WO2010090095A1 - セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2010090095A1
WO2010090095A1 PCT/JP2010/050928 JP2010050928W WO2010090095A1 WO 2010090095 A1 WO2010090095 A1 WO 2010090095A1 JP 2010050928 W JP2010050928 W JP 2010050928W WO 2010090095 A1 WO2010090095 A1 WO 2010090095A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cellobiose
epimerase
isomerized sugar
experiment
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/050928
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
光 渡邊
政裕 八木
西本　友之
茶圓　博人
福田　恵温
Original Assignee
株式会社林原生物化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社林原生物化学研究所 filed Critical 株式会社林原生物化学研究所
Priority to US13/147,965 priority Critical patent/US20120040407A1/en
Priority to EP10738433.1A priority patent/EP2395080B1/en
Priority to JP2010549436A priority patent/JP5677097B2/ja
Publication of WO2010090095A1 publication Critical patent/WO2010090095A1/ja
Priority to US13/590,460 priority patent/US9175282B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a novel cellobiose 2-epimerase, a method for producing the same, and uses thereof. Specifically, cellobiose 2-epimerase catalyzing not only a 2-epimerization reaction but also an aldose-ketose conversion reaction, a method for producing the same, and the enzyme
  • the present invention relates to a coding DNA, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant, and a method for producing an isomerized sugar using the enzyme.
  • Isomerase is a general term for enzymes that catalyze the conversion between isomers. According to Enzyme Nomenclature, Academic Press. Inc., 1992, (1) optical isomerization. EC5.1 group containing racemase and epimerase that catalyze A; (2) EC 5.2 group that catalyzes conversion between cis-trans geometric isomers; (3) Aldose-ketose conversion, keto-enol tautomerism, intramolecular (5) EC5.5 group catalyzing intramolecular group rearrangement to form a structural isomer; (5) EC5.5 catalyzing intramolecular lyase reaction Group; and (6) 6 groups of EC 5.99 group catalyzing other isomerization reactions.
  • isomerases that catalyze the isomerization of neutral sugars
  • isomerases that catalyze the isomerization of neutral sugars for example, the interconversion of D-xylose and D-xylulose, D-glucose and D-fructose (aldose-ketose conversion) is catalyzed.
  • Xylose isomerase EC 5.3.1.5
  • aldose 1-epimerase EC 5.1.3.3
  • ketopentoses and ketohexoses in position 3 are well known, such as ketose 3-epimerase (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-125576, international publication number WO 2007/058086, etc.), It is widely used for the production of isomerized sugar, the determination of sugar, and the preparation of rare carbohydrates.
  • the above-mentioned known cellobiose 2-epimerase has a problem that it has low heat resistance and is difficult to use for producing sugars such as epilactose and epicellobiose at an industrial level.
  • Enzyme heat resistance is an extremely important factor in the practical application of enzyme reactions. Enzymes with excellent heat resistance can be reacted for a long time with a small amount of enzyme, so the amount of enzyme in the enzyme reaction can be reduced economically. It is advantageous. In consideration of industrial use, it is preferable to carry out the reaction at 55 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher in order to prevent contamination with germs. From such a point of view, cellobiose 2-epimerase having higher heat resistance is desired.
  • An object of the present invention is to provide a cellobiose 2-epimerase excellent in heat resistance, a method for producing the same, and a use thereof.
  • thermophilic microorganisms in search of cellobiose 2-epimerase having excellent heat resistance.
  • epilactose was produced by epimerizing lactose into a cell disruption extract of the microorganism CCDS cell saccharolyticus ATCC 43494 belonging to the genus Caldicellulosyruptor, The enzyme activity which produces
  • the epimerase was purified to the extent that it electrophoretically shows a single band, and its properties were examined. It was found that the epimerase had stable heat resistance up to 70 ° C. However, the amount of the purified enzyme preparation obtained was very small, which was insufficient for examining the detailed substrate specificity of the epimerase.
  • the DNA encoding the epimerase is cloned from the genomic DNA of cardicellulosyl buttor saccharolyticus, and E. coli is transformed with the recombinant DNA containing this.
  • the recombinant enzyme was prepared by culturing.
  • this enzyme not only converted cellobiose and lactose into epimers and converted them into epicellobiose and epilactose, but also D-glucose and It acts on D-galactose, further acts on maltose in the case of disaccharides and epimerizes by acting on maltooligosaccharides and cellooligosaccharides having a polymerization degree of 3 or more in the case of oligosaccharides, and corresponding D-mannose, D-talose, epimaltose (4 -O- ⁇ -D-glucosyl D-mannose), and has been found to have a wide range of substrate specificities such as conversion to epimaltooligosaccharides and epicellooligosaccharides having a polymerization degree of 3 or more.
  • the enzyme catalyzes not only the 2-epimerization reaction but also the aldose-ketose conversion reaction when the amount of enzyme action increases, and D-glucose or D-mannose, D-galactose or D-talose, maltose or epimaltose.
  • the present inventors established a novel cellobiose 2-epimerase, a DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA and a transformant comprising the DNA, a method for producing the enzyme, and the enzyme.
  • the present invention was completed by establishing a method for producing an isomerized sugar utilizing the above.
  • the present invention uses cellobiose 2-epimerase excellent in heat resistance, DNA encoding the enzyme, recombinant DNA containing the same, transformant, a method for producing the enzyme, and the enzyme.
  • the above-described problems are solved by providing a method for producing an isomerized sugar.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention has high heat resistance, enables large-scale expression in recombinant microorganisms, and facilitates purification of the recombinant enzyme. According to the cellobiose 2-epimerase of the present invention, it is possible to produce D-mannose from D-glucose, epimaltose from maltose, epicellobiose or cellobiulose from cellobiose, and epilactose or lactulose from lactose. Rare and higher added sugars can be produced at the industrial level.
  • FIG. 3 is a graph showing the influence of temperature on the enzyme activity of cellobiose 2-epimerase of the present invention. It is a figure which shows the influence of pH which acts on the enzyme activity of the cellobiose 2-epimerase of this invention. It is a figure which shows the influence of the temperature which acts on stability of the cellobiose 2-epimerase of this invention.
  • 2 is an HPLC chromatogram of a reaction solution obtained by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on lactose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar A isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on lactose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of a commercially available epilactose standard product.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar B isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on lactose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of a commercially available lactulose standard.
  • 2 is an HPLC chromatogram of a reaction solution obtained by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on cellobiose.
  • 2 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar C isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on cellobiose.
  • 3 is a 13 C-NMR spectrum of isomerized sugar C isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on cellobiose.
  • 2 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar D isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on cellobiose.
  • 3 is a 13 C-NMR spectrum of isomerized sugar D isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on cellobiose.
  • 2 is an HPLC chromatogram of a reaction solution obtained by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar E isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltose.
  • 6 is a 13 C-NMR spectrum of isomerized sugar E isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar F isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltose.
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of a commercially available standard maltulose product.
  • 2 is an HPLC chromatogram of a reaction solution obtained by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltotriose.
  • 2 is a 1 H-NMR spectrum of isomerized sugar G isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltotriose.
  • 3 is a 13 C-NMR spectrum of isomerized sugar G isolated by allowing cellobiose 2-epimerase of the present invention to act on maltotriose.
  • FIG. a Maltooligosaccharide mixture (marker of glucose polymerization degree) b: Cellobiose standard product c: Cellobiose reaction solution d: Lactose standard product e: Lactose reaction solution f: Epilactose standard product g: Epilactose reaction solution ⁇ : Lactose (isomerized sugar) G 1 : Glucose G 2 : Maltose G 3 : Maltotriose G 4 : Maltotetraose In FIG. Lac: lactose A + B: mixture of isomerized sugars A and B In FIG.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention is an enzyme that catalyzes an isomerization reaction, more specifically, the following 2-epimerization reaction and aldose-ketose conversion reaction.
  • 2-epimerization reaction The 2-position of D-glucose and D-galactose is epimerized and converted to D-mannose and D-talose, respectively, and the reverse reaction is also catalyzed; Epimerize the 2-position of reducing terminal glucose in maltose, cellobiose and lactose to convert to epimaltose, epicellobiose and epilactose, respectively; Epimerize the 2-position of the reducing terminal glucose in maltooligosaccharides and cellooligosaccharides having a degree of polymerization of 3 or more, and convert them into epimaltooligosaccharide and epicellooligosaccharide, respectively; (2) Aldose-ketose conversion reaction D-glucose or D-mannose is converted
  • cellobiose 2-epimerase of the present invention include those having the following physicochemical properties.
  • lactose 2-epimerase activity was measured as follows. 200 ⁇ l of enzyme solution is added to 1000 ⁇ l of a substrate solution prepared so that lactose is 35.1 mM and acetate buffer (pH 6.0) is 20 mM as final concentrations in the reaction solution to obtain 1200 ⁇ l of reaction solution, and the reaction is carried out at 50 ° C. for 20 minutes. Then, the reaction was stopped by heating in a boiling water bath for 10 minutes.
  • This reaction stop solution was subjected to HPLC analysis, and the amount of epilactose produced by the reaction of this enzyme was measured.
  • HPLC is performed using a “MCI GEL CK08EP” column (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) under conditions where the column temperature is 75 ° C., the flow rate is 0.6 ml / min, and water is used as the eluent.
  • a differential refractometer “RID-10A” manufactured by Shimadzu Corporation was used.
  • One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 ⁇ mol of epilactose per minute from lactose under the above conditions.
  • One of the cellobiose 2-epimerases of the present invention having the above physicochemical properties has not only the above physicochemical properties but also the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as its N-terminal sequence. There may be.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention usually has a specific amino acid sequence, and examples thereof include the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing or an amino acid sequence homologous thereto.
  • the amino acid sequence homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing as long as it retains the enzyme activity of catalyzing various isomerization reactions. Examples include amino acid sequences in which one or more and less than 10 amino acids have been deleted, substituted, or added.
  • the DNA of the present invention means a DNA encoding cellobiose 2-epimerase having the above amino acid sequence.
  • the DNA of the present invention encodes the cellobiose 2-epimerase, it may be naturally derived or artificially synthesized.
  • Natural sources include, for example, microorganisms of the genus Cardiscellulosyptor, including Caldicellulosiruptor saccharolyticus ATCC 43494. Genomic DNA containing the DNA of the present invention from these cells Can be obtained.
  • such a microorganism is inoculated into a nutrient medium, cultured for about 1 to 3 days under anaerobic conditions, and then the cells are collected from the culture and treated with cell wall lytic enzymes such as lysozyme and ⁇ -glucanase and ultrasonic waves.
  • cell wall lytic enzymes such as lysozyme and ⁇ -glucanase and ultrasonic waves.
  • the genomic DNA containing the DNA is eluted out of the cells.
  • a proteolytic enzyme such as protease may be used in combination, or a surfactant such as SDS may be coexistent or freeze-thawed.
  • the target genomic DNA can be obtained by applying conventional methods such as phenol extraction, alcohol precipitation, centrifugation, and ribonuclease treatment to the treated product thus obtained.
  • the DNA of the present invention may be chemically synthesized based on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • PCR synthesis can be advantageously performed using a genomic DNA containing the DNA as a template and a chemically synthesized oligonucleotide serving as an appropriate primer.
  • the DNA of the present invention may have a specific base sequence, and examples thereof include, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or a base sequence homologous thereto, or complementary to those base sequences. Can be mentioned.
  • the nucleotide sequence that is homologous to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing is 1 to less than 30 within the range that retains the activity of the encoded enzyme in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • the base sequence in which the base is deleted, substituted, or added.
  • the DNA of the present invention retains the activity of the encoding enzyme in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • One or more bases without changing the amino acid sequence of the encoding enzyme based on the degeneracy of the genetic code in a base sequence in which one or more and less than 30 bases have been deleted, substituted or added DNA having a base sequence in which is replaced with other bases is also included.
  • Recombinant DNA usually consists of DNA and an autonomously replicable vector. If DNA is available, it can be prepared relatively easily by conventional recombinant DNA techniques.
  • vectors include plasmid vectors such as pBR322, pUC18, pBluescript II SK (+), pUB110, pTZ4, pC194, pCR-Script Cam SK +, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, and ⁇ gt ⁇ ⁇ , ⁇ 11, ⁇ 1, ⁇ 105, and the like.
  • pBR322 pUC18, pBluescript II SK (+), pCR-Script Cam SK +, ⁇ gt ⁇ ⁇ C and ⁇ gt ⁇ ⁇ B are preferred for expressing the DNA of the present invention in E. coli, whereas it is expressed in Bacillus subtilis.
  • pUB110, pTZ4, pC194, ⁇ 11, ⁇ 1, and ⁇ 105 are preferable.
  • pHV14, TRp7, YEp7 and pBS7 are useful when replicating recombinant DNA in two or more hosts. In order to insert DNA into such a vector, a general method is usually employed in this field.
  • genomic DNA containing DNA and an autonomously replicable vector are cleaved with a restriction enzyme, and then the generated DNA fragment and vector fragment are ligated.
  • Restriction enzymes that specifically act on nucleotides for the cleavage of genetic DNA and vectors, especially type II restriction enzymes, in particular Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I, Pst If I, Nde I, Nco I or the like is used, it is easy to link the DNA fragment and the vector fragment.
  • DNA ligase may be allowed to act in vivo or in vitro.
  • the recombinant DNA thus obtained can be replicated indefinitely by appropriately introducing it into a host to form a transformant and culturing it.
  • a transformant can be obtained by introducing the recombinant DNA thus obtained into an appropriate host microorganism such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, or yeast.
  • an appropriate host microorganism such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, or yeast.
  • a colony hybridization method may be applied, or a crude enzyme may be prepared by culturing in a nutrient medium, and one having the cellobiose 2-epimerase activity may be selected.
  • the medium used for culturing microorganisms (including transformants) capable of producing cellobiose 2-epimerase of the present invention may be any nutrient medium that can grow microorganisms and can produce cellobiose 2-epimerase. Any medium may be used. Any carbon source may be used as long as it can be used by microorganisms for growth.For example, a partially decomposed product of starch, carbohydrates such as glucose, fructose, lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, molasses, citric acid, succinic acid, etc. Organic acids such as can also be used. The concentration of these carbon sources in the medium can be appropriately selected depending on the type of carbon source.
  • inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates and organic nitrogen-containing materials such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract and meat extract
  • inorganic component for example, salts such as calcium salt, magnesium salt, potassium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, zinc salt, iron salt, copper salt, molybdenum salt, and cobalt salt are appropriately used. it can.
  • amino acids, vitamins, and the like can be used as necessary.
  • the conditions under which the microorganism having the ability to produce cellobiose 2-epimerase of the present invention grows appropriately may be appropriately selected and used.
  • the culture is usually performed at a temperature of 50 to 80 ° C., preferably 60 to 70 ° C., pH 5 to 8, preferably pH 6.5 to 7.5. Performed anaerobically under the chosen conditions.
  • the culture time may be a time during which the microorganism can grow, and is preferably 10 to 72 hours.
  • the microorganism is a transformant
  • the culture is usually performed at a temperature of 15 to 37 ° C.
  • the conditions selected from the above ranges may be 10 to 150 hours under aerobic conditions with aeration and agitation.
  • the culture method may be either batch culture or continuous culture.
  • the culture containing the cellobiose 2-epimerase of the present invention is recovered.
  • the cellobiose 2-epimerase activity of the present invention is mainly found in the microbial cells, and the microbial cells can be collected as a crude enzyme, or the microbial cell disruption extract can be used as a crude enzyme solution.
  • a known solid-liquid separation method is employed to recover the bacterial cells from the culture. For example, a method of centrifuging the culture itself, a method of filtering and separating using a precoat filter or the like, a method of separating by membrane filtration such as a flat membrane or a hollow fiber membrane, and the like are appropriately employed.
  • the cell disruption extract can be used as a crude enzyme solution as it is, it is generally used after being concentrated.
  • concentration method an ammonium sulfate salting-out method, an acetone and alcohol precipitation method, a membrane concentration method using a flat membrane, a hollow membrane, or the like can be employed.
  • the enzyme may accumulate in the microbial cells depending on the type of host.
  • the cells or culture can be used as they are, but usually, prior to use, after extraction from the cells by osmotic shock or a surfactant, if necessary, or It is also possible to advantageously carry out the use of the recombinant enzyme separated from the bacterial cells or the disrupted cells by filtration, centrifugation or the like after disrupting the cells with ultrasonic waves or cell wall lytic enzymes.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention can be used as it is or after concentrating a crude enzyme solution such as a cell disruption extract, but if necessary, it can be further separated and purified by a known method. Can also be used. For example, the supernatant of the cell disruption extract is concentrated with a UF membrane, or the enzyme solution obtained by salting out and dialyzing ammonium sulfate is purified by combining various purification methods such as anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration chromatography. Thus, the cellobiose 2-epimerase of the present invention can be electrophoretically obtained as a single enzyme.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention is a recombinant enzyme obtained by culturing a transformant
