min). La identidad y Ia pureza (90-95%) se confirmaron mediante HPLC y espectrometría de masas de desorción/ionización lasérica asistida por matriz-tiempo de vuelo que dieron los siguientes resultados:In the first place, the synthesis of derivatives of PTD7 was carried out, (Fig. 2) for this purpose the solid phase peptide synthesis with Fmoc was used, two and four glycine residues (G) were incorporated in the pre-assembled peptoidyl 7-resin (a Peptoid functionalized polystyrene resin 7 (PTD7) (f = 0.71 mmol / g) For Lact-derivatives, L-lactic acid was introduced in the last stage using the same conditions.The PTD7 derivative was segmented from the resin by treatment with trifluoroacetic acid (TFA, 95%) and purified by preparative RP-HPLC (Lichrospher® 100 C18, 250 x 10 mm) using a gradient of acetonitrile in 0.1% aqueous TFA (30 to 90% of acetonitrile in 25 min.) The identity and purity (90-95%) were confirmed by HPLC and mass spectrometry of laser desorption / ionization assisted by matrix-time of flight that gave the following results:
PTD7-2G : 1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.80 (1H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H), 6.70 (d, J=9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH2N), 3.99 (m, 1H, CHPh2(Nt)), 3.93 (m, 1H, CHPh2(Ct)), 3.82-3.66 (m, 4H, COCH2N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCH2), 3.48 (m, 2H, NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.82 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.56 (m, 2H, NCH2CH2), 2.33 (m, 2H, CH2CHPh2 (Nt)), 1.94 (m, 2H, CH2CHPh2 (Q)). 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 169.1 , 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 55.12, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5. MALDI-TOF MS: m/z 825,4 [M]PTD7-2G: 1 H NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 7.80 (1H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J = 9 Hz, 2H), 6.70 ( d, J = 9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH 2 N), 3.99 (m, 1H, CHPh 2 (N t )), 3.93 (m, 1H, CHPh 2 (C t )) , 3.82-3.66 (m, 4H, COCH 2 N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCH 2 ), 3.48 (m, 2H, NCH 2 CH 2 ), 3.42-3.33 (m, 2H, NCH 2 CH 2 CH), 2.82 (m, 2H, NCH 2 CH 2 CH), 2.56 (m, 2H, NCH 2 CH 2 ), 2.33 (m, 2H, CH 2 CHPh 2 (N t )), 1.94 (m, 2H , CH 2 CHPh 2 (Q)). 13 C NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 169.1, 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 55.12, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5. MALDI-TOF MS: m / z 825.4 [M]
PTD7-2GLact : 1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.80 (2H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J=9 Hz, 2H), 6.70 (d, J=9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH2N), 3.99 (m, 1H, CHPh2(N4)), 3.93 (m, 1H, SHPh2(Ct)), 3.88 (m, 1H, CH3-CH-OH), 3-82-3.66 (m, 4H, COCH2N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCJH2), 3.48 (m, 2H, NCH2CH2), 3.42-3.33 (m, 2H, NChI2CH2CH), 2.82 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.56 (m, 2H, NCH2CH2), 2.33 (m, 2H, CH2CHPh2 (N1)), 1.94 (m, 2H, CH2CHPh2 (C1)), 1.30 (dd, 3H, CHCH3). 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 171.4, 169.1 , 158.7, 143.4, 143.3, 130.1 , 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 68.2, 55.2, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5, 20.2. MALDI-TOF MS: 919,4 [M + Na]+ PTD7-2GLact: 1 H NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 7.80 (2H, -NH-), 7.09-7.27 (m, 2OH, Ar), 6.87 (d, J = 9 Hz, 2H), 6.70 ( d, J = 9 Hz, 2H), 4.19-3.93 (m, 6H, COCH 2 N), 3.99 (m, 1H, CHPh 2 (N 4 )), 3.93 (m, 1H, SHPh 2 (C t )) , 3.88 (m, 1H, CH 3 -CH-OH), 3-82-3.66 (m, 4H, COCH 2 N (2G)), 3.59 (s, 3H, OCJH 2 ), 3.48 (m, 2H, NCH 2 CH 2 ), 3.42-3.33 (m, 2H, NChI 2 CH 2 CH), 2.82 (m, 2H , NCH 2 CH 2 CH), 2.56 (m, 2H, NCH 2 CH 2 ), 2.33 (m, 2H, CH 2 CHPh 2 (N 1 )), 1.94 (m, 2H, CH 2 CHPh 2 (C 1 ) ), 1.30 (dd, 3H, CHCH 3 ). 13 C NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 171.4, 169.1, 158.7, 143.4, 143.3, 130.1, 129.7, 128.9, 128.5, 127.6, 127.5, 126.9, 126.8, 126.4, 114.3, 68.2, 55.2, 51.2, 51.2, 48.2, 47.4, 42.4, 34.2, 33.5, 20.2. MALDI-TOF MS: 919.4 [M + Na] +
