WO2010123012A1 - アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体 - Google Patents

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亜樹 松島
博史 浪崎
繁典 八木
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Definitions

  • the present invention relates to an IgG2 having agonist activity wherein at least 234th valine is substituted with alanine, 237th glutamine with alanine, and 331th proline with serine (numbers are based on EU index by Kabat et al.).
  • a monoclonal antibody that binds to human CD40 having a heavy chain constant region, a DNA encoding the monoclonal antibody, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, and the transformant The present invention relates to a method for producing the monoclonal antibody used, a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody, and a therapeutic agent.
  • CD40 CD40 is an antigen present on the cell membrane surface with a molecular weight of 50 kDa, and is expressed on B cells, dendritic cells (DC), certain cancer cells, thymic epithelial cells, and the like. CD40 is known to play an important role in the proliferation and differentiation of B cells and DCs. CD40 has been identified as an antigen expressed on the surface of human B cells (Non-patent Documents 1 and 2). From the homology of amino acid sequences, CD40 belongs to low-affinity NGF receptor, TNF receptor, CD27, OX40, CD30 and the like. Is considered as a member of the TNF receptor family.
  • the ligand for human and mouse CD40 (CD40L) is a type II membrane protein expressed on activated CD4 + T cells and has also been shown to introduce strong activation signals into human and mouse B cells.
  • DC has been confirmed in DC, and it has been revealed that DC plays an important role.
  • APC antigen-presenting cells
  • DC has a strong antigen presenting ability and a strong helper T (Th) cell activation ability.
  • Th helper T
  • a dendritic cell (DC1) obtained by culturing peripheral blood monocytes, which are myeloid dendritic cells, with GM-CSF and IL-4 and matured by CD40L has IL-12 production ability in vitro and is heterogeneous. It stimulates and activates naive Th cells and induces IFN ⁇ -producing T cells (ie, promotes differentiation into Th1). Since this action is inhibited by an anti-IL-12 antibody, it is considered to be a reaction mediated by IL-12.
  • lymphoid dendritic cells obtained by culturing plasmacytoid T cells present in lymphoid tissue T region or peripheral blood with IL-3 and CD40L do not have IL-12 production ability and are different from naive Th. It has been shown to stimulate and activate cells, induce IL-4 producing T cells and promote differentiation into Th2. Th1 cells are involved in the activation of cellular immunity, and Th2 cells are thought to be involved in suppressing humoral immunity and at the same time suppressing cellular immunity.
  • Cytotoxic T cells (CTL) activated with the help of Th1 cells can remove pathogens (such as many viruses, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, and Toxoplasma gondii) and tumor cells that grow in the cytoplasm .
  • pathogens such as many viruses, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, and Toxoplasma gondii
  • Monoclonal antibodies that bind to CD40 expressed on the membrane surface have been shown to exhibit various biological activities against B cells. Those having an agonist activity against CD40 (agonist antibody) and those having an antagonist activity (antagonist antibody) are roughly classified.
  • Agonist antibody B cell activation is known as an effect of an agonist antibody.
  • anti-CD40 antibody induces cell adhesion (Non-Patent Documents 5 and 6), increases cell size (Non-Patent Documents 6 and 7), and is activated only by anti-IgM antibody, anti-CD20 antibody or phorbol ester.
  • Non-patent Documents 8-10 Induced B cell division (Non-patent Documents 8-10), induced B cell division in the presence of IL4 (Non-patent Documents 7 and 11), IL-4 stimulation, IgE of T cell-depleted cultured cells (Non-patent Documents 12 and 13), IL-4 secretion of soluble CD23 / FceRII from B cells, which induces the expression of IgG and IgM (Non-patent Documents 13) and (Non-patent Documents 14 and 15) It has been reported that IL-6 production (Non-patent Document 17) is promoted by enhancing expression (Non-patent Document 16).
  • Non-patent Document 18 human primary cultured B cells
  • Non-patent Document 19 the antigen receptor
  • CD40 has been identified as an antigen expressed on the surface of human B cells
  • many of the isolated antibodies mainly use proliferation-differentiation-inducing functions for human B cells and cell death-inducing activity in cancer cells as indicators. Have been evaluated (Non-Patent Documents 20, 21, and 22).
  • Non-patent Document 23 It has also been shown that anti-CD40 antibodies mature DCs (Non-patent Document 23). Furthermore, the role of CD4 T cells in antigen-specific CD8 T cell priming was reported to be in DC activation via CD40-CD40L signaling, and the role of CD4 helper T cells in DC activation by anti-CD40 monoclonal antibodies. It can be substituted (Non-patent Document 24). In addition, it was shown that the body can be protected not only from tumor cells expressing CD40 but also from non-expressing tumor cells by administration of an anti-CD40 antibody in mice (Non-patent Document 25).
  • anti-CD40 antibodies having agonist activity can be used for the treatment of infectious diseases caused by bacteria, viruses, etc., the treatment of malignant tumors, and the like.
  • Patent Document 1 discloses the KM341-1-19 antibody as an anti-CD40 antibody having agonist activity.
  • the hybridoma KM341-1-19 producing the KM3411-1-19 antibody was established on September 27, 2001 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture). It is deposited internationally under the Budapest Treaty (Accession Number: FERM BP-7759).
  • Patent Document 2 the heavy chain variable region of the KM341-1-19 antibody and the proline at position 331 are substituted with serine (this substitution is denoted as P331S (hereinafter the same)), and the numbers are in the EU index by Kabat et al.
  • a 341G2Ser antibody having a heavy chain constant region, which is based on IgG2 Non-patent Document 26
  • Patent Document 3 discloses anti-CD40 antibody 21.4.1 having agonist activity.
  • IgG2 subclass antibodies are known to have weak effector functional activity of antibodies mediated by Fc ⁇ receptors, but substitution by V234A and G237A (numbers are based on EU index by Kabat et al.) It has been reported that lysis of target cells by effector cells can be further suppressed (Non-patent Document 34). However, there is no disclosure about the effect of V234A and G237A on the agonist activity of anti-CD40 antibodies. Further, there is no disclosure about the effect of substitution of IgG2 subclass V234A and G237A on blood kinetics of anti-CD40 antibody. Furthermore, there is no disclosure about the effect of substitution of IgG2 subclasses V234A and G237A on the liver of anti-CD40 antibodies.
  • CDC activity can be reduced by substituting with an amino acid (Non-patent Documents 35-40). Specifically, CDC activity can be reduced by substituting A for D270, K322, P329, and P331. CDC activity can also be reduced by converting P331 to S or G.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having agonist activity that binds to human CD40, a DNA encoding the monoclonal antibody, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, and the transformation It is in providing the manufacturing method of this monoclonal antibody using a body, the pharmaceutical composition containing this monoclonal antibody, and a therapeutic agent.
  • valine at position 234 is alanine (V234A)
  • glutamine at position 237 is alanine (G237A)
  • proline at position 331 is serine (P331S).
  • V234A valine at position 234
  • G237A glutamine at position 237
  • proline at position 331 is serine (P331S).
  • human CD40 A monoclonal antibody having a heavy chain constant region that is IgG2 (hereinafter referred to as “IgG2-AAS”) (which is based on the EU index by Kabat et al.). In some cases, IgG2-AAS antibody may be referred to) to complete the present invention.
  • the present invention relates to the following [1] to [23].
  • Heavy chain constant region which is IgG2 with at least 234 position valine replaced with alanine, 237 position glutamine replaced with alanine and 331 position proline replaced with serine (numbers are based on EU index by Kabat et al.)
  • a monoclonal antibody that binds to human CD40 having agonist activity [2] A monoclonal antibody having a heavy chain constant region represented by SEQ ID NO: 30 and having agonist activity and binding to human CD40.
  • the transformant of [10] is cultured in a medium, the monoclonal antibody of any one of [1] to [7] is produced and accumulated in the culture, and the monoclonal antibody is collected from the culture.
  • a heavy chain constant region which is a polypeptide obtained by removing a secretion signal from the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 and a light chain constant region which is a polypeptide obtained by removing the secretion signal from the polypeptide represented by SEQ ID NO: 12 A monoclonal antibody.
  • the transformant of [16] or [17] is cultured in a medium, the monoclonal antibody of [12] is produced and accumulated in the culture, and the monoclonal antibody is collected from the culture [12] A method for producing a monoclonal antibody.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to any one of [1] to [7] and [12] as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for malignant tumors or infectious diseases comprising the monoclonal antibody according to any one of [1] to [7] and [12] as an active ingredient.
  • Use of the monoclonal antibody according to any one of [1] to [7] and [12] for the manufacture of a therapeutic agent for malignant tumors or infectious diseases.
  • a monoclonal antibody that binds to human CD40 having a heavy chain constant region which is IgG2-AAS exhibits strong agonist activity.
  • the present invention provides an IgG2 heavy chain in which at least 234th valine is substituted with alanine, 237th glutamine with alanine, and 331th proline with serine (numbers are based on EU index by Kabat et al.).
  • Monoclonal antibody having a constant chain region, having agonist activity and binding to human CD40 (sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), DNA encoding the monoclonal antibody, a vector comprising the DNA, the vector Can be provided, a method for producing the monoclonal antibody using the transformant, a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody, and a therapeutic agent.
  • IgG2-AAS (341) antibody which is one of the monoclonal antibodies, has a longer residence time in blood than IgG2-S (341) antibody.
  • IgG2-AAS (341) antibody is less toxic to the liver than IgG2-S antibody.
  • IgG2-AAS (341) antibody It is a figure which shows the binding activity of IgG2-AAS (341) antibody.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents average fluorescence intensity.
  • the average fluorescence intensity of IgG2-AAS (341) antibody is indicated by a circle and a broken line
  • the average fluorescence intensity of IgG2-S (341) antibody is indicated by a circle and a solid line
  • the average fluorescence intensity of a negative control antibody is indicated by an * mark and a dotted line, respectively.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents average fluorescence intensity.
  • the average fluorescence intensity of the IgG2-AAS (21.4.1) antibody is indicated by ⁇ and a broken line
  • the average fluorescence intensity of the IgG2-S (21.4.1) antibody is indicated by a circle and a solid line
  • the average fluorescence intensity of the negative control antibody is indicated by an asterisk (*).
  • dotted lines It is a figure which shows the agonist activity of IgG2-AAS (341) antibody.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents average fluorescence intensity.
  • the average fluorescence intensity of IgG2-AAS (341) antibody is indicated by a circle and a broken line
  • the average fluorescence intensity of IgG2-S (341) antibody is indicated by a circle and a solid line
  • the average fluorescence intensity of a negative control antibody is indicated by an * mark and a dotted line, respectively.
  • the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL)
  • the vertical axis represents average fluorescence intensity.
  • the average fluorescence intensity of the IgG2-AAS (21.4.1) antibody is indicated by ⁇ and a broken line
  • the average fluorescence intensity of the IgG2-S (21.4.1) antibody is indicated by a circle and a solid line
  • the average fluorescence intensity of the negative control antibody is indicated by an asterisk (*).
  • dotted lines It is a figure which shows the blood concentration of IgG2-AAS (341) antibody.
  • the horizontal axis represents time (day) after administration, and the vertical axis represents blood drug concentration ( ⁇ g / mL).
  • the blood concentration of IgG2-AAS (341) antibody is indicated by ⁇ and solid line, and ⁇ and solid line
  • the blood concentration of IgG2-S (341) antibody is indicated by ⁇ and solid line, and ⁇ and solid line, respectively.
  • the horizontal axis represents the time after administration (hour), and the vertical axis represents the activity value (carmen unit).
  • the AST at the time of IgG2-AAS (341) antibody administration is indicated by a circle and a broken line
  • the AST at the time of IgG2-S (341) antibody administration is indicated by a circle and a solid line
  • the AST at the time of PBS administration is indicated by an * mark and a dotted line, respectively.
  • the horizontal axis represents the time after administration (hour), and the vertical axis represents the activity value (carmen unit).
  • the ALT at the time of IgG2-AAS (341) antibody administration is indicated by a black circle and a broken line
  • the ALT at the time of IgG2-S (341) antibody administration is indicated by a circle and a solid line
  • the ALT at the time of PBS administration is indicated by an * mark and a dotted line, respectively.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that binds to human CD40 having a heavy chain constant region that is IgG2-AAS and exhibiting agonist activity.
  • the antibody of the present invention binds to the extracellular region of human CD40.
  • the antibody of the present invention binds to CD40 by a known immunological detection method for cells expressing CD40 using a radioimmunoassay using a solid phase sandwich method or the like, or an enzyme immunoassay (ELISA), Preferably, it can be confirmed by a method capable of examining the binding property of a cell expressing a specific antigen and an antibody to the specific antigen, such as fluorescent cell staining.
  • a fluorescent antibody staining method using a FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) or the like [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)], fluorescent cell staining using flow cytometry, or surface plasmon resonance using a Biacore system (manufactured by GE Healthcare).
  • known immunological detection methods [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Biotechnology, 198 (1987)] etc. can also be confirmed.
  • the cell expressing CD40 may be any cell as long as it expresses CD40.
  • a cell naturally existing in the human body a cell line established from a cell naturally existing in the human body, or a gene set Examples thereof include cells obtained by the replacement technique.
  • Examples of cells that naturally exist in the human body include cells in which the polypeptide is expressed in autoimmune disease patients, allergic patients, and cancer patients.
  • Examples thereof include cells expressing CD40.
  • the CD40 As a cell line established from cells naturally existing in the human body, among the cell lines obtained by establishing cells expressing the CD40 obtained from the above cancer patients, the CD40 is expressed. For example, Ramos (ATCC CRL-1596), Raji (ATCC CCL-86), Daudi (ATCC CCL-213) and T24 (ATCC HTB-4) cell lines established from humans Etc.
  • cells obtained by gene recombination technology include cells expressing CD40 obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding CD40 into insect cells or animal cells.
  • the sequence information of human CD40 DNA and protein can be obtained from a known database such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and is represented by SEQ ID NO: 36, respectively. It is registered as a base sequence (NCBI accession number: NM — 001250) and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 (NCBI accession number: NP — 001241).
