WO2010050554A1 - ヒトｃｘｃｌ１タンパク質の免疫学的測定方法 - Google Patents

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seq
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human cxcl1
antibody
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智子 金森
基晩 鄭
祥徳 田中
愛子 高山
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring human CXCL1 protein (hereinafter referred to as human CXCL1). More specifically, it is a method for measuring human CXCL1, which is an immunization combining a monoclonal antibody or a fragment thereof that specifically binds to any of three specific partial sequence regions on the amino acid sequence constituting human CXCL1.
  • the present invention relates to a measurement method.
  • the present invention also relates to a monoclonal antibody that specifically binds to human CXCL1, or a fragment thereof, which can be used in the aforementioned method for measuring human CXCL1 protein.
  • Human CXCL1 is a type of chemokine belonging to the CXC family. This protein is present in platelets in blood and is known to be overexpressed during an inflammatory reaction like other CXC families.
  • Non-patent Document 1 a tumor-related factor. Therefore, it is expected that it can be a marker for urothelial cancer by quantitative detection from urine.
  • Non-patent Document 1 Patent Document 1
  • human CXCL1 has been reported to vary at the gene level and protein level in tissues and blood of patients with other malignant tumors such as colorectal cancer, ovarian cancer, and malignant melanoma
  • Non-Patent Document 2, Non-patent Document 2, Patent Document 3 and Non-Patent Document 4 have potential to detect not only urothelial cancer but also these cancers very early and / or early.
  • the measurement method using the existing enzyme immunoassay lacks the sensitivity necessary to detect the cancer.
  • the human CXCL1 measurement kit manufactured by R & D SYSTEMS (hereinafter referred to as R & D SYSTEMS) described in Patent Document 1 has a detection limit concentration of about 20 pg / mL, whereas the human CXCL1 concentration in normal human urine is detected. Less than the limit. Therefore, a more sensitive method for measuring human CXCL1 has been desired.
  • an object of one embodiment of the present invention is to provide an immunological measurement method for detecting human CXCL1 with higher sensitivity. More specifically, human CXCL1 is further expressed by an immunoassay that combines an antibody or antigen recognition portion that specifically binds to any one of the three specific sequences of the amino acid sequence constituting human CXCL1. The object is to realize a method of detecting with high sensitivity.
  • Another object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically recognizes human CXCL1 or a fragment thereof. More specifically, it includes a novel amino acid sequence that specifically recognizes human CXCL1 and can be used in the aforementioned method for detecting human CXCL1 with higher sensitivity, and has a higher affinity than conventional antibodies. Another object is to provide antibodies or fragments thereof.
  • the present inventors have recognized monoclonal antibodies or antigens that specifically bind to three specific partial sequence regions of the amino acid sequence constituting human CXCL1. It has been found that human CXCL1 can be detected with higher sensitivity than before by combining the portions and measuring immunologically.
  • a monoclonal antibody containing a novel amino acid sequence that specifically binds to three partial sequences on the above-mentioned human CXCL1 and a hybridoma producing the antibody were successfully produced.
  • a gene encoding the amino acid sequence constituting the antibody was isolated and its base sequence was determined. This made it possible to produce recombinant antibodies and their recombinant fragments. This invention is made
  • a human CXCL1 protein or a fragment thereof in a sample is measured using an anti-human CXCL1 monoclonal antibody that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof.
  • the immunological measurement method for human CXCL1 protein according to 1).
  • An anti-human CXCL1 monoclonal antibody or a fragment thereof, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 and CDR3 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • the concentration of human CXCL1 can be measured with higher sensitivity than before.
  • a high-affinity anti-human CXCL1 monoclonal antibody that specifically recognizes human CXCL1 or a fragment thereof can be provided.
  • a commercially available antibody that specifically recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is immobilized on a solid phase, and the biotinylated labeled antibody of the present invention that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a commercially available biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody
  • Sandwich ELISA method using 5 types of antibodies of the present invention (IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, IgG2b-1) and commercially available antibodies, and using biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody
  • the graph which detected human CXCL1 in a buffer solution by FIG. 5 is a graph in which human CXCL1 in plasma is detected by sandwich ELISA using five antibodies of the present invention and a commercially available antibody immobilized on a solid phase and a biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody.
  • FIG. 5 is a graph in which human CXCL1 in urine is detected by sandwich ELISA using five types of antibodies of the present invention and a commercially available antibody, and a biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody.
  • the graph (1) which showed the bladder cancer cell infiltration suppression ability of five types of antibodies of this invention, and a commercially available antibody.
  • the graph (2) which showed the bladder cancer cell infiltration suppression ability of four types of antibodies of this invention, and a commercially available antibody.
  • human CXCL1 means a protein consisting of the amino acid sequence described in Genbank NM — 001511 or a natural variant thereof.
  • natural variant refers to a variant that exists in nature, for example, one in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence, It has 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • identity includes the number of gaps when two amino acid sequences are aligned (aligned) with or without introducing gaps between the two amino acid sequences.
  • “Several” means an integer of 2 to 10, for example, an integer of 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, 2 to 3.
  • Specific examples of natural mutants include mutants based on polymorphisms such as SNP (single nucleotide polymorphism), splice mutants, and the like.
  • the substitution is preferably a conservative amino acid substitution. This is because a conservative amino acid substitution may have a structure or property substantially equivalent to human CXCL1 having the amino acid sequence.
  • Conservative amino acids include nonpolar amino acids (glycine, alanine, phenylalanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, tryptophan), polar amino acids (amino acids other than nonpolar amino acids), charged amino acids (acidic amino acids (aspartic acid) , Glutamic acid) and basic amino acids (arginine, histidine, lysine)) and uncharged amino acids (amino acids other than charged amino acids), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan, tyrosine), branched amino acids (leucine, isoleucine, valine), and Aliphatic amino acids (glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine) and the like are known.
  • “monoclonal antibody” includes a framework region (FR) derived from an immunoglobulin or a fragment thereof and a complementary chain determining region (CDR) and is specific to an antigen.
  • FR framework region
  • CDR complementary chain determining region
  • the “anti-human CXCL1 monoclonal antibody” of the present invention refers to a polypeptide that specifically binds to human CXCL1 or a fragment thereof and can recognize human CXCL1 or a fragment thereof.
  • Specific binding means binding only to a target antigen (human CXCL1 or a fragment thereof in the present invention).
  • a typical immunoglobulin molecule is constructed as a tetramer in which two sets of polypeptide chains, called heavy and light chains, are interconnected in two pairs by disulfide bonds.
  • the heavy chain consists of an N-terminal heavy chain variable region (V H ) and a C-terminal heavy chain constant region (C H )
  • the light chain consists of an N-terminal light chain variable region (V L ) and C It consists of the terminal light chain constant region (C L ).
  • V H and V L are particularly important in that they are involved in antibody binding specificity.
  • Each of V H and V L is composed of about 110 amino acid residues, and has three complementarity determining regions (CDR1, CDR2, CDR3) directly involved in the binding specificity to an antigen therein, and a variable region. It has four framework regions (FR1, FR2, FR3, FR4) that function as the skeleton structure.
  • the complementary chain determining region is known to form a three-dimensional structure complementary to the antigen molecule and determine the specificity of the antibody (EA Kabat et al, 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol. .1, eds.5, NIH publication).
  • the amino acid sequence of the constant region is almost unchanged between intraspecific antibodies, whereas the amino acid sequence of the complementary chain determining region is highly variable between antibodies, and is therefore also called a hypervariable region. .
