WO2010090452A2 - 세포 내 전달능이 증가된 작은 간섭 rna 복합체 - Google Patents

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WO2010090452A2
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to siRNA complexes and multifunctional nucleic acid structure complexes with increased intracellular delivery capacity.
  • RNA interference is a very specific and efficient mechanism for inhibiting gene expression, which is composed of a sense having a sequence homologous to the mRNA of the gene of interest and an antisense having a sequence complementary to this.
  • the strand RNA (hereinafter referred to as "dsRNA”) is introduced into a cell to induce degradation of the target gene mRNA, thereby suppressing expression of the target gene.
  • RNAi technique has been studied for modifications to increase the activity and / or intracellular delivery efficiency, and is expected to be an effective therapeutic agent for the treatment of many diseases including cancer and viral infection in the future.
  • Many researchers have successfully suppressed virus replication using various RNAi techniques, such as small interfering RNA (siRNA) and short hairpin RNA (shRNA) (Jacque JM et al., Nature , 418: 435, 2002; Novina CD et al, Nat Med, 8:à 681, 2002; Nishitsuji H. et al, Microbes Infect, 6:76, 2004).
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • RNAi mechanism In the case of inhibiting expression of only one target gene by the RNAi mechanism, the virus may deviate from the RNAi-mediated gene expression suppression mechanism by substitution or deletion of one nucleotide of the target gene in the viral genome. (Westerhout EM et al., Nucleic Acids Res ., 33: 796, 2005). As such, one of the ways for minimizing virus deviation from gene expression suppression mechanism is to induce multiple RNAi mechanisms targeting various parts of the viral genome.
  • RNAi mechanism has been developed as a drug for cancer treatment.
  • RNAi can induce cell cycle arrest and induce apoptosis in cancer cells by targeting genes essential for tumor survival.
  • RNAi mechanisms have been developed primarily based on shRNA expression systems (Konstantinova P. et al., Gene Ther ., 13: 1403, 2006; ter Brake O. et al., Mol. Ther ., 14: 883, 2006; Watanabe T. et al., Gene Ther. , 13: 883, 2006).
  • Khaled et al. Also fabricated RNA nanostructures comprising multiple siRNAs based on the phi29 RNA backbone for nonviral siRNA delivery (Khaled A. et al., Nano Lett ., 5: 1797, 2005). Skeletal structures were too long to be synthesized chemically and had limited practical use. Accordingly, there has been a need for development of siRNA constructs with new structures that can be applied to multiple siRNAs and that can be chemically synthesized.
  • siRNA siRNA
  • the 21-base siRNA a known siRNA structure
  • PEI cationic polymers
  • the present inventors have made diligent efforts to provide new siRNA complexes capable of inhibiting the expression of a plurality of genes and having improved intracellular delivery ability.
  • a multi-siRNA and multifunctional nucleic acid constructs can be prepared with specific structures, and these are respectively cationic cell carriers. After forming a complex together, it was confirmed that the cells have significantly improved cell delivery ability while effectively inhibiting expression of a plurality of genes, and completed the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a multifunctional nucleic acid structure complex of a novel structure having improved intracellular delivery capacity.
  • the present invention provides an siRNA complex with increased intracellular delivery capacity, wherein a cationic cell transporter is coupled to multiple siRNAs in which three or more siRNAs are conjugated to each other at one end thereof.
  • the present invention also provides a method for intracellular delivery of siRNA, wherein the siRNA complex is introduced into a cell.
  • the present invention also relates to a compound having three or more functional groups, one end of each of three or more nucleic acid oligonucleotides selected from the group consisting of siRNA, miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer To provide a multifunctional nucleic acid construct.
  • the present invention also provides a multifunctional nucleic acid structure complex having increased intracellular delivery ability, in which a cationic cell transporter is bound to the multifunctional nucleic acid structure.
  • the present invention also provides a method for intracellular delivery of a multifunctional nucleic acid structure, wherein the multifunctional nucleic acid structure complex is introduced into a cell.
  • the present invention is also characterized by linking one end of a nucleic acid oligonucleotide selected from the group consisting of siRNA, miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer to a compound having three or more functional groups. It provides a method for producing a multifunctional nucleic acid construct.
  • the present invention also provides a method for preparing a multifunctional nucleic acid structural complex having increased intracellular delivery ability, comprising the following steps:
  • a multifunctional nucleic acid structure is prepared by connecting one end of a nucleic acid oligonucleotide selected from the group consisting of siRNA, miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer to a compound having three or more functional groups Doing;
  • the present invention also provides a composition for inhibiting gene expression containing the siRNA complex.
  • the present invention also provides a use for inhibiting gene expression of the siRNA complex.
  • the present invention also provides a method for inhibiting gene expression, wherein the siRNA complex is introduced into a cell.
  • the present invention also provides an anticancer composition containing the siRNA complex.
  • the present invention also provides an anticancer use of the siRNA complex.
  • the present invention also provides a method for inhibiting or treating cancer, wherein the siRNA complex is introduced into a cell.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting gene expression containing the multifunctional nucleic acid structure complex.
  • the present invention also provides a use for inhibiting gene expression of the multifunctional nucleic acid structure complex.
  • the present invention also provides a method for inhibiting gene expression, wherein the multifunctional nucleic acid structure complex is introduced into a cell.
  • the present invention also provides an anticancer composition containing the multifunctional nucleic acid structure complex.
  • the present invention also provides an anticancer use of the multifunctional nucleic acid structure complex.
  • the present invention also provides a method for inhibiting or treating cancer, wherein the multifunctional nucleic acid structure complex is introduced into a cell.
  • the present invention also provides a kit for inhibiting gene expression comprising the composition for inhibiting gene expression.
  • the present invention also provides the use of the siRNA complex or the multifunctional nucleic acid structure complex as a viral therapeutic agent.
  • tsiRNA which is a multiple siRNA of a multisiRNA complex according to the present invention, and the gene inhibitory activity of the siRNA complex according to the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the gene inhibitory activity when combined with multiple siRNA according to the invention PEI (a), when combined with Lipofectamine2000 (b).
  • Figure 3 is a photograph of the FITC-labeled siRNA mixture (siLamin, siDBP, FITC-siTIG3) and FITC-labeled tsiRNA (FITC-tsiRNA) were combined with PEI and introduced into HeLa cells, followed by fluorescence microscopy.
  • FIG. 4 shows multiple siRNA (tsiRNA-CVA) structures (a) according to the invention targeting different sites of the CVA24 genome and three siRNA mixtures targeting each of these sites using PEI and three It is a graph comparing relative luciferase activity after introduction into cells with each luciferase vector including different viral sequences.
  • 5 is a result of performing 5 ′ RACE analysis to determine whether the siRNA structure according to the present invention inhibits gene expression by the same RNAi mechanism as the conventional 19 + 2 siRNA.
  • FIG. 6 shows that the siRNA structure according to the present invention causes a nonspecific antiviral response, and after introducing the siRNA mixture and tsiRNA in combination with PEI, the level of induction of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) is determined by RT-. It is a comparative graph measured by the PCR method.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • T-tiSurvivin Trebler tsiSurvivin
  • siSurvivin and long siSurvivin used as a control of Trebler tsiSurvivin.
  • FIG. 9 is a graph showing the gene expression efficiency of T-tiSurvivin-PEI transporter.
  • T-tiRNA structure (a) and gene expression inhibition efficiency prepared by binding siSurvivin, siIntegrin and si ⁇ -catenin to Trebler phosphoramidite.
  • Figure 11 is a graph (b) showing the MT-tiRNA structure (a) and gene expression inhibition efficiency prepared by binding Anti-miR21, siIntegrin and si ⁇ -catenin to Trebler phosphoramidite.
  • Figure 13 is the electrophoresis result (a) to confirm the separation rate by HS of the T-tiSurvivin complex, and the fluorescent intensity was measured by using a flow cytometer (b) and a photograph measuring the intracellular delivery capacity using FITC The result is (c and d).
  • FIG. 14 is a graph (a) confirming the gene expression inhibition efficiency of the T-tiSurvivin complex, a graph (b) and a microscopic image (c) showing the effect of inhibiting HepG2 cell growth after introduction of the T-tiSurvivin complex.
  • FIG. 15 is a graph showing the expression level of IFITI mRNA (a), IFN- ⁇ mRNA (b) and OAS2 mRNA in T98G cells transfected with tiRNA complex.
  • 16 shows the results of electrophoresis of 27 bp dsRNA, siLamin, tsiRNA, siSurvivin and T-tiSurvivin before and after Dicer treatment.
  • 17 shows a structure in which some nucleotides of tsiRNA are chemically modified.
  • T-tiSurvivin is a structure chemically modified some nucleotides of T-tiSurvivin.
  • Figure 19 is the result of electrophoresis after Dicer treatment of tsiRNA (OMe) (a) and T-tiSurvivin (OMe) (b) having a chemical modification.
  • OMe 20 is a graph showing the gene expression inhibition efficiency of tsiRNA (OMe) (a) and T-tiSurvivin (OMe) (b) with chemical modification.
  • RNA small interfering RNA
  • dsRNA short double stranded RNA
  • the regulatory protein includes a transcription factor, a heat shock protein or a protein involved in DNA / RNA replication, transcription and / or translation.
  • the gene of interest to be suppressed expression is inherent in the viral genome and may be integrated into an animal gene or exist as an extrachromosomal component.
  • the gene of interest may be a gene on the HIV genome.
  • siRNA molecules are useful for inactivating translation of HIV genes in mammalian cells.
  • the “complex” of the multi-siRNA or multifunctional nucleic acid structure and the cationic cell transporter is a conjugate by an intercharge action, consisting of a strong interaction between the negative charge of the backbone of the multi-siRNA and the positive charge of the cationic cell transporter.
  • the present invention relates to an siRNA complex having increased intracellular delivery capacity, in which a cationic cell transporter is bound to multiple siRNAs in which three or more siRNAs are conjugated to each other at one end thereof.
  • the multi siRNA refers to a siRNA structure structured so that three or more siRNAs are conjugated to each other at one end thereof, and may be used by conjugating a plurality of siRNAs such as four different siRNAs, but expressing a plurality of target genes. In order to significantly increase the intracellular delivery capacity while inhibiting, preferably, a conjugated structure using three different siRNAs is used.
  • the multiple siRNA may have a structure in which the 5 'direction end of the antisense is directed toward the outside, and is joined to each other at the 3' direction end of the antisense, which is the other end. 1A shows a conjugation of siRNAs targeting three different genes of interest into the multiple siRNA structure of the present invention.
  • the siRNA may be characterized by including a chemical modification, the chemical modification is a hydroxyl group of the 2 'position of the ribose of at least one nucleotide included in the siRNA, for example, a hydrogen atom, a fluorine atom, It may be characterized by being substituted with any one of -O-alkyl group, -O-acyl group, and amino group.
  • the chemical modification is a hydroxyl group of the 2 'position of the ribose of at least one nucleotide included in the siRNA, for example, a hydrogen atom, a fluorine atom, It may be characterized by being substituted with any one of -O-alkyl group, -O-acyl group, and amino group.
  • the cationic cell transporter in the present invention is used to deliver a nucleic acid, i.e., siRNA, intracellularly in either in vitro or in vivo, and is a reagent for positively charged delivery.
  • Cationic cell carriers interact strongly with multiple siRNAs of the present invention to form complexes so that siRNAs can be efficiently introduced into cells.
  • Cationic cell carriers may be cationic polymers or cationic lipids, for example liposomes such as polyethyleneimine (PEI) or Lipofectamine 2000 (Invitrogen), but are not limited to positively charged delivery.
  • PEI polyethyleneimine
  • Invitrogen Lipofectamine 2000
  • each of three or more nucleic acid oligonucleotides selected from the group consisting of siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide (antagomiR), aptamer and ribozyme of the compound having three or more functional groups It relates to a multifunctional nucleic acid structure, one end of which is connected.
  • a multifunctional nucleic acid structure is a nucleic acid obtained by binding functional nucleic acid oligonucleotides such as siRNA, miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer to each functional group of a compound having three or more functional groups.
  • functional nucleic acid oligonucleotides such as siRNA, miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer to each functional group of a compound having three or more functional groups.
  • three or more nucleic acid oligonucleotides refers to three or more nucleic acid oligonucleotides of the same kind, or consist of two or three identical nucleic acid oligonucleotides and one or more different nucleic acid oligonucleotides, or all of different kinds.
  • nucleic acid oligonucleotides that is, it may be composed of only three or more siRNA as shown in Figure 7 and 10a, or may be composed of two siRNA and one antagomiR as shown in Figure 11a.