  • the cell disruption extract is used for ammonium sulfate salting out by utilizing the fact that it has better heat resistance than ordinary proteins.
  • the crude enzyme preparation concentrated in this way is heat-denatured at about 70 ° C for a certain period of time to heat-denature the contaminating host-derived protein, and the protein that precipitates by denaturation is removed by centrifugation or the like for easy purification. Can do.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention can be made into an immobilized enzyme by a known method using the cell disruption extract, concentrated solution or purified enzyme solution having the cellobiose 2-epimerase activity of the present invention.
  • the immobilization method for example, a binding method to an ion exchanger, a covalent bonding method / adsorption method with a resin and a membrane, a comprehensive method using a polymer substance, and the like can be appropriately employed.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention has a wide range of substrate specificities.
  • monosaccharides act on D-glucose, D-galactose, and D-mannose, and are converted to their epimers D-mannose, D-talose, and D-glucose.
  • Disaccharides act on maltose, cellobiose and lactose and convert to epimaltose, epicellobiose and epilactose, respectively.
  • oligosaccharides act on cellooligosaccharides and maltooligosaccharides, and are converted into corresponding epicellooligosaccharides and epimaltooligosaccharides, respectively.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention catalyzes not only a 2-epimerization reaction but also an aldose-ketose conversion reaction when the amount of enzyme action is increased.
  • D-glucose or D-mannose is converted to D-fructose
  • D-galactose or D-talose is converted to D-tagatose.
  • cellobiose or epicellobiose is converted to cellobiulose
  • lactose or epilactose is converted to lactulose
  • maltose or epimaltose is converted to maltulose.
  • this enzyme converts aldose to ketose and catalyzes the reverse reaction, the conversion activity of ketose to aldose is weak, and a large amount of enzyme is required for the conversion.
  • the substrate concentration is not particularly limited.
  • the reaction of the inventive cellobiose 2-epimerase proceeds to produce its epimer and / or aldose-ketose isomerized sugar from a particular carbohydrate.
  • a substrate concentration of 1% (w / v) or more is suitable, and various epimers and / or isomerized sugars can be advantageously produced under these conditions.
  • the reaction temperature may be a temperature at which the reaction proceeds, that is, up to about 80 ° C. Preferably, a temperature around 50 to 60 ° C. is used.
  • the reaction pH is usually adjusted in the range of 5.0 to 9.0, preferably in the range of pH 6.0 to 8.0.
  • the amount of enzyme used and the reaction time are closely related and may be appropriately selected depending on the progress of the target enzyme reaction.
  • the microorganism having cellobiose 2-epimerase producing ability of the present invention is cultured in a nutrient medium containing the above-mentioned aldose or ketose as a substrate, and is produced in the culture solution and is an isomerized sugar corresponding to aldose or ketose, respectively. It is also possible to produce an isomerized sugar by collecting
  • a normal method used for sugar purification may be appropriately employed.
  • decolorization with activated carbon desalting with H-type or OH-type ion exchange resins.
  • Fractionation by column chromatography such as ion exchange column chromatography, activated carbon column chromatography, silica gel column chromatography, separation by a membrane having an appropriate separation performance, and further, it is possible to utilize contaminated carbohydrates without using the target carbohydrate.
  • One or two or more purification methods such as fermentation treatment with microorganisms that decompose or decompose, such as yeast, and enzyme treatment using an enzyme that specifically degrades the raw sugar without acting on the target carbohydrate can be appropriately employed. .
  • ion exchange column chromatography As an industrial purification method, it is preferable to employ ion exchange column chromatography. For example, strongly acidic cations disclosed in JP-A-58-23799 and JP-A-58-72598 are disclosed.
  • a saccharide composition in which the content of the target carbohydrate is improved can be advantageously produced by removing contaminating saccharides by column chromatography using an exchange resin.
  • ⁇ Experiment 1-1 Cultivation of Calgicellosylptor saccharolyticus ATCC 43494 and preparation of cell disruption extract> Prepare the American Type Culture Collection Medium, No. 1368, described on page 470 of "ATCC Catalog of Bacteria and Bacteriophages, 18th Edition" (American Type Culture Collection, 1992). After sterilization, 12 ml in a 12 ml pressure-resistant glass bottle was inoculated with cardicellulosyl butter saccharolyticus ATCC 43494 and incubated at a temperature of 70 ° C. for about 72 hours. The bacterial cells obtained by centrifuging the culture broth were ultrasonically disrupted, and the centrifugal supernatant of the disrupted bacterial cell extract was used as a crude enzyme solution.
  • Example 1-2 Action of crude enzyme solution on lactose, cellobiose and epilactose>
  • Cellobiose, lactose or epilactose was dissolved in 100 mM acetate buffer (pH 6.0) to a final concentration of 3.4% (w / v), and each was used as a substrate solution.
  • 10 ⁇ l of the crude enzyme solution prepared by the method of Experiment 1-1 was added to 10 ⁇ l of the substrate solution, and reacted at 50 ° C. for 16 hours. After completion of the reaction, it was subjected to thin layer chromatography (hereinafter abbreviated as “TLC”) analysis under the following conditions.
  • TLC thin layer chromatography
  • symbols a to g represent samples subjected to TLC analysis
  • symbols a, b, c, d, e, f, and g represent a maltooligosaccharide mixture (glucose polymerization degree marker) and a cellobiose standard product, respectively.
  • Cellobiose reaction solution, lactose standard product, lactose reaction solution, epilactose standard product and epilactose reaction solution are shown.
  • the cellobiose reaction solution (reference c in FIG. 1) contains glucose (position corresponding to G 1 in reference a in FIG. 1) and an unknown sugar (reference a in FIG. 1).
  • spot position corresponding to G 4 observed in the lactose of the reaction solution (glucose and galactose to code e) in FIG. 1 is lactose degradation products (position corresponding to G 2 in the code a in FIG. 1) Spot was recognized.
  • spots of isomers presumed to be lactose (symbol ⁇ in FIG. 1) were recognized in the reaction solution of epilactose (symbol g in FIG. 1). Since the production of lactose, an isomerized product, was observed from epilactose, there was a possibility that products other than the degradation products existed in the reaction solution of cellobiose and lactose, and that the spots overlapped with the degradation product spots.
  • reaction solution of cellobiose and lactose was further trimethylsilylated (TMS) according to a conventional method and then subjected to gas chromatography (hereinafter abbreviated as “GC”) under the following conditions.
  • TMS trimethylsilylated
  • GC gas chromatography
  • Cardis cellulosylptor saccharolyticus ATCC 43494 has the ability to produce epimerase (cellobiose 2-epimerase) which epimerizes cellobiose, lactose and epilactose.
  • ⁇ GC analysis conditions Gas chromatograph: GC-14A (manufactured by Shimadzu Corporation) Column: 2% OV-17 Chromosolv W / AW-DMCS (Inner diameter 3mm x length 2m, manufactured by GL Sciences Inc.) Carrier gas: nitrogen Carrier gas flow rate: 40 ml / min Combustion gas: hydrogen Combustion gas flow rate: 40 ml / min Auxiliary combustion gas: air Auxiliary combustion gas flow rate: 600 ml / min Temperature rising program: 160 ° C. ⁇ 320 ° C. (7.5 ° C./min) Detection: FID (hydrogen flame ionization detector)
  • ⁇ Experiment 2 Purification of cellobiose 2-epimerase from Cardiscellulosyptor saccharolyticus ATCC 43494> The enzyme was purified for the purpose of clarifying the physicochemical properties of cellobiose 2-epimerase produced by Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494.
  • Example 2-1 Preparation of crude enzyme solution> Culture and seed culture in the same manner as in Experiment 1-1, except that eight 100 ml pressure-resistant glass bottles containing 100 ml of the medium used in Experiment 1-1 were inoculated with Cardiscellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494. It was. Next, 8 11L pressure-resistant steel bottles containing 10L of the same medium are inoculated one by one with the seed culture medium, and cultured in the same manner. After the culture, about 80L of the culture medium is centrifuged to wet cells. About 24 g was obtained.
  • the cells were suspended in 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), sonicated, and then centrifuged to obtain a microbial cell extract extract supernatant.
  • the supernatant of the cell disruption extract was used as a crude enzyme solution.
  • the epimerase activity of the crude enzyme solution was measured, and converted to 0.009 units / ml per 1 ml of the culture solution.
  • Example 2-2 Purification of cellobiose 2-epimerase>
  • the crude enzyme solution obtained in Experiment 2-1 was concentrated with a UF membrane, and about 40 ml of the concentrated enzyme solution was recovered.
  • the concentrated enzyme solution was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and centrifuged to remove insolubles.
  • the supernatant of the dialyzed solution 38 ml was added to “DEAE-Toyopearl 650S” (Tosoh Corporation).
  • Sold to anion Anion exchange column chromatography using a gel (gel capacity: 380 ml).
  • the protein adsorbed on the column was eluted with a linear gradient from 0 to 0.5 M NaCl, and the epimerase activity of the obtained fraction was examined. As a result, the epimerase activity was eluted in a fraction having a NaCl concentration of about 0.1 M. This eluted active fraction was collected, dialyzed against the same buffer containing 1M ammonium sulfate, and subjected to hydrophobic column chromatography (gel capacity 50 ml) using “Butyl-Toyopearl 650M” (sold by Tosoh Corporation) gel. .
  • the epimerase activity was eluted in a fraction having an ammonium sulfate concentration of about 0.8 M.
  • the active fraction was concentrated with a UF membrane, dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.4 M NaCl, and then equilibrated with the same buffer as a “Superdex 75” column ( It was subjected to gel filtration chromatography using 16 mm ⁇ 60 cm (manufactured by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), and the epimerase activity fraction was recovered.
  • the collected active fraction was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and a “DEAE-5PW” column (3.3 ml, manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with the same buffer was used.
  • the sample was subjected to anion exchange chromatography.
  • the protein adsorbed on the column was eluted with a NaCl linear gradient from 0 M to 0.5 M, and an epimerase activity fraction eluted in a fraction having a NaCl concentration of about 0.1 M was recovered.
  • the purified enzyme preparation obtained by the above purification was 0.9 mg as protein, and the activity recovery rate from the crude enzyme solution was 3.4%.
  • the specific activity of the purified enzyme preparation was 26.9 units / mg protein.
  • the protein was quantified by the Raleigh method using bovine serum albumin as a standard protein.
  • the purity of the purified enzyme preparation was assayed by gel electrophoresis using a 5-20% (w / v) concentration gradient polyacrylamide gel, the protein band was single and the purity was high.
  • ⁇ Experiment 3-1 Molecular weight> A purified cellobiose 2-epimerase sample obtained by the method of Experiment 2 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a 5 to 20% (w / v) gradient gel, and simultaneously migrated molecular weight markers (Nippon Bio-Rad) The molecular weight was 44,000 ⁇ 5,000 daltons as measured by comparison with that of Laboratories Inc.).
  • ⁇ Experiment 3-2 Optimum temperature and pH> Using the cellobiose 2-epimerase purified sample obtained by the method of Experiment 2, the effects of temperature and pH on epimerase activity were examined in accordance with the activity measurement method. The results are shown in FIG. 3 (optimum temperature) and FIG. 4 (optimum pH). The optimum temperature of this epimerase was 80 ° C. at pH 6.0 and reaction for 20 minutes. The optimum pH was 7.8 by reaction at 50 ° C. for 20 minutes.
  • Example 3-3 Temperature stability and pH stability> Using the cellobiose 2-epimerase purified sample obtained by the method of Experiment 2, the effects of temperature and pH on the stability of epimerase activity were examined.
  • the temperature stability was determined by measuring the remaining enzyme activity after holding the enzyme solution at each temperature for 60 minutes, cooling with water using a 10 mM acetate buffer (pH 6.0).
  • the pH stability was determined by maintaining the enzyme in a 100 mM buffer at each pH at 4 ° C. for 24 hours, readjusting the pH to 6.0, and measuring the remaining enzyme activity.
  • FIG. 5 temperature stability
  • FIG. 6 pH stability
  • the epimerase was stable up to 70 ° C.
  • this epimerase was stable in the range of pH 4.5 to 9.5.
  • HPLC column (trade name “Micro RPC C2 / C18 SC2.1 / 10”, diameter 2.1 mm ⁇ length, in which the hydrolyzate was previously equilibrated with 0.065% (v / v) trifluoroacetic acid. 100 mm, manufactured by GE Healthcare Bioscience), 0.065% (v / v) trifluoroacetic acid to 0.055% (v / v) trifoliate under conditions of a flow rate of 0.1 ml / min and room temperature.
  • the peptide fragment was fractionated by passing through a 160-minute linear gradient of fluoroacetic acid-80% (v / v) acetonitrile solution.
  • Peptide fragments eluted from the column were detected by measuring absorbance at a wavelength of 214 nm.
  • Three peptide fragments P1, P2, and P3 eluted at retention times of about 29 minutes, about 37 minutes, and about 39 minutes were collected, and their amino acid sequences were analyzed in the same manner as in Experiment 3-5. It had the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 4 in the table.
  • ⁇ Experiment 4-1 Preparation of genomic DNA> Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494 was cultured in the same manner as in Experiment 1-1, and about 20 ml of the culture solution was centrifuged to obtain 10 mg of cultured cells. Genomic DNA was prepared from the collected cells using “DN easy tissue kit” (Qiagen) according to the method described in the instructions attached to the kit to obtain 1.8 mg. The concentration of the prepared genomic DNA was 1.8 mg / ml.
  • DN easy tissue kit Qiagen
  • ⁇ Experiment 4-2 Cloning of DNA encoding cellobiose 2-epimerase and determination of nucleotide sequence> Based on the first to sixth amino acid sequences of the N-terminal amino acid sequence of cellobiose 2-epimerase (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is used as a sense primer.
  • An oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. Using these primers, the genomic DNA obtained in Experiment 4-1 as a template, KOD-plus-DNA polymerase (Toyobo) as a PCR enzyme, and DNA thermal cycler PJ2000 (Perkin Elmer) using a conventional method As a result of PCR amplification, a DNA fragment of about 1,000 bp was amplified.
  • This DNA fragment was cloned into the restriction enzyme Srf I site of the cloning vector pCR-Script Cam SK + (manufactured by Stratagene), and Escherichia coli XL-10 Gold was transformed with the obtained recombinant DNA.
  • Srf I site of the cloning vector pCR-Script Cam SK + (manufactured by Stratagene)
  • Escherichia coli XL-10 Gold was transformed with the obtained recombinant DNA.
  • pCRCS1 The recombinant DNA was named “pCRCS1”.
  • the amino acid sequence encoded by the decoded 1,004 bp base sequence contained the internal structure of cellobiose 2-epimerase.
  • a partial amino acid sequence (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) was included. From this result, it was speculated that the obtained DNA fragment was a part of the DNA encoding the desired cellobiose 2-epimerase.
  • the genomic DNA obtained in Experiment 4-1 was used as the restriction enzyme Pst I.
  • the digest was self-ligated to obtain a circularized genome. Based on the nucleotide sequence of a DNA fragment presumed to be a part of DNA encoding cellobiose 2-epimerase, oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 in the sequence listing were synthesized as sense and antisense primers, respectively.
  • SEQ ID NOs: 7 and 8 in the sequence listing were synthesized as sense and antisense primers, respectively.
  • the base sequence of the obtained DNA fragment of about 3,400 bp was directly decoded by the conventional dideoxy method.
  • the N-terminal amino acid sequence of cellobiose 2-epimerase (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was obtained.
  • An open reading frame encoding an amino acid sequence including all three types of internal partial amino acid sequences (amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 in the sequence listing) was observed, and the full length of the target gene was present in this DNA fragment. Turned out to be. Based on this finding, the base sequence of DNA encoding cellobiose 2-epimerase and the amino acid sequence of the enzyme encoded thereby were determined.
  • the DNA encoding Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494-derived cellobiose 2-epimerase has a base sequence having a chain length of 1,170 bp represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. The sequence was found to encode the amino acid sequence of 390 residues shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • N-terminal amino acid sequence of cellobiose 2-epimerase found in Experiment 3-5 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and three internal amino acid sequences identified in Experiment 3-6 (SEQ ID NO: in the sequence listing) 2 to 4) are all found in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, and the first to 15th, 342th to 349th, The amino acid sequences of 104th to 110th and 329th to 335th were completely identical.
  • the molecular weight calculated from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is 46,488, and this value is derived from Cardis cellulosyl butter saccharolyticus ATCC 43494 derived in Experiment 3-1.
  • the molecular weight of epimerase was in good agreement with 44,000 ⁇ 5,000 daltons.
  • ⁇ Experiment 4-3 Construction of recombinant cellobiose 2-epimerase expression vector and preparation of transformant> Based on the first to ninth amino acid sequences in the N-terminal amino acid sequence of the cellobiose 2-epimerase derived from Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and the gene In order to prepare a restriction enzyme Nco I recognition site on the 5′-terminal side, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing was synthesized as a sense primer.
  • the amplified DNA is digested with restriction enzymes Nco I and Bam HI, treated with phenol / chloroform to inactivate the restriction enzymes, and the digested product is used to express the digested DNA with restriction enzymes Nco I and Bam HI in advance.
  • the vector, pET-3d (manufactured by Novagen) was inserted using a commercially available kit (trade name “Ligation High, manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Using this reaction product, the cloning host Escherichia coli XL10-Gold (manufactured by Stratagene) was used.
  • a plasmid was prepared from the transformant and examined, and a plasmid having a target DNA fragment of about 1,200 bp was selected, and the recombinant DNA possessed by the selected transformant was named “pETCS1”.
  • An expression host E. coli Rosetta (DE3) manufactured by Novagen was transformed with the recombinant DNA, pETCS1, to prepare a transformant “ETCS1”.
  • ⁇ Experiment 4-4 Expression and purification of recombinant cellobiose 2-epimerase in transformant>
  • the TB medium tryptone 1.2%, yeast extract 2.4%, glycerin 0.4%, dihydrogen phosphate 1 and 100 ml each of the transformant ETCS1 obtained in Experiment 4-3 was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask. Potassium 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM, pH 6.8, ampicillin 80 ⁇ g / ml, chloramphenicol 30 ⁇ g / ml) and inoculated at 27 ° C. for 24 hours.
  • the obtained culture was centrifuged and separated into a culture supernatant and bacterial cells according to a conventional method.
  • the whole extract from the cell was prepared by the ultrasonic crushing method.