  • the complementarity determining region and the framework region are arranged in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino acid end to the carboxy terminal direction.
  • V L and V H form an antigen binding site by forming a dimer relative to each other in the immunoglobulin molecule.
  • immunoglobulins IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD classes are known, but the antibody of the present invention may be any class. IgG is preferred.
  • Antibodies useful in the present invention can be derived from any animal source including birds and mammals. Examples include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, donkeys, sheep, camels, horses, chickens, and humans.
  • the “monoclonal antibody” of the present invention may be synthesized chemically or by using a recombinant DNA method. For example, chimeric antibodies and recombinant antibodies such as humanized antibodies are also included in the present invention.
  • a chimeric antibody is an antibody in which the constant region of one antibody is replaced with the constant region of another antibody.
  • an antibody in which the constant region is replaced with the constant region of a human antibody is applicable.
  • V L comprises the amino acid sequence in the V L of anti-human CXCL1 mouse monoclonal antibody shown in any of SEQ ID NO: 10,18,26,34, or 42
  • C L is any comprises an amino acid sequence at the C L of a human antibody
  • V H comprises the amino acid sequence of V H of anti-human CXCL1 mouse monoclonal antibody shown in any of SEQ ID NO: 11,19,27,35, or 43
  • an antibody in which C H contains an amino acid sequence in C H of any human antibody is
  • a humanized antibody is a mosaic antibody in which CDR groups derived from a certain antibody (usually a non-human antibody such as a mouse antibody) are artificially combined with the FR and constant region of a human antibody.
  • CDR groups derived from a certain antibody usually a non-human antibody such as a mouse antibody
  • an antibody combining each CDR of an anti-human CXCL1 mouse monoclonal antibody, each FR of an arbitrary human antibody, and a constant region is applicable. Since the antigen-binding specificity of an antibody is mainly borne by the CDRs in the variable region, the entire amino acid sequence of a certain antibody is obtained when producing a recombinant antibody having the same binding characteristics as that of the certain antibody. There is no need.
  • a mosaic antibody is prepared by replacing a DNA sequence encoding each CDR derived from a certain antibody with a DNA sequence encoding a corresponding CDR derived from a human antibody, and expressing it.
  • a recombinant antibody that mimics the properties of a certain antibody can be obtained.
  • Such a technique is called a CDR grafted antibody. Nature, 1986, Vol. 321, 522.
  • the anti-human CXCL1 antibody or fragment thereof of the present invention does not necessarily need to be a humanized antibody when used for detection of human CXCL1 or a fragment thereof. Can be derived from antibodies of any animal other than human.
  • the “antibody” may be a multispecific antibody.
  • a multispecific antibody refers to a multivalent antibody, that is, an antibody that binds to different epitopes in each antigen-binding site in an antibody having a plurality of antigen-binding sites in one molecule.
  • a bispecific antibody in which each antigen binding site binds to a different epitope can be mentioned.
  • the multispecific antibody is preferably capable of binding to different epitopes in which each antigen-binding site is present on human CXCL1. These antibodies can be obtained by artificially modifying IgG or the like by a known method using recombinant DNA technology.
  • a fragment thereof in “monoclonal antibody or fragment thereof” is a partial region of the antibody, and has substantially the same activity as the antigen-specific binding activity of the antibody.
  • a polypeptide chain or a complex thereof is applicable.
  • Specific examples include a number of well-characterized antibody fragments generated by cleaving immunoglobulins with various peptidases. More specific examples include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′ and the like.
  • Fab is a fragment caused by IgG molecule by papain is cleaved at the N-terminal side of the disulfide linkages in the hinge portion, the three domains that make up the V H and C H (C H 1, C H 2, C H 3) is composed of a polypeptide consisting of C H 1 adjacent to V H and a light chain.
  • F (ab ′) 2 is a dimer of Fab ′ produced by cleaving IgG molecules at the C-terminal side of the disulfide bond at the hinge part by pepsin.
  • Fab ′ is slightly longer in H chain than the Fab, but has a structure substantially equivalent to that of Fab (Fundamental Immunology, Paul ed., 3d ed., 1993).
  • Fab ′ can be obtained by reducing F (ab ′) 2 under mild conditions and breaking the disulfide linkage in the hinge region.
  • Each of these antibody fragments includes an antigen-binding site and has an ability to specifically bind to an antigen (that is, human CXCL1 or a fragment thereof in the present invention).
  • the “fragment thereof” of the present invention may be synthesized chemically or by using a recombinant DNA method.
  • an antibody fragment newly synthesized using a recombinant DNA method can be mentioned.
  • Ichiryou body obtained by artificially linked via a linker peptide or the like having one or more V L and one or more V H appropriate length and sequence of the antibody of the present invention It corresponds to a polypeptide molecule or a multimeric polypeptide thereof.
  • Examples of such polypeptides include single chain Fv (scFv: single chain Fragment of variable region) (Pierce catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical co., Rockford, IL di) (see Body, Diab).
  • VL and VH are usually located on separate polypeptide chains (light chain and heavy chain).
  • a single chain Fv is a synthetic antibody fragment in which these variable regions are connected by a flexible linker having a sufficient length and has a structure encompassed by a single polypeptide chain. Within the single chain Fv, both variable regions can self-assemble with each other to form one functional antigen binding site.
  • Single-stranded Fv can be obtained by integrating and expressing a recombinant DNA encoding the same into a phage genome using known techniques.
  • a diabody is a molecule having a structure based on a dimeric structure of a single chain Fv (Holliger et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 6444-6448).
  • the linker is shorter than about 12 amino acid residues, the two variable sites within the single chain Fv cannot self-assemble, but by forming a diabody, ie, two single chain Fv Can interact with the V L of one Fv chain and the V H of the other Fv chain to form two functional antigen binding sites (Marvin et al, 2005, Acta Pharmacol). Sin., 26: 649-658).
  • a diabody is a bivalent antibody fragment, but each antigen-binding site need not bind to the same epitope, and each has a bispecificity that recognizes and specifically binds to a different epitope. It does not matter.
  • one antigen-binding site is represented by SEQ ID NOs: 39, 40, and 41 including a VL containing CDRs (corresponding to CDR1, CDR2, and CDR3, respectively) containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 36, 37, and 38.
  • CDR comprising an amino acid sequence (respectively, CDRl, CDR2, CDR3 correspond to) a V H containing, other antigen-binding sites
  • CDR comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, 29, 30
  • CDRl, CDR2, CDR comprising an amino acid sequence represented by V L and SEQ ID NO: 31, 32, 33 including the corresponding to CDR3
  • CDRl, CDR2, corresponding to CDR3 may consist V H containing.
  • Triabodies and tetrabodies have their trimer and tetramer structures based on a single-chain Fv structure as in the diabody. These are trivalent and tetravalent antibody fragments, respectively, and may be multispecific antibodies.
  • fragment thereof is an antibody fragment identified using a phage display library (see, for example, McCafferty et al., 1990, Nature, Vol. 348, 522-554) and has an antigen-binding ability.
  • a phage display library see, for example, McCafferty et al., 1990, Nature, Vol. 348, 522-554
  • has an antigen-binding ability are included.
  • Kuby, J. et al. Immunology, 3rd Ed. 1998, W.M. H. Freeman & Co. See also New York.
  • the present invention provides an antibody or a fragment thereof having a variable region having a desirable binding activity for human CXCL1, and an amino acid sequence constituting the CDR. That is, the present invention provides an antibody or fragment thereof comprising an immunoglobulin variable region comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 4 to 43.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 in the light chain of CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, and the CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: in the heavy chain thereof, respectively.
