WO2010070037A1 - Nachweiskonjugat und verfahren zu polychromatischen analyse - Google Patents

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WO2010070037A1
WO2010070037A1 PCT/EP2009/067384 EP2009067384W WO2010070037A1 WO 2010070037 A1 WO2010070037 A1 WO 2010070037A1 EP 2009067384 W EP2009067384 W EP 2009067384W WO 2010070037 A1 WO2010070037 A1 WO 2010070037A1
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quencher
oligonucleotide
oligonucleotide linker
linker
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PCT/EP2009/067384
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Christian Hennig
Gesine Hansen
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Medizinische Hochschule Hannover
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Definitions

  • the invention relates to detection conjugates having an antibody moiety, methods for detecting analytes by means of a detection conjugate and the use of the detection conjugates in methods for the specific detection of analytes, e.g. of specific antigens which are arranged in solution, extracellularly or intracellularly on cells suspended or bound to a carrier substrate or on a carrier substrate, and in particular on living cells or on denatured and permeabilized cells bound in suspension or on a carrier substrate , Detection conjugates contain, as an alternative to the antibody portion, a specific binding portion for an analyte, e.g. a receptor ligand, a receptor, a specific binding molecule, e.g. a lectin, biotin, avidin, an oligosaccharide, each as a binding portion of the detection conjugate.
  • a specific binding portion for an analyte, e.g. a receptor ligand, a receptor, a specific binding molecule, e.g. a
  • Detecting conjugates according to the invention comprise a binding moiety and a fluorochrome moiety linked thereto which is linked to a first end of a linker. At the second end of the linker opposite the first end may be arranged with the binding portion, so that the linker is arranged between the binding portion and the fluorochrome portion.
  • the detection conjugates are characterized in that the attached to the fluorochrome portion of the conjugate linker is adapted to make the optical activity of the fluorochrome portion of the conjugate by interaction with a reagent ineffective.
  • the binding portion may be connected to the fluorochrome portion, while the linker is connected at its first end to the fluorochrome portion.
  • the inventive device of the linker in the presence of a reagent which is a compound specifically reactive with the linker, makes the optical activity of the fluorochrome portion ineffective, permits detection methods in which at least two detection conjugates with different specificity are used simultaneously and / or successively, each with the step of inactivating a linker specific for the optical activity of the fluorochrome portion in the conjugate, eg after detection of a detection conjugate such that e.g. when used as an alternative to bleaching with the same and different fluorochrome portions of the conjugates, no mutual interference occurs, such as interference or the mutual excitation of fluorochromes.
  • the linkers of conjugates which are contacted sequentially or simultaneously with the same sample have different binding specificities for a particular specific reagent for inactivating the fluorochrome portion.
  • Mahnke and Roederer describe how a plurality of antibody conjugates for the detection of antigens on flow cytometry cells can be aligned to interfere with the fluorochrome content upon concomitant use each having different emission spectra to be distinguishable.
  • Perfetto et al. (Nature 648-654 (2004)) describe flow cytometers for the detection of a variety of fluorochromes by each very specific short-term specific excitation and wavelength-specific detection of emitted light, which is referred to as simultaneous measurement. It is shown that different fluorochromes co-present in a sample still exhibit nonspecific emissions when excited at a wavelength specific to the fluorochrome, which is attributed to energy transfer among the fluorochromes. To avoid nonspecific signals, the tuning of the antibody-fluorochrome conjugates to be used simultaneously is proposed in an empirical method. To further reduce nonspecific emission signals, a mathematical compensation is proposed to exclude emissions that may be due to nonspecific energy transfer between fluorochromes.
  • US Pat. No. 6,150,173 describes a computer-controlled automatic pipetting apparatus with which antibody fluorochrome conjugates are successively incubated with a sample, the emitted radiation is measured after irradiation of an excitation wavelength, then the fluorochrome is destroyed by irradiation with UV and a new antibody-fluorochrome conjugate is added the same sample is given.
  • WO 2007/101706 A1 describes that prior to the detection of a specific antibody-fluorochrome conjugate, the biological sample is treated by irradiation in order to reduce nonspecific fluorescence.
  • fluorochromes can emit non-specific light, for example after energy transfer from another fluorochrome, if a plurality of different fluorochromes are used simultaneously for the analysis of a sample.
  • kits of reagents also referred to as a kit, containing a detection conjugate having a binding moiety and a reagent for inactivating the fluorochrome moiety through interaction with the linker.
  • the binding portion is in particular an antibody portion.
  • the detection conjugate has a fluorochrome moiety linked to the antibody moiety and a linker attached to the fluorochrome moiety, wherein the linker comprises or consists of an oligonucleotide.
  • the linker is connected at its first end to the fluorochrome portion.
  • the linker is connected at its second end opposite the first end to the binding moiety so that the linker binds binding moiety and fluorochrome together.
  • the linker comprises or consists of an oligonucleotide
  • the linker is also referred to as an oligonucleotide linker.
  • the detection conjugate may consist of the binding moiety, which is preferably a natural or synthetic antibody, the fluorochrome and the oligonucleotide linker.
  • oligonucleotide generally comprises single- and double-stranded DNA and / or RNA and synthetic oligonucleotide sequences, for example PNA (peptide nucleic acid), in particular with a length in the range of 6 to 200 nucleotides, preferably 20 to 100 nucleotides.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the term antibody will be used to represent the binding moiety
  • detection conjugate or antibody conjugate will also be used to represent binding moiety conjugates having, instead of the antibody moiety, a different binding moiety, for example selected from the group consisting of oligonucleic acids, receptor ligands , Receptors, lectins, oligosaccharides, coordinative complexes, antigens, eg aptamers, peptides specific for predetermined MHCI or MHCII, MHC tetramers, biotin, avidin and paratope-forming antibody fragments.
  • a binding moiety has an affinity for an analyte, which is a binding partner of the binding moiety.
  • an aptamer which is binding portion preferably consists of single-stranded DNA or RNA, for example with or from the sequence 5 '-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-S' (SEQ ID NO. 3), which is specific for the tumor marker MUCL S 1.3, or 5 '-
  • the assembly of reagents besides the first reagent containing the detection conjugate as a second reagent that renders the fluorochrome portion of the detection conjugate inactive, a quencher attached to an oligonucleotide specific to the oligonucleotide of the oligonucleotide linker is hybridizable, and in particular has a portion which has a reverse sequence complementary to the oligonucleotide linker.
  • the oligonucleotide of the quencher has a length sufficient to hybridize to the oligonucleotide linker, e.g. from 10 to 30 nt in length.
  • the portion of the oligonucleotide linker to which the oligonucleotide linked to the quencher is hybridizable is also referred to as the quencher portion.
  • the oligonucleotide linker joins the linking moiety to the fluorochrome moiety, but alternatively, the oligonucleotide linker may be bound only to the fluorochrome moiety and the fluorochrome moiety may be linked to the moiety directly or through a linking group.
  • the oligonucleotide linker to provide a nucleotide sequence as a quencher section on the detection conjugate to which a hybridizable oligonucleotide with bound quencher binds, so that the quencher is placed in the vicinity of the fluorochrome part, also occurs in this arrangement.
  • the oligonucleotide contained as part of the oligonucleotide linker in the antibody conjugate of the present invention allows for the specific inactivation of the fluorochrome because the quencher-bound oligonucleotide places the quencher on the fluorochrome portion by hybridizing with the quencher portion of the oligonucleotide linker and the quencher subsequently emits from the fluorochrome portion Absorbs radiation.
  • the antibody conjugate according to the invention is suitable for a test kit and a detection method with at least two consecutively used detection conjugates, because the fluorochrome portion can be made ineffective by being able to assign to the fluorochrome portion a quencher in close spatial proximity that is capable of Fluorochromanteil emitted radiation and extinguish radiationless.
  • at least two, preferably from 2 to 10 or up to 4 antibody conjugates can be used simultaneously instead of an antibody conjugate.
  • the establishment of the antibody conjugate to allow a quencher to be assigned to the fluorochrome portion of a conjugate is accomplished by providing the quencher with an oligonucleotide hybridizable with a quencher portion of the oligonucleotide linker, and more particularly having a base sequence that is reverse complementary to a quencher portion of the oligonucleotide linker ,
  • the oligonucleotide linked to the quencher may be an antisense oligonucleotide hybridizable with a quencher portion of the oligonucleotide linker, eg RNA, DNA or PNA, preferably an oligonucleotide that hybridizes in aqueous solution to a portion of the oligonucleotide linker adjacent to the fluorochrome portion.
  • Hybridization of a complementary oligonucleotide to a quencher portion of the oligonucleotide linker coupled to a quencher has been shown to bring this quencher into close spatial proximity to the fluorochrome portion of the conjugate such that the fluorochrome portion and quencher are within the ranger radius and the energy transfer from the fluorochrome portion takes place on the quencher, and from this the radiationless or optically undetectable dissipation of energy.
  • the oligonucleotide linker is located between the binding moiety and the fluorochrome moiety and inactivation of the fluorochrome is achieved by hydrolysis of the linker when used in analytical methods such that regardless of binding of the antibody to an antigen, the fluorochrome moiety of the conjugate is separated and thereby localized Detection, for example, the emission of radiation at the binding site of the binding portion, made ineffective.
  • unspecific hydrolases for example ribonucleases (RNases), deoxyribonucleases (DNases), in particular endo-RNases and endo-DNases, can be used and, if the oligonucleotide linker contains a nucleotide sequence specific for a restrictase, the specific restrictionase.
  • RNases ribonucleases
  • DNases deoxyribonucleases
  • endo-RNases endo-RNases and endo-DNases
  • the oligonucleotide linker erf ⁇ ndungswasher binding moiety conjugates may generally be covalently or via coupling groups bound to the binding moiety, for example via a thio, ester, amide or amine bond, or at least bifunctional compounds covalently or via a complex of two specific binding, especially complexing Coupling groups, one of which is connected to the binding portion and one with the Oligonukleotidlinker or covalently bound.
  • biotin and avidin or biotin and streptavidin may be coupling groups, one group of which is connected to one end of the oligonucleotide linker and the other to the binding portion and / or to the fluorochrome portion.
  • One of the attachment possibilities of the oligonucleotide linker to the binding moiety may be used in any embodiment for binding the fluorochrome moiety to the oligonucleotide linker, and independently in the first embodiment, for binding the quencher to its oligonucleotide.
  • the ineffectiveness according to the invention of the fluorochrome portion of an antibody-fluorochrome conjugate enables successive detection reactions of different epitopes or antigens by the specific antibody portion of the conjugate for each epitope, by disabling the fluorochrome portion of the conjugate, either according to the second embodiment by separating the fluorochrome portion or In the first embodiment, by suppressing the activity of the fluorochrome portion by means of a quencher, the site-specific binding of the binding portion is no longer detectable by detection of the fluorochrome portion.
  • another antibody conjugate can then be contacted with the same sample to detect another specific antigen, whereby the fluorochrome portion of the previously used antibody conjugate is ineffective and therefore can not produce interfering emissions, for example no nonspecific emission due to energy transfer, while the fluorochrome portion the further antibody conjugate is detectable.
  • at least two antibody conjugates having different analyte specificity of the binding moiety can be used instead of an antibody conjugate.
  • the invention therefore provides a detection conjugate and a method for its in situ preparation, eg in contact with the sample, and the use of the detection conjugate for Analysis ready.
  • the detection conjugate has a binding moiety and a fluorochrome moiety, as well as an oligonucleotide linker which preferably binds moiety and fluorochrome moiety together and may be single or double stranded in some sections.
  • the oligonucleotide linker is hydrolyzable by a nuclease in the second embodiment and in the preferred first embodiment contains a quencher section.
  • the section contained in the oligonucleotide linker in a variant of the invention with which the oligonucleotide of the hybridisable fluorochrome is hybridisable, in particular reverse-complementary, is also referred to as the fluorochrome section.
  • the oligonucleotide linker has a fluorochrome portion in its nucleotide sequence, and the fluorochrome is linked to an oligonucleotide containing a portion, eg, a reverse complementary portion, hybridizable to the fluorochrome portion.
  • the oligonucleotide linker has a quencher portion and the detection conjugate is in the composition in combination with a hybridizable quencher that, by contacting with the detection conjugate, renders the fluorochrome portion ineffective.
  • the quencher segment can be present in the fraction of the oligonucleotide linker which is connected as a second oligonucleotide linker segment to the fluorochrome, e.g. directly or without nucleic acid hybridization, or in the portion linked by nucleic acid hybridization to the binding moiety.
  • the second oligonucleotide linker portion bonded to the fluorochrome and hybridizable with the fluorochrome portion comprises the quencher portion.
  • An oligonucleotide segment linked without nucleic acid hybridization is e.g. covalent or complexed without the involvement of nucleic acids.
  • the invention preferably relates to an antibody conjugate to whose quencher section of the oligonucleotide linker the oligonucleotide of a hybridizable quencher is hybridized, and to a method for its production by hybridization of the oligonucleotide of a hybridizable quencher with the quencher section of the oligonucleotide linker, eg in the method for analysis.
  • the antibody conjugate can be prepared by contacting the sample with the constituents of the detection conjugate, which preferably has an oligonucleotide linker with a quencher section, and preferably by subsequent contacting with a hybridizable quencher.
  • the embodiments of the invention have the advantage that antibody conjugates, each having the same fluorochrome portion, can be used several times in succession for the analysis of different antigens, ie with different antibody fractions, since in each case prior to contacting the sample with another antibody conjugate, fluorochrome portions already present in the sample are rendered ineffective .
  • the oligonucleotide linker may also have the same oligonucleotide sequence in detection conjugates of the invention, since interaction with oligonucleotide linkers or hybridizable quencher oligonucleotides of antibody conjugates contacted with the sample in previous steps of the detection method will not occur to any significant extent, especially not because of the washing steps. which are preferably carried out after contacting with an antibody conjugate and / or after adding a hybridizable quencher or a nuclease as a method step.
  • the method of the present invention contemplates contacting a sample with the detection conjugate of the invention, preferably washing to remove unbound detection conjugate, irradiating energy at an excitation wavelength to excite the fluorochrome portion to emit radiation, detecting emitted radiation, and then rendering ineffective of the fluorochrome portion by contacting with a hybridizable quencher.
  • the oligonucleotide linker has a quencher section.
  • the inactivation of the fluorochrome portion takes place by hydrolysis of the oligonucleotide linker, for example by contacting with an endo-nuclease.
  • the sample is washed to remove unbound hybridizable quencher or nuclease, respectively.
  • the sample is contacted with a further detection conjugate according to the invention and its fluorochrome content is detected, likewise by irradiation of an excitation wavelength and Detection of emitted radiation. It has been found that the detection method on a sample of human cells immobilized on a slide can be carried out with at least 15 consecutive contacts with detection conjugates without significant interaction of the detection conjugates with each other.
  • Oligonucleotide linkers and quencher-linked oligonucleotides, particularly quencher sections and fluorochrome sections preferably each have different unique nucleic acid sequences, i. those which have no sequence similarity to one another for hybridization to other nucleic acids and which do not hybridize with the sample to be analyzed, in particular a nucleic acid sequence which is not hybridizable or non-complementary to nucleic acids of cells to be analyzed.