  • the ultrasonic disruption method bacterial cells are suspended in 20 mM acetate buffer (pH 6.5), and then the ultrasonic cell homogenizer (Model UH-600, manufactured by SMT Co., Ltd.) is used while cooling the bacterial cell suspension in ice water. ) And crushing the cells to obtain a whole cell extract.
  • the cellobiose 2-epimerase activity (lactose 2-epimerase activity) of each of the culture supernatant and the whole cell extract thus prepared was measured, and each activity value was converted per 1 ml of the culture.
  • Escherichia coli Rosetta (DE3) carrying plasmid pET-3d was cultured under the same conditions as in the case of the above-mentioned transformant, and a culture supernatant and a whole cell extract were prepared from the culture. was measured.
  • the whole cell extract obtained above was heat-treated at 70 ° C. for 30 minutes, and the host-derived protein that had been heat-denatured and insolubilized was removed by centrifugation.
  • the heat-treated liquid supernatant was purified by anion exchange chromatography using a “DEAE-5PW” column and gel filtration column chromatography using a “Superdex 200” gel, and this purified enzyme preparation was further tested. Analysis was performed according to the method shown in FIG. As a result, the molecular weight determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was 44,000 ⁇ 5,000 daltons, the optimum temperature for epimerase activity was pH 6.0, 80 ° C. for 20 minutes, and the optimum pH was 50.
  • reaction solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes to stop the reaction, and then subjected to TLC analysis by the same method as in Experiment 1-2 in order to examine carbohydrates in the reaction solution before and after the enzyme reaction.
  • Substrate specificity was determined by examining the presence or absence of spots of reaction products other than substrate carbohydrates and the degree of color development. The results are shown in Table 3.
  • the enzyme works well on lactose, cellobiose, cellotriose and cellotetraose among the substrates tested, and also on D-glucose, D-mannose, maltose and maltotriose. Acted to produce a product believed to be an isomerized sugar. Furthermore, D-galactose, D-fructose, D-tagatose, maltulose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose were also slightly affected.
  • Recombinant cellobiose 2-epimerase purified preparation prepared by the method of Experiment 4-4 is added to 0.1 ml of substrate solution in the case of D-glucose and D-mannose, 130 units (enzyme solution) per gram of substrate solids.
  • 500 units 0.1 ml as an enzyme solution
  • the reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 10 minutes.
  • Each reaction solution was subjected to HPLC analysis to examine the product in the reaction solution. The analysis of the product in the reaction solution was performed under the following HPLC conditions in order to separate monosaccharides. The results are shown in Table 4.
  • this cellobiose 2-epimerase is obtained from D-glucose to D-mannose and D-fructose, from D-galactose to D-talose and D-tagatose, and from D-mannose to D -Glucose and D-fructose were produced respectively.
  • the action of this enzyme on D-galactose was weaker than that on D-glucose and D-mannose. Since this enzyme not only converted D-glucose and D-galactose into their epimers D-mannose and D-talose, but also produced D-fructose and D-tagatose, respectively.
  • Example 7-1 Preparation of isomerized sugar from lactose> Purified recombinant cellobiose 2-epimerase obtained by the method of Experiment 4-4 in 200 ml of a substrate solution in which lactose is dissolved in 20 mM acetate buffer (pH 6.0) to a final concentration of 1.1 w / v% Was added at 130 units (20 ml of enzyme solution) per gram of the solid substrate and reacted at 50 ° C. for 8 hours. After the enzyme reaction, the reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 10 minutes. In order to examine carbohydrates in the reaction solution, TLC analysis under the conditions described in Experiment 1-2 and HPLC analysis under the following conditions were performed.
  • Example 7-2 Isolation and purification of isomerized sugars A and B> As described above, isomerized sugars A and B are separated by TLC, but isomerized sugar B is not separated from lactose. On the other hand, isomerized sugars A and B and lactose are separated by HPLC, but isomerized sugar A and B are separated. B did not separate. Based on this finding, lactose was first removed by HPLC to obtain a mixture of isomerized sugars A and B, and then isomerized sugars A and B were isolated and purified by preparative TLC.
  • Example 7-2-1 Acquisition of a mixture of isomerized sugars A and B by preparative HPLC> 330 mg of the reaction solution obtained in Experiment 7-1 was divided into 80 portions and subjected to HPLC described in Experiment 7-1. The mixture of isomerized sugars A and B was fractionated, and the fraction collected was concentrated. Then, 153 mg of a sugar preparation (containing 1.3% by mass of monosaccharide) having a content of 98.7% by mass as a mixture was obtained as a solid.
  • Example 7-2-2 Isolation of isomerized sugars A and B by preparative TLC> After 57.6 mg of a sugar preparation containing isomerized sugars A and B obtained in Experiment 7-2-1 was subjected to TLC described in Experiment 1-2 and developed twice, The silica gel having the corresponding Rf value is scraped separately, and the isomerized sugars A and B are extracted from the collected silica gel with deionized water according to a conventional method, concentrated and dried to obtain the isomerized sugar A preparation as a solid. .9 mg and 17.8 mg of isomerized sugar B preparation as a solid were obtained.
  • Example 7-3 Structural analysis of isomerized sugars A and B>
  • this enzyme catalyzes both 2-epimerization reaction and aldose-ketose conversion reaction.
  • isomerized sugar A was epilactose, which is an epimer of the substrate lactose
  • isomerized sugar B was lactulose obtained by isomerizing the reducing terminal glucose of lactose to fructose.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • ⁇ Experiment 8-1 Preparation of Isomerized Sugar from Cellobiose> Recombinant cellobiose 2-epimerase production preparation obtained by the method of Experiment 4-4 was added to 20 ml of a substrate solution in which cellobiose was dissolved in 20 mM acetate buffer (pH 6.0) to 10% (w / v). Then, 50 units (10 ml as an enzyme solution) were added per gram of the solid substrate, and reacted at 60 ° C. for 23 hours. After the enzyme reaction, the reaction solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes to stop the reaction. The sugar composition of the reaction solution was examined by HPLC analysis under the following conditions. The HPLC chromatogram is shown in FIG.
  • Example 8-2 Isolation and purification of isomerized sugars C and D> As a solid in the reaction solution obtained in Experiment 8-1, 432 mg was divided into 100 portions and subjected to HPLC described in Experiment 8-1, and isomerized sugars C and D were separated and purified. Each preparative fraction was concentrated and dried to obtain 17.9 mg of isomerized sugar C and 118 mg of isomerized sugar D having a purity of 100%.
  • Example 8-3 Structural analysis of isomerized sugar C>
  • ⁇ Experiment 8-3-1 Mass Spectrometry> The isomerized sugar C obtained in Experiment 8-2 was subjected to mass spectrometry using a mass spectrometer “LCQ-Advantage” (manufactured by Thermo Fisher). As a result, a sodium-added molecular ion having a mass number of 365 was remarkably detected and isomerized. The mass number of sugar C was found to be 342.
  • ⁇ Experiment 8-3-2 Enzymatic degradation> ⁇ -Glucosidase (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was added to 0.3 ml of a substrate solution in which the isomerized sugar C obtained in Experiment 8-2 was dissolved in a 20 mM acetate buffer to a concentration of 2% (w / v). 500 units were added per gram of substrate (0.3 ml as an enzyme solution) and reacted at 40 ° C. for 16 hours. After stopping the reaction by heating at 100 ° C. for 10 minutes, the reaction product was subjected to HPLC used in Experiment 6 and the resulting monosaccharide was examined.
  • isomerized sugar C is a disaccharide in which D-glucose is ⁇ -bonded to D-mannose.
  • ⁇ Experiment 8-3-3 Nuclear magnetic resonance analysis> Using the sample of isomerized sugar C obtained by the method of Experiment 8-2, nuclear magnetic resonance (NMR) analysis was performed according to a conventional method. The 1 H-NMR spectrum was measured under the conditions described in Experiment 7-3, and the 13 C-NMR spectrum was measured under the following conditions. ⁇ 13 C-NMR measurement conditions> Nuclear magnetic resonance apparatus: JNM-AL300 type (manufactured by JEOL Ltd.) Solvent: D 2 O Sample amount: 14-30 mg Magnetic field strength: 75.45 MHz Integration count: 1000 times
  • the 1 H-NMR spectrum of the isomerized sugar C preparation is shown in FIG. 12, and the 13 C-NMR spectrum is shown in FIG.
  • the C-4 position signal of D-mannose (79.3 and 78.9 ppm, the sign * in FIG. 13) was greatly shifted to the low magnetic field side.
  • a signal of about 4.35 ppm (sign ⁇ in FIG. 12) is attributed to the 1-position proton of the D-glucose residue, and its spin-spin coupling constant was determined.
  • the isomerized sugar C produced from cellobiose by the action of this epimerase is 4-O- ⁇ -D-glucosyl D-mannose, that is, epicellobiose. It has been found.
  • Example 8-4 Structural analysis of isomerized sugar D>
  • ⁇ Experiment 8-4-1 Mass Spectrometry> Mass analysis of the isomerized sugar D obtained in Experiment 8-2 was performed in the same manner as in Experiment 8-3-1. As a result, a sodium-added molecular ion having a mass number of 365 was significantly detected, and the mass number of isomerized sugar C was 342. It turned out to be.
  • ⁇ Experiment 8-4-2 Enzymatic degradation> Enzymatic degradation of isomerized sugar D was performed in the same manner as in Experiment 8-3-2, except that isomerized sugar D obtained in Experiment 8-2 was used instead of isomerized sugar C. The reaction product was subjected to the HPLC used in Experiment 6 and the resulting monosaccharide was examined. As a result, equimolar amounts of D-glucose and D-fructose were observed. Considering this result and the substrate specificity of ⁇ -glucosidase, it was found that the isomerized sugar D is a disaccharide obtained by ⁇ -bonding D-glucose to D-fructose.
  • FIG. 14 shows the 1 H-NMR spectrum
  • FIG. 15 shows the 13 C-NMR spectrum.
  • the C-4 position signals of D-fructose (79.9, 86.4 and 87.7 ppm, symbol * in FIG. 15) were greatly shifted to the low magnetic field side.
  • D-glucose was found to bind to the 4-position of D-fructose.
  • the signal of about 4.49 ppm, the signal of about 4.40 ppm, and the signal of about 4.38 ppm are the 1st position of the D-glucose residue.
  • the spin-spin coupling constant attributed to protons was determined and found to be about 7.9 Hz (about 4.49 ppm signal), about 7.7 Hz (about 4.40 ppm signal), and about 6.1 Hz (about 4.38 ppm signal), it was found that the anomeric form of the 1-position of the D-glucose residue bonded to the 4-position of D-fructose is the ⁇ -form.
  • the chemical shift value of each carbon signal in the 13 C-NMR spectrum of isomerized sugar D is disclosed in Feffer et al., Carbohydrate Research, 102, 11-22 (1982). It was in good agreement with that of cellobiurose.
  • Example 9-1 Preparation of isomerized sugar from maltose>
  • the reaction was the same as in Experiment 8-1 except that the substrate was changed from cellobiose to maltose and the amount of enzyme action of recombinant cellobiose 2-epimerase obtained by the method of Experiment 4-4 was 200 units per gram of substrate solid.
  • the HPLC chromatogram of the reaction solution is shown in FIG. As shown in FIG. 16, in the reaction solution, two peaks considered to be isomerized sugar were observed together with an unreacted maltose peak (reference numeral Mal in FIG. 16).
  • the saccharide eluted at 31.6 minutes is the isomerized sugar E (reference symbol E in FIG. 16), and the saccharide eluted at 28.0 minutes is the isomerized sugar F (reference symbol F in FIG. 16).
  • the sugar composition of the reaction solution was maltose 70.1% by mass, isomerized sugar E 22.2% by mass, and isomerized sugar F 7.7% by mass.
  • Experiment 9-2 Isolation and purification of isomerized sugars E and F> 191 mg of the reaction solution obtained in Experiment 9-1 was divided into 29 times and subjected to HPLC used in Experiment 8-1 to separate and purify isomerized sugars E and F, respectively. The fractionated fractions were concentrated and dried to obtain 38.1 mg of isomerized sugar E having a purity of 99.1% by mass and 14.2 mg of isomerized sugar F having a purity of 92.3% by mass.
  • Example 9-3 Structural analysis of isomerized sugar E>
  • ⁇ Experiment 9-3-1 Mass spectrometry> Mass analysis of the isomerized sugar E obtained in Experiment 9-2 was performed in the same manner as in Experiment 8-3-1. As a result, a sodium-added molecular ion having a mass number of 365 was significantly detected, and the mass number of the isomerized sugar E was 342. It turned out to be.
  • ⁇ Experiment 9-3-2 Enzymatic degradation> ⁇ -Glucosidase (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) is used as a substrate in 0.3 ml of a substrate solution obtained by dissolving isomerized sugar E obtained in Experiment 9-2 in a 20 mM acetate buffer to a concentration of 2% (w / v). 500 units were added per gram (0.3 ml as an enzyme solution) and reacted at 50 ° C. for 16 hours. After stopping the reaction by heating at 100 ° C. for 10 minutes, the reaction product was subjected to HPLC used in Experiment 6 and the resulting monosaccharide was examined.
  • isomerized sugar E is a disaccharide in which D-glucose is ⁇ -linked to D-mannose.
  • the isomerized sugar E produced from maltose by the action of this epimerase is 4-O- ⁇ -D-glucosyl D-mannose, that is, epimaltose. It has been found.
  • Example 9-4 Structural analysis of isomerized sugar F>
  • this enzyme catalyzes not only 2-epimerization reaction but also aldose-ketose conversion reaction.
  • lactose was produced from lactose and in Experiment 8, cellobiose was produced from cellobiose.
  • Isomerized sugar F was presumed to be maltulose obtained by isomerizing maltose reducing terminal glucose to fructose.
  • the difference between isomerized sugar F and a commercially available standard maltulose was examined by 1 H-NMR analysis.
  • FIGS. 19 and 20 show the 1 H-NMR spectra of isomerized sugar F and standard maltulose, respectively.
  • Example 10-1 Preparation of Isomerized Sugar from Maltotriose>
  • a reaction solution was obtained by reacting in the same manner as in Experiment 9-1 except that the substrate was changed from maltose to maltotriose.
  • the HPLC chromatogram of the reaction solution is shown in FIG. As shown in FIG. 21, in the reaction solution, an unreacted maltotriose peak (sign G 3 in FIG. 21) and one peak considered to be an isomerized sugar were observed.
  • the saccharide eluted at 29.9 minutes in the HPLC was designated as isomerized sugar G (symbol G in FIG. 21).
  • the sugar composition of the reaction solution was 73.8% by mass of maltotriose, 23.3% by mass of isomerized sugar G, and 2.9% by mass of other unknown sugars.
  • Example 10-2 Isolation and purification of isomerized sugar G> As a solid in the reaction solution obtained in Experiment 10-1, 475 mg was divided into 80 portions and subjected to the HPLC used in Experiment 8-1, and the isomerized sugar G was separated and purified. The preparative fraction was concentrated and dried to obtain 113 mg of isomerized sugar G having a purity of 99.4% by mass.
  • Example 10-3 Structural analysis of isomerized sugar G>
  • ⁇ Experiment 10-3-1 Mass Spectrometry> Mass analysis of the isomerized sugar G obtained in Experiment 10-2 was performed in the same manner as in Experiment 8-3-1. As a result, a sodium-added molecular ion having a mass number of 527 was significantly detected, and the mass number of the isomerized sugar G was 504. It turned out to be.
  • ⁇ Experiment 10-3-2 Enzymatic degradation> Enzymatic digestion with ⁇ -glucosidase as in Experiment 9-3-2, except that the isomerized sugar E preparation was replaced with the isomerized sugar G preparation obtained in Experiment 10-2.
  • D-glucose and D-mannose were found in a molar ratio of 2: 1.
  • isomerized sugar G is a trisaccharide composed of one D-mannose molecule and two D-glucose molecules present at the reducing end.
  • a signal of about 5.26 ppm (symbol x in FIG. 22) is attributed to the 1-position proton of the D-glucose residue bonded to D-glucose, and its spin-spin coupling constant was determined to be about 3. Since the frequency was 7 Hz, it was found that the anomeric form of the 1-position of the D-glucose residue bonded to the 4-position of D-glucose was also ⁇ -type.
  • the amount of enzyme action was 130 or 500 units per gram of substrate when the substrate was a monosaccharide, and 1 and / or 130 units per gram of substrate when the substrate was a disaccharide or trisaccharide.
  • Each reaction solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes to stop the reaction, and subjected to HPLC analysis to measure the isomerized sugar content per solid in the reaction solution.
  • the epilactose and lactulose contents in the reaction solution of the substrate lactose were measured by the GC analysis used in Experiment 1-2. The results are shown in Table 5.
  • this cellobiose 2-epimerase acts well on cellobiose and lactose, and catalyzes the 2-epimerization reaction even when the amount of enzyme action is relatively low at 1 unit per gram of substrate, and epicellobiose And epilactose was produced.
  • the amount of enzyme action was increased, cellobiurose and lactulose were remarkably produced by the aldose-ketose conversion reaction.
  • the effect of this enzyme on monosaccharides and trisaccharides was weaker than that on cellobiose and lactose, and a large amount of enzyme was required for isomerization.
  • Non-patent Document 3 The physicochemical properties and substrate specificity of the cellobiose 2-epimerase derived from Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494 obtained in the experiments so far were compared with the known luminococcus albus-derived cellobiose 2-epimerase (Non-patent Document 3). Table 6 together with the physicochemical properties and substrate specificity of cellobiose 2-epimerase derived from Eubacterium cellulosolvens (extracted from Non-Patent Document 4).
  • the cellobiose 2-epimerase derived from Cardis cellulosyruptor saccharolyticus ATCC 43494 is compared with the known cellobiose 2-epimerase derived from Luminococcus albus and Eubacterium cellulosolvens, respectively.
  • the enzyme was excellent in heat resistance, having an optimum temperature of 45 to 50 ° C higher and a temperature stability of about 30 ° C.
  • Non-patent Documents 3 and 4 It was found to be a novel enzyme that also acts on monosaccharides such as D-glucose, D-galactose, and D-mannose, and maltose.
  • Example 3 The reaction solution was decolorized, desalted in the same manner as in Example 3 and concentrated under reduced pressure to obtain transparent syrup, and then this syrup was subjected to column chromatography using a salt-type strongly acidic cation exchange resin as in Example 1. Separation, purification, and concentration gave syrupy cellobiulose in a yield of about 45% per solid.
  • Transformant “ETCS1” was cultured by the method of Experiment 4-4, and the culture broth was centrifuged to obtain 100 g of wet cells expressing cellobiose 2-epimerase activity. Next, the wet cells were kneaded with 100 ml of 2.5% sodium alginate (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
  • the obtained slurry containing the bacterial cells was continuously dropped from a height of about 20 cm onto a 0.1 M CaCl 2 aqueous solution stirred with a magnetic stirrer to prepare a spherical gelled product having a diameter of about 2 mm. This was kept in a 0.1 M CaCl 2 aqueous solution for about 2 hours, and then suction filtered to recover alginic acid-immobilized cells. Since this immobilized microbial cell expresses cellobiose 2-epimerase activity, it can be advantageously used as immobilized cellobiose 2-epimerase by packing it in a column.
  • the cellobiose 2-epimerase of the present invention has superior heat resistance as compared to the conventionally known cellobiose 2-epimerase and catalyzes a novel sugar isomerization reaction, so that D-glucose to D-mannose, maltose to epi Maltose is an enzyme that is extremely advantageous for industrial production of high-value-added carbohydrates from inexpensive raw materials such as cellobiose to epicellobiose and cellobiulose, or lactose to epilactose and lactulose. .
  • the present invention is an invention that exhibits such remarkable operational effects, and is an invention that has a significant industrial contribution.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