A continuación se realizó Ia funcionalización con Polietilenglicol (PEG), para ello se preparó un compuesto de PEG bifuncional (Mw 4000 Da) que contenía grupos extremos carboxilo (PEG-COOH). En primer lugar, PEG-OH (320 mg, 0,08 mmol) se destiló en tolueno, a continuación, se añadió una solución 1 M de terc-butóxido potásico en alcohol terc-butílico y Ia mezcla de reacción se dejó reposar durante 1 ñ a 5O0C y durante Ia noche a 370C. La mezcla de reacción en bruto se filtró y se trató con TFA al 45,4%/ CH2CI2 al 54,5 %/H20 al 0,1% durante 3 h a temperatura ambiente. El compuesto carboxilado esperado se precipitó en terc-butil-metil-éter frío y se filtró. 1H NMR (δ, CDCI3): 10,9 ppm (s, COOH) y FT-IR (u, cm"1): 1710 (s, COOH) confirmaban Ia presencia de Ia funcionalidad -COOH. ,Next, the functionalization was carried out with Polyethylene Glycol (PEG), for this a bifunctional PEG compound (Mw 4000 Da) was prepared containing carboxyl end groups (PEG-COOH). First, PEG-OH (320 mg, 0.08 mmol) was distilled in toluene, then a 1 M solution of potassium tert-butoxide in tert-butyl alcohol was added and the reaction mixture was allowed to stand for 1 ñ at 5O 0 C and overnight at 37 0 C. The crude reaction mixture was filtered and treated with 45.4% TFA / 54.5% CH 2 CI 2 / 0.1 0.1 H 2 % for 3 h at room temperature. The expected carboxylated compound was precipitated in cold tert-butyl methyl ether and filtered. 1 H NMR (δ, CDCI 3 ): 10.9 ppm (s, COOH) and FT-IR (u, cm "1 ): 1710 (s, COOH) confirmed the presence of the -COOH functionality.,
Posteriormente se realizó Ia síntesis del conjugado de PEG-2G-PTD7, para ello a una solución de PEG-COOH (65 mg, Mw 4000 Da) en DMF anhidra (4 mi) se añadió DIC (10 μl, 0,064 mmol) y, después de 5 min, HOBt (8,8 mg, 0,064 mmol) y Ia mezcla se agitó durante 15 min. A continuación, se añadió el 2G-PTD7 (26,8 mg, 0,032 mmol, relación molar PEG/peptoide = 2) y el pH se ajustó hasta 8 con DIEA. Se dejó que Ia reacción avanzara durante 24 h a temperatura ambiente. La verificación mediante cromatografía en capa fina (TLC, gel de sílice) mostraba Ia conversión completa de PTD7-2G (Rf = 0,4) en conjugado de polímero (Rf = 0, CH2CI2/Me0H = 90:10). Para detener Ia reacción, Ia DMF se retiró bajo vacío; el residuo se almacenó a -2O0C hasta Ia purificación, se redisolvió en agua, se centrifugó para retirar Ia urea y el sobrenadante se purificó a través de una columna G10. Las fracciones recogidas se liofilizaron a continuación para dar un polvo blanco (70%). El producto purificado se caracterizó mediante 1H NMR, cuyos resultados fueron los siguientes.Subsequently, the synthesis of the PEG-2G-PTD7 conjugate was performed, for this purpose a solution of PEG-COOH (65 mg, Mw 4000 Da) in anhydrous DMF (4 ml) was added DIC (10 μl, 0.064 mmol) and, after 5 min, HOBt (8.8 mg, 0.064 mmol) and the mixture was stirred for 15 min. Next, 2G-PTD7 (26.8 mg, 0.032 mmol, PEG / peptoid molar ratio = 2) was added and the pH was adjusted to 8 with DIEA. The reaction was allowed to proceed for 24 hours at room temperature. Verification by thin layer chromatography (TLC, silica gel) showed the complete conversion of PTD7-2G (Rf = 0.4) into polymer conjugate (Rf = 0, CH 2 CI 2 / Me0H = 90:10). To stop the reaction, the DMF was removed under vacuum; The residue was stored at -2O 0 C until purification, redissolved in water, centrifuged to remove the urea and the supernatant was purified through a G10 column. The collected fractions were then lyophilized to give a white powder (70%). The purified product was characterized by 1 H NMR, the results of which were as follows.
1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar), 4.80 (m, 2H, COCJH2N), 4.60-4.03 (2H, COCH2N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH2N+ CHPh2 + COCJH2N (2G) + OCH3 +,NCH2CH2+ NCH2CH2CH), 2.99 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.53 (m, PEG, -CH2CO- + NCH2CH2 + CH2CHPh2 (N1)), 1.94 (ca, 2H, CH2CHPh2 (Ct)]. 13C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1 , 130.1 , 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1 , 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.47, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1, 26.6. 1 H NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar ), 4.80 (m, 2H, COCJH 2 N), 4.60-4.03 (2H, COCH 2 N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH 2 N + CHPh 2 + COCJH 2 N (2G) + OCH 3 + , NCH 2 CH 2 + NCH 2 CH 2 CH), 2.99 (m, 2H, NCH 2 CH 2 CH), 2.53 (m, PEG, -CH 2 CO- + NCH 2 CH 2 + CH 2 CHPh 2 (N 1 )) , 1.94 (ca, 2H, CH 2 CHPh 2 (C t )]. 13 C NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1, 130.1, 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 ( m), 62.0, 57.4, 55.47, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1, 26.6.