  • the amino acid sequence shown by 7, 8, 9 can be included.
  • V L and V H can include the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, and 14 in the light chain of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, and the CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain in the SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence shown by 15, 16, 17 can be included.
  • V L and V H can include the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, respectively.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 20, 21, and 22 in the light chain of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, and CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain in the light chain.
  • the amino acid sequence shown by 23, 24, 25 can be included.
  • V L and V H can include the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, respectively.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 28, 29, and 30 in the light chain of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, and CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain in the light chain.
  • the amino acid sequence shown by 31, 32, 33 can be included.
  • V L and V H can include the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, respectively.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 36, 37, and 38 in the light chain, and CDR1, CDR2, and CDR3 in the heavy chain, respectively.
  • the amino acid sequence shown by 39, 40, 41 can be included.
  • V L and V H can include the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, respectively.
  • modification refers to functional modifications necessary for the antibody or fragment thereof of the present invention to have a specific binding activity with human CXCL1 (for example, glycosylation), and the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the antibody label include fluorescent dyes (FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5), fluorescent proteins (eg, PE, APC, GFP), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase), Or labeling with biotin or (strept) avidin).
  • the glycosylation of the antibodies of the present invention may also be modified to adjust the affinity of the antibody for the target antigen.
  • modification can be accomplished, for example, by altering one or more glycosylation sites within the antibody sequence. More specifically, for example, by removing one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence constituting one or more glycosylation sites in FR and removing the glycosylation site, the glycosylation at that site is lost. Can be made.
  • Such deglycosylation is effective in increasing the affinity of the antibody for the antigen (US Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861).
  • the monoclonal antibody or fragment thereof used in the measurement method of the present invention is preliminarily cross-reacted with another antigen (protein or fragment thereof) before use in order to ensure specific binding activity to human CXCL1 or fragment thereof. It is preferable to verify the property.
  • the antigen to be confirmed for crossing include proteins belonging to the CXC family, particularly human CXCL2 protein and human CXCL3 protein that are structurally similar to human CXCL1.
  • an ELISA method using human CXCL1 as an antigen can be used. If the antibody to be tested for reaction specificity, that is, the anti-human CXCL1 monoclonal antibody, and the other antigen protein whose cross-reactivity is to be confirmed coexist in the field of the reaction between the fragment and human CXCL1, the competitive state of the two It is possible to confirm the crossing property by observing. Such a method for confirming the crossing property using the principle of competitive inhibition can quickly perform screening because it is not necessary to prepare reaction systems for all antigens.
  • the anti-human CXCL1 monoclonal antibody of the present invention or a hybridoma producing the antibody can be produced by the method described below. However, it is not limited to this method, It can also produce by any other method known in the said field
  • A. Method for Producing Anti-human CXCL1 Monoclonal Antibody To produce an anti-human CXCL1 monoclonal antibody that specifically binds to any one of the amino acid partial sequence regions of SEQ ID NOs: 1 to 3 among the amino acid sequences constituting human CXCL1, A monoclonal antibody is prepared using the full length as an immunogen, and then a method for screening an antibody that specifically binds to any one of the amino acid partial sequence regions of SEQ ID NOS: 1 to 3, and previously shown in SEQ ID NOS: 1, 2, or 3 There is a method for producing a monoclonal antibody using a partial sequence of human CXCL1 as an immunogen.
  • Human CXCL1 used as an immunogen (antigen) is prepared.
  • Human CXCL1 may be any of human CXCL1, in which all or part of the amino acid sequence is chemically synthesized, such as natural, recombinant, or peptide synthesis.
  • Natural human CXCL1 is a known protein separation / purification technique such as gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography from human samples including human body fluids such as blood or urine, or culture supernatants of human cultured cells. It can be recovered using graphy.
  • Recombinant human CXCL1 can be expressed in microorganisms, insect cells, or animal cells into which DNA encoding the protein has been introduced, and then recovered from the cells using known protein separation / purification techniques.
  • Synthetic human CXCL1 can be synthesized, for example, by publicly known techniques such as solid phase peptide synthesis using public human CXCL1 amino acid sequence information.
  • the cDNA sequence of human CXCL1 has been published as accession number X12510 in GenBank.
  • the synthetic human CXCL1 may be used by linking to a carrier protein such as KLH (Scattle hemocyanin), OVA (ovalbumin), BSA (bovine serum albumin).
  • the immunogen may be a natural type or a recombinant type as in the case of immunizing a full-length sequence. Or may be chemically synthesized.
  • a partial sequence of natural human CXCL1 is used as an immunogen
  • purified human CXCL1 is treated with an appropriate protease such as trypsin, and then peaks are separated and fractionated on a reverse phase column.
  • the amino acid sequence of the peptide contained in each sorted peak is determined by a mass spectrometer, and the partial sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or a peak that is a part thereof can be used as an immunogen.
  • the amino acid partial sequence of recombinant human CXCL1 is used as an immunogen
  • the amino acid partial sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 or a part thereof is encoded among the DNA sequences encoding human CXCL1 described above.
  • human CXCL1 partial sequence the preparation of the amino acid partial sequence of recombinant human CXCL1 represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 (hereinafter referred to as human CXCL1 partial sequence) will be described in detail.
  • a phage or a plasmid that can autonomously grow in a host microorganism can be used.
  • plasmids derived from E. coli pET16b, pGEX6p, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids YEp13, YEp24, YCp50, etc.
  • examples of di include ⁇ phage ( ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • the purified polynucleotide is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and a DNA ligase or the like is used inside the vector cleaved with an appropriate restriction enzyme. There is a way to concatenate.
  • the obtained human CXCL1 partial sequence expression vector is introduced into a host capable of expressing human CXCL1 protein to obtain a human CXCL1 partial sequence expression transformant.
  • the host to be used is not particularly limited as long as it is suitable for the vector used and can express human CXCL1.
  • bacteria for example, Escherichia coli
  • Bacillus subtilis for example, Bacillus subtilis
  • yeast insect cells
  • animal cells COS cells
  • CHO cells Journal of immunology, 1998), etc. , Vol.160, 3393-3402
  • the method for introducing the vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a known method for introducing the vector into bacteria, for example, heat shock method, calcium Examples thereof include a method using ions, an electroporation method, etc. All of these techniques are known in the art and described in various literatures, for example, Sambrook, J. et al., 1989, Molecular. Cl ning: See A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, and for the transformation of animal cells, the Lipofectin method (PNAS, 86, 1989, PNAS, 86, 1989). (PNAS, 1987, Vol. 84, 7413), electroporation method, calcium phosphate method (Virology, 1973, Vol. 52, 456-467), DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
  • a human CXCL1 partial sequence expression vector is autonomously replicable in the bacterium, and at the same time, it is composed of a promoter sequence, a ribosome binding sequence, a DNA sequence encoding a human CXCL1 partial sequence, and a transcription termination sequence. It is preferable. Moreover, the gene which codes the regulatory factor which controls a promoter may be contained. Any promoter may be used as long as it can function in a host such as Escherichia coli.
  • Human CXCL1 partial sequence expression transformant when a eukaryotic cell such as a yeast, an animal cell, or an insect cell is used as a host, a human CXCL1 partial sequence expression transformant can be similarly obtained according to a technique known in the art.