　耐熱性に優れるセロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途を提供することを課題とし、耐熱性に優れるセロビオース２－エピメラーゼ、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、当該酵素の製造方法、さらには当該酵素を用いた異性化糖の製造方法を提供することにより上記課題を解決する。

Description

セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
　本発明は、新規セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途に関し、詳細には、２－エピマー化反応のみならずアルドース－ケトース変換反応をも触媒するセロビオース２－エピメラーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、さらには当該酵素を用いた異性化糖の製造方法に関するものである。
　異性化酵素（イソメラーゼ）は異性体間の変換を触媒する酵素の総称であり、エンザイム・ノメンクレイチャー（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、アメリカ合衆国、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ.　Ｉｎｃ．１９９２年）によると、（１）光学異性化を触媒するラセマーゼ、エピメラーゼを含むＥＣ５．１群；（２）シス－トランス幾何異性体間の変換を触媒するＥＣ５．２群；（３）アルドース－ケトース変換、ケト－エノール互変異性、分子内で二重結合の位置の移動を触媒するＥＣ５．３群；（４）分子内基転位を触媒し構造異性体を生成するＥＣ５．４群；（５）分子内リアーゼ反応を触媒するＥＣ５．５群；及び（６）他の異性化反応を触媒するＥＣ５．９９群の６群に分類されている。これら異性化酵素の内、中性糖の異性化を触媒する異性化酵素としては、例えば、Ｄ－キシロースとＤ－キシルロース、Ｄ－グルコースとＤ－フラクトースの相互変換（アルドース－ケトース変換）を触媒するキシロースイソメラーゼ（ＥＣ　５．３．１．５）、アルドースのα、βアノマーの相互変換を触媒するアルドース１－エピメラーゼ（ＥＣ　５．１．３．３）、種々のケトペントース及びケトヘキソースの３位をエピマー化し、それぞれに対応するエピマーに変換するケトース３－エピメラーゼ（特開平６－１２５７７６号公報、国際公開番号　ＷＯ　２００７／０５８０８６号パンフレットなどを参照）などがよく知られており、それぞれ工業的な異性化糖の製造、糖の定量、希少糖質の調製などに幅広く利用されている。
　一方、タイラー（Ｔｙｌｅｒ）ら、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、第１１９巻、３６３乃至３６７頁（１９６７年）には、嫌気性菌ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｕｓ）が産生する、セロビオースの還元末端グルコースの２位をエピマー化してエピセロビオース（４－Ｏ－β－Ｄ－グルコシルＤ－マンノース）に変換するセロビオース２－エピメラーゼが報告されており、当該酵素には前記エンザイム・ノメンクレイチャーにおいて酵素番号ＥＣ　５．１．３．１１が付与されている。イトウ（Ｉｔｏ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第３６０巻、６４０乃至６４５頁（２００７年）及びイトウ（Ｉｔｏ）ら、アプライド・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第７９巻、４３３乃至４４１頁（２００８年）には当該セロビオース２－エピメラーゼのアミノ酸配列、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列、及び、当該セロビオース２－エピメラーゼがセロビオースのみならずセロオリゴ糖やラクトースにも作用し、エピセロオリゴ糖やエピラクトース（４－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトシルＤ－マンノース）をも生成することなどが開示されている。さらに、タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ）ら、フェムス・ミクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２８７巻、３４乃至４０頁（２００８年）には、同じく嫌気性菌であるユーバクテリウム・セルロソルベンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）由来のセロビオース２－エピメラーゼが開示されている。
　また、ニシムカイ（Ｎｉｓｈｉｍｕｋａｉ）ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｏｏｄ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５６巻、１０３４０乃至１０３４５頁（２００８年）には、セロビオース２－エピメラーゼを用いてラクトースを変換して調製されるエピラクトースが、ラットに摂取させた場合、小腸でのカルシウム吸収を増強し、腸内の短鎖脂肪酸量を増加させ、血漿中のコレステロールを低減するなどの生理機能を発揮するという知見が開示されており、エピラクトースのプレバイオティクスの素材としての開発が期待されている。
　しかしながら、上記した公知のセロビオース２－エピメラーゼには、耐熱性が低く、エピラクトース、エピセロビオースなどの糖質を工業レベルで製造するには利用し難いという問題点がある。酵素の耐熱性は、酵素反応を実用化する際、極めて重要な因子であり、耐熱性に優れる酵素は、少量の酵素量で長時間反応できるため、酵素反応における酵素量が低減でき経済的に有利である。また、工業的な利用を考慮すると、雑菌汚染を防止するため５５℃以上、望ましくは、６０℃以上で反応を行うことが好ましい。このような観点から、より耐熱性に優れるセロビオース２－エピメラーゼが望まれている。
　本発明は、耐熱性に優れるセロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途を提供することを課題とする。
　このような状況下、上記課題を解決するために、本発明者らは、耐熱性に優れたセロビオース２－エピメラーゼを求めて多数の好熱性微生物を対象としてスクリーニングを行った。その結果、カルジセルロシルプトル（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属に属する微生物カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ４３４９４の菌体破砕抽出液にラクトースをエピマー化してエピラクトースを生成し、また、セロビオースから異性化糖と推定される糖質を生成する酵素活性を見出した。当該エピメラーゼを、電気泳動的に単一バンドを示す程度まで精製し性質を調べたところ、７０℃まで安定な耐熱性を有することが判明した。しかしながら、得られた精製酵素標品は微量であり、当該エピメラーゼの詳細な基質特異性を調べるには不十分であった。
　そこで、当該エピメラーゼの部分アミノ酸配列の情報に基づき、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカスのゲノムＤＮＡより、当該エピメラーゼをコードするＤＮＡをクローニングし、これを含む組換えＤＮＡで大腸菌を形質転換し、培養して組換え酵素を調製した。この組換え酵素を用いて基質特異性を調べたところ、意外にもこの酵素は、セロビオース及びラクトースをエピマー化してそれぞれをエピセロビオース及びエピラクトースに変換するのみならず、単糖ではＤ－グルコース及びＤ－ガラクトースに作用し、二糖ではさらにマルトースに、オリゴ糖では重合度３以上のマルトオリゴ糖及びセロオリゴ糖に作用してエピマー化し、それぞれに対応するＤ－マンノース、Ｄ－タロース、エピマルトース（４－Ｏ－α－Ｄ－グルコシルＤ－マンノース）、重合度３以上のエピマルトオリゴ糖及びエピセロオリゴ糖に変換するという幅広い基質特異性を有することを見出した。また、本酵素は、酵素作用量を増すと２－エピマー化反応のみならずアルドース－ケトース変換反応をも触媒し、Ｄ－グルコース又はＤ－マンノース、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロース、マルトース又はエピマルトース、セロビオース又はエピセロビオース、及び、ラクトース又はエピラクトースに作用して、それぞれ対応するＤ－フラクトース、Ｄ－タガトース、マルツロース（４－Ｏ－α－Ｄ－グルコシルＤ－フラクトース）、セロビウロース（４－Ｏ－β－Ｄ－グルコシルＤ－フラクトース）及びラクツロース（４－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトシルＤ－フラクトース）に変換する作用を有することも見出した。すなわち、本酵素は、２－エピマー化反応とアルドース－ケトース変換反応のいずれをも触媒する、新規なセロビオース２－エピメラーゼであることが判明した。
　これらの知見に基づき、本発明者らは、新規セロビオース２－エピメラーゼ、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、当該酵素の製造方法を確立するとともに、該酵素を利用した異性化糖の製造方法を確立して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、耐熱性に優れるセロビオース２－エピメラーゼ、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ、形質転換体、及び、当該酵素の製造方法、さらには当該酵素を用いた異性化糖の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、耐熱性が高く、組換え微生物における大量発現が可能で、組換え型酵素の精製も容易である。本発明のセロビオース２－エピメラーゼによれば、Ｄ－グルコースからＤ－マンノースを、マルトースからエピマルトースを、セロビオースからエピセロビオース又はセロビウロースを、さらに、ラクトースからエピラクトース又はラクツロースを製造でき、安価な原料から、希少であって、より付加価値の高い糖質を工業レベルで製造することができる。
カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４の菌体破砕抽出液上清をセロビオース、ラクトース又はエピラクトースに作用させた場合の反応液のＴＬＣクロマトグラムである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをラクトースに作用させて得た反応液のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをラクトースに作用させて単離した異性化糖Ａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 市販のエピラクトース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをラクトースに作用させて単離した異性化糖Ｂの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 市販のラクツロース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをセロビオースに作用させて得た反応液のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをセロビオースに作用させて単離した異性化糖Ｃの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをセロビオースに作用させて単離した異性化糖Ｃの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをセロビオースに作用させて単離した異性化糖Ｄの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをセロビオースに作用させて単離した異性化糖Ｄの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトースに作用させて得た反応液のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトースに作用させて単離した異性化糖Ｅの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトースに作用させて単離した異性化糖Ｅの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトースに作用させて単離した異性化糖Ｆの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 市販のマルツロース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトトリオースに作用させて得た反応液のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトトリオースに作用させて単離した異性化糖Ｇの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のセロビオース２－エピメラーゼをマルトトリオースに作用させて単離した異性化糖Ｇの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。
図１において、
ａ：マルトオリゴ糖混合物（グルコース重合度のマーカー）
ｂ：セロビオース標準品
ｃ：セロビオース反応液
ｄ：ラクトース標準品
ｅ：ラクトース反応液
ｆ：エピラクトース標準品
ｇ：エピラクトース反応液
←：ラクトース（異性化糖）
Ｇ１：グルコース
Ｇ２：マルトース
Ｇ３：マルトトリオース
Ｇ４：マルトテトラオース
図６において、
Ｌａｃ：ラクトース
Ａ＋Ｂ：異性化糖Ａ及びＢの混合物
図１１において、
Ｃｅｌ：セロビオース
Ｃ：異性化糖Ｃ
Ｄ：異性化糖Ｄ
図１２、１４及び１７において、
↓：Ｄ－グルコースの１位プロトンのシグナル
図１３、１８及び２３において、
＊：Ｄ－マンノースのＣ－４位シグナル
図１５において
＊：Ｄ－フラクトースのＣ－４位シグナル
図１６において、
Ｍａｌ：マルトース
Ｅ：異性化糖Ｅ
Ｆ：異性化糖Ｆ
図２１において、
Ｇ３：マルトトリオース
Ｇ：異性化糖Ｇ
図２２において、
↓：Ｄ－マンノースに結合したＤ－グルコースの１プロトンのシグナル
ｘ：Ｄ－グルコースに結合したＤ－グルコースの１プロトンのシグナル
図２３において、
＃：Ｄ－グルコースが結合したＤ－グルコースのＣ－４位シグナル
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、異性化反応、より具体的には、下記の２－エピマー化反応とアルドース－ケトース変換反応を触媒する酵素である。
（１）２－エピマー化反応
　Ｄ－グルコース及びＤ－ガラクトースの２位をエピマー化して、それぞれＤ－マンノース及びＤ－タロースに変換し、その逆反応も触媒する；
　マルトース、セロビオース及びラクトースにおける還元末端グルコースの２位をエピマー化して、それぞれエピマルトース、エピセロビオース及びエピラクトースに変換する；
　重合度３以上のマルトオリゴ糖及びセロオリゴ糖における還元末端グルコースの２位をエピマー化して、それぞれエピマルトオリゴ糖及びエピセロオリゴ糖に変換する；
（２）アルドース－ケトース変換反応
　Ｄ－グルコース又はＤ－マンノースをＤ－フラクトースに、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロースをＤ－タガトースにそれぞれ変換し、その逆反応も触媒する；
　マルトース又はエピマルトースをマルツロースに、セロビオース又はエピセロビオースをセロビウロースに、ラクトース又はエピラクトースをラクツロースに変換する。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼの具体例としては、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（１）分子量
　ＳＤＳ－ゲル電気泳動法において、４４，０００±５，０００ダルトン；
（２）至適温度
　ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で８０℃；
（３）至適ｐＨ
　５０℃、２０分間反応の条件下でｐＨ７．８；
（４）温度安定性
　ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下で７０℃まで安定；
（５）ｐＨ安定性
　４℃、２４時間保持する条件下でｐＨ４．５乃至９．５の範囲で安定。
　本明細書を通じてセロビオース２－エピメラーゼの酵素活性は、高純度品が安価に入手できるラクトースを基質として用い、ラクトースをエピマー化してエピラクトースを生成するラクトース２－エピメラーゼ活性として評価した。ラクトース２－エピメラーゼ活性は以下のようにして測定した。反応液における終濃度としてラクトースを３５．１ｍＭ、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０ｍＭとなるよう調製した基質溶液１０００μｌに酵素液２００μｌを加えて１２００μｌの反応液とし、５０℃で２０分間反応を行った後、沸騰湯浴中で１０分間加熱し反応を停止させた。この反応停止液をＨＰＬＣ分析に供し、本酵素の反応によって生成したエピラクトース量を測定した。なお、ＨＰＬＣは、『エムシーアイゲル（ＭＣＩ　ＧＥＬ）ＣＫ０８ＥＰ』カラム（三菱化学株式会社製）を用い、カラム温度７５℃、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液に水を用いる条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩＤ－１０Ａ』（株式会社島津製作所製）を用いて行なった。酵素活性１単位は、上記条件下でラクトースから１分間に１μｍｏｌのエピラクトースを生成する酵素量と定義した。
　また、上記理化学的性質を有する本発明のセロビオース２－エピメラーゼの一つは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端配列として、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有している場合がある。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、通常、特定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列としては、種々の異性化反応を触媒するという上記酵素活性を保持する範囲で、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列において１個以上１０個未満のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明のＤＮＡとは、上記のアミノ酸配列を有するセロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡは、当該セロビオース２－エピメラーゼをコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ４３４９４を含むカルジセルロシルプトル属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、嫌気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ－グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的のゲノムＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
　本発明のＤＮＡは、特定の塩基配列を有する場合があり、その一例としては、例えば、配列表における配列番号９で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列、又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号９で示される塩基配列に相同的な塩基配列としては、配列表における配列番号９で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で、１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列が挙げられる。また、当然のことながら、本発明のＤＮＡには、配列表における配列番号９で示される塩基配列か、又は、配列表における配列番号９で示される塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で、１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列において、遺伝暗号の縮重に基づき、コードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換した塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。
　本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜のベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　ＳＫ＋、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　ＳＫ＋、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ　３ＡＩ、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｂａｍ　ＨＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉ、Ｎｄｅ　Ｉ、Ｎｃｏ　Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
　このようにして得られる組換えＤＮＡを、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜の宿主微生物に導入することにより形質転換体を得ることができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養して粗酵素を調製し、当該セロビオース２－エピメラーゼ活性を有するものを選択すればよい。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物（形質転換体を含む）の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、セロビオース２－エピメラーゼを産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、澱粉の部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
　培養には、本発明のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物が良好に生育する条件を適宜選択して用いればよい。例えば、カルジセルロシルプトル属の微生物を用いる場合、培養は、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは、６０乃至７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくは、ｐＨ６．５乃至７．５の範囲から選ばれる条件で嫌気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０乃至７２時間である。また、微生物が形質転換体である場合、その宿主微生物の種類によって異なるものの、培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至５０℃、ｐＨ２乃至９の範囲から選ばれる条件で、通気攪拌する好気的な条件下で１０時間乃至１５０時間とすればよい。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