Para Ia síntesis del conjugado PEG-Lact2G-PTD7, a una solución de PEG-COOH (55 mg, Mw 4000 Da) en DMF anhidra (4 mi) se añadió DIC (9 μl, 0,055 mmol) y, después de 5 min, HOBt (7,4 mg, 0,055 mmol) y Ia mezcla se agitó durante 15 min. A continuación, se añadió el PTD7-2GLact (24,5 mg, 0,027 mmol, relación molar PEG/peptoide = 2) y el pH se ajustó hasta 8 con DIEA. Se dejó que Ia reacción avanzara durante 24 h a temperatura ambiente. La verificación por cromatografía en capa fina (TLC, gel de sílice) mostraba Ia conversión completa de PTD7-2GLact (Rf = 0,5) en conjugado de polímero (Rf = 0, CH2CI2/Me0H = 90:10). La mezcla de reacción en bruto se trató y se purificó según se describe anteriormente. Las fracciones se liofilizaron a continuación para dar un polvo blanco (60%). El producto purificado se caracterizó mediante 1H NMR, cuyos resultados fueron los siguientes:For the synthesis of the PEG-Lact2G-PTD7 conjugate, DIC (9 μl, 0.055 mmol) was added to a solution of PEG-COOH (55 mg, Mw 4000 Da) in anhydrous DMF (4 ml) and, after 5 min, HOBt (7.4 mg, 0.055 mmol) and the mixture was stirred for 15 min. Next, PTD7-2GLact (24.5 mg, 0.027 mmol, PEG / peptoid molar ratio = 2) was added and the pH was adjusted to 8 with DIEA. The reaction was allowed to proceed for 24 hours at room temperature. Verification by thin layer chromatography (TLC, silica gel) showed the complete conversion of PTD7-2GLact (Rf = 0.5) into polymer conjugate (Rf = 0, CH 2 CI 2 / Me0H = 90:10). The crude reaction mixture was treated and purified as described above. The fractions were then lyophilized to give a white powder (60%). The purified product was characterized by 1 H NMR, the results of which were as follows:
1H NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar), 5.29 (m, 2H, CH3-CH-O-), 4.80 (m, 2H, COCH2N), 4.60-4.03 (ca, 2H, COCH2N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH2N+ CHPh2 + COCH2N (2G) + OCÍI3 + NCjH2CH2+ NCH2CH2CH), 2.99 (m, 2H, NCH2CH2CH), 2.53 (m, PEG, -CJH2CO- + NCH2CJH2 + CH2CHPh2 (N4)), 1.94 (2H, CH2CHPh2 (Q)), 1.30 (m, 6H, CHCjH3J. 73C NMR: (CDCI3, 300 MHz) δ 174.4, 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1 , 130.1 , 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1 , 90.4, 83.8, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0, 57.4, 55.4, 41.2, 38,2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1 , 26.6, 18.1 , 15.3. 1 H NMR: (CDCI 3 , 300 MHz) δ 7.92 (br, -NH-), 7.49 (br, -NH), 7.15-6.81 (m, Ar), 6.72 (m, Ar), 6.63 (m, Ar ), 5.29 (m, 2H, CH 3 -CH-O-), 4.80 (m, 2H, COCH 2 N), 4.60-4.03 (ca, 2H, COCH 2 N), 3.95- 3.41 (m, PEG + COCH 2 N + CHPh 2 + COCH 2 N (2G) + OCÍI 3 + NCjH 2 CH 2 + NCH 2 CH 2 CH), 2.99 (m, 2H, NCH 2 CH 2 CH), 2.53 (m, PEG, -CJH 2 CO - + NCH 2 CJH 2 + CH 2 CHPh 2 (N 4 )), 1.94 (2H, CH 2 CHPh 2 (Q)), 1.30 (m, 6H, CHCjH 3 J. 73 C NMR: (CDCI 3 , 300 MHz ) δ 174.4, 169.8, 158.6, 144.6, 143.6, 143.4, 135.1, 130.1, 128.8, 128.6, 127.8, 126.9, 126.4, 114.3, 114.1, 90.4, 83.8, 75.5, 72.4, 72.2, 71.4, 70.0 (m), 62.0 , 57.4, 55.4, 41.2, 38.2, 35.0, 33.8, 32.6, 31.2, 30.6, 29.7, 28.1, 26.6, 18.1, 15.3.
Ejemplo 2: Evaluación de Ia estabilidad y Ia biosensibilidad de los nanoconiugados en diferentes ambientes fisiológicos (plasma, condiciones hidrolíticas y condiciones lisosómicas). .Example 2: Evaluation of the stability and biosensitivity of nanoconjugates in different physiological environments (plasma, hydrolytic conditions and lysosomal conditions). .
Estabilidad de los conjugados en presencia de catepsina B.Stability of the conjugates in the presence of cathepsin B.
Se añadió catepsina B (5 U) a una solución de 3 mg de conjugado en 1 mi de un tampón de pH 6 compuesto por acetato sódico 20 mM, EDTA 2 mM y DTT 5 mM y Ia mezcla se incubó a 37°C. Se tomaron alícuotas (150 μl) en tiempos de hasta 72 h, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron congeladas en Ia oscuridad hasta que se ensayaban mediante HPLC (análisis de alícuotas de 100 μl después del procedimiento de extracción) y/o SEC (análisis directo de alícuotas de 50 μl). En experimentos de control, los polímeros se incubaron en tampón solo (sin adición de catepsina B) para determinar Ia segmentación hidrolítica no enzimática.Cathepsin B (5 U) was added to a solution of 3 mg of conjugate in 1 ml of a pH 6 buffer composed of 20 mM sodium acetate, 2 mM EDTA and 5 mM DTT and the mixture was incubated at 37 ° C. Aliquots (150 μl) were taken in times of up to 72 h, immediately frozen in liquid nitrogen and stored frozen in Ia dark until tested by HPLC (analysis of 100 μl aliquots after the extraction procedure) and / or SEC (direct analysis of 50 μl aliquots). In control experiments, the polymers were incubated in buffer alone (without the addition of cathepsin B) to determine non-enzymatic hydrolytic segmentation.