  • nucleic acid oligonucleotides may be prepared including chemical modifications, wherein the chemical modifications include, for example, a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group at the 2 'position of the ribose of at least one nucleotide included in the nucleic acid oligonucleotide. It may be characterized by being substituted with any one of -O-alkyl group, -O-acyl group, and amino group.
  • the multifunctional nucleic acid structure connects one end of a nucleic acid oligonucleotide selected from the group consisting of siRNA, miRNA, miRNA, antagomiR, antisense, antisense oligonucleotide, ribozyme and aptamer to a compound having three or more functional groups. It is prepared by linking a nucleic acid fragment to each functional group of the compound having three or more functional groups, and then complementary to the nucleic acid fragment by including a sequence capable of complementarily binding to the nucleic acid fragment in the nucleic acid oligonucleotide It can be characterized by connecting by making the coupling.
  • the compound having three or more functional groups may be, for example, phosphoramidite compound, iodineacetyl compound, maleimide compound, epoxide compound, thiol-disulfide Compounds, thiolated Elman reagent, NHS or sulfo-NHS compounds, isocyanate compounds and the like can be used, but are not limited to three or more siRNA or other functional nucleic acid oligonucleotides having three or more functional groups It will be apparent to those skilled in the art that the present invention can be used without limitation as long as it can be combined. In this case, the compound having three or more functional groups to be used may be linked with the oligonucleotides that are appropriately substituted with an amine or thiol.
  • siRNAs comprising sequences capable of complementarily binding to the nucleic acid fragments on one strand of the antisense may be prepared and linked by complementary binding to the nucleic acid fragments, thereby producing a multifunctional nucleic acid structure having a new structure.
  • “complementary binding” means that at least about 70-80%, preferably at least about 80-90%, and more preferably at least about 90% of the fragments included in the sense or antisense strand of the nucleic acid sequence and the siRNA. It is meant that at least 95% and even more preferably at least about 95% to 99% of the sequences can hybridize to each other complementarily or completely complementarily. However, a mismatch may be deliberately introduced in the connection part at an annealing possible level.
  • the present invention provides a multifunctional nucleic acid structure complex by binding a cationic cell transporter to the multifunctional nucleic acid structure according to the present invention by an intercharge action, and in another aspect, the present invention provides a cell in which a cationic cell transporter is bound.
  • the present invention relates to a multifunctional nucleic acid structure complex with increased resistance to delivery.
  • Cationic cell carriers may be cationic polymers or cationic lipids, for example liposomes such as polyethyleneimine (PEI) or Lipofectamine 2000 (Invitrogen), but are not limited to positively charged delivery.
  • PEI polyethyleneimine
  • Isolrogen Lipofectamine 2000
  • siRNA complexes according to the present invention and siRNA-cationic lipid complexes according to the conventional siRNA structure were introduced into cells to measure gene expression inhibition efficiency. It was confirmed that it suppresses the expression level of all target genes more efficiently as compared.
  • the siRNA complex according to the present invention is coupled to PEI to the conventional siRNA structure It was confirmed that the intracellular delivery activity is very good compared to that. That is, conventional siRNA is not suitable for binding to cationic lipids such as polyethyleneimine (PEI), and it was confirmed that the intracellular permeability is low (FIG. 3), but the multiple siRNA of the present invention is polyethylenimine ( It has been shown to exhibit very high intracellular delivery activity in combination with cationic cell transporters such as PEI).
  • PEI polyethyleneimine
  • the siRNA complex according to the present invention relates to a method for effectively delivering siRNA into a cell, which method comprises introducing the siRNA complex according to the present invention into a cell.
  • siRNA complexes according to the present invention in order to check whether the siRNA complex according to the present invention can be used in the same category as the use of a general RNAi mechanism, by performing a mechanism analysis experiment in contrast to the conventional siRNA structure, according to the present invention It was confirmed that the multiple siRNA structures of the siRNA complexes inhibit gene expression by the same RNAi mechanism as the conventional 19 + 2 siRNA structure. This means that siRNA complexes according to the invention can be used in the same category as the use of conventional RNAi.
  • the present invention provides cationic cells in multiple siRNAs in which three or more siRNAs are conjugated to each other at one end thereof. It relates to a composition for inhibiting gene expression containing a complex to which the carrier is bound.
  • the present invention is a gene in the form of a multifunctional nucleic acid structure complex in which a cationic cell transporter is coupled to a multifunctional nucleic acid structure in which three or more siRNAs are linked to each other using a compound having three or more functional groups at each end thereof. It is possible to provide a composition for inhibiting expression.
  • the multifunctional nucleic acid structure complex according to the present invention not only has a remarkable gene expression inhibitory effect like a multisiRNA complex, but also has a functional nucleic acid oligonucleotide such as miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, aptamer and ribozyme in addition to siRNA.
  • a nucleic acid structure having a multi-function can provide a nucleic acid structure having a multi-function by combining the oride.
  • siRNAs which require a specific structure and require the conjugation of double-stranded RNAs such as siRNAs
  • a compound having three or more functional groups is used to form a basic backbone having short oligonucleotides.
  • the multi-siRNA complex has a very high immune sensitivity to dsRNA treatment Unlike some of the non-specific immune responses in T98G cells, it was confirmed that the multifunctional nucleic acid structural complexes did not cause these immune responses.
  • the resistance to Dicer was tested to confirm that the multifunctional nucleic acid structure complex showed higher resistance.
  • kits for inhibiting gene expression may take the form of bottles, tubs, sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc., which may be partially or wholly plastic, glass, paper, foil, It may be formed from a wax or the like.
  • the container may be equipped with a fully or partially separable stopper, which may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the container may also be equipped with a stopper, which may be accessible to the contents by a needle.
  • the kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
  • the present invention relates to a method for inhibiting gene expression using the composition for inhibiting gene expression. will be.
  • the complex according to the present invention has the effect of inhibiting the proliferation of cancer cells, the present invention in another aspect the anti-cancer containing the multisiRNA complex or multifunctional nucleic acid structure complex To the composition.
  • the anticancer composition according to the present invention may be provided as a pharmaceutical composition including the complex alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents, wherein the complex may be a disease and its severity, age of the patient, It may be included in the pharmaceutical composition in an appropriate pharmaceutically effective amount depending on body weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment.
  • “pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like when administered to a human.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives.
  • Pharmaceutical compositions of the invention can also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of sterile injectable solutions and the like.
  • the following examples illustrate only the Lamin A / C, DBP, TIG3, Survivin gene and CVA24 virus genome as target genes, but the complexes and compositions according to the present invention are targeted to other target genes.
  • the same result can be obtained even if provided, and it is possible to provide a multifunctional nucleic acid structure according to the present invention by using a functional nucleic acid oligonucleotide other than AntimiR-21 used in the following Examples. It will be obvious to those with ordinary knowledge in the field.
  • siRNAs used in the present examples and siRNAs to be used in the experiment were provided by purchasing chemically synthesized RNAs from Bioneer, and then annealing according to the manufacturer's protocol.
  • tsiRNA triple-target gene silencing siRNA targeting lamin A / C, DBP and TIG3 mRNA was prepared as shown in FIG. 1A.
  • Three strands for providing the tsiRNA are as follows.
  • siRNAs for each of the three sites used as controls are as follows.
  • SiRNA for lamin mRNA SiLamin
  • Antisense 5'-UGUUCUUCUGGAAGUCCAG (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 5)
  • SiRNA for DBP mRNA siDBP
  • Antisense 5'-UGAGAAGCGAUGUCUUCGA (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 7)
  • SiRNA for TIG3 mRNA siTIG3
  • Antisense 5'-UAGAGAACGCCUGAGACAG (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Polyethylenimine (PEI, Polyplus) was added to the tsiRNA obtained above according to the manufacturer's protocol to prepare an siRNA complex according to the present invention.
  • tsiRNA triple-target gene silencing siRNA
  • PEI triple-target gene silencing siRNA
  • tsiRNA triple-target gene silencing siRNA
  • PEI triple-target gene silencing siRNA
  • Lamin A / C, DBP and TIG3 mRNA prepared in Example 1 and Example 1 SiLamin, siDBP and siTIG3, which are the conventional siRNA constructs of the complexes with PEI, were introduced into HeLa cells (ATCC CCL-2), respectively.
  • HeLa cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (Hyclone) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), cells were plated in 12-well plates and confluency in antibiotic-free medium before introduction. ) Was incubated for 24 hours until it became 80%.
  • siRNA mixture was used for each 100nM
  • tsiRNA was also used for 100nM
  • the mRNA levels of Lamin, DBP and TIG3 were measured by RT-PCR at 30 minutes, 1 hour, and 3 hours after the introduction, respectively. As shown in FIGS. 1B to 1D, According to the siRNA complex (tsiRNA) shows better gene suppression activity.
  • siRNA complexes prepared by adding Lipofectamine2000 (Invitrogen) to the siRNA complexes (TsiRNA) obtained in Example 1 and the tsiRNA obtained in Example 1 according to the manufacturer's protocol, respectively, were prepared in the same manner as described above. MRNA levels were measured by RT-PCR 24 hours after introduction into HeLa cells (ATCC CCL-2).
  • siRNA complex according to the present invention is more effective in inhibiting the expression of three different genes as compared to the case of treating the conventional siRNA structure by combining a cationic cell carrier such as PEI or Lipofectamine2000.
  • Example 3 Measurement of intracellular delivery capacity of siRNA complexes according to the present invention
  • siRNA complex In order to compare the intracellular delivery ability of the siRNA complex and the conventional siRNA (siTIG3) according to the present invention, the following experiment was performed.
  • FITC was labeled at the 3 'end of the sense strand of siTIG3 and the 3' end of the TIG3 sense of tsiRNA.
  • FITC labeled siRNA mixtures siLamin, siDBP, FITC-siTIG3
  • FITC-tsiRNA FITC labeled tsiRNA
  • siRNA complex according to the present invention is very excellent in intracellular delivery activity compared to the PEI bound to the conventional siRNA structure.
  • the siRNA complex according to the present invention is first selected from the virus genome (coxsackievirus A24: CVA24). 4A (tsiRNA-CVA) was prepared to target different sites of dogs (CRE, 3D1, 3D2).
  • Three strands for providing the tsiRNA-CVA are as follows.
  • siRNAs for each of the three sites used as controls are as follows.
  • SiRNA for CVA-CRE mRNA siRNA for CVA-CRE mRNA
  • Antisense 5'-UCAAUACGGUGUUUGCUCU (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 22)
  • SiRNA for CVA-3D1 mRNA siRNA for CVA-3D1 mRNA (siCVA-3D1)
  • SiRNA for CVA-3D2 mRNA siCVA-3D2
  • Antisense 5'-UUGUCAGCUGGAGUCAUGG (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 26)
  • the target sequence for siCVA-CRE, the target sequence for siCVA-3D1, and the target sequence for siCVA-3D2 were respectively expressed in the 3 'untranslated region of the luciferase mRNA coding gene of the pMIR Report-luciferase vector (Ambion).
  • Vectors pMIR-CRE, pMIR-3D1, and pMIR-3D2 inserted at the SpeII and HindIII positions were constructed. Each inserted target sequence is as follows.
  • siRNA mixture siCVA-CRE, siCVA-3D1, siCVA-3D2
  • a complex of PEI or a complex of tsiRNA-CVA and PEI and HeLa cells was measured as follows. That is, 24 hours after introduction, cells were eluted with a Passive lysis buffer of Dual-luciferase Reorter Assay System (Promega). Luciferase activity was measured using a Victor3 plate reader (PerkinElmer) for Drosophila and Renilla luciferase.
  • siRNA complex according to the present invention exhibits much lower luciferase activity, compared with the introduction of PEI by binding to the conventional siRNA structure.
  • siRNA complex according to the present invention can be usefully used for the inhibition of replication of viruses showing a high evasion rate against the existing RNAi mechanism, which is the structure of the siRNA complex according to the present invention of Example 2 It is not limited to the inhibition of expression of the gene of interest, it means that can be provided as a general siRNA mechanism with improved cell delivery capacity and inhibition efficiency.
  • siRNA siLamin, siDBP, siTIG3
  • tsiRNA prepared in Example 1 were introduced into HeLa cells using PEI, and then 18 hours later, total RNA was extracted with Tri-reagent kit (Ambion).
  • Total RNA (3 ⁇ g) ligation of 0.25 ⁇ g of GeneRacer RNA oligo without pretreatment, followed by reverse transcription of GeneRacer RNA oligo-conjugated total RNA using GeneRacer oligo dT and SuperScript TM III RT kit (Invitrogen).