　このようにして微生物を培養した後、本発明のセロビオース２－エピメラーゼを含む培養物を回収する。本発明のセロビオース２－エピメラーゼ活性は、主に菌体内に認められ、菌体を粗酵素として採取することも、菌体破砕抽出液を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を回収するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。菌体破砕抽出液は、そのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼが組換え酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
　上記のように本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、菌体破砕抽出液などの粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、菌体破砕抽出液の上清をＵＦ膜で濃縮、又は硫安塩析・透析した酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなど各種の精製方法を組み合わせて精製することにより、本発明のセロビオース２－エピメラーゼを電気泳動的に単一な酵素として得ることができる。また、本発明のセロビオース２－エピメラーゼが形質転換体を培養して得た組換え型酵素の場合、通常の蛋白質よりも耐熱性に優れる点を利用して、菌体破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を、約７０℃で一定時間熱処理することにより夾雑する宿主由来の蛋白質を熱変性させ、変性により沈澱する蛋白質を遠心分離などで除去することにより簡便に精製することができる。
　更に、本発明のセロビオース２－エピメラーゼ活性を有する菌体破砕抽出液、濃縮液又は精製した酵素液を用いて、本発明のセロビオース２－エピメラーゼを公知の方法により固定化酵素とすることもできる。固定化方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼは幅広い基質特異性を有する。後述する実験の項で示すように、単糖ではＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース及びＤ－マンノースに作用し、それぞれのエピマーであるＤ－マンノース、Ｄ－タロース及びＤ－グルコースに変換する。二糖では、マルトース、セロビオース及びラクトースに作用し、それぞれエピマルトース、エピセロビオース及びエピラクトースに変換する。さらに、オリゴ糖ではセロオリゴ糖及びマルトオリゴ糖に作用し、それぞれに対応するエピセロオリゴ糖及びエピマルトオリゴ糖に変換する。
　またさらに、本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、酵素作用量を増すと、２－エピマー化反応のみならず、アルドース－ケトース変換反応をも触媒する。単糖では、Ｄ－グルコース又はＤ－マンノースをＤ－フラクトースに、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロースをＤ－タガトースに変換する。二糖では、セロビオース又はエピセロビオースをセロビウロースに、ラクトース又はエピラクトースをラクツロースに、また、マルトース又はエピマルトースをマルツロースに変換する。本酵素はアルドースをケトースに変換し、その逆反応をも触媒するものの、ケトースのアルドースへの変換活性は微弱であり、変換には多量の酵素を要する。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼを基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のセロビオース２－エピメラーゼの反応は進行して、特定の糖質からそのエピマー及び／又はアルドース－ケトース変換した異性化糖を生成する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、種々のエピマー及び／又は異性化糖を有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち８０℃付近までで行えばよい。好ましくは５０乃至６０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、５．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０乃至８．０の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
　また、本発明のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物を、基質となる上記アルドース又はケトースを含んでなる栄養培地で培養し、培養液中に生成する、アルドース又はケトースにそれぞれ対応する異性化糖を採取することにより異性化糖を製造することもできる。
　上記の反応系によって得られた異性化糖の精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、目的糖質を利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、目的糖質に作用せず原料糖質を特異的に分解する酵素を用いる酵素処理などの１種又は２種以上の精製方法が適宜採用できる。
　とりわけ、工業的な精製方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８－２３７９９号公報、特開昭５８－７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的糖質含量を向上させた糖組成物を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
　以下、実験により本発明をさらに具体的に説明する。
＜実験１：カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４菌体破砕抽出液によるエピラクトース及びエピセロビオースの生成＞
＜実験１－１：カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４の培養と菌体破砕抽出液の調製＞
　『ＡＴＣＣカタログ・オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション発行、１９９２年）４７０頁に記載のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション培地、１３６８番を調製し、１２ｍｌ容耐圧ガラスボトルに１２ｍｌ入れ滅菌した後、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４を接種して温度７０℃で約７２時間静置培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、菌体破砕抽出液の遠心上清を粗酵素液とした。
＜実験１－２：粗酵素液のラクトース、セロビオース及びエピラクトースへの作用＞
　セロビオース、ラクトース又はエピラクトースを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に終濃度３．４％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、それぞれ基質溶液とした。基質溶液１０μｌに、実験１－１の方法で調製した粗酵素液を１０μｌ加え、５０℃で１６時間反応させた。反応終了後、下記の条件による薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略称する）分析に供した。ＴＬＣクロマトグラムを図１に示す。
＜ＴＬＣ分析の条件＞
薄層プレート：シリカゲルアルミプレート（１０×２０ｃｍ）
　　　　　　（『キーゼルゲル６０Ｆ２５４』、メルク社製、１０×２０ｃｍ）
展開溶媒：ｎ－ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）混液
展開方法及び回数：上昇法にて２回展開
発色方法：１０％硫酸－メタノール溶液を噴霧し、１１０℃、６分間加熱
　図１における符号ａ乃至ｇは、それぞれＴＬＣ分析に供した試料を表し、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれマルトオリゴ糖混合物（グルコース重合度のマーカー）、セロビオース標準品、セロビオース反応液、ラクトース標準品、ラクトース反応液、エピラクトース標準品及びエピラクトース反応液を示す。図１に示すように、セロビオースの反応液（図１における符号ｃ）にはセロビオースの分解産物であるグルコース（図１の符号ａにおけるＧ１に相当する位置）と未知糖（図１の符号ａにおけるＧ４に相当する位置）のスポットが認められ、ラクトースの反応液（図１における符号ｅ）にはラクトースの分解産物であるグルコースとガラクトース（図１の符号ａにおけるＧ２に相当する位置）のスポットが認められた。一方、エピラクトースの反応液（図１における符号ｇ）にはラクトースと推定される異性化物のスポット（図１における符号←）が認められた。エピラクトースから異性化物であるラクトースの生成が認められたことから、セロビオースとラクトースの反応液には分解産物以外の生成物が存在し、そのスポットが分解産物のスポットと重なっている可能性が考えられたため、セロビオースとラクトースの反応液について、さらに、反応液を常法に従いトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）した後、下記の条件によるガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略称する。）に供して生成物を同定した。その結果、ラクトースからは分解産物以外にエピラクトースが、セロビオースからは分解産物以外にエピセロビオースと推定される未知糖が、それぞれ生成していることが確認された。この結果から、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４はセロビオース、ラクトース及びエピラクトースをエピマー化するエピメラーゼ（セロビオース２－エピメラーゼ）産生能を有することが判明した。
＜ＧＣ分析条件＞
　ガスクロマトグラフ：ＧＣ－１４Ａ（株式会社島津製作所製）
　カラム：２％　ＯＶ－１７　クロモソルブＷ／ＡＷ－ＤＭＣＳ
　　　　　（内径３ｍｍ×長さ２ｍ、株式会社ジー・エル・サイエンス製）
　キャリアーガス：窒素　　　　　　キャリアーガス流量：４０ｍｌ／分
　燃焼ガス：水素　　　　　　　　　燃焼ガス流量：４０ｍｌ／分
　助燃ガス：空気　　　　　　　　　助燃ガス流量：６００ｍｌ／分
　昇温プログラム：１６０℃　→　３２０℃（７．５℃／分）
　検出：ＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）
＜実験２：カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４からのセロビオース２－エピメラーゼの精製＞
　カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４が産生するセロビオース２－エピメラーゼの理化学的性質を明らかにする目的で当該酵素の精製を行った。
＜実験２－１：粗酵素液の調製＞
　実験１－１で用いた培地１００ｍｌを入れた１００ｍｌ容耐圧ガラスボトル８本に、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４を接種した以外は、実験１－１と同様に培養し、種培養とした。次いで、同培地１０Ｌを入れた１１Ｌ容耐圧スチールボトル８本に、種培養した培養液を１本ずつ接種して同様に培養し、培養後、約８０Ｌの培養液を遠心分離して湿菌体約２４ｇを得た。菌体を２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕した後遠心分離して菌体破砕抽出液上清を得た。菌体破砕抽出液上清を粗酵素液とした。粗酵素液のエピメラーゼ活性を測定し、培養液１ｍｌ当たりに換算すると０．００９単位／ｍｌであった。
＜実験２－２：セロビオース２－エピメラーゼの精製＞
　実験２－１で得た粗酵素液をＵＦ膜にて濃縮し、濃縮酵素液約４０ｍｌを回収した。この濃縮酵素液を２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）対して一晩透析し、遠心分離して不溶物を除いて得た透析液上清（３８ｍｌ）を『ＤＥＡＥ－トヨパール６５０Ｓ』（東ソー株式会社販売）ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３８０ｍｌ）に供した。カラムに吸着した蛋白を０から０．５ＭＮａＣｌまでのリニアグラジエントにより溶出させ、得られたフラクションのエピメラーゼ活性を調べたところ、エピメラーゼ活性は約０．１ＭのＮａＣｌ濃度の画分に溶出していた。この溶出活性画分を回収し、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、『Ｂｕｔｙｌ－トヨパール６５０Ｍ』（東ソー株式会社販売）ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量５０ｍｌ）に供した。カラムに吸着した蛋白を１Ｍから０Ｍ硫安までのリニアグラジエントにより溶出させたところ、エピメラーゼ活性は約０．８Ｍの硫安濃度の画分に溶出していた。当該活性画分をＵＦ膜で濃縮し、０．４Ｍ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化した『スーパーデックス７５』カラム（１６ｍｍ×６０ｃｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供し、エピメラーゼ活性画分を回収した。回収した活性画分を２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）対して一晩透析し、同緩衝液で平衡化した『ＤＥＡＥ－５ＰＷ』カラム（３．３ｍｌ、東ソー株式会社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムに吸着した蛋白を０Ｍから０．５ＭまでのＮａＣｌリニアグラジエントにより溶出し、約０．１ＭのＮａＣｌ濃度の画分に溶出するエピメラーゼ活性画分を回収した。
　以上の精製により得られた精製酵素標品は、蛋白として０．９ｍｇであり、粗酵素液からの活性回収率は３．４％であった。また、本精製酵素標品の比活性は２６．９単位／ｍｇ－蛋白であった。なお、蛋白の定量は牛血清アルブミンを標準蛋白としたローリー法にて行った。本精製酵素標品の純度を５乃至２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動法により検定したところ、蛋白バンドは単一であり純度の高い標品であった。
＜実験３：カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼの諸性質＞
＜実験３－１：分子量＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を５乃至２０％（ｗ／ｖ）グラジエントゲルを用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、分子量は４４，０００±５，０００ダルトンであった。
＜実験３－２：至適温度及び至適ｐＨ＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を用いて、エピメラーゼ活性に及ぼす温度及びｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示す。本エピメラーゼの至適温度はｐＨ６．０、２０分間反応で８０℃であった。至適ｐＨは、５０℃、２０分間反応でｐＨ７．８であった。
＜実験３－３：温度安定性及びｐＨ安定性＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を用いて、エピメラーゼ活性の安定性に及ぼす温度及びｐＨの影響を調べた。温度安定性は、１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、酵素溶液を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、酵素を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に再調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示す。図５から明らかなように、本エピメラーゼは７０℃まで安定であった。また、図６から明らかなように、本エピメラーゼは、ｐＨ４．５乃至９．５の範囲で安定であった。
＜実験３－４：酵素活性に及ぼす金属イオンの影響＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を、１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定することにより調べた。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、本エピメラーゼの活性は、Ａｌ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋及びＰｂ２＋イオンによって阻害され、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋及びＨｇ２＋イオンによってほぼ完全に阻害されることが判明した。
＜実験３－５：Ｎ末端アミノ酸配列＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー　モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＮ末端から１５残基分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、メチオニン―アスパラギン酸－イソロイシン－スレオニン－アルギニン－フェニルアラニン－リジン－グルタミン酸－アスパラギン酸－ロイシン－リジン－アラニン－ヒスチジン－ロイシン－グルタミン酸　を有していることが判明した。
＜実験３－６：内部部分アミノ酸配列＞
　実験２の方法で得たセロビオース２－エピメラーゼ精製標品を適量とり、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約０．６ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約５０μｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）１．２μｇを加えて、３０℃、２０時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ２．１／１０』、直径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に注入し、流速０．１ｍｌ／分、室温の条件下、０．０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸－から０．０５５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸－８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液の１６０分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長２１４ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。保持時間約２９分、約３７分及び約３９分に溶出した３種のペプチド断片Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を分取し、それぞれのアミノ酸配列を実験３－５と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号２、３及び４で示されるアミノ酸配列を有していた。
＜実験４：セロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
　セロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡをカルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定及び形質転換体の調製を行った。
＜実験４－１：ゲノムＤＮＡの調製＞
　実験１－１と同じ方法でカルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４を培養し、培養液約２０ｍｌを遠心分離して、培養菌体１０ｍｇを得た。回収した菌体から『ディーエヌイージー・ティシュー・キット』（キアゲン社製）を用い、キットに添付された説明書記載の方法に従ってゲノムＤＮＡを調製し、１．８ｍｇを得た。調製したゲノムＤＮＡの濃度は１．８ｍｇ／ｍｌとした。
＜実験４－２：セロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定＞
　セロビオース２－エピメラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）の第１乃至第６番目のアミノ酸配列に基づき、センスプライマーとして配列表における配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、同エピメラーゼの内部部分アミノ酸配列である配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列の第２乃至第７番目のアミノ酸配列に基づき、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４－１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ－プラス－ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ　サーマルサイクラー　ＰＪ２０００（パーキン・エルマー社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行ったところ、約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ｃａｍ　ＳＫ＋（ストラタジーン社製）の制限酵素Ｓｒｆ　Ｉサイトにクローニングし、得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ－１０Ｇｏｌｄを形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べたところ、目的とする約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片を有していた。その組換えＤＮＡを「ｐＣＲＣＳ１」と命名した。
　組換えＤＮＡ、ｐＣＲＣＳ１が有する約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、通常のジデオキシ法により解読したところ、解読した１，００４ｂｐの塩基配列がコードするアミノ酸配列中に、セロビオース２－エピメラーゼの内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列）が含まれていた。この結果から、得られたＤＮＡ断片は目的とするセロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡの一部と推察された。
　上記のセロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｐｓｔ　Ｉにて切断されないことを予め確認した後、実験４－１で得たゲノムＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。セロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡの一部と推定されるＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号７及び８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約３，４００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。