Estabilidad de los conjugados en condiciones hidrolíticas (diferentes valores de pH) Los conjugados (3 mg/ml) se incubaron a 370C en solución tamponadora de fosfato (PBS) a pH 5,5 y 7,4 durante 72 horas. Se recogieron muestras de 100 μl en tiempos predeterminados y se analizaron mediante RP-HPLC, usando una columna C18 LiChroSpher 100 (5 μm), con el detector UV a 480 nm. Qomo eluyente A se utilizó agua y como eluyente B se utilizó acetonitrilo, conteniendo ambos TFA al 0,1 %. La elución se realizó mediante el siguiente gradiente: de 25% de B a 30% de B durante 10 min, de 30% de B a 80% de B durante 5 min, de 80% de B a 90% de B durante 5 minutos y de 90% de B a 25% de B durante 5 min. El caudal fue de 1 ml/min.Stability of the conjugates in hydrolytic (different pH) conditions Conjugates (3 mg / ml) were incubated at 37 0 C in phosphate buffer solution (PBS) at pH 5.5 and 7.4 for 72 hours. 100 µl samples were collected at predetermined times and analyzed by RP-HPLC, using a C18 LiChroSpher 100 column (5 µm), with the UV detector at 480 nm. As eluent A water was used and as eluent B acetonitrile was used, both containing 0.1% TFA. Elution was performed using the following gradient: from 25% B to 30% B for 10 min, 30% B to 80% B for 5 min, 80% B to 90% B for 5 minutes and from 90% of B to 25% of B for 5 min. The flow rate was 1 ml / min.
Los resultados (Fig.3) mostraron que los conjugados de PGA eran estables en tampones acuosos. Los dos nanoconjugados se degradaban en presencia de enzimas lisosómicas (catepsina B), permitiendo Ia liberación del fármaco de un modo dependiente del tiempo.The results (Fig. 3) showed that PGA conjugates were stable in aqueous buffers. The two nanoconjugates degraded in the presence of lysosomal enzymes (cathepsin B), allowing the release of the drug in a time-dependent manner.
Estabilidad de los conjugados en plasmaStability of plasma conjugates
Los conjugados (3 mg/ml) se incubaron durante 1 y 24 horas a 37°C en plasma de ratón obtenido después de Ia centrifugación de sangre a 1500 x g durante 10 minutos a 4°C. Se extrajeron muestras de 100 μl en tiempos predeterminados y se añadieronThe conjugates (3 mg / ml) were incubated for 1 and 24 hours at 37 ° C in mouse plasma obtained after centrifugation of blood at 1500 x g for 10 minutes at 4 ° C. 100 μl samples were taken at predetermined times and added
300 μl de acetonitrilo para precipitar las proteínas. Las muestras se centrifugaron a300 μl of acetonitrile to precipitate proteins. The samples were centrifuged at
15000 x g y el sobrenadante se secó. El residuo se redisolvió con 100 μl de acetonitrilo y se analizó mediante RP-HPLC según se ha descrito anteriormente. '15000 x g and the supernatant dried. The residue was redissolved with 100 µl of acetonitrile and analyzed by RP-HPLC as described above. '
Los resultados (Fig. 4) mostraron que los nanoconjugados eran estables en plasma y que Ia liberación de PEG-Lact2G-PTD7 fue más rápida que Ia de PEG-2G-PTD7, sin embargo, existía alguna liberación de PTD7 desde PEG-Lact2G-PTD7 en plasmaThe results (Fig. 4) showed that the nanoconjugates were stable in plasma and that the release of PEG-Lact2G-PTD7 was faster than that of PEG-2G-PTD7, however, there was some release of PTD7 from PEG-Lact2G- PTD7 in plasma
(40% de liberación de fármaco en 24 h)(40% drug release in 24 h)
Ejemplo 3: Caracterización biofísica detallada de conjugados de polímero-PTD7. Estudios de NMR Los experimentos homonucleares incluían 2D 1H, 1H NOESY y TOCSY con anchuras espectrales de 8 kHz en ambas dimensiones, usando un esquema WATERGATE para suprimir Ia señal de agua para el H2O. Los tiempos de mezcladura eran 400 y 80 ms para los experimentos de NOESY y TOCSY, respectivamente. La espectroscopia de NMR ordenada por difusión bidimensional (DOSY) (Barjat, H., Morris, G. A., Smart, S., Swanson, A. G., Williams, S. C. R. J. Magn. Reson, Ser. B 108, 170-172 (1995)), se realizó con una ecosecuencia estimulada usando impulsos de gradiente bipolares (Brand, T.; Cabrita, E. J.; Berger, S. Prog. NMR Spectrosc. 46, 159-196 (2005)) y con un esquema WATERGATE para suprimir Ia señal del agua. Las longitudes de los impulsos y los retrasos se mantuvieron constantes y se adquirieron 16 espectros de 24 exploraciones cada uno con Ia fuerza del gradiente de difusión variando entre '5% y 100%. Las longitudes del gradiente de difusión y el eco estimulado se optimizaron para cada muestra. Valores típicos eran δ = 6-7 ms, Δ = 160-170 ms. El procesamiento y el análisis de los datos se realizaron con el protocolo de DOSY incluido en el paquete de software Topspin.Example 3: Detailed biophysical characterization of polymer-PTD7 conjugates. NMR studies Homonuclear experiments included 2D 1 H, 1 H NOESY and TOCSY with spectral widths of 8 kHz in both dimensions, using a WATERGATE scheme to suppress the water signal for H 2 O. Mixing times were 400 and 80 ms for NOESY and TOCSY experiments, respectively. NMR spectroscopy ordered by two-dimensional diffusion (DOSY) (Barjat, H., Morris, GA, Smart, S., Swanson, AG, Williams, SCRJ Magn. Reson, Ser. B 108, 170-172 (1995)), it was performed with an ecosequence stimulated using bipolar gradient pulses (Brand, T .; Cabrita, EJ; Berger, S. Prog. NMR Spectrosc. 46, 159-196 (2005)) and with a WATERGATE scheme to suppress the water signal . The pulse lengths and delays were kept constant and 16 spectra of 24 scans each were acquired with the strength of the diffusion gradient varying between '5% and 100%. The lengths of the diffusion gradient and the stimulated echo were optimized for each sample. Typical values were δ = 6-7 ms, Δ = 160-170 ms. Data processing and analysis were performed using the DOSY protocol included in the Topspin software package.