  • RNA oligo conjugated mRNA was amplified using gene specific primers. PCR products were then cloned into T & A vector (RBC) and sequenced with M13 forward primer.
  • both the treatment of the siRNA-PEI complex and the treatment of tsiRNA-PEI complex was shown to cut the same point of Lamin, DBP and TIG3 mRNA.
  • the experimental results indicate that the multiple siRNA structure of the siRNA complex according to the present invention inhibits gene expression by the same RNAi mechanism as the conventional 19 + 2 siRNA structure.
  • RNA double strands of 30 bp or more have been reported to produce nonspecific antiviral responses in HeLa cells that do not cause specific gene expression inhibition (Manche L. et al., Mol. Cell Biol. , 12: 5238, 1992; Elbashir SM et. al., Nature , 411: 494, 2001), it was tested whether the siRNA complexes according to the present invention showed specific and efficient gene expression inhibition efficiency when compared with conventional siRNA structures.
  • the siRNA mixture and tsiRNA of Example 2 were introduced in combination with PEI, and then the level of induction of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) was RT-PCR in the same manner as in Example 2. It measured by the method.
  • the primer pairs used were as follows, and poly (I: C) -induced cells were used as a positive control for causing the antiviral response.
  • IFN- ⁇ forward 5'-AGA AGT CTG CAC CTG AAA AGA TAT T-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • siRNA complexes according to the present invention also IFN- ⁇ mRNA induced by a positive control of poly I: C as in the case of introducing a siRNA mixture having a conventional siRNA structure combined with PEI It was only less than 1% of the level.
  • the experimental results indicate that despite the multiple siRNA of the siRNA complex according to the present invention has a length of 30bp or more, it does not show a nonspecific antiviral response as in the conventional siRNA structure.
  • Example 7 Preparation of triple siRNA delivery complexes using linker and measurement of gene suppression activity
  • Triple siRNA delivery complexes were prepared using triple phosphoramidite compounds (Trebler phosphoramidite, Trilink Bio Technology, USA) as shown in FIG. 7.
  • the Trebler phosphoramidite was purchased, and then, three-stranded DNA oligonucleotide of SEQ ID NO: 42 was connected to Trebler phosphoramidite by request from Genotech (red, 5 '-> 3' direction from Trebler).
  • an RNA oligonucleotide (SEQ ID NO: 43) having a base sequence complementary to the DNA oligonucleotide of SEQ ID NO: 42, an antisense sequence of siSurvivin (SEQ ID NO: 43), and a siSurvivin sense sequence (SEQ ID NO: 44) were simultaneously annealed.
  • T-tiSurvivin was implemented as follows.
  • siSurvivin, long siSurvivin, and T-tiSurvivin, respectively, of FIG. 8 were combined with PEI and delivered to HeLa cells, respectively, and after 24 hours, the expression level of Survivin mRNA was measured in the same manner as in Example 2. Measurement was made using time RT-PCR.
  • the primer pairs used are as follows.
  • siSurvivin, siIntegrin and si ⁇ -catenin were combined with Trebler phosphoramidite to prepare a triple siRNA delivery complex as shown in FIG. 10A. Then, the mixture of siSurvivin, siIntegrin and si ⁇ -catenin of FIG. 8 as a control and T-tiRNA of FIG. 10A and PEI were delivered to HeLa cells, and after 24 hours, survivin mRNA, Integrin mRNA, and ⁇ -catenin mRNA The expression level was measured using real-time RT-PCR in the same manner as in Example 2.
  • the primer pairs used are as follows. At this time, the primer pair for Survivin was used as the primer pair used in Example 7-1.
  • siIntegrin sense 5'-UGAACUGCACUUCAGAUAU (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 58)
  • siIntegrin antisense 5'-AUAUCUGAAGUGCAGUUCA (dTdT) -3 '(SEQ ID NO: 59)
  • si ⁇ -catenin sense 5’-GUAGCUGAUAUUGAUGGACUU-3 ’(SEQ ID NO: 60)
  • si ⁇ -catenin antisense 5'-GUCCAUCAAUAUCAGCUACUU-3 '(SEQ ID NO: 61)
  • RNA structures as shown in FIG. 11A.
  • a vector was constructed by inserting the target sequence for miR-21 into the SpeII and HindIII positions of the 3 ′ untranslated region of the luciferase mRNA coding gene of the pMIR Report-luciferase vector (Ambion). Each inserted target sequence is as follows.
  • MT-tiRNA of FIG. 11A and a mixture of Anti-miR21, siIntegrin, and si ⁇ -catenin as a control were delivered to HeLa cells after binding to PEI, and luciferase activity was measured as in Example 4.
  • Anti-miR21 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 '(SEQ ID NO: 65)
  • the primer pair used was the primer pair used in Example 7-2.
  • the MT-tiRNA complex according to the present invention significantly inhibited the luciferase activity by inhibiting miR-21. That is, the nucleic acid structure complex according to the present invention was confirmed to exhibit a multi-function that can also exhibit the function of inhibiting miRNA.
  • Example 7-1 three RNA structures were constructed by connecting three Anti-miR21s to Trebler phosphoramidite. Then, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 7-3. Anti-miR21 was used as a control.
  • Example 8 Determination of binding and cell transfer capacity with cationic cell carriers
  • HS heparan sulfate
  • the fluorescence intensity of cells into which FITC-labeled RNAs were introduced was measured using a flow cytometer. The measurement was performed by binding FITC-labeled T-tiSurvivin and siSurvivin to PEI, transfecting HeLa cells, and then collecting cells after 3 hours, washing twice with PBS, and then using the FACSCalibur system (Becton Dickinson). Was done.
  • the multifunctional nucleic acid structure according to the present invention was shown to increase the fluorescence intensity, as a result of quantification, as shown in Figure 13d, at about the average intensity 10 times the difference was found to appear.
  • the multifunctional nucleic acid construct according to the present invention has an excellent intracellular delivery activity as compared to the conventional siRNA bound PEI.
  • T-tiSurvivin according to the present invention is siSurvivin is a conventional siRNA structure Compared to the significantly inhibited Survivin expression (Fig. 14a), then T-tiSurvivin of Figure 7 and siSurvivin of Figure 8 was introduced into HepG2 cells (ATCC No. HB-8065), a liver cancer cell, respectively, the degree of cancer cell growth inhibition was measured.
  • the complex according to the present invention has an effect of inhibiting the proliferation of cancer cells, and thus can be provided as an anticancer composition for treating cancer and inhibiting proliferation.
  • T98G cells reported to have very high immune sensitivity to dsRNA treatment were introduced with T-tiSurvivin of FIG. 7, siSurvivin of FIG. 8, siRNA mixture and tsiRNA of Example 2 in combination with Lipofectamine2000, and then IFIT1.
  • Induction levels of IFN- ⁇ and OAS2 were measured by the RT-PCR method in the same manner as in Example 2.
  • the primer pairs used were as follows, and poly (I: C) -induced cells were used as a positive control for causing the antiviral response.
  • IFN- ⁇ forward 5'-AGA AGT CTG CAC CTG AAA AGA TAT T-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • OAS2-forward 5'-TCA GAA GAG AAG CCA ACG TGA-3 '(SEQ ID NO: 68)
  • Reaction was carried out according to the manufacturer's protocol for 12 hours using 27 bp of dsRNA, siLamin and tsiRNA of Example 2, siSurvivin of FIG. 8, and T-tiSurvivin of FIG. 7 each using Turbo Dicer siRNA generation Kit (Genlantis). 2 ⁇ l fractions of each reaction were run on a 10% non-denaturing polyacrylamide gel. At this time, it was stained with EtBr, and confirmed by UV transillumination.
  • Example 11-2 In order to determine whether the multisiRNA complex and the multifunctional nucleic acid structural complex having a chemical modification that does not act as a substrate on Dicer as in Example 11-2 have a gene expression inhibitory effect, the same method as in Example 2 and Example 7-1 RT-PCR was performed.
  • the siRNA complex and the multifunctional nucleic acid structure complex according to the present invention are a novel structure that can be easily chemically synthesized as compared to the shRNA system for suppressing the expression of a plurality of target genes, but with improved efficiency than the conventional siRNA.
  • the multifunctional nucleic acid structure complex by combining functional nucleic acid oligonucleotides such as miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, aptamer and ribozyme in addition to siRNA to provide a variety of functions at the same time Can be.
  • functional nucleic acid oligonucleotides such as miRNA, antagomiR, antisense oligonucleotide, aptamer and ribozyme in addition to siRNA to provide a variety of functions at the same time Can be.

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Abstract

본 발명은 세포 내 전달능이 증가된 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체는 종래 복수의 목적 유전자 발현을 억제하기 위한 shRNA 시스템에 비하여 용이하게 화학적 합성될 수 있는 새로운 구조이면서도, 종래의 siRNA 보다 향상된 효율로 복수의 유전자를 동시에 발현 억제시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 높은 세포 내 전달능을 가질 뿐만 아니라, 비특이적인 항바이러스성 반응을 일으킴없이 특이적으로 목적 유전자들을 발현 억제시킬 수 있는 바, 암이나 바이러스성 감염 등을 치료하기 위한 siRNA 기작 매개 치료제로서 매우 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조 복합체는, siRNA 이외에 miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 라이보자임(ribozyme)과 같은 기능성 핵산올리고뉴클에오티드를 결합하여 동시에 다양한 기능을 제공할 수 있다.

Description

세포 내 전달능이 증가된 작은 간섭 RNA 복합체
본 발명은 세포 내 전달능이 증가된 siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체에 관한 것이다.
RNA 간섭 (RNA interference: RNAi)는 매우 특이적이고, 효율적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 메카니즘으로, 이는 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을가지는 센스와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스로 구성되는 이중가닥RNA(이하, 「dsRNA」라 칭한다)를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제한다.
이러한 RNAi 기법에 대하여 지금까지 활성 및/또는 세포 내 전달효율을 높이기 위한 변형들에 대한 연구가 진행되어 왔으며, 장차 암이나 바이러스성 감염을 포함한 많은 질병들의 치료를 위한 효과적인 치료제가 될 것으로 기대되어 왔다. 많은 연구자들은 작은 간섭 RNA (small interfering RNA: siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA)와 같은 다양한 RNAi 기법을 사용하여 성공적으로 바이러스의 복제를 억제한 바 있다 (Jacque J.M. et al., Nature, 418: 435, 2002; Novina C.D. et al., Nat. Med., 8:681, 2002; Nishitsuji H. et al., Microbes Infect., 6:76, 2004). 그러나, RNAi 기작에 의하여 하나의 목적 유전자만을 발현 억제시키는 경우, 바이러스 게놈 내부의 목적유전자의 하나의 뉴클레오티드의 치환 내지 결실에 의하여 바이러스가 RNAi-매개 유전자 발현 억제 기작에서 벗어나는 경우가 발생할 수 있다고 보고되었다 (Westerhout E.M. et al., Nucleic Acids Res., 33:796, 2005). 이와 같이 바이러스가 유전자 발현억제 기작에서 벗어나는 것을 최소화하기 위한 방안 중 하나는 바이러스 게놈 내의 다양한 부분을 타겟팅하는 다중 RNAi 기작을 유도하는 것이다.
한편, 바이러스 복제 억제뿐만 아니라, RNAi 기작은 암 치료를 위한 약으로서도 개발되어 왔다. RNAi는 세포 사이클 정지를 유도하고, 종양 생존에 본질적인 유전자를 타겟팅하여 암 세포에 세포사멸(apoptosis)를 유도할 수 있다. 이때, 다수의 유전자에 대한 동시다발적인 유전자 발현의 억제는 암 세포에 강한 세포사멸을 유도하게 된다고 보고되고 있다 (Menendez J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:10715, 2004). 이에 RNAi 기작을 이용하여 복수의 목적 유전자를 발현 억제시키기 위한 효율적인 전략의 개발이 요구되었다.
그러나, 현재까지는 다중 표적 RNAi 기작은 주로 shRNA 발현시스템을 기반으로 개발되어 왔다 (Konstantinova P. et al., Gene Ther., 13:1403, 2006; ter Brake O. et al., Mol. Ther., 14:883, 2006; Watanabe T. et al., Gene Ther., 13:883, 2006)). 또한, Khaled 등은 비바이러스성 siRNA 전달을 위하여, phi29 RNA 골격에 기반한 다중 siRNA를 포함하는 RNA 나노구조를 제작하였으나 (Khaled A. et al., Nano Lett., 5:1797, 2005), 이러한 RNA 골격 구조는 그 길이가 너무 길어 화학적으로 합성될 수 없어 실제 사용에 제한을 가지고 있었다. 따라서, 다중 siRNA에 적용될 수 있으면서 화학적으로 합성될 수 있는 새로운 구조의 siRNA 구조체 개발이 요청되었다.