  • the binding moiety is an oligonucleotide
  • the binding moiety to the probe contains complementary sequences, while the oligonucleotide linker has non-probe complementary sequences that are not hybridizable with the probe.
  • the oligonucleotide of the quencher preferably has a sequence which is not complementary to the sample and can not be hybridized with it, but a sequence which can be hybridized only with the quencher section of the oligonucleotide linker.
  • the quencher is connected to its oligonucleotide such that when hybridized with the quencher portion of the oligonucleotide linker it occupies an array in the immediate vicinity of the fluorochrome portion.
  • the oligonucleotide of the linker which connects the binding moiety to the fluorochrome moiety is double-stranded in a portion in which an oligonucleotide linker portion connected to the fluorochrome moiety hybridizes to a portion of the oligonucleotide linker, which is connected to the binding portion.
  • the second oligonucleotide linker portion connected to the fluorochrome portion has a hybridizable with the fluorochrome portion of the oligonucleotide linker, eg a reverse complementary nucleotide sequence.
  • the conjugate By hybridizing the second oligonucleotide linker portion linked to the fluorochrome portion to the first oligonucleotide linker portion linked to the binding portion, the conjugate has an oligonucleotide linker connecting the fluorochrome portion to the binding portion.
  • oligonucleotide linker fluorochrome moiety conjugate is characterized by hybridization with the Fluorochromanteil connected second Oligonukleotidlinkerabitess a partially double-stranded oligonucleotide linker on.
  • the oligonucleotide linker is partially hybridizable with the oligonucleotide of the quencher, e.g. in a quencher portion of the first oligonucleotide linker portion to which the oligonucleotide linked to the quencher is hybridizable.
  • the double-stranded portion of the oligonucleotide linker is also hydrolyzable, so that no additional single-stranded portion in the oligonucleotide linker is required for inactivation.
  • a double-stranded portion of the oligonucleotide linker may contain a restriction sequence recognition sequence.
  • a fluorochrome also referred to as a hybridizable fluorochrome, provided with a second oligonucleotide linker portion complementary to the first oligonucleotide linker portion, specifically connects to the fluorochrome portion of the first oligonucleotide linker portion bearing the binding moiety through the specific hybridization by means of its complementary second oligonucleotide linker portion, thereby forming the conjugate that contains a binding moiety , an oligonucleotide linker having a portion of double-stranded nucleotide sequence and a fluorochrome, or consists of these elements.
  • the antibody-fluorochrome conjugate consists of at least one binding portion, at least one fluorochrome portion and at least one portion-linked double-stranded oligonucleotide linker connecting them and is therefore suitable for specifically disabling the fluorochrome portion, in particular by binding a hybridizable quencher with e.g. reverse complementary nucleotide sequence to the quencher section of the oligonucleotide linker, or by hydrolysis of the oligonucleotide linker by nuclease.
  • a hybridizable quencher with e.g. reverse complementary nucleotide sequence to the quencher section of the oligonucleotide linker, or by hydrolysis of the oligonucleotide linker by nuclease.
  • the binding conjugate can be formed when performing the method in admixture with the sample.
  • the test kit of the invention then comprises a first reagent having a first moiety having a binding moiety-first oligonucleotide linker moiety conjugate and, separated from the first moiety or in admixture with the first moiety, a second moiety comprising a fluorochrome with bound second oligonucleotide linker moiety which is hybridizable with the fluorochrome portion of the first oligonucleotide linker portion.
  • the analytical method preferably comprises the steps of contacting a sample with the binding moiety oligonucleotide linker-portion conjugate, washing the sample to remove unbound binding moiety oligonucleotide linker moiety conjugate, contacting the sample with fluorochrome moiety having an oligonucleotide moiety (also hybridizable with the oligonucleotide linker moiety) hybridizable Fluorochrome), and washing to remove the unbound hybridizable fluorochrome, and optical detection of the fluorochrome.
  • the fluorochrome portion is rendered inactive by contacting the sample with a quencher having a oligonucleotide hybridizable with the oligonucleotide linker and / or contacting with a nuclease followed by washing.
  • the fluorochrome portion and the second oligonucleotide linker portion of the hybridizable fluorochrome which is hybridizable therewith, and preferably also the quencher portion and the hybridizable portion of the oligonucleotide of the hybridizable quencher are unique, in particular the fluorochrome portion and the quencher portion are each unique and form exclusively with the portions hybridizable therewith the oligonucleotides of hybridizable fluorochrome or hybridizable quencher under the detection conditions a double-stranded section. More preferably, the fluorochrome portion and the quencher portion are each under less stringent hybridization conditions, e.g.
  • the formation of an oligonucleotide linker in the fluorochrome portion specific for the binding portion is performed by hybridization with the second oligonucleotide linker portion of the hybridizable fluorochrome.
  • the quencher portion is also part of the oligonucleotide linker, if it is part of the second Oligonukleotidlinkerabitess the hybridisable fluorochrome.
  • the quencher portion of the Oligonukleotidlinkers For in the formation of Oligonukleotidlinkers by hybridization of its fluorochrome portion with a binding portion for the specific, reverse complementary portion of the oligonucleotide of the hybridizable fluorochrome the quencher portion of the Oligonukleotidlinkers.
  • the arrangement of the quencher section on the second oligonucleotide linker section of the hybridisable fluorochrome is preferred here, since then in the inventive method when contacting a sample having a plurality of binding moieties with Oligonukleotidlinker having a specific binding portion for the unique fluorochrome portion, with successive contacting of the sample with each only one hybridizable fluorochrome, the quencher portion of the hybridizable fluorochrome may be the same, and corresponding to the hybridizable portion of the oligonucleotide of the hybridizable quencher may each have the same, to the quencher portion of the reverse complementary unique nucleotide sequence.
  • oligonucleotide linker of each embodiment of conjugates of the invention in particular antibody conjugates according to the invention, both in methods for the analysis of living cells, in particular animal cells and tissues, which may be immobilized both in suspension and on a substrate, due to the specific ineffective of the fluorochrome portion is suitable for multiple successive contacting of the sample with detection conjugates.
  • the fluorochrome is located at a first end of the quencher portion of the oligonucleotide linker and, correspondingly, the quencher is connected to the end of its oligonucleotide that is positioned adjacent to the first end of the quencher portion upon hybridization.
  • the binding portion is located at the second end of the oligonucleotide linker opposite the first end of the quencher portion, or the second end of the oligonucleotide linker is unbound when the binding portion is attached to the fluorochrome without intermediate oligonucleotide linkers.
  • the quencher is preferably attached at the 5' end of its oligonucleotide, or at its 3 'end when the first end of the oligonucleotide is attached Quencherabitess the 5 'end of the oligonucleotide linker.
  • the oligonucleotide of the quencher is reverse complementary to the quencher portion and the The quencher is located at the end opposite the end of the nucleotide sequence of the quencher section, so that in the case of an oligonucleotide of the quencher that is reverse complementary to the quencher section, the quencher can be arranged in the vicinity of the fluorochrome section.
  • the basis for the analysis method according to the invention is in each case the oligonucleotide linker which, in the second embodiment, enables inactivation of a fluorochrome by hydrolysis of the linker and, in the preferred first embodiment, by means of the specific hybridization of a quencher-bearing oligonucleotide with a quencher section, for the oligonucleotide linker.
  • the antibody conjugates according to the invention are used in methods for analyzing biological samples which are immobilized in suspension or on a support and have denatured antigens, in particular denatured and / or perforated prokaryotic and eukaryotic cells and tissues, in particular animal cells and tissue.
  • the conjugates according to the invention find use in the analysis of suspended analytes, including cell-bound antigens, for example in flow cytometry for labeling of living animal cells, optionally with sorting of labeled cells as a function of the detection of the fluorochrome.
  • the analysis method according to the invention comprises the chronological successive contacting of a biological sample immobilized on a carrier substrate, in particular of living animal cells, which are immobilized for example by binding on a coated carrier substrate, with a detection conjugate according to the invention.
  • the immobilization on the carrier substrate which is preferably a glass microscope slide, can be mediated, for example, by a coating of the carrier substrate which requires the adsorption of cells, for example a coating with polylysine.
  • the carrier substrate is preferably covered by a spaced lid, for example a cover glass arranged parallel to the carrier substrate.
  • the carrier substrate and / or the lid may serve as spacers
  • the biological sample is immobilized in the passageway, namely on the support substrate, and can be successively contacted by compositions, the detection of antibody conjugate which interacts with an antigen of the sample by detection of the radiation emitted by the fluorochrome portion, which generated in response to incident radiation with excitation wavelength.
  • unbound detection conjugate is removed following contact with the sample by exchange of the medium surrounding the sample. Removal of unbound antibody conjugate preferably occurs by passing a flushing medium through the passageway such that only detection conjugate bound to the sample remains on the immobilized sample and emits radiation therefrom, while unbound detection conjugate is removed from the sample by washing.
  • a carrier substrate may be provided with a frame which is arranged as a positive projection on the carrier substrate and, for example, has a height of 0.8 to 5 times the layer thickness of the tissue sample, preferably a height from 1 to 1.5 times the layer thickness of the tissue sample, while most preferably the lid is spaced from the tissue sample and the frame.
  • the form-fitting about a tissue sample frame on the carrier substrate allows the passage of aqueous compositions through the passageway formed between the carrier substrate and lid, so that aqueous compositions, such as washing solutions and compositions containing the detection conjugate according to the invention, to the fixed tissue sample and can be flowed away from this.
  • biological samples in particular animal cells and tissue samples may be denatured and / or perforated in a conventional manner on a carrier substrate.
  • the method according to the invention permits the superimposition of signals of different conjugates, in particular microscopic images, detected in chronological succession, which are different from those on the Sample arranged conjugates contain emitted radiation.
  • the immobilization and the fixation of the biological sample in a passage allow the sample during a successive detection steps, for example with antibody conjugates each having a different antibody content, to leave the sample in a fixed position in the receiving area of a detector, for example in the field of view of a microscope or to arrange the sample repeatedly by identical arrangement of the carrier substrate in the detection range of the detector, for example the field of view of a microscope in the identical position, for example, if the detection steps of contacting with different antibody conjugates are performed in a different position of the carrier substrate.
  • the fluorochrome portion can be deactivated or inactivated, preferably by hydrolysis of the oligonucleotide linker or by contacting the sample with a quencher which is connected to an oligonucleotide which is partially reversely complementary to the oligonucleotide linker is.
  • a hybridizable fluorochrome can be contacted with the antibody conjugate resulting in the specific hybridization of a fluorochrome to the antibody conjugate.
  • Oligonucleotides and their sections are particularly hybridizable, for the purposes of the invention when under cell physiological conditions, such as in a cell-physiological buffer medium, preferably at 20-37 0 C, specifically form a dimer.
  • an oligonucleotide reverse-conjugated to a quencher portion or fluorochrome portion of the oligonucleotide linker, which is linked to the quencher or fluorochrome denotes an oligonucleotide included in the aqueous compositions used during the detection method, for example PBS (phosphate buffered saline), HEPES buffer, Tris Buffer, preferably at pH 6.5 to 7.5 at salt concentrations in the range of 20 to 800 mM of the sum of mono- and divalent ions with the Oligonukleotidlinker forms a double-stranded nucleic acid hybrid, which is particularly sequence-specific.
  • PBS phosphate buffered saline
  • HEPES buffer
  • oligonucleotides having a sequence which is reverse-complementary to a section of the oligonucleotide linker, eg having an identity of at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95 to 99% to the reverse-complementary nucleic acid sequence.
  • the fluorochrome portion and the second oligonucleotide linker portion preferably have mutually reverse-complementary nucleic acid sequences that are in the during the detection process used aqueous compositions form a nucleic acid hybrid, in particular with a reverse complementary sequence identity of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95 to 99%.
  • the oligonucleotide linker preferably also the quencher-bound oligonucleotide and the second oligonucleotide linker portion of the fluorochrome, preferably have nucleic acid sequences that are not present in the DNA and / or RNA of the sample to be analyzed, e.g. of the animal cell to be analyzed, in particular have a sequence deviation of at least 5%, more preferably at least 10%, even more preferably at least 20%.
  • Preferred lengths of the oligonucleotide linker, the quencher-bound oligonucleotide, and the second oligonucleotide linker portion of the fluorochrome are from 10 to 150 nt (nucleotides), preferably 15 to 100 nt, more preferably 20 to 50 nt, of which at least 10, more preferably 30 nt, more preferably all are complementary to each other.
  • a suitable fluorochrome can be selected from Cy3, PE, FITC, APC, Alexa dyes and Atto dyes; a suitable quencher can be tuned to the fluorochrome, e.g. from the group comprising dabcyl, dabsyl, dark hole quenchers, black berry quenchers and QSY dyes.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the detection method of the first embodiment
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the detection method in a variant of the second embodiment
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the detection method of the first embodiment in a variant of the first embodiment
  • FIG. 6 micrographs A) of a biological sample with an antibody according to the invention and B) a microscopic image of the same sample, but after hydrolysis of the antibody conjugate used under A) and incubation with a second antibody conjugate with different antigen specificity on the fixed sample, under C DZ results of the untreated cell sample, D) DZ results of an aliquot of the sample after incubation with an antibody according to the invention, and E) DZ results of an aliquot of the sample analyzed under D) after hydrolysis of the linker.
  • FIG. 1 shows schematically the structure of a conjugate according to the invention of the first embodiment, which consists of the binding portion 1, the fluorochrome portion 5 and the oligonucleotide linker 4 connecting them as the first reagent of a test kit.
  • the fluorochrome portion 5, here Cy3 is covalent, e.g. via bifunctional compounds, attached to the first end of the oligonucleotide linker 4.
  • the binding moiety 1 is shown schematically in the form of an IgG antibody, to which by means of a covalently bound first coupling reagent 2, e.g. Streptavidin, and by means of a second coupling reagent 3 bound to the first coupling reagent 2, e.g. Biotin, the second end of the oligonucleotide linker 4 is bound.
  • first coupling reagent 2 e.g. Streptavidin
  • a second coupling reagent 3 bound to the first coupling reagent 2
  • the oligonucleotide linker 4 may have terminally a biotin-acceptor domain (BAD).
  • BAD biotin-acceptor domain
  • the bond may be covalent, for example by derivatization of the binding moiety 1 and / or the oligonucleotide linker 4, for example, to form an ester, amide or thioitati.
  • the binding of the fluorochrome 5 to the oligonucleotide linker 4 is preferably covalent.
  • the oligonucleotide linker 4 can have the nucleic acid sequence TTT TTT TTT TGT TTT TTT TT (SEQ ID NO: 1) from 5 'to 3', which can be used as quencher section 4b by contacting or hybridizing with the oligonucleotide 7, which is provided with a quencher 6 is connected, the quencher 6 in the vicinity of the Fluorochromanteils 5 arranges. As a result, the fluorochrome portion 5 is made optically inactive.