  • CD40 means human CD40 unless otherwise specified.
  • examples of the monoclonal antibody include a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • Monoclonal antibody is an antibody secreted by a single clone of antibody-producing cells, and recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant). Furthermore, the amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody is uniform.
  • the monoclonal antibody consists of two heavy chains (consisting of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region) and two light chains (consisting of a light chain variable region and a light chain constant region).
  • Epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences to which sugar chains are bound, and amino acid sequences to which sugar chains are bound.
  • the epitope recognized by the monoclonal antibody of the present invention is preferably present in the extracellular region of CD40.
  • the recombinant antibody includes antibodies produced by genetic recombination, such as human chimeric antibodies, human CDR-grafted antibodies, and human antibodies.
  • CDR is an abbreviation for Complementarity Determining Region (hereinafter, referred to as CDR).
  • a recombinant antibody having characteristics of a monoclonal antibody, low antigenicity, and extended blood half-life is preferable as a therapeutic agent.
  • the human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter sometimes referred to as VH) and light chain variable region (hereinafter sometimes referred to as VL) and a human antibody heavy chain constant.
  • the human chimeric antibody of the present invention is used for animal cells having cDNA encoding VH and VL obtained from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes CD40, and having genes encoding CH and CL of the human antibody.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting each into an expression vector and introduced into an animal cell for expression and production.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibody VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention has any amino acid sequence of CDRs of VH and VL of non-human animal antibodies produced from hybridomas that produce monoclonal antibodies of non-human animals that specifically recognize CD40.
  • cDNA encoding the V region transplanted into the VH and VL framework regions of human antibodies (hereinafter sometimes referred to as FR) and expression for animal cells having genes encoding CH and CL of human antibodies
  • FR human antibodies
  • Each can be inserted into a vector to construct a human CDR-grafted antibody expression vector, which can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • IgA, IgM, IgE, and IgG in the heavy chain constant region class of human antibodies, and IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 in the IgG subclass.
  • IgG2 There are multiple allotypes in IgG2 (see, eg, SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, hereinafter referred to as Alo76042.1, CAC12842, and AAN76043.1 in NCBI Reference Sequences, which are allotypes 1, 2, and 3, respectively).
  • the monoclonal antibody of the present invention may be of any isotype.
  • ⁇ and ⁇ in the class of the light chain constant region of the human antibody, and any of the light chain constant regions of the monoclonal antibody of the present invention may be used.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • the antibody naturally present in the human body can be cultured by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, transplanting the ES cells into an early mouse embryo, and generating them (Tomizuka.et). al., Proc NatlAcad Sci USA., 2000 Vo197: 722).
  • human antibody-producing hybridomas are obtained and cultured using normal hybridoma production methods performed in non-human animals to produce human antibodies in the culture supernatant. It can be produced by accumulating.
  • the monoclonal antibody that binds to human CD40 in the present invention has a heavy chain constant region that is IgG2-AAS.
  • IgG2-AAS antibody is IgG2 in which proline at position 331 is substituted with serine (the number is based on the EU index by Kabat et al.) (Hereinafter referred to as IgG2-S).
  • IgG2-S antibody The effect of enhancing the agonist activity was found in comparison with an antibody having a heavy chain constant region (hereinafter sometimes referred to as IgG2-S antibody).
  • IgG2-AAS (341) antibody which is one of the monoclonal antibodies of the present invention, has found an effect that the residence time in blood is prolonged compared with IgG2-S (341) antibody. It was. Furthermore, the IgG2-AAS (341) antibody was found to have an effect that toxicity to the liver was reduced as compared with the IgG2-S (341) antibody.
  • CD40 ligand is known to be toxic to the liver (Journal of Clinical Oncology, 19 (13), 3280-3287 (2001)). Similarly, monoclonal antibodies that bind to CD40 exhibiting agonist activity are also present in the liver. (American Journal of Pathology, 168 (3), 786-795 (2006)).
  • the IgG2-AAS antibody in the present invention has enhanced agonist activity as compared with the IgG2-S antibody, toxicity to the liver is reduced as compared with the IgG2-S antibody.
  • the decrease can be confirmed, for example, by a decrease in the blood concentration of aspartate aminotransferase (hereinafter sometimes referred to as AST) or alanine aminotransferase (hereinafter sometimes referred to as ALT).
  • Monoclonal antibodies in which one or more amino acids are deleted, added, substituted and / or inserted in the amino acid sequence constituting the above-described monoclonal antibody and have the same activity as the above-mentioned antibody are also included in the monoclonal antibody of the present invention. Is done.
  • the position of the deletion, addition, substitution and / or insertion is specifically a heavy chain constant region, a light chain constant region, a heavy chain variable region or a light chain variable region, and further said heavy chain and light chain variable region In CDR1, CDR2 or CDR3, or in the framework region (FR).
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited, but site-specific mutagenesis [Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)], etc., and the number that can be deleted, added, substituted, and / or inserted.
  • the number is more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5 (for example, 1, 2, 3, 4 or 5).
  • amino acids may be deleted, added, substituted and / or inserted in addition to AAS substitution. Also included are monoclonal antibodies having such heavy chain constant regions.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues means the following. That is, it means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or a plurality of amino acid residues in any one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence.
  • deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be either a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine , L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, or L-cysteine.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyrosine
  • the monoclonal antibody of the present invention includes a derivative of an antibody
  • antibody derivatives include the H- or L-chain N-terminal side or C-terminal side of a monoclonal antibody that binds to CD40, appropriate substituents or side chains in the antibody, and sugar chains in the monoclonal antibody.
  • it can be produced by combining a radioisotope, a low molecular weight drug, a high molecular weight drug, an immunostimulant, a protein or an antibody drug by a chemical method [Introduction to Antibody Engineering, Jinshokan (1994)]. it can.
  • a gene encoding a monoclonal antibody that binds to CD40 and a DNA encoding a protein or antibody drug to be bound are inserted into an expression vector, the expression vector is introduced into an appropriate host cell, and expressed. It can be manufactured by engineering methods.
  • radioisotope examples include 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, and 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • Low molecular weight drugs include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P glycoprotein inhibitors, platinum complex derivatives , Anti-cancer drugs such as M phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], steroids such as hydrocortisone and prednisone, non-steroidal drugs such as aspirin and indomethacin, gold thiomalate, Anti-inflammatory agents such as immunomodulators such as penicillamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine, and antihistamines such as chlorpheniramine maleate or clemacytin [Inflammation and anti-inflammatory therapy, Ishiyaku Shuppan Co., Ltd.
  • Anticancer agents include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), doxorubicin (adriamycin) ), Epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, daunomycin, pepromycin, estramustaxate, paclitaxel , Aldesleukin, asparaginase, busulfan Carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine, camptothecin, 10-hydroxy-7-
  • Low molecular weight drug and antibody can be bound by binding between the drug and antibody amino groups via glutaraldehyde, or by coupling the drug amino group and antibody carboxyl group via water-soluble carbodiimide. The method of making it.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • a method of linking PEG and an antibody a method of reacting with a PEGylation modifying reagent and the like can be mentioned [Bioconjugate pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • the PEGylation modifying reagent include a modifier for the ⁇ -amino group of lysine (Japanese Patent Laid-Open No. 61-178926), a modifier for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-23587). Or a modifier for guanidino group of arginine (Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan), ⁇ -galactosylceramide and the like. It is done.
  • proteins include cytokines or growth factors that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages, or neutrophils, or toxin proteins.
  • cytokines or growth factors examples include interferon (hereinafter referred to as INF) - ⁇ , INF- ⁇ , INF- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-12, IL-15, IL- 18, IL-21, IL-23, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and the like.
  • INF interferon
  • IL interleukin
  • IL-12 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-15 interleukin- 18, IL-21
  • IL-23 granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • toxin protein examples include ricin
  • Antibody drugs include antigens that induce apoptosis by antibody binding, antigens involved in tumor pathogenesis or antigens that regulate immune function, and antibodies against antigens involved in angiogenesis of lesion sites.
  • CD Cluster of differentiation
  • CD20 CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, Epidermal Growth Factor (R) Etc.
  • HLA human leukocyte antigen
  • R Epidermal Growth Factor
  • CD40, CD40 ligand, B7 family molecules are antigens involved in tumor pathogenesis or antibodies that regulate immune function , B7 family molecule ligand (CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, or BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecule (DR4, DR5, TNFR1 Or TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule, TRAIL family molecule receptor family (TRAIL-R1, TRAIL-R2, RAIL-R3 or TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK), RANK ligand, CD25, folate receptor 4, cytokine [IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10,
  • antibody antigens that inhibit angiogenesis at the lesion site include vascular, axial growth factor (VEGF), anangiopoietin, fibroblast growth factor (FGF), EGF, and platelet-induced growth.
  • VEGF vascular, axial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF EGF
  • platelet-induced growth EPO
  • EPO Erythropoietin
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • IL-8 Epilin
  • SDF-1 SDF-1
  • cDNA encoding protein is linked to cDNA encoding monoclonal antibody, DNA encoding the fusion is constructed, and the DNA is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector. Then, the expression vector can be expressed by introducing it into a prokaryote or eukaryote to produce a fusion.
  • a drug that binds to a monoclonal antibody that binds to CD40 may be an ordinary immunological detection or measurement method.
  • a label used in the above examples include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or lophine, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), etc. Can be given.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or lophine, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), etc.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • RITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition and a therapeutic agent containing a monoclonal antibody that binds to CD40 as an active ingredient.
  • the disease is not limited as long as the anti-CD40 antibody having agonist activity is therapeutically effective.
  • the anti-CD40 antibody having agonist activity induces cellular immunity and humoral immunity as described above, infection ( Examples include hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis A virus, influenza virus, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, malaria parasite or Toxoplasma parasite) and malignant tumors.
  • malignant tumor When a cancer cell itself in a malignant tumor expresses CD40, the malignant tumor can also be treated by inducing apoptosis in the cell by an agonist anti-CD40 antibody.
  • malignant tumors include malignant lymphoma, malignant melanoma, lung cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, mesothelioma, breast cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, renal cell carcinoma, prostate cancer, Uterine cancer or ovarian cancer.
  • the therapeutic agent of the present invention contains the above-described monoclonal antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the antibody of the present invention may contain only the antibody as an active ingredient, but usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method known in the art.
  • oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, preferably intravenous.
  • Internal administration can be given.
  • administration forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult.
  • the present invention relates to a method for immunological detection or measurement of CD40, a reagent for immunological detection or measurement of CD40, an immunological assay for cells expressing CD40, which contains a monoclonal antibody that binds to CD40 as an active ingredient.
  • the present invention relates to a detection or measurement method and a diagnostic agent for a disease involving CD40 positive cells.
  • any known method may be used as a method for detecting or measuring the amount of CD40.
  • Examples include immunological detection or measurement methods.
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, western blot method Or a physicochemical method etc. are mention
  • a disease associated with CD40 can be diagnosed.
  • Suitable immunological detection methods can be used to detect the cells in which the polypeptide is expressed, but immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, immunohistological staining, etc. Preferably used. Moreover, fluorescent antibody staining methods such as FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can also be used.
  • the biological sample to be detected or measured for CD40 may include cells expressing CD40, such as tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid, or culture fluid. If it is a thing, it will not specifically limit.
  • the diagnostic agent containing the monoclonal antibody of the present invention may contain a reagent for conducting an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • the detection reagent include a labeled secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody, or a reagent that is used in a usual immunological detection or measurement method such as a substrate corresponding to the label.
  • the antibody production method, disease treatment method, and disease diagnosis method of the present invention will be specifically described below.
  • Method for producing monoclonal antibody Preparation of antigen Cells expressing CD40 or CD40 as an antigen are expressed in E. coli, yeast, insect cells, or animal cells using an expression vector containing cDNA encoding CD40 full length or a partial length thereof. It can be obtained by introducing into the above.
  • CD40 can be purified and obtained from cultured human tumor cells, human tissues, etc. that express CD40 in large amounts. Further, the tumor cultured cells or the tissue can be used as an antigen as it is.
  • a synthetic peptide having a CD40 partial sequence can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • the CD40 used in the present invention can be produced by, for example, expressing the CD40-encoding DNA in a host cell by the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a CD40-encoding portion downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing the polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector can be used as long as it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can do.
  • any microorganism that belongs to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells can be used so long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector When a prokaryote such as E. coli is used as a host cell, the recombinant vector is capable of autonomous replication in a prokaryote and at the same time contains a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a CD40-encoding portion, and a transcription termination sequence. It is preferable that it is a vector containing.
  • the recombinant vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding CD40 can be substituted so that it is an optimal codon for expression in the host, thereby improving the target CD40 production rate.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 hereinafter, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 manufactured by Invitrogen
  • pGEMEX-1 manufactured by Promega
  • pQE-8 manufactured by Qiagen
  • pKYP10 Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)]
  • pGEL1 Proc.
  • coli IGKA2 (FERM BP-6798), Japanese Unexamined Patent Publication 60- 221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol. , 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), or pME18SFL3.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ .
  • Any method can be used for introducing a recombinant vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell to be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 Japanese Unexamined Patent Publication No. 3]. No. 22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen) PcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, or pKANTEX93 (International Publication No. 97/10354).
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter. , Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • IE SV40 early promoter
  • a retroviral promoter e.g., a promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter.
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. 75, Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260.
  • mouse myeloma cell NSO mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • Syrian hamster cell BHK or HBT5637 Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector incorporating the DNA encoding CD40 obtained as described above is cultured in a medium, and the CD40 is produced and accumulated in the culture, By collecting from the culture, CD40 can be produced.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • CD40 When expressed in cells derived from eukaryotes, CD40 to which sugars or sugar chains are added can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122 , 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science, 122 , 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • a method for producing CD40 there are a method of producing it in a host cell, a method of producing it outside the host cell, or a method of producing it on the outer membrane of the host cell. Changing the host cell to be used and the structure of CD40 to be produced. Thus, an appropriate method can be selected.