  • Human CXCL1 partial sequence expression vectors used in eukaryotic cells include promoter sequences, DNA sequences encoding human CXCL1 partial sequences, as well as cis elements such as enhancers, splicing signals (donor sites, acceptor sites, branch points, etc.) ), A poly A addition signal, a selection marker sequence, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like may be linked.
  • the method of culturing a transformant in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium is not particularly limited as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the microorganism, and can grow and proliferate.
  • Either a natural medium or a synthetic medium can be used. More specific examples include LB medium, but of course not limited thereto.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • the culture is usually carried out at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as aeration and agitation culture.
  • the pH is preferably maintained near neutrality.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • the transformant is an animal cell such as a CHO cell
  • the host cell is inoculated into Gibco's DMEM medium at 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. do it.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • the human CXCL1 partial sequence expression vector is a protein expression-inducing vector containing a protein expression control system (for example, when the host is a microorganism, a repressor gene, an operator, etc.), a predetermined expression is given to the transformant. It is necessary to induce the expression of the human CXCL1 partial sequence. Since the expression induction method varies depending on the protein expression control system contained in the vector, an induction process suitable for the system may be performed. For example, the most commonly used protein expression control system in a protein expression inducing vector using a bacterium as a host is a system comprising a lac repressor gene and a lac operator.
  • expression can be induced by IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactoside) treatment.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactoside
  • an appropriate amount for example, a final concentration of 1 mM
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactoside
  • A2 Preparation of production cells of anti-human CXCL1 partial sequence antibody
  • the immunogen obtained in A1 is dissolved in a buffer solution to prepare an immunogen solution.
  • an adjuvant may be added if necessary for effective immunization.
  • adjuvants include commercially available complete Freund's adjuvant (FCA), incomplete Freund's adjuvant (FIA) and the like, and these may be used alone or in combination.
  • the prepared immunogen solution is administered to a mammal, for example, a rat, a mouse (for example, a BALB / c of an inbred mouse), a rabbit or the like, and immunized.
  • a mammal for example, a rat, a mouse (for example, a BALB / c of an inbred mouse), a rabbit or the like, and immunized.
  • the method of administering the immunogen include, but are not limited to, subcutaneous injection using FIA or FCA, intraperitoneal injection using FIA, or intravenous injection using 0.15 mol / L sodium chloride.
  • the single dose of the immunogen is appropriately determined according to the type of immunized animal, the route of administration, etc., and is about 30 to 200 ⁇ g per animal.
  • the immunization interval is not particularly limited, and after the initial immunization, booster immunization is performed 2 to 6 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method, etc. If the antibody titer reaches a plateau, the immunogen is injected intravenously or intraperitoneally, Final immunization. Then, antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization.
  • Collection of antibody-producing cells from immunized animals and cell fusion Hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically recognize anti-human CXCL1 partial sequences by cell fusion of antibody-producing cells obtained from immunized animals and myeloma cells can be produced.
  • Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines derived from mice and the like can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin and thymidine) in an unfused state, and can only grow in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • the cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal. Specific examples of myeloma cells include P3X62-Ag., Which is a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficient cell line derived from BALB / c mice. 8 strain (ATCC CIB9), P3X63-Ag. 8).
  • Examples include U1 strain (JCRB9085), P3 / NSI / 1-Ag4-1 strain (JCRB0009), P3x63Ag8.653 strain (JCRB0028) or Sp2 / 0-Ag14 strain (JCRB0029).
  • the antibody-producing cell and the myeloma cell are about 1: 1 to 20: 1 in an animal cell culture medium such as DMEM or RPMI1640 medium without serum. Mix at a ratio and perform a fusion reaction in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 to 4,000 Da or the like can be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an auxiliary such as dimethyl sulfoxide may be used in combination in order to increase the fusion efficiency.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation) (Nature, 1977, Vol. 266, 550-552).
  • a cell suspension is obtained using, for example, RPMI 1640 medium containing fetal bovine serum. After appropriate dilution, seed 2 ⁇ 10 6 cells / well on a 96-well microtiter plate, add selective medium to each well, and then perform culture by appropriately exchanging the selective medium.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • a hybridoma of antibody-producing cells and myeloma cells can be obtained by using a selective medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. Therefore, cells that grow from about 10 days after the start of culture in a selective medium can be selected as hybridomas.
  • HAT medium a selective medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. Therefore, cells that grow from about 10 days after the start of culture in a selective medium can be selected as hybridomas.
  • the hybridoma selected in the HAT medium is first screened using the binding activity to natural or recombinant human CXCL1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 as an index. Subsequently, the hybridoma producing an antibody having binding activity to human CXCL1 is subjected to a cross-ability test. That is, the binding activity to other CXC families and the like is verified, and an acceptable one is selected. Acceptable crossing means a negligible degree of crossing in the intended use of the antibody.
  • an ELISA method can be used.
  • a microplate on which human CXCL1 or a fragment thereof as an antigen is immobilized is prepared, and a sample obtained by appropriately diluting the culture supernatant of the hybridoma is added thereto and reacted. After sufficiently reacting, the wells are washed, and a secondary antibody label against immunoglobulin is added for further reaction. If the well is washed again and measured using the label of the secondary antibody finally bound to the well, the binding activity of the antibody present in the culture supernatant to the antigen can be quantitatively known.
  • the hybridoma of the present invention can be used for antibody production by ascites using a mouse. Specifically, ascites fluid containing antibodies is obtained by inoculating the hybridoma into the abdominal cavity of mice derived from the cells used as the fusion partner used to produce the hybridoma or nude mice, and collecting ascites as appropriate. It can be recovered. More specifically, ascites fluid containing antibodies can be collected by inoculating hybridomas using Sp / 0 cells as fusion partners into the peritoneal cavity of BALB / c mice 10 days after pristane inoculation.
  • the hybridoma in this invention can be used for antibody production by culturing using a suitable culture medium.
  • the antibody is obtained by inoculating a hybridoma in Gibco's hybridoma SFM medium at 1 ⁇ 10 5 cells / mL and culturing in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. until the hybridoma dies.
  • the present invention is not limited to this.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention utilizes a cDNA sequence encoding the amino acid sequence of a monoclonal antibody that specifically recognizes the human CXCL1 partial sequence disclosed in the present invention. Can also be obtained by recombinant DNA manipulation.
  • the nucleotide sequences of V H and V L are arbitrary C L , and each ligated to nucleotide sequence encoding a C H, incorporate each polynucleotide in an appropriate expression vector, after introduction into the host cell can also be expressed as a full immunoglobulin molecule. Also, using CDR graft antibody technology, B2.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of CDR in the variable region obtained by the above method and the polynucleotide encoding each FR of any immunoglobulin are ligated and incorporated into an appropriate expression vector. It may be expressed as a simple immunoglobulin molecule.
  • Each polynucleotide can be synthesized chemically, or the method of Fujimoto et al., which is known as a method for synthesizing long-chain DNA (Hideya Fujimoto, synthetic gene production method, plant cell engineering series 7, plant PCR experiment protocol) 1997, Shujunsha, p. 95-100).
  • the sequence of C L , C H , and FR region to be linked is preferably derived from mouse, but derived from any other animal such as human. There may be.
  • the heavy chain and the light chain are expressed in the same host cell so that they can be produced as a dimer comprising the heavy chain / light chain.
  • cells can be cotransformed with a light chain expression vector and a heavy chain expression vector, and the antibody according to the present invention can be obtained from the transformed cells.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence can be directly incorporated into an appropriate expression vector, introduced into a host cell, and expressed as a fragment of an immunoglobulin molecule.
