WO2010130639A1 - Mikroskopie eines objektes mit einer abfolge von optischer mikroskopie und teilchenstrahlmikroskopie - Google Patents

Mikroskopie eines objektes mit einer abfolge von optischer mikroskopie und teilchenstrahlmikroskopie Download PDF

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WO2010130639A1
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holder
microscopy
cover glass
microscope
film
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PCT/EP2010/056228
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Christian Thomas
Torsten Sievers
Alexander Thesen
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Carl Zeiss Ag
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    • H01J2237/20—Positioning, supporting, modifying or maintaining the physical state of objects being observed or treated
    • H01J2237/2007—Holding mechanisms

Definitions

  • the invention relates to the microscopy of an object with a combination of optical microscopy and particle beam microscopy.
  • a slide system for microscopy of an object with a sequence of optical microscopy and particle beam microscopy comprising: an electrically conductive holder, wherein in the holder at least one window is formed, and wherein preferably the holder has the dimensions of a standard Glass microscope slide for optical microscopy, has a slide member adapted to support the object to be microscoped and which is adapted to be laid over the window, and a fixture adapted to fix the slide member over the window.
  • a recess that is not completely enclosed by the material of the holder, and z. B. is located on the edge of the slide.
  • the method can also be designed to the effect that in both microscopes the position of the alignment mark relative to the respective microscope is determined by imaging the alignment mark (s) with the microscope. The layers of object areas are then stored relative to the alignment mark (s).
  • the object carrier element carries the object or the sample and on the other hand is fastened to the holder. It can be configured appropriately depending on the microscope or object. In particular, it is possible to carry out the slide element as a conductive network.
  • the fastening device is then designed so that it attaches the network over the window, for example, clamps.
  • an immersion liquid is often used to increase the resolution. It may include, for example, oil or water.
  • a liquid is in particle beam microscopy usually disturbing the required vacuum. It must therefore be removed, if one wants to perform the optical microscopy before the particle beam microscopy. This is particularly easy if the system comprises a transparent film whose optical refractive index is adapted to that of the cover glass and which protects the cover glass from an immersion liquid used for optical microscopy, so that
  • the immersion liquid is removable.
  • Such a film is also possible and advantageous independent of the mentioned combination microscopy.
  • Cover glasses have a refractive index of 1, 5255, a film is particularly advantageous, the
  • Refractive index between 1, 4 and 1, 6 is.
  • the thickness of the adhesive layer is preferably only a fraction (e.g., 1/10 or less) of the wavelength of the radiation used in the optical Microscopy, or the refractive index of the adhesive layer is adapted to that of the coverslip and the film within said tolerances.
  • the adhesive layer is preferably formed so that when removing the film only the adhesive layer adheres to the film and not on the cover glass.
  • the film For easier lifting, it is possible to provide the film with a stiffening ring which rotates at the edge of the film. He can provide a cup-like structure of the film with stiffening ring. As a result, on the one hand, the immersion oil on the film (for example, in this cup-like structure) is reliably absorbed, and on the other hand, the lifting off of the film is facilitated.
  • Lifting the film is easy even if the film is larger than the window, since it then protrudes over the window frame and can be easily removed.
  • an adapter For attachment of the holder in the microscope, in particular in the particle beam microscope, an adapter is advantageous, which has a mounting device for attaching the adapter to a
  • this adapter has a recess for introducing a particle beam detector under the bearing surface and above the mounting device, since then a measurement in the transmission mode is possible.
  • FIG. 3 is a perspective view of a second embodiment of a slide system
  • FIG. 4 is a sectional view taken along the line A-A of FIG. 3,
  • FIG. 7a-c show a sectional view (FIG. 7a) or plan views (FIGS. 7b and c) of the slide system of FIG. 5, extended by a component for removing immersion liquid from the slide, FIG.
  • FIGS. 10 and 11 are schematic diagrams of an adapter for mounting one of the slides according to FIGS. 1 to 9 in an electron beam microscope.
  • Fig. 1 shows a slide system 1, with which an object, in the example described a biological sample, with a combination of light microscopy and
  • the system 1 comprises a metallic one
  • Holder 2 which has the outer dimensions of a standard glass slide. For example, it is 75.5 mm long and 25.5 mm wide. Such a size allows a particularly simple use of the holder 2 in a conventional light microscope.
  • other sizes for the holder 2 are possible and depending on the application advantageous.
  • the holder 2 has a window 3 in a central region, in which light microscopy usually would be used for a glass slide, which is formed as a complete aperture through the plate-shaped holder 2.
  • a window 3 in which light microscopy usually would be used for a glass slide, which is formed as a complete aperture through the plate-shaped holder 2.
  • rails 5 and 6 are formed laterally of the window 3, into which a cover glass 7 can be inserted, on which a sample 8 to be examined is located.
  • the insertion takes place in the direction of a schematically illustrated arrow 9.
  • 5 and 6 stops are provided on the rails, which limit the insertion of the cover glass 7.
  • clamping and fixing mechanisms can be provided which fix the inserted cover glass 7.
  • FIG. 2 shows a sectional view through the system 1 with inserted cover glass 7, wherein the section taken along the line A-A.
  • Elements, features or components of the system 1, which have already been explained with reference to FIG. 1, are provided in FIG. 2 with the same reference numerals and will not be explained again here (as in other figures).
  • the holder 2 fits due to the design in any conventional light microscope and can also be easily introduced into an electron microscope due to its metallic property and the window.
  • the cover glass 4 held on the underside, on which the sample 8 is located, can now be optically detected with a light microscope beam path 10.
  • an immersion oil 11 can be applied to the cover glass 7 on the underside of the cover glass 7 opposite the sample 8, if this is necessary for light microscopy.
  • another (e.g., aqueous) immersion agent may also be used.
  • the arrangement of the cover glass 7 allows on the bottom 4 of the holder 2, that a microscope objective can easily approach the cover glass 7, so that the usual example for inverted light microscopes working distance of about 200 microns easily realized can be.
  • the rails 5 and 6 are designed to be suitable, that the cover glass 7 holding fine leg of the rails can not come into contact with the microscope objective.
  • the window 3 causes the sample is also accessible from two sides optically, so that a transmitted light microscopy can be easily realized.
  • the sample is still accessible to an electron beam 12 so that it can be examined in the same holder 2 not only by light microscopy but also by electron beam microscopy.
  • Backscattered and / or secondary electrons 13 emitted by the sample then give an electron microscopic image of the sample 8.
  • the sample 8 can also be electroconductively coated, if appropriate, before the electron microscopy.
  • the sample 8 can remain on the cover glass 7 inserted into the holder 2 during all operations.
  • the assignment of the sample 8 to the holder 2 is thus given in all preparation and microscopy steps.
  • the holder 2 therefore has suitable marking means, for example a marking 14 on the upper side 15 of the holder, the marking 14 being visible for electron beam microscopy.
  • the mark (s) are designed so as to define a coordinate system by means of which the sample areas to be examined can be correlated between light microscopy and electron beam microscopy. Because of these correlation possibilities, the slide system 1 allows a correlated microscopy of the sample 8.
  • the marker 14 may be applied to a transparent medium, which is placed in another or the same window, so that it can be detected from both sides for light microscopy.
  • the cover glass is coated in an electrically conductive or electrically conductive manner. Due to the use of light microscopy, either an optically transparent, electrically conductive coating can be used, or the electrically conductive coating is / is applied only on the side of the cover glass 7, from which the electron beam 12 falls onto the sample 8. In the illustration of Figs. 1 and 2, this would be the top of the cover glass. 7 Variations of the slide system 1 of Fig. 1 and 2 are of course possible, for example, not only a cover glass 7 but also a plurality of coverslips can be used in parallel in a holder. Also, other mounting options instead of the rails 5 and 6 are possible; Examples of this will be explained.
  • the holder 2 is in turn electrically conductive, for example made of aluminum or another conductive metal, and has, as in the construction of Figs. 1 and 2, the dimensions of a standard slide for the Light microscopy on.
  • a recess 16 is formed in the windows 17 and 18 which are formed as through holes through the holder 2 in the recess 16.
  • nets 19 are laid, which are then inserted in the direction of arrow 9 in the recess 16.
  • the nets 19 may be clamped over the windows 17 and 18, respectively, by means of a clamping device (not shown in the figures) and are adapted to receive a sample 8 on their upper surface.
  • FIG. 4 shows a sectional view along the line A-A of the slide system 1 of FIG. 3, that is to say a representation which in its view corresponds to that of FIG. 2.
  • the sample 8 on the network 19 is optically accessible both from above and from below, so it can be with a light microscope beam path 10, which works here without immersion oil, both in reflected light, and transmitted light mode microscopy.
  • the nets 19 are arranged as close as possible to the underside 4 of the holder, to allow an approach in the range of the working distance of a conventional inverted light microscope.
  • the sample 8 is now also accessible from both sides.
  • electron beam microscopy with detection of secondary and / or backscattered electrons 13 as well as transmissive electron beam microscopy with detection of transmitted electrons 20 is possible.