  • CD40 When CD40 is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989)], Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)], and actively secreting CD40 out of the host cell by using the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-336963 or International Publication No. 94/23021. be able to.
  • the production amount of CD40 can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075).
  • the CD40 obtained can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells When CD40 is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then used with an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer, or a dynomill. The cells are disrupted to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) , Methods such as hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing To obtain a purified sample Door can be.
  • a solvent extraction method ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical)
  • CD40 When CD40 is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is collected and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble substance of CD40 as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble matter of CD40 is solubilized with a protein denaturant. After the solubilized solution is diluted or dialyzed to restore the CD40 to a normal three-dimensional structure, a purified polypeptide preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as CD40 or a modified sugar thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • CD40 used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • chemical chemistry is performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. It can also be synthesized.
  • (2) Immunization of animals and preparation of antibody-producing cells for fusion 3 to 20-week-old animals such as mice, rats or hamsters are immunized with the antigen obtained in (1), and the spleen, lymph nodes, Collect antibody-producing cells in peripheral blood.
  • CD40 knockout mice can be used as immunized animals when the immunogenicity is low and sufficient increase in antibody titer is not observed in the above animals.
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • (3) Preparation of myeloma cells As a myeloma cell, a cell line obtained from a mouse is used.
  • an 8-azaguanine resistant mouse BALB / c-derived myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3- U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1 / 1-Ag41 (NS-1) [European J. et al. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979)] or P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] or the like is used.
  • the myeloma cells are passaged in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine] and passaged to normal medium 3-4 days prior to cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine
  • the cells After loosening the precipitated cells, the cells are gently suspended in the HAT medium [normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin] to the antibody-producing cells for fusion. This suspension is cultured for 7-14 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • HAT medium normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing CD40 and does not react with an antigen not containing CD40 is selected by a hybridoma selection method such as a binding assay described later.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and a stable and strong antibody titer was observed.
  • One is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma SFM medium and cultured for 3 to 7 days. .
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the resulting supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Digo GF21 can also be added to the Hybridoma SFM medium.
  • the subclass of the antibody is determined by an enzyme immunoassay using a subcluster epiting kit. The amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm. (6) Selection of monoclonal antibody The monoclonal antibody is selected by a binding assay by the enzyme immunoassay shown below.
  • the antigen is obtained from a gene-transferred cell, a recombinant protein, or a human tissue obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding CD40 obtained in (1) into E. coli, yeast, insect cells, or animal cells. Purified polypeptide or partial peptide is used. When the antigen is a partial peptide, a conjugate with a carrier protein such as BSA or KLH is prepared and used.
  • a carrier protein such as BSA or KLH
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as the first antibody and allowed to react.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the immunogen is selected.
  • the monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody that binds to human CD40 of the present invention and binds to CD40 can be obtained by adding the test antibody to the above-described binding assay system and allowing it to react. That is, by screening for an antibody that inhibits the binding of a monoclonal antibody when a test antibody is added, a monoclonal antibody that competes with the acquired monoclonal antibody for binding to CD40 can be obtained.
  • the epitope that is recognized by the monoclonal antibody that binds to CD40 of the present invention and the antibody that binds to the same epitope are identified by identifying the epitope of the antibody obtained by the above-mentioned binding assay system, and a partial of the identified epitope. It can be obtained by preparing a synthetic peptide or a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of an epitope and immunizing it.
  • agonist activity can be measured by various assays. For example, as shown in the Examples, there is a method for measuring the promotion of CD95 expression by an anti-CD40 antibody using Ramos cells.
  • Production of Recombinant Antibody As an example of producing a recombinant antibody, a method for producing a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody is shown below.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which DNAs encoding human antibodies CH and CL are incorporated, and the expression vector for animal cells is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for DNA encoding CH and CL of human antibodies
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any animal cell expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody. For example, pAGE107 [Cytotechnol. , 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter and enhancer include the SV40 early promoter [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun. , 149, 960 (1987)], or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expressing a recombinant antibody of a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]
  • pKANTEX93 International Publication No.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • Recombinant phages or recombinant plasmids having cDNA encoding VH or VL are isolated from the library using DNA encoding the C region portion or V region portion of the mouse antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence.
  • non-human animal for producing a hybridoma cell producing a non-human antibody a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it can produce a hybridoma cell. .
  • RNA easy kit For preparation of total RNA from hybridoma cells, the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol. , 154, 3 (1987)], or a kit such as RNA easy kit (Qiagen).
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method For preparation of mRNA from total RNA, oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)], or OligoSurPK ⁇ 30 Use a kit such as (Takara Bio).
  • mRNA can be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP Express [Stratesies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ ZAPII (Stratagene), ⁇ gt11 DNA, gtgt10 Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), ⁇ ExCell, pT7T3-18U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983)], or pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • PCR method Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring 9 (ColdSpringLarbor 198) ), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)] can also be used to prepare cDNA encoding VH or VL.
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method.
  • a base sequence analysis method include the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], etc., and then ABI PRISM 3700 (manufactured by PE Biosystems) or A.I. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used.
  • the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and further, the subgroup to which they belong can be known.
  • amino acid sequences of CDRs of VH and VL, VH and VL amino acid sequences of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. It can be found by comparing with "Health and Human Services (1991)”.
  • VH and VL complete amino acid sequences for example, the BLAST method [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)] and the like, it can be confirmed whether the complete amino acid sequences of VH and VL are novel.
  • the non-human antibody VH or VL is upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody of the recombinant antibody expression vector obtained in (1), respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each of the encoded cDNAs.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid
  • VH and VL cDNAs designed to be appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1).
  • Each is cloned to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • a cDNA encoding the non-human antibody VH or VL is amplified by a PCR method using a synthetic DNA having a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at both ends, and the recombinant antibody expression vector obtained in (1) Can also be cloned.
  • Construction of cDNA encoding V region of human CDR-grafted antibody A cDNA encoding VH or VL of human CDR-grafted antibody can be constructed as follows.
  • the amino acid sequence of the VH or VL FR of the human antibody to be grafted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • the FR amino acid sequence of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, or the common amino acid sequence of each subgroup of FRs of human antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] are used.
  • an FR amino acid sequence having the highest homology (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of the VH or VL of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • Frequency of codon usage of the designed amino acid sequence in the base sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Considering “Health and Human Services (1991)”, the DNA sequence is converted into a DNA sequence, and the DNA sequence encoding the VH or VL amino acid sequence of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • the human CDR-grafted antibody VH can be easily added to the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1).
  • cDNA encoding VL can be cloned.
  • each H chain and L chain full-length synthetic DNA synthesized as one DNA based on the designed DNA sequence.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK ( ⁇ ) (Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired human CDR is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the VH or VL of the transplanted antibody is obtained.
  • Modification of V region amino acid sequence of human CDR-grafted antibody A human CDR-grafted antibody can be obtained by transplanting only non-human antibody VH and VL CDRs into human antibody VH and VL FRs. The binding activity is reduced compared to the original non-human antibody [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • amino acid residues that are directly involved in binding to the antigen amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and Decreased by maintaining the three-dimensional structure of the antibody, identifying amino acid residues indirectly involved in antigen binding, and substituting those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody Antigen binding activity can be increased.
  • the amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • cDNA encoding VL can be cloned, and a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends are introduced into the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1), and cloned so as to be expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody.
  • Transient expression of recombinant antibodies Transient expression of recombinant antibodies using the recombinant antibody expression vectors obtained in (3) and (6) or modified expression vectors
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced.
  • COS-7 cells American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] are used. Use [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991)].
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are measured by enzyme-linked immunosorbent assay [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Academic Press (1996), Antibodies-A-L Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like.
  • enzyme-linked immunosorbent assay enzyme-linked immunosorbent assay
  • (8) Obtaining a transformant that stably expresses the recombinant antibody and preparation of the recombinant antibody Introducing the recombinant antibody expression vector obtained in (3) and (6) into an appropriate host cell
  • a transformed strain that stably expresses the recombinant antibody can be obtained.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • DUkXB11 ATCC CCL-9096
  • Pro-5 ATCC CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice 20 also referred to as YB2 / 0
  • mouse myeloma cell NSO mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • mouse P3X63-Ag8.653 cell ATCC number: CRL1580
  • dihydrofolate reductase gene (Hereinafter referred to as dhfr) deficient CHO cells [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], lectin-resistant Lec13 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]
  • CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene International Publication No. 2005 / No. 035586, WO 02/31140
  • rat YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells (ATCC number: CRL1662) are used.
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) (Japan).
  • G418 sulfate hereinafter referred to as G418, (Japan).
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma-SFM medium ( Invitrogen) or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums.
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL301 medium manufactured by JRH
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium Invitrogen
  • a medium obtained by adding various additives such as FBS
  • the transformed strain can increase the expression level of the recombinant antibody using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891). 3. Purification of Monoclonal Antibody Recombinant antibodies are purified from the culture supernatant of transformed strains using a protein A-column [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Academic Press (1996), Antibiotics-Moratory Bio- Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. In addition, methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third]. edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. 4). Evaluation of activity of purified monoclonal antibody The activity of the purified monoclonal antibody of the present invention can be evaluated as follows.
  • the binding activity to the CD40-expressing cell line is measured using the binding assay described in 1- (6) above and the surface plasmon resonance method using the Biacore system. In addition, the fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • CDC activity or ADCC activity against an antigen-positive cultured cell line is measured by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • agonist activity can be measured by various assays. For example, as shown in the Examples, there is a method for measuring the promotion of CD95 expression by an anti-CD40 antibody using Ramos cells. 4).
  • Method for controlling effector activity of antibody As a method for controlling the effector activity of the monoclonal antibody of the present invention, it exists at the reducing end of the N-linked complex sugar chain that binds to the 297th asparagine (Asn) of the Fc region of the antibody.
  • Effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody.
  • Antibody-dependent cytotoxic activity ADCC activity
  • complement-dependent cytotoxic activity CDC activity
  • macrophages macrophages
  • dendritic cells Antibody-dependent phagocytosis (antibody-dependent phagocytosis, ADP activity) such as phagocytic cells is known.
  • the antibody is expressed using CHO cells deficient in ⁇ 1,6-fucose transferase gene, An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • Antibodies without fucose binding have high ADCC activity.
  • the antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced.
  • an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower ADCC activity than an antibody to which fucose is not bound.
  • ADCC activity and CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody. Since ADCC and CDC activities are known to vary in activity depending on the antibody subclass, ADCC and CDC activities can be reduced by subclass conversion. For example, among human IgG subclasses, IgG4 is known as a subclass with low ADCC and CDC activity, IgG2 has CDC activity, but ADCC activity is low, and IgG1 has both ADCC and CDC activity. (Charles A. Janeway et. Al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd / Garland u Publishing Inc.). By taking advantage of this feature, an antibody with less cytotoxic activity can be obtained by selecting a specific subclass. In addition, an antibody having a desired activity can be produced by combining a specific subclass of antibody with a point mutation.
  • Glu233-Ser239, Gly316-Lys338, Lys274-Arg301, Tyr407-Arg416, Asn297, Glu318, Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, Ala327-Ile332 are related to IgG and Fc.
  • ADCC activity can be reduced by introducing mutations in this region. Specifically, the ability to bind to FcR can be reduced by replacing L235 with E.
  • an antibody with controlled effector activity of an antibody can be obtained by combining the above point mutations and using it for one antibody.
  • the anti-CD40 antibody having agonist activity can be used as a therapeutic agent for various diseases by having the ability to activate immunity. Therefore, is there no ADCC activity and CDC activity leading to cell death of CD40-expressing cells involved in the activation? Alternatively, it is considered preferable to be reduced. If the CD40-expressing cells are damaged by ADCC activity or CDC activity, there is a possibility that the immunosuppressed state is opposite to the expected immune activation, which may lead to exacerbation of the disease. 5).
  • Method for Treating Disease Using Anti-CD40 Monoclonal Antibody of the Present Invention The monoclonal antibody of the present invention can be used for the treatment of malignant tumors or infectious diseases.
  • the therapeutic agent containing the monoclonal antibody of the present invention may contain only the antibody as an active ingredient, but it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and formulated. Provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the art.
  • the administration route includes oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, and the administration form includes spray, capsule, tablet, powder, granule Agents, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous
  • the administration form includes spray, capsule, tablet, powder, granule Agents, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • Suitable formulations for oral administration are emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, or granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories or sprays.
  • Injection is manufactured using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and in which the monoclonal antibody of the present invention is dispersed as fine particles to facilitate absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • the diagnosis of cancer which is one of the diseases associated with CD40, can be performed by detecting or measuring CD40 as follows, for example.
  • Diagnosis can be made by detecting CD40 expressed in cancer cells in a patient using an immunological technique such as a flow cytometer.
  • the immunological technique is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance labeled immunoassay method for example, a radioactive substance labeled immunoassay method, an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method or a physicochemical method is used.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method includes, for example, reacting the antigen of the present invention with an antigen or cells expressing the antigen, and further reacting with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment, followed by a scintillation counter, etc. Measure with
  • the enzyme immunoassay is performed, for example, by reacting the antibody of the present invention with an antigen or cells expressing the antigen, and further reacting with a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment, and then adding a coloring dye to an absorptiometer. Measure with for example, a sandwich ELISA method is used.
  • a label used in the enzyme immunoassay an enzyme label known in the art [Enzyme Immunoassay, Medical Shoin (1987)] can be used. For example, alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting a second antibody with the trapped antigen.
  • two types of antibodies or antibody fragments that recognize an antigen to be detected or measured and that have different antigen recognition sites are prepared, of which the first antibody or antibody fragment is pre-plated (for example, 96 Next, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction according to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments recognizing different epitopes, or a combination of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • the fluorescence immunoassay is described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay a fluorescent label known in the art [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] can be used.
  • FITC or RITC is used.