  • recently developed phage display antibody technology (Brinkmann et al, 1995, J Immunol Methods, 182, 41-50, International Publication No.
  • WO97 / 13844 that utilizes genetic engineering techniques to express recombinant antibodies on the phage surface.
  • a specific antibody can also be obtained by expressing a diversified single chain Fv antibody as a phage fusion protein by artificially shuffling genes encoding heavy and light chains.
  • Preparation of a polynucleotide encoding a recombinant anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibody or a fragment thereof, a vector incorporating the polynucleotide, and a method for introducing the vector into the host were described in “A. Method for producing human CXCL1 antibody” above. Such recombinant DNA techniques known in the art may be used.
  • the desired recombinant anti-human CXCL1 antibody or fragment thereof can be obtained from the culture medium of transformed cells or from the cells.
  • immunoglobulin expression vectors include, but are not limited to, plasmids, phagemids, cosmids, virus vectors (for example, SV40 virus based vectors, EB virus based vectors, BPV based vectors) and the like.
  • virus vectors for example, SV40 virus based vectors, EB virus based vectors, BPV based vectors
  • BCMGS Neo vector which is one of the BPV based vectors
  • the BCMGS Neo vector which is one of the BPV based vectors, is a desirable vector that efficiently expresses foreign genes by transforming into COS7 cells and the like (Hajime Isayama “Bovine Papillomavirus Vector”, Masami Muramatsu and Hiroshi Okayama Human edition, experimental medicine separate volume: Handbook of genetic engineering, 1991, Yodosha (Japan), 297-299).
  • the vector includes control elements (for example, a promoter, an enhancer, a terminator, a polyadenylation site, a splicing site) necessary for expressing the antibody or a fragment thereof, or A selectable marker can be included if desired.
  • control elements for example, a promoter, an enhancer, a terminator, a polyadenylation site, a splicing site
  • a host cell containing a vector expressing an antibody or a fragment thereof can be produced in the culture supernatant or the host cell by culturing according to a conventional method. Specifically, when CHO cells are used as a host, inoculate the host cells into Gibco DMEM medium at 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and culture in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. By this, a culture supernatant containing the antibody can be obtained.
  • the host cell is Escherichia coli
  • it is inoculated and cultured in a general medium used for culturing Escherichia coli such as LB medium, and the expression of protein is induced to induce the expression of the protein.
  • a general medium used for culturing Escherichia coli such as LB medium
  • the antibody or fragment thereof as an expression product contains a constant region
  • purification and recovery from the culture supernatant or cell disruption solution using a protein A column, protein G column, anti-immunoglobulin antibody affinity column, etc. can do.
  • the expression is made only in the variable region and does not include the constant region, so other appropriate purification methods are applied.
  • a tag sequence advantageous for purification such as a histidine tag
  • it can be purified by affinity chromatography using the corresponding ligand.
  • tag fusion protein If it is not a tag fusion protein, it can be purified according to conventional protein purification methods such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, and hydroxyapatite chromatography.
  • a decomposition treatment is performed using an appropriate protease such as trypsin. Even after the degradation treatment, the antibody is difficult to be digested with trypsin, so that the antigen-antibody complex can be recovered using Protein G Sepharose or the like.
  • the recovered antigen-antibody complex is analyzed by LC-MS to bind to and protect the antibody. The epitope on human CXCL1 that the antibody recognizes, that is, the antibody can be identified.
  • the epitope on human CXCL1 recognized by the anti-human CXCL1 monoclonal antibody can be confirmed, for example, by a competition method using a synthetic peptide.
  • a synthetic peptide is prepared by a solid phase synthesis method or the like of 4 to 8 amino acids in the amino acid sequence constituting human CXCL1.
  • this synthetic peptide was allowed to act when the anti-human CXCL1 monoclonal antibody was reacted with solid phase human CXCL1, and the binding of the anti-human CXCL1 monoclonal antibody was inhibited. It can be determined that the amino acid sequence of the synthetic peptide is an epitope recognized by the anti-human CXCL1 monoclonal antibody.
  • Human CXCL1 Detection Method an immunological measurement method for human CXCL1 can be realized by using the thus obtained monoclonal antibody or a fragment thereof.
  • the measurement method of the present invention is excellent in specificity for human CXCL1, and can provide an ideal immunological measurement method for human CXCL1.
  • sample used in the measurement method of the present invention refers to various samples that can contain human CXCL1.
  • human CXCL1 is a cultured cell containing a DNA encoding human CXCL1 or a fragment thereof, a cultured cell lysate, a culture supernatant, or a human sample.
  • a human sample is a human-derived living body such as a tissue collected from a human (for example, a post-operatively collected tissue) or a body fluid such as blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, lymph, tears, semen, etc.
  • a sample preferably blood, serum, plasma or urine.
  • the sample in the present invention may be a solid sample as well as a liquid sample.
  • a tissue slice specimen or the like can be used. If the tissue section specimen is subjected to the human CXCL1 measurement method of the present invention, it is convenient because the presence or location of human CXCL1 can be observed in situ.
  • any one sequence region of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, which are partial sequences of the amino acid sequence constituting human CXCL1, is specifically recognized, and each different sequence region is specifically identified.
  • Anti-human CXCL1 that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 3 in combination of two or more, preferably two types of the above-mentioned anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibodies or fragments thereof It is characterized by being used in combination including a monoclonal antibody.
  • Combining anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibodies or fragments thereof, each of which recognizes a different amino acid sequence region of human CXCL1, contributes to improved detection sensitivity of human CXCL1.
  • the immunoassay of the present invention may be performed by a known immunoassay using a labeled antibody such as ELISA, EIA, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay or luminescence immunoassay, or surface plasmon resonance method.
  • SPR method and quartz crystal microbalance measurement method (QCM method) can be used, but it is preferably applied to immunological measurement methods using labeled antibodies.
  • the ELISA method is also called an enzyme immunosorbent assay, which uses an enzyme-labeled antibody or antigen for a very small amount of target antigen contained in a sample, and converts the antigen-antibody reaction to the coloring concentration or fluorescence using the action of the enzyme.
  • This is a method of detecting the intensity and quantifying the target antigen. That is, the antibody of the present invention or a fragment thereof, or human CXCL1 or a fragment thereof is immobilized on a solid phase carrier, and an immunological reaction with the antibody or the like, human CXCL1 or the like is enzymatically detected.
  • There are methods such as a direct method, an indirect method, and a sandwich method, and the present invention is applied to the sandwich method.
  • the solid phase carrier is made of a material such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics, or magnetic material.
  • Insoluble carriers in the form of beads, microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used. Immobilization of the antibody of the present invention or a fragment thereof or human CXCL1 or a fragment thereof on a solid phase carrier can be achieved by binding in accordance with a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination method thereof.
  • labeling substance examples include peroxidase (POD), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, amylase, biotin-avidin complex, etc.
  • POD peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • ⁇ -galactosidase urease
  • catalase glucose oxidase
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase
  • amylase biotin-avidin complex
  • fluorescein isothiocyanate tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine isothiocyanate, Alexa480 or AlexaFluor 488, etc.
  • tritium iodine 125 or iodine 131 Etc.
  • NADH-FMNH 2 -luciferase system for the luminescence immunoassay method, NADH-FMNH 2 -luciferase system, luminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system, or dioxetane compound system can be used.
  • the binding method between the labeled antigen and the antibody is a known method such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method or periodic acid method in the case of ELISA, and chloramine T method in the case of radioimmunoassay.
  • a known method such as the Bolton Hunter method can be used.