  • the oligonucleotide 7 which can be hybridized with the quencher section 4b of the oligonucleotide linker 4 is preferably reverse-complementary to the quencher section 4b, for example with the nucleic acid sequence AAA AAA AAA AAA AC AAA AAA (SEQ ID NO: 2, from 5 'to 3').
  • the quencher 6 is preferably bound to the end of the oligonucleotide 7, which is adjacent to the fluorochrome 5 in hybrid formation with the Oligonukleotidlinker 4.
  • a sample may be contacted with the first reagent consisting of binding moiety 1, fluorochrome moiety 5, and oligonucleotide linker 4 attached to fluorochrome moiety 5 at its first end.
  • the oligonucleotide linker 4 has a quencher section 4b, to which an oligonucleotide 7 which is connected to the quencher 5 is hybridizable.
  • the subsequent contacting of the sample with a further first reagent enables the detection of its fluorochrome portion without being affected by the first reagent previously contacted with the sample, the fluorochrome of which is rendered ineffective by arranging the quencher 6 in its vicinity.
  • its fluorochrome portion 5 may be obtained by hydrolysis of the oligonucleotide linker 4 and washing are effectively made ineffective, as shown schematically for the second embodiment in Figure 2.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of a conjugate according to the invention of the second embodiment which consists of the binding moiety 1, here shown in the form of a receptor ligand, and fluorochrome 5 bound thereto by means of an oligonucleotide linker 4 covalently bound to the binding moiety 1.
  • the oligonucleotide linker 4 is double-stranded in the section in which the second Oligonukleotidlinkerabites 8 bound to the fluorochrome 5 with the hybridizable first
  • Oligonukleotidlinkerabites 4a is hybridized.
  • the bonds between binding portion 1 and first oligonucleotide linker portion 4a, as well as between second oligonucleotide linker portion 8 and fluorochrome 5 are formed by association respectively to a component of covalently bonded first and second coupling reagents corresponding to Figure 1, or covalent.
  • the second embodiment also has an oligonucleotide linker 4 which can be hydrolyzed by an endonuclease in this variant of the partially double-stranded oligonucleotide linker 4, here an endonuclease is contained as the second reagent in the test kit. Accordingly, here the oligonucleotide linker 4 optionally has no quencher section 4b.
  • the sample may be contacted with a first portion of the first reagent consisting of bound oligonucleotide linker 4 having a first oligonucleotide linker portion 4a containing a fluorochrome portion and contacted simultaneously or subsequently with a second portion corresponding to the first oligonucleotide linker portion 4a hybridisierbaren or hybridized second Oligonukleotidlinkerabites 8 bound fluorochrome portion 5 contains.
  • specifically bound binding moiety 1 can be detected by detecting the fluorochrome moiety 5 bound thereto via the partially double-stranded oligonucleotide linker 4.
  • FIG. 3 shows schematically the structure of a conjugate according to the invention of the first embodiment in the variant that the oligonucleotide linker 4 is partially double-stranded.
  • the binding moiety 1 is bound to the oligonucleotide linker 4 which has a first oligonucleotide linker portion 4a with fluorochrome portion to which the second oligonucleotide linker portion 8 bound to the fluorochrome portion 5 is hybridizable.
  • the oligonucleotide linker 4 has correspondingly the first oligonucleotide linker portion 4a, to which the second oligonucleotide linker portion 8, to which the fluorochrome 5 is bound, is hybridizable in sections, for example, is reverse-complementary. Adjacent to the first oligonucleotide section 4 a, the oligonucleotide linker 4 has a quencher section 4 b, to which the oligonucleotide 7 is hybridizable, for example reverse-complementary, which is bound to the quencher 6.
  • the fluorochrome 5 is preferably bound to the end of the second oligonucleotide linker portion 8 which, when hybridized with the first oligonucleotide linker portion 4a, abuts the quencher portion 4b of the oligonucleotide linker 4 to which the oligonucleotide 7 hybridizes carries the quencher 6.
  • the quencher 6 is preferably bound to the end of the oligonucleotide 7, which in hybrid formation with the Oligonukleotidlinker 4, or its quencher section 4b, to the first Oligonukleotidlinkerabites 4a of the oligonucleotide linker 4, to which the second oligonucleotide linker portion 8 of the fluorochrome 5 is hybridizable.
  • the binding portion 1 Upon hybridization of the second oligonucleotide linker portion 8 connected to the fluorochrome 5 to the first oligonucleotide linker portion 4, the binding portion 1 is connected to the fluorochrome 5 so that fluorescence is emitted upon irradiation of light hv with excitation wavelength. This emission is measured according to the invention for the detection of the conjugate.
  • conjugates according to the invention may have one or more oligonucleotide linkers 4 which are bonded to the binding moiety 1.
  • Example 1 Preparation of an Antibody-Fluorochrome Conjugate with Oligonucleotide Linker
  • a biotinylated anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5, available from BD Bioscience) was incubated with streptavidin and the resulting streptavidin Antibody conjugate was purified.
  • the oligonucleotide linker synthetically prepared single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 was used, at the 3 'end of which biotin was coupled and at the 5' end of which the fluorophore Cy3 (available from Molecular Probes Inc.) was coupled.
  • the biotinylated oligonucleotide was incubated with the streptavidin-coupled antibody and subsequently purified by gel chromatography. Binding between streptavidin and biotin yielded a conjugate of the structure antibody-biotin-streptavidin-biotin-oligonucleotide linker fluorochrome.
  • Example 2 Detection of an antigen on the cell surface of human cells
  • human leukocytes were isolated from peripheral blood and immobilized on a glass slide with a cell-adhesive coating (polylysine, available from Karl Roth GmbH).
  • the slide had two parallel spaced apart protrusions as spacers which carried a coverslip parallel to the slide.
  • the respective openings formed at the ends of the slide were used as inlet and outlet ports, respectively, for supplying and removing solutions.
  • the cells were microscopically (Axioplan 2e microscope, Zeiss, with motor stage adjustment and focusing, mercury lamp HBO 100 for excitation, filter for PE or FITC, Plan-Neofluar 16x / 0.50 immersion objective and CCD camera Axiocam MRm for recording) under irradiation of an excitation wavelength analyzed to determine the background fluorescence.
  • the resulting microscopic image is shown in FIG. 4 a), in which cells identified by light microscopy are marked by inserted circles.
  • antibody conjugate was added according to Example 1, which contained as antibody portion anti-CD4 antibody.
  • FIG. 4 b) shows the same point as FIG. 4 a) with fluorescence detection of the light emitted by the fluorochrome Cy 3. This photograph shows that inventive Conjugates are suitable for the specific detection of cell antigens, since the CD4-positive cells are selectively labeled.
  • an oligonucleotide connected to a quencher was passed through the inlet opening to the cells, namely the oligonucleotide, which was partially complementary inverse to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, at the 3 'end of which the quencher BHQ2 (black) Hole-Quencher, available from BioSearch, Novato, USA).
  • 100 ⁇ L of PBS was added to the inlet port for washing and a little of the same volume removed at the outlet port.
  • a renewed fluorescence micrograph of the same site is shown in Figure 4c). This result makes it clear that the optical activity of the fluorochrome of the conjugate according to the invention can be selectively rendered ineffective.
  • DNase could be added to neutralize the fluorochrome portion, followed by washing with about 100-200 ⁇ L PBS to hydrolyze the oligonucleotide linker of the conjugate and remove the fluorochrome.
  • Example 3 Successive detection of soluble antigens after immobilization on a carrier substrate
  • Conjugates according to the invention were used for the analysis of cell-free analytes, for example for the detection of superficially bound IgG2a.
  • a glass slide coated with polylysine as used in Example 2 phycoerythrin-labeled rat immunoglobulin Ig2Ga kappa was allowed to bind.
  • free binding sites of the slide were saturated with bovine serum albumin (3% in PBS).
  • Figure 5a A Fluorescence micrographs are shown in Figure 5a), in which the fluorescence of individual molecules is visible. The position of the labeled IgG2a was detected and stored relative to the slide.
  • an antibody conjugate was prepared, which was prepared according to Example 1, but with an anti-IgG2a antibody. Unbound conjugate was removed by washing with PBS.
  • the subsequent fluorescence micrograph of Figure 5c) shows that the same positions as in Figure 5a) were labeled by the conjugate of the invention, so these conjugates are also suitable for the identification of cell-free analytes.
  • Example 4 Hydrolysis of an Antibody Conjugate According to the Invention on Immobilized Human Cells and on Suspended Human Cells (DZ) It could be shown that the fluorochrome portion of an antibody conjugate according to the invention obtainable according to Example 1 and its antibody portion are an anti-CD4 antibody and its fluorochrome portion Cy3 which were linked to an oligonucleotide linker (SEQ ID NO: 1) could be rendered ineffective on live, immobilized immune cells and on suspended live immune cells.
  • SEQ ID NO: 1 an oligonucleotide linker
  • Example 2 immobilized human immune cells were incubated with the antibody conjugate; the micrograph including the detected Fluorescence is shown in Figure 6A). Subsequently, the sample was treated by contacting with DNase to separate the fluorochrome portion. To remove unbound fluorochrome, the immobilized sample was washed. Alternatively, the hybridizable quencher used in Example 2 was added with the oligonucleotide reverse-complementary to the quencher portion of the oligonucleotide linker, also resulting in the inactivation of the fluorochrome.
  • the sample was incubated with an antibody conjugate with the same oligonucleotide linker but with an anti-CD19 antibody moiety and PE as the fluorochrome moiety; the microscopic image of detected emissions is shown in FIG. 5B) and makes it clear that the cells detected with the anti-CD4 antibody conjugate (each marked by manually inserted circles) did not give a fluorescence signal in the analysis with anti-CD19 antibody conjugate.
  • the DZ analyzes clearly show that the antibody conjugate according to the invention was able to effectively detect the surface marker and that the antibody conjugate bound to the cells produced a detectable signal of emitted radiation, the hydrolysis of the oligonucleotide linker with subsequent washing leading to complete inactivation of the fluorochrome portion.
  • Corresponding results were also obtained by adding the hybridizable quencher with an oligonucleotide which is reverse-complementary to the quencher section of the oligonucleotide linker.
  • Example 5 Use of the Conjugates for Iterative Cell Sorting by DZ
  • Mouse spleen cells were incubated in suspension in PBS with an anti-CD3 antibody conjugate prepared according to Example 1 for 10 min at room temperature.
  • flow cytometry FACXAria, BD Biosciences
  • T helper lymphocytes separated from the remaining cells.
  • the T helper lymphocytes are then incubated for 10 min at room temperature in PBS with the oligonucleotide quencher used in Example 2.
  • the subsequent analysis by DZ showed that the fluorochrome was rendered inactive.
  • the T helper lymphocytes could be analyzed and sorted with a second antibody conjugate that had a different antibody moiety, but the same oligonucleotide linker and fluorochrome.

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Abstract

Die Erfindung stellt eine Zusammenstellung von Reagenzien als Testkit bereit, die ein Nachweiskonjugat mit einem Bindeanteil und ein Reagenz zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils durch Wechselwirkung mit dem Linker enthält. Der Bindeanteil ist insbesondere ein Antikörperanteil. Das Nachweiskonjugat weist einen mit dem Antikörperanteil verbundenen Fluorochromanteil und einen mit dem Fluorochromanteil verbundenen Linker auf, wobei der Linker ein Oligonukleotid umfasst. Durch Hydrolyse des Linkers oder spezifische Hybridisierung eines Quenchers mit Oligonukleotid mit dem Linker kann der Fluorochromanteil unwirksam gemacht werden.

Description

NACHWEISKONJUGAT UND VERFAHREN ZU POLYCHROMAT I S CHEN ANALYSE
Die Erfindung betrifft Nachweiskonjugate mit einem Antikörperanteil, Verfahren zur Detektion von Analyten mittels eines Nachweiskonjugats und die Verwendung der Nachweiskonjugate in Verfahren zum spezifischen Nachweis von Analyten, z.B. von spezifischen Antigenen, die in Lösung, extrazellulär oder intrazellulär an suspendierten oder an einem Trägersubstrat gebundenen Zellen oder an einem Trägersubstrat gebunden sind, und insbesondere an lebenden Zellen oder an denaturierten und permeabilisierten Zellen, die in Suspension oder an ein Trägersubstrat gebunden sind, angeordnet sind. Nachweiskonjugate enthalten als Alternative zum Antikörperanteil einen für einen Analyten spezifischen Bindeanteil, z.B. einen Rezeptorligand, einen Rezeptor, ein spezifisch bindendes Molekül, z.B. ein Lektin, Biotin, Avidin, ein Oligosaccharid, jeweils als Bindeanteil des Nachweiskonjugats.
Erfindungsgemäße Nachweiskonjugate umfassen einen Bindeanteil und einen mit diesem verbundenen Fluorochromanteil, der mit einem ersten Ende eines Linkers verbunden ist. An dem dem ersten Ende gegenüberliegenden zweiten Ende des Linkers kann der Bindeanteil angeordnet sein, so dass der Linker zwischen Bindeanteil und Fluorochromanteil angeordnet ist. Die Nachweiskonjugate zeichnen sich dadurch aus, dass der am Fluorochromanteil des Konjugats angebundene Linker eingerichtet ist, die optische Aktivität des Fluorochromanteils des Konjugats durch Wechselwirkung mit einem Reagenz unwirksam zu machen. In einer ersten Ausfuhrungsform kann der Bindeanteil mit dem Fluorochromanteil verbunden sein, während der Linker mit seinem ersten Ende mit dem Fluorochromanteil verbunden ist.
Die erfϊndungsgemäße Einrichtung des Linkers dazu, bei Anwesenheit eines Reagenzes, das eine mit dem Linker spezifisch reaktive Verbindung ist, die optische Aktivität des Fluorochromanteils unwirksam zu machen, erlaubt Nachweisverfahren, bei denen gleichzeitig und/oder nacheinander zumindest zwei Nachweiskonjugate mit verschiedener Spezifität verwendet werden, jeweils mit dem Schritt des für einen Linker spezifischen Unwirksammachens der optischen Aktivität des Fluorochromanteils im Konjugat, z.B. nach Detektion eines Nachweiskonjugats, sodass z.B. bei Verwendung in Alternative zum Bleichen bei gleichen und verschiedenen Fluorochromanteilen der Konjugate keine wechselseitige Störung auftritt, beispielsweise Interferenz oder die wechselseitige Anregung von Fluorochromen unterbleibt. Auf diese Weise wird eine unspezifische Minderung des optischen Signals eines Fluorochroms oder die Erzeugung eines unspezifischen optischen Signals von einem Konjugat vermieden, das von einem vorherigen Analyseschritt zurückbleibt. Vorzugsweise haben die Linker von Konjugaten, die nacheinander oder gleichzeitig mit derselben Probe kontaktiert werden, unterschiedliche Bindespezifitäten für ein jeweils passend spezifisches Reagenz zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils.