한편, siRNA 기법에 있어서, 또다른 장애물은 siRNA를 세포 내로 효율적으로 전달하는 것으로, 종래 알려진 siRNA 구조인 21 염기쌍의 siRNA는 플라스미드 DNA와 비교할 때, PEI와 같은 양이온 폴리머와 결합하기에는 적당하지 않은 것으로 보고되었다 (Balcato-Bellemin A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:16050, 2007).
이에 본 발명자는 복수의 유전자를 발현 억제시킬 수 있으면서도 향상된 세포 내 전달능을 가지는 새로운 siRNA 복합체를 제공하고자 예의 노력한 결과, 특정 구조로 다중 siRNA와 다기능성 핵산구조체를 제작하여 이들을 각각 양이온성 세포전달체와 함께 복합체를 형성시킨 다음, 효과적으로 복수의 유전자를 발현 억제시키면서도 현저하게 향상된 세포 전달능을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 복수의 유전자를 발현 억제시킬 수 있으면서도 동시에 향상된 세포 내 전달능을 가지는 새로운 siRNA 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 향상된 세포 내 전달능을 가지는 새로운 구조의 다기능성 핵산구조 복합체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 서로 접합되어 있는 다중 siRNA에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 siRNA 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 siRNA의 세포 내 전달방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 3 이상의 핵산올리고뉴클레오티드의 각각의 일 말단이 연결되어 있는 다기능성 핵산구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조체에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 다기능성 핵산구조 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조의 세포 내 전달방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드의 일 말단을 연결시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 세포 내 전달능이 증가된 다기능성 핵산구조 복합체의 제조방법을 제공한다:
(a) 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드의 일 말단을 연결하여 다기능성 핵산구조체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 다기능성 RNA구조에 양이온성 세포전달체를 전하간 작용에 의하여 결합시키는 단계.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체의 유전자 발현 억제용 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체를 세포 내 도입하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 억제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체를 함유하는 항암조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체의 항암 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체를 세포 내 도입하는 것을 특징으로 하는 암의 억제 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체의 유전자 발현 억제용 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체를 세포 내 도입하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 억제방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체를 함유하는 항암 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체의 항암 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다기능성 핵산구조 복합체를 세포 내 도입하는 것을 특징으로 하는 암의 억제 또는 치료방법을 제공하다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 발현용 억제용 조성물을 포함하는 유전자 발현 억제용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 복합체 또는 다기능성 핵산구조 복합체의 바이러스 치료제로서의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 다중siRNA 복합체의 다중 siRNA인 tsiRNA의 구조 (a) 및 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 유전자 억제 활성을 보여주는 그래프 (b 내지 d)이다.
도 2는 본 발명에 따른 다중siRNA를 PEI와 결합시킨 경우와(a), Lipofectamine2000과 결합시킨 경우(b)의 유전자 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 FITC 라벨링한 siRNA 혼합물(siLamin, siDBP, FITC-siTIG3)과 FITC 라벨링한 tsiRNA (FITC-tsiRNA)를 PEI와 결합시켜 HeLa 세포에 도입한 후, 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 CVA24 게놈의 서로 다른 부위를 타겟으로 하는 본 발명에 따른 다중 siRNA (tsiRNA-CVA) 구조 (a) 및 이와 각각 상기 부위를 타겟으로 하는 3개의 siRNA 혼합물을 PEI를 이용하여, 3개의 서로 다른 바이러스 염기서열을 포함하는 각각의 루시퍼라제 벡터와 함께 세포내로 도입한 뒤 상대적인 루시퍼라제 활성을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 siRNA 구조가 종래의 19+2 siRNA와 동일한 RNAi 기작에 의하여 유전자 발현을 억제시키는지 확인하기 위하여, 5’RACE 분석을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 siRNA 구조가 비특이적인 항바이러스성 반응을 일으키는지 확인하기 위하여, siRNA 혼합물과 tsiRNA를 PEI와 결합하여 도입시킨 후, 인터페론-β(IFN-β)의 유도 수준을 RT-PCR 방법에 의하여 측정한 비교 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 사용된 Trebler tsiSurvivin(T-tiSurvivin)의 구조이다.
도 8은 Trebler tsiSurvivin의 대조군으로 사용된 siSurvivin과 long siSurvivin의 염기서열이다.
도 9는 T-tiSurvivin-PEI 전달체의 유전자 발현 효율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 siSurvivin, siIntegrin 및 siβ-catenin을 Trebler phosphoramidite에 결합시켜 제조한 T-tiRNA 구조 (a) 및 유전자 발현 억제 효율을 나타낸 그래프(b)이다.
도 11은 Anti-miR21, siIntegrin 및 siβ-catenin을 Trebler phosphoramidite에 결합시켜 제조한 MT-tiRNA 구조 (a) 및 유전자 발현 억제 효율을 나타낸 그래프(b)이다.
도 12는 T-tiAnti-miR21의 도입 시 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 13은 T-tiSurvivin 복합체의 HS에 의한 분리율을 확인하기 위한 전기영동 결과 (a)와, FITC를 이용하여 세포 내 전달능을 측정한 사진(b) 및 유세포분석기를 이용하여 형광강도를 측정한 결과 (c 및 d)이다.
도 14는 T-tiSurvivin 복합체의 유전자 발현억제효율을 확인한 그래프 (a)와, T-tiSurvivin 복합체 도입 후 HepG2세포 성장 억제효능을 나타내는 그래프(b) 및 현미경 이미지(c)이다.
도 15는 tiRNA 복합체로 트랜스펙션된 T98G 세포에서의 IFITI mRNA(a), IFN-β mRNA (b) 및 OAS2 mRNA의 발현정도를 나타내는 그래프이다.
도 16은 Dicer 처리 전후의 27bp의 dsRNA, siLamin, tsiRNA, siSurvivin 및 T-tiSurvivin를 전기영동한 결과이다.
도 17은 tsiRNA의 일부 뉴클레오티드를 화학적변형시킨 구조이다.
도 18은 T-tiSurvivin의 일부 뉴클레오티드를 화학적 변형시킨 구조이다.
도 19는 화학적 변형을 가지는 tsiRNA(OMe) (a) 및 T-tiSurvivin(OMe) (b)의 Dicer 처리 후 전기영동한 결과이다.
도 20은 화학적 변형을 가지는 tsiRNA(OMe) (a) 및 T-tiSurvivin(OMe) (b)의 유전자 발현 억제 효율을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 “siRNA (small interfering RNA)”란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
본원에서 “유전자”란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다. 예컨대, 목적유전자는 HIV 게놈상의 유전자일 수 있다. 이 경우, siRNA 분자는 포유동물 세포 내 HIV 유전자의 번역을 불활성화시키는데 유용하다.
본원에서, 상기 다중 siRNA 또는 다기능성 핵산구조체와 양이온성 세포전달체의 “복합체”는 다중 siRNA의 골격의 음전하와, 양이온성 세포전달체의 양전하의 강한 상호작용으로 이루어지는 것으로 전하간 작용에 의한 결합체이다.
본 발명은 일 관점에서, 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 서로 접합되어 있는 다중 siRNA에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 siRNA 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 다중 siRNA란 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 서로 접합되도록 구조화된 siRNA 구조체를 말하며, 서로 다른 siRNA를 4개 등 다수의 siRNA를 접합하여 사용할 수 있으나, 복수개의 목적유전자의 발현을 억제시키면서도 세포 내 전달능을 현저히 높이기 위해서는 바람직하게는 3개의 서로 다른 siRNA를 이용하는 접합된 구조를 이용한다. 또한, 상기 다중 siRNA는 안티센스의 5’ 방향 말단은 외부를 향하도록 하고, 다른 편 말단인 안티센스의 3’ 방향 말단에서 서로 접합되는 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 도 1a는 3개의 서로 다른 목적유전자를 타겟으로 하는 siRNA를 본 발명의 다중 siRNA 구조로 접합한 것이다.
이때, 상기 siRNA는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 화학적 변형은 예시적으로 상기 siRNA에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2’ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 양이온성 세포전달체는 in vitro 및 in vivo의 어느 상태에서도 핵산, 즉 siRNA를 세포 내 전달하기 위하여 사용하는 것으로, 양성으로 전하된 전달을 위한 시약이다. 양이온성 세포전달체는 본 발명의 다중 siRNA와 강하게 상호작용을 하여 복합체를 형성함으로써 siRNA가 효과적으로 세포 내 도입될 수 있도록 한다. 양이온성 세포전달체로는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질을 사용할 수 있는데, 예를 들어 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 같은 리포좀을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 양성으로 전하된 전달을 위한 시약의 경우 본 발명에 따른 복합체를 제공하기 위하여 사용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명할 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, miRNA의 안티센스 올리고뉴클레오티드(antagomiR), 압타머 및 라이보자임(ribozyme)으로 구성된 군에서 선택되는 3 이상의 핵산올리고뉴클레오티드의 각각의 일 말단이 연결되어 있는 다기능성 핵산구조체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 다기능성 핵산구조체란 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물의 각 관능기에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머와 같은 기능성 핵산올리고뉴클레오티드를 결합시킨 핵산구조체를 말하며, 상기에서 “3 이상의 핵산올리고뉴클레오티드”는 서로 동일한 종류의 3 이상의 핵산올리고뉴클레오티드이거나, 2 또는 3개의 동일한 종류의 핵산올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 상이한 핵산올리고뉴클레오티드로 구성되거나, 또는 모두 상이한 종류의 핵산올리고뉴클레오티드로 구성되는 것으로 해석되어진다. 즉, 도 7 및 도 10a와 같이 3이상의 siRNA로만 구성되거나, 도 11a과 같이 2개의 siRNA와 하나의 antagomiR로 구성될 수 있다.
이러한 핵산올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하여 제조될 수 있는데, 화학적 변형은 예시적으로 상기 핵산올리고뉴클레오티드에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2’ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다.
이러한 다기능성 핵산구조체는 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드의 일 말단을 연결시킴으로서 제조되는데, 이는 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물의 각 관능기에 핵산단편을 연결한 다음, 상기 핵산올리고뉴클레오티드에 상기 핵산단편과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함시켜 상기 핵산단편과 상보적으로 결합하게 함으로써 연결하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물은 예시적으로 포스포라미다이트 화합물, 요오드아세틸(lodoacetyl) 화합물, 말레이미드(maleimide) 화합물, 에폭사이드 화합물, 티올-다이설파이드(thiol-disulfide) 화합물, 티올화된 엘만 시약, NHS 또는 sulfo-NHS 화합물, 이소시아테이트(Isocyanate) 화합물 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물로 3개 이상의 siRNA 또는 타 기능성 핵산올리고뉴클레오티를 결합할 수 있으면 제한되지 않고 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명할 것이다. 이때, 상기 사용되는 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물은 적절히 아민 또는 티올 등으로 말단이 치환된 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다.
예시적으로 링커로서 포스포라미다이트 화합물을 사용하는 경우, 바람직하게는 Trebler phosphoramidite(Trilink Bio Technology)와 같은 3개의 팔(arm)을 갖는 포스포라미다이트 화합물에 3개의 핵산단편을 연결하고, 센스 또는 안티센스 중 하나의 가닥에 상기 핵산단편과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하는 siRNA들을 제작하여 상기 핵산단편에 상보적 결합에 의하여 연결시킴으로써 새로운 구조의 다기능성 핵산구조체를 제작할 수 있다. 이때, “상보적으로 결합”이란 상기 핵산 단편의 서열과 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 포함되는 일부 단편이 약 70~80% 이상, 바람직하게는 약 80∼90% 이상, 보다 바람직하게는 약 90∼95% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95∼99% 이상 서열이 서로 상보적이거나 완전히 상보적으로 혼성화 될 수 있음을 의미한다. 다만, annealing이 가능한 수준에서 연결을 위한 부분에 mismatch가 계획적으로 도입될 수 있다.
본 발명에 따른 다기능성 핵산구조체에 양이온성 세포전달체를 전하간 작용에 의하여 결합시킴으로써 다기능성 핵산구조 복합체를 제공할 수 있으며, 이에 본 발명은 다른 관점에서, 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 다기능성 핵산구조 복합체에 관한 것이다.
양이온성 세포전달체로는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질을 사용할 수 있는데, 예를 들어 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 같은 리포좀을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 양성으로 전하된 전달을 위한 시약의 경우 본 발명에 따른 복합체를 제공하기 위하여 사용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명할 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 siRNA 복합체와 종래 siRNA 구조에 따른 siRNA-양이온성 지질 복합체를 세포 내에 도입하여 유전자 발현 억제효율을 측정한 결과, 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래 siRNA 구조체에 비하여 더 효율적으로 모든 목적 유전자의 발현 수준을 억제함을 확인하였다.