  • the particle beam comes z. B. from above, and the detection can be done above and below the sample.
  • the structure of the holder 2 further allows to direct the electron beam laterally on the sample 8 to perform three-dimensional investigations.
  • the networks 19 are preferably designed to be conductive, as materials are copper, gold, nickel, etc. in question.
  • the sample on the slide element (for example, the cover glass 7 or the net 19) is fixed relative to the holder 2, so that a displacement of the sample 8 relative to the holder 2 does not occur.
  • the cover glass 7 is an example of a slide member configured to support the object to be microscoped and placed over the window 3.
  • the network 19 of the construction of FIG. 3 is therefore an alternative to the cover glass 7 with regard to the realization of the object carrier element.
  • FIGS. 5a-c show a modification thereof.
  • the cover glass 7 is inserted into a recess formed on the holder 2, which corresponds to the extent of the recess 16 of the construction of FIG. 3 and therefore also carries the same reference numerals in Fig. 5a.
  • FIGS. 5a and 5b show sectional views of a slide system 1, which also operates with a coverslip 7 as a slide element.
  • 5a shows the process of assembly. The assembled state is shown in FIGS. 5b and 5c as a sectional view and a top view, respectively.
  • the cover glass 7 is inserted into the recess 16 in the direction of the arrow 23.
  • a clamping ring 22 is inserted in the direction of an arrow 24, which covers the cover glass 7 between a formed on the bottom 4 of the holder 2 web, which corresponds in function to the web 21 of FIG. 4 and therefore also in Figs. 5a and b bears this reference numeral, and the clamping ring 22 is clamped.
  • the clamping ring 22 is thereby, as the plan view of Fig. 5c shows, for example, by means of screws which engage in the holder 2, bolted to the holder 2.
  • FIGS. 6a-6c show a design which corresponds to that of FIGS. 5a-c with regard to the attachment of the slide element.
  • the system 1 of Fig. 6a-c is designed for nets 19 as slide elements. Structure and operation correspond essentially to the construction of Fig. 5a-c.
  • the nets 19 are less rigid than the cover glass 7, are inserted before inserting the nets 19 in the recess 16 spring washers 25, the the nets 19 additionally clamped between the clamping ring 22 and the web 21 and thus ensure better attachment.
  • immersion agents are used to increase the resolution, for example immersion oils.
  • Such an immersion oil is provided, for example, with the reference numeral 11 in FIG. 2. Since electron beam microscopy is usually performed in a vacuum, immersion oil must first be removed if a sample is to be examined first by light microscopy and then by electron beam microscopy.
  • Figs. 7a to 7c show a related development of the system, which makes it easy to remove the immersion oil 11 or another liquid immersion medium.
  • the immersion oil 11 is applied to the underside 4 of the holder 2 of the slide system 1 on the cover glass 7, which carries the sample 8 at the top, but within a rubber ring 26. As the top view of Fig.
  • the immersion oil 11 is mounted within the opening 27 of the rubber ring 26.
  • the holder 2 further has such a configuration that it is possible to withdraw the rubber ring 26 laterally from the cover glass 7. In the construction of Fig. 1, this can be done for example by moving the rubber ring 26 parallel to the rails 5, 6.
  • the holder 2 has no circumferential on the bottom 4 web 21, but the web 21 runs in a U-shape, so that on one side of the rubber ring 26th can be deducted from the cover glass 7.
  • the cover glass can be cleaned of immersion liquid in a simple manner by drawing off the rubber ring over the cover glass 7 before the holder 2 is introduced into the electron microscope. Contamination of the vacuum of the electron microscope is thus avoided in a simple manner.
  • polymethyl methacrylimide (PMMI) of 1, 5340 (for pleximide 8817 F), or cycloolefinic copolymers (COC) have a refractive index of 1, 5333 (for Topas 5013).
  • the refractive index of polymer films can be even more precisely adjusted by adding inorganic nanoparticles.
  • the film 28 has a refractive index which is adapted to that of the cover glass 7 to the effect that it is equal to that of the cover glass 7 as possible. It will be in front of the light microscopic Investigation so applied to the sample 8 opposite underside of the cover glass 7 that no air gap or bubbles arise disturbing optical properties such as reflection are avoided and the film 28 adheres to the cover glass 7. This can be done for example by electrostatic charging or adhesion, or by a thin adhesive layer, the thickness of which is significantly smaller than the wavelength of the light used or their refractive index on cover glass 7 and film 28 is adapted and adhering to the removal of the film 28 exclusively on this.
  • the film 28 does not necessarily adhere tightly to the cover glass 7, but ideally can also be raised so as to run the immersion oil 11, the light microscopic
  • Holder 2 with the cover glass 7 does not pose a risk of contamination for the vacuum system of the electron microscope.
  • the film 28 can also be provided with a stiffening ring, which provides a cup-like structure of the film 28 with stiffening ring, so that the immersion oil 11 is securely received in this pot-like structure. This facilitates the lifting of the film 28 with the immersion oil 11.
  • the stiffening structure should be designed to reduce the working distance between the light microscope beam path 11, i. a lens of the light microscope, and the underside of the cover glass 7 is not affected.
  • the correlative microscopy by a combination of light microscopy and electron beam microscopy advantageously achieves that the sample 8 is fixed in position relative to the holder 2 in all microscopy conditions.
  • a marking can be provided for referencing this layer on the holder 2.
  • FIG. 9 shows both a plan view of the holder 2 according to FIGS. 5a-c and of the holder according to FIGS. 7a-c. The latter is depicted above the former.
  • a marking arrangement 29 is provided on the holder 2, which defines a coordinate system for the holder 2.
  • Each double mark 30 consists of two individual marks 31, 32 of different sizes, which are thus suitable for two different magnification levels.
  • markings It is essential for the markings that they can be detected with both microscopy methods, or that markings are provided which are in a known orientation relative to one another and can be perceived individually for at least one of the microscopy methods.
  • the position of the holder 2 can be calibrated both in light microscopy and in electron beam microscopy.
  • Displacement table of the microscope read out. This can be done both manually by the user and automatically using image processing algorithms. If one has thus determined the three markings of the marking arrangements with respect to their coordinates, the coordinate system of the holder 2 is defined. This allows you to easily save the position of the sample table for each interesting sample area. After this
  • an adapter 33 is preferably provided, which is shown in FIGS. 10 and 11.
  • the adapter 33 makes it possible to take a sample arranged on the holder 2, which was previously examined by light microscopy, directly in an electron microscope and analyze further there.
  • the adapter 33 has for this purpose a dovetail 34, which is formed on a foot 35 for attachment to a receiving device of the electron beam microscope.
  • a correspondingly fitting mounting device is provided on the foot 35 of the adapter 33; the dovetail 34 is shown here only as an example.
  • a support 38 for receiving the holder 2. This is fixed with clamping springs 37 or other suitable holding means on the support 38.
  • the adapter 33 at the same time also causes a pre-alignment of the holder 2, in which it comprises means which cooperate with corresponding counterparts on the holder 2 according to the key / lock principle.
  • This key / lock principle preferably achieves a pre-aligned position of the holder 2 with a fitting accuracy of less than 50 microns.
  • the adapter 33 as shown in FIGS. 10 and 11, on the support 35 have a recess 36, in which engage the holder 2 correspondingly provided guide edges. As a result, the holder 2 can be placed in a pre-adjusted position on the adapter 33 and fixed there mechanically.
  • the adapter 33 between the foot 35 and the dovetail 34 and the support 38 has a recess 39 and in the support 38 has a passage opening 40 into which a transmission electron detector of the electron microscope can be introduced.
  • the dimensions of the adapter 33 are designed so that a sample located on the inserted holder 2, which is secured to the adapter 33, is located in the electron microscope predetermined working distance to the pole piece, for example, at a distance of 3 mm.
  • the adapter 33 is further electrically conductive to avoid electrostatic charging of the adapter or the slide 10 or the sample and to ground the sample.

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Abstract

Zum Mikroskopieren eines Objektes (8) mit einer Kombination aus optischer Mikroskopie (10) und Teilchenstrahlmikroskopie (12) wird ein Objektträger-System (1) verwendet, das aufweist: einen elektrisch leitfähigen Halter (2), wobei im Halter (2) mindestens ein Fenster (3; 17, 18) ausgebildet ist und wobei vorzugsweise der Halter (2) die Abmessungen eines Standard-Glas-Objektträgers für die optische Mikroskopie (10) hat, ein Objektträgerelement (7; 19), das zum Tragen des zu mikroskopierenden Objektes (8) ausgebildet ist und das über das Fenster (3; 17, 18) legbar ausgebildet ist, und eine Befestigungseinrichtung (5, 6; 22, 25), die zum Fixieren des Objektträgerelementes (7; 19) über dem Fenster (3; 17, 18) ausgebildet ist. Durch dieses Objektträger-System (1) kann das Objekt (8) mit getrennten Mikroskopen untersucht werden, ohne daß ein Umbetten des Objektes nötig wird.