Stand der Technik
Mahnke und Roederer (Clin. Lab. Med. 2007, 27(3) (2007)) beschreiben, wie eine Mehrzahl von Antikörperkonjugaten für den Nachweis von Antigenen auf Zellen in der Durchflusszytometrie aufeinander abgestimmt werden können, um beim gleichzeitigen Einsatz Interferenzen der Fluorochromanteile zu vermeiden, die jeweils unterschiedliche Emissionsspektren haben, um unterscheidbar zu sein. Zur Trennung überlappender Emissionsspektren, insbesondere bei unspezifischer Anregung eines Fluorochroms durch Energietransfer von einem anderen Fluorochrom, wird eine rechnergestützte Auswertung der Signale vorgeschlagen, bei der unspezifische Emissionssignale als Hintergrund abgezogen werden können.
Laffers et al. (Cytometry Part A 69 A: 127-130 (2006)) beschreiben die Analyse von Zellen per DURCHFLUSSZYTOMETRIE oder immobilisierter Zellen mit Antikörper-Fluorochrom- Konjugaten, die jeweils unterschiedliche Fluorochrome aufwiesen. Für die Auswertung wurden die Daten aus der Durchflusszytometrie (DZ) oder Mikroskopie mit Fluoreszenzdetektion computergestützt überlagert.
Tärnok (Cytometry Part A 69 A: 555-562 (2006)) erwähnt neben der Zytometrie unter Verwendung von Antikörperkonjugaten mit verschiedenen Fluorochromen die nacheinander folgende Anwendung von Antikörper-Fluorochrom-Konjugaten, das Ausbleichen von Fluorochromen mittels Bestrahlung, die Aktivierung und die Zerstörung von Fluorochromen mittels Strahlung.
Perfetto et al. (Nature 648-654 (2004)) beschreiben Durchflusszytometer für die Detektion einer Vielzahl von Fluorochromen durch jeweils sehr kurz nacheinander erfolgende spezifische Anregung und Wellenlängen-spezifische Detektion emittierten Lichts, was als gleichzeitige Messung bezeichnet wird. Es wird gezeigt, dass verschiedene Fluorochrome, die gleichzeitig in einer Probe vorliegen, bei Anregung mit einer Wellenlänge, die für das Fluorochrom spezifisch ist, dennoch unspezifische Emissionen zeigen, was auf einen Energietransfer unter den Fluorochromen zurückgeführt wird. Zur Vermeidung unspezifischer Signale wird die Abstimmung der gleichzeitig einzusetzenden Antikörper-Fluorochrom- Konjugate in einem empirischen Verfahren vorgeschlagen. Zur weiteren Verminderung unspezifischer Emissionssignale wird eine mathematische Kompensation vorgeschlagen, mit der Emissionen herausgerechnet werden, die auf den unspezifischen Energietransfer zwischen Fluorochromen zurückgehen können.
Die US 6,150,173 beschreibt einen rechnergesteuerten Pipettierautomaten, mit dem jeweils nacheinander Antikörper-Fluorochrom-Konjugate mit einer Probe inkubiert werden, nach Einstrahlung einer Anregungswellenlänge die emittierte Strahlung gemessen wird, anschließend das Fluorochrom durch Bestrahlung mit UV zerstört und ein neues Antikörper- Fluorochrom-Konjugat zu der selben Probe gegeben wird. Die WO 2007/101706 Al beschreibt, dass vor der Detektion eines spezifischen Antikörper- Fluorochrom-Konjugats die biologische Probe durch Bestrahlung behandelt wird, um unspezifische Fluoreszenz zu verringern.
An den vorgenannten Verfahren zum Nachweis mehrerer Antikörper-Fluorochrom- Konjugate ist nachteilig, dass Fluorochrome unspezifisch Licht emittieren können, beispielsweise nach Energietransfer von einem anderen Fluorochrom, wenn mehrere unterschiedliche Fluorochrome gleichzeitig zur Analyse einer Probe verwendet werden. Bei Verfahren, in denen Antikörper-Fluorochrom-Konjugate nacheinander mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, wobei jeweils ein Fluorochrom durch Bestrahlung zerstört wird, ist nachteilig, dass einerseits zum Zerstören von Fluorochromen ein hoher Energieeintrag die Probe verändern kann, andererseits die Zerstörung eines Fluorochroms nicht vollständig bzw. nicht irreversibel erfolgt, sodass häufig auch im Anschluss an eine solche zerstörende Bestrahlung unspezifische Emissionen von Fluorochromen festgestellt werden kann, was auch als Regeneration der Fluorochrome bezeichnet wird.
Weiterhin ist an Verfahren, Fluorochrome durch Bestrahlung unwirksam zu machen die verhältnismäßig lange Dauer der Bestrahlung nachteilig.
Aufgabe der Erfindung
Gegenüber dem bekannten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, Reagenzien mit einem Konjugat mit einem spezifisch einen Analyten bindenden Bindeanteil und einem Fluorochromanteil (auch als Fluorophor oder Fluoreszenzfarbstoff bezeichnet) bereitzustellen, mit dem die Nachteile des Standes der Technik vermieden werden, insbesondere ein Bindeanteil-Fluorochrom-Konjugat, insbesondere ein Antikörper-Fluorochrom-Konjugat bereitzustellen, das eingerichtet ist, dass bei gleichzeitiger und/oder sequenzieller Kontaktierung einer Probe mit zumindest zwei Bindeanteil-Fluorochromanteil-Konjugaten die Wirkung eines Fluorochroms gezielt inaktivierbar ist.
Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Analyse unter Verwendung der Reagenzien bereitzustellen, bei dem zwischen der Kontaktierung der Probe mit verschiedenen Bindeanteil-Fluorochrom- Konjugaten die optische Aktivität zumindest eines Fluorochroms unwirksam gemacht wird, insbesondere mit Konjugaten, deren Bindeanteile verschieden und deren Fluorochromanteile identisch sind. Es wird angestrebt, dass das Analyseverfahren die Bestrahlung zum Unwirksammachen von Fluorochromen durch eine gezielte Wechselwirkung eines Reagenzes mit dem Fluorochrom ersetzt.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die vorgenannten Aufgaben mit den Merkmalen der Ansprüche und stellt insbesondere eine Zusammenstellung von Reagenzien bereit, die auch als Testkit bezeichnet wird, das ein Nachweiskonjugat mit einem Bindeanteil und ein Reagenz zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils durch Wechselwirkung mit dem Linker enthält. Der Bindeanteil ist insbesondere ein Antikörperanteil. Das Nachweiskonjugat weist einen mit dem Antikörperanteil verbundenen Fluorochromanteil und einen mit dem Fluorochromanteil verbundenen Linker auf, wobei der Linker ein Oligonukleotid umfasst oder daraus besteht. Vorzugsweise ist der Linker mit seinem ersten Ende mit dem Fluorochromanteil verbunden. Optional ist der Linker mit seinem zweiten, dem ersten Ende gegenüberliegenden Ende mit dem Bindeanteil verbunden, so dass der Linker Bindeanteil und Fluorochrom miteinander verbindet. Da der Linker ein Oligonukleotid aufweist oder daraus besteht, wird der Linker auch als Oligonukleotidlinker bezeichnet. Das Nachweiskonjugat kann aus dem Bindeanteil, der vorzugsweise ein natürlicher oder synthetischer Antikörper ist, dem Fluorochrom und dem Oligonukleotidlinker bestehen. Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff Oligonukleotid generell ein- und doppelsträngige DNA und/oder RNA und synthetische Oligonukleotidsequenzen, beispielsweise PNA (Peptidnukleinsäure), insbesondere mit einer Länge im Bereich von 6 bis 200 Nukleotiden, bevorzugt 20 bis 100 Nukleotiden.
Für die nachfolgende Beschreibung wird der Begriff Antikörper stellvertretend für Bindeanteil verwendet, und der Begriff Nachweiskonjugat oder Antikörperkonjugat wird auch stellvertretend für Bindeanteil-Konjugate verwendet, die anstelle des Antikörperanteils einen anderen Bindeanteil aufweisen, der z.B. aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oligonukleinsäuren, Rezeptorliganden, Rezeptoren, Lektinen, Oligosacchariden, koordinativen Komplexen, Antigenen, z.B. Aptameren, Peptiden, die für vorbestimmte MHCI oder MHCII spezifisch sind, MHC-Tetramere, Biotin, Avidin und Paratop bildenden Antikörperfragmenten besteht. Ein Bindeanteil weist eine Affinität zu einem Analyten auf, der ein Bindungspartner des Bindeanteils ist. Als Bindeanteil hoher Affinität sind Antikörper und deren Paratop bildende Abschnitte bevorzugt, sowie Aptamere. Ein Aptamer, das Bindeanteil ist, besteht vorzugsweise aus einzelsträngiger DNA oder RNA, z.B. mit oder aus der Sequenz 5 '-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-S ' (Seq.-ID Nr. 3), die für den Tumormarker MUCl S 1.3 spezifisch ist, oder 5'-
UCGUAUGGGUGGGAUCGGGAAGGGCUACGAACA-3 ' (Seq.-ID Nr. 4), die für den Maus-CD30 (Lymphom-Marker) spezifisch ist.
In einer ersten Ausführungsform enthält die Zusammenstellung von Reagenzien neben dem ersten Reagenz, das das Nachweiskonjugat enthält, als zweites Reagenz, das den Fluorochromanteil des Nachweiskonjugats bei Kontaktieren unwirksam macht, einen Quencher, der mit einem Oligonukleotid verbunden ist, das spezifisch mit dem Oligonukleotid des Oligonukleotidlinkers hybridisierbar ist, und das insbesondere einen Abschnitt aufweist, der eine zum Oligonukleotidlinker revers komplementäre Basenfolge hat. Vorzugsweise hat das Oligonukleotid des Quenchers eine zur Hybridisierung an den Oligonukleotidlinker ausreichende Länge, z.B. von 10 bis 30 nt Länge. Der Abschnitt des Oligonukleotidlinkers, an den das mit dem Quencher verbundene Oligonukleotid hybridisierbar ist, wird auch als Quencherabschnitt bezeichnet.
Vorzugsweise verbindet der Oligonukleotidlinker den Bindeanteil mit dem Fluorochromanteil, jedoch kann der Oligonukleotidlinker alternativ nur an den Fluorochromanteil gebunden sein, und der Fluorochromanteil kann direkt oder mittels einer Bindungsgruppe mit dem Bindeanteil verbunden sein. Denn die erfindungsgemäße Wirkung des Oligonukleotidlinkers, eine Nukleotidsequenz als Quencherabschnitt am Nachweiskonjugat bereitzustellen, an den ein hybridisierbares Oligonukleotid mit gebundenem Quencher bindet, so dass der Quencher in die Nähe des Fluorochromanteils angeordnet wird, tritt auch bei dieser Anordnung auf.
In der ersten Ausführungsform ermöglicht das als Bestandteil des Oligonukleotidlinkers in dem erfindungsgemäßen Antikörperkonjugat enthaltene Oligonukleotid das spezifische Unwirksammachen des Fluorochroms, da das am Quencher gebundene Oligonukleotid den Quencher durch Hybridisieren mit dem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers am Fluorochromanteil anordnet, und der Quencher in der Folge vom Fluorochromanteil emittierte Strahlung aufnimmt. In der ersten Ausführungsform ist das erfϊndungsgemäße Antikörperkonjugat für ein Testkit und ein Nachweisverfahren mit zumindest zwei nacheinander eingesetzten Nachweiskonjugaten geeignet, weil der Fluorochromanteil dadurch unwirksam gemacht werden kann, dass dem Fluorochromanteil ein Quencher in unmittelbarer räumlicher Nähe zuordnbar ist, der in der Lage ist, vom Fluorochromanteil emittierte Strahlung aufzunehmen und strahlungslos auszulöschen. In jeder Ausfuhrungsform und Variante der Erfindung können optional anstelle eines Antikörperkonjugats zumindest zwei, vorzugsweise 2 bis 10 oder bis 4 Antikörperkonjugate gleichzeitig eingesetzt werden. Die Einrichtung des Antikörperkonjugats dazu, dass ein Quencher dem Fluorochromanteil eines Konjugats zuordnbar ist, ist dadurch realisiert, dass der Quencher mit einem Oligonukleotid versehen ist, das mit einem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisierbar ist, und insbesondere eine zu einem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementäre Basenfolge aufweist. Beispielsweise kann das mit dem Quencher verbundene Oligonukleotid ein mit einem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisierbares antisense-Oligonukleotid sein, z.B. RNA, DNA oder PNA, vorzugsweise ein Oligonukleotid, das in wässriger Lösung mit einem Abschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisiert, der dem Fluorochromanteil benachbart ist. Es hat sich gezeigt, dass die Hybridisierung eines zu einem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementären Oligonukleotids, das mit einem Quencher verbunden ist, diesen Quencher in enge räumliche Nähe zum Fluorochromanteil des Konjugats bringt, sodass Fluorochromanteil und Quencher innerhalb des Försterradius liegen und der Energietransfer vom Fluorochromanteil auf den Quencher erfolgt, und von diesem die strahlungslose oder optisch nicht detektierbare Dissipation der Energie.
In einer zweiten Ausfuhrungsform ist der Oligonukleotidlinker zwischen Bindeanteil und Fluorochromanteil angeordnet und das Unwirksammachen des Fluorochroms wird bei der Verwendung in Analyseverfahren durch Hydrolyse des Linkers erreicht, sodass unabhängig von der Bindung des Antikörpers an ein Antigen der Fluorochromanteil des Konjugats abgetrennt wird und dadurch für die ortsspezifische Detektion, z.B. die Emission von Strahlung am Bindungsort des Bindeanteils, unwirksam gemacht ist. Zur Hydrolyse des erfindungsgemäßen Oligonukleotidlinkers können unspezifische Hydrolasen, beispielsweise Ribonukleasen (RNasen), Desoxyribonukleasen (DNasen), insbesondere Endo-RNasen und Endo-DNasen eingesetzt werden, sowie dann, wenn der Oligonukleotidlinker eine für eine Restriktase spezifische Nukleotidsequenz enthält, die spezifische Restriktase. Der Oligonukleotidlinker erfϊndungsgemäßer Bindeanteil-Konjugate kann generell kovalent oder über Kopplungsgruppen an den Bindeanteil gebunden sein, z.B. über eine Thio-, Ester-, Amid- oder Aminbindung, bzw. über zumindest bifunktionale Verbindungen kovalent oder über einen Komplex zweier spezifisch aneinander bindender, insbesondere komplexbildender Kopplungsgruppen, von denen jeweils eine mit dem Bindeanteil und eine mit dem Oligonukleotidlinker verbunden oder kovalent gebunden ist. So können Biotin und Avidin bzw. Biotin und Streptavidin Kopplungsgruppen sein, von denen jeweils eine Gruppe mit einem Ende des Oligonukleotidlinkers und die andere mit dem Bindeanteil und/oder mit dem Fluorochromanteil verbunden ist.
Eine der Bindungsmöglichkeiten des Oligonukleotidlinkers an den Bindeanteil kann in jeder Ausführungsform zur Bindung des Fluorochromanteils an den Oligonukleotidlinker verwendet sein, und unabhängig davon, in der ersten Ausführungsform zur Bindung des Quenchers an sein Oligonukleotid.