아울러, 종래 바이러스성 감염에 대한 RNAi 기작을 위한 치료의 경우, 바이러스의 게놈 내 뉴클레오티드의 치환 내지 결실에 의한 회피가 문제되어 왔으나, 본 발명의 다른 실시예에서는 바이러스 게놈 중 서로 다른 세 부위를 타겟팅하는 다중 siRNA를 PEI를 이용하여 도입함으로써, 해당 바이러스 게놈 부위를 포함하는 mRNA의 발현을 현저하게 낮추는 것으로 확인된 바, 바이러스성 감염의 치료를 위해서도 본 발명이 유용함을 제시하였다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 형광현미경을 이용하여 본 발명에 따른 siRNA 복합체와 종래의 siRNA의 세포 내 투과율을 비교한 결과, 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래의 siRNA구조에 PEI를 결합시킨 것에 비하여 세포 내 전달 활성이 매우 우수함을 확인하였다. 즉, 종래 siRNA의 경우 폴리에틸렌이민(PEI)와 같은 양이온성 지질과 결합하기에는 적당하지 않은 것으로 보고되고, 세포 내 투과율이 낮은 것으로 확인되었으나 (도 3), 본 발명의 다중 siRNA는 폴리에틸엔이민(PEI)과 같은 양이온성 세포전달체와 결합하여 매우 높은 세포 내 전달 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 siRNA 복합체는 효과적으로 siRNA를 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 siRNA 복합체를 세포 내 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 siRNA 복합체를 일반적인 RNAi 기작의 용도와 동일한 범주에서 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 종래의 siRNA 구조와 대비하여 기작분석 실험을 수행하여, 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 다중 siRNA 구조가 종래의 19+2 siRNA 구조와 동일한 RNAi 기작에 의하여 유전자 발현을 억제함을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 siRNA 복합체를 종래 RNAi의 용도와 동일한 범주에서 사용할 수 있음을 의미한다.
따라서, 상기 siRNA 복합체를 세포 내 전달함으로써, 효율적으로 목적 유전자의 발현이 억제할 수 있는바, 본 발명은 다른 관점에서, 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 서로 접합되어 있는 다중 siRNA에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는 복합체를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물을 이용하여 서로 연결되어 있는 다기능성 핵산구조체에 양이온성 세포전달체를 결합시킨 다기능성 핵산구조 복합체의 형태로도 유전자 발현 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 다기능성 핵산구조 복합체는 다중siRNA 복합체처럼 현저한 유전자 발현 억제 효과를 가질 뿐만 아니라, siRNA 이외에 miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 라이보자임(ribozyme)과 같은 기능성 핵산올리고뉴클에오티드를 결합하여 다기능성을 가지는 핵산구조체를 제공할 수 있는 장점이 있다. 다중siRNA의 경우, 특정한 구조를 요하며 siRNA와 같은 이중나선의 RNA의 접합을 요하는 것과 달리, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물을 이용하여 짧은 올리고뉴클레오티드를 가지는 기본 골격을 구성함으로써, 어떠한 핵산올리고뉴클레오티드도 구조체 내에 도입될 수 있게 고안하였다. 따라서, antagomiR와 같은 단일가닥 핵산올리고뉴클레오티드의 결합도 가능하게 한다. 또한, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 결합시킴으로써, 다중tsiRNA보다 비교적 짧은 길이의 핵산단편 제조로 구조체의 제공이 가능해진바, 제조단가 역시 내려가고 제조공정 역시 용이하게 이루어진다.
아울러, 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조 복합체와 다중siRNA 복합체의 면역반응 유도여부를 실험한 결과, 다중siRNA 복합체가 dsRNA 처리에 대하여 매우 높은 면역 민감성을 가지는 것으로 보고된 T98G 세포에서 비특이적인 면역반응을 일부 일으키는 것과 달리, 다기능성 핵산구조 복합체는 이러한 면역반응을 일으키지 않음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, Dicer에 대한 저항성을 실험하여 다기능성 핵산구조 복합체가 더 높은 저항성을 보임을 확인하였다.
한편, 상기 유전자 발현 억제용 조성물은 유전자 발현 억제용 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 유전자 발현 억제용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유전자 발현 억제용 조성물을 이용함으로써, 효과적으로 동시에 2개 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있는바, 이에 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자 발현 억제용 조성물을 이용한 유전자 발현 억제방법에 관한 것이다.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 복합체가 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인한 바, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 다중siRNA 복합체 또는 다기능성 핵산구조 복합체를 함유하는 항암조성물에 대한 것이다.
본 발명에 따른 항암조성물은 상기 복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 목적유전자로서 라민 A/C (Lamin A/C), DBP, TIG3, Survivin 유전자 및 CVA24 바이러스 게놈만을 예시하였으나, 기타 다른 목적 유전자를 타겟으로 하여 본 발명에 따른 복합체 및 조성물을 제공한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있으며, 하기 실시예에서 사용된 AntimiR-21이외의 다른 기능성 핵산올리고뉴클레오티드를 이용하여서도 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조체를 제공할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1. 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 제조
본 실시예들에서 사용된 다중 siRNA 및 실험에 사용할 siRNA들은 Bioneer 사로부터 화학적으로 합성된 RNA들을 구매한 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 어닐닝함으로써 제공되었다.
먼저 라민 A/C (Lamin A/C), DBP 및 TIG3 mRNA를 타겟으로 하는 삼중 목적 유전자 발현 억제 RNA (triple-target gene silencing siRNA: tsiRNA)는 도 1a와 같이, 제조하였다.
상기 tsiRNA를 제공하기 위한 3개의 가닥은 다음과 같다.
1st strand: 5’-UGUUCUUCUGGAAGUCCAGUCGAAGACAUCGCUUCUCA-3’ (서열번호 1)
2nd strand: 5’-UGAGAAGCGAUGUCUUCGACUGUCUCAGGCGUUCUCUA-3’ (서열번호 2)
3rd strand: 5’-UAGAGAACGCCUGAGACAGCUGGACUUCCAGAAGAACA-3’ (서열번호 3)
한편, 대조군으로서 사용한 상기 3개의 각 부위에 대한 siRNA들은 다음과 같다.
Lamin mRNA에 대한 siRNA (siLamin)
센스(sense): 5’-CUGGACUUCCAGAAGAACA(dTdT)-3’(서열번호 4)
안티센스(antisense): 5’-UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT)-3’ (서열번호 5)
DBP mRNA에 대한 siRNA (siDBP)
센스(sense): 5’-UCGAAGACAUCGCUUCUCA(dTdT)-3’ (서열번호 6)
안티센스(antisense): 5’-UGAGAAGCGAUGUCUUCGA(dTdT)-3’ (서열번호 7)
TIG3 mRNA에 대한 siRNA (siTIG3)
센스(sense): 5’-CUGUCUCAGGCGUUCUCUA(dTdT)-3’ (서열번호 8)
안티센스(antisense): 5’-UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT)-3’ (서열번호 9)
상기에서 수득한 tsiRNA에 폴리에틸엔이민(PEI, Polyplus사)를 제조자의 프로토콜에 따라 가하여 본 발명에 따른 siRNA 복합체를 제조하였다.
실시예 2: 본 발명에 따른 siRNA 복합체와 종래 siRNA의 유전자 억제 활성 측정
실시예 1에서 제조한 라민 A/C (Lamin A/C), DBP 및 TIG3 mRNA를 타겟으로 하는 삼중 목적 유전자 발현 억제 RNA (triple-target gene silencing siRNA: tsiRNA)와 PEI의 복합체와, 실시예 1의 종래 siRNA 구조체인 siLamin, siDBP 및 siTIG3을 각각 PEI와 복합체를 형성한 것을 HeLa 세포(ATCC CCL-2)로 도입하였다. HeLa 세포는 10% FBS (fetal bovine serum)을 보충한 Dulbecco’s 개질 Eagle’s 배지 (Hyclone 사)에서 배양하였으며, 세포들은 12-웰 플레이트에서 평판 배양하고, 도입 전에는 항생제 없는 완전배지에서 컨플루언시(confluency)가 80%가 될 때까지 24시간 배양하였다. siRNA 혼합물은 각 100nM을 사용하였으며, tsiRNA도 100nM 사용하였으며, 사용한 PEI(N/P=5)는 Polyplus사에서 구입한 것으로 도입은 제조자의 프로토콜에 따랐다.
도입한 후 3시간 후에 배지를 교환하였으며, 라민, DBP, 및 TIG3 mRNA의 수준은 정량적인 리얼 타임 RT-PCR에 의하여 측정하였다. 즉, 총 RNA를 Tir-reagent 키트(Ambion사)를 이용하여 세포 용해물로부터 추출한 다음, 수득된 총 RNA는 ImPro-IITM 역전사 시스템(Promega 사)을 이용하여 cDNA 합성을 하기 위한 주형으로 사용하였다. 상기 cDNA의 합성은 상기 제조사의 프로토콜에 따랐다. 그리고 나서, 스텝 원 리얼-타임 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 각 목적 유전자의 발현 수준을 측정하였고, 측정된 라민, DBP, TIG3의 mRNA 수준은 GAPPDH (대조군) mRNA 수준으로 나누어 비교하였다. 사용한 각 유전자에 대한 프라이머는 다음과 같다.
DBP RT-PCR용 프라이머쌍
DBP-forward 5’-CCT CGA AGA CAT CGC TTC TC-3’ (서열번호 10)
DBP-reverse 5’-GCA CCG ATA TCT GGT TCT CC-3’ (서열번호 11)
GAPDH RT-PCR용 프라이머쌍
GAPDH-forward 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’ (서열번호 12)
GAPDH-reverse 5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3’ (서열번호 13)
Lamin RT-PCR용 프라이머쌍
Lamin-forward 5’-CCG AGT CTG AAG AGG TGG TC-3’ (서열번호 14)
Lamin-reverse 5’-AGG TCA CCC TCC TTC TTG GT-3’ (서열번호 15)
TIG3 RT-PCR용 프라이머쌍
TIG3-forward 5’-AGA TTT TCC GCC TTG GCT AT-3’(서열번호 16)
TIG3-reverse 5’-TTT CAC CTC TGC ACT GTT GC-3’ (서열번호 17)
도입한 다음 도입 후 30분, 1시간 및 3시간 후에 RT-PCR로 mRNA 수준을 각각 라민, DBP 및 TIG3의 mRNA 수준을 측정한 결과, 도 1b 내지 1d에 나타난 바와 같이, 각 시간대 별로 본 발명에 따른 siRNA 복합체 (tsiRNA)가 더 우수한 유전자 억제 활성을 보임을 나타낸다.
한편, 실시예 1에서 수득한 siRNA 복합체 (TsiRNA) 및 실시예 1에서 수득한 tsiRNA에 Lipofectamine2000 (Invitrogen사)를 제조사의 프로토콜에 따라 가하여 제조한 siRNA 복합체 (TsiRNA-1)을 각각 상기와 동일한 방법으로 HeLa 세포(ATCC CCL-2)로 도입한 다음 24시간 후 RT-PCR로 mRNA 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 종래 보고된 바와 유사하게 (Bolcato-Bellemin A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:16050, 2007) 각각의 siRNA들과 PEI와의 혼합물은 매우 제한된 유전자 발현 억제 활성을 보였으나, TsiRNA를 양이온성 폴리머인 PEI를 결합시킨 경우와, 양이온성 지질인 Lipofectamine2000을 결합시킨 경우 모두 3개의 모든 유전자 mRNA의 발현수준이 훨씬 더 낮음을 볼 수 있었다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래의 siRNA 구조에 PEI나 Lipofectamine2000와 같은 양이온성 세포전달체를 결합하여 처리한 경우에 비하여 세개의 서로 다른 유전자 발현을 억제하는데 더 효과적임을 나타낸다.