Estudios de dispersión dinámica de luz (DLS)Dynamic light scattering studies (DLS)
Las medidas de DLS se realizaron a 250C usando un instrumento Malvern Zetasizer NanoZS, equipado con un láser de 532 nm con un ángulo de dispersión fijo de 90°. Se prepararon por duplicado soluciones micelares acuosas de LPS (E. CoIi 0111 :B4; 1 ,2 mg/ml de solución de reserva) y cada polímero (1 mg/ml) usando agua destilada y una solución de tampón de fosfato (PBS) 0,1 M a pH 7,4 (Na2HPO4, KH2PO4, NaCI). Las soluciones micelares se sometieron a ultrasonidos durante 10 min a 40C y se filtraron a través de un filtro de membrana de celulosa de 0,45 μm antes del análisis. No se observaban diferencias significativas en las diferentes soluciones. La distribución del tamaño de las micelas por volumen se midió (diámetro, nm) para cada polímero en ausencia o presencia de una concentración creciente de solución micelar de LPS (0,02-0,1 mg/ml) (n >3).The DLS measurements were performed at 25 0 C using a Malvern Zetasizer NanoZS instrument, equipped with a 532 nm laser at an angle of 90 ° fixed dispersion. Aqueous micellar solutions of LPS (E. CoIi 0111: B4; 1.2 mg / ml of stock solution) and each polymer (1 mg / ml) were prepared in duplicate using distilled water and a phosphate buffer solution (PBS) 0.1 M at pH 7.4 (Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCI). The micellar solutions were subjected to ultrasound for 10 min at 4 0 C and filtered through a 0.45 μm cellulose membrane filter before analysis. There were no significant differences in the different solutions. The size distribution of the micelles by volume was measured (diameter, nm) for each polymer in the absence or presence of an increasing concentration of LPS micellar solution (0.02-0.1 mg / ml) (n> 3).
Los análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) mostraron que las micelas de LPS en de 0,2 a 0,1 mg/ml (muy por encima de Ia concentración micelar crítica, CMC (Santos, N. C, Silva, A.C., Castanho, M., Martins-Silva, J. & Saldanha, C. Chembiochem 4, 96- 100 (2003)) tenían un tamaño promedio de 6 nm (figura 4: Fig. 1c), mientras que los conjugados de PEG-PTD7 producían micelas de diferentes tamaños, dependiendo del conector polímero-fármaco (Fig. 5). De forma interesante, cuando PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7, que tienen diámetros micelares promedio de 12 nm y 6 nm, respectivamente, se valoraban con concentraciones crecientes de LPS micelar, el tamaño promedio de las micelas se incrementaba hasta 20 nm, Por tanto, los conjugados PEG-PTD7 producen Ia estabilización de complejos comicelares disminuyendo de este modo Ia toxicidad del LPS al evitar su interacción con receptores celulares específicos y facilitando su eliminación del torrente sanguíneo de forma renal, por tanto los nanόconjugados PEG-PTD7 sirven para Ia diálisis intracorpórea.Dynamic light scattering analysis (DLS) showed that the LPS micelles in 0.2 to 0.1 mg / ml (well above the critical micellar concentration, CMC (Santos, N. C, Silva, AC, Castanho, M., Martins-Silva, J. & Saldanha, C. Chembiochem 4, 96-100 (2003)) had an average size of 6 nm (Figure 4: Fig. 1c), while PEG-PTD7 conjugates they produced micelles of different sizes, depending on the polymer-drug connector (Fig. 5). Interestingly, when PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7, which have average micellar diameters of 12 nm and 6 nm, respectively, they were evaluated with increasing concentrations of micellar LPS, the average size of the micelles was increased up to 20 nm. Therefore, the PEG-PTD7 conjugates produce the stabilization of comyellar complexes thus decreasing the toxicity of the LPS by avoiding its interaction with specific cellular receptors and facilitating their elimination from the bloodstream from the kidney, therefore the PEG-PTD7 nanoconjugates serve for intracorporeal dialysis.
Ejemplo 4: Viabilidad celularExample 4: Cell viability
Evaluación biológica de conjupados de PTD7 en cultivo celular.Biological evaluation of PTD7 conjugates in cell culture.