Description

Mikroskopie eines Objektes mit einer Abfolge von optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlmikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf das Mikroskopieren eines Objektes mit einer Kombination aus optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie.
Insbesondere für biologische und materialwissenschaftliche Proben ist oftmals eine Untersuchung sowohl mit optischer Mikroskopie, z.B. mit Lichtmikroskopie, und mit Teilchenstrahlenmikroskopie, z.B. Elektronenmikroskopie, wünschenswert. Im Stand der Technik verwendet man dazu aufwendige Mikroskope, die beide Mikroskopieverfahren durchführen können. Ein solches Mikroskop ist beispielsweise aus der EP 0849765 A2 oder der US 6683316 B2 bekannt. Solche Kombinationsmikroskope sind insbesondere deshalb aufwendig, weil das optische Mikroskop vollständig in die Vakuumkammer, die für die Teilchenstrahlenmikroskopie benötigt wird, eingebaut werden muß, und ein Probentisch vorgesehen werden muß, der die Probe zwischen beiden Mikroskopen im Vakuum verschiebt. Die Folge sind ein relativ großes Vakuumvolumen und zudem ein hoher Aufwand bei der Fertigung des optischen Mikroskops, das dann in vakuumtauglicher Bauweise erstellt werden muß. Ein weiterer Nachteil ist es, daß eine optische Abbildung mit Immersion im Vakuum nicht realisiert werden kann. Verzichtet man bei der Teilchenstrahlmikroskopie auf Anordnung des Objektes im Vakuum, wie z. B. im Kombinationsmikroskop gemäß US 20080308731 A1 , leidet die Abbildungsqualität, da die Elektronen an einer Membran sowie an Luft gestreut werden.
Eine Alternative für die Verwendung solcher Kombinationsmikroskope ist der sequentielle Einsatz von Einzelgeräten. Hierzu werden im Stand der Technik verschiedene Halterkonzepte verwendet. Für die optische Mikroskopie werden üblicherweise Objektträger aus Glas mit über die Probe gelegten Deckgläsern verwendet, die einige Zentimeter groß sind. In der Elektronikmikroskopie sind Netze üblich, die einige Millimeter groß sind, oder metallische Probenteller. Um nun ein zu mikroskopierendes Objekt, beispielsweise eine biologische Probe, von der optischen Mikroskopie zur Teilchenstrahlenmikroskopie zu verbringen, muß die Probe von einem Haltersystem auf das andere transferiert werden. Dies bringt einige Nachteile mit sich. Zum einen ist der Transfer zeitaufwendig und bringt die Gefahr der Probenbeschädigung oder Zerstörung mit sich. Zum anderen ist die Ortsreferenzierung in den beiden Mikroskopieverfahren schwierig, da die Position eines z. B. mit optischer Mikroskopie untersuchten Bereiches für die Teilchenstrahlenmikroskopie erst wieder gefunden werden muß. Auch die Verwendung von Markern im Objekt bzw. auf der biologischen Probe, hilft hier nicht weiter, da sich beim Transfer in der Regel auch die Probenstruktur, z.B. durch Verspannungen, ändert. Ein zeitaufwendiges und mühsames Wiederfinden der bereits zuvor mit dem anderen Verfahren mikroskopierten Objektstelle ist somit unvermeidbar.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das Mikroskopieren eines Objektes mit einer Abfolge von optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie zu erleichtern, ohne den mit einem Kombinationsmikroskop erforderlichen Aufwand betreiben zu müssen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Objektträger-System zum Mikroskopieren eines Objektes mit einer Abfolge von optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie gelöst, wobei das System aufweist: einen elektrisch leitfähigen Halter, wobei im Halter mindestens ein Fenster ausgebildet ist und wobei vorzugsweise der Halter die Abmessungen eines Standard- Glas-Objektträgers für die optische Mikroskopie hat, ein Objektträgerelement, das zum Tragen des zu mikroskopierenden Objektes ausgebildet ist und das über das Fenster legbar ausgebildet ist, und eine Befestigungseinrichtung, die zum Fixieren des Objektträgerelementes über dem Fenster ausgebildet ist.
Unter einem Fenster wird dabei in dieser Beschreibung auch eine Aussparung verstanden, die nicht komplett vom Material des Halters umschlossen ist, und z. B. am Rand des Objektträgers liegt.
Im Rahmen der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Mikroskopie eines Objektes vorgesehen, wobei das Objekt mit einem optischen Mikroskop und zuvor oder danach mit einem
Teilchenstrahlmikroskop untersucht wird, wobei weiter ein Objektträger-System der geschilderten Art verwendet wird. Das Objekt wird also auf das Objektträgerelement aufgebracht und über das Fenster des Halters gelegt. Dann wird der Halter nacheinander in die beiden verwendeten Mikroskope, d. h. das optische Mikroskop und das Teilchenstrahlmikroskop eingesetzt, so daß das Objekt nacheinander mit beiden Mikroskopen untersucht wird. Wie erwähnt, ist ein Umbetten des Objektes nicht möglich. Daß sich das Objekt in beiden Mikroskopen auf demselben Halter befindet, ist besonders dann vorteilhaft, wenn man zugleich Mikroskope verwendet, die eine Mechanik zum Bewegen des Halters aufweisen, wenn dieser in das Mikroskop eingelegt ist. Es ist dann in einer Weiterbildung des Verfahrens möglich, ein Objektträger-System zu verwenden, dessen Halter die erwähnte(n) Justiermarkierung(en) aufweist. Es wird ein Objektbereich festgelegt, und bei der Mikroskopie mit dem zuerst verwendeten Mikroskop, z. B. dem optischen Mikroskop, wird eine Relativlage von Objektbereich und Justiermarke ermittelt, indem durch Betätigen der Mechanik sowohl der Objektbereich als auch die Justiermarke(n) mit dem zuerst verwendeten Mikroskop abgebildet werden. Da damit die Relativlage von Objektbereich und Justiermarke(n) bekannt ist, wird im anschließend verwendeten Mikroskop, z. B. dem Teilchenstrahlmikroskop, zuerst die Justiermarke abgebildet und aus der bereits bekannten Relativlage ausgehend von der Justiermarke der Objektbereich durch Betätigen der Mechanik angefahren.
Das Verfahren kann auch dahingehend ausgebildet werden, daß in beiden Mikroskopen die Lage der Justiermarke bezogen auf das jeweilige Mikroskop ermittelt wird, indem die Justiermarke(n) mit dem Mikroskop abgebildet wird (werden). Die Lagen von Objektbereichen werden dann in Bezug auf die Justiermarke(n) gespeichert.
Das Verfahren erlaubt es einfach, einen bestimmten Objektbereich in eine gewünschte Lage im jeweiligen Mikroskop zu bringen, das durch die Justiermarke(n) eine Kalibrierung des Objektbereiches bezogen auf die Lage zum Halter bewirkt wird.
Über die Justiermarkierung(en) kann die Mechanik zum Bewegen des Halters, beispielsweise ein Probentisch, sowohl im optischen Mikroskop als auch im Teilchenstrahlmikroskop hinsichtlich der Lage des Halters kalibriert werden. Dazu fährt man die Justiermarkierung(en) an, und die entsprechende Position der Mechanik, z. B. des Probentisches, wird ausgelesen. Das kann sowohl durch den Benutzer als auch automatisch unter Verwendung entsprechender Steuerungsmittel erfolgen. Durch die Justiermarkierung(en) ist zugleich eine Lageangabe für den Halter definiert; bei der Verwendung von drei Justiermarkierungen kann ein Koordinatensystem festgelegt werden. Somit kann die Stellung des Probenhalters für jeden interessierenden Objektbereich einfach bezogen auf die Justiermarkierung(en) abgespeichert werden. Nach dem Transfer des Halters in das zweite Mikroskop, z. B. das Teilchenstrahlmikroskop, erfolgt zunächst wieder die Kalibrierung über die Justiermarkierung(en), indem durch Betätigung der Mechanik, z. B. des Probenhalters, die Markierung(en) abgebildet wird/werden und dies mit der entsprechenden Stellung der Mechanik, z. B. des Probentisches, verknüpft wird. So können bereits abgespeicherte Objektbereiche einfach durch Betätigung der Mechanik angefahren werden. Der Benutzer muß - A -
sich nicht darum kümmern, zuvor definierte Objektbereiche im zweiten Mikroskop wieder neu zu finden.
Durch das erfindungsgemäße Objektträger-System kann das Objekt nacheinander mit getrennten Mikroskopen untersucht werden, ohne daß ein Transfer oder Umbetten des Objektes nötig wird. Die Erfindung schafft also ein korrelatives Objektträger-System, das es ermöglicht, die Probe auf einem Halter anzubringen und auf demselben Halter nacheinander sowohl mit einem optischen Mikroskop und einem Teilchenstrahlmikroskop zu untersuchen.