Das erfindungsgemäße Unwirksammachen des Fluorochromanteils eines Antikörper- Fluorochrom-Konjugats ermöglicht jeweils aufeinander folgende Nachweisreaktionen verschiedener Epitope oder Antigene durch den für das jeweilige Epitop spezifischen Antikörperanteil des Konjugats, wobei durch Unwirksammachen des Fluorochromanteils des Konjugats, entweder gemäß der zweiten Ausführungsform durch Abtrennen des Fluorochromanteils oder gemäß der ersten Ausführungsform durch Unterdrücken bzw. Auslöschen der Aktivität des Fluorochromanteils mittels eines Quenchers, die ortsspezifische Bindung des Bindeanteils nicht mehr durch Nachweis des Fluorochromanteils detektierbar ist. Daher kann im Nachweisverfahren anschließend ein weiteres Antikörperkonjugat mit der selben Probe kontaktiert werden, um ein weiteres spezifisches Antigen nachzuweisen, wobei der Fluorochromanteil des zuvor eingesetzten Antikörperkonjugats unwirksam ist und daher keine störenden Emissionen erzeugen kann, beispielsweise keine unspezifische Emission aufgrund von Energietransfer, während der Fluorochromanteil des weiteren Antikörperkonjugats nachweisbar ist. Auch in dieser Ausführungsform können anstelle eines Antikörperkonjugats zumindest zwei Antikörperkonjugate mit verschiedener Analytenspezifität des Bindeanteils eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt daher ein Nachweiskonjugat und ein Verfahren zu dessen in-situ Herstellung, z.B. in Kontakt mit der Probe, und die Verwendung des Nachweiskonjugats zur Analyse bereit. Das Nachweiskonjugat weist einen Bindeanteil und einen Fluorochromanteil auf, sowie einen Oligonukleotidlinker, der vorzugsweise Bindeanteil und Fluorochromanteil miteinander verbindet und abschnittsweise einzel- oder doppelsträngig sein kann. Der Oligonukleotidlinker ist in der zweiten Ausführungsform durch eine Nuklease hydrolysierbar und enthält in der bevorzugten ersten Ausfuhrungsform einen Quencherabschnitt. Der in einer Variante der Erfindung im Oligonukleotidlinker enthaltene Abschnitt, mit dem das Oligonukleotid des hybridisierbaren Fluorochroms hybridisierbar ist, insbesondere revers komplementär ist, wird auch als Fluorochromabschnitt bezeichnet. In der doppelsträngigen Ausführung weist der Oligonukleotidlinker in seiner Nukleotidsequenz einen Fluorochromabschnitt auf, und das Fluorochrom ist mit einem Oligonukleotid verbunden, das einen zum Fluorochromabschnitt hybridisierbaren, z.B. revers komplementären Abschnitt enthält. In der bevorzugten Ausführung weist der Oligonukleotidlinker einen Quencherabschnitt auf und das Nachweiskonjugat liegt in der Zusammenstellung in Kombination mit einem hybridisierbaren Quencher vor, der durch Kontaktieren mit dem Nachweiskonjugat dessen Fluorochromanteil unwirksam macht.
Der Quencherabschnitt kann bei einem Oligonukleotidlinker, der durch Hybridisierung des hybridisierbaren Fluorochroms mit dem Fluorochromabschnitt abschnittsweise doppelsträngig ist, in dem Anteil des Oligonukleotidlinkers enthalten sein, der als zweiter Oligonukleotid- linkerabschnitt mit dem Fluorochrom verbunden ist, z.B. direkt bzw. ohne Nukleinsäurehybridisierung, oder in dem Abschnitt, der mittels Nukleinsäurehybridisierung mit dem Bindeanteil verbunden ist. So enthält z.B. der am Fluorochrom gebundene zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt, der mit dem Fluorochromabschnitt hybridisierbar ist, den Quencherabschnitt. Ein Oligonukleotidabschnitt, der ohne Nukleinsäurehybridisierung verbunden ist, ist z.B. kovalent oder durch Komplexbildung ohne Beteiligung von Nukleinsäuren verbunden.
Bevorzugt betrifft die Erfindung ein Antikörperkonjugat, an dessen Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers das Oligonukleotid eines hybridisierbaren Quenchers hybridisiert ist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Hybridisierung des Oligonukleotids eines hybridisierbaren Quenchers mit dem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers, z.B. im Verfahren zur Analyse. Im erfindungsgemäßen Verfahren kann das Antikörperkonjugat durch Kontaktieren der Probe mit den Bestandteilen des Nachweiskonjugats hergestellt werden, das bevorzugt einen Oligonukleotidlinker mit einem Quencherabschnitt aufweist, und vorzugsweise durch anschließendes Kontaktieren mit einem hybridisierbaren Quencher. Das Kontaktieren des Antikörperkonjugats mit dem hybridisierbaren Quencher fuhrt zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils und erlaubt die anschließende Analyse mit einem weiteren Nachweiskonjugat, das den gleichen oder einen anderen Fluorochromanteil aufweist, ohne dass Wechselwirkungen mit einem der vorhergehend oder gleichzeitig verwendeten Nachweiskonjugate auftreten, insbesondere bei Nachweiskonjugaten, deren Quencher- abschnitte jeweils einzigartig bzw. die einem Bindeanteil spezifisch zugeordnet sind. Die Ausfuhrungsformen der Erfindung haben den Vorteil, dass mehrfach hintereinander Antikörperkonjugate mit jeweils dem selben Fluorochromanteil zur Analyse unterschiedlicher Antigene, d.h. mit unterschiedlichen Antikörperanteilen eingesetzt werden können, da jeweils vor dem Kontaktieren der Probe mit einem weiteren Antikörperkonjugat bereits in der Probe vorhandene Fluorochromanteile unwirksam gemacht sind. Auch der Oligonukleotidlinker kann bei Nachweiskonjugaten der Erfindung jeweils dieselbe Oligonukleotidsequenz aufweisen, denn eine Wechselwirkung mit Oligonukleotidlinkern oder Oligonukleotiden hybridisierbarer Quencher von Antikörperkonjugaten, die in vorherigen Schritten des Nachweisverfahrens mit der Probe kontaktiert wurden, tritt nicht im signifikanten Ausmaß auf, insbesondere nicht wegen der Waschschritte, die nach Kontaktieren mit einem Antikörperkonjugat und/oder nach Zugabe eines hybridisierbaren Quenchers bzw. einer Nuklease als Verfahrensschritt vorzugsweise durchgeführt werden.
Entsprechend sieht das erfindungsgemäße Verfahren in der ersten Ausführungsform vor, eine Probe mit dem erfindungsgemäßen Nachweiskonjugat zu kontaktieren, vorzugsweise Waschen zur Entfernung ungebundenen Nachweiskonjugats, Einstrahlen von Energie bei einer Anregungswellenlänge, um den Fluorochromanteil zur Emission von Strahlung anzuregen, Detektieren emittierter Strahlung, und anschließendes Unwirksammachen des Fluorochromanteils mittels Kontaktieren mit einem hybridisierbaren Quencher. Entsprechend weist in der ersten Ausfuhrungsform der Oligonukleotidlinker einen Quencherabschnitt auf.
In der zweiten Ausfuhrungsform erfolgt das Unwirksammachen des Fluorochromanteils durch Hydro lysieren des Oligonukleotidlinkers, beispielsweise durch Kontaktieren mit einer Endo-Nuklease. Nach Unwirksammachen des Fluorochromanteils wird die Probe gewaschen, um ungebundenen hybridisierbaren Quencher bzw. Nuklease zu entfernen. Anschließend wird die Probe mit einem weiteren erfindungsgemäßen Nachweiskonjugat kontaktiert und dessen Fluorochromanteil detektiert, ebenfalls durch Einstrahlen einer Anregungswellenlänge und Detektion emittierter Strahlung. Es hat sich gezeigt, dass das Nachweisverfahren an einer Probe menschlicher Zellen, die auf einem Objektträger immobilisiert waren, mit mindestens 15 aufeinander folgenden Kontaktierungen mit Nachweiskonjugaten ohne nennenswerte Wechselwirkung der Nachweiskonjugate untereinander durchführbar ist.
Oligonukleotidlinker und an Quenchern gebundene Oligonukleotide, insbesondere Quencherabschnitte und Fluorochromabschnitte, haben vorzugsweise jeweils unterschiedliche einzigartige Nukleinsäuresequenzen, d.h. solche, die zueinander keine Sequenzähnlichkeit zur Hybridisierung gegenüber anderen Nukleinsäuren aufweisen und die nicht mit der zu analysierenden Probe hybridisieren, insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, die zu Nukleinsäuren zu analysierender Zellen nicht hybridisierbar bzw. nicht komplementär ist. In Ausführungsformen, in denen der Bindeanteil ein Oligonukleotid ist, enthält der Bindeanteil zur Probe komplementäre Sequenzen, während der Oligonukleotidlinker eine nicht zur Probe komplementäre und nicht mit dieser hybridisierbare Sequenzen aufweist. Das Oligonukleotid des Quenchers hat vorzugsweise eine nicht zur Probe komplementäre und nicht mit dieser hybridisierbare Sequenz, sondern eine nur mit dem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisierbare Sequenz. Der Quencher ist so mit seinem Oligonukleotid verbunden, dass er bei Hybridisierung mit dem Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers eine Anordnung in unmittelbarer Nähe des Fluorochromanteils einnimmt.
In einer Variante der Erfindung, die in der ersten und zweiten Ausführungsform möglich ist, ist das Oligonukleotid des Linkers, der den Bindeanteil mit dem Fluorochromanteil verbindet, in einem Abschnitt zweisträngig, in welchem ein mit dem Fluorochromanteil verbundener Oligonukleotidlinkerabschnitt mit einem Abschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisiert, der mit dem Bindeanteil verbunden ist. Der mit dem Fluorochromanteil verbundene zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt hat eine mit dem Fluorochromabschnitt des Oligonukleotidlinkers hybridisierbare, z.B. eine revers komplementäre Nukleotidsequenz. Durch Hybridisierung des mit dem Fluorochromanteil verbundenen zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts mit dem ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt, der mit dem Bindeanteil verbunden ist, weist das Konjugat einen den Fluorochromanteil mit dem Bindeanteil verbindenden Oligonukleotidlinker auf. Ein solches Bindeanteil- Oligonukleotidlinker-Fluorochromanteil-Konjugat weist durch Hybridisierung des mit dem Fluorochromanteil verbundenen zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts einen abschnittweise doppelsträngigen Oligonukleotidlinker auf.
Entsprechend der ersten Ausführungsform ist der Oligonukleotidlinker abschnittweise mit dem Oligonukleotid des Quenchers hybridisierbar, z.B. in einem Quencherabschnitt des ersten Oligonukleotidlinkerabschnitts, an den das mit dem Quencher verbundene Oligonukleotid hybridisierbar ist. Entsprechend der zweiten Ausführungsform ist auch der doppelsträngige Abschnitt des Oligonukleotidlinkers hydrolysierbar, so dass kein zusätzlicher einzelsträngiger Abschnitt im Oligonukleotidlinker für das Unwirksammachen erforderlich ist. Für die zweite Ausführungsform kann in dem doppelsträngigen Abschnitt des Oligonukleotidlinkers eine Erkennungssequenz einer Restriktase enthalten sein. Ein mit einem zum ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt komplementären zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt versehenes Fluorochrom, auch als hybridisierbares Fluorochrom bezeichnet, verbindet sich spezifisch durch die spezifische Hybridisierung mittels seines komplementären zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts mit dem Fluorochromabschnitt des ersten Oligonukleotidlinkerabschnitts, der den Bindeanteil trägt und bildet dadurch das Konjugat, das einen Bindeanteil, einen Oligonukleotidlinker mit einem Abschnitt aus doppelsträngiger Nukleotidsequenz und ein Fluorochrom aufweist oder aus diesen Elementen besteht. Entsprechend besteht das Antikörper- Fluorochrom-Konjugat in dieser Variante aus zumindest einem Bindeanteil, zumindest einem Fluorochromanteil und zumindest einem diese verbindenden, abschnittsweise doppelsträngigen Oligonukleotidlinker und ist daher zum spezifischen Unwirksammachen des Fluorochromanteils geeignet, insbesondere durch Bindung eines hybridisierbaren Quenchers mit z.B. revers komplementärer Nukleotidsequenz an den Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers, oder durch Hydrolyse des Oligonukleotidlinkers mittels Nuklease.
Auch in der Variante der Bindekonjugate mit einem Oligonukleotidlinker, der durch Hybridisierung eines am Fluorochromanteil gebundenen zweiten
Oligonukleotidlinkerabschnitts mit dem Fluorochromabschnitt abschnittsweise doppelsträngig ist, kann das Bindekonjugat bei Durchführung des Verfahrens in Mischung mit der Probe gebildet werden. Entsprechend umfasst das Testkit der Erfindung dann ein erstes Reagenz mit einem ersten Anteil, der ein Bindeanteil-ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt-Konjugat aufweist und, getrennt von dem ersten Anteil oder in Mischung mit dem ersten Anteil, einen zweiten Anteil, der ein Fluorochrom mit gebundenem zweitem Oligonukleotidlinkerabschnitt aufweist, der mit dem Fluorochromabschnitt des ersten Oligonukleotidlinkerabschnitts hybridisierbar ist.
In dieser Variante umfasst das Analyseverfahren vorzugsweise die Schritte des Kontaktierens einer Probe mit dem Bindeanteil-Oligonukleotidlinkerabschnitt-Konjugat, Waschen der Probe zum Entfernen ungebundenen Bindeanteil-Oligonukleotidlinkerabschnitt-Konjugats, Kontaktieren der Probe mit Fluorochromanteil, das einen mit dem Oligonukleotidlinkerabschnitt hybridisierbaren Oligonukleotidabschnitt (auch als hybridisierbares Fluorochrom bezeichnet) aufweist, und Waschen zum Entfernen des ungebundenen hybridisierbaren Fluorochroms, und die optische Detektion des Fluorochroms. Anschließend wird der Fluorochromanteil durch Kontaktieren der Probe mit einem, ein mit dem Oligonukleotidlinker hybridisierbares Oligonukleotid aufweisenden Quencher und/oder Kontaktieren mit einer Nuklease mit anschließendem Waschen unwirksam gemacht.