　得られた約３，４００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、セロビオース２－エピメラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）で始まり、３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）を全て含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームが認められ、本ＤＮＡ断片中に目的遺伝子全長が存在していることが判明した。この知見に基づきセロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡは、配列表における配列番号９で示される鎖長１，１７０ｂｐの塩基配列を有しており、当該塩基配列は配列表における配列番号１０で示される３９０残基のアミノ酸配列をコードしていることが判明した。実験３－５で判明したセロビオース２－エピメラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）及び実験３－６で判明した３種の内部部分アミノ酸配列（配列表における配列番号２乃至４で示されるアミノ酸配列）は、そのいずれもが配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列に認められ、それぞれ当該アミノ酸配列における第１乃至第１５番目、第３４２乃至第３４９番目、第１０４乃至第１１０番目、及び、第３２９乃至第３３５番目のアミノ酸配列と完全に一致していた。なお、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列から算出される分子量は４６，４８８であり、この値は実験３－１で求めたカルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼの分子量、４４，０００±５，０００ダルトンとよく一致するものであった。
　＜実験４－３：組換え型セロビオース２－エピメラーゼ発現用ベクターの構築と形質転換体の調製＞
　カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）における第１乃至第９番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の５´末端側に制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ認識部位を作製すべく、センスプライマーとして配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。また、配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列における第３８４乃至第３９０番目のアミノ酸配列に基づき、また、遺伝子の３´末端側に制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ認識部位を作製すべく、アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用い、実験４－１で得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ－プラス－ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ　サーマルサイクラー　ＰＪ２０００（パーキン・エルマー社製）を用いて常法によりＰＣＲ増幅を行ったところ、約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＢａｍ　ＨＩにより消化し、フェノール・クロロホルム処理して制限酵素を失活させた後、この消化物を用いて、予め制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＢａｍ　ＨＩで消化した発現ベクター、ｐＥＴ－３ｄ（ノバジェン社製）に市販のキット（商品名「Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ、東洋紡製）を用いて挿入した。この反応物を用いてクローニング用宿主大腸菌ＸＬ１０－Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社製）を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製して調べ、目的とする約１，２００ｂｐのＤＮＡ断片を有するものを選択した。選択した形質転換体が有する組換えＤＮＡを「ｐＥＴＣＳ１」と命名した。組換えＤＮＡ、ｐＥＴＣＳ１を用いて発現用宿主大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、形質転換体『ＥＴＣＳ１』を調製した。
＜実験４－４：形質転換体における組換え型セロビオース２－エピメラーゼの発現と精製＞
　実験４－３で得た形質転換体ＥＴＣＳ１を、５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌずつ入れたＴＢ培地（トリプトン　１．２％、酵母エキス　２．４％、グリセリン　０．４％、リン酸２水素１カリウム　１７ｍＭ、リン酸水素２カリウム　７２ｍＭ、ｐＨ６．８、アンピシリン　８０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール　３０μｇ／ｍｌ含有）に植菌し、２７℃で２４時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体とに分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ－６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細胞抽出物とした。
　このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれのセロビオース２－エピメラーゼ活性（ラクトース２－エピメラーゼ活性）を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。なお、対照としてプラスミドｐＥＴ－３ｄを保持する大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様に酵素活性を測定した。これらの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から明らかなように、形質転換体ＥＴＣＳ１は、セロビオース２－エピメラーゼを細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では培養上清、全細胞抽出物のいずれにも当該エピメラーゼ活性は全く認められなかった。
　上記で得た全細胞抽出物を、７０℃で３０分間熱処理し、熱変性して不溶化した宿主由来の蛋白を遠心分離にて除去した。この熱処理液上清を、『ＤＥＡＥ－５ＰＷ』カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー及び『スーパーデックス　２００』ゲルを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験３に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は４４，０００±５，０００ダルトン、エピメラーゼ活性の至適温度は、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で８０℃、至適ｐＨは５０℃、２０分間反応の条件下で７．８、温度安定性は、各温度に６０分間保持する条件下で７０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は、各ｐＨに４℃で２４時間保持する条件下で４．５乃至９．５の範囲で安定であった。組換え型エピメラーゼのこれらの理化学的性質は、実験２で精製したセロビオース２－エピメラーゼのそれと実質的に同一であった。以上の結果は、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼは、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造できることを示している。
　なお、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４のゲノムＤＮＡの全塩基配列は既に明らかにされており、遺伝子データベース『ＧｅｎＢａｎｋ』に登録されている（アクセッションＮｏ．ＣＰ０００６７９）。実験４－２で判明したセロビオース２－エピメラーゼの全アミノ酸配列（配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列）に基づき、当該ゲノムＤＮＡ情報を検索したところ、セロビオース２－エピメラーゼのアミノ酸配列は、意外にもカルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４のゲノムＤＮＡにおいて、「Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ」をコードすると推定されている遺伝子（Ｃｓａｃ０２９４）がコードするアミノ酸配列と完全に一致していることが判明した。この結果は、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４のゲノムＤＮＡにおいて「Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ」をコードすると推定されていた遺伝子（Ｃｓａｃ０２９４）が、正しくはセロビオース２－エピメラーゼをコードする遺伝子であることを物語っている。
＜実験５：セロビオース２－エピメラーゼの基質特異性＞
　実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼ精製標品を各種糖質に作用させて基質特異性を調べた。Ｄ－グルコース、Ｄ－キシロース、Ｄ－アロース、Ｄ－リボース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－プシコース、Ｄ－タガトース、Ｌ－ソルボース、Ｌ－ラムノース、Ｌ－リボース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ネオトレハロース、ゲンチオビオース、ラクトース、スクロース、マルツロース、パラチノース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セラギノース、イソマルトシルグルコシド、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、エルロース、マルチトール、マルトトリイトール、メチル－α－グルコシド、メチル－β－グルコシド、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、又は、Ｎ－アセチルガラクトサミンを２％（ｗ／ｖ）含み、終濃度４０ｍＭになるようＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた各基質溶液に、実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼ精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ５００単位ずつ加え、６０℃で２４時間作用させた。反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、実験１－２で行ったものと同じ方法によるＴＬＣ分析に供した。基質特異性は、基質糖質以外の反応生成物のスポットの有無と発色の強さの程度を調べることにより判定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から明らかなように、本酵素は、試験した基質の内、ラクトース、セロビオース、セロトリオース及びセロテトラオースによく作用し、また、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、マルトース及びマルトトリオースに作用して、異性化糖と考えられる生成物を生成した。さらに、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フラクトース、Ｄ－タガトース、マルツロース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースにも僅かに作用した。
＜実験６：単糖から生成する異性化糖＞
　本セロビオース２－エピメラーゼをＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース又はＤ－マンノースに作用させた場合の反応生成物を調べた。Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース又はＤ－マンノースを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に終濃度２０％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、それぞれ基質溶液とした。基質溶液０．１ｍｌに、実験４－４の方法で調製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼ精製標品を、Ｄ－グルコース及びＤ－マンノースの場合には基質固形物１グラム当たり１３０単位（酵素液として０．１ｍｌ）、Ｄ－ガラクトースの場合には基質固形物１グラム当たり５００単位（酵素液として０．１ｍｌ）加え、６０℃で４８時間反応させた。酵素反応後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。各反応液は反応液中の生成物を調べるためＨＰＬＣ分析に供した。なお、反応液中の生成物の分析は、単糖を分離するため下記のＨＰＬＣ条件により行った。結果を表４に示す。
＜ＨＰＬＣ条件＞
　カラム：ＭＣＩｇｅｌ　ＣＫ０８ＥＣ（三菱化学株式会社製）
　溶離液：脱イオン水　　　　　　　　　カラム温度：７５℃
　流　速：０．６ｍｌ／分
　検　出：示差屈折計　ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から明らかなように、本セロビオース２－エピメラーゼは、Ｄ－グルコースからＤ－マンノース及びＤ－フラクトースを、Ｄ－ガラクトースからＤ－タロース及びＤ－タガトースを、また、Ｄ－マンノースからＤ－グルコース及びＤ－フラクトースをそれぞれ生成していた。本酵素のＤ－ガラクトースへの作用は、Ｄ－グルコース及びＤ－マンノースへの作用に比べ弱いものであった。本酵素は、Ｄ－グルコース及びＤ－ガラクトースをそれぞれのエピマーであるＤ－マンノース及びＤ－タロースに変換するのみならず、それぞれＤ－フラクトース及びＤ－タガトースをも生成したことから、本酵素は２－エピマー化反応とアルドース－ケトース変換反応のいずれをも触媒する酵素であることが判明した。
＜実験７：ラクトースから生成する異性化糖＞
　本セロビオース２－エピメラーゼの作用によりラクトースから生成する異性化糖を確認する目的で、異性化糖の単離と構造解析を行った。
＜実験７－１：ラクトースからの異性化糖の調製＞
　２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に終濃度１．１ｗ／ｖ％となるようにラクトースを溶解した基質溶液２００ｍｌに、実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼ精製標品を、基質固形物１グラム当たり１３０単位（酵素液として２０ｍｌ）を加え、５０℃で８時間反応させた。酵素反応後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。反応液中の糖質を調べるため、実験１－２に記載した条件によるＴＬＣ分析と下記の条件によるＨＰＬＣ分析とを行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
　カラム：ＭＣＩｇｅｌ　ＣＫ０８ＥＰ（三菱化学株式会社製造）
　溶離液：脱イオン水　　　　　　　　　カラム温度：７５℃
　流　速：０．６ｍｌ／分
　検　出：示差屈折計　ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）
　ＴＬＣクロマトグラムにおいて、反応液中には未反応のラクトースとともに２種類の異性化糖が認められた。ＴＬＣにおいてエピラクトースと同じＲｆ値を示す異性化糖を異性化糖Ａと、ラクトースとほとんど分離しないＲｆ値のより低い異性化糖を異性化糖Ｂと呼称することにした。異性化糖Ｂは、ジフェニルアミン－アニリン－リン酸発色において発色したことから、構造中にケトースを含む異性化糖と考えられた。反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。ＨＰＬＣにおいて、これら異性化糖Ａ及びＢはラクトース（図６における符号Ｌａｃ）とは分離したものの、異性化糖同士では分離せず混合物の状態で検出され（図６における符号Ａ＋Ｂ）、反応液の糖組成はラクトース５２．７質量％、異性化糖Ａ及びＢの混合物４７．３質量％であった。
＜実験７－２：異性化糖Ａ及びＢの単離精製＞
　上記したように、ＴＬＣでは異性化糖ＡとＢは分離するものの異性化糖Ｂがラクトースと分離せず、一方、ＨＰＬＣでは異性化糖Ａ及びＢとラクトースは分離するものの、異性化糖ＡとＢは分離しなかった。この知見に基づき、まずＨＰＬＣによりラクトースを除去し異性化糖Ａ及びＢの混合物を取得した後、分取ＴＬＣにより異性化糖Ａ及びＢを単離精製することとした。
＜実験７－２－１：分取ＨＰＬＣによる異性化糖Ａ及びＢの混合物の取得＞
　実験７－１で得た反応液の固形物として３３０ｍｇを８０回に分けて実験７－１に記載したＨＰＬＣに供し、異性化糖Ａ及びＢの混合物を分取し、分取画分を濃縮、乾固し、混合物としての含量９８．７質量％の糖質標品（単糖を１．３質量％含有）を固形物として１５３ｍｇ得た。
＜実験７－２－２：分取ＴＬＣによる異性化糖Ａ及びＢの単離＞
　実験７－２－１で得た異性化糖Ａ及びＢを含む糖質標品５７．６ｍｇを実験１－２に記載したＴＬＣに供して２回展開した後、異性化糖Ａ及びＢそれぞれに該当するＲｆ値のシリカゲルを別々にかき取り、採取したシリカゲルから異性化糖Ａ及びＢを常法に従い脱イオン水で抽出し、濃縮、乾固して異性化糖Ａ標品を固形物として２１．９ｍｇ、異性化糖Ｂ標品を固形物として１７．８ｍｇ得た。得られた標品の一部を実験１－２に記載の方法でＧＣ分析に供し、それぞれの純度を測定したところ、異性化糖Ａは純度９０．２質量％（単糖を９．８質量％含有）、異性化糖Ｂは純度９７．７質量％（単糖を２．３質量％含有）であった。
＜実験７－３：異性化糖Ａ及びＢの構造解析＞
　実験６において本酵素は２－エピマー化反応とアルドース－ケトース変換反応のいずれをも触媒することが判明した。その結果に基づいて、異性化糖Ａを基質ラクトースのエピマーであるエピラクトースと、また、異性化糖Ｂをラクトースの還元末端グルコースがフラクトースに異性化したラクツロースと推定した。以下、本実験では、異性化糖Ａ及びＢの、市販のエピラクトース標準品及びラクツロース標準品との異同を核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により調べた。
　実験７－２で得られた異性化糖Ａ及びＢの標品を用い、下記の条件によりプロトンＮＭＲ（１Ｈ－ＮＭＲ）分析を行った。また、市販のエピラクトース及びラクツロースの標準品についても同様に行った。異性化糖Ａ及びエピラクトース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図７及び８に、また、異性化糖Ｂ及びラクツロース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図９及び１０に示した。
＜１Ｈ－ＮＭＲ測定条件＞
　核磁気共鳴装置：ＪＮＭ－ＡＬ３００型（日本電子株式会社製）
　溶媒：Ｄ２Ｏ　　　　　　　　　　試料量：２０ｍｇ
　磁場強度：３００．４ＭＨｚ　　　積算回数：１６回
　図７及び８から明らかなように、異性化糖Ａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはエピラクトース標準品のそれと、また、図９及び１０から明らかなように、異性化糖Ｂの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはラクツロース標準品のそれと、それぞれ完全に一致した。以上の結果から、ラクトースから生成した異性化糖Ａはエピラクトースであり、異性化糖Ｂはラクツロースであることが確認された。
＜実験８：セロビオースから生成する異性化糖＞
　本セロビオース２－エピメラーゼの作用によりセロビオースから生成する異性化糖を特定する目的で、異性化糖の単離と構造解析を行った。
＜実験８－１：セロビオースからの異性化糖の調製＞
　セロビオースを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に１０％（ｗ／ｖ）となるように溶解した基質溶液２０ｍｌに、実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼ生成標品を、基質固形物１グラム当たり５０単位（酵素液として１０ｍｌ）加え、６０℃で２３時間反応させた。酵素反応後、反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。反応液の糖組成を下記の条件によるＨＰＬＣ分析にて調べた。ＨＰＬＣクロマトグラムを図１１に示す。
＜ＨＰＬＣ条件＞
　カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＵＧＡＲ　ＳＰ０８１０（昭和電工株式会社製）とＭＣＩｇｅｌ　ＣＫ０８ＥＰ（三菱化学株式会社製造）の２本のカラムをこの順序で直列に連結したもの
　溶離液：脱イオン水　　　　　　　　　カラム温度：７５℃
　流　速：０．６ｍｌ／分
　検　出：示差屈折計　ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）
　図１１に示すように、反応液には未反応のセロビオースのピーク（図１１における符号Ｃｅｌ）とともに異性化糖と考えられる２つのピークが認められた。上記ＨＰＬＣにおいて２８．９分に溶出する糖質を異性化糖Ｃ（図１１における符号Ｃ）と、また、２７．４分に溶出する糖質を異性化糖Ｄ（図１１における符号Ｄ）と呼称することにした。反応液の糖組成はセロビオース４０．５質量％、異性化糖Ｃ１６．５質量％、及び、異性化糖Ｄ４３．０質量％であった。
＜実験８－２：異性化糖Ｃ及びＤの単離精製＞
　実験８－１で得た反応液の固形物として４３２ｍｇを１００回に分けて実験８－１に記載したＨＰＬＣに供し、異性化糖Ｃ及びＤをそれぞれ分取し精製した。それぞれの分取画分を濃縮、乾固し、いずれも純度１００％の異性化糖Ｃを１７．９ｍｇ、異性化糖Ｄを１１８ｍｇ得た。
＜実験８－３：異性化糖Ｃの構造解析＞
＜実験８－３－１：質量分析＞
　実験８－２で得た異性化糖Ｃについて質量分析装置『ＬＣＱ－Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモフィッシャー社製）を用いて質量分析したところ、質量数３６５のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、異性化糖Ｃの質量数は３４２であることが判明した。
＜実験８－３－２：酵素分解＞
　実験８－２で得た異性化糖Ｃを２０ｍＭ酢酸緩衝液に濃度２％（ｗ／ｖ）となるように溶解した基質溶液０．３ｍｌに、β－グルコシダーゼ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を基質１グラム当たり５００単位添加（酵素液として０．３ｍｌ）し、４０℃で１６時間反応させた。１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、反応生成物を調べるため実験６で用いたＨＰＬＣに供し、生成した単糖を調べたところ、Ｄ－グルコースとＤ－マンノースが等モル認められた。この結果とβ－グルコシダーゼの基質特異性を考慮すると、異性化糖ＣはＤ－マンノースにＤ－グルコースがβ結合した二糖であることが判明した。
＜実験８－３－３：核磁気共鳴分析＞
　実験８－２の方法で得られた異性化糖Ｃの標品を用い、常法に従って、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは実験７－３記載の条件で、また、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルは下記の条件で測定した。
＜１３Ｃ－ＮＭＲ測定条件＞
　核磁気共鳴装置：ＪＮＭ－ＡＬ３００型（日本電子株式会社製）
　溶媒：Ｄ２Ｏ　　　　　　　　　　試料量：１４～３０ｍｇ
　磁場強度：７５．４５ＭＨｚ　　　積算回数：１０００回