Se obtuvieron macrófagos de ratón (RAW 264.7) de ATCC (American Type CultureMouse macrophages (RAW 264.7) were obtained from ATCC (American Type Culture
Collection, EE. UU. de A). Las células se hicieron crecer en Medio de EagleCollection, USA UU. of A). The cells were grown in Eagle Medium
Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRI) complementado con suero bovino fetalDulbecco Modified (DMEM, Gibco BRI) supplemented with fetal bovine serum
(FBS - Gibco' BRI) al 10% y L-glutamina al 1 %. Los cultivos se incubaron a 370C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%-aire al 95%. Se prepararon subcultivos de macrófagos cada 2-3 días raspando las células en medio reciente.(FBS - Gibco 'BRI) 10% and L-glutamine 1%. The cultures were incubated at 37 0 C in a humidified atmosphere of 5% CO2 -air at 95%. Subcultures of macrophages were prepared every 2-3 days by scraping the cells in fresh medium.
Ensayos de viabilidad celular con MTTCell viability assays with MTT
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetil-2- tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). Células RAW 264.7 se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocilios estériles a una densidad de siembra de 6 x 104 células/ml en DMEM complementado con FBS al 10% y se dejaron sedimentar durante 24 h. Diversas concentraciones de los compuestos se añadieron a las placas y las células se incubaron durante 24 h. Después de Ia retirada del medio, los cristales de formazano precipitados se disolvieron en DMSO de calidad óptica (100 μl) y las placas se leyeron a 570 nm usando una Wallac 1420 Workstation.Cell viability was assessed by the 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazole bromide (MTT) bromide assay. RAW 264.7 cells were seeded in sterile 96 well microtiter plates at a seeding density of 6 x 10 4 cells / ml in DMEM supplemented with 10% FBS and allowed to settle for 24 h. Various concentrations of the compounds were added to the plates and the cells were incubated for 24 h. After removal of the medium, the precipitated formazan crystals were dissolved in optical quality DMSO (100 μl) and the plates were read at 570 nm using a Wallac 1420 Workstation.
Los conjugados de PGA-PTD7 eran algo menos tóxicos que el PTD7 solo en un ensayo basado en líneas celulares de macrófagos RAW 264.722: los valores de IC50 eran 10 μM eqüiv. de fármaco para PGA-4G-PTD7 y 2 μM equiv. de fármaco para PTD7(resultados no mostrados). En contraste, ni PEG-2G-PTD7 ni PEG-Lact2G-PTD7 mostraban (Fig6) toxicidad celular hasta 30 μM equiv. de fármaco, más de 20 veces menos tóxicos que el fármaco libre original.PGA-PTD7 conjugates were somewhat less toxic than PTD7 alone in an assay based on RAW 264.7 macrophage cell lines 22 : IC 50 values were 10 μM eqüiv. of drug for PGA-4G-PTD7 and 2 μM equiv. of drug for PTD7 (results not shown). In contrast, neither PEG-2G-PTD7 nor PEG-Lact2G-PTD7 showed (Fig6) cellular toxicity up to 30 μM equiv. of drug, more than 20 times less toxic than the original free drug.
Evaluación de Ia expresión de TNP-g Se sembraron células RAW 264.7 en placas de 96 pocilios a una densidad de 100.000 células/ml en DMEM complementado con SBF al 1% y se dejaron sedimentar durante 24 h. A continuación, se añadió LPS (E. CoIi 055:B5; 0,5 ng/ml) en ausencia o presencia de PTD 7 y los conjugados a diferentes concentraciones. Después de 24 h, los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron durante 10 min a 400 x g y se almacenaron a -2O0C hasta Ia determinación del contenido de citoquina. El contenido de TNF-α en el sobrenadante celular se determinó usando un kit ELISA comercial (BD Bioscience) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se diluyeron 10 veces con tampón. Los cambios de color a 450 nm se midieron usando un lector dé placas de microvaloración. Los niveles de citoquinas se expresaron como picogramos por mililitro. El intervalo de detección del kit de ELISA era 0-1000 pg/ml. EI contenido de TNF-α de cada muestra se ensayó tres veces.Evaluation of the expression of TNP-g RAW 264.7 cells were seeded in 96-well plates at a density of 100,000 cells / ml in DMEM supplemented with 1% SBF and allowed to settle for 24 h. Next, LPS (E. CoIi 055: B5; 0.5 ng / ml) was added in the absence or presence of PTD 7 and the conjugates at different concentrations. After 24 h, the supernatants were collected and centrifuged for 10 min at 400 xg and stored at -2O 0 C until the cytokine content was determined. The TNF-α content in the cell supernatant was determined using a commercial ELISA kit (BD Bioscience) following the manufacturer's protocol. The samples were diluted 10 times with buffer. Color changes at 450 nm were measured using a microtiter plate reader. Cytokine levels were expressed as picograms per milliliter. The detection range of the ELISA kit was 0-1000 pg / ml. The TNF-α content of each sample was tested three times.
Los resultados mostraron que Ia presencia de PEG-2G-PTD7 o PEG-Lact2G-PTD7 disminuía casi cuantitativamente Ia producción de TNF-α inducida por LPS (Fig 7).The results showed that the presence of PEG-2G-PTD7 or PEG-Lact2G-PTD7 decreased almost quantitatively the production of TNF-α induced by LPS (Fig 7).