Der Fluorochromabschnitt und der damit hybridisierbare zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt des hybridisierbaren Fluorochroms sowie vorzugsweise auch der Quencherabschnitt und der damit hybridisierbare Abschnitt des Oligonukleotids des hybridisierbaren Quenchers sind einzigartig, insbesondere der Fluorochromabschnitt und der Quencherabschnitt, sind vorzugsweise jeweils einzigartig und bilden ausschließlich jeweils mit den mit ihnen hybridisierbaren Abschnitten der Oligonukleotide von hybridisierbarem Fluorochrom bzw. hybridisierbaren Quencher unter den Detektionsbedingungen einen doppelsträngigen Abschnitt. Besonders bevorzugt sind der Fluorochromabschnitt und der Quencherabschnitt jeweils unter wenig stringenten Hybridisierungsbedingungen, z.B. unter physiologischen Bedingungen, einzigartig und hybridisieren nicht miteinander, insbesondere sind sie ausschließlich mit dem zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt des hybridisierbaren Fluorochroms bzw. dem Oligonukleotid des hybridisierbaren Quenchers hybridisierbar, und sind besonders bevorzugt nicht mit einer Nukleotidsequenz der zu analysierenden Probe hybridisierbar. Auf diese Weise erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren die Ausbildung eines Oligonukleotidlinkers in dem für den Bindeanteil spezifischen Fluorochromabschnitt durch Hybridisierung mit dem zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt des hybridisierbaren Fluorochroms.
In dieser Ausführungsform ist der Quencherabschnitt auch dann Bestandteil des Oligonukleotidlinkers, wenn er Bestandteil des zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts des hybridisierbaren Fluorochroms ist. Denn bei Ausbildung des Oligonukleotidlinkers durch Hybridisierung seines Fluorochromabschnitts mit einem für den Bindeanteil spezifischen, revers komplementären Abschnitt des Oligonukleotids des hybridisierbaren Fluorochroms ist der Quencherabschnitt Bestandteil des Oligonukleotidlinkers. Die Anordnung des Quencherabschnitts auf dem zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt des hybridisierbaren Fluorochroms ist hier bevorzugt, da dann im erfindungsgemäßen Verfahren bei Kontaktierung einer Probe mit einer Mehrzahl von Bindeanteilen mit Oligonukleotidlinker, der einen für den Bindeanteil spezifischen einzigartigen Fluorochromabschnitt aufweist, mit nacheinander folgender Kontaktierung der Probe mit jeweils nur einem hybridisierbaren Fluorochrom, der Quencherabschnitt des hybridisierbaren Fluorochroms jeweils gleich sein kann, und entsprechend der hybridisierbare Abschnitt des Oligonukleotids des hybridisierbaren Quenchers jeweils dieselbe, zum Quencherabschnitt revers komplementäre einzigartige Nukleotidsequenz aufweisen kann.
Es hat sich gezeigt, dass der Oligonukleotidlinker jeder Ausführungsform erfindungsgemäßer Konjugate, insbesondere erfindungsgemäßer Antikörperkonjugate, sowohl bei Verfahren zur Analyse von lebenden Zellen, insbesondere tierischen Zellen und Geweben, die sowohl in Suspension als auch auf einem Substrat immobilisiert sein können, auf Grund des spezifischen Unwirksammachens des Fluorochromanteils zur mehrfach aufeinanderfolgenden Kontaktierung der Probe mit Nachweiskonjugaten geeignet ist.
Generell ist das Fluorochrom an einem ersten Ende des Quencherabschnitts des Oligonukleotidlinkers angeordnet, und entsprechend ist der Quencher mit dem Ende seines Oligonukleotids verbunden, das bei der Hybridisierung angrenzend an das erste Ende des Quencherabschnitts positioniert ist. An dem dem ersten Ende des Quencherabschnitts gegenüberliegenden zweiten Ende des Oligonukleotidlinkers ist der Bindeanteil angeordnet, oder das zweite Ende des Oligonukleotidlinkers ist ungebunden, wenn der Bindeanteil ohne zwischenliegenden Oligonukleotidlinker mit dem Fluorochrom verbunden ist.
Wenn z.B. das erste Ende des Oligonukleotidlinkers das 3 '-Ende des Quencherabschnitts ist, an dem der Fluorochromanteil angeordnet ist, ist der Quencher vorzugsweise am 5 '-Ende seines Oligonukleotids angebunden, bzw. an dessen 3 '-Ende, wenn das erste Ende des Quencherabschnitts das 5 '-Ende des Oligonukleotidlinkers ist. Vorzugsweise ist das Oligonukleotid des Quenchers zum Quencherabschnitt revers komplementär und der Quencher ist an dem Ende angeordnet, das dem Ende der Nukleotidsequenz des Quencherabschnitts gegenüberliegt, so dass bei einem Oligonukleotid des Quenchers, das revers komplementär zum Quencherabschnitt ist, der Quencher in die Nähe des Fluorochromanteils anordnbar ist.
Grundlage für das erfϊndungsgemäße Analyseverfahren ist jeweils der Oligonukleotidlinker, der in der zweiten Ausführungsform durch Hydrolyse des Linkers und in der bevorzugten ersten Ausführungsform mittels der spezifischen Hybridisierung eines einen Quencher tragenden Oligonukleotids mit einem Quencherabschnitt die für den Oligonukleotidlinker spezifische Inaktivierung eines Fluorochroms ermöglicht.
Insbesondere finden die erfindungsgemäßen Antikörperkonjugate bei Verfahren zur Analyse biologischer Proben Verwendung, die in Suspension oder auf einem Träger immobilisiert sind und denaturierte Antigene aufweisen, insbesondere denaturierte und/oder perforierte prokaryotische und eukaryotische Zellen und Gewebe, insbesondere tierische Zellen und Gewebe.
So finden die erfindungsgemäßen Konjugate Verwendung bei der Analyse suspendierter Analyten, einschließlich zellgebundener Antigene, beispielsweise in der Durchflusszytometrie zur Markierung lebender tierischer Zellen, optional mit Sortierung markierter Zellen in Abhängigkeit von der Detektion des Fluorochroms.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Analyseverfahren die zeitlich aufeinander folgende Kontaktierung einer auf einem Trägersubstrat immobilisierten biologischen Probe, insbesondere lebender tierischer Zellen, die beispielsweise durch Bindung auf einem beschichteten Trägersubstrat immobilisiert sind, mit einem erfindungsgemäßen Nachweiskonjugat. Die Immobilisierung auf dem Trägersubstrat, der vorzugsweise ein mikroskopischer Objektträger aus Glas ist, kann beispielsweise durch eine Beschichtung des Trägersubstrats vermittelt sein, die die Adsorption von Zellen fordert, z.B. eine Beschichtung mit Polylysin. Für die aufeinander folgenden Schritte der Kontaktierung der biologischen Probe mit verschiedenen wässrigen Zusammensetzungen wird das Trägersubstrat vorzugsweise von einem beabstandeten Deckel überdeckt, z.B. einem parallel zum Trägersubstrat angeordneten Deckglas. Für die Beabstandung des Deckels vom Trägersubstrat kann das Trägersubstrat und/oder der Deckel als Abstandshalter dienende Vorsprünge aufweisen, beispielsweise zwei beabstandete, etwa parallel zueinander angeordnete Vorsprünge, die zwischen sich, dem Trägersubstrat und dem Deckel einen Durchtrittskanal bilden. Die biologische Probe ist in dem Durchtrittskanal, nämlich auf dem Trägersubstrat immobilisiert bzw. fixiert und kann nacheinander von Zusammensetzungen kontaktiert werden, wobei der Nachweis von Antikörperkonjugat, das mit einem Antigen der Probe in Wechselwirkung tritt, durch Detektion der vom Fluorochromanteil emittierten Strahlung erfolgt, die in Reaktion auf eingestrahlte Strahlung mit Anregungswellenlänge entsteht. Vorzugsweise wird ungebundenes Nachweiskonjugat im Anschluss an die Kontaktierung mit der Probe durch Austausch des Mediums entfernt, das die Probe umgibt. Das Entfernen ungebundenen Antikörperkonjugats erfolgt vorzugsweise durch Durchtretenlassen eines Spülmediums durch den Durchtrittskanal, sodass nur an der Probe gebundenes Nachweiskonjugat an der immobilisierten Probe verbleibt und dort Strahlung emittiert, während ungebundenes Nachweiskonjugat durch das Waschen von der Probe entfernt ist.
Zur Immobilisierung von biologischen Proben, beispielsweise von Gewebsschnitten, kann ein Trägersubstrat mit einem Rahmen versehen sein, der als formschlüssiger Vorsprung auf dem Trägersubstrat angeordnet ist und beispielsweise eine Höhe von 0,8- bis 5-mal der Schichtdicke der Gewebsprobe hat, vorzugsweise eine Höhe von 1- bis 1,5-mal der Schichtdicke der Gewebsprobe, während besonders bevorzugt der Deckel in einem Abstand zur Gewebsprobe und dem Rahmen angeordnet ist. Auf diese Weise ermöglicht der formschlüssig um eine Gewebsprobe angeordnete Rahmen auf dem Trägersubstrat den Durchtritt wässriger Zusammensetzungen durch den Durchtrittskanal, der zwischen Trägersubstrat und Deckel gebildet ist, sodass wässrige Zusammensetzungen, beispielsweise Waschlösungen und Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Nachweiskonjugat enthalten, zu der fixierten Gewebsprobe und von dieser weg strömen gelassen werden können.
Weiterhin können biologische Proben, insbesondere tierische Zellen und Gewebsproben in herkömmlicher Weise auf einem Trägersubstrat denaturiert und/oder perforiert fixiert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse erlaubt durch die Immobilisierung bzw. Fixierung der biologischen Probe die Überlagerung zeitlich nacheinander detektierter Signale verschiedener Konjugate, insbesondere mikroskopischer Abbildungen, die von den an der Probe angeordneten Konjugaten emittierte Strahlung enthalten. Besonders vorteilhaft erlauben es die Immobilisierung und die Fixierung der biologischen Probe in einem Durchtrittskanal, dass die Probe während aufeinander folgender Detektionsschritte, beispielsweise mit Antikörperkonjugaten mit jeweils unterschiedlichem Antikörperanteil, die Probe in einer festgelegten Position im Aufnahmebereich eines Detektors, beispielsweise im Gesichtsfeld eines Mikroskops zu belassen, oder die Probe durch identische Anordnung des Trägersubstrats im Erfassungsbereich des Detektors, beispielsweise dem Gesichtsfeld eines Mikroskops jeweils in der identischen Position wiederholt anzuordnen, z.B. wenn die Nachweisschritte der Kontaktierung mit unterschiedlichen Antikörperkonjugaten in einer anderen Position des Trägersubstrats durchgeführt werden.
Nachdem an die Probe gebundenes Antikörperkonjugat, bzw. dessen Fluorochromanteil optisch detektiert wurde, kann der Fluorochromanteil unwirksam gemacht bzw. inaktiviert werden, erfindungsgemäß bevorzugt durch Hydrolyse des Oligonukleotidlinkers oder durch Kontaktierung der Probe mit einem Quencher, der mit einem zum Oligonukleotidlinker abschnittsweise revers komplementären Oligonukleotid verbunden ist. Zusätzlich oder alternativ zu dem am Oligonukleotidlinker gebundenen Fluorochromanteil kann ein hybridisierbares Fluorochrom mit dem Antikörperkonjugat kontaktiert werden, was zur spezifischen Hybridisierung eines Fluorochroms an das Antikörperkonjugat führt.
Für die Zwecke der Erfindung sind Oligonukleotide und deren Abschnitte insbesondere dann hybridisierbar, wenn sie unter zellphysiologischen Bedingungen, z.B. in einem zellphysiologischen Puffermedium, vorzugsweise bei 20-370C , spezifisch ein Dimer ausbilden. Insbesondere bezeichnet ein zu einem Quencherabschnitt bzw. Fluorochromabschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementäres Oligonukleotid, das mit dem Quencher bzw. Fluorochrom verbunden ist, ein Oligonukleotid, das in den während des Nachweisverfahrens verwendeten wässrigen Zusammensetzungen, beispielsweise PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), HEPES-Puffer, Tris-Puffer, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,5 bei Salzkonzentrationen im Bereich von 20 bis 800 mM der Summe ein- und zweiwertiger Ionen mit dem Oligonukleotidlinker ein doppelsträngiges Nukleinsäurehybrid ausbildet, das insbesondere sequenzspezifisch ist. Dies sind insbesondere Oligonukleotide mit einer zu einem Abschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementären Sequenz, z.B. mit einer Identität von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95 bis 99% zur revers komplementären Nukleinsäuresequenz. In Varianten, in der der Oligonukleotidlinker in einem Abschnitt doppelsträngig ist, in dem ein Oligonukleotidlinkerabschnitt und ein mit dem Fluorochromanteil verbundener Oligonukleotidabschnitt hybridisierbar bzw. hybridisiert sind, weisen der Fluorochromabschnitt und der zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt vorzugsweise zueinander revers komplementäre Nukleinsäuresequenzen auf, die in den während des Nachweisverfahrens verwendeten wässrigen Zusammensetzungen ein Nukleinsäurehybrid ausbilden, insbesondere mit einer revers komplementären Sequenzidentität von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95 bis 99%.
Der Oligonukleotidlinker, vorzugsweise auch das am Quencher gebundene Oligonukleotid und der zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt des Fluorochroms weisen vorzugsweise Nukleinsäuresequenzen auf, die nicht in der DNA und/oder RNA der zu analysierenden Probe, z.B. der zu analysierenden tierischen Zelle vorkommen, insbesondere eine Sequenzabweichung von mindestens 5%, bevorzugter mindestens 10%, noch bevorzugter mindestens 20% haben. Bevorzugte Längen des Oligonukleotidlinkers, des am Quencher gebundenen Oligonukleotids und des zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts des Fluorochroms betragen 10 bis 150 nt (Nukleotide), vorzugsweise 15 bis 100 nt, bevorzugter 20 bis 50 nt, von denen mindestens 10, bevorzugter 30 nt, noch bevorzugter alle komplementär zueinander sind.
Ein geeignetes Fluorochrom kann ausgewählt werden aus Cy3, PE, FITC, APC, Alexa- Farbstoffen und Atto -Farbstoffen; ein geeigneter Quencher kann auf das Fluorochrom abgestimmt werden, z.B. aus der Gruppe, die Dabcyl, Dabsyl, Dark-Hole-Quencher, Black- Berry-Quencher und QSY-Farbstoffe umfasst.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen
- Figur 1 eine schematische Darstellung des Detektionsverfahrens der ersten Ausführungsform zeigt, - Figur 2 eine schematische Darstellung des Detektionsverfahrens in einer Variante der zweiten Ausführungsform zeigt,
- Figur 3 eine schematische Darstellung des Detektionsverfahrens der ersten Ausfuhrungsform in einer Variante der ersten Ausführungsform zeigt,
- Figur 4 a) bis d) immobilisierte menschliche Leukozyten nach Inkubation mit erfindungsgemäßem Antikörper im mikroskopischen Bild unter Anregung der Fluoreszenz in den Schritten des Detektionsverfahrens, und
- Figur 5 a) bis d) aus einer Lösung immobilisierte zellfreie Antigene nach Inkubation mit erfindungsgemäßem Antikörper im mikroskopischen Bild unter Anregung der Fluoreszenz in den Schritten des Detektionsverfahrens.