Unter dem Begriff optische Mikroskopie wird dabei im Sinne dieser Beschreibung jedes Mikroskopieverfahren verstanden, das zur Abbildung den optischen Gesetzen gehorchende Strahlung, insbesondere im sichtbaren Bereich, also Licht, verwendet. Teilchenstrahlenmikroskopie im Sinne dieser Beschreibung ist dann gegeben, wenn eine Abbildung mittels einem Strahl geladener Teilchen erfolgt, beispielsweise in Form der Elektronenstrahlmikroskopie. Soweit in dieser Beschreibung von Lichtmikroskopie oder Elektronenstrahlmikroskopie die Rede ist, ist dies lediglich beispielhaft für optische Mikroskopie bzw. Teilchenstrahlmikroskopie zu verstehen.
Der Halter des erfindungsgemäßen Objektträger-Systems ist sowohl für die optische Mikroskopie als auch für die Teilchenstrahlmikroskopie geeignet. Letzteres bedingt, daß er elektrisch leitfähig ist und vorzugsweise nicht oder nur in tolerierbaren, vorbestimmten Grenzen magnetisierbar. Die Probe, d.h. das zu mikroskopierende Objekt, wird auf dem
Objektträgerelement gehalten bzw. getragen. Das Objektträgerelement kann dann über das im
Halter ausgebildete Fenster gelegt werden, und die Befestigungseinrichtung fixiert das Objektträgerelement dann über dem Fenster. Durch diese Fixierung ist das Objekt auf dem
Halter befestigt und kann sowohl mit optischer Mikroskopie als auch mit
Teilchenstrahlmikroskopie untersucht werden, ohne daß ein Umbetten auf andere Träger erforderlich ist. Damit werden dieselben Vorteile erreicht, die ein Kombinationsmikroskop hat, ohne daß der mit einem solchen Kombinationsmikroskop verbundene Aufwand, das sowohl optische Mikroskopie als auch Teilchenstrahlenmikroskopie ausführen kann, betrieben werden muß. Auch ist die Abbildungsqualität sowohl im optischen als auch im Teilchenstrahlmikroskop sehr viel besser.
Durch das Fenster ist die Probe bzw. das Objekt, welches sich auf dem am Halter befestigten Objektträgerelement befindet, sowohl von oben, wie als auch von unten optisch zugänglich. Dies ermöglicht nicht nur Auflichtmikroskopie, sondern auch Durchlichtmikroskopie, soweit das Objektträgerelement entsprechend transparent ist. Analoges gilt für die Teilchenstrahlmikroskopie. Um für die optische Mikroskopie einen möglichst geringen Arbeitsabstand zwischen Strahlengang des optischen Mikroskops und dem Objekt realisieren zu können, ist es vorteilhaft, das System so auszugestalten, daß die Probe sich möglichst nah an einer Seite, beispielsweise der Unterseite des Halters befindet. Dies kann auf einfache Weise dadurch erreicht werden, daß der Halter eine Vertiefung aufweist und das Fenster in der Vertiefung gebildet ist. Weiter ist das Objektträgerelement so in die Vertiefung einlegbar, daß sich die Probe bei über das Fenster gelegtem Objektträgerelement näher an einer Seite des Halters, beispielsweise der Unterseite, befindet, als an der anderen. Als Alternative zu einem eine Vertiefung aufweisenden Halter kann die Befestigungseinrichtung auch auf einer Seite, z. B. der Unterseite, des Halters angeordnet sein, so daß das Objektträgerelement an die entsprechende Seite des Halters und über das Fenster gelegt wird.
Auf das hier beschriebene Objektträger-System wird die Probe aufgebracht. Dann wird sie mit einem optischen Mikroskop und einem Teilchenstrahlenmikroskop untersucht, wobei die Reihenfolge applikationsabhängig gewählt werden kann. Der Halter wird in beide Mikroskope eingelegt. Üblicherweise untersucht man in einem Objekt bestimmte interessierende Objektbereiche. Um nach dem Einlegen bzw. Einbringen in das entsprechende Mikroskop die Lage des interessierenden Objektbereichs möglichst gut zu kennen bzw. eindeutig bestimmen zu können, ist es vorteilhaft, auf dem Halter mindestens eine Justiermarkierung anzubringen, die sowohl mit optischer Mikroskopie, als auch mit Teilchenstrahlmikroskopie detektierbar ist. Zusätzlich und optional kann der Halter mechanische Ausrichtmittel aufweisen, die zum Ausrichten des Halters in einem optischen Mikroskop und/oder einem Teilchenstrahlmikroskop ausgebildet sind. Diese mechanischen Ausrichtmittel können beispielsweise in Form eines Schlüssel/Schloß-Prinzipes, geeigneter Anschläge, Führungen, oder dergleichen gestaltet sein. Sie bewirken, daß der Halter in einer vorbestimmten Lage zum jeweiligen Mikroskop liegt, was innerhalb der Genauigkeit dieser Ausrichtung eine Referenzierung von Objektbereichen ermöglicht.
Die optionale oder alternative Variante mit der mindestens einen Justiermarkierung leistet eine gesteigerte Genauigkeit. Sie ist besonders hoch, wenn mindestens drei Justiermarkierungen angebracht sind, die ein Koordinatensystem für den Halter festlegen. Dabei kann optional jede Justiermarkierung als Doppelmarkierung ausgeführt sein, die für zwei unterschiedliche Mikroskopie-Vergrößerungsstufen angepaßt sind.
Die Fixierung des Objektträgerelementes über dem Fenster trägt zur gewünschten Ortsfestigkeit des Objektes in beiden Mikroskopen bei. Diese Fixierung kann beispielsweise mittels einer Klemmeinrichtung realisiert werden. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Befestigungseinrichtung mindestens eine neben dem Fenster mit dem Halter verbundene oder dort verankerte Klemmeinrichtung zum Fixieren des Objektträgerelementes über dem Fenster aufweist. Diese Klemmeinrichtung kann beispielsweise einen Klemmring und/oder Federringe umfassen.
Das Objektträgerelement trägt einerseits das Objekt bzw. die Probe und wird andererseits am Halter befestigt. Es kann je nach Mikroskop bzw. Objekt geeignet ausgestaltet sein. Insbesondere ist es möglich, das Objektträgerelement als leitfähiges Netz auszuführen. Die Befestigungseinrichtung ist dann so ausgebildet, daß sie das Netz über dem Fenster befestigt, beispielsweise festklemmt.
Eine alternative Realisierung für das Objektträgerelement ist ein Deckglas, wie es aus der Lichtmikroskopie bekannt ist. Ein solches Deckglas kann mit einer Befestigungseinrichtung kombiniert werden, die seitlich neben dem Fenster des Halters liegende Schienen aufweist, in die das Deckglas einschiebbar ist, so daß es auf diese Weise über das Fenster gelegt werden kann und zugleich am Halter befestigt ist. Gegebenenfalls weisen die Schienen zusätzlich geeignete Fixierungs- oder Klemmittel zum Fixieren des Deckglases in den Schienen auf.
In der optischen Mikroskopie wird zur Auflösungserhöhung häufig eine Immersionsflüssigkeit verwendet. Sie kann beispielsweise Öl oder Wasser beinhalten. Eine solche Flüssigkeit ist in der Teilchenstrahlmikroskopie in der Regel störend für das erforderliche Vakuum. Sie muß deshalb, möchte man die optische Mikroskopie vor der Teilchenstrahlmikroskopie ausführen, entfernt werden. Das ist besonders einfach möglich, wenn das System eine transparente Folie umfaßt, deren optische Brechzahl an die des Deckglases angepaßt ist und die das Deckglas vor einer für die optische Mikroskopie verwendeten Immersionsflüssigkeit schützt, so daß durch
Abheben der Folie die Immersionsflüssigkeit entfernbar ist. Eine solche Folie ist auch unabhängig von der erwähnten Kombinationsmikroskopie möglich und vorteilhaft. Unter einem an den des Deckglases angepaßten Brechungsindex wird dabei insbesondere ein
Brechungsindex verstanden, der dem des Deckglases möglichst (z. B. mit max. 10 % Abweichung) oder innerhalb vorgegebener Toleranzen (z. B. 0,1 ) gleicht. Weil herkömmliche
Deckgläser eine Brechzahl von 1 ,5255 aufweisen, ist eine Folie besonders vorteilhaft, deren
Brechzahl zwischen 1 ,4 und 1 ,6 liegt.
Zur Befestigung der Folie auf dem Deckglas kommen insbesondere elektrostatische Aufladungen, Adhäsion (Haftung durch lockere molekulare Bindungen, z. B. aufgrund von van- der-Waals-Kräften) oder eine Klebeschicht in Frage. Damit letztere die Abbildung durch das optische Mikroskop nicht stört, beträgt die Dicke der Klebeschicht vorzugsweise nur ein Bruchteil (z. B. 1/10 oder weniger) der Wellenlänge der verwendeten Strahlung in der optischen Mikroskopie, oder die Brechzahl der Klebeschicht ist an die des Deckglases und der Folie innerhalb der genannten Toleranzen angepaßt bzw. angeglichen. Um keine Rückstände der Klebeschicht auf dem Deckglas zu erzeugen, ist die Klebeschicht vorzugsweise so ausgebildet, daß beim Entfernen der Folie ausschließlich die Klebeschicht an der Folie haften bleibt und nicht am Deckglas.