실시예 3: 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 세포 내 전달능 측정
본 발명에 따른 siRNA 복합체 및 종래 siRNA (siTIG3)의 세포 내 전달능을 비교하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
siTIG3의 센스 가닥의 3’ 말단과, tsiRNA의 TIG3 센스의 3’ 말단에 FITC를 라벨링하였다. 그리고, FITC 라벨링한 siRNA 혼합물(siLamin, siDBP, FITC-siTIG3)과 FITC 라벨링한 tsiRNA (FITC-tsiRNA)를 PEI와 결합시켜 HeLa 세포에 도입하였다. 도입 후 HeLa 세포는 시간대 별로 형광 현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
10분, 30분, 1시간 및 3시간 간격으로 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 도 3a의 siRNA 혼합물을 PEI를 이용하여 도입시킨 경우 테스트한 모든 배양 시간대에서 거의 형광이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여 FITC 라벨링한 tsiRNA를 PEI를 이용하여 도입한 경우(도 3b) 세포 내 부위에서 산재된 녹색의 스팟을 볼 수 있었으며, 이는 배양시간이 증가함에 따라 점차적으로 그 강도도 증가하는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래의 siRNA구조에 PEI를 결합시킨 것에 비하여 세포 내 전달 활성이 매우 우수함을 나타낸다.
실시예 4: 바이러스 게놈에 대한 타겟
종래 RNAi 기작을 이용한 바이러스 복제 억제의 경우 높은 바이러스의 회피율로 인한 문제점이 있었다. 이에 이러한 문제점을 극복할 수 있는지 실험하고, 본 발명에 따른 siRNA 구조가 일반적으로 siRNA 기작을 위하여 적용되는 기작인지 확인하기 위하여, 먼저 본 발명에 따른 siRNA 복합체를 바이러스 게놈 (coxsackievirus A24: CVA24) 중 3개의 서로 다른 부위(CRE, 3D1, 3D2)를 타겟으로 하도록 도 4a (tsiRNA-CVA)와 같이, 제조하였다.
상기 tsiRNA-CVA를 제공하기 위한 3개의 가닥은 다음과 같다.
tsiRNA-CVA:
1st strand: 5’-UCAAUACGGUGUUUGCUCUUGGUGAUGAUGUAAUUGCU-3’ (서열번호 18)
2nd strand: 5’-AGCAAUUACAUCAUCACCACCAUGACUCCAGCUGACAA-3’ (서열번호 19)
3rd strand: 5’-UUGUCAGCUGGAGUCAUGGAGAGCAAACACCGUAUUGA-3’ (서열번호 20)
한편, 대조군으로서 사용한 상기 3개의 각 부위에 대한 siRNA들은 다음과 같다.
CVA-CRE mRNA에 대한 siRNA (siCVA-CRE)
센스(sense): 5’-AGAGCAAACACCGUAUUGA(dTdT)-3’ (서열번호 21)
안티센스(antisense): 5’-UCAAUACGGUGUUUGCUCU(dTdT)-3’ (서열번호 22)
CVA-3D1 mRNA에 대한 siRNA(siCVA-3D1)
센스(sense): 5’-UGGUGAUGAUGUAAUUGCU(dTdT)-3’ (서열번호 23)
안티센스(antisense): 5’-AGCAAUUACAUCAUCACCA(dTdT)-3’ (서열번호 24)
CVA-3D2 mRNA에 대한 siRNA(siCVA-3D2)
센스(sense): 5’-CCAUGACUCCAGCUGACAA(dTdT)-3’ (서열번호 25)
안티센스(antisense): 5’-UUGUCAGCUGGAGUCAUGG(dTdT)-3’ (서열번호 26)
그 다음, siCVA-CRE에 대한 타겟서열, siCVA-3D1에 대한 타겟서열, siCVA-3D2에 대한 타겟 서열을 각각 pMIR Report-luciferase vector (Ambion 사)의 루시퍼라제 mRNA 코딩 유전자의 3’ 비번역 부위의 SpeII 및 HindIII 위치에 삽입한 벡터 pMIR-CRE, pMIR-3D1, 및 pMIR-3D2를 구축하였다. 상기 삽입되는 각 타겟서열은 다음과 같다.
CRE AS-target
Hind 5’-AGCTT T CAA TAC GGT GTT TGC TCT A -3’(서열번호 27)
Spe 3’- A A GTT ATG CCA CAA ACG AGA TGATC-5’(서열번호 28)
3D1 AS-target
Hind 5’-AGCTT A GCA ATT ACA TCA TCA CCA A -3’(서열번호 29)
Spe 3’- A T CGT TAA TGT AGT AGT GGT TGATC-5’(서열번호 30)
3D2 AS-target
Hind 5’-AGCTT T TGT CAG CTG GAG TCA TGG A -3’(서열번호 31)
Spe 3’- A A ACA GTC GAC CTC AGT ACC TGATC-5’(서열번호 32)
각각의 상기 벡터를 siRNA 혼합물 (siCVA-CRE, siCVA-3D1, siCVA-3D2)과 PEI의 복합체 또는 tsiRNA-CVA와 PEI의 복합체와 HeLa 세포에 도입한 다음, 루시퍼라제 활성을 다음과 같이 측정하였다. 즉, 도입 후 24시간 후에, 세포를 Dual-luciferase Reorter Assay System (Promega사)의 Passive lysis 버퍼로 용출시켰다. 루시퍼라제 활성은 초파리 및 Renilla 루시퍼라제를 위한 Victor3 평판 리더기 (Victor3 plate reader, PerkinElmer사)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 결과와 유사하게, 종래 siRNA 구조에 PEI를 결합시켜 도입한 것에 비하여, 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 휠씬 낮은 루시퍼라제 활성을 보이는 것으로 확인되었다.
상기 실험결과는 본 발명에 따른 siRNA 복합체는 기존의 RNAi 기작에 대하여 높은 회피율을 보이는 바이러스의 복제 억제를 위해서도 유용하게 사용할 수 있음을 제시하며, 이는 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 구조가 실시예 2의 목적 유전자의 발현 억제에만 한정되는 것이 아닌, 세포 전달능 및 억제 효율이 개선된 일반적인 siRNA 기작으로서 제공될 수 있음을 의미한다.
다만, 추가적으로 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래의 RNAi 기작의 용도와 동일한 범주에서 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 다음의 기작분석 실험을 수행하였다.
실시예 5: 유전자 발현 억제 기작의 분석
본 발명에 따른 siRNA 구조가 종래의 19+2 siRNA와 동일한 RNAi 기작에 의하여 유전자 발현을 억제시키는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 즉, 각 목적 mRNA에 대한 절단 부위를 분석하기 위하여 5’RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 분석을 수행하였다.
먼저, siRNA (siLamin, siDBP, siTIG3) 또는 실시예 1에서 제작한 tsiRNA를 PEI를 이용하여 HeLa 세포에 도입한 다음, 18시간 후에 Tri-reagent kit (Ambion)으로 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA(3μg)은 전처리없이 0.25μg의 GeneRacer RNA oligo를 접합(ligation)시킨 다음, GeneRacer RNA oligo-접합된 전체 RNA를 GeneRacer oligo dT 및 SuperScript™III RT kit (Invitrogen)을 이용하여 역전사시켰다. RNA 올리고 접합된 mRNA는 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 그 다음 PCR 산물은 T＆A vector(RBC)로 클론한 다음, M13 forward primer로 시퀀싱하였다.
TIG3 Gene specific 3’primer:
5’-GGGGCAGATGGCTGTTTATTGATCC-3’(서열번호 33)
TIG3 Gene specific 3’nested primer:
5’-ACTTTTGCCAGCGAGAGAGGGAAAC-3’(서열번호 34)
Lamin Gene specific 3’primer:
5’-CCAGTGAGTCCTCCAGGTCTCGAAG-3’(서열번호 35)
Lamin Gene specific 3’nested primer:
5’-CCTGGCATTGTCCAGCTTGGCAGA-3’(서열번호 36)
DBP gene specific primer
5’-CGGGACAGCACGGCGCGGTAGT-3’(서열번호 37)
DBP gene specific 3’ nested primer
5’-CTCCTGGCGCACGGCCACAACTT-3’(서열번호 38)
M13 forward primer
5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (서열번호 39)
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, siRNA-PEI 복합체를 처리한 경우와 tsiRNA-PEI 복합체를 처리한 경우 모두 Lamin, DBP 및 TIG3 mRNA의 동일한 지점을 자르는 것으로 나타났다.
상기 실험결과는 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 다중 siRNA 구조가 종래의 19+2 siRNA 구조와 동일한 RNAi 기작에 의하여 유전자 발현을 억제함을 의미한다.
실시예 6: 비특이적인 항바이러스 반응 발생 여부 측정
30bp 이상의 RNA 이중가닥은 비특이적인 항바이러스 반응을 HeLa 세포에서 일으켜 특이적인 유전자 발현 억제를 일으키지 않았다고 보고된바 (Manche L. et al., Mol. Cell Biol., 12:5238, 1992; Elbashir S.M. et al., Nature, 411:494, 2001), 본 발명에 따른 siRNA 복합체가 종래의 siRNA 구조와 비교할 때, 특이적이고 효율적인 유전자 발현 억제 효율을 보이는지 실험하였다.
항바이러스성 반응이 제기되는지 확인하기 위하여, 실시예 2의 siRNA 혼합물과 tsiRNA를 PEI와 결합하여 도입시킨 후, 인터페론-β(IFN-β)의 유도 수준을 실시예 2와 동일한 방법으로 RT-PCR 방법에 의하여 측정하였다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같으며, 항바이러스성 반응을 일으키는 양성 대조군으로는 폴리(I:C)-도입된 세포를 사용하였다.
IFN-β RT-PCR용 프라이머쌍
IFN-β forward: 5’-AGA AGT CTG CAC CTG AAA AGA TAT T-3’ (서열번호 40)
IFN-β reverse: 5’-TGT ACT CCT TGG CCT TCA GGT AA-3’(서열번호 41)
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 siRNA 복합체 역시 종래의 siRNA 구조를 가지는 siRNA 혼합물을 PEI와 결합시켜 도입한 경우와 마찬가지로 폴리 I:C의 양성 대조군에 의해 유도되는 IFN-β mRNA 수준의 1% 미만에 불과하였다.
상기 실험결과는 본 발명에 따른 siRNA 복합체의 다중 siRNA가 30bp 이상의 길이임에도 불구하고 종래 siRNA 구조와 마찬가지로 비특이적인 항바이러스 반응을 보이지 않음을 의미한다.
실시예 7: 링커를 이용한 삼중 siRNA 전달 복합체의 제조 및 유전자 억제 활성 측정
7-1: T-tiSurvivin의 제조 및 유전자 억제활성 측정
도 7에 나타난 바와 같은 삼중 포스포라미다이트 화합물(Trebler phosphoramidite, Trilink Bio Technology, USA)를 이용하여 삼중 siRNA 전달 복합체를 제작하였다.
먼저, 상기 Trebler phosphoramidite를 구매한 다음, 제노텍사에 의뢰하여 Trebler phosphoramidite에 서열번호 42의 DNA 올리고뉴클레오티드를 세 가닥 연결하였다 (적색 표시, Trebler로부터 5'->3' 방향). 그 다음, 서열번호 42의 DNA 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 부분과 siSurvivin 의 안티센스 서열을 동시에 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 (서열번호 43), 그리고 siSurvivin 센스 서열 (서열번호 44)을 동시에 어닐링하여 도 7과 같이 T-tiSurvivin을 구현하였다. 그리고나서, 대조군으로서 도 8의 siSurvivin, long siSurvivin, 그리고 도 7의 T-tiSurvivin을 각각 PEI와 결합시켜 HeLa 세포 내부에 전달한 뒤, 24시간 후에 Survivin mRNA의 발현 정도를 실시예 2와 동일한 방법으로 리얼 타임 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다.
Survivin-forward: 5’-GCA CCA CTT CCA GGG TTT AT-3’ (서열번호 48)
Survivin-reverse: 5’-CTC TGG TGC CAC TTT CAA GA-3’ (서열번호 49)
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, T-tiSurvivin의 유전자 발현 억제효과가 기존의 siRNA나 긴(long) siSurvivin에 비하여 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, IC50 값을 측정한 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이, 종래 구조의 siRNA에 비하여 약 11배 낮은 값을 보이는 것으로 확인되었다. 이는 기존의 siRNA 구조에 비하여 본 발명의 링커를 이용한 삼중구조의 siRNA가 더 우수한 유전자 억제효율을 보임을 의미한다.
7-2: Survivin, cateinin, Integrin 의 발현 억제하는 T-tiRNA의 제조 및 유전자 억제활성 측정
실시예 7-1과 동일한 방법으로, siSurvivin, siIntegrin 및 siβ-catenin을 Trebler phosphoramidite에 결합시켜 도 10a와 같이 삼중 siRNA 전달 복합체를 제작하였다. 그리고나서, 도 10a의 T-tiRNA 및 대조군으로서 도 8의 siSurvivin와 siIntegrin, siβ-catenin의 혼합물을 PEI와 결합시켜 HeLa 세포 내부에 전달한 뒤, 24시간 후에 Survivin mRNA, Integrin mRNA, β-catenin mRNA의 발현 정도를 실시예 2와 동일한 방법으로 리얼 타임 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다. 이때, Survivin에 대한 프라이머쌍은 실시예 7-1에서 사용한 프라이머쌍을 이용하였다.