  • the immunological measurement method of the present invention is used for the production of immune complex aggregates such as immunoturbidimetric method, latex agglutination reaction, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination reaction or particle agglutination reaction.
  • Immunoturbidimetric method such as immunoturbidimetric method, latex agglutination reaction, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination reaction or particle agglutination reaction.
  • a phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good's buffer, or the like can be used as a solvent, and a reaction accelerator such as polyethylene glycol or a nonspecific reaction inhibitor may be included. Good.
  • the immunological measurement method of the present invention it is preferable to select and use two types from among the above-mentioned three types of anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibody or a fragment thereof.
  • a specific method will be described by taking as an example the case of using a monoclonal antibody that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1 and a monoclonal antibody that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 3.
  • the embodiment of the present invention is not limited to this.
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1 is immobilized on an insoluble carrier.
  • the antibody to be immobilized may be of one type or several types as long as it specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1.
  • a sample containing human CXCL1 is allowed to act on the immobilized surface of the antibody to form a complex of the immobilized antibody and human CXCL1 on the surface of the carrier. Thereafter, by sufficiently washing with a washing solution, unbound substances other than human CXCL1 present in the sample are removed.
  • a monoclonal antibody labeled body that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 3 is prepared, and the labeled antibody is allowed to act on a carrier to which a complex of the immobilized antibody and human CXCL1 is bound. After sufficiently washing with, human CXCL1 present in the sample can be detected by detecting using a label.
  • the labeled antibody may be one type or several types as long as it is a monoclonal antibody that specifically recognizes the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 3, but it is preferable to use two or more types, It is more preferable to use two types.
  • the antibody used for immobilization and the antibody used for labeling can also be used for labeling and immobilization, respectively.
  • a sample containing a labeled antibody and human CXCL1 can be mixed first to form an antigen-antibody complex and then allowed to act on the immobilized antibody. If the antibody to be immobilized is labeled with biotin, a biotinylated immobilized antibody, a sample containing human CXCL1, and an antibody with a label other than biotin are mixed together to form an antigen-antibody complex, and then avidin is immobilized on the solid phase. By acting on the immobilized carrier, the antigen-antibody complex can be detected using a label other than biotinylation.
  • the immunological measurement method of the present invention can use an immunochromatographic test strip.
  • the test strip for immunochromatography includes, for example, a sample receiving portion made of a material that easily absorbs a sample, a reagent portion containing a labeled diagnostic agent of the present invention, a developing portion in which a reaction product of the sample and the diagnostic agent moves, and development It consists of a presentation unit that captures and colors the reaction product.
  • Commercially available pregnancy diagnostic agents and the like have the same form.
  • the principle of this measurement method is as follows. First, when a sample is given to the sample receiving portion, the sample receiving portion absorbs the sample and causes the sample to reach the reagent portion.
  • the above-mentioned anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibody or a fragment thereof labeled with human CXCL1 in the sample in the reagent part undergoes an antigen-antibody reaction, and the formed reaction complex moves through the development part and reaches the presentation part. .
  • the reaction complex is captured by reacting with another type of anti-human CXCL1 partial sequence monoclonal antibody that recognizes a CXCL1 partial sequence different from the labeled monoclonal antibody. Coloration will be recognized.
  • the above immunochromatographic test strip is extremely invasive and does not pose any pain or danger to the use of reagents to the user.
  • this test strip can be mass-produced at a low cost by a manufacturing method as described in, for example, JP-A-10-54830.
  • the surface plasmon resonance phenomenon is a phenomenon in which the intensity of reflected light is significantly attenuated when a metal thin film is irradiated with laser light at a specific incident angle (resonance angle).
  • the SPR sensor using the principle of the SPR phenomenon can measure the adsorbate on the surface of the metal thin film with high sensitivity. Therefore, by preliminarily immobilizing antibodies and / or target antigens on the surface of the metal thin film and passing the sample over the surface of the metal thin film, adsorption on the metal surface before and after passing through the sample caused as a result of the antigen-antibody reaction. Differences in objects can be detected.
  • a substitution method, an indirect competition method, and the like are known, and any of them may be used. This technique is well known in the art. See, for example, Kazuhiro Nagata and Hiroshi Handa, real-time analysis of biological material interactions, Springer Fairlark Tokyo, Tokyo, 2000.
  • the measurement method of the present invention can use a quartz crystal microbalance measurement method (QCM method).
  • QCM method utilizes a phenomenon in which when a substance is adsorbed on the surface of an electrode attached to a crystal oscillator, the resonance frequency of the crystal oscillator decreases according to its mass.
  • the QCM sensor using this method is a mass measurement sensor that quantitatively captures a very small amount of adsorbed material based on the amount of change in the water resonance frequency.
  • This technique is well known in the art. For example, J. et al. Christopher Love, L. A. Estroff, J.M. K. Kriebel, R.A. G. Nuzzo, G.M. M.M.
  • Human CXCL1 Detection Kit The present invention can also be used as a kit for carrying out these immunological measurement methods. That is, the antibody or fragment thereof according to the present invention, the antibody, the fragment, a labeled secondary antibody, a substrate necessary for detection of the label, a positive control or a negative control, or a buffer used for dilution or washing of a sample Etc. can be combined into a kit.
  • Example 1 Preparation of recombinant human CXCL1 using E. coli (Preparation of human CXCL1 gene)
  • human CXCL1 mRNA was first prepared from HEK293 cells.
  • Qiasredder and RNeasy mini kit manufactured by Qiagen were used, and the details followed the attached protocol.
  • cDNA was synthesized using the obtained total mRNA as a template to prepare a human cDNA library.
  • the reverse transcription reaction followed the protocol attached to the enzyme.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 contains a part of the 5 'terminal region of the human CXCL1 gene and an NdeI recognition sequence upstream thereof.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 includes a part of the 3 'terminal region of the human CXCL1 gene and a BamHI recognition sequence downstream thereof.
  • the PCR reaction solution was prepared by using KOD (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a DNA polymerase according to the protocol attached to KOD so as to contain 10 ng of cDNA library and 10 pmol of each primer.
  • the reaction conditions were as follows: heating at 94 ° C. for 10 minutes, repeating 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute, and finally holding at 72 ° C. for 4 minutes Performed under conditions.
  • the amplified DNA fragment was purified using Quantum prep PCR Kleen Spin Columns (Bio-rad). By this reaction, a PCR product having a total length of about 300 bp was obtained.
  • a ligation reaction was performed to incorporate the obtained DNA fragment into a ring-opened pUC118 (Takara Bio Inc.) that had been subjected to HincII cleavage and BAP treatment.
  • Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used for DNA ligase, and the reaction followed the attached protocol.
  • competent cells were transformed with the solution after the ligation reaction.
  • Escherichia coli strain DH5 ⁇ manufactured by Takara Bio Inc.
  • the transformed bacteria were spread on an LB plate containing 100 ⁇ g / mL of antibiotic ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the obtained transformant was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, and the target pUC118_CXCL1 was obtained by miniprep.
  • pUC118_CXCL1 was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis. After electrophoresis, a fragment of about 300 bp confirmed by ultraviolet irradiation was excised from the gel, and the DNA fragment was extracted. Extraction was performed using PCR GFX Column (manufactured by GE Healthcare Bioscience). In order to incorporate the extracted DNA fragment into the expression vector pET16b (manufactured by Novagen) (about 6 kb fragment) cleaved with NdeI / BamHI, a ligation reaction was performed. Subsequently, DH5 ⁇ transformation using the solution after the ligation reaction, culturing of the transformant, and miniprep were performed to obtain the target pET16b_CXCL1. Each process followed the above-mentioned method.