　異性化糖Ｃ標品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１２に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図１３に示す。図１３の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｄ－マンノースのＣ－４位シグナル（７９．３及び７８．９ｐｐｍ、図１３における符号＊）が大きく低磁場側にシフトしていたことから、Ｄ－グルコースはＤ－マンノースの４位に結合していることが分かった。また、図１２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、約４．３５ｐｐｍのシグナル（図１２における符号↓）はＤ－グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン－スピン結合定数を求めたところ、約７．９Ｈｚであったことから、Ｄ－マンノースの４位に結合したＤ－グルコース残基の１位のアノマー型はβ型であることが判明した。さらに、異性化糖Ｃの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおける各炭素シグナルの化学シフト値は、ウスイら、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第４３巻，８６３－８６５頁（１９７９年）に開示されたエピセロビオースのそれとよく一致した。
　実験８－３－１乃至８－３－３の結果から、本エピメラーゼの作用によりセロビオースから生成した異性化糖Ｃは、４－Ｏ－β－Ｄ－グルコシルＤ－マンノース、すなわち、エピセロビオースであることが判明した。
＜実験８－４：異性化糖Ｄの構造解析＞
＜実験８－４－１：質量分析＞
　実験８－２で得た異性化糖Ｄについて実験８－３－１と同様に質量分析したところ、質量数３６５のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、異性化糖Ｃの質量数は３４２であることが判明した。
＜実験８－４－２：酵素分解＞
　異性化糖Ｃに替えて実験８－２で得た異性化糖Ｄを用いた以外は実験８－３－２と同様に処理して、異性化糖Ｄの酵素分解を行った。反応生成物を調べるため実験６で用いたＨＰＬＣに供し、生成した単糖を調べたところ、Ｄ－グルコースとＤ－フラクトースが等モル認められた。この結果とβ－グルコシダーゼの基質特異性を考慮すると、異性化糖ＤはＤ－フラクトースにＤ－グルコースがβ結合した二糖であることが判明した。
＜実験８－４－３：核磁気共鳴分析＞
　実験８－３－３と同様に、実験８－２の方法で得た異性化糖Ｄ標品のＮＭＲ分析を行った。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１４に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図１５に示す。図１５の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｄ－フラクトースのＣ－４位シグナル（７９．９、８６．４及び８７．７ｐｐｍ、図１５における符号＊）が大きく低磁場側にシフトしていたことから、Ｄ－グルコースはＤ－フラクトースの４位に結合していることが分かった。また、図１４の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、約４．４９ｐｐｍのシグナル、約４．４０ｐｐｍのシグナル、及び、約４．３８ｐｐｍのシグナル（図１４における符号↓）はＤ－グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン－スピン結合定数を求めたところ、約７．９Ｈｚ（約４．４９ｐｐｍのシグナル）、約７．７Ｈｚ（約４．４０ｐｐｍのシグナル）、及び、約６．１Ｈｚ（約４．３８ｐｐｍのシグナル）であったことから、Ｄ－フラクトースの４位に結合したＤ－グルコース残基の１位のアノマー型はβ型であることが判明した。さらに、異性化糖Ｄの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおける各炭素シグナルの化学シフト値は、フェファーら、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），第１０２巻，１１－２２頁（１９８２年）に開示されたセロビウロースのそれとよく一致した。
　実験８－４－１乃至８－４－３の結果から、本エピメラーゼの作用によりセロビオースから生成した異性化糖Ｄは、４－Ｏ－β－Ｄ－グルコシルＤ－フラクトース、すなわち、セロビウロースであることが判明した。
＜実験９：マルトースから生成する異性化糖＞
　本セロビオース２－エピメラーゼの作用によりマルトースから生成する異性化糖を特定する目的で、異性化糖の単離と構造解析を行った。
＜実験９－１：マルトースからの異性化糖の調製＞
　基質をセロビオースからマルトースに替え、実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼの酵素作用量を基質固形物１グラム当たり２００単位とした以外は、実験８－１と同様に反応させて反応液を得た。反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを図１６に示す。図１６に示すように、反応液には未反応のマルトースのピーク（図１６における符号Ｍａｌ）とともに異性化糖と考えられる２つのピークが認められた。上記ＨＰＬＣにおいて３１．６分に溶出する糖質を異性化糖Ｅ（図１６における符号Ｅ）と、また、２８．０分に溶出する糖質を異性化糖Ｆ（図１６における符号Ｆ）と呼称することにした。反応液の糖組成はマルトース７０．１質量％、異性化糖Ｅ２２．２質量％、及び、異性化糖Ｆ７．７質量％であった。
＜実験９－２：異性化糖Ｅ及びＦの単離精製＞
　実験９－１で得た反応液の固形物として１９１ｍｇを２９回に分けて実験８－１で用いたＨＰＬＣに供し、異性化糖Ｅ及びＦをそれぞれ分取し精製した。分取画分をそれぞれ濃縮、乾固し、純度９９．１質量％の異性化糖Ｅを３８．１ｍｇ、純度９２．３質量％の異性化糖Ｆを１４．２ｍｇ得た。
＜実験９－３：異性化糖Ｅの構造解析＞
＜実験９－３－１：質量分析＞
　実験９－２で得た異性化糖Ｅについて実験８－３－１と同様に質量分析したところ、質量数３６５のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、異性化糖Ｅの質量数は３４２であることが判明した。
＜実験９－３－２：酵素分解＞
　実験９－２で得た異性化糖Ｅを２０ｍＭ酢酸緩衝液に濃度２％（ｗ／ｖ）となるように溶解した基質溶液０．３ｍｌに、α－グルコシダーゼ（天野エンザイム株式会社製）を基質１グラム当たり５００単位添加（酵素液として０．３ｍｌ）し、５０℃で１６時間反応させた。１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、反応生成物を調べるため実験６で用いたＨＰＬＣに供し、生成した単糖を調べたところ、Ｄ－グルコースとＤ－マンノースが等モル認められた。この結果とα－グルコシダーゼの基質特異性を考慮すると、異性化糖ＥはＤ－マンノースにＤ－グルコースがα結合した二糖であることが判明した。
＜実験９－３－３：核磁気共鳴分析＞
　実験８－３－３と同様に、実験９－２の方法で得た異性化糖Ｅ標品のＮＭＲ分析を行った。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１７に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図１８に示す。図１８の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｄ－マンノースのＣ－４位シグナル（７７．７及び７７．２ｐｐｍ、図１８における符号＊）が大きく低磁場側にシフトしていたことから、Ｄ－グルコースはＤ－マンノースの４位に結合していることが分かった。また、図１７の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、約５．２２ｐｐｍのシグナル（図１７における符号↓）はＤ－グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン－スピン結合定数を求めたところ、約３．９Ｈｚであったことから、Ｄ－マンノースの４位に結合したＤ－グルコース残基の１位のアノマー型はα型であることが判明した。さらに、異性化糖Ｅの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおける各炭素シグナルの化学シフト値は、特開平１０－９５７９４号公報に開示された４－α－Ｄ－グルコシルＤ－マンノースのそれとよく一致した。
　実験９－３－１乃至９－３－３の結果から、本エピメラーゼの作用によりマルトースから生成した異性化糖Ｅは、４－Ｏ－α－Ｄ－グルコシルＤ－マンノース、すなわち、エピマルトースであることが判明した。
＜実験９－４：異性化糖Ｆの構造解析＞
　実験６において本酵素は２－エピマー化反応のみならずアルドース－ケトース変換反応をも触媒することが判明し、実験７においてラクトースからラクツロースが、実験８においてセロビオースからセロビウロースが生成していたことから、異性化糖Ｆはマルトースの還元末端グルコースがフラクトースに異性化したマルツロースであると推定された。以下、本実験では、異性化糖Ｆの市販のマルツロース標準品との異同を１Ｈ－ＮＭＲ分析により調べた。
　実験９－２で得た異性化糖Ｆ標品を用い、実験７－３と同じ条件で１Ｈ－ＮＭＲ分析を行った。また、市販のマルツロース標準品についても同様に行った。異性化糖Ｆ及びマルツロース標準品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１９及び２０に示した。
　図１９及び２０から明らかなように、異性化糖Ｆの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはマルツロース標準品のそれと完全に一致した。この結果から、マルトースから生成した異性化糖Ｆはマルツロースと同定された。
＜実験１０：マルトトリオースから生成する異性化糖＞
　本セロビオース２－エピメラーゼの作用によりマルトトリオースから生成する異性化糖を特定する目的で、異性化糖の単離と構造解析を行った。
＜実験１０－１：マルトトリオースからの異性化糖の調製＞
　基質をマルトースからマルトトリオースに替えた以外は、実験９－１と同様に反応させて反応液を得た。反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示す。図２１に示すように、反応液には未反応のマルトトリオースのピーク（図２１における符号Ｇ３）とともに異性化糖と考えられる１つのピークが認められた。上記ＨＰＬＣにおいて２９．９分に溶出する糖質を異性化糖Ｇ（図２１における符号Ｇ）と呼称することにした。反応液の糖組成はマルトトリオース７３．８質量％、異性化糖Ｇ２３．３質量％、及び、その他未知糖２．９質量％であった。
＜実験１０－２：異性化糖Ｇの単離精製＞
　実験１０－１で得た反応液の固形物として４７５ｍｇを８０回に分けて実験８－１で用いたＨＰＬＣに供し、異性化糖Ｇを分取し精製した。分取画分を濃縮、乾固し、純度９９．４質量％の異性化糖Ｇを１１３ｍｇ得た。
＜実験１０－３：異性化糖Ｇの構造解析＞
＜実験１０－３－１：質量分析＞
　実験１０－２で得た異性化糖Ｇについて実験８－３－１と同様に質量分析したところ、質量数５２７のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、異性化糖Ｇの質量数は５０４であることが判明した。
＜実験１０－３－２：酵素分解＞
　異性化糖Ｅ標品を実験１０－２で得た異性化糖Ｇ標品に替えた以外は実験９－３－２と同様にα－グルコシダーゼで酵素分解し、反応液をＨＰＬＣに供して生成した単糖を調べたところ、Ｄ－グルコースとＤ－マンノースが２：１のモル比で認められた。この結果とα－グルコシダーゼの基質特異性を考慮すると、異性化糖Ｇは、還元末端に存在するＤ－マンノース１分子とＤ－グルコース２分子とからなる三糖であることが判明した。
＜実験１０－３－３：核磁気共鳴分析＞
　実験８－３－３と同様に、実験１０－２の方法で得た異性化糖Ｇ標品のＮＭＲ分析を行った。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２２に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図２３に示す。図２３の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｄ－マンノースのＣ－４位シグナル（７７．９及び７７．３ｐｐｍ、図２３における符号＊）が大きく低磁場側にシフトしていたことから、Ｄ－グルコースはＤ－マンノースの４位に結合していることが分かった。また、Ｄ－グルコース１分子のＣ－４位シグナル（７９．２ｐｐｍ、図２３における符号＃）も大きく低磁場側にシフトしていたことから、Ｄ－グルコース１分子がＤ－グルコースの４位に結合していることも判明した。さらに、図２２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、約５．２０ｐｐｍのシグナル（図２２における符号↓）はＤ－マンノースに結合したＤ－グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン－スピン結合定数を求めたところ、約３．９Ｈｚであったことから、Ｄ－マンノースの４位に結合したＤ－グルコース残基の１位のアノマー型はα型であることが判明した。またさらに、約５．２６ｐｐｍのシグナル（図２２における符号ｘ）はＤ－グルコースに結合したＤ－グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン－スピン結合定数を求めたところ、約３．７Ｈｚであったことから、Ｄ－グルコースの４位に結合したＤ－グルコース残基の１位のアノマー型もα型であることが判明した。
　実験１０－３－１乃至１０－３－３の結果から、本エピメラーゼの作用によりマルトトリオースから生成した異性化糖Ｇは、４－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－４－Ｏ－α－グルコシルＤ－マンノース、すなわち、エピマルトトリオースであることが判明した。
＜実験１１：各種糖質からの異性化糖の生成－酵素作用量の影響－＞
　実験５乃至１０の結果から、本セロビオース２－エピメラーゼは、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－タガトースなどの単糖、マルトース、セロビオース、ラクトースなどの二糖、及び、マルトオリゴ糖、セロオリゴ糖などのオリゴ糖に作用し、２－エピマー化反応とアルドース－ケトース変換反応を触媒することが判明した。本実験では、各種基質の異性化反応に及ぼす酵素作用量の影響を調べた。
　単糖としてＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－タロース、Ｄ－フラクトース及びＤ－タガトースの６種、二糖としてマルトース、セロビオース及びラクトースの３種、三糖としてマルトトリオースの１種をそれぞれ基質として用い、それぞれを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、実験４－４の方法で得た組換え型セロビオース２－エピメラーゼ精製標品を添加し、基質濃度１０％（ｗ／ｖ）、６０℃で７２時間反応させた。酵素作用量は、基質が単糖の場合は基質１グラム当たり１３０又は５００単位、基質が二糖及び三糖の場合は、基質１グラム当たり１及び／又は１３０単位とした。各反応液は、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、ＨＰＬＣ分析に供して反応液の固形物当たりの異性化糖含量を測定した。なお、基質ラクトースの反応液中のエピラクトース及びラクツロース含量については、実験１－２で用いたＧＣ分析により測定した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５から明らかなように、本セロビオース２－エピメラーゼはセロビオース及びラクトースによく作用し、酵素作用量が基質１グラム当たり１単位と比較的低い場合においても２－エピマー化反応を触媒し、エピセロビオース及びエピラクトースを生成した。また、酵素作用量を増加させるとアルドース－ケトース変換反応によるセロビウロース及びラクツロースが顕著に生成した。本酵素の単糖や三糖への作用は、セロビオース及びラクトースへの場合と比較して弱く、異性化には多量の酵素を要した。
　ここまでの実験で得られたカルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼの理化学的性質及び基質特異性を、公知のルミノコッカス・アルブス由来セロビオース２－エピメラーゼ（非特許文献３より抜粋）及びユーバクテリウム・セルロソルベンス由来セロビオース２－エピメラーゼ（非特許文献４より抜粋）の理化学的性質及び基質特異性とともに表６にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６から明らかなように、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼは、ルミノコッカス・アルブス及びユーバクテリウム・セルロソルベンスにそれぞれ由来する公知のセロビオース２－エピメラーゼと比較して、至適温度が４５乃至５０℃高く、温度安定性が３０℃程度高い、耐熱性に優れる酵素であった。また、カルジセルロシルプトル・サッカロリティカス　ＡＴＣＣ４３４９４由来セロビオース２－エピメラーゼは、公知のルミノコッカス・アルブス由来及びユーバクテリウム・セルロソルベンス由来セロビオース２－エピメラーゼでは作用しないと報告（非特許文献３及び４を参照）されているＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノースなどの単糖や、マルトースにも作用する新規な酵素であることが判明した
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
＜Ｄ－マンノースの調製＞
　Ｄ－グルコースの１０％（ｗ／ｖ）水溶液（ｐＨ６．５）に、実験４－４の方法で精製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼをＤ－グルコース１グラム当り１３０単位（ラクトース２－エピメラーゼ活性）の割合で加え、６０℃で４８時間反応させたところ、糖組成中Ｄ－マンノースが２１質量％生成した。反応後、反応液を常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、Ｈ型イオン交換樹脂（商品名「ダイヤイオン　ＳＫ１Ｂ」、三菱化学株式会社製）及びＯＨ型イオン交換樹脂（商品名「ダイヤイオン　ＷＡ３０」、三菱化学株式会社製）を用いて脱塩し、減圧濃縮してＤ－マンノースを含む透明なシラップを得た。本シラップを塩型強酸性カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ－５３０、Ｃａ型、三菱化学株式会社製）を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、分離精製し、濃縮してシラップ状のＤ－マンノースを固形物当り収率約１８％で得た。
＜エピラクトースの調製＞
　ラクトースの１０％（ｗ／ｖ）水溶液（ｐＨ６．５）に、実験４－４の方法で精製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼをラクトース１グラム当り２単位（ラクトース２－エピメラーゼ活性）の割合で加え、６０℃で７２時間反応させた。反応液を１００℃で１５分間加熱して反応を停止させ、冷却した後、反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣにて測定したところ、固形物当たり未反応のラクトースを６９質量％、エピラクトースを２８質量％、ラクツロースを３質量％含有していた。この糖液のｐＨを４．５に調製した後、ラクターゼ剤（商品名「ラクターゼＹ－ＡＯ」、ヤクルト薬品工業株式会社販売）を基質１グラム当たり２５単位添加し、４０℃で１６時間反応させて、糖液中のラクトース及びラクツロースを優先的に加水分解し、反応後、反応液を実施例１と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮してエピラクトースを含む透明なシラップを得た。本シラップを実施例１と同様に塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分離精製し、濃縮してシラップ状のエピラクトースを固形物当り収率約２３％で得た。
＜エピセロビオース含有シラップの調製＞
　セロビオースの１０％（ｗ／ｖ）水溶液（ｐＨ６．５）に、実験４－４の方法で精製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼをセロビオース１グラム当り２単位（ラクトース２－エピメラーゼ活性）の割合で加え、６０℃で７２時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、冷却した後、反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣにて測定したところ、固形物当たり未反応のセロビオースを６９質量％、エピセロビオースを２８質量％、セロビウロースを３質量％含有していた。反応液を実施例１と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮し透明なエピセロビオース含有シラップを固形物当り収率約９７％で得た。
＜エピマルトース含有シラップの調製＞
　マルトースの１０％（ｗ／ｖ）水溶液（ｐＨ７．３）に、実験４－４の方法で精製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼをマルトース１グラム当り２００単位（ラクトース２－エピメラーゼ活性）の割合で加え、６０℃で２３時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、冷却した後、反応液の糖組成をＨＰＬＣにて測定したところ、固形物当たり未反応のマルトースを７０質量％、エピマルトースを２２質量％、マルツロースを８質量％含有していた。反応液を実施例１と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮し透明なエピマルトース含有シラップを固形物当り収率約９６％で得た。
＜セロビウロースの調製＞
　実験４－４の方法で精製した組換え型セロビオース２－エピメラーゼをセロビオース１グラム当り１３０単位（ラクトース２－エピメラーゼ活性）作用させた以外は、実施例３と同様にしてセロビオースに作用させた。反応停止後の反応液の糖組成をＨＰＬＣにて調べたところ、固形物当たり未反応のセロビオースを３３質量％、エピセロビオースを１３質量％、セロビウロースを５４質量％含有していた。反応液を実施例３と同様に、脱色、脱塩し、減圧濃縮して透明なシラップを得た後、本シラップを実施例１と同様に塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、分離精製し、濃縮してシラップ状のセロビウロースを固形物当り収率約４５％で得た。
＜固定化セロビオース２－エピメラーゼ＞
　実験４－４の方法で形質転換体『ＥＴＣＳ１』を培養し、培養液を遠心分離してセロビオース２－エピメラーゼ活性を発現した湿菌体１００ｇを得た。次いで、この湿菌体を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した２．５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社販売）１００ｍｌに混練した。得られた菌体を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌した０．１ＭのＣａＣｌ２水溶液に、水面より約２０ｃｍの高さから連続的に滴下し、直径約２ｍｍの球状のゲル化物を調製した。これを０．１ＭのＣａＣｌ２水溶液中に約２時間保持した後、吸引濾過してアルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌体はセロビオース２－エピメラーゼ活性を発現していることから、カラムに充填するなどして固定化セロビオース２－エピメラーゼとして有利に利用できる。
　本発明のセロビオース２－エピメラーゼは、従来公知のセロビオース２－エピメラーゼに比べ優れた耐熱性を有し、また新規な糖異性化反応を触媒するので、Ｄ－グルコースからＤ－マンノースの、マルトースからエピマルトースの、セロビオースからエピセロビオースやセロビウロースの、又は、ラクトースからエピラクトースやラクツロースの製造など、安価な原料から、より付加価値の高い糖質を工業レベルで製造する上で非常に有利な酵素である。本発明は、かくも顕著な作用効果を奏する発明であり、産業上の貢献度が誠に多大な意義ある発明である。