  • Luminescent immunoassay is performed by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, such as acridinium ester and lophine.
  • an antigen or cells expressing the antigen are fractionated with SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE [Antibodies- A Laboratory Manual Cold Spring Laboratory (1988)], and then the gel is polyvinylidene fluoride (PVDF).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PAGE Polyvinylidene fluoride
  • Cells and tissues expressing CD40 are lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1 to 10% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) at room temperature for 30 minutes to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • Tween-PBS PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20
  • Tween-PBS peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was washed at room temperature. React for 2 hours.
  • CD40 is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham).
  • ECL Western Blotting Detection Reagents manufactured by Amersham.
  • an antibody used for detection by Western blotting an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding CD40 as an antigen and the monoclonal antibody of the present invention, and detecting the aggregate.
  • a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, or a latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical testing method, Kanbara Publishing (1998)] can be used as a physicochemical method.
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration in the test sample is measured.
  • a known immunological detection method for detection or measurement of cells expressing CD40, a known immunological detection method can be used.
  • immunoprecipitation method immune cell staining method, immunohistochemical staining method, fluorescent antibody staining method, etc. Is used.
  • CD40-expressing cells and the like are reacted with the monoclonal antibody of the present invention, and then a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to precipitate the antigen-antibody complex. .
  • a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to precipitate the antigen-antibody complex.
  • the following method can be used.
  • the above-described monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the antibody When the antibody is in an unpurified state, such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein-G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant is dispensed and bound. Next, after discarding the BSA-PBS and thoroughly washing with PBS, a lysate of cells or tissues expressing CD40 is reacted. Immunoprecipitates are extracted from the well-washed plate with SDS-PAGE sample buffer and detected by Western blotting as described above.
  • an unpurified state such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein-G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant
  • the immune cell staining method or the immunohistochemical staining method is a method in which cells or tissues expressing an antigen are treated with a surfactant or methanol to improve the passage of the antibody in some cases, and then reacted with the monoclonal antibody of the present invention. And then reacting with a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or a biotin label, or an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof, then the label is visualized and microscopically observed .
  • a fluorescent antibody staining method [Monoclonal Antibodies-Principles and Practices, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha, Inc. Fick (1987)].
  • antibodies that bind to the extracellular region of CD40 can detect cells that are expressed while retaining the natural three-dimensional structure by fluorescent antibody staining.
  • the formed antibody-antigen complex and the free that is not involved in the formation of the antibody-antigen complex can be measured without separating the antibody or antigen.
  • IgG2-AAS (341) antibody (1) DNA sequence of heavy chain (SEQ ID NO: 1) ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT
  • an antibody produced by hybridoma KM341-1-19 (Accession No. BP-7759) (hereinafter referred to as 341-1-19 antibody)
  • a DNA fragment containing the heavy chain variable region DNA (SEQ ID NO: 3) and a light chain variable region DNA (SEQ ID NO: 13) were prepared.
  • a DNA fragment containing the DNA (SEQ ID NO: 23) of 21.4.1 (hereinafter referred to as 21.4.1 antibody) heavy chain variable region, And a DNA fragment containing the light chain variable region DNA (SEQ ID NO: 27).
  • DNA coding for IgG2 (SEQ ID NO: 29) in which valine at position 234 is replaced with alanine, glutamine at position 237 is replaced with alanine, and proline at position 331 is replaced with serine (numbers are based on EU index by Kabat et al.)
  • a DNA fragment containing DNA to which the stop codon TGA was added (hereinafter referred to as IgG2-AAS / DNA) was prepared and placed in an N5KG2-Val Lark vector (IDEC Pharmaceuticals: hereinafter abbreviated as N5KG2 vector) having an IgG2 constant region. .
  • DNA (hereinafter referred to as IgG2-S / DNA) in which a stop codon TGA is added to DNA (SEQ ID NO: 31) encoding IgG2 in which proline at position 331 is substituted with serine (the number is based on the EU index by Kabat et al.).
  • N5KG2-Val Lark vector was prepared by the method described in WO05 / 063981. That is, a DNA fragment containing IgG2-S / DNA was prepared, from which a DNA fragment containing IgG2-S / DNA was cleaved with NheI and BamHI and replaced with DNA encoding the IgG2 constant region of the N5KG2 vector.
  • This expression vector was named N5KG2 / P331S vector.
  • N5KG2 / V234A / G237A / P331S vector and N5KG2 / P331S vector were cleaved with BglII and BsiWI, respectively, to insert a DNA fragment containing the light chain variable region DNA of the above 341-1-19 antibody, followed by SalI
  • the expression vectors that were IgG2 (numbers are based on the EU index by Kabat et al.) Were completed (named N5KG2 / V234A / G237
  • N5KG2_V234A_G237A_P331S or N5KG2 _P331S vector was digested with BglII and BsiWI, and similarly, an expression vector into which a DNA fragment containing a 21.4.1 antibody light chain variable region DNA and a DNA fragment containing a heavy chain variable region DNA were inserted Were completed (named N5KG2 / V234A / G237A / P331S-21.4.1 vector and N5KG2 / P331S-21.4.1 vector, respectively).
  • Example 1 Expression and purification of antibody
  • the expression vector prepared in Example 1 was prepared with EndoFree Plasmid Kit (Qiagen), and the expression vector was suspended in free-floating 293 cells using FreeStyle TM 293 Expression System (Invitrogen Life Technology). Invitrogen Life Technology Co., Ltd.), and culture supernatants containing each antibody were obtained by transient expression.
  • the culture supernatant (approximately 500 ⁇ g as IgG) filtered through a 0.22 ⁇ m membrane filter (MILLIPORE) was charged into HiTrap rProtein A FF (column volume 1 mL) (Amersham Biosciences), an affinity column for antibody purification.
  • HiTrap rProtein A FF column volume 1 mL
  • the Ramos cell line was suspended in a staining buffer (SB) containing PBS containing 0.1% NaN3, 2 mM EDTA and 2% FCS at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cell suspension 100 ⁇ L / well) was dispensed into a 96-well round bottom plate (Becton Dickinson).
  • Purified antibody 50 ⁇ L was added and incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • a human IgG2 antibody against 2,4-dinitrophenol was used.
  • a purified antibody (50 ⁇ L) was added and incubated at ice temperature for 15 minutes.
  • Ramos cells were suspended in RPMI1640 medium (GIBCO Cat # 31800105) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen Cat # 10099-141) and seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well. . Purified antibody was added to a 96-well plate at 50 ⁇ L / well. After overnight culture at 5% CO 2 and 37 ° C., the cells were collected and analyzed using FACS using R-PE labeled anti-CD95 antibody (BD Pharmingen Cat # 555674) in the same manner as in Example 3.
  • IgG2-AAS (341) antibody or IgG2-S (341) antibody (1 mg / kg) was intravenously administered. Blood was collected from the vein before and after administration, and allowed to stand at room temperature for 20 to 60 minutes, centrifuged (room temperature, 3000 rpm, 15 minutes) to obtain serum, and stored in an ultra-low temperature freezer until measurement.
  • the serum drug concentration was measured by ELISA.
  • Human CD40-human Fc fusion protein diluted in Tris buffered saline (SIGMA Cat # T6664) to 1 ⁇ g / mL in each well of an immunoplate (Greiner Cat # 675097) (WO 02/088186 After adding 100 ⁇ L (prepared with reference to Example 1), it was incubated at 4 ° C. overnight. The solution in the well was discarded and the water was thoroughly removed. After adding 300 ⁇ L of Tris-buffered saline containing 1% BSA (SIGMA Cat # A7638), the mixture was incubated overnight at 4 ° C. Monkey serum was diluted 20-fold with Tris-buffered saline containing 1% BSA.
  • IgG2-AAS (341) antibody has a longer residence time in blood than IgG2-S (341) antibody (FIG. 3).
  • Fertilized eggs injected with DNA were transplanted into the oviducts of female mice in a pseudopregnant state to produce individuals.
  • the tail tip of the obtained individual was digested overnight with protease K / SDS, and then genomic DNA was prepared by phenol chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • genomic DNA was prepared by phenol chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • a part of the human CD40 gene region was amplified by PCR, and individuals having the human CD40 gene were selected.
  • Peripheral blood of this mouse was collected at 50 ⁇ L with a heparin-coated capillary, 10 ⁇ L of PE-labeled anti-human CD40 antibody (Beckman Coulter; IM1936U) was added and incubated at ice temperature for 15 minutes.
  • IgG2-AAS (341) antibody or IgG2-S (341) antibody was diluted with phosphate buffer and administered to the human CD40BAC transgenic mice (each with 4 antibodies) via tail vein (10 ⁇ g / head).
  • a 50 ⁇ g / mL solution was administered at 200 ⁇ L / head.
  • Blood was collected from the vein before administration and at 15, 24, and 39 hours after administration, and centrifuged (room temperature, 9000 rpm, 2 minutes) to obtain serum.
  • the obtained serum was stored in an ultra-low temperature freezer until measurement, and the serum was diluted 50-fold with phosphate buffer and described in the attached document using TA-LN Kainos (Kainos Cat # TDR5100).
  • AST and ALT were measured by the method described. As a result, it was confirmed that the IgG2-AAS (341) antibody had lower concentrations of AST and ALT than the IgG2-S (341) antibody (FIGS. 4A and 4B).
  • Antiproliferative activity of antibodies against tumor cells T24 cell line is RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen Cat # 10099-141) at 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL. Cat # 31800105) and seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well.
  • the IgG2-AAS (341) antibody prepared in Example 2 was diluted, added to a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, and cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. for 3 days.
  • IgG2-AAS (341) antibody heavy chain DNA sequence (SEQ ID NO: 1) ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA AGAGCACAGT GGCTGGGAGGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCA
  • Amino acid sequence of heavy chain variable region of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 4)
  • QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR
  • QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN
  • QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSS
  • Amino acid sequence of heavy chain variable region CDR1 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 6) SNSATWN
  • DNA sequence of heavy chain variable region CDR2 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 7) AGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGT
  • DNA sequence of heavy chain variable region CDR3 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 9) GCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT C
  • Amino acid sequence of heavy chain variable region CDR3 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 10) AQWLGGDYP YYYSMDV
  • Amino acid sequence of the light chain of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 12) MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGGGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK VDIKRTVAAP SVFIFPPSDE QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
  • DNA sequence of light chain CDR1 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 15) A GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CC
  • DNA sequence of light chain CDR2 of IgG2-AAS (341) antibody (SEQ ID NO: 17) GAT GCATCCAACA GGGCCACT
  • DNA sequence of heavy chain of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 21) ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC CCACTCCCAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG
  • Amino acid sequence of heavy chain of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 22) MDWTWRILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAS
  • DNA sequence of heavy chain variable region of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 23) CAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCA
  • DNA sequence of the light chain of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 25) ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GGTTCCCAGG TTCCAGATGC GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA GGGACCAAGG TGGATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TC
  • Amino acid sequence of the light chain of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 26) MRLPAQLLGL LLLWFPGSRC DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
  • DNA sequence of light chain variable region of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 27) GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA GGGACCAAGG TGGATCAA ACGT
  • Amino acid sequence of light chain variable region of IgG2-AAS (21.4.1) antibody (SEQ ID NO: 28) DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG GTKVEIKR
  • DNA sequence of the heavy chain constant region of the IgG2-S (341) antibody (SEQ ID NO: 31) GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG CCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC TTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCA CCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTC
  • IgG2 allotype 1 ASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
  • the present invention relates to a heavy chain constant that is an IgG2 in which at least 234th valine is substituted with alanine, 237th glutamine with alanine, and 331th proline with serine (numbers are based on EU index by Kabat et al.).
  • a monoclonal antibody that binds to human CD40 having a region, agonist activity, DNA encoding the monoclonal antibody, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, and the transformant A method for producing the monoclonal antibody to be used, a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody, and a therapeutic agent can be provided.