Ejemplo 5: Estudios in vivoExample 5: In vivo studies
Grupos de ratones BALB-c de 8-10 semanas de edad fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 500 μg de LPS (E. CoIi 055:B5) en PBS solo o en combinación con PTD7 (60 μg), conjugados de PEG-PTD7 (60 μg, equiv. de fármaco) o 100 μg de polimixina B (PMB). Se analizó un total de 11 grupos. El LPS se inyectó en el lado izquierdo de Ia cavidad peritoneal mientras que el PTD7 (disuelto en PEG200), los conjugados de PEG-PTD7 (en PBS) o Ia PMB se inyectaron en el lado derecho de Ia cavidad peritoneal. Se extrajo sangre de los animales 90 min y 180 min después de Ia inyección de LPS desde Ia vena safena. Se llevó a cabo un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier usando el software GraphPad. ' .Groups of BALB-c mice of 8-10 weeks of age were injected intraperitoneally (ip) with 500 μg of LPS (E. CoIi 055: B5) in PBS alone or in combination with PTD7 (60 μg), conjugates of PEG-PTD7 (60 μg, drug equiv.) Or 100 μg polymyxin B (PMB). A total of 11 groups were analyzed. The LPS was injected on the left side of the peritoneal cavity while the PTD7 (dissolved in PEG200), the conjugates of PEG-PTD7 (in PBS) or the PMB were injected on the right side of the peritoneal cavity. Blood was drawn from the animals 90 min and 180 min after the injection of LPS from the saphenous vein. A Kaplan-Meier survival analysis was performed using GraphPad software. '.
Se obtuvo suero de cada muestra recogida después de Ia centrifugación de sangre a 1500 x g durante 10 min a 4°C. Los niveles de citoquinas inducidos por LPS en suero se examinaron a los 90 y 180 min después de tratamientos en diferentes diluciones (1 :0, 1 :10, 1 :40) mediante un ensayo múltiple de citoquinas LINCOplex de ratón, incluyendo interferón-γ (IFN-γ), intérleuquina-1β (IL-1β), interleuquina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleuquina-12(p70) (IL-12(p70)). El ensayo múltiple se llevó a cabo por duplicado en dos ocasiones diferentes de acuerdo con las especificaciones de! fabricante. Se generaron curvas estándar para cada citoquina usando las concentraciones de citoquinas de referencia suministradas por el fabricante. Se analizaron datos aleatorios (intensidad de fluorescencia media) mediante el MasterPlex Quantification Software para obtener valores de concentración. Los datos de las gráficas se expresan en pg/ml como media ± E.E.M. (n >>3).Serum was obtained from each sample collected after centrifugation of blood at 1500 xg for 10 min at 4 ° C. Serum LPS-induced cytokine levels were examined at 90 and 180 min after treatments at different dilutions (1: 0, 1: 10, 1: 40) by a multiple mouse LINCOplex cytokine assay, including interferon-γ (IFN-γ), intérleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL -4), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-12 (p70) (IL-12 (p70)). The multiple test was carried out in duplicate on two different occasions according to the specifications of! maker. Curves were generated standard for each cytokine using the reference cytokine concentrations supplied by the manufacturer. Random data (medium fluorescence intensity) was analyzed using the MasterPlex Quantification Software to obtain concentration values. The graph data are expressed in pg / ml as mean ± SEM (n >> 3).
Para el análisis estadístico in vivo de citoquinas se usó el ANOVA bidirecccional para consignar Ia significación estadística. Se usó análisis retrospectivo de Bonferroni-Holm para corregir con respecto a múltiples comparaciones. En todos los casos, se consideraba que p < 0,05 representaba Ia significación estadística.For the in vivo statistical analysis of cytokines, the bidirectional ANOVA was used to record the statistical significance. Retrospective Bonferroni-Holm analysis was used to correct for multiple comparisons. In all cases, p <0.05 was considered to represent the statistical significance.
Los resultados mostraron que los niveles en plasma de IL-2, IL-4, IL-12 (p70) y GM- CSF no se incrementaban significativamente en respuesta a. LPS. Las concentraciones de TNF-α eran las más altas 90 min después de Ia estimulación con LPS, y PTD7 y PMB reducían los niveles en plasma de esta citoquina más eficazmente que PEG-2G- PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 (probablemente debido a Ia farmacocinética; Fig. 8). Sin embargo, los niveles de IL-1β, IL-6 e IFN-γ eran superiores 180 min después dé Ia inyección, y PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 reducían significativamente los niveles en plasma de IL-1β, IL-6 e IFN-γ. Estas tres citoquinas proinflamatorias median en muchas de las características inmunopatológicas del choque inducido por LPS (Cohén, J. Nature 420, 885-891 (2002)).Sus actividades biológicas se solapan y están notablemente incrementadas en pacientes que desarrollan choque séptico letal (Sil, D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811-2819 (2007); Hack, CE. et al. Blood 74, 1704-1710 (1989); Netea, M.G. et al. Eur JImmunol 31, 2529-2538 (2001); Yan, JJ. et al. Nαt Med 10, 161-167, (2004)). Los datos demuestran una supervivencia mejorada de ratones estimulados con LPS tratados con PEG-2G-PTD7 y PEG-Lact2G-PTD7 que se debió, al menos en parte, a niveles en plasma significativamente reducidos de citoquinas proinflamatorias. The results showed that the plasma levels of IL-2, IL-4, IL-12 (p70) and GM-CSF did not increase significantly in response to. LPS TNF-α concentrations were the highest 90 min after stimulation with LPS, and PTD7 and PMB reduced plasma levels of this cytokine more efficiently than PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7 (probably due to Ia pharmacokinetics; Fig. 8). However, the levels of IL-1β, IL-6 and IFN-γ were higher 180 min after the injection, and PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7 significantly reduced plasma levels of IL-1β, IL -6 and IFN-γ. These three proinflammatory cytokines mediate many of the immunopathological features of LPS-induced shock (Cohen, J. Nature 420, 885-891 (2002)). Their biological activities overlap and are markedly increased in patients who develop lethal septic shock (Sil , D. et al. Antimicrob Agents Chemother 51, 2811-2819 (2007); Hack, CE. Et al. Blood 74, 1704-1710 (1989); Netea, MG et al. Eur JImmunol 31, 2529-2538 (2001 ); Yan, JJ. Et al. Nαt Med 10, 161-167, (2004)). The data demonstrate improved survival of LPS-stimulated mice treated with PEG-2G-PTD7 and PEG-Lact2G-PTD7 that was due, at least in part, to significantly reduced plasma levels of pro-inflammatory cytokines.