Zum einfacheren Abheben ist es möglich, die Folie mit einem Versteifungsring zu versehen, der am Rand der Folie umläuft. Er kann für eine topfartige Struktur der Folie mit Versteifungsring sorgen. Dadurch ist zum einen das Immersionsöl auf der Folie (z. B. in dieser topfartigen Struktur) sicher aufgenommen, zum anderen ist das Abheben der Folie erleichtert.
Ein Abheben der Folie ist auch dann einfach, wenn die Folie größer als das Fenster ist, da sie dann über den Fensterrahmen vorsteht und einfach abgenommen werden kann.
Alternativ zu einer Folie kann auch ein Ring verwendet werden, der an einer Unterseite eine Gummilippe aufweist, wobei das Ringinnere kleiner als das Deckglas ist, so daß der Ring auf das Deckglas legbar ist und mit der Gummilippe für die optische Mikroskopie auf das Deckglas aufgebrachte Immersionsflüssigkeit vom Deckglas abziehbar ist. Für eine derartige Ausgestaltung des Systems ist der Halter so geformt, daß das Deckglas an einem Rand nicht vom Halter so begrenzt wird, daß das Abziehen der Gummilippe behindert wäre. Vielmehr erlaubt der Halter es, bei im Halter befestigten Deckglas den Gummiring bzw. die Gummilippe über einen Rand des Deckglases hin abzuziehen.
Zur Befestigung des Halters im Mikroskop, insbesondere im Teilchenstrahlmikroskop ist ein Adapter vorteilhaft, der eine Montageeinrichtung zum Befestigen des Adapters an einer
Aufnahmevorrichtung des Teilchenstrahlmikroskops aufweist und an dem eine Auflagefläche mit Halteeinrichtung zum Fixieren des Halters auf der Auflagefläche ausgebildet ist.
Vorzugsweise weist dieser Adapter unter der Auflagefläche und über der Montageeinrichtung eine Aussparung zum Einführen eines Teilchenstrahldetektors auf, da dann eine Messung im Transmissionsbetrieb möglich ist.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 eine perspektivische Darstellung einer ersten Ausführungsform eines Objektträger- Systems,
Fig. 2 eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A der Fig. 1 ,
Fig. 3 eine perspektivische Darstellung einer zweiten Ausführungsform eines Objektträger- Systems,
Fig. 4 eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A der Fig. 3,
Fig. 5a-c Schnittdarstellungen (Fig. 5a und b) bzw. eine Draufsicht (Fig. 5c) auf ein Objektträger-System ähnlich dem der Fig. 1 ,
Fig. 6a-c Schnittdarstellungen (Fig. 6a und b) bzw. eine Draufsicht (Fig. 6c) eines Objektträger- Systems ähnlich dem der Fig. 3,
Fig. 7a-c eine Schnittdarstellung (Fig. 7a) bzw. Draufsichten (Fig. 7b und c) des Objektträger- Systems der Fig. 5 erweitert um ein Bauteil zum Entfernen von Immersionsflüssigkeit vom Objektträger,
Fig. 8a und 8b Schnittdarstellungen einer alternativen Erweiterung des Objektträgers der Fig. 5, ebenfalls zur Entfernung von Immersionsflüssigkeit,
Fig. 9 Draufsichten auf zwei Objektträgerbauweisen zur Verdeutlichung von Markierungen, die in der Mikroskopie ausgewertet werden, und
Fig. 10 und 11 Schemadarstellungen eines Adapters zur Anbringung eines der Objektträger gemäß Fig. 1 bis 9 in einem Elektronenstrahlmikroskop.
Anhand der Figuren wird ein Objektträger-System beschrieben, mittels dem ein Objekt mit einer Kombination aus optischer Mikroskopie und Teilchenstrahlenmikroskopie untersucht werden kann. In der nachfolgenden Beschreibung wird als Beispiel für optische Mikroskopie die Lichtmikroskopie, und insbesondere auch die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Dies ist natürlich nicht als Einschränkung zu verstehen, sondern soll lediglich der besseren Verständlichkeit dienen. Gleichermaßen wird als Beispiel für die Teilchenstrahlmikroskopie das Mikroskopieren mit Elektronenstrahlen geschildert, was ebenfalls nicht als Einschränkung für das beschriebene Objektträgersystem aufzufassen ist. Werden in den Beschreibungen Begriffe wie „Unterseite", „Oberseite", „links" und „rechts" verwendet, sind diese, soweit nicht anders beschrieben, auf die in den Figuren dargestellte Lage der Bauteile bezogen.
Fig. 1 zeigt ein Objektträger-System 1 , mit dem ein Objekt, im beschriebenen Beispiel eine biologische Probe, mit einer Kombination aus Lichtmikroskopie und
Elektronenstrahlmikroskopie untersucht werden kann. Das System 1 umfaßt einen metallischen
Halter 2, der die Außenabmessungen eines Standardglasobjektträgers hat. Er ist also beispielsweise 75,5 mm lang und 25,5 mm breit. Eine solche Größe erlaubt eine besonders einfache Verwendung des Halters 2 in einem herkömmlichen Lichtmikroskop. Gegebenenfalls sind natürlich auch andere Größen für den Halter 2 möglich und je nach Anwendung vorteilhaft.
Der Halter 2 weist in einem zentralen Bereich, in dem üblicherweise die Lichtmikroskopie bei einem Glas-Objektträger zur Anwendung käme, ein Fenster 3 auf, das als vollständiger Durchbruch durch den plattenförmigen Halter 2 gebildet ist. An der Unterseite des Halters 2 sind seitlich des Fensters 3 Schienen 5 und 6 gebildet, in die ein Deckglas 7 eingeschoben werden kann, auf dem sich eine zu mikroskopierende Probe 8 befindet. Das Einschieben erfolgt in Richtung eines schematisch dargestellten Pfeiles 9. Optional (und nicht in Fig. 1 zu sehen) sind an den Schienen 5 und 6 Anschläge vorgesehen, die das Einschieben des Deckglases 7 begrenzen. Zusätzlich können auch Klemm- und Fixierungsmechanismen vorgesehen sein, welche das eingeschobene Deckglas 7 fixieren.
Fig. 2 zeigt eine Schnittdarstellung durch das System 1 mit eingeschobenem Deckglas 7, wobei der Schnitt entlang der Linie A-A erfolgte. Elemente, Merkmale bzw. Bauteile des Systems 1 , die anhand der Fig. 1 bereits erläutert wurden, sind in Fig. 2 mit den selben Bezugszeichen versehen und werden hier (wie in anderen Figuren auch) nicht nochmals erläutert.
Der Halter 2 paßt aufgrund der Bauweise in jedes gängige Lichtmikroskop und kann aufgrund seiner metallischen Eigenschaft und des Fensters auch problemlos in ein Elektronenmikroskop eingebracht werden. Das an der Unterseite gehalterte Deckglas 4, auf dem sich die Probe 8 befindet, kann nun mit einem Lichtmikroskopstrahlengang 10 optisch erfaßt werden. Dabei kann ein Immersionsöl 11 auf das Deckglas 7 an der der Probe 8 gegenüberliegenden Unterseite des Deckglases 7 aufgebracht werden, wenn dies für die Lichtmikroskopie erforderlich ist. Natürlich kann für die hier beschriebenen Ausführungsformen grundsätzlich statt Öl auch ein anderes (z.B. wäßriges) Immersionsmittel verwendet werden.
Weiter erlaubt die Anordnung des Deckglases 7 an der Unterseite 4 des Halters 2, daß sich ein Mikroskopobjektiv problemlos an das Deckglas 7 annähern kann, so daß der beispielsweise für invertierte Lichtmikroskope übliche Arbeitsabstand von etwa 200 μm problemlos realisiert werden kann. Die Schienen 5 und 6 sind dazu geeignet ausgebildet, daß die das Deckglas 7 haltenden Feinschenkel der Schienen nicht mit dem Mikroskopobjektiv in Kontakt kommen können.
Das Fenster 3 bewirkt, daß die Probe auch optisch von zwei Seiten zugänglich ist, so daß auch eine Durchlichtmikroskopie einfach realisiert werden kann.
Von der Oberseite ist die Probe weiter für einen Elektronenstrahl 12 zugänglich, so daß sie im selben Halter 2 nicht nur mit Lichtmikroskopie, sondern auch mit Elektronenstrahlmikroskopie untersucht werden kann. Von der Probe abgestrahlte Rückstreu- und/oder Sekundärelektronen 13 geben dann ein elektronenmikroskopisches Bild der Probe 8.
Für elektronenmikroskopische Untersuchungen im Hochvakuum kann weiter die Probe 8 auch gegebenenfalls vor der Elektronenmikroskopie elektrisch leitend beschichtet werden.