Abstract

　本発明は、アゴニスト活性を有するヒトCD40に結合するモノクローナル抗体、すなわち少なくとも234位のバリンがアラニン、237位のグルタミンがアラニン、および331位のプロリンがセリンに置換(数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく)されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有するヒトCD40に結合するモノクローナル抗体を提供する。

Description

アミノ酸変異が導入されたIgG2を有する抗体
　本発明は、アゴニスト活性を有する、少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である重鎖定常領域を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該モノクローナル抗体の製造方法、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物および治療剤に関する。
１．CD40
　ＣＤ４０は分子量５０ｋＤａの細胞膜表面に存在する抗原であり、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ある種の癌細胞、胸腺上皮細胞などに発現している。ＣＤ４０はＢ細胞やＤＣの増殖、分化に重要な働きをしていることが知られている。ＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定され（非特許文献１、２）、アミノ酸配列の相同性から、ＣＤ４０は、低親和性ＮＧＦレセプターやＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０などが属しているＴＮＦレセプターファミリーの１つのメンバーとして考えられている。ヒトおよびマウスのＣＤ４０に対するリガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞に発現しているＩＩ型膜蛋白質であり、強力な活性化シグナルをヒトおよびマウスのＢ細胞に導入することも分かっている。
　また、DCにはＢ細胞よりも多くのＣＤ４０の発現が確認されており、重要な役割を担っていることが明らかとなっている。ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌと結合すると、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化、すなわちＣＤ８０（Ｂ７－１）やＣＤ８６（Ｂ７－２）などの補助刺激分子の発現、あるいはＩＬ－１２の産生が増強される（非特許文献３、４）。DCは強い抗原提示能を有し、強力なヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞活性化能を持っている。また、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔｈ細胞のＴｈ１又はＴｈ２細胞への分化をDCが制御していると考えられている。ミエロイド系樹状細胞である末梢血単球をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに培養してＣＤ４０Ｌにより成熟させた樹状細胞（ＤＣ１）はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ－１２産生能を有し、異系ｎａｉｖｅ Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を誘導する（すなわちＴｈ１への分化を促す）。この作用は抗ＩＬ－１２抗体により阻害されることから、ＩＬ－１２を介した反応と考えられる。一方リンパ組織Ｔ領域や、末梢血に存在するｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｔ細胞をＩＬ－３、ＣＤ４０Lとともに培養したリンパ球系樹状細胞（ＤＣ２）は、ＩＬ－１２産生能は有さず、そして異系ｎａｉｖｅ Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＬ－４産生Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ２への分化を促進することが示されている。Ｔｈ１細胞は細胞性免疫の活性化にかかわり、Ｔｈ２細胞は液性免疫能を高めると同時に細胞性免疫能の抑制に関与すると考えられている。Ｔｈ１細胞のヘルプで活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、細胞質内で増殖する病原体（多くのウイルス、リステリア菌、結核菌、およびトキソプラズマ原虫など）や腫瘍細胞を除去することができる。
　膜表面に発現したＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体が、Ｂ細胞に対していろいろな生物活性を示すことが示されてきた。CD40に対してアゴニスト活性を有するもの（アゴニスト抗体）と、アンタゴニスト活性を有するもの（アンタゴニスト抗体）に大別される。
２．アゴニスト抗体
　アゴニスト抗体の作用として、Ｂ細胞の活性化が知られている。たとえば、抗ＣＤ４０抗体が細胞接着を誘導する（非特許文献５、６）、細胞の大きさを増進する（非特許文献６、７）、抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ２０抗体またはｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒのみで活性化されたＢ細胞の分裂を誘導する（非特許文献８－１０）、ＩＬ４存在下でＢ細胞の分裂を誘導する（非特許文献７、１１）、ＩＬ－４刺激、Ｔ細胞除去培養細胞のＩｇＥ（非特許文献１２、１３）、ＩｇＧ、ＩｇＭ（非特許文献１３）の発現を誘導する、ＩＬ－４によるＢ細胞からの可溶性ＣＤ２３／ＦｃｅＲＩＩの分泌と（非特許文献１４、１５）細胞上の発現増強（非特許文献１６）をする、ＩＬ－６の生産を促進する（非特許文献１７）ことが報告されている。　
　さらには、ＣＤｗ３２＋接着細胞存在下で、ＩＬ－４及び抗ＣＤ４０抗体を添加することにより、ヒト初代培養Ｂ細胞から、Ｂ細胞クローンを樹立することや（非特許文献１８）、胚中心の中心細胞のアポトーシスが、抗原レセプターの働きにかかわらず、ＣＤ４０を介して阻害されること（非特許文献１９）が報告されている。以上のようにＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定されたため、単離された抗体の多くは、主にヒトＢ細胞に対する増殖分化誘導機能、癌細胞における細胞死誘導活性を指標に評価されてきた（非特許文献２０、２１、２２）。
　また、抗ＣＤ４０抗体がＤＣを成熟させることが示されている（非特許文献２３）。さらに、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞プライミングにおけるＣＤ４Ｔ細胞の役割は、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌシグナリングを介したＤＣの活性化にあることが報告され、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体により、ＤＣの活性化におけるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の役割を代替できることが示されている（非特許文献２４）。また、マウスにおいて抗ＣＤ４０抗体の投与によりＣＤ４０を発現する腫瘍細胞のみならず非発現腫瘍細胞からも生体を防御可能であることが示された（非特許文献２５）。
　上述した機能に基づき、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ４０抗体は、細菌、ウイルスなどに起因するの感染症の治療、悪性腫瘍の治療等に使用しうるものと考えられている。
　特許文献１にはアゴニスト活性を有する抗ＣＤ４０抗体としてＫＭ３４１－１－１９抗体が開示されている。ＫＭ３４１－１－１９抗体を産生するハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９は２００１年９月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）。特許文献２には、ＫＭ３４１－１－１９抗体の重鎖可変領域、および331位のプロリンがセリンに置換（このような置換をP331Sと表記する（以下同様）、数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく（非特許文献２６））されているIgG2である重鎖定常領域を有する、341G2Ser抗体が開示されている。
　特許文献３には、アゴニスト活性を有する抗CD40抗体21.4.1が開示されている。
３．アミノ酸の変異　
IgGのlower hinge領域233-239位（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）は、免疫グロブリンFcレセプターの一種であるFcγレセプターとの結合領域の１つであることが報告されている（非特許文献２７)。免疫グロブリンFcレセプターは、抗体を介した免疫応答に重要な役割を果たしている。具体的には、ファゴサイトーシスやＡＤＣＣ活性である（非特許文献２８、２９)。Fcγレセプターは、白血球表面に発現しており、FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16)の３つのクラスに分けられ、さらにFcγRIIはFcγRIIAおよびIIBに、FcγRIIIはIIIAおよびIIIBに分類される。
　IgG1のlower hinge領域をFcγレセプターを介した抗体のエフェクター機能活性が弱いサブクラスであるIgG2へ置換することで、Fcγレセプターへの結合が低下することが報告されている。具体的には、E233P, L234V, L235A, G236の欠損などである（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく（非特許文献３０－３３)）。上述の通り、IgG2をサブクラスとする抗体については、Fcγレセプターを介した抗体のエフェクター機能活性が弱いことが知られているが、V234AおよびG237A（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）の置換により、エフェクター細胞によるターゲット細胞の溶解を更に抑制することが可能であることが報告されている（非特許文献３４）。しかし、V234AおよびG237Aが抗CD40抗体のアゴニスト活性に及ぼす影響については開示がない。また、IgG2サブクラスのV234AおよびG237Aの置換が、抗CD40抗体の血中動態に及ぼす影響については開示がない。また更に、IgG2サブクラスのV234AおよびG237Aの置換が、抗CD40抗体の肝臓に及ぼす影響については開示がない。
　Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、Ｐ３２９（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）は、ヒトＩｇＧの補体活性化能に重要な役割を果たしていると考えられており、この部位を他のアミノ酸に置換することによって、ＣＤＣ活性を低減できる（非特許文献３５－４０）。具体的には、ＣＤＣ活性の低減は、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１をＡに置換することにより可能である。また、ＣＤＣ活性の低減は、Ｐ３３１をＳやＧに変換することによっても可能である。
国際公開第02/088186号明細書 国際公開第2005/063981号明細書 国際公開第03/040170号明細書
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　本発明の課題は、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該モノクローナル抗体の製造方法、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物および治療剤を提供することにある。
　上記課題を解決するべく研究を重ねた結果、本発明者らは、少なくとも234位のバリンがアラニン（V234A）に、237位のグルタミンがアラニン（G237A）に、および331位のプロリンがセリン（P331S）に置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2（以下、IgG2-AASと表記することがある）である重鎖定常領域を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体（以下、IgG2-AAS抗体と表記することがある）を作製し、本発明を完成するに至った。
　具体的には、本発明は以下の［１］から［２３］に関する。
[１]　少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
[２]　配列番号30で示される重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
[３]　配列番号6で示されるCDR1、配列番号8で示されるCDR2、および配列番号10で示されるCDR3を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号16で示されるCDR1、配列番号18で示されるCDR2、および配列番号20で示されるCDR3を有する軽鎖可変領域を有する、[１]または[２]のモノクローナル抗体。
[４]配列番号4で示される重鎖可変領域、および配列番号14で示される軽鎖可変領域を有する、[１]または[２]のモノクローナル抗体。
[５]　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体の重鎖可変領域およびハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体の軽鎖可変領域を有する、[１]または[２]のモノクローナル抗体。
[６]　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体と競合する、[１]または[２]のモノクローナル抗体。
[７]　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体のヒトCD40上のエピトープの一部または全部に結合する、[１]または[２]のモノクローナル抗体。
[８]　[１]～[７]のいずれかのモノクローナル抗体をコードするDNA。
[９]　[８]のDNAを含有する組換えベクター。
[１０]　[９]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[１１]　[１０]の形質転換体を培地に培養し、培養物中に[１]～[７]のいずれかのモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする[１]～[７]のいずれかのモノクローナル抗体の製造方法。
[１２]　配列番号２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドである重鎖定常領域、および配列番号１２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドである軽鎖定常領域を有する、モノクローナル抗体。
[１３]　配列番号２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[１４]　配列番号１２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[１５]　配列番号２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNA、および配列番号１２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを有する組換ベクター。
[１６]　[１３]および[１４]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[１７]　[１５]の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[１８]　[１６]または[１７]の形質転換体を培地に培養し、培養物中に[１２]のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする[１２]のモノクローナル抗体の製造方法。
[１９]　[１]～[７]および[１２]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
[２０]　[１]～[７]および[１２]のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍または感染症の治療剤。
[２１]　悪性腫瘍または感染症の治療剤の製造のための[１]～[７]および[１２]のいずれかのモノクローナル抗体の使用。
[２２]　悪性腫瘍または感染症の治療のための[１]～[７]および[１２]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
[２３]　[１]～[７]および[１２]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、悪性腫瘍または感染症の治療方法。
　実施例でも示されるように、IgG2-AASである重鎖定常領域を有するヒトCD40に結合するモノクローナル抗体（IgG2-AAS抗体）は強いアゴニスト活性を示す。従って、本発明は、少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体と表記することがある）、該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該モノクローナル抗体の製造方法、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物および治療剤を提供することができる。また、実施例で示される通り、該モノクローナル抗体の一つであるIgG2-AAS(341)抗体は、IgG2-S(341)抗体に比べて、血中滞留時間が延長している。また更に、IgG2-AAS(341)抗体は、IgG2-S抗体に比べて、肝臓に対する毒性が低下している。
IgG2-AAS(341)抗体の結合活性を示す図である。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。IgG2-AAS(341)抗体の平均蛍光強度を●印と破線で、IgG2-S(341)抗体の平均蛍光強度を○印と実線で、陰性コントロール抗体の平均蛍光強度を＊印と点線でそれぞれ示す。 IgG2-AAS(21.4.1）抗体の結合活性を示す図である。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。IgG2-AAS(21.4.1)抗体の平均蛍光強度を●印と破線で、IgG2-S(21.4.1)抗体の平均蛍光強度を○印と実線で、陰性コントロール抗体の平均蛍光強度を＊印と点線でそれぞれ示す。 IgG2-AAS(341)抗体のアゴニスト活性を示す図である。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。IgG2-AAS(341)抗体の平均蛍光強度を●印と破線で、IgG2-S(341)抗体の平均蛍光強度を○印と実線で、陰性コントロール抗体の平均蛍光強度を＊印と点線でそれぞれ示す。 IgG2-AAS(21.4.1）抗体のアゴニスト活性を示す図である。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。IgG2-AAS(21.4.1)抗体の平均蛍光強度を●印と破線で、IgG2-S(21.4.1)抗体の平均蛍光強度を○印と実線で、陰性コントロール抗体の平均蛍光強度を＊印と点線でそれぞれ示す。 IgG2-AAS(341)抗体の血中濃度を示す図である。横軸は投与後時間(日)、縦軸は血中薬物濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。IgG2-AAS(341)抗体の血中濃度を○印と実線、および▲印と実線で、IgG2-S(341)抗体の血中濃度を■印と実線、および△印と実線で、それぞれ示す。 ASTの血中濃度を示す図である。横軸は投与後時間(時間)、縦軸は活性値（カルメン単位）を示す。IgG2-AAS(341)抗体投与時のASTを●印と破線で、IgG2-S(341)抗体投与時のASTを○印と実線で、ＰＢＳ投与時のASTを＊印と点線でそれぞれ示す。 ALTの血中濃度を示す図である。横軸は投与後時間(時間)、縦軸は活性値（カルメン単位）を示す。IgG2-AAS(341)抗体投与時のALTを●印と破線で、IgG2-S(341)抗体投与時のALTを○印と実線で、ＰＢＳ投与時のALTを＊印と点線でそれぞれ示す。
　本発明は、アゴニスト活性を示す、IgG2-AASである重鎖定常領域を有するヒトCD40に結合するモノクローナル抗体に関する。
　本発明の抗体は、ヒトCD40の細胞外領域に結合する。
　本発明の抗体が、ＣＤ４０に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたＣＤ４０を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法により確認することができる。例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，　３６，　３７３　（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法があげられる。また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，　講談社サイエンティフィック　（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　ＣＤ４０を発現した細胞としては、該ＣＤ４０を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、または遺伝子組換え技術により得られた細胞などがあげられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞としては、自己免疫疾患患者、アレルギー患者および癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該ＣＤ４０が発現している細胞などがあげられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から得られた該ＣＤ４０を発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ＣＤ４０を発現している細胞株があげられ、例えば、ヒトから樹立された細胞株であるRamos（ATCC CRL-1596）、Raji（ATCC CCL-86）、Daudi（ATCC CCL-213）およびT24（ATCC HTB-4）などがあげられる。
　遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該ＣＤ４０をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該ＣＤ４０を発現した細胞などがあげられる。ヒトCD40のDNAおよびタンパク質の配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの公知のデータベースから取得することができ、それぞれ、配列番号３６で示される塩基配列（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＭ＿００１２５０）、配列番号３７で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＰ＿００１２４１）として登録されている。本発明において、特段の説明がない場合には、CD40はヒトCD40のことを意味している。
　本発明においてモノクローナル抗体としては、例えば抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識する。さらにモノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。
　本発明においては、モノクローナル抗体は、2本の重鎖（重鎖可変領域および重鎖定常領域からなる）および2本の軽鎖（軽鎖可変領域および軽鎖定常領域からなる）からなる。
　エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などがあげられる。本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープは、好ましくはＣＤ４０の細胞外領域に存在する。
本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。CDRとは、ヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ）の略称であり、以下ＣＤＲと表記することがある。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
　ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記することがある）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記することがある）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記することがある）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記することがある）とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ＣＤ４０を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＤ４０を特異的に認識するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記することがある）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体の重鎖定常領域のクラスにはIgA、IgM、IgEおよびIgGが存在し、IgGのサブクラスにはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が存在する。IgG2には複数のアロタイプが存在し（例えば、配列番号３３、３４および３５が挙げられ、以下それぞれアロタイプ１、２および３とする、NCBI Reference SequencesにおけるAAN76042.1、CAC12842およびAAN76043.1参照。）、本発明のモノクローナル抗体は何れのアイソタイプでもよい。ヒト抗体の軽鎖定常領域のクラスにはκおよびλが存在し、本発明のモノクローナル抗体の軽鎖定常領域は、何れのものでもよい。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，２０００Ｖｏ１９７：７２２）。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
　本発明における、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体は、IgG2-AASである重鎖定常領域を有する。本発明者らは、実施例に示すとおり、IgG2-AAS抗体は、331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2（以下、IgG2-Sと表記することがある）である重鎖定常領域を有する抗体（以下、IgG2-S抗体と表記することがある）に比べて、アゴニスト活性が増強するという効果を見出した。
また、実施例で示される通り、本発明のモノクローナル抗体の一つであるIgG2-AAS(341)抗体は、IgG2-S(341)抗体に比べて、血中滞留時間が延長するという効果を見出した。また更に、IgG2-AAS(341)抗体は、IgG2-S(341)抗体に比べて、肝臓に対する毒性が低下しているという効果を見出した。
CD40リガンドは肝臓に対して毒性を示すことが知られている（Journal of Clinical Oncology, 19(13), 3280-3287(2001)）が、同様にアゴニスト活性を示すCD40に結合するモノクローナル抗体も肝臓に対して毒性を示すことが知られている（American Journal of Pathology, 168(3), 786-795(2006)）。本発明におけるIgG2-AAS抗体は、IgG2-S抗体に比べてアゴニスト活性が増強しているにも関わらず、IgG2-S抗体に比べて肝臓に対する毒性が低下している。前記低下は、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ASTと表記することがある）あるいはアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、ALTと表記することがある）の血中濃度の低下で確認することが出来る。
　上述のモノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換および/または挿入され、かつ上述の抗体と同様な活性を有するモノクローナル抗体も、本発明のモノクローナル抗体に包含される。欠失、付加、置換および/または挿入の位置は、具体的には、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、さらには前記の重鎖および軽鎖可変領域におけるCDR1、CDR2またはCDR3、あるいはフレームワーク領域（FR）に存在する。
　欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１０，　６４８７　（１９８２）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７９，　６４０９　（１９８２）、Ｇｅｎｅ，　３４，　３１５　（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１３，　４４３１　（１９８５）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　８２，　４８８　（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、付加、置換および/または挿入できる程度の数である。例えば、IgG2-AASにおける234位のバリンからアラニンへの、237位のグルタミンからアラニンへの、および331位のプロリンがセリンへの置換以外に、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個（例えば、1個、2個、3個、４個または5個）である。
　従って、本発明において、IgG2-AASである重鎖定常領域においては、AASの置換以外にもアミノ酸が欠失、付加、置換および/または挿入されていることがあり、本発明におけるモノクローナル抗体は、そのような重鎖定常領域を有するモノクローナル抗体も包含する。
　上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、またはＬ－システインなどがあげられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン　
　本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、抗体などの蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における、抗体の誘導体は、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらにはモノクローナル抗体中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門，　地人書館　（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質または抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどがあげられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などがあげられる。
　低分子の薬剤としては、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤、あるいはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，　癌と化学療法社　（１９９６）］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、あるいはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，　医歯薬出版株式会社　（１９８２）］などがあげられる。抗癌剤としては、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、またはその誘導体、などがあげられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
　高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，　廣川書店　（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品，　廣川書店　（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などがあげられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミドなどがあげられる。
　蛋白質としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカインあるいは増殖因子、または毒素蛋白質などがあげられる。