  • pET16b_CXCL1 was used to transform Escherichia coli strain Rosetta-Gami 2 (Novagen). The obtained transformant was pre-cultured overnight at 37 ° C. in 30 mL of LB medium containing ampicillin and chloramphenicol. Next, 3 L of the same medium is inoculated with the preculture, cultured at 37 ° C. for 3 hours, added with IPTG having a final concentration of 1 mM, and cultured at 32 ° C. for 6 hours to obtain the target recombinant human CXCL1. After inducing expression, the cells were collected by centrifugation.
  • the obtained bacterial cells were washed with PBS, and then the insoluble fraction was prepared as a precipitate using B-PER (PIERCE). The details followed the attached protocol. Next, the insoluble fraction was solubilized with Inclusionbody solubilization reagent (manufactured by PIERCE), and histidine tag-fused human CXCL1 was adsorbed using TALON Metal Affinity Resin (manufactured by CLONETECH). The resin adsorbed with protein was washed with PBS containing 10 mM imidazole and then eluted with 1M imidazole solution.
  • Example 2 Production and selection of mouse monoclonal antibody against human CXCL1 (Production of anti-human CXCL1 antibody-producing mouse) 100 ⁇ L of the 0.3 mg / mL human CXCL1 solution obtained in Example 1 was mixed with 100 ⁇ L of MPL + TDM Emulsion (manufactured by Corixa), and the whole amount was intraperitoneally administered to 7-week-old BALB / c mice. The same amount of human CXCL1 solution prepared in the same manner was administered after 2 weeks and 4 weeks. Subsequently, 100 ⁇ L of blood was collected from the tail vein of the mouse and allowed to settle overnight, and then centrifuged at 5000 ⁇ g for 5 minutes to collect the supernatant as plasma.
  • the suspension was again suspended in RPMI 1640 medium, and the number of cells was counted to prepare an SP2 / 0 myeloma cell solution that was 1/10 the number of spleen cells. Both cell solutions were mixed, centrifuged at 2200 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were tapped to loosen, 1 mL of a solution prepared by mixing PEG (manufactured by ROCHE) and HBSS (manufactured by GIBCO) at a ratio of 5: 1 was added and stirred. In the subsequent work, unless otherwise specified, all solutions and culture media were kept warm at 37 ° C.
  • RPMI 1640 medium 9 mL was added over 5 minutes, mixed gently, and then centrifuged at 2200 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • the obtained precipitated cells are suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 15% FCS and HAT (manufactured by ROCHE), poured into a 96-well cell culture plate (manufactured by Greiner) at 200 ⁇ L per well, and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 Incubated for 1 week.
  • the colony grown under the HAT-added condition is judged as a hybridoma in which spleen cells and myeloma cells are fused, and the supernatant of the well in which the colonies are grown is diluted 5-fold, and 100 ⁇ L is added to the well of the human CXCL1 solid phase plate.
  • the presence or absence of antibody production was confirmed by the same method as described above.
  • Wells in which antibody production was confirmed were regarded as positive.
  • the positive well colonies were suspended in RPMI medium containing 15% FCS and HT (manufactured by Invitrogen), and positive clones were cloned by the limiting dilution method.
  • the antibody was produced by acclimation to SFM medium (GIBCO).
  • the hybridoma was inoculated to 60 mL of 100% SFM medium at 1 ⁇ 10 5 cells / mL and cultured for 10 days until the cells died, and then the culture was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to remove the cells. .
  • the antibody contained was purified using MabTrapKit (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the antigen solution was discarded and washed with PBS-T, and then 100 ⁇ L of 50 ⁇ g / mL biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody (manufactured by R & D SYSTEMS) was placed in the well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After discarding the solution in the well and washing with PBS-T, 100 ⁇ L of avidin-HRP solution (R & D SYSTEMS) was reacted at room temperature for 30 minutes. Further, the avidin-HRP solution was discarded, washed with PBS-T, and 100 ⁇ L of TMB solution was added and reacted for 15 minutes.
  • biotin-labeled anti-human CXCL1 polyclonal antibody manufactured by R & D SYSTEMS
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L of 2N sulfuric acid solution. Color development was confirmed by measuring absorbance at 450 nm. The purified antibody in the well having a strong color reaction was judged to be an antibody having high affinity for human CXCL1. As a result, five types of antibodies, IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1, were selected.
  • hybridomas producing each antibody were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 15% FCS at 37 ° C. under 5% CO 2 until 1 ⁇ 10 6 cells / mL. Thereafter, the culture solution was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the cells were collected. MRNA was prepared from the recovered hybridoma. For the preparation, Qiaredder and RNeasy mini kit (manufactured by Qiagen)) were used, and the details followed the attached protocol. Next, reverse transcriptase Superscript II (manufactured by Invitrogen)) was used to synthesize cDNA using the obtained total mRNA as a template and an Oligo dT primer to prepare a cDNA library.
  • PCR was performed using Mouse Ig Primer (manufactured by Novagen) using the cDNA library obtained for each hybridoma as a template, and the amplification product (mouse immunoglobulin variable region cDNA) was provided by ZERO BLUNT provided by Invitrogen.
  • Ligation was performed by inserting into the EcoRI site of PCR TOPO Vector.
  • Ligation used Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and followed the attached protocol. Competent cells were transformed using the ligation reaction solution. Competent cells were DH5 ⁇ (manufactured by Takara Bio Inc.), and the details were performed according to the attached protocol.
  • the bacteria after the transformation treatment were applied to LB plates containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • Four transformants from each amplification product were inoculated into LB liquid medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • LB liquid medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • four types of vector solutions each incorporating a DNA encoding a monoclonal antibody were obtained for each amplification product.
  • the obtained vector solution was subjected to DNA sequence analysis of the region encoding the monoclonal antibody using M13 primer.
  • the analysis was performed using a 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems).
  • a clone having no stop codon in the insertion region is judged as a DNA sequence encoding the target monoclonal antibody, and the light chain of the five antibodies (IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, IgG2b-1)
  • the DNA sequence of the heavy chain was determined.
  • the amino acid sequence encoded according to the codon usage of Escherichia coli was determined, and the sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 43 could be obtained.
  • SEQ ID NOs: 36 to 43 were obtained as amino acid sequences encoding IgG1-1. More particularly, SEQ ID NOs: 36, 37, and 38 encode the light chain CDR1, CDR2, and CDR3 of IgG1-1, respectively. SEQ ID NOs: 39, 40, and 41 encode the same heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 of IgG1-1, respectively. SEQ ID NOs: 42 and 43 encode the full length of the light chain variable region and the full length of the heavy chain variable region of IgG1-1, respectively.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 28 to 35 were obtained as amino acid sequences encoding IgG1-3. More specifically, SEQ ID NOs: 28 to 33 sequentially encode IgG1-3 light chain CDR1 to heavy chain CDR1 to CDR3. SEQ ID NOs: 34 and 35 encode the entire light chain variable region and heavy chain variable region of IgG1-3, respectively.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 11 were obtained as amino acid sequences encoding IgG1-10. More specifically, SEQ ID NOs: 4 to 9 sequentially encode IgG1-10 light chain CDR1 to heavy chain CDR1 to CDR3. SEQ ID NOs: 10 and 11 encode the entire light chain variable region and heavy chain variable region of IgG1-10, respectively.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 to 27 were obtained as amino acid sequences encoding IgG1-14. More specifically, SEQ ID NOs: 20 to 25 sequentially encode IgG1-14 light chain CDR1-3 and heavy chain CDR1-3. SEQ ID NOs: 26 and 27 encode the entire light chain variable region and heavy chain variable region of IgG1-14, respectively.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 to 19 were obtained as amino acid sequences encoding IgG2b-1. More specifically, SEQ ID NOs: 12 to 17 sequentially encode IgG2b-1 light chain CDR1 to heavy chain CDR1 to CDR3. SEQ ID NOs: 18 and 19 respectively encode the full length of the light chain variable region and the full length of the heavy chain variable region of IgG2b-1.