Integrin-forward 5’-CGT ATC TGC GGG ATG AAT CT-3’ (서열번호 54)
Integrin-reverse 5’-GGG TTG CAA GCC TGT TGT AT-3’ (서열번호 55)
β-catenin-forward 5’-ATG TCC AGC GTT TGG CTG AA-3’ (서열번호 56)
β-catenin- reverse 5’-TGG TCC TCG TCA TTT AGC AG-3’ (서열번호 57)
siIntegrin sense: 5’-UGAACUGCACUUCAGAUAU(dTdT)-3’ (서열번호 58)
siIntegrin antisense: 5’-AUAUCUGAAGUGCAGUUCA(dTdT)-3’ (서열번호 59)
siβ-catenin sense: 5’-GUAGCUGAUAUUGAUGGACUU-3’ (서열번호 60)
siβ-catenin antisense: 5’-GUCCAUCAAUAUCAGCUACUU-3’ (서열번호 61)
그 결과, 도 10b에 나타난 바와 같이, T-tiRNA의 유전자 발현 억제효과가 siRNA 혼합물에 비하여 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이 역시 기존의 siRNA 구조에 비하여 본 발명의 링커를 이용한 삼중구조의 siRNA가 더 우수한 유전자 억제효율을 보임을 의미한다.
7-3: miR-21를 억제하고, catenin 및 Integrin 의 발현을 억제하는 다기능성 MT-tiRNA의 제조 및 유전자 억제활성 측정
실시예 7-1과 동일한 방법으로, Anti-miR21, siIntegrin 및 siβ-catenin을 Trebler phosphoramidite에 결합시켜 도 11a와 같이 삼중 RNA구조체를 제작하였다. 그리고나서, miR-21에 대한 타겟서열을 pMIR Report-luciferase vector (Ambion 사)의 루시퍼라제 mRNA 코딩 유전자의 3’ 비번역 부위의 SpeII 및 HindIII 위치에 삽입한 벡터를 구축하였다. 상기 삽입되는 각 타겟서열은 다음과 같다.
miR-21 target
miR-21 sense:
5’-AATGCACTAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGCTCAGCAAGCTTAATGC-3’ (서열번호 63)
miR-21 antisense:
5’-GCATTAAGCTTGCTGAGCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAACTAGTGCATT-3’ (서열번호 64)
상기 벡터를 도 11a의 MT-tiRNA 및 대조군으로서 Anti-miR21 및 siIntegrin, siβ-catenin의 혼합물을 PEI와 결합시켜 HeLa 세포 내부에 전달한 뒤, 실시예 4와 같이 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
Anti-miR21: 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’ (서열번호 65)
또한, 도 11a의 MT-tiRNA와 대조군으로서 Anti-miR21 및 siIntegrin, siβ-catenin의 혼합물을 PEI와 결합시켜 HeLa 세포 내부에 전달한 뒤, 24시간 후에 Integrin mRNA, β-catenin mRNA의 발현 정도를 실시예 2와 동일한 방법으로 리얼 타임 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 사용된 프라이머쌍은 실시예 7-2에서 사용한 프라이머쌍을 이용하였다.
그 결과, 도 11b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 MT-tiRNA 복합체가 miR-21을 억제하여 루시퍼라제 활성이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 핵산구조 복합체는 miRNA을 억제하는 기능도 나타낼 수 있는 다기능성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11c에 나타난 바와 같이, T-tiRNA의 유전자 발현 억제효과가 siRNA 혼합물에 비하여 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이 역시 기존의 siRNA 구조에 비하여 본 발명의 링커를 이용한 삼중구조의 siRNA가 더 우수한 유전자 억제효율을 보임을 의미한다.
7-4: miR-21을 억제하는 T-tiAnti-miR21의 제조 및 miR-21 억제 활성 측정
추가적으로 실시예 7-1과 동일한 방법으로, 3개의 Anti-miR21을 각각 Trebler phosphoramidite에 연결시켜 삼중 RNA구조체를 제작하였다. 그 다음, 실시예 7-3과 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 대조군으로는 Anti-miR21을 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, antagomiR인 Anti-miR21를 도입한 경우와 달리, T-tiAnti-miR21을 도입한 경우, miR-21을 억제하여 루시퍼라제 활성이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 핵산구조 복합체는 기존의 AntagomiR에 비하여 더 높은 효율로 miRNA의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 양이온성 세포전달체와의 결합력 및 세포전달력 측정
8-1: HS에 의한 분리율 비교
세포 내로 핵산을 도입하는 과정에서 핵산과 양이온성 세포전달체간 상호작용이 세포 표면의 음전하를 띠는 프로티오글리칸(proteoglycan)으로 인하여 저해받을 수 있으므로, 본 발명에 따른 다중siRNA 복합체의 세포표면에 발현되는 양이온성 프로티오글리칸인 HS(heparan sulfate)에 의한 분리율을 다음과 같이 실험하였다. 먼저, 도 8의 19bp siSurvivin 및 도 7의 T-tiSurvivin을 각각 PEI(N/P=5)와 결합시킨 다음, 각 복합체와 HS(Sigma/Aldrich)를 HS의 양을 점차 증가시키며 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 이용시켜 각 복합체로부터 떨어져 나온 siRNA의 양을 측정하였다. 이때, EtBr로 염색하고 UV transillumination으로 가시화하여 확인하였다.
그 결과, 도 13a에 나타난 바와 같이, siSurvivin은 동량(1 equivalent (wt/wt))의 HS에 의해 PEI로부터 분리되어 나왔으나, 본 발명에 따른 복합체는 4배 증가된 HS와 함께 배양한 경우에야 분리되어 나오는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 실험결과는 본 발명에 따른 다기능성 RNA구조 복합체는 세포 내로의 도입 전 양이온성 세포 표면물질에 의한 영향에 저항성을 가짐을 나타낸다.
8-2: FITC를 이용한 세포 내 전달능 측정
본 발명에 따른 다기능성 RNA구조체(T-tiSurvivin) 및 종래 siRNA(siSurvivin(도 8))에 대한 세포 내 전달정도를 비교하기 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 FITC로 각각 라벨링한 다음, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 13b에 나타난 바와 같이, siSurvivin의 경우 세포 내 거의 도입되지 않은 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 T-tiSurvivin의 경우 세포 내 부위에서 산재된 녹색의 스팟을 확인할 수 있었다.
아울러, 유세포분석기를 이용하여 FITC-라벨된 RNA들이 도입된 세포들의 형광강도를 측정하였다. 측정은, FITC-라벨된 T-tiSurvivin 및 siSurvivin을 각각 PEI에 결합시켜 HeLa 세포에 트랜스펙션시킨 다음, 3시간 후에 세포들 수집하여 PBS로 두 번 세척한 후 FACSCalibur system (Becton Dickinson)을 이용하여 이루어졌다.
그 결과, 도 13c에 나타난 바와 같이, 종래의 siRNA 구조에 비하여, 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조체가 형광강도가 증가된 것으로 나타났으며, 이를 정량화한 결과, 도 13d와 같이, 평균강도에서 약 10배의 차이가 나타남을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조체가 종래의 siRNA에 PEI를 결합시킨 것에 비하여 세포 내 전달 활성이 매우 우수함을 나타낸다.
실시예 9: 암세포 성장 억제효과 확인
본 발명에 따른 복합체가 항암조성물로서 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 먼저 실시예 7-1과 같은 방법으로 Survivin mRNA 발현정도를 측정한 결과, 본 발명에 따른 T-tiSurvivin이 종래의 siRNA구조인 siSurvivin에 비하여 현저하게 Survivin 발현을 억제함을 확인 (도 14a)한 다음, 도 7의 T-tiSurvivin과 도 8의 siSurvivin을 각각 간암세포주인 HepG2 세포(ATCC No. HB-8065)에 도입하여 암세포성장억제정도를 측정하였다.
그 결과, 도 14b 및 도 14c에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 다기능성 RNA구조체인 T-tiSurvivin을 PEI 와 결합시켜 도입한 경우 siSurvivin을 도입한 경우와 아무것도 처리하지 않은 대조군과 달리 암세포 증식을 억제하고 사멸화하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 따른 복합체가 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있어 암의 치료 및 증식억제용 항암조성물로 제공될 수 있음을 확인하였다.
실시예 10: 면역반응 유도여부 확인
본 발명에 따른 다중siRNA 및 핵산구조체가 종래 siRNA와 비교하여, dsRNA에 의해 매개되는 선천성 면역반응을 야기하는지 확인하기 위하여, 3개의 항바이러스성 면역 반응 유전자의 발현여부를 확인하였다.
먼저, dsRNA 처리에 대하여 매우 높은 면역 민감성을 가지는 것으로 보고된 T98G 세포에 도 7의 T-tiSurvivin, 도 8의 siSurvivin와, 실시예 2의 siRNA 혼합물 및 tsiRNA를 각각 Lipofectamine2000과 결합하여 도입시킨 후, IFIT1, IFN-β, OAS2의 유도 수준을 실시예 2와 동일한 방법으로 RT-PCR 방법에 의하여 측정하였다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같으며, 항바이러스성 반응을 일으키는 양성 대조군으로는 폴리(I:C)-도입된 세포를 사용하였다.
IFIT1 RT-PCR용 프라이머쌍
IFIT1-Forward 5’-GCC ACA AAA AAT CAC AAG CCA-3’(서열번호 66)
IFIT1-reverse 5’-CCA TTG TCT GGA TTT AAG CGG-3’ (서열번호 67)
IFN-β RT-PCR용 프라이머쌍
IFN-β forward: 5’-AGA AGT CTG CAC CTG AAA AGA TAT T-3’ (서열번호 40)
IFN-β reverse: 5’-TGT ACT CCT TGG CCT TCA GGT AA-3’(서열번호 41)
OAS2 RT-PCR용 프라이머쌍
OAS2-forward: 5’-TCA GAA GAG AAG CCA ACG TGA-3’ (서열번호 68)
OAS2-reverse: 5’-CGG AGA CAG CGA GGG TAA AT-3’ (서열번호 69)
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조 복합체와 달리, dsRNA 처리에 대하여 매우 높은 면역 민감성을 가지는 것으로 보고된 T98G 세포에서 발명에 따른 다중siRNA 복합체의 경우 바이러스에 의한 면역반응유전자로 알려진 IFIT1 및 OAS2의 발현을 유도함을 확인할 수 있었다. 즉, 비특이적인 면역반응을 유도함을 확인할 수 있었다. 다만, IFN-β의 경우 HELA 세포에 도입한 실시예 2와 유사하게 폴리 I:C의 양성 대조군에 의해 유도되는 IFN-β mRNA 수준의 1% 미만에 불과하였다.
상기 실험결과는 비특이적인 면역반응을 유도하지 않기 위해서는 3 이상의 관능기를 가지는 화합물을 링커로서 이용한 다기능성 핵산구조 복합체가 더 효과적임을 제시한다.
실시예 11: 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체의 제작 및 Dicer에 대한 기질인지 여부의 확인
긴 dsRNA가 세포내 도입되는 경우, Dicer에 의하여 잘려서 21~23bp의 siRNA가 생성되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 다중siRNA 및 다기능성 핵산구조체가 종래의 dsRNA들과 상이한 기작에 따르는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
11-1: tsiRNA 및 T-tiSurvivin가 Dicer 기질로 작용하는지의 확인
27bp의 dsRNA, 실시예 2의 siLamin과 tsiRNA, 도 8의 siSurvivin, 및 도 7의 T-tiSurvivin을 각각 30pmol씩 Turbo Dicer siRNA generation Kit (Genlantis)을 이용하여 12시간 동안 제조자의 프로토콜에 따라 반응시킨 다음, 각 반응물을 2 ㎕ 분획을 취하여 10% non-denaturing polyacrylamide gel에서 전개시켰다. 이때, EtBr로 염색하고, UV transillumination으로 확인하였다.
27bp dsRNA
Survivin27 Sense: 5’-UCU UAG GAA AGG AGA UCA ACA UUU UCA-3’ (서열번호 70)
Survivin27 Antisense: 5’-UGA AAA UGU UGA UCU CCU UUC CUA AGA-3’(서열번호 71)
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 27bp dsRNA는 완전히 잘려지는 것과 달리, 본 발명에 따른 다중siRNA나 다기능성 핵산구조체는 좋은 Dicer 기질은 아닌 것으로 확인되었다. 다만, tsiRNA의 경우 일부 부분적으로 Dicer에 의해 잘린 것으로 확인되었다. 이에 이하 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 및 다기능성 핵산구조체를 제작하여 다음의 실험을 수행하였다.