Wesentlich für die Erfindung ist, daß die Probe 8 während aller Vorgänge auf dem in den Halter 2 eingeschobenen Deckglas 7 verbleiben kann. Die Zuordnung der Probe 8 zum Halter 2 ist somit in allen Präparations- und Mikroskopieschritten fest gegeben. Der Halter 2 weist deshalb geeignete Markierungsmittel auf, beispielsweise eine Markierung 14 an der Oberseite 15 des Halters, wobei die Markierung 14 für Elektronenstrahlmikroskopie sichtbar ist. Gleichermaßen findet sich auf der Unterseite 4 des Halters eine zugeordnete weitere Markierung, die mit der Lichtmikroskopie erfaßt werden kann. Natürlich können auch mehrere Markierungen verwendet werden. Vorteilhafterweise ist die Markierung/sind die Markierungen so ausgestaltet, daß sie ein Koordinatensystem definieren, anhand dessen die zu untersuchenden Probenbereiche zwischen Lichtmikroskopie und Elektronenstrahlmikroskopie korreliert werden können. Aufgrund dieser Korrelationsmöglichkeiten erlaubt das Objektträger-System 1 eine korrelierte Mikroskopie der Probe 8. Alternativ kann die Markierung 14 auf ein transparentes Medium aufgebracht sein, welches in ein weiteres oder dasselbe Fenster eingebracht wird, so daß sie für die Lichtmikroskopie von beiden Seiten erfaßbar ist.
Für solche elektronenmikroskopischen Untersuchungen im Hochvakuum ist es weiter vorteilhaft, wenn das Deckglas elektrisch leitend beschichtet oder elektrisch leitend ausgebildet ist. Aufgrund der Verwendung der Lichtmikroskopie kann dabei entweder eine optisch transparente elektrisch leitende Beschichtung zum Einsatz kommen, oder die elektrisch leitende Beschichtung ist/wird nur auf der Seite des Deckglases 7 aufgebracht, von der der Elektronenstrahl 12 auf die Probe 8 fällt. In der Darstellung der Fig. 1 und 2 wäre dies die Oberseite des Deckglases 7. Abwandlungen des Objektträger-Systems 1 der Fig. 1 und 2 sind natürlich möglich, so können beispielsweise nicht nur ein Deckglas 7 sondern auch mehrere Deckgläser parallel in einem Halter verwendet werden. Auch sind andere Befestigungsmöglichkeiten anstelle der Schienen 5 und 6 möglich; Beispiele hierfür werden noch erläutert.
Fig. 3 zeigt eine weitere Bauweise des Objektträger-Systems 1. Der Halter 2 ist wiederum elektrisch leitend, beispielsweise aus Aluminium oder einem anderen leitenden Metall, gefertigt und weist wie bei der Bauweise der Fig. 1 und 2 auch die Abmessungen eines Standardobjektträgers für die Lichtmikroskopie auf. An der Oberseite des Halters 2 ist eine Vertiefung 16 gebildet, in der Fenster 17 und 18 liegen, welche als Durchgangslöcher durch den Halter 2 in der Vertiefung 16 ausgebildet sind. In diese Vertiefungen und über die Fenster 17, 18 sind Netze 19 legbar, die dann in Richtung des Pfeiles 9 in die Vertiefung 16 eingelegt werden. Die Netze 19 können mittels einer (in den Figuren nicht gezeigten) Klemmvorrichtung über den Fenstern 17 bzw. 18 festgeklemmt werden und sind dazu ausgebildet, auf ihrer Oberseite eine Probe 8 aufzunehmen.
Fig. 4 zeigt eine Schnittdarstellung entlang der Linie A-A des Objektträger-Systems 1 der Fig. 3, also eine Darstellung, die in ihrer Sicht der der Fig. 2 entspricht.
Wie zu sehen ist, ist die Probe 8 auf dem Netz 19 optisch sowohl von oben als auch von unten zugänglich, sie kann also mit einem Lichtmikroskopstrahlengang 10, der hier ohne Immersionsöl arbeitet, sowohl im Auflicht-, als auch im Durchlichtbetrieb mikroskopiert werden. Wie in der Bauweise der Fig. 1 auch, sind die Netze 19 so nahe wie möglich an der Unterseite 4 des Halters angeordnet, um eine Annäherung im Bereich des Arbeitsabstandes eines üblichen inversen Lichtmikroskopes zu ermöglichen. Dazu sind vorzugsweise die Stege 21 , die nach Einbringung der Vertiefung 16 noch zwischen der Oberseite der Vertiefung 16 und der Unterseite 4 des Halters 2 verbleiben, mit einer Stegdicke von unter 200 μm, ausgearbeitet.
Für die Elektronenstrahlmikroskopie mittels des Elektronenstrahls 12 ist die Probe 8 nun ebenfalls von beiden Seiten zugänglich. Es ist also eine Elektronenstrahlmikroskopie mit Nachweis von Sekundär- und/oder Rückstreuelektronen 13, wie auch eine transmissive Elektronenstrahlenmikroskopie mit Nachweis von transmittierten Elektronen 20 möglich. Der Teilchenstrahl kommt z. B. von oben, und die Detektion kann ober- und unterhalb der Probe erfolgen.
Der Aufbau des Halters 2 erlaubt es weiter, den Elektronenstrahl auch seitlich auf die Probe 8 zu richten, um dreidimensionale Untersuchungen auszuführen. Die Netze 19 sind vorzugsweise leitend ausgeführt, als Materialien kommen Kupfer, Gold, Nickel etc. in Frage.
Wesentlich für die Arbeitsweise des Objektträger-Systems ist es, daß die Probe auf dem Objektträgerelement (beispielsweise dem Deckglas 7 oder dem Netz 19) gegenüber dem Halter 2 ortsfest fixiert ist, so daß eine Verschiebung der Probe 8 relativ zum Halter 2 nicht auftritt.
Die anhand der Fig. 1 und 2 in dieser Hinsicht geschilderte Bauweise mit Schienen ist natürlich nicht die einzige Möglichkeit, das Objektträgerelement über dem Fenster 3 und bezüglich des Halters 2 zu fixieren.
Das Deckglas 7 ist ein Beispiel für ein Objektträgerelement, das zum Tragen des zu mikroskopierenden Objektes ausgebildet ist und das über das Fenster 3 gelegt werden kann.
Das Netz 19 der Bauweise der Fig. 3 ist also eine Alternative zum Deckglas 7 hinsichtlich der Realisierung des Objektträgerelementes.
Die Fig. 5a-c zeigen eine diesbezügliche Abwandlung. Hier wird das Deckglas 7 in eine am Halter 2 ausgebildete Vertiefung eingelegt, die insofern der Vertiefung 16 der Bauweise der Fig. 3 entspricht und deshalb auch das selbe Bezugszeichen in Fig. 5a trägt. Die Fig. 5a und 5b zeigen Schnittdarstellungen eines Objektträger-Systems 1 , das ebenfalls mit einem Deckglas 7 als Objektträgerelement arbeitet. Fig. 5a stellt den Vorgang des Zusammenbaus dar. In den Fig.5b und 5c ist als Schnittdarstellung bzw. Draufsicht der zusammengebaute Zustand dargestellt.
Das Deckglas 7 wird in die Vertiefung 16 in Richtung des Pfeiles 23 eingelegt. Über das Deckglas 7 wird ein Klemmring 22 in Richtung eines Pfeiles 24 eingelegt, der das Deckglas 7 zwischen einem an der Unterseite 4 des Halters 2 gebildeten Steg, der in seiner Funktion dem Steg 21 der Fig. 4 entspricht und deshalb auch in den Fig. 5a und b dieses Bezugszeichen trägt, und dem Klemmring 22 eingeklemmt. Der Klemmring 22 wird dabei, wie die Draufsicht der Fig. 5c zeigt, beispielsweise mittels Schrauben, die in den Halter 2 eingreifen, mit dem Halter 2 verschraubt.
Die Fig. 6a-6c zeigen eine Bauweise, die hinsichtlich der Befestigung des Objektträgerelementes der der Fig. 5a-c entspricht. Allerdings ist das System 1 der Fig. 6a-c für Netze 19 als Objektträgerelemente ausgebildet. Aufbau und Funktionsweise entsprechen im wesentlichen der Bauweise der Fig. 5a-c. Da die Netze 19 jedoch weniger starr sind, als das Deckglas 7, werden vor Einlegen der Netze 19 in die Vertiefung 16 Federringe 25 eingelegt, die die Netze 19 zusätzlich zwischen dem Klemmring 22 und dem Steg 21 einspannen und so für eine bessere Befestigung sorgen.