- Figur 6 mikroskopische Aufnahmen A) einer biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper und B) eine mikroskopische Aufnahme der selben Probe, jedoch nach Hydrolyse der unter A) verwendeten Antikörperkonjugats und Inkubation mit einem zweiten Antikörperkonjugat mit anderer Antigenspezifität an der fixierten Probe zeigt, unter C) DZ - Ergebnisse der unbehandelten Zellprobe, unter D) DZ - Ergebnisse eines Aliquots der Probe nach Inkubation mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, und E) DZ - Ergebnisse eines Aliquots der unter D) analysierten Probe nach Hydrolyse des Linkers.
Figur 1 zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen Konjugats der ersten Ausführungsform, das als erstes Reagenz eines Testkits aus dem Bindeanteil 1 , dem Fluorochromanteil 5 und dem diese verbindenden Oligonukleotidlinker 4 besteht. Der Fluorochromanteil 5, hier Cy3, ist kovalent, z.B. über bifunktionale Verbindungen, an das erste Ende des Oligonukleotidlinkers 4 gebunden. Der Bindeanteil 1 ist schematisch in Form eines IgG- Antikörpers gezeigt, an dem mittels eines kovalent gebundenen ersten Kopplungsreagenzes 2, z.B. Streptavidin, und mittels eines am ersten Kopplungsreagenz 2 gebundenen zweiten Kopplungsreagenzes 3, z.B. Biotin, das zweite Ende des Oligonukleotidlinkers 4 gebunden ist. Bei Einstrahlung von Licht (hv) mit einer Anregungswellenlänge für das Fluorochrom 5 wird von dem Fluorochromanteil 5 Strahlung emittiert.
Zur Bindung des zweiten Kopplungsreagenzes 3 kann der Oligonukleotidlinker 4 terminal eine Biotin- Akzeptor-Domäne (BAD) aufweisen. Alternativ zur Bindung des Oligonukleotidlinkers 4 an den Bindeanteil 1 mittels erstem und zweiten Kopplungsreagenz kann die Bindung kovalent sein, z.B. durch Derivatisierung des Bindeanteils 1 und/oder des Oligonukleotidlinkers 4, z.B. zur Bildung einer Ester-, Amid- oder Thiobindung. Die Bindung des Fluorochroms 5 an den Oligonukleotidlinker 4 ist vorzugsweise kovalent.
Der Oligonukleotidlinker 4 kann die Nukleinsäuresequenz TTT TTT TTT TGT TTT TTT TT (Seq.-ID. Nr. 1) von 5 ' nach 3 ' aufweisen, die als Quencherabschnitt 4b durch Kontaktierung bzw. Hybridisierung mit dem Oligonukleotid 7, das mit einem Quencher 6 verbunden ist, den Quencher 6 in die Nähe des Fluorochromanteils 5 anordnet. Dadurch wird der Fluorochromanteil 5 optisch unwirksam gemacht. Das mit dem Quencherabschnitt 4b des Oligonukleotidlinkers 4 hybridisierbare Oligonukleotid 7 ist vorzugsweise abschnittsweise zum Quencherabschnitt 4b revers komplementär, beispielsweise mit der Nukleinsäuresequenz AAA AAA AAA ACA AAA AAA AAA (Seq.-ID Nr. 2, von 5 ' nach 3 ').
Zur Positionierung des Quenchers 6 in die Nähe, insbesondere innerhalb des Förster-Radius des Fluorochroms 5, ist der Quencher 6 vorzugsweise an das Ende des Oligonukleotids 7 gebunden, das bei Hybridbildung mit dem Oligonukleotidlinker 4 dem Fluorochrom 5 benachbart ist.
Für das Analyseverfahren kann eine Probe mit dem ersten Reagenz, das aus Bindeanteil 1 , Fluorochromanteil 5 und dem mit seinem ersten Ende am Fluorochromanteil 5 angebundenen Oligonukleotidlinker 4 besteht, kontaktiert werden. Nach Waschen kann die spezifische Bindung des Bindeanteils 1 an die Probe durch Detektion des Fluorochromanteils analysiert werden. Der Oligonukleotidlinker 4 weist einen Quencherabschnitt 4b auf, zu dem ein Oligonukleotid 7 hybridisierbar ist, das mit dem Quencher 5 verbunden ist. Durch Kontaktieren des an der Probe gebundenen ersten Reagenzes mit einem zweiten Reagenz, das einen an einem Oligonukleotid 7 gebundenen Quencher 6 aufweist, wird der Fluorochromanteil 5 unwirksam gemacht. Die nachfolgende Kontaktierung der Probe mit einem weiteren ersten Reagenz ermöglicht die Detektion von dessen Fluorochromanteil ohne Beeinträchtigung durch das zuvor mit der Probe kontaktierte erste Reagenz, dessen Fluorochrom durch Anordnung des Quenchers 6 in dessen Nähe unwirksam gemacht ist. Als Alternative zum Unwirksammachen durch spezifische Anordnung eines Quenchers 6 am ersten Reagenz kann dessen Fluorochromanteil 5 durch Hydrolyse des Oligonukleotidlinkers 4 und Waschen effektiv unwirksam gemacht werden, wie für die zweite Ausführungsform in Figur 2 schematisch dargestellt ist.
Figur 2 zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen Konjugats der zweiten Ausführungsform, das aus dem Bindeanteil 1 , hier in Form eines Rezeptorliganden gezeigt, und daran mittels eines kovalent am Bindeanteil 1 gebundenen Oligonukleotidlinkers 4 gebundenen Fluorochroms 5 besteht. Der Oligonukleotidlinker 4 ist in dem Abschnitt doppelsträngig, in dem der am Fluorochrom 5 gebundene zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt 8 mit dem hybridisierbaren ersten
Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a hybridisiert ist. Vorzugsweise sind die Bindungen zwischen Bindeanteil 1 und erstem Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a, sowie zwischen zweitem Oligonukleotidlinkerabschnitt 8 und Fluorochrom 5 durch Assoziation jeweils an einem Bestandteil kovalent gebundener erster und zweiter Kopplungsreagenzien entsprechend Figur 1 gebildet, oder kovalent.
Da die zweite Ausführungsform auch in dieser Variante des abschnittsweise doppelsträngigen Oligonukleotidlinkers 4 einen durch eine Endonuklease hydrolysierbaren Oligonukleotidlinker 4 aufweist, ist hier eine Endonuklease als zweites Reagenz im Testkit enthalten. Entsprechend weist hier der Oligonukleotidlinker 4 optional keinen Quencherabschnitt 4b auf.
Im Analyseverfahren kann die Probe mit einem ersten Anteil des ersten Reagenzes kontaktiert werden, der aus Bindeanteil mit gebundenem Oligonukleotidlinker 4 mit einem einen Fluorochromabschnitt enthaltenden ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a besteht, und gleichzeitig oder anschließend mit einem zweiten Anteil kontaktiert werden, der den an den ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a hybridisierbaren bzw. hybridisierten zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt 8 gebundenen Fluorochromanteil 5 enthält. Nach Entfernung ungebundener Anteile von der Probe durch Waschen kann spezifisch gebundener Bindeanteil 1 durch Detektion des daran über den abschnittsweise doppelsträngigen Oligonukleotidlinker 4 gebundenen Fluorochromanteil 5 nachgewiesen werden. Zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils 5 kann der Oligonukleotidlinker 4 durch Kontaktieren mit einer Endonuklease (nicht dargestellt) und anschließendes Waschen von dem Bindeanteil 1 entfernt und dadurch effektiv unwirksam gemacht werden. Figur 3 zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen Konjugats der ersten Ausführungsform in der Variante, dass der Oligonukleotidlinker 4 abschnittsweise doppelsträngig ist. Der Bindeanteil 1 ist an den Oligonukleotidlinker 4 gebunden, der einen ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a mit Fluorochromabschnitt aufweist, an den der an den Fluorochromanteil 5 gebundene zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt 8 hybridisierbar ist. Der Oligonukleotidlinker 4 weist entsprechend den ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a auf, zu dem der zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt 8, an den das Fluorochrom 5 gebunden ist, abschnittsweise hybridisierbar, z.B. revers komplementär ist. Angrenzend an den ersten Oligonukleotidabschnitt 4a weist der Oligonukleotidlinker 4 einen Quencherabschnitt 4b auf, zu dem das Oligonukleotid 7 hybridisierbar, z.B. revers komplementär ist, welches an den Quencher 6 gebunden ist. Zur Positionierung des Fluorochroms 5 in die Nähe des Quenchers 6 ist das Fluorochrom 5 vorzugsweise an das Ende des zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts 8 gebunden, das bei Hybridisierung mit dem ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a an den Quencherabschnitt 4b des Oligonukleotidlinkers 4 angrenzt, mit welchem das Oligonukleotid 7 hybridisiert, das den Quencher 6 trägt. Zur Positionierung des Quenchers 6 in die Nähe, insbesondere innerhalb des Förster-Radius des Fluorochroms 5, ist der Quencher 6 vorzugsweise an das Ende des Oligonukleotids 7 gebunden, das bei Hybridbildung mit dem Oligonukleotidlinker 4, bzw. dessen Quencherabschnitt 4b, an den ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4a des Oligonukleotidlinkers 4 angrenzt, an den der zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt 8 des Fluorochroms 5 hybridisierbar ist.
Bei Hybridisierung des zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitts 8, der mit dem Fluorochrom 5 verbunden ist, mit dem ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt 4 wird der Bindeanteil 1 mit dem Fluorochrom 5 verbunden, so dass bei Einstrahlung von Licht hv mit Anregungswellenlänge Fluoreszenz emittiert wird. Diese Emission wird erfindungsgemäß zur Detektion des Konjugats gemessen.
Der Zusatz von hybridisierbarem Quencher 6, der mit einem zu einem Quencherabschnitt 4b des Oligonukleotidlinkers 4 komplementären Oligonukleotid 7 verbunden ist, führt durch Positionierung des Quenchers 6 in die Nähe des Fluorochroms 5 zum Unwirksammachen des Fluorochroms 5. Wie in Figuren 1 bis 3 gezeigt, können erfϊndungsgemäße Konjugate ein oder mehr Oligonukleotidlinker 4 aufweisen, die an den Bindeanteil 1 gebunden sind.
Beispiel 1 : Herstellung eines Antikörper-Fluorochrom-Konjugats mit Oligonukleotidlinker Als Beispiel für ein erfindungsgemäßes Konjugat der ersten Ausführungsform wurde ein biotinylierter anti-Maus-CD4-Antikörper (Klon GKl.5, erhältlich von BD Bioscience) mit Streptavidin inkubiert und das entstandene Streptavidin-Antikörperkonjugat wurde aufgereinigt. Als Oligonukleotidlinker wurde synthetisch hergestellte einsträngige DNA der Seq.-ID Nr. 1 verwendet, an deren 3 '-Ende Biotin und an deren 5 '-Ende das Fluorophor Cy3 (erhältlich von Molecular Probes Inc.) gekoppelt war. Zur Bindung des Oligonukleotidlinkers an den als Bindeanteil eingesetzten Antikörper wurde das biotinylierte Oligonukleotid mit dem Streptavidin-gekoppelten Antikörper inkubiert und anschließend gelchromatographisch aufgereinigt. Die Bindung zwischen Streptavidin und Biotin ergab ein Konjugat der Struktur Antikörper-Biotin-Streptavidin-Biotin-Oligonukleotidlinker-Fluorochrom.
Beispiel 2: Detektion eines Antigens auf der Zelloberfläche menschlicher Zellen Als Beispiel für eine biologische Probe wurden menschliche Leukozyten aus peripherem Blut isoliert und auf einem Objektträger aus Glas mit einer zelladhäsiven Beschichtung (Polylysin, erhältlich von Karl Roth GmbH) immobilisiert. Der Objektträger wies zwei parallele beabstandete Vorsprünge als Abstandshalter auf, die ein zum Objektträger paralleles Deckglas trugen. Die jeweils an den Enden des Objektträgers entstandenen Öffnungen wurden als Einlass- bzw. Auslassöffnung zur Zu- und Abführung von Lösungen verwendet.
Nach Entfernen ungebundener Bestandteile durch Waschen mit physiologischer phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) wurden die Zellen mikroskopisch (Axioplan 2e Mikroskop, Zeiss, mit motorischer Objekttischverstellung und Fokussierung, Quecksilberlampe HBO 100 zur Anregung, Filter für PE oder FITC, Plan-Neofluar 16x/0,50 Immersionsobjektiv und CCD Kamera Axiocam MRm zur Aufzeichnung) unter Einstrahlung einer Anregungswellenlänge analysiert, um die Hintergrund-Fluoreszenz zu bestimmen. Das erhaltene mikroskopische Bild ist in Figur 4 a) gezeigt, in dem lichtmikroskopisch identifizierte Zellen durch eingefügte Kreise markiert sind. Anschließend wurde Antikörperkonjugat nach Beispiel 1 zugegeben, das als Antikörperanteil anti-CD4-Antikörper enthielt. Figur 4 b) zeigt die selbe Stelle wie Figur 4 a) bei Fluoreszenzdetektion des vom Fluorochrom Cy3 emittierten Lichts. Diese Aufnahme zeigt, dass erfindungsgemäße Konjugate zum spezifischen Nachweis von Zellantigenen geeignet sind, da die CD4-positiven Zellen selektiv markiert sind.
Anschließend wurde ein mit einem Quencher verbundenes Oligonukleotid durch die Einlassöffhung zu den Zellen gegeben, nämlich das zu Seq.-ID Nr. 1 abschnittsweise revers komplementäre Oligonukleotid Seq.-ID Nr. 2, an dessen 3 '-Ende der Quencher BHQ2 (Black-Hole-Quencher, erhältlich von BioSearch, Novato, USA) gebunden war. Nach Inkubation für 1 min bein Raumtemperatur wurde zum Waschen 100 μL PBS an der Einlassöffhung zugegeben und etwas dasselbe Volumen an der Auslassöffhung abgenommen. Eine erneute fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der selben Stelle ist in Figur 4c) gezeigt. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass die optische Aktivität des Fluorochroms des erfindungsgemäßen Konjugats selektiv unwirksam gemacht werden kann. Alternativ zum Zusatz des Oligonukleotid-tragenden Quenchers konnte zum Unwirksammachen des Fluorochromanteils DNase zugesetzt werden, gefolgt von Waschen mit ca. 100 bis 200 μL PBS, um den Oligonukleotidlinker des Konjugats zu hydrolysieren und das Fluorochrom zu entfernen.
Anschließend wurden dieselben immobilisierten Zellen mit einem Antikörperkonjugat kontaktiert, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt war, jedoch mit einem anti-Maus-CD19- Antikörper. Die fluoreszenzmikroskopische Aufnahme ist in Figur 4d) gezeigt, die deutlich macht, dass erfindungsgemäße Konjugate zur aufeinanderfolgenden Detektion von Antigenen geeignet sind, jeweils mit spezifischen Unwirksammachen des Fluorochromanteils eines Konjugats vor Kontaktierung der Probe mit einem weiteren Konjugat. Auch die Fluoreszenz des anti-CD 19-Konjugats konnte durch Zusatz des selben Quenchers, der das zum Oligonukleotidlinker revers komplementäre Oligonukleotid trug, oder durch Zusatz von DNase unwirksam gemacht, d.h. entfernt werden.