Claims

REIVINDICACIONES
1- Conjugado polimérico amfifílico que comprende Ia fórmula general I:1- Polymeric amphiphilic conjugate comprising the general formula I:
PTD7-(L1 )n-(L2)m-(PEG)- (L2)m-(L1 )n-PTD7 donde:PTD7- (L1) n- (L2) m- (PEG) - (L2) m- (L1) n-PTD7 where:
L1 es una secuencia peptídica de 1 a 5 aminoácidos donde dichos aminoácidos son seleccionados de entre GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Lys, Asp,L1 is a peptide sequence of 1 to 5 amino acids where said amino acids are selected from GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Lys, Asp,
GIu. n = 1-5GIu n = 1-5
L2 es ácido láctico m = 0-1L2 is lactic acid m = 0-1
PTD7 comprende Ia siguiente fórmula general IlPTD7 comprises the following general formula Il
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0001
2. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque2. Polymeric amphiphilic conjugate according to claim 1, characterized in that
L1 es GIy n = 2L1 is GIy n = 2
L2 es ácido láctico m = 0L2 is lactic acid m = 0
3. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 , donde el conjugado polimérico comprende Ia fórmula general IV.3. Polymeric amphiphilic conjugate according to claim 1, wherein the polymeric conjugate comprises the general formula IV.
L1 es GIy n = 2L1 is GIy n = 2
L2 es ácido láctico m = 1 L2 is lactic acid m = 1
4. Conjugado polimétrico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.4. Polyphilic amphiphilic conjugate according to any of claims 1-3 for use as a medicament.
5. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en diálisis intracorpórea.5. Polymeric amphiphilic conjugate according to any of claims 1-3 for use in intracorporeal dialysis.
6. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de Ia reivindicaciones 1-3 para el tratamiento de infecciones bacterianas.6. Polymeric amphiphilic conjugate according to any of claims 1-3 for the treatment of bacterial infections.
7. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 6 donde la infección bacteriana es producida por endotoxinas de bacterias Gram negativas.7. Polymeric amphiphilic conjugate according to claim 6 wherein the bacterial infection is produced by endotoxins of Gram negative bacteria.
8. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 7 donde las endotoxinas bacterianas son de naturaleza lipídica.8. Polymeric amphiphilic conjugate according to claim 7 wherein the bacterial endotoxins are lipidic in nature.
9. Conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 8 donde Ia endotoxina bacteriana es LPS.9. Polymeric amphiphilic conjugate according to claim 8 wherein the bacterial endotoxin is LPS.
10. Conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para el tratamiento de Ia sepsis bacteriana.10. Polymeric amphiphilic conjugate according to any of claims 1-3 for the treatment of bacterial sepsis.
11. Composición farmacéutica que comprende un conjugado polimérico amfifílico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.11. Pharmaceutical composition comprising an amphiphilic polymer conjugate according to any of claims 1-3.
12. Procedimiento para Ia síntesis de un conjugado polimérico amfifílico según Ia reivindicación 1 que comprende las siguientes reacciones: a) Incorporar mediante síntesis en fase sólida de al menos 1 aminoácido al PTD7 unido a una resina para dar lugar al compuesto PTD7-(L1 )n, donde L1 es una secuencia peptídica de 1 a 5 aminoácidos donde dichos aminoácidos son seleccionados de entre GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Asp, GIu b) Eliminar Ia resina unida al compuesto obtenido en el paso anterior c) Conjugación del compuesto obtenido en b) con PEG funcionalizado con - COOH 12. Method for the synthesis of an amphiphilic polymer conjugate according to claim 1 comprising the following reactions: a) Incorporate by solid phase synthesis of at least 1 amino acid to PTD7 bound to a resin to give the compound PTD7- (L1) n , where L1 is a peptide sequence of 1 to 5 amino acids where said amino acids are selected from GIy, Val, Leu, He, Phe, Arg, Asp, GIu b) Remove the resin bound to the compound obtained in the previous step c) Conjugation of the compound obtained in b) with PEG functionalized with - COOH
13. Procedimiento según Ia reivindicación 12 donde entre Ia etapa a) y Ia etapa b) comprende Ia incorporación de un ácido láctico al compuesto PTD7-2G para dar lugar al compuesto PTD7-2GLact. 13. Method according to claim 12 wherein between stage a) and stage b) comprises the incorporation of a lactic acid to the compound PTD7-2G to give rise to the compound PTD7-2GLact.
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