In der Lichtmikroskopie werden zur Auflösungserhöhung Immersionsmittel verwendet, beispielsweise Immersionsöle. Ein solches Immersionsöl ist beispielsweise mit dem Bezugszeichen 1 1 in Fig. 2 versehen. Da Elektronenstrahlenmikroskopie üblicherweise im Vakuum durchgeführt wird, muß Immersionsöl zuvor entfernt werden, wenn eine Probe zuerst mit Lichtmikroskopie und dann mit Elektronenstrahlmikroskopie untersucht werden soll. Die Fig. 7a bis 7c zeigen eine diesbezügliche Weiterbildung des Systems, welche eine Entfernung des Immersionsöls 11 oder eines anderen flüssigen Immersionsmittels einfach macht. Dazu ist an der Unterseite 4 des Halters 2 des Objektträger-Systems 1 auf das Deckglas 7, welches an der Oberseite die Probe 8 trägt, das Immersionsöl 11 aufgebracht, allerdings innerhalb eines Gummirings 26. Wie die Draufsicht der Fig. 7b, die von der Unterseite 4 auf den Halter 2 gerichtet ist, zeigt, ist das Immersionsöl 11 innerhalb der Öffnung 27 des Gummirings 26 angebracht. In dieser Ausgestaltung weist der Halter 2 weiter eine derartige Ausgestaltung auf, daß es möglich ist, den Gummiring 26 seitlich vom Deckglas 7 abzuziehen. In der Bauweise der Fig. 1 kann dies beispielsweise durch Verschieben des Gummirings 26 parallel zu den Schienen 5, 6 erfolgen. In der Bauweise mit Klemmring 22, wie sie in den Fig. 7a bis c gezeigt ist, hat der Halter 2 keinen an der Unterseite 4 umlaufenden Steg 21 , sondern der Steg 21 läuft U-förmig um, so daß an einer Seite der Gummiring 26 vom Deckglas 7 abgezogen werden kann. Dadurch kann das Deckglas auf einfache Art und Weise von Immersionsflüssigkeit gereinigt werden, indem vor dem Einschleusen des Halters 2 in das Elektronenmikroskop der Gummiring über das Deckglas 7 abgezogen wird. Eine Kontamination des Vakuums des Elektronenmikroskops ist damit auf einfache Weise vermieden.
Die Fig. 8a und 8b zeigen eine alternative Ausgestaltung zur Verhinderung der Kontamination eines Elektronenmikroskops. Hierbei wird eine transparente Folie 28 verwendet, die zwischen das Immersionsöl 11 und das Deckglas 7 gelegt wird. Die Brechzahl von Kunststoffolien aus organischen Polymeren liegt in der Regel zwischen 1 ,3 und 1 ,7. So hat z.B. Polyethylenterephthalat (PET) eine Brechzahl von 1 ,5750, Polymethylmethacrylat (PMMA) von 1 ,4914 (für Plexiglas 7N), Polystyrol (PS) von 1 ,5900 (für PS 168 N), Polycarbonat(PC) von 1 ,5660 (für PC APEC 2097), Polymethylmethacrylimid (PMMI) von 1 ,5340 (für Pleximid 8817 F), oder cycloolefinische Copolymere (COC) haben eine Brechzahl von 1 ,5333 (für Topas 5013). Außerdem kann die Brechzahl von Polymerfolien durch Beigabe von anorganischen Nanopartikeln noch genauer angeglichen werden.
Die Folie 28 hat einen Brechungsindex, der an den des Deckglases 7 dahingehend angepaßt, ist, daß er dem des Deckglases 7 möglichst gleicht. Sie wird vor der lichtmikroskopischen Untersuchung so auf die der Probe 8 gegenüberliegende Unterseite des Deckglases 7 aufgebracht, daß kein Luftspalt oder Blasen entstehen, störende optische Eigenschaften wie Reflexion vermieden werden und die Folie 28 am Deckglas 7 haftet. Dies kann z.B. durch elektrostatische Aufladung oder Adhäsion geschehen oder durch eine dünne Klebeschicht, deren Dicke deutlich kleiner ist als die Wellenlänge des verwendeten Lichts oder deren Brechzahl an Deckglas 7 und Folie 28 angepaßt ist und die beim Entfernen der Folie 28 ausschließlich an dieser haften bleibt.
An Bereichen des Deckglases 7, wo keine lichtmikroskopische Untersuchung stattfindet, muß die Folie 28 nicht notwendigerweise eng am Deckglas 7 haften, sondern kann idealerweise auch abgehoben sein, um so ein Verlaufen des Immersionsöls 11 , das zur lichtmikroskopischen
Untersuchung aufgebracht wird, zu verhindern. Vor dem Einschleusen in das
Elektronenmikroskop wird die Folie 28 mitsamt des Immersionsöls 11 abgezogen, und vom
Halter 2 mit dem Deckglas 7 geht keine Kontaminationsgefahr für das Vakuumsystem des Elektronenmikroskops aus.
Natürlich kann die Folie 28 auch mit einem Versteifungsring versehen werden, der für eine topfartige Struktur der Folie 28 mit Versteifungsring sorgt, so daß das Immersionsöl 11 in dieser topfartigen Struktur sicher aufgenommen ist. Dies erleichtert das Abheben der Folie 28 mit dem Immersionsöl 11. Allerdings sollte die Versteifungsstruktur so ausgebildet sein, daß sie den Arbeitsabstand zwischen Lichtmikroskopstrahlengang 11 , d.h. einem Objektiv des Lichtmikroskops, und der Unterseite des Deckglases 7 nicht beeinträchtigt.
Die korrelative Mikroskopie durch eine Kombination aus Lichtmikroskopie und Elektronenstrahlenmikroskopie erreicht vorteilhaft, daß die Probe 8 relativ zum Halter 2 in allen Mikroskopiezuständen örtlich fixiert ist. Wie bereits erwähnt, kann zur Referenzierung dieser Lage am Halter 2 eine Markierung vorgesehen werden. Diese Ausgestaltung ist exemplarisch in Fig. 9 gezeigt, die sowohl eine Draufsicht auf den Halter 2 gemäß den Fig. 5a-c als auch auf den Halter gemäß Fig. 7a-c zeigt. Letzterer ist über dem Ersteren abgebildet. Um ein vom Mikroskop unabhängiges Koordinatensystem zu definieren, ist in diesem Ausführungsbeispiel auf dem Halter 2 eine Markierungsanordnung 29 vorgesehen, die ein Koordinatensystem für den Halter 2 festlegt. Die Markierungsanordnung besteht aus insgesamt drei Doppelmarkierungen 30, die beispielsweise, wie in Fig. 9 dargestellt, L-förmig zueinander liegen. Diese Anordnung ist in Fig. 9 als vergrößerte Teildarstellung eingetragen. Die L-förmige Ausbildung der Doppelmarkierungen 30 erlaubt eine eindeutige Festlegung des Koordinatensystems. Aus dem Abstand der Doppelmarkierungen 30 kann somit einfach Lage und Orientierung des Halters 2 ermittelt werden. Die Doppelmarkierungen 30 sind natürlich so ausgestaltet, daß sie sowohl mit der Lichtmikroskopie, als auch mit der Elektronenstrahlenmikroskopie detektierbar sind, z. B. als Chrom-Markierung auf transparentem und leitfähig beschichtetem Quarzglas.
Jede Doppelmarkierung 30 besteht aus zwei Einzelmarkierungen 31 , 32 unterschiedlicher Größe, die somit für zwei verschiedene Vergrößerungsstufen geeignet sind.
Dies ist aber nicht zwingend so, alternativ können auch nur Einzelmarkierungen anstelle der Doppelmarkierungen 30 verwendet werden.
Wesentlich für die Markierungen ist, daß sie mit beiden Mikroskopieverfahren erfaßbar sind, oder daß Markierungen vorgesehen sind, die zueinander in bekannter Ausrichtung sind und jeweils für sich zumindest für eine der Mikroskopiemethoden wahrnehmbar ist.
Über die Markierungsanordnung 29 kann die Lage des Halters 2 sowohl in Lichtmikroskopie als auch in Elektronenstrahlmikroskopie kalibriert werden. Dazu werden nacheinander die drei
Markierungen der Markierungsanordnung 29 angefahren und die entsprechende Position eines
Verschiebetisches des Mikroskops ausgelesen. Dies kann sowohl manuell durch den Benutzer als auch automatisch unter Verwendung von Bildverarbeitungsalgorithmen erfolgen. Hat man derart die drei Markierungen der Markierungsanordnungen hinsichtlich ihrer Koordinaten bestimmt, ist das Koordinatensystem des Halters 2 definiert. Damit kann einfach die Position des Probentisches für jeden interessanten Probenbereich gespeichert werden. Nach dem
Transfer des Halters 2 in das andere Mikroskop erfolgt zunächst wieder eine Kalibrierung der
Lage der Markierungsanordnung 29. Anschließend können die zuvor abgespeicherten
Probenbereiche dann automatisch und ohne zeitaufwendiges Suchen wieder angefahren werden.
Zur Befestigung des Halters 2 in einem Elektronenmikroskop ist vorzugsweise ein Adapter 33 vorgesehen, der in Fig. 10 und 11 dargestellt ist.