Claims (14)

  1. 　下記の異性化反応を触媒するセロビオース２－エピメラーゼ：
    （１）２－エピマー化反応
    　Ｄ－グルコース及びＤ－ガラクトースの２位をエピマー化して、それぞれＤ－マンノース及びＤ－タロースに変換し、その逆反応も触媒する；
    　マルトース、セロビオース及びラクトースにおける還元末端グルコースの２位をエピマー化して、それぞれエピマルトース、エピセロビオース及びエピラクトースに変換する；
    　重合度３以上のマルトオリゴ糖及びセロオリゴ糖における還元末端グルコースの２位をエピマー化して、それぞれエピマルトオリゴ糖及びエピセロオリゴ糖に変換する；
    （２）アルドース－ケトース変換反応
    　Ｄ－グルコース又はＤ－マンノースをＤ－フラクトースに、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロースをＤ－タガトースにそれぞれ変換し、その逆反応も触媒する；
    　マルトース又はエピマルトースをマルツロースに、セロビオース又はエピセロビオースをセロビウロースに、ラクトース又はエピラクトースをラクツロースに変換する。
  2. 　下記の理化学的性質を有する請求の範囲第１項記載のセロビオース２－エピメラーゼ：
    （１）分子量
    　ＳＤＳ－ゲル電気泳動法において、４４，０００±５，０００ダルトン；
    （２）至適温度
    　ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で８０℃；
    （３）至適ｐＨ
    　５０℃、２０分間反応の条件下でｐＨ７．８；
    （４）温度安定性
    　ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下で７０℃まで安定；
    （５）ｐＨ安定性
    　４℃、２４時間保持する条件下でｐＨ４．５乃至９．５の範囲で安定。
  3. 　配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列か、当該アミノ酸配列において酵素活性を保持する範囲で１個以上１０個未満のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項又は第２項記載のセロビオース２－エピメラーゼ。
  4. 　請求の範囲第３項記載のセロビオース２－エピメラーゼをコードするＤＮＡ。
  5. 　ＤＮＡが、配列表における配列番号９で示される塩基配列か、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列表における配列番号９で示される塩基配列において１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又は、これらに相補的な塩基配列を有する請求の範囲第４項記載のＤＮＡ。
  6. 　配列表における配列番号９で示される塩基配列か、又は、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列表における配列番号９で示される塩基配列において１個以上３０個未満の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列における塩基の１個又は２個以上が、遺伝暗号の縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基に置換した請求の範囲第４項記載のＤＮＡ。
  7. 　請求の範囲第４項乃至第６項のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターＤＮＡとを含んでなる組換えＤＮＡ。
  8. 　請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して得られる形質転換体。
  9. 　請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地で培養し、培養物から産生したセロビオース２－エピメラーゼを採取することを特徴とするセロビオース２－エピメラーゼの製造方法。
  10. 　微生物が、請求の範囲第８項記載の形質転換体である請求の範囲第９項記載のセロビオース２－エピメラーゼの製造方法。
  11. 　Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、マルトース、セロビオース、ラクトース、重合度３以上のマルトオリゴ糖、及び、重合度３以上のセロオリゴ糖から選ばれる糖質に、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のセロビオース２－エピメラーゼを作用させて、それぞれに対応するＤ－マンノース、Ｄ－タロース、エピマルトース、エピセロビオース、エピラクトース、重合度３以上のエピマルトオリゴ糖、及び、重合度３以上のエピセロオリゴ糖から選ばれる異性化糖を生成させる工程と、生成した異性化糖を採取する工程とを含んでなる異性化糖の製造方法。
  12. 　Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、マルトース、セロビオース、ラクトース、重合度３以上のマルトオリゴ糖、及び、重合度３以上のセロオリゴ糖から選ばれる糖質を含んでなる栄養培地で請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、培養液中に生成する、それぞれに対応するＤ－マンノース、Ｄ－タロース、エピマルトース、エピセロビオース、エピラクトース、重合度３以上のエピマルトオリゴ糖、及び、重合度３以上のエピセロオリゴ糖から選ばれる異性化糖を採取する工程とを含んでなる異性化糖の製造方法。
  13. 　Ｄ－グルコース又はＤ－マンノース、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロース、マルトース又はエピマルトース、セロビオース又はエピセロビオース、及び、ラクトース又はエピラクトースから選ばれる糖質に、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のセロビオース２－エピメラーゼを作用させて、それぞれに対応するＤ－フラクトース、Ｄ－タガトース、マルツロース、セロビウロース及びラクツロースから選ばれる異性化糖を生成させる工程と、生成した異性化糖を採取する工程とを含んでなる異性化糖の製造方法。
  14. 　Ｄ－グルコース又はＤ－マンノース、Ｄ－ガラクトース又はＤ－タロース、マルトース又はエピマルトース、セロビオース又はエピセロビオース、及び、ラクトース又はエピラクトースから選ばれる糖質を含んでなる栄養培地で請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のセロビオース２－エピメラーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、培養液中に生成する、それぞれに対応するＤ－フラクトース、Ｄ－タガトース、マルツロース、セロビウロース及びラクツロースから選ばれる異性化糖を採取する工程とを含んでなる異性化糖の製造方法。
     
     
PCT/JP2010/050928 2009-02-05 2010-01-25 セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途 WO2010090095A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/147,965 US20120040407A1 (en) 2009-02-05 2010-01-25 Cellobiose 2-epimerase, its preparation and uses
EP10738433.1A EP2395080B1 (en) 2009-02-05 2010-01-25 Cellobiose 2-epimerase, process for producing same, and use of same
JP2010549436A JP5677097B2 (ja) 2009-02-05 2010-01-25 セロビオース２−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
US13/590,460 US9175282B2 (en) 2009-02-05 2012-08-21 Cellobiose 2-epimerase, its preparation and uses

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-025070 2009-02-05
JP2009025070 2009-02-05

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/147,965 A-371-Of-International US20120040407A1 (en) 2009-02-05 2010-01-25 Cellobiose 2-epimerase, its preparation and uses
US13/590,460 Division US9175282B2 (en) 2009-02-05 2012-08-21 Cellobiose 2-epimerase, its preparation and uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010090095A1 true WO2010090095A1 (ja) 2010-08-12

Family

ID=42541999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/050928 WO2010090095A1 (ja) 2009-02-05 2010-01-25 セロビオース２－エピメラーゼとその製造方法並びに用途

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20120040407A1 (ja)
EP (1) EP2395080B1 (ja)
JP (1) JP5677097B2 (ja)
TW (1) TWI471418B (ja)
WO (1) WO2010090095A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011217701A (ja) * 2010-04-14 2011-11-04 Nippon Shokuhin Kako Co Ltd 高純度エピラクトースおよびその製造方法
KR101261004B1 (ko) 2011-02-23 2013-05-06 건국대학교 산학협력단 셀로비오스 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법
WO2022025022A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 日本食品化工株式会社 糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101868194B1 (ko) * 2013-11-19 2018-06-18 씨제이제일제당 (주) 호열균 유래 당 에피머화효소를 포함하는, 비인산헥소오스의 에피머화용 조성물
WO2019166514A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 C-Lecta Gmbh Enzymatic in-situ fortification of food with functional carbohydrates
WO2023170250A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Frieslandcampina Nederland B.V. Enzymatic process for the preparation of lactulose
GB202209640D0 (en) 2022-06-30 2022-08-17 Norwegian Univ Of Life Sciences Method

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823799A (ja) 1981-08-03 1983-02-12 株式会社林原生物化学研究所 高純度マルト−スの製造方法
JPS5872598A (ja) 1981-10-26 1983-04-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 高純度イソマルト−スの製造方法
JPH06125776A (ja) 1992-10-08 1994-05-10 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JPH0779498A (ja) 1993-08-05 1995-03-20 Hewlett Packard Co <Hp> 音響変換器用のｚ−軸導電性積層裏当て層
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
WO2008062555A1 (fr) * 2006-11-20 2008-05-29 National University Corporation Hokkaido University Nouveau polypeptide ayant une activité épimérase et son utilisation

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100402564B1 (ko) * 1994-03-25 2003-10-22 마루킨 츄유 가부시키가이샤 에피머라제
JPH1095794A (ja) 1996-09-19 1998-04-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 新規な糖類及びその製造法
WO2009119538A1 (ja) * 2008-03-25 2009-10-01 国立大学法人 北海道大学 エピメラーゼ活性を有する新規ポリペプチド、その製造方法ならびにその利用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823799A (ja) 1981-08-03 1983-02-12 株式会社林原生物化学研究所 高純度マルト−スの製造方法
JPS5872598A (ja) 1981-10-26 1983-04-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 高純度イソマルト−スの製造方法
JPH06125776A (ja) 1992-10-08 1994-05-10 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JPH0779498A (ja) 1993-08-05 1995-03-20 Hewlett Packard Co <Hp> 音響変換器用のｚ−軸導電性積層裏当て層
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
WO2008062555A1 (fr) * 2006-11-20 2008-05-29 National University Corporation Hokkaido University Nouveau polypeptide ayant une activité épimérase et son utilisation

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"American Type Culture Collection Medium No. 1368", 1992, AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION, article "ATCC Catalogue of American Type Culture Collection the 18thed.", pages: 470
"Enzyme Nomenclature", 1992, ACADEMIC PRESS INC.
DATABASE PROTEIN [online] NCBI; 2007, XP008164001, Database accession no. YP_001179132 *
FURTHERMORE, TAGUCHI ET AL., FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 287, 2008, pages 34 - 40
ITO ET AL., APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 79, 2008, pages 433 - 441
ITO ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATION, vol. 360, 2007, pages 640 - 645
NISHIMUKAI ET AL., JOURNAL OFAGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 56, 2008, pages 10340 - 10345
PFEFFER ET AL., CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 102, 1982, pages 11 - 22
See also references of EP2395080A4 *
TAGUCHI H. ET AL.: "Cloning and sequencing of the gene for cellobiose 2-epimerase from a ruminal strain of Eubacterium cellulosolvens.", FEMS MICROBIOL LETT., vol. 287, no. 1, 2008, pages 34 - 40 *
TYLERET, ARCHIVES OF BIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS, vol. 119, 1967, pages 363 - 367
USUI ET AL., AGRICULTURAL BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 43, 1979, pages 863 - 865
VAN DE WERKEN H.J. ET AL.: "Hydrogenomics of the extremely thermophilic bacterium Caldicellulosiruptor saccharolyticus", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 74, no. 21, 2008, pages 6720 - 6729 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011217701A (ja) * 2010-04-14 2011-11-04 Nippon Shokuhin Kako Co Ltd 高純度エピラクトースおよびその製造方法
KR101261004B1 (ko) 2011-02-23 2013-05-06 건국대학교 산학협력단 셀로비오스 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법
WO2022025022A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 日本食品化工株式会社 糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物
JP2022026753A (ja) * 2020-07-31 2022-02-10 日本食品化工株式会社 糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、エピメリ化反応生成物の製造方法およびエピメリ化反応生成物

Also Published As

Publication number Publication date
JP5677097B2 (ja) 2015-02-25
EP2395080B1 (en) 2014-08-06
JPWO2010090095A1 (ja) 2012-08-09
US20120040407A1 (en) 2012-02-16
US20120329098A1 (en) 2012-12-27
TW201040270A (en) 2010-11-16
EP2395080A1 (en) 2011-12-14
EP2395080A4 (en) 2012-10-31
TWI471418B (zh) 2015-02-01
US9175282B2 (en) 2015-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5098086B2 (ja) ケトース３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP5677097B2 (ja) セロビオース２−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
EP1885850B1 (en) D-psicose production method by d-psicose epimerase
US8173399B2 (en) Method for producing lacto-N-biose I and galacto-N-biose
JP5997693B2 (ja) アルスロバクターグロビホルミスの生産する酵素
JP5848834B2 (ja) アルスロバクターグロビホルミスの生産するケトース３−エピメラーゼ
Leang et al. Novel reactions of L-rhamnose isomerase from Pseudomonas stutzeri and its relation with D-xylose isomerase via substrate specificity
Menavuvu et al. Novel substrate specificity of D-arabinose isomerase from Klebsiella pneumoniae and its application to production of D-altrose from D-psicose
KR100427529B1 (ko) 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 열안정성 효소
KR100395445B1 (ko) 환원성 전분당으로부터 비환원성 당질을 생성하는 재조합 열안정성 효소
EP0671470A2 (en) Trehalose releasing enzyme, DNA encoding therefor, their preparation and uses
EP0674005A2 (en) Non-reducing saccharide-forming enzyme, DNA encoding it, and their preparations and uses
JP5933321B2 (ja) 新規なα−グルコシダーゼとその製造法並びに用途
EP0695804B1 (en) DNA encoding for a recombinant enzyme for converting maltose into trehalose
KR20020051835A (ko) 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의제조방법
US8137946B2 (en) Recombinant GRAS strains expressing thermophilic arabinose isomerase as an active form and method of preparing food grade tagatose by using the same
WO2019035482A1 (ja) エピメリ化活性を有するタンパク質
WO2022114207A1 (ja) 新規ｌ－ラムノースイソメラーゼ
JP5714241B2 (ja) α−グルコシダーゼとその製造方法並びに用途
KR20170117860A (ko) 딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용하는 타가토스의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물
KR20230115919A (ko) 원-팟 d-알로스 생산용 조성물 및 이를 이용한 알로스의 제조방법
JP2010148502A (ja) β−ホスホグルコムターゼとその製造方法並びに用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10738433

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010549436

Country of ref document: JP

Ref document number: 13147965

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010738433

Country of ref document: EP