  • Example 3 Analysis of partial sequence of human CXCL1 recognized by selected antibody
  • Example 3 Analysis of partial sequence of human CXCL1 recognized by selected antibody
  • the epitope on the recognized amino acid sequence of human CXCL1 was analyzed.
  • DTT was added to 100 ⁇ L of 1 ⁇ g / ⁇ L human CXCL1 solution to a final concentration of 10 mM, reacted at 95 ° C. for 5 minutes to reduce disulfide bonds in CXCL1, and then iodine with a final concentration of 20 mM.
  • Acetamide was added, and thiol group alkylation reaction was carried out at 37 ° C. under light-shielding conditions for 30 minutes.
  • 20 ⁇ g of each of the antibodies selected in Example 2 was added to 12 ⁇ g of the resulting reduced alkylated human CXCL, and the volume was increased to 100 ⁇ L of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), followed by reaction at room temperature for 1 hour with stirring and mixing. I let you.
  • trypsin manufactured by Promega
  • aminopeptidase M manufactured by ROCHE
  • carboxypeptidase Y manufactured by ROCHE
  • the antigen-antibody complex was eluted with 100 ⁇ L of 0.1% formic acid, and Q-TOF Premier (manufactured by Waters-MicroMass) was used as the eluate. LC-MS analysis was performed using this. Analysis followed the protocol attached to the instrument.
  • Example 4 Detection of human CXCL1 by sandwich ELISA using monoclonal antibody IgG2b-1 and monoclonal antibody IgG1-10 From Example 3, it was found that the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1 was specifically recognized.
  • the human CXCL1 was measured by sandwich ELISA using the antibody IgG2b-1 and the biotin-labeled antibody IgG1-10, which was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3.
  • Biotinylation of IgG1-10 was performed using Sulfo-NHS Biotin (manufactured by PIERCE), and the details followed the attached protocol.
  • a 10 ⁇ g / mL PBS solution of IgG2b-1 was prepared, and then 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and immobilized overnight. On the next day, the solution was discarded, 200 ⁇ L of 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • Example 5 Detection of human CXCL1 by sandwich ELISA using monoclonal antibody IgG2b-1 and monoclonal antibody IgG1-14 From Example 3, it was found that the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1 was specifically recognized.
  • Human CXCL1 was measured by sandwich ELISA using the monoclonal antibody IgG2b-1 and the biotin-labeled monoclonal antibody IgG1-14, which was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3. .
  • IgG1-14 biotinylation and sandwich ELISA were performed in the same manner as in Example 4. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Detection of human CXCL1 by sandwich ELISA using monoclonal antibody IgG1-3 and monoclonal antibody IgG1-14 From Example 3, it was found that the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 2 was specifically recognized.
  • Human CXCL1 was measured by sandwich ELISA using the antibody IgG1-3 and the biotin-labeled antibody IgG1-14, which was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3.
  • IgG1-14 biotinylation and sandwich ELISA were performed in the same manner as in Example 4. The results are shown in FIG.
  • Human CXCL1 detection by sandwich ELISA method using a commercially available kit Recombinant human CXCL1 was measured using Human CXCL1 / GRO alpha DuoSet (manufactured by R & D SYSTEMS), which is a commercially available human CXCL1 detection kit.
  • the kit immobilizes an anti-human CXCL1 mouse monoclonal antibody (recognizing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2) and uses a biotinylated labeled goat polyclonal antibody for detection.
  • the solid phase was applied to a 96-well polystyrene plate manufactured by Greiner, and the detailed experimental procedure followed the attached protocol. The results are shown in FIG. 1, FIG. 4 and FIG.
  • Example 7 Detection of human CXCL1 by sandwich ELISA using a mixed solution of monoclonal antibody IgG2b-1 and monoclonal antibodies IgG1-10 and IgG1-14 From Example 3, the amino acid sequence region represented by SEQ ID NO: 1 Antibody IgG2b-1, which was found to specifically recognize, and biotin-labeled antibody IgG1-10, which was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3, or IgG-10 and IgG1- Human CXCL1 was measured by a sandwich ELISA method using a mixture of biotin-labeled compounds each labeled with 14 biotin. Antibody biotinylation and sandwich ELISA were performed as in Example 4. The result is shown in FIG.
  • the signal at each concentration is higher than that of one antibody at the same concentration. It was found that the measurement sensitivity of human CXCL1 was increased by using two types of labeled antibodies to be recognized rather than using one type.
  • Example 8 Detection of human CXCL1 added to urine by sandwich ELISA using monoclonal antibody IgG2b-1 and monoclonal antibody IgG1-10 or IgG1-14 From Example 3, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Antibody IgG2b-1, which was found to specifically recognize the region, and biotin-labeled antibody IgG1-10, which was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3, or IgG1-14 Human CXCL1 added to urine was measured by sandwich ELISA using a biotin-labeled product.
  • Biotinylation of IgG1-10 and IgG1-14 was performed using Sulfo-NHS Biotin (manufactured by PIERCE), and the details followed the attached protocol.
  • a 10 ⁇ g / mL PBS solution of IgG2b-1 was prepared, and then 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and immobilized overnight. The next day, the solution was discarded, 200 ⁇ L of 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • recombinant human CXCL1 was added to human urine collected on that day so that it would be 250 pg / mL, and 100 ⁇ L of antigen-added urine serially diluted with the human urine to 3.9 pg / mL was added to each well.
  • the reaction was performed at room temperature for 1 hour.
  • the antigen solution in the well was discarded and washed with PBS-T, and then 100 ⁇ L of 1 ⁇ g / mL biotin-labeled IgG1-10 diluted with 1% BSA-PBS was reacted at room temperature for 1 hour.
  • Example 9 Detection of human CXCL1 added to urine by sandwich ELISA using monoclonal antibody IgG1-3 and monoclonal antibody IgG1-14 From Example 3, the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 2 was specifically identified. Added to urine by sandwich ELISA using antibody IgG1-3 identified to be recognized and biotinylated antibody IgG1-14 identified to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3 The human CXCL1 was measured. Antibody biotinylation and sandwich ELISA were performed as in Example 8. The results are shown in FIG.
  • Example 10 Detection of CXCL1 by sandwich ELISA using a commercially available kit monoclonal antibody and monoclonal antibody IgG1-10 Commercially available kit that was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 2 in Example 3 Sandwich using a mouse monoclonal antibody attached to Human CXCL1 / GRO alpha DuoSet (manufactured by R & D SYSTEMS) and a biotin-labeled antibody IgG1-10 that was found to specifically recognize the amino acid sequence region shown in SEQ ID NO: 3. The human CXCL1 added to the buffer solution by ELISA was measured.
  • Biotinylation of IgG1-10 was performed using Sulfo-NHS Biotin (manufactured by PIERCE), and the details followed the attached protocol.
  • a 4 ⁇ g / mL PBS solution of a mouse monoclonal antibody