Dieser Adapter ermöglicht es, eine auf dem Halter 2 angeordnete Probe, die zuvor lichtmikroskopisch untersucht wurde, direkt in ein Elektronenmikroskop aufzunehmen und dort weiter zu analysieren. Der Adapter 33 weist dazu einen Schwalbenschwanz 34 auf, der an einem Fuß 35 zur Befestigung an einer Aufnahmevorrichtung des Elektronenstrahlmikroskops ausgebildet ist. Natürlich ist je nach Aufnahmevorrichtung des Elektronenstrahlmikroskops eine entsprechend passende Montageeinrichtung am Fuß 35 des Adapters 33 vorgesehen; der Schwalbenschwanz 34 ist hier nur exemplarisch dargestellt. An der Oberseite des Adapters 33 befindet sich eine Auflage 38 zur Aufnahme des Halters 2. Dieser wird mit Klemmfedern 37 oder anderen geeigneten Halteeinrichtungen auf der Auflage 38 fixiert. In einer bevorzugten Ausgestaltung bewirkt der Adapter 33 zugleich auch noch eine Vorausrichtung des Halters 2, in dem er Mittel aufweist, die mit entsprechenden Gegenstücken am Halter 2 nach dem Schlüssel/Schloß-Prinzip zusammenwirken. Dieses Schlüssel/Schloß- Prinzip erreicht vorzugsweise eine vorjustierte Lage des Halters 2 mit einer Paßgenauigkeit von weniger als 50 μm. Beispielsweise kann der Adapter 33, wie in Fig. 10 und 11 gezeigt, an der Auflage 35 eine Aussparung 36 aufweisen, in welche am Halter 2 entsprechend vorgesehene Führungskanten eingreifen. Dadurch kann der Halter 2 in einer vorjustierten Stelle auf den Adapter 33 aufgelegt und dort mechanisch fixiert werden.
Um eine Transmissionsmessung in der Elektronenstrahlenmikroskopie zu ermöglichen, weist der Adapter 33 zwischen dem Fuß 35 bzw. dem Schwalbenschwanz 34 und der Auflage 38 eine Aussparung 39 und in der Auflage 38 eine Durchtrittsöffnung 40 auf, in die ein Transmissionselektronendetektor des Elektronenmikroskops eingeführt werden kann. Die Abmessungen des Adapters 33 wird so gestaltet, daß eine Probe, die sich auf dem eingesetzten Halter 2 befindet, welcher am Adapter 33 befestigt ist, sich im für das Elektronenmikroskop vorbestimmten Arbeitsabstand zum Polschuh befindet, beispielsweise in einem Abstand von 3 mm.
Für eine ordnungsgemäße Arbeitsweise ist der Adapter 33 weiter elektrisch leitend ausgebildet, um eine elektrostatische Aufladung des Adapters bzw. des Objektträgers 10 oder der Probe zu vermeiden und die Probe zu erden.

Claims

Patentansprüche
1. Objektträger-System zum Mikroskopieren eines Objektes (8) mit einer Kombination aus optischer Mikroskopie (10) und Teilchenstrahlmikroskopie (12), wobei das System (1 ) aufweist: einen elektrisch leitfähigen Halter (2), wobei im Halter (2) mindestens ein Fenster (3; 17, 18) ausgebildet ist und wobei vorzugsweise der Halter (2) die Abmessungen eines Standard- Glas-Objektträgers für die optische Mikroskopie (10) hat, ein Objektträgerelement (7; 19), das zum Tragen des zu mikroskopierenden Objektes (8) ausgebildet ist und das über das Fenster (3; 17, 18) legbar ausgebildet ist, und eine Befestigungseinrichtung (5, 6; 22, 25), die zum Fixieren des Objektträgerelementes (7; 19) über dem Fenster (3; 17, 18) ausgebildet ist.
2. System nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Halter (2) eine Vertiefung (16) aufweist, das Fenster (3; 17, 18) in der Vertiefung (16) gebildet ist und das
Objektträgerelement (7; 19) in die Vertiefung (16) einlegbar ist, so daß das über das Fenster (3; 17, 18) gelegte Objektträgerelement (7; 19) sich näher an einer Unterseite (4) des Halters (2) als an einer Oberseite des Halters (2) befindet.
3. System nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Halter (2) mindestens eine Justiermarkierung (14; 29) angebracht ist, die sowohl mit optischer Mikroskopie (10) als auch mit Teilchenstrahlmikroskopie (12) detektierbar ist.
4. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Halter (2) mindestens drei Justiermarkierungen (30) angebracht sind, die ein Koordinatensystem für den Halter (2) festlegen.
5. System nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede Justiermarkierung (30) als Doppelmarkierung (31 , 32) ausgeführt ist, die für zwei unterschiedliche Mikroskopie- Vergrößerungsstufen angepaßt sind.
6. System nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Befestigungseinrichtung mindestens eine neben dem Fenster (3; 17, 18) mit dem Halter (2) verbundene Klemmeinrichtung (22) zum Fixieren des Objektträgerelementes (7; 19) über dem Fenster (3; 17, 18) aufweist.
7. System nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektträgerelement als leitfähiges Netz (19) ausgebildet ist.
8. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektträgerelement als Deckglas (7) ausgebildet ist.
9. System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Befestigungseinrichtung seitlich neben dem Fenster (3) liegende Schienen (5, 6) aufweist, in die das Deckglas (7) einschiebbar und so über das Fenster (3) legbar ist.
10. System nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das System eine transparente Folie (28) umfaßt, deren optische Brechzahl an die des Deckglases (7) angepaßt ist und die das Deckglas (7) von der für die optische Mikroskopie (10) verwendeten Immersionsflüssigkeit (11 ) schützt, so daß durch Abheben der Folie (28) die Immersionsflüssigkeit (11 ) entfernbar ist.
11. System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (28) auf einer Seite eine Klebstoffschicht aufweist, die beim Abheben der Folie (28) vom Deckglas (7) ausschließlich an der Folie (28) haften bleibt.
12. System nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (28) größer als das Fenster (3) ist.
13. System nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das System (1 ) einen Ring (26) umfaßt, der an einer Unterseite eine Gummilippe aufweist, wobei das Ringinnere (27) kleiner als das Deckglas (7) ist, so daß der Ring (26) auf das Deckglas (7) legbar ist und mit der Gummilippe für die optische Mikroskopie (10) auf das Deckglas (7) aufgebrachte Immersionsflüssigkeit (11 ) vom Deckglas (7) abziehbar ist.
14. System nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Adapter (33) vorgesehen ist, der eine Montageeinrichtung (34) zur Befestigung des Adapters (33) an einer Aufnahmevorrichtung eines Teilchenstrahlmikroskops aufweist und an dem eine Auflagefläche (35) mit Halteeinrichtung (36) zum Fixieren des Halters (2) auf der Auflagefläche (35) ausgebildet ist.
15. System nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Adapter (33) unter der Auflagefläche (35) und über der Montageeinrichtung (34) eine Aussparung (37) zum Einführen eines Teilchenstrahldetektors aufweist.
16. System nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Halter (2) mechanische Ausrichtmittel aufweist, die zum Ausrichten des Halters (2) in einem optischen Mikroskop (10) und/oder einem Teilchenstrahlmikroskop (12) ausgebildet sind.
17. Verfahren zur Mikroskopie eines Objektes (8), wobei das Objekt (8) mit einem optischen Mikroskop (10) und zuvor oder danach mit einem Teilchenstrahlmikroskop (12) untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein System (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 16 verwendet wird, das Objekt (8) auf dem Halter (2) angeordnet und dieser nacheinander in beide Mikroskope (10, 12) eingelegt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroskope verwendet werden, die eine Mechanik zum Bewegen des Halters aufweisen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Objektträger-System nach einem der Ansprüche 3 bis 5 verwendet wird, daß ein Objektbereich festgelegt wird, mit dem zuerst verwendeten Mikroskop die Relativlage von Objektbereich und Justiermarke ermittelt wird, indem durch Betätigen der Mechanik sowohl der Objektbereich als auch die Justiermarke mit dem zuerst verwendeten Mikroskop abgebildet werden, im anschließend verwendeten Mikroskop die Justiermarke abgebildet wird und ausgehend von der Justiermarke der Objektbereich durch Betätigen der Mechanik angefahren wird.
20. Verfahren nach einem der obigen Verfahrensansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in beiden Mikroskopen die Lage der Justiermarke bezogen auf das jeweilige Mikroskop ermittelt wird, und daß die Lagen von Objektbereichen in Bezug auf die Justiermarke gespeichert werden.
21. Objektträger-System für Immersionsflüssigkeit (11 ) verwendende, optische Mikroskopie, das einen Objektträger (2) und ein Deckglas (7) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das
System eine transparente Folie (28) umfaßt, deren optische Brechzahl an die des Deckglases (7) angepaßt ist und die das Deckglas (7) von der für die optische Mikroskopie (10) verwendeten Immersionsflüssigkeit (11 ) schützt, so daß durch Abheben der Folie (28) die Immersionsflüssigkeit (11 ) entfernbar ist.
22. System nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß der Rand der Folie mit einem Versteifungsring versehen ist.
23. System nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (28) auf einer Seite eine Klebstoffschicht aufweist, die beim Abheben der Folie (28) vom Deckglas (7) ausschließlich an der Folie (28) haften bleibt.
24. System nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (28) eine Brechzahl hat, die von der des Deckglases (7) um maximal 10 % abweicht.
25. System nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (28) größer ist, als das Deckglas (7).
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