Beispiel 3: Nacheinander folgende Detektion löslicher Antigene nach Immobilisierung auf einem Trägersubstrat
Erfindungsgemäße Konjugate wurden zur Analyse zellfreier Analyten verwendet, beispielhaft zur Detektion von oberflächlich gebundenem IgG2a. Auf einem mit Polylysin beschichteten Objektträger aus Glas, wie in Beispiel 2 verwendet, wurde Phycoerythrin-markiertes Ratten- Immunglobulin Ig2Ga kappa binden gelassen. Anschließend wurden freie Bindungsstellen des Objektträgers mit Rinderserumalbumin (3% in PBS) gesättigt. Eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme ist in Figur 5a) gezeigt, in der die Fluoreszenz einzelner Moleküle sichtbar ist. Die Position des markierten IgG2a wurde festgestellt und in Bezug zum Objektträger gespeichert.
Zur Auslöschung der Eigenfluoreszenz des Phycoerythrin-markierten Ratten-Immunglobulins wurde mit der spezifischen Anregungswellenlänge (488nm) bestrahlt. Die Einzelmolekül- und fluoreszenzmikroskopische Aufnahme in Figur 5b) zeigt, dass die Fluoreszenzaktivität des Phycorerythrins dadurch ausgelöscht wurde.
Anschließend wurde ein Antikörperkonjugat zugegeben, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurde, jedoch mit einem anti-IgG2a- Antikörper. Ungebundenes Konjugat wurde durch Waschen mit PBS entfernt. Die anschließende fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Figur 5c) zeigt, dass dieselben Positionen wie in Figur 5a) von dem erfindungsgemäßen Konjugat markiert wurden, also diese Konjugate auch zur Identifikation zellfreier Analyten geeignet sind.
Durch nachfolgende Inkubation mit dem mit einem revers komplementären Oligonukleotid verbundenen Quencher aus Beispiel 2 führte zum Unwirksammachen der für den Analyten spezifischen Fluoreszenz des erfindungsgemäßen Konjugats. Eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme ist in Figur 5d) gezeigt, aus der die Auslöschung der Fluoreszenz der Konjugate deutlich wird. Als Alternative zum Quencher konnte DNase zugesetzt werden und die immobilisierten Analyten gewaschen werden, um die Fluoreszenz des Konjugats unwirksam zu machen.
Beispiel 4: Hydrolyse eines erfindungsgemäßen Antikörperkonjugats an immobilisierten menschlichen Zellen und an suspendierten menschlichen Zellen (DZ) Es konnte gezeigt werden, dass der Fluorochromanteil eines erfindungsgemäßen Antikörperkonjugats, das nach Beispiel 1 erhältlich ist und dessen Antikörperanteil ein anti- CD4-Antikörper und dessen Fluorochromanteil Cy3 war, die mit einem Oligonukleotidlinker (Seq.-ID Nr. 1) verbunden waren, an lebenden, immobilisierten Immunzellen und an suspendierten lebenden Immunzellen unwirksam gemacht werden konnte.
Entsprechend Beispiel 2 wurden immobilisierte menschliche Immunzellen mit dem Antikörperkonjugat inkubiert; die mikroskopische Aufnahme einschließlich der detektierten Fluoreszenz ist in Figur 6 A) gezeigt. Anschließend wurde die Probe durch Kontaktierung mit DNase behandelt, um den Fluorochromanteil abzutrennen. Zur Entfernung ungebundenen Fluorochroms wurde die immobilisierte Probe gewaschen. Alternativ wurde der in Beispiel 2 verwendete hybridisierbare Quencher mit zum Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementären Oligonukleotid zugegeben, was ebenfalls zum Unwirksammachen des Fluorochroms führte.
Anschließend wurde die Probe mit einem Antikörperkonjugat mit dem selben Oligonukleotidlinker, jedoch mit einem anti-CD 19-Antikörperanteil und PE als Fluorochromanteil inkubiert; das mikroskopische Abbild detektierter Emissionen ist in Figur 5 B) gezeigt und macht deutlich, dass die mit dem anti-CD4-Antikörperkonjugat detektierten Zellen (jeweils durch manuell eingefügte Kreise gekennzeichnet) in der Analyse mit anti- CD 19-Antikörperkonjugat kein Fluoreszenzsignal ergaben.
Zum Nachweis des effektiven Unwirksammachens des Fluorochromanteils eines Antikörperkonjugats durch Abtrennen des Fluorochromanteils wurde ein Aliquot von Zellen ohne Antikörperkonjugat, ein Aliquot der Zellen nach Inkubation mit Antikörperkonjugat (anti-CD4-Antikörper-Oligonukleotidlinker-Cy3), und davon ein Aliquot nach Hydrolyse des Linkers durch Inkubation mit DNase per DZ analysiert. Die Ergebnisse sind in Figuren 7 C) für nicht mit Antikörperkonjugat inkubierte Zellen, D) mit anti-CD4 - Antikörperkonjugat inkubierte Zellen und E) nach Hydrolyse des Linkers von Zellen, die mit anti-CD4- Antikörperkonjugat inkubiert waren, gezeigt. Die DZ- Analysen machen deutlich, dass das erfindungsgemäße Antikörperkonjugat den Oberflächenmarker effektiv nachweisen konnte und das an die Zellen gebundene Antikörperkonjugat ein detektierbares Signal emittierter Strahlung erzeugt, wobei die Hydrolyse des Oligonukleotidlinkers mit anschließendem Waschen zum vollständigen Unwirksammachen des Fluorochromanteils führte. Entsprechende Ergebnisse wurden auch durch Zusatz des hybridisierbaren Quenchers mit einem zum Quencherabschnitt des Oligonukleotidlinkers revers komplementären Oligonukleotid erhalten.
Beispiel 5 : Verwendung der Konjugate zur iterativen Zellsortierung per DZ Milzzellen der Maus wurden in Suspension in PBS mit einem entsprechend Beispiel 1 hergestellten anti-CD3 -Antikörperkonjugat für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Per Durchflusszytometrie (FACXAria, BD Biosciences) werden fluoreszenzmarkierte Zellen, hier T-Helferlymphozyten, von den übrigen Zellen abgetrennt. Die T-Helferlymphozyten werden dann für 10 min bei Raumtemperatur in PBS mit dem in Beispiel 2 verwendeten Quencher mit Oligonukleotid inkubiert. Die anschließende Analyse per DZ zeigte, dass der Fluorochrom unwirksam gemacht war. Nach Abtrennen des Quenchers konnten die T- Helferlymphozyten mit einem zweiten Antikörperkonjugat analysiert und sortiert werden, das einen anderen Antikörperanteil aufwies, jedoch den gleichen Oligonukleotidlinker und dasselbe Fluorochrom.
Bezugszeichenliste : 7 zum Quencherabschnitt 4b des
1 Bindeanteil Oligonukleotidlinkers 4 revers
2 erstes Kopplungsreagenz komplementäres Oligonukleotid
3 zweites Kopplungsreagenz 8 mit dem Fluorochromabschnitt des
4 Oligonukleotidlinker Oligonukleotidlinkers hybridisierbarer 4a Fluorochromabschnitt zweiter Oligonukleotidlinkerabschnitt 4b Quencherabschnitt
5 Fluorochrom
6 Quencher

Claims

Ansprüche
1. Zusammenstellung von Reagenzien zum Nachweis von Analyten in Proben, umfassend ein erstes Reagenz, das ein Nachweiskonjugat mit einem für einen Analyten spezifischen Bindeanteil (1), einem mit dem Bindeanteil (1) verbundenen Fluorochromanteil (5) und einem mit seinem ersten Ende mit dem Fluorochromanteil verbundenen Oligonukleotidlinker (4) aufweist, der zumindest abschnittsweise ein Oligonukleotid ist, das in seiner Nukleinsäuresequenz einen Quencherabschnitt (4b) aufweist, und ein zweites Reagenz, das einen Quencher (6) aufweist, der mit dem Ende eines mit dem Quencherabschnitt (4b) hybridisierbaren Oligonukleotids (7) verbunden ist, das bei Hybridisierung mit dem Oligonukleotidlinker (4) an dessen ersten Ende liegt.
2. Zusammenstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotidlinker (4) mit seinem zweiten Ende, das dem ersten Ende gegenüberliegt, mit dem Bindeanteil (1) verbunden ist.
3. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotidlinker (4) einen ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt (4a) aufweist, der an den Bindeanteil (1) gebunden ist, wobei der erste Oligonukleotidlinkerabschnitt (4a) in seiner Nukleinsäuresequenz einen Fluorochromabschnitt (4a) aufweist, und dass der Fluorochromanteil (5) mit einem mit dem Fluorochromabschnitt (4a) hybridisierbaren zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt (8) verbunden ist.
4. Zusammenstellung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt (8), der mit dem Fluorochromanteil (5) verbunden ist, den Quencherabschnitt (4b) aufweist.
5. Zusammenstellung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Nachweiskonjugate enthalten sind, die jeweils Fluorochromabschnitte (4a) mit identischen oder ähnlichen Nukleotidsequenzen aufweisen, an die unter physiologischen Bedingungen der selbe zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt (8) hybridisierbar ist.
6. Zusammenstellung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Nachweiskonjugate enthalten sind, die jeweils Fluorochromabschnitte (4a) mit identischen oder ähnlichen Nukleotidsequenzen aufweisen, an die unter physiologischen Bedingungen der selbe zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt (8) hybridisierbar ist.
7. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Nachweiskonjugate enthalten sind, die jeweils Quencherabschnitte (4b) mit einzigartigen Nukleotidsequenzen aufweisen.
8. Zusammenstellung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Nachweiskonjugate enthalten sind, die jeweils Quencherabschnitte (4b) mit identischen oder ähnlichen Nukleotidsequenzen aufweisen, an die unter physiologischen Bedingungen das selbe mit dem Quencher (6) verbundene Oligonukleotid (7) hybridisierbar ist.
9. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Reagenz kein mit dem Oligonukleotid (7) verbundener Quencher (6) ist und optional der Oligonukleotidlinker (4) keinen Quencherabschnitt (4b) aufweist, und dass das zweite Reagenz der Zusammenstellung eine Nuklease ist.
10. Zusammenstellung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotidlinker (4) eine Erkennungssequenz für eine Restriktase aufweist und die Nuklease eine für die Erkennungssequenz spezifische Restriktase ist.
11. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass unabhängig voneinander der Oligonukleotidlinker (4) und/oder das mit dem Quencher (6) verbundene Oligonukleotid (7) eine einsträngige Oligoribonukleinsäure (RNA), Oligodesoxyribonukleinsäure (DNA) oder Oligo- Peptidnukleinsäure (PNA) ist.
12. Zusammenstellung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass unabhängig voneinander der erste Oligonukleotidlinkerabschnitt (4a) des Oligonukleotidlinkers (4) und/oder der mit diesem hybridisierbare zweite Oligonukleotidlinkerabschnitt (8), der mit dem Fluorochromanteil (5) verbunden ist, eine einsträngige Oligoribonukleinsäure (RNA), Oligodesoxyribonukleinsäure (DNA) oder Oligo-Peptidnukleinsäure (PNA) ist.
13. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr Oligonukleotidlinker (4) mit dem Bindeanteil (1) verbunden sind.
14. Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindeanteil (1) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antikörpern, Paratop bildenden Antikörperfragmenten, Lektinen, Aptameren, Peptiden, die für vorbestimmte MHCI oder MHCII spezifisch sind, MHC-Tetrameren, Biotin und Avidin besteht.
15. Verwendung einer Zusammenstellung nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Analyse biologischer Proben, gekennzeichnet durch die aufeinander folgende Kontaktierung der Probe mit einem Nachweiskonjugat einer ersten Analytenspezifität, Kontaktierung der Probe mit dem zweiten Reagenz, und Kontaktierung der Probe mit einem Nachweiskonjugat einer zweiten Analytenspezifität.
16. Verfahren zur Analyse biologischer Proben, gekennzeichnet durch die Herstellung einer Zusammenstellung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in Kontakt mit der Probe.
17. Verfahren nach Anspruch 16, mit den Schritten der Kontaktierung einer biologischen Probe mit einem Nachweiskonjugat, das einen
Bindeanteil (1) mit einer ersten Spezifität für einen ersten Analyten, einen mit dem
Bindeanteil (1) verbundenen Fluorochromanteil (5) und ein mit seinem ersten Ende mit dem Fluorochromanteil (5) verbundenen Linker aufweist, des Detektierens von durch den Fluorochromanteil (5) emittierter Strahlung, des Unwirksammachens des Fluorochromanteils (5), dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ein Oligonukleotidlinker (4) ist, der zumindest abschnittsweise ein
Oligonukleotid ist, das in seiner Nukleinsäuresequenz einen Quencherabschnitt (4b) aufweist, und dass das Unwirksammachen des Fluorochromanteils (5) durch Kontaktieren des Nachweiskonjugats mit einem Quencher (6) erfolgt, der mit dem Ende eines mit dem Quencherabschnitt (4b) hybridisierbaren Oligonukleotids (8) verbunden ist, das bei Hybridisierung mit dem Oligonukleotidlinker (4) an dessen ersten Ende liegt.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, gekennzeichnet durch die aufeinander folgende Kontaktierung der Probe mit einem Nachweiskonjugat einer ersten Analytenspezifϊtät, Kontaktierung der Probe mit einem für das erste Nachweiskonjugat spezifischen Quencher und Kontaktierung der Probe mit einem Nachweiskonjugat einer zweiten Analytenspezifϊtät.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluorochromanteil (5) und der Oligonukleotidlinker (4) in nacheinander folgenden Kontaktierungen eingesetzter Nachweiskonjugate untereinander jeweils identisch sind und der Quencher (6) jeweils der gleiche mit gleichem Oligonukleotid (7) ist.
20. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Unwirksammachen des Fluorochromanteils (5) an Stelle des Kontaktierens mit einem Quencher (6) durch Kontaktieren des Nachweiskonjugats mit einer Nuklease und anschließendes Entfernen ungebundener Bestandteile erfolgt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotidlinker (4) eine ersten Oligonukleotidlinkerabschnitt (4a) aufweist, der an den Bindeanteil (1) gebunden ist und in seiner Nukleotidsequenz einen Fluorochromabschnitt (4a) aufweist und dass das Bindekonjugat durch Kontaktieren des Fluorochromabschnitts (4a) mit einem Fluorochromanteil (5) erzeugt wird, das mit einem mit dem Fluorochromabschnitt hybridisierbaren zweiten Oligonukleotidlinkerabschnitt (8) verbunden ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe gleichzeitig mit zumindest zwei Nachweiskonjugaten kontaktiert wird, deren Fluorochromabschnitte (4a) jeweils einzigartig sind.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe gleichzeitig mit zumindest zwei Nachweiskonjugaten kontaktiert wird, deren Quencherabschnitte (4b) jeweils einzigartig sind.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass Analyten auf einem Trägersubstrat fixiert sind.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat Bestandteil eines Durchflusskanals ist, in dem die Analyten von wässrigen Zusammensetzungen umströmbar angeordnet sind.
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