　サイトカインあるいは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などがあげられる。毒素蛋白質としては、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどがあげられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体があげられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩ、またはＥｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などがあげられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としてはＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、またはＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、またはＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、またはＣＴＡＣＫなど）、またはこれらのケモカインの受容体があげられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ－１、またはこれらの受容体などがあげられる。
　蛋白質または抗体医薬との融合体は、モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合体を製造することができる。
　上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法に、あるいは検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があげられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、あるいはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、あるいはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、あるいはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などがあげられる。　　
　また、本発明は、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物および治療剤に関する。疾患としては、アゴニスト活性を有する抗CD40抗体が治療上有効である限りは限定されないが、上述の通りアゴニスト活性を有する抗CD40抗体は細胞性免疫および液性免疫を誘導することから、感染症（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、リステリア菌、結核菌、マラリア原虫またはトキソプラズマ原虫に起因）および悪性腫瘍が挙げられる。悪性腫瘍中の癌細胞自体がCD40を発現している場合には、アゴニスト抗CD40抗体による該細胞へのアポトーシスを誘導によっても悪性腫瘍の治療が可能である。悪性腫瘍としては、例えば、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、咽頭癌、中皮腫、乳癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮癌または卵巣癌が挙げられる。
　本発明の治療剤は、上述した本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有する。
　本発明の抗体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内あるいは静脈内などの非経口投与があげられ、好ましくは静脈内投与をあげられる。
　投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、またはテープ剤などがあげられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　さらに、本発明は、ＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する、ＣＤ４０の免疫学的検出または測定方法、ＣＤ４０の免疫学的検出用または測定用試薬、ＣＤ４０が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法、およびＣＤ４０陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。
　本発明においてＣＤ４０の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法があげられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などがあげられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などがあげられる。
　本発明のモノクローナル抗体を用いてＣＤ４０が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ４０が関連する疾患を診断することができる。
　該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、または免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。
　本発明においてＣＤ４０を検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、または培養液など、ＣＤ４０が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のモノクローナル抗体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などがあげられる。検出用試薬としては、該モノクローナル抗体を認識する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬があげられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
　１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるＣＤ４０またはＣＤ４０を発現させた細胞は、ＣＤ４０全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＣＤ４０を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＣＤ４０を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＣＤ４０の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるＣＤ４０は、例えば以下の方法により、該ＣＤ４０をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ＣＤ４０をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＤ４０をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ＣＤ４０をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＣＤ４０の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　４８，　６６９　（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２　（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７２，　２３９２　（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などがあげられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、またはＴ７プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、または大腸菌ＤＨ５αなどがあげられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）、Ｇｅｎｅ，　１７，　１０７　（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１６８，　１１１　（１９７９）］があげられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７　［日本国特開平３－２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３　（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，　３２９，　８４０　（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１０１，　１３０７　（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号明細書）などがあげられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターあるいはエンハンサーがあげられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　１０８，　９４５　（１９５８）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　６０　，　１２７５　（１９６８）；　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　５５，　５１３　（１９６８）；　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，　４１，　１２９　（１９７３）；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１８，　１１５　（１９９６）；　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１４８，　２６０　（１９９７）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４２１６　（１９８０）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　６０，　１２７５　（１９６８）；　Ｃｅｌｌ，　６，　１２１　（１９７５）；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ｉ，　ＩＩ　（ｐｐ．　８８３－９００）；）、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１　（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｃａｔ　＃　１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）、などがあげられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３　（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８４，　７４１３　（１９８７）］などがあげられる。
　以上のようにして得られるＣＤ４０をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＣＤ４０を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＣＤ４０を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたＣＤ４０を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，　１９９，　５１９　（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１２２，　５０１　（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　８，　３９６　（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．，　７３，　１　（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などがあげられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＣＤ４０をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）］を用いることができる。
　ＣＤ４０の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるＣＤ４０の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ＣＤ４０が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６４，　１７６１９　（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８６，　８２２７　（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，　４，　１２８８　（１９９０）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号明細書などに記載の方法を用いることにより、ＣＤ４０を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＣＤ４０の生産量を上昇させることもできる。
　得られたＣＤ４０は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ＣＤ４０が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ＣＤ４０が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＣＤ４０の不溶体を回収する。回収した該ＣＤ４０の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＣＤ４０を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ＣＤ４０またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＣＤ４０またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＣＤ４０は、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＣＤ４０ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１８，　１　（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　６，　５１１　（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ，　２７６，　２６９　（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１２３，　１５４８　（１９７９）］、またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５　（１９７５）］などが用いられる。
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＣＤ４０を含む抗原に反応し、ＣＤ４０を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラムまたはプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイにより行う。
　抗原としては、（１）で得られるＣＤ４０をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、あるいは動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチドあるいは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡまたはＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
　抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　本発明のヒトＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体と競合してＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインティングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＣＤ４０への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
　更に、本発明のＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
　本発明において、アゴニスト活性は種々のアッセイにて測定可能である。例えば、実施例に示すとおり、Ramos細胞を用いた抗CD40抗体によるCD95発現促進を測定する方法が挙げられる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）　遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　３，　１３３　（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０１，　１３０７　（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，　２７，　２２３　（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７８，　１５２７　（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　４，　１７３　（１９９０）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１３，　７９　（１９９３）］などを用いる。動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０１，　１３０７　（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１４９，　９６０　（１９８７）〕、または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，　４１，　４７９　（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，　３３，　７１７　（１９８３）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１６７，　２７１　（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号明細書）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　１７，　５５９　（１９９８）］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨあるいはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨあるいはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、またはラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３　（１９８７）］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７）］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、あるいはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　５，　５８　（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１７，　９４９４　（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｉ，　４９　（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　３，　２８０　（１９８３）］、またはｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］などを用いる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　５，　８１　（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　３９，　４４０　（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２２，　７７８　（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１６６，　１　（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１６，　１１８　（１９６６）］、またはＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，　３８，　２７５　（１９８５）］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７）］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
　決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３　（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
　また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
　または、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，　９，　２６６　（１９９１）］。ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１１２，　５３５　（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　７，　１５０１　（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，　２８３　（１９９１）］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ　（１９９１）］、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８４，　７４１３　（１９８７）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，　講談社サイエンティフィック　（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３　（１９９０）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１　（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｃａｔ　＃　１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４２１６　（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１２，　５５　（１９８６）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号明細書、国際公開第０２／３１１４０号明細書）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
３．モノクローナル抗体の精製
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０　（１９７０）］、またはウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
４．精製モノクローナル抗体の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ＣＤ４０発現細胞株に対する結合活性は、前述の１－（６）記載のバインディングアッセイおよびＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，　３６，　３７３　（１９９３）］などを用いて測定できる。
　抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，　３６，　３７３　（１９９３）］により測定する。
　本発明において、アゴニスト活性は種々のアッセイにて測定可能である。例えば、実施例に示すとおり、Ramos細胞を用いた抗CD40抗体によるCD95発現促進を測定する方法が挙げられる。
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα-１,６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号明細書、国際公開第２００２／３１１４０号明細書、国際公開第００/６１７３９号明細書）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
　抗体のFｃのN結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のFｃに結合しているN結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。一方、抗体のＦｃに結合しているN結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。ＡＤＣＣ，ＣＤＣ活性は、抗体のサブクラスによって活性が異なることが知られているため、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の低減はサブクラスの変換によって可能であると考えられる。たとえば、一般的にヒトＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ４はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性が低いサブクラスとして知られており、ＩｇＧ２はＣＤＣ活性はあるが、ＡＤＣＣ活性は低く、ＩｇＧ１はＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の両方とも高いことが報告されている（Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．）。この特徴を生かし、特定のサブクラスを選択することにより細胞障害活性の少ない抗体にすることができる。また、特定のサブクラスの抗体と、点変異の組み合わせによって、目的の活性をもつ抗体を作ることができる。
　先に述べた、(i)IgG2サブクラスへのV234AおよびG237A（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）の置換（Michael, S., et.al., J.Immunol., 1997, 159: 3613）、および(ii)Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１のＡへの置換、あるいはＰ３３１のＳまたはＧへの置換（Ｅｓｏｈｅ Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１６４：４１７８－４１８４，Ｙｕａｎｙｕａｎ Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：３４６９－３４７４，Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：２５４２，Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５，８６：３１９，Ｌｕｎｄ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７：４９６３，Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３，１７８：６６１）以外にも、例えば以下が挙げられる。Ｇｌｕ２３３－Ｓｅｒ２３９、Ｇｌｙ３１６－Ｌｙｓ３３８、Ｌｙｓ２７４－Ａｒｇ３０１、Ｔｙｒ４０７－Ａｒｇ４１６、Ａｓｎ２９７、Ｇｌｕ３１８、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２はＩｇＧとＦｃＲの結合に関与していると考えられており（Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２，５６３－５６４、Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｅｉｋｅｎ，Ｈ．，Ｔａｍｍ，Ａ．，ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｅ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６，２３１－２４８、Ｇａｖｉｎ，Ａ．，Ｈｕｌｅｔｔ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．（１９９８）ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１１－３５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｓａｕｔｅｓ，Ｃ．（１９９７）ｉｎ Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，ａｎｄ Ｓａｕｔｅｓ，Ｃ．，ｅｄｓ），ｐｐ．２９－６６，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ、Ｄａ’ｒｏｎ，Ｍ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２０３－２３４、Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，１４８３－１４９１、Ｃｈａｐｐｅｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｓｅｎｍａｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｍ．，Ｘｕ，Ｙ．－Ｙ．，Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｈ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，９０３６－９０４０、Ｗｏｏｆ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，３１９－３３０、Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，ａｎｄ Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５３１３－５３１８）、この領域に変異を導入することにより、ＡＤＣＣ活性の低減が可能であると考えられる。具体的にはＬ２３５をＥに置換することにより、ＦｃＲとの結合能を低減させることは可能である。
　更に、上述の点変異を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
　アゴニスト活性を有する抗ＣＤ４０抗体は、免疫を活性化する能力を有することで各種疾患の治療剤に使用できるので、該活性化に関与するＣＤ４０発現細胞の細胞死に繋がるＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が無いかもしくは軽減されていることが好ましいと考えられる。仮に、ＡＤＣＣ活性あるいはＣＤＣ活性によってＣＤ４０発現細胞が障害を受けてしまった場合、期待する免疫活性化とは反対の免疫抑制状態になる可能性が考えられ、疾患の増悪をもたらす可能性ある。
５．本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を用いた疾患の治療方法
　本発明のモノクローナル抗体は、悪性腫瘍または感染症の治療に使用することができる。
　本発明のモノクローナル抗体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路には、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内あるいは静脈内などの非経口投与があげられ、投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、またはテープ剤などがあげられる。
　経口投与に適当な製剤は、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などである。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールあるいは果糖などの糖類、ポリエチレングリコールあるいはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油あるいは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバーあるいはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖あるいはマンニトールなどの賦形剤、デンプンあるいはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムあるいはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースあるいはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤または噴霧剤などである。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