11-2: 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체의 제조 및 이들이 Dicer의 기질로 작용하는지의 확인
실시예 2의 tsiRNA 및 도 7의 T-tiSurvivin의 접합되는 부분의 일 말단들을 도 17 및 도 18과 같이 회색으로 밑줄 친 부분의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기를 -O-메틸기로 치환한 화학적 변형을 가지는 다중siRNA (tsiRNA(OMe)) 및 다기능성 핵산구조체(T-tiSurvivin(OMe))를 제조한 다음, 실시예 11-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, tsiRNA(OMe) 및 T-tiSurvivin(OMe) 모두 Dicer에 기질로서 작용하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
11-3: 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체의 유전자 발현 억제효과 확인
실시예 11-2와 같이 Dicer에 기질로서 작용하지 않는 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체가 유전자 발현 억제효과를 갖는지 확인하기 위하여, 실시예 2 및 실시예 7-1과 같은 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 화학적 변형을 가지는 다중siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체 모두 우수한 유전자 발현 억제 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 siRNA 복합체 및 다기능성 핵산구조 복합체는 종래 복수의 목적 유전자 발현을 억제하기 위한 shRNA 시스템에 비하여 용이하게 화학적 합성될 수 있는 새로운 구조이면서도, 종래의 siRNA 보다 향상된 효율로 복수의 유전자를 동시에 발현 억제시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 높은 세포 내 전달능을 가질 뿐만 아니라, 비특이적인 항바이러스성 반응을 일으킴없이 특이적으로 목적 유전자들을 발현 억제시킬 수 있는 바, 암이나 바이러스성 감염 등을 치료하기 위한 siRNA 기작 매개 치료제로서 매우 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 다기능성 핵산구조 복합체는, siRNA 이외에 miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 라이보자임(ribozyme)과 같은 기능성 핵산올리고뉴클에오티드를 결합하여 동시에 다양한 기능을 제공할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일로 첨부하였음.

Claims (35)

  1. 3 이상의 siRNA가 각각의 일 말단에서 서로 접합되어 있는 다중 siRNA에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 siRNA 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3 이상의 siRNA는 안티센스의 3’ 방향 말단에서 서로 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 siRNA에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2’ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다중 siRNA는 서로 다른 siRNA로 구성되는 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 전달체는 전하간 작용에 의하여 결합되는 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 세포전달체는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질인 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 양이온성 세포전달체는 폴리에틸렌이민 또는 리포좀인 것을 특징으로 하는 siRNA 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 siRNA의 세포 내 전달방법.
  10. 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 3 이상의 핵산올리고뉴클레오티드의 각각의 일 말단이 연결되어 있는 다기능성 핵산구조체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물의 각 관능기에 핵산단편을 연결하고, 상기 siRNA의 센스 또는 안티센스 중 하나의 가닥, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머 중 어느 하나가 상기 핵산단편과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하도록 함으로써 상기 핵산단편과의 상보적 결합에 의하여 연결되는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 다기능성 핵산구조는 1 이상의 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 다기능성 RNA구조는 3개의 siRNA로 구성되는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 다기능성 RNA구조는 서로 다른 3개의 siRNA로 구성되는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  15. 제10항에 있어서, 상기 핵산올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 핵산올리고뉴클레오티드에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2’ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  17. 제10항에 있어서, 상기 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물은 포스포라미다이트 화합물, 요오드아세틸(lodoacetyl) 화합물, 말레이미드(maleimide) 화합물, 에폭사이드 화합물, 티올-다이설파이드(thiol-disulfide) 화합물, 티올화된 엘만 시약, NHS 또는 sulfo-NHS 화합물, 이소시아테이트(Isocyanate) 화합물 중 어느 하나임을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항의 다기능성 핵산구조체에 양이온성 세포전달체가 결합되어 있는, 세포 내 전달능이 증가된 다기능성 핵산구조 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 전달체는 전하간 작용에 의하여 결합되는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조 복합체.
  20. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 세포전달체는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질인 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조 복합체.
  21. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 세포전달체는 폴리에틸렌이민 또는 리포좀인 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조 복합체.
  22. 제18항의 복합체를 세포 내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체의 세포 내 전달방법.
  23. 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드의 일 말단을 연결시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 핵산구조체의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물의 각 관능기에 핵산단편을 연결한 다음, 상기 핵산올리고뉴클레오티드에 상기 핵산단편과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함시켜 상기 핵산단편과 상보적으로 결합하게 함으로써 연결하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물은 포스포라미다이트 화합물, 요오드아세틸(lodoacetyl) 화합물, 말레이미드(maleimide) 화합물, 에폭사이드 화합물, 티올-다이설파이드(thiol-disulfide) 화합물, 티올화된 엘만 시약, NHS 또는 sulfo-NHS 화합물, 이소시아테이트(Isocyanate) 화합물 중 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
  26. 다음 단계를 포함하는, 세포 내 전달능이 증가된 다기능성 핵산구조 복합체의 제조방법:
    (a) 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물에 siRNA, miRNA, antagomiR, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임(ribozyme) 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 핵산올리고뉴클레오티드의 일 말단을 연결하여 다기능성 핵산구조체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 다기능성 핵산구조체에 양이온성 세포전달체를 전하간 작용에 의하여 결합시키는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 상기 (a) 단계는 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물의 각 관능기에 핵산단편을 연결한 다음, 상기 핵산올리고뉴클레오티드에 상기 핵산단편과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함시켜 상기 핵산단편과 상보적으로 결합하게 함으로써 연결하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 3개 이상의 관능기를 가지는 화합물은 포스포라미다이트 화합물, 요오드아세틸(lodoacetyl) 화합물, 말레이미드(maleimide) 화합물, 에폭사이드 화합물, 티올-다이설파이드(thiol-disulfide) 화합물, 티올화된 엘만 시약, NHS 또는 sulfo-NHS 화합물, 이소시아테이트(Isocyanate) 화합물 중 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열번호 42의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 핵산올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 양이온성 세포전달체는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 siRNA 복합체를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  33. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 siRNA 복합체를 함유하는 항암조성물.
  34. 제12항의 다기능성 핵산구조 복합체를 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  35. 제12항의 다기능성 핵산구조 복합체를 함유하는 항암 조성물.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
WO2012135152A1 (en) * 2011-03-25 2012-10-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
JP2014527819A (ja) * 2011-09-14 2014-10-23 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 多量体オリゴヌクレオチド化合物
US9790494B2 (en) 2012-09-14 2017-10-17 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds having non-nucleotide based cleavable linkers
US10731157B2 (en) 2015-08-24 2020-08-04 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101679349B1 (ko) 2010-09-14 2016-11-24 엘지전자 주식회사 이동 단말기, 그 구동 방법 및 식별 모듈 카드
ES2732929T3 (es) * 2010-10-22 2019-11-26 Olix Pharmaceuticals Inc Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas
CN110248665A (zh) * 2017-02-06 2019-09-17 Mpeg La有限责任公司 具有降低的肾清除的多聚体寡核苷酸
AU2018433363B2 (en) * 2018-07-20 2022-12-08 Guangzhou Ribobio Co., Ltd. Nucleic acid unit and polymeric nucleic acid and application thereof
CA3110300A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Sirnaomics, Inc. Products and compositions
WO2020144583A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 Olix Pharmaceuticals, Inc. Cell-penetrating tripodal interfering rna
KR102635551B1 (ko) 2019-08-02 2024-02-08 가부시키가이샤 하모닉 드라이브 시스템즈 로터리 액츄에이터
CN114480377A (zh) * 2022-01-27 2022-05-13 浙江浥眸生物科技有限公司 一种刷状核酸组装体和复合纳米粒子及其应用
CN114748640B (zh) * 2022-05-06 2024-02-09 南方医科大学珠江医院 一种pH响应性的siRNA递送系统

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20050196781A1 (en) * 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of STAT3 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050222066A1 (en) * 2001-05-18 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US20040147466A1 (en) 2002-01-17 2004-07-29 Barman Shikha P. Nucleic acid delivery formulations
US20040053876A1 (en) * 2002-03-26 2004-03-18 The Regents Of The University Of Michigan siRNAs and uses therof
US20060178327A1 (en) * 2003-05-30 2006-08-10 Yeung Wah Hin A Inhibition of gene expression by delivery of specially selected double stranded or other forms of small interfering RNA precursors enabling the formation and function of small interfering RNA in vivo and in vitro
CA2604032C (en) * 2005-04-06 2017-08-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US20070148246A1 (en) * 2005-08-11 2007-06-28 Dan Luo Nucleic Acid-Based Matrixes
WO2007030167A1 (en) * 2005-09-02 2007-03-15 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Modification of double-stranded ribonucleic acid molecules
EP1951870B1 (de) * 2005-11-25 2013-04-24 Mologen AG Dna-konstrukte zur spezifischen hemmung der genexpression durch rna-interferenz
WO2007091269A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
KR100793505B1 (ko) * 2006-05-30 2008-01-14 울산대학교 산학협력단 복수의 표적 ｍＲＮＡ에 적용 가능한 ｓｉＲＮＡ염기서열을 추출하는 방법
WO2008109105A2 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Flagship Ventures Methods and compositions for improved therapeutic effects with sirna
WO2009020344A2 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Postech Acad Ind Found Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same
KR100806088B1 (ko) 2007-08-09 2008-02-21 고려대학교 산학협력단 히알루론산과 폴리에틸렌이민으로 이루어진 양이온성고분자 접합체를 이용한 핵산 전달용 조성물
KR100810034B1 (ko) 2007-08-23 2008-03-05 주식회사 바이오폴리메드 세포 증식 및 이동 억제를 위한 ＮＦ-ＫＢ ｐ105의ｓｉＲＮＡ 및 이를 함유하는 조성물
KR101590586B1 (ko) * 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALCATO-BELLEMIN A.L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 104, 2007, pages 16050
BOLCATO-BELLEMIN A.L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 104, 2007, pages 16050
BRAKE O. ET AL., MOL. THER., vol. 14, 2006, pages 883
ELBASHIR S.M. ET AL., NATURE, vol. 411, 2001, pages 494
JACQUE J.M. ET AL., NATURE, vol. 418, 2002, pages 435
KHALED A. ET AL., NANO LETT., vol. 5, 2005, pages 1797
KONSTANTINOVA P. ET AL., GENE THER., vol. 13, 2006, pages 1403
MANCHE L. ET AL., MOL. CELL BIOL., vol. 12, 1992, pages 5238
MENENDEZ J.A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 101, 2004, pages 10715
NISHITSUJI H. ET AL., MICROBES INFECT., vol. 6, 2004, pages 76
NOVINA C.D. ET AL., NAT. MED., vol. 8, 2002, pages 681
See also references of EP2395085A4
WATANABE T. ET AL., GENE THER., vol. 13, 2006, pages 883
WESTERHOUT E.M. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 33, 2005, pages 796

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2438168A2 (en) * 2009-06-01 2012-04-11 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
JP2012528572A (ja) * 2009-06-01 2012-11-15 ヘイロー−バイオ アールエヌエーアイ セラピューティクス， インコーポレイテッド 多価ｒｎａ干渉のためのポリヌクレオチド、組成物およびそれらの使用方法
EP2438168A4 (en) * 2009-06-01 2014-01-22 Halo Bio Rnai Therapeutics Inc MULTIVALENT RNA INTERFERENCE POLYNUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING SAME
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
US8877722B2 (en) 2011-03-25 2014-11-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2012135152A1 (en) * 2011-03-25 2012-10-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
US20130142778A1 (en) * 2011-03-25 2013-06-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
US9580708B2 (en) 2011-09-14 2017-02-28 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotides compounds
JP2014527819A (ja) * 2011-09-14 2014-10-23 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 多量体オリゴヌクレオチド化合物
US9732341B2 (en) 2011-09-14 2017-08-15 Translate Bio Ma, Inc. Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkers
US9732340B2 (en) 2011-09-14 2017-08-15 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotides compounds having cleavable linkers
US10093924B2 (en) 2011-09-14 2018-10-09 Translate Bio Ma, Inc. Multimetric oligonucleotide compounds
US10704046B2 (en) 2011-09-14 2020-07-07 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US9790494B2 (en) 2012-09-14 2017-10-17 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds having non-nucleotide based cleavable linkers
US10844375B2 (en) 2012-09-14 2020-11-24 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds having non-nucleotide based cleavable linkers
US10731157B2 (en) 2015-08-24 2020-08-04 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof

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