５．本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法
　本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ４０またはＣＤ４０が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ４０が関連する疾患を診断することができる。
　ＣＤ４０が関連する疾患の一つである癌の診断は、例えば、以下のようにＣＤ４０の検出または測定して行うことができる。
　患者体内の癌細胞に発現しているＣＤ４０をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法，　医学書院　（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，　講談社サイエンティフィック　（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法，　ソフトサイエンス社　（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、またはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２，　廣川書店　（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識があげられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどを用いる。
　ウェスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。CD40を発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、CD40を検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるＣＤ４０と本発明のモノクローナル抗体とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要，　金原出版　（１９９８）］などを用いることもできる。ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　一方、ＣＤ４０が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
　免疫沈降法は、ＣＤ４０を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン－Ａまたはプロテイン－ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＣＤ４０を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，　Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，　講談社サイエンティフィック　（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、本発明のモノクローナル抗体のうち、ＣＤ４０の細胞外領域に結合する抗体は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
　本発明のモノクローナル抗体の具体例を以下に挙げる（分泌シグナルの領域はSignalPver.3で予測している。また、CDRの領域はKabatらによるルールに基づいて決めている。）。
１．IgG2-AAS(341)抗体
（１）重鎖のDNA配列（配列番号１）
ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA
CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC
ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG
CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT
CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC
CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA
AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA
GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCG
CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC
TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC TGACCAGCGG CGTGCACACC
TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC
TCCAGCAACT TCGGCACCCA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC
AAGGTGGACA AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA
CCTGCAGCAG CACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC
TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCCGAGGTC
CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG
GAGCAGTTCA ACAGCACGTT CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG
CTGAACGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CTCCATCGAG
AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA
TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC
CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC
ACACCTCCCA TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC
AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC
AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AA
(i)分泌シグナル：１番目のＡ～６０番目のＡ
(ii)可変領域：６１番目のＣ～４４４番目のＡ
　・CDR1: １５１番目のＡ～１７１番目のＣ
　・CDR2: ２１４番目のＡ～２６７番目のＴ
　・CDR3: ３６４番目のＧ～４１１番目のＣ
(iii)定常領域：４４５番目のＧ～１４２２番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく234位：７８４番目のＧ～７８６番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく237位：７９０番目のＧ～７９２番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく331位：１０７２番目のＴ～１０７４番目のＣ
（２）重鎖のアミノ酸配列(配列番号２）
MSVSFLIFLP VLGLPWGVLS QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR
QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT
RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT
KVDKTVERKC CVECPPCPAP PAAAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV
QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPASIE
KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
(i)分泌シグナル：1番目のM～20番目のS
(ii)可変領域：21番目のQ～148番目のS
　・CDR1: ５１番目のＳ～５７番目のＮ
　・CDR2: ７２番目のＲ～８９番目のＳ
　・CDR3: １２２番目のＡ～１３７番目のＶ
(iii)定常領域：149番目のA～474番目のK
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく234位：２６２番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく237位：２６４番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく331位：３５８番目のＳ
（３）軽鎖のDNA配列（配列番号１１）
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA
GTGGATATCA AACGTACGGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG
CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG
GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC
ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA
GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG
CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGT
(i)分泌シグナル：１番目のＡ～６０番目のＡ
(ii)可変領域：６１番目のＧ～３７２番目のＡ
　・CDR1: １３０番目のＡ～１６２番目のＣ
　・CDR2: ２０８番目のＧ～２２８番目のＴ
　・CDR3: ３２５番目のＣ～３４２番目のＴ
(iii)定常領域：３７３番目のＣ～６９３番目のＴ
（４）軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK
VDIKRTVAAP SVFIFPPSDE QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV
TEQDSKDSTY SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C*
(i)分泌シグナル：１番目のＭ～２０番目のＧ
(ii)可変領域：２１番目のＥ～１２４番目のＫ
　・CDR1: ４４番目のＲ～５４番目のＡ
　・CDR2: ７０番目のＤ～７６番目のＴ
　・CDR3: １０９番目のＱ～１１４番目のＴ
(iii)定常領域：１２５番目のＲ～２３１番目のＣ
2．IgG2-AAS(21.4.1)抗体
（１）重鎖のDNA配列（配列番号２１）
ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC CCACTCCCAG
GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC
TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT
GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA
CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG
GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC
CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG
GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC
AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA
CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT
GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC
TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC
AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGCAGCA
GCACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC
CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC
TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC
AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC
AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG CCTCCATCGA GAAAACCATC
TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG
GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC
ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC
ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG
TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC
ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
(i)分泌シグナル：１番目のＡ～５７番目のＣ
(ii)可変領域：５８番目のＣ～４３５番目のＡ
(iii)定常領域：４３６番目のＧ～１４１３番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく234位：７７５番目のG～７７７番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく237位：７８１番目のG～７８３番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく331位：１０６３番目のT～１０６５番目のＣ
（２）重鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）
MDWTWRILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP
GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP
LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPASIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K*
(i)分泌シグナル：１番目のＭ～１９番目のＳ
(ii)可変領域：２０番目のＱ～１４５番目のＳ
(iii)定常領域：１４６番目のＡ～４７１番目のＫ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく234位：２５９番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく237位：２６１番目のＡ
　・ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく331位：３５５番目のＳ
（３）軽鎖のDNA配列（配列番号２５）
ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GGTTCCCAGG TTCCAGATGC
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC
ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA
AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT
GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA
GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA
TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT
CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG
GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC
CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT
(i)分泌シグナル：１番目のＡ～６０番目のＣ
(ii)可変領域：６１番目のＧ～３８４番目のＴ
(iii)定常領域：３８５番目のＡ～７０２番目のＴ
（４）軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）
MRLPAQLLGL LLLWFPGSRC DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP
GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC*
(i)分泌シグナル：１番目のＭ～２０番目のＣ
(ii)可変領域：２１番目のＤ～１２８番目のＲ
(iii)定常領域：１２９番目のＴ～２３４番目のＣ
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
　発現ベクターの作製　国際公開第02/088186号明細書に記載の抗CD40抗体のうち、ハイブリドーマKM341-1-19（受託番号BP-7759）が産生する抗体（以下、３４１－１－１９抗体）の重鎖可変領域のDNA（配列番号3）を含むDNA断片、および軽鎖可変領域のDNA（配列番号13）を含むDNA断片をそれぞれ作製した。
　同様にして、国際公開第03/040170号明細書に記載の抗CD40抗体のうち、21.4.1（以下、21.4.1抗体）の重鎖可変領域のDNA（配列番号23）を含むDNA断片、および軽鎖可変領域のDNA（配列番号27）を含むDNA断片をそれぞれ作製した。
　234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2をコードするDNA（配列番号29）に終止コドンTGAを加えたDNA（以下、IgG2-AAS/DNA）を含むDNA断片を作製し、それをIgG2定常領域を有するN5KG2-Val Larkベクター（IDEC Pharmaceuticals社:以下N5KG2ベクターと略記）に入れた。即ち上記のDNA断片からIgG2-AAS/DNAを含むDNA断片をNheI, BamHIで切断しN5KG2ベクターのIgG2定常領域をコードするDNAと置き換えた。この発現ベクターをN5KG2/V234A/G237A/P331Sベクターと名づけた。また、331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2をコードするDNA（配列番号３１）に終止コドンTGAを加えたDNA （以下、IgG2-S/DNA）を含むN5KG2-Val Larkベクターは国際公開第05/063981号明細書に記載の方法で作製した。即ち、IgG2-S/DNAを含むDNA断片を作製し、そこからIgG2-S/DNAを含むDNA断片をNheI, BamHIで切断しN5KG2ベクターのIgG2定常領域をコードするDNAと置き換えた。この発現ベクターをN5KG2/P331Sベクターと名づけた。
　このN5KG2/V234A/G237A/P331SベクターおよびN5KG2/P331Sベクターを、それぞれBglIIおよびBsiWIで切断して上記の341-1-19抗体の軽鎖可変領域のDNAを含むDNA断片を挿入し、その後にSalI、NheIで切断して上記の341-1-19抗体の重鎖可変領域のDNAを含むDNA断片を挿入し、最終的に341-1-19抗体の可変領域を有し、かつ重鎖定常領域が234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2または331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である発現ベクターを完成させた（それぞれ、N5KG2/V234A/G237A/P331S-341ベクターおよびN5KG2/P331S-341ベクターと名づけた）。
　また、N5KG2_V234A_G237A_P331SまたはN5KG2 _P331SベクターをBglII、BsiWIで消化し、同様にして、21.4.1抗体の軽鎖可変領域のDNAを含むDNA断片および重鎖可変領域のDNAを含むDNA断片を挿入した発現ベクターを完成させた（それぞれ、N5KG2/V234A/G237A/P331S-21.4.1ベクターおよびN5KG2/P331S-21.4.1ベクターと名づけた）。
　抗体の発現および精製
　実施例１で作製した発現ベクターをEndoFree Plasmid Kit（キアゲン社）にて調製
し、FreeStyleTM 293 Expression System（インビトロジェンライフテクノロジー社）を
用いて、当該発現ベクターを浮遊性293細胞（インビトロジェンライフテクノロジー社）に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清を得た。孔径0.22μmのメンブランフィルター（MILLIPORE製）で濾過した培養上清（IgGとして約500μg）を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein A FF（カラム体積１mL）（アマシャムバイオサイエンス社）にチャージし、PBS(-)で洗浄後20mMクエン酸バッファー（pH3.4）により溶出し、200mMリン酸バッファー（pH7.0）を含むチューブに回収した。N5KG2/V234A/G237A/P331S-341ベクター、N5KG2/P331S-341ベクター、N5KG2/V234A/G237A/P331S-21.4.1ベクター、およびN5KG2/P331S-21.4.1ベクターを有する細胞から得られた抗体を、それぞれIgG2-AAS(341)抗体、IgG2-S(341)抗体、IgG2-AAS(21.4.1)抗体、およびIgG2-S(21.4.1) 抗体と命名した。
　抗体の結合活性
　実施例２で作製したIgG2-AAS(341)抗体、IgG2-S(341)抗体、IgG2-AAS(21.4.1)抗体、およびIgG2-S(21.4.1) 抗体がヒトCD40に結合するかどうか調べるために、ヒトCD40を発現するRamos細胞（ATCC CRL-1596）への結合活性を測定した。
　2×106個/mLの濃度でRamos細胞株を0.1%NaN3、2mMEDTA、2%FCS含有PBSの染色バッファー（SB）に浮遊させた。細胞浮遊液（100μL／ウェル）を96-well丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。精製抗体（50μL）を加え、氷温下30分間インキュベートした。陰性コントロールとして2,4-dinitrophenolに対するヒトIgG2抗体を用い、同様に精製抗体（50μL）添加後氷温下15分間インキュベートした。SBで洗浄した後、250倍希釈したR-PE蛍光標識抗ヒト抗体(Southern Biotechnology社)50μLを加え、氷温下15分間インキュベートした。SBで２回洗浄した後、300～500μLのFACS緩衝液に懸濁し、FACS（FACScaliver、ベクトンディッキンソン社）で各細胞の蛍光強度(MFI)を測定した。
　その結果、何れの抗体もヒトCD40に結合することを確認した(図１Aおよび図１B)。
　抗体のアゴニスト活性
　KM341－1－19抗体および21.4.1抗体はいずれもアゴニスト抗体として知られている。そこで、重鎖定常領域の相違によるアゴニスト活性への影響を調べた。Ramos細胞において、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。そこで、CD40リガンドの代わりに抗体を添加することにより、当該抗体のCD95の発現を指標に、当該抗体のアゴニスト活性を評価した。
　1.0×106個/mLのRamos細胞を10%ウシ胎児血清（Invitrogen社 Cat#10099-141）を含むRPMI1640培地（GIBCO社 Cat# 31800105）に懸濁し、96ウエルプレートに50μL/wellで播種した。精製抗体を、96ウエルプレートに50μL/well添加した。5%CO2, 37℃で一晩培養後、細胞を集めR-PE標識抗CD95抗体（BD Pharmingen社 Cat# 555674）を用い、実施例３と同様にしてFACSを使って解析した。
　その結果、IgG2-AAS(341)抗体およびIgG2-AAS(21.4.1)抗体いずれについても、比較対象のIgG2-S(341)抗体およびおよびIgG2-S(21.4.1)抗体よりも強いアゴニスト活性を有していた（図２A、図２B）。
　抗体の血中滞留時間
　実施例２で作製したIgG2-AAS(341)抗体、およびIgG2-S(341)抗体の生体内での血中滞留時間を調べるために、カニクイザルへの静脈投与を行い、血清中の薬物濃度を経時的に測定した。
　IgG2-AAS(341)抗体またはIgG2-S(341)抗体（1 mg/kg）を静脈投与した。投与前および投与後に静脈から採血し、室温で20 ～ 60分間静置後，遠心分離（室温，3000 rpm，15分間）して血清を得、測定までの期間、超低温フリーザーで保存した。
　血清中の薬物濃度はELISA法にて測定した。イムノプレート（Greiner社 Cat#675097）の各ウェルにトリス緩衝生理食塩水（SIGMA社Cat#T6664）で1μg/mLに希釈したヒトCD40-ヒトFc 融合タンパク質（国際公開第02/088186号明細書の実施例１を参考に作製した）100 μLを添加後、4℃にて一晩インキュベーションした。ウェル内の溶液を捨て、水分をよく取り除いた。1%BSA（SIGMA社 Cat#A7638）を含むトリス緩衝生理食塩水300 μLを添加後、4℃にて一晩インキュベーションした。1%BSAを含むトリス緩衝生理食塩水で、サル血清を20倍希釈した。ウェル内の溶液を捨て、水分をよく取り除き、各ウェルに上記の希釈血清 100 μLを添加後、4℃にて一晩インキュベーションした。各ウェルを0.1%Tween20,0.5mol/L NaClを含むトリス緩衝生理食塩水300 μLにて5回洗浄し、水分をよく取り除いた。1%BSAを含むトリス緩衝生理食塩水で、Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG-Biotin（株式会社免疫生物研究所 Cat#17249）を20 ng/mLに希釈し、100 μLを各ウェルに添加後、室温にて約2時間静置した。50 mmol/L Tris-HCl（pH7.6）5mLにStreptavidine-ABComplex/AP （DACO社 Cat#K0391）付属のreagentA及びreagentBを1滴ずつ添加した後、30分以上冷暗所で静置した。この溶液をSample diluent Bufferで51倍希釈した。各ウェルを0.1%Tween20,0.5mol/L NaClを含むトリス緩衝生理食塩水300 μLにて5回洗浄し、水分をよく取り除いた。各ウェルに上記のStreptavidine-ABComplex/AP 希釈液100 μLを添加後、室温にて約1時間静置いた。各ウェルを0.1%Tween20,0.5mol/L NaClを含むトリス緩衝生理食塩水300 μLにて5回洗浄し、水分をよく取り除いた。Lumi-phos 530（和光純薬工業株式会社Cat#537-24662）を0.1%ジエタノールアミン(和光純薬工業株式会社　Cat#093-03115)、1mmol/L MgCl2および0.02%NaN3を含む水溶液（pH10）で２倍に希釈し、100 μLを各ウェルに添加した。プレートシェーカーで約15秒混合した後、30℃にて20分間インキュベーションした。化学発光強度を測定し、抗体の濃度を決定した。尚、測定中はプレートリーダーの温度を30℃にセットした。
　その結果、IgG2-AAS(341)抗体はIgG2-S(341)抗体よりも血中滞留時間が延長することを確認した(図３)。
　抗体投与後の血液生化学パラメーター
　実施例２で作製したIgG2-AAS(341)抗体、およびIgG2-S(341)抗体が、投与された個体の血液生化学パラメーターに与える影響を調べるために、ヒトCD40BACトランスジェニックマウスへの静脈投与を行い、血清中の抗体濃度を経時的に測定した。
　まず、ヒトCD40BACトランスジェニックマウスを作製した。ヒトCD40遺伝子を含む環状BAC (bacterial artificial chromosome)クローンを陰イオン交換カラム(MACHEREY-NAGEL社; #740579 )により精製し、そのDNA 溶液をC57BL/6J Jclマウス（日本クレア）の受精卵前核にマイクロインジェクションした。DNAを注入した受精卵は偽妊娠状態にした雌マウスの卵管に移植することにより個体を作出した。得られた個体の尾先端部をプロテアーゼK/SDSで一晩消化した後、ゲノムDNAをフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿で調製した。得られたゲノムDNAを鋳型にヒトCD40遺伝子領域の一部をPCRで増幅させ、ヒトCD40遺伝子を持つ個体を選別した。本マウスの末梢血をヘパリンコートキャピラリーで50μL採取し、PE標識抗ヒトCD40抗体 (Beckman Coulter;IM1936U)を10μL添加し氷温下15分間インキュベートした。その後FACS Lysing Solution (BD)で溶血・固定させ、FACS（FACScalibur、ベクトンディッキンソン社）で蛍光を測定した。その結果、通常CD40が発現することが知られているB細胞、単核球、血小板にヒトCD40が発現していることを確認した。
　次いで、IgG2-AAS(341)抗体またはIgG2-S(341)抗体をリン酸緩衝液で希釈し、ヒトCD40BACトランスジェニックマウス（それぞれの抗体いついて4匹ずつ）に尾静脈投与した（10μg/head (50μg/mLの溶液を200μL/head投与)。投与前，投与後15, 24, 39時間のポイントで静脈から採血した。遠心分離（室温，9000 rpm，2分間）して血清を得た。得られた血清は、測定までの期間、超低温フリーザーで保存した。血清はリン酸緩衝液にて50倍に希釈し、TA-LNカイノス（カイノス社 Cat#TDR5100）を用いて、添付書類に記載された方法で、ASTおよびALTを測定した。
　その結果、IgG2-AAS(341)抗体はIgG2-S(341)抗体よりも、ASTおよびALTの濃度が低下することを確認した(図４A、図４B)。
　抗体の腫瘍細胞に対する増殖抑制活性
　T24細胞株（ATCC #HTB-4）は、1.0×105個/mLとなるように10%ウシ胎児血清（Invitrogen Cat#10099-141）を含むRPMI1640培地（GIBCO Cat# 31800105）で調整し、96ウエルプレートに50μL/wellで播種した。実施例２で作製したIgG2-AAS(341)抗体を希釈し、96ウエルプレートに50μL/well添加し、5%CO2, 37℃で3日間培養した。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega Cat#G7570）を100μL/well加え、室温で10分間静置した。SpectraMax M5で発光シグナルを測定し、抗体を添加しなかった場合の生存細胞数を100%としたときの各濃度での生存細胞数の割合を計算した。その結果、IgG2-AAS(341)抗体は濃度依存的にT24細胞の増殖を抑制することを確認した。
　以下に本発明の抗体の部分的DNAおよびアミノ酸配列を示す。
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖のDNA配列(配列番号１)
ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCCTGCCC GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA
CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC
ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG
CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT
CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC
CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA
AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA
GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCG
CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC
TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC TGACCAGCGG CGTGCACACC
TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC
TCCAGCAACT TCGGCACCCA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC
AAGGTGGACA AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA
CCTGCAGCAG CACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC
TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCCGAGGTC
CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG
GAGCAGTTCA ACAGCACGTT CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG
CTGAACGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CTCCATCGAG
AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA
TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC
CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC
ACACCTCCCA TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC
AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC
AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AA
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖のアミノ酸配列(配列番号２)
MSVSFLIFLP VLGLPWGVLS QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR
QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT
RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT
KVDKTVERKC CVECPPCPAP PAAAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV
QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPASIE
KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域のDNA配列(配列番号３)
CAGGTCCAAC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC
ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAGTG CTACTTGGAA CTGGATCAGG
CAGTCCCCAT CGAGAGACCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT
CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGTCGA ATAATCATCA ACCCAGACAC ATCCAACAAC
CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT CCCGAGGACA CGGCTATATA TTACTGTACA
AGAGCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT CTGGGGCCAA
GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCA
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号４)
QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSATWNWIR
QSPSRDLEWL GRTYYRSKWY RDYVGSVKSR IIINPDTSNN QFSLQLNSVT PEDTAIYYCT
RAQWLGGDYP YYYSMDVWGQ GTTVTVSS
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のDNA配列(配列番号５)
AGCAACAGTG CTACTTGGAA C
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列(配列番号６)
SNSATWN
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のDNA配列(配列番号７)
AGGACAT ACTACAGGTC CAAGTGGTAT CGTGATTATG TAGGATCTGT GAAAAGT
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列(配列番号８)
RTYYRSKWY RDYVGSVKS
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のDNA配列(配列番号９)
GCACAGT GGCTGGGAGG GGATTACCCC TACTACTACA GTATGGACGT C
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列(配列番号１０)
AQWLGGDYP YYYSMDV
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖のDNA配列(配列番号１１)
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA
GTGGATATCA AACGTACGGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG
CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG
GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC
ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA
GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG
CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGT
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号１２)
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK
VDIKRTVAAP SVFIFPPSDE QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV
TEQDSKDSTY SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列(配列番号１３)
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACA CTTTCGGCCC TGGGACCAAA
GTGGATATCA AA
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１４)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNTFGPGTK
VDIK
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のDNA配列(配列番号１５)
A GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CC
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列(配列番号１６)
RASQSVS SYLA
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のDNA配列(配列番号１７)
GAT GCATCCAACA GGGCCACT 
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列(配列番号１８)
D ASNRAT
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のDNA配列(配列番号１９)
CAGCAG CGTAGCAACA CT
IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列(配列番号２０)
QQ RSNT
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖のDNA配列(配列番号２１)
ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC CCACTCCCAG
GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC
TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT
GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA
CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG
GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC
CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG
GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC
AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA
CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT
GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC
TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC
AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGCAGCA
GCACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC
CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC
TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC
AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC
AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG CCTCCATCGA GAAAACCATC
TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG
GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC
ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC
ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG
TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC
ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAA
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖のアミノ酸配列(配列番号２２)
MDWTWRILFL VAAATGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP
GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP
LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPASIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のDNA配列(配列番号２３)
CAG
GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC
TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACCGGC TACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT
GGACAAGGGC TTGAgtGGAT GGGATGGATC AACCCTGACA GTGGTGGCAC AAACTATGCA
CAGAAGTTTC AGGGCAGGGT CACCATGACC AGGGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG
GAGCTGAACA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATCAGCCC
CTAGGATATT GTACTAATGG TGTATGCTCC TACTTTGACT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG
GTCACCGTCT CCTCA
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号２４)
Q VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTG YYMHWVRQAP
GQGLEWMGWI NPDSGGTNYA QKFQGRVTMT RDTSISTAYM ELNRLRSDDT AVYYCARDQP
LGYCTNGVCS YFDYWGQGTL VTVSS
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のDNA配列(配列番号２５)
ATGAGGCTCC CTGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GGTTCCCAGG TTCCAGATGC
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC
ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA
AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT
GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA
GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA
TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT
CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG
GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC
CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号２６)
MRLPAQLLGL LLLWFPGSRC DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP
GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列(配列番号２７)
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC
ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTTAC AGCTGGTTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA
GGGAAAGCCC CTAACCTCCT GATCTATACT GCATCCACTT TACAAAGTGG GGTCCCATCA
AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAACCT
GAAGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG GCTAACATTT TCCCGCTCAC TTTCGGCGGA
GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGT
IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号２８)
DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIY SWLAWYQQKP
GKAPNLLIYT ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ANIFPLTFGG
GTKVEIKR
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列(配列番号２９)
GCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCG
CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT CAAGGACTAC
TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC TGACCAGCGG CGTGCACACC
TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC
TCCAGCAACT TCGGCACCCA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC
AAGGTGGACA AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA
CCTGCAGCAG CACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC
TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCCGAGGTC
CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG
GAGCAGTTCA ACAGCACGTT CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG
CTGAACGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CTCCATCGAG
AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA
TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC
CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC
ACACCTCCCA TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC
AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC
AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AA
IgG2-AAS(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列番号３０)
ASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPAA APSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPASIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
IgG2-S(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列(配列番号３１)
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG
CCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC
TTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACC
TTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC
TCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCA
CCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTC
CAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAG
GAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGG
CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAG
AAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA
TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAC
CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA 
IgG2-S(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列番号３２)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT
KVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIE
KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG2アロタイプ１のアミノ酸配列(配列番号３３)
ASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
IgG2アロタイプ２のアミノ酸配列(配列番号３４)
ASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVTSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGMEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
IgG2アロタイプ３のアミノ酸配列(配列番号３５)
ASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE
PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYTCNV DHKPSNTKVD
KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN
WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI
SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
　なお、本出願は、２００９年４月２０日付けで出願された米国仮出願（米国仮出願第61/170,738号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
　本発明は、少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該モノクローナル抗体の製造方法、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物および治療剤を提供することができる。
配列番号１－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖のDNA配列
配列番号２－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域のDNA配列
配列番号４－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のDNA配列
配列番号６－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列
配列番号７－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のDNA配列
配列番号８－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列
配列番号９－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のDNA配列
配列番号１０－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列
配列番号１１－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖のDNA配列
配列番号１２－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列
配列番号１４－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のDNA配列
配列番号１６－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号１７－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のDNA配列
配列番号１８－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号１９－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のDNA配列
配列番号２０－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号２１－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖のDNA配列
配列番号２２－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２３－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のDNA配列
配列番号２４－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２５－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のDNA配列
配列番号２６－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２７－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のDNA配列
配列番号２８－人工配列の説明：IgG2-AAS(21.4.1)抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２９－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列
配列番号３０－人工配列の説明：IgG2-AAS(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号３１－人工配列の説明：IgG2-S(341)抗体の重鎖定常領域のDNA配列
配列番号３２－人工配列の説明：IgG2-S(341)抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列

Claims (20)

  1. 　少なくとも234位のバリンがアラニンに、237位のグルタミンがアラニンに、および331位のプロリンがセリンに置換（数字はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく）されているIgG2である重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
  2. 　配列番号30で示される重鎖定常領域を有する、アゴニスト活性を有する、ヒトCD40に結合するモノクローナル抗体。
  3. 　配列番号6で示されるCDR1、配列番号8で示されるCDR2、および配列番号10で示されるCDR3を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号16で示されるCDR1、配列番号18で示されるCDR2、および配列番号20で示されるCDR3を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  4. 　配列番号4で示される重鎖可変領域、および配列番号14で示される軽鎖可変領域を有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  5. 　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体の重鎖可変領域およびハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体の軽鎖可変領域を有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  6. 　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体と競合する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  7. 　ハイブリドーマＫＭ３４１－１－１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－７７５９）が産生する抗体のヒトCD40上のエピトープの一部または全部に結合する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードするDNA。
  9. 　請求項８に記載のDNAを含有する組換えベクター。
  10. 　請求項９に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  11. 　請求項１０に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
  12. 　配列番号２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチド、および配列番号１２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドを有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
  13. 　配列番号２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNA、および配列番号１２で示されるポリペプチドから分泌シグナルを除いたポリペプチドをコードするDNAを含有する組換ベクター。
  14. 　請求項１３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  15. 　請求項１４に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１２に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、該培養物から該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする請求項１２に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
  16. 　請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
  17. 　請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍または感染症の治療剤。
  18. 　悪性腫瘍または感染症の治療剤の製造のための請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
  19. 　悪性腫瘍または感染症の治療のための請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  20. 　請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、悪性腫瘍または感染症の治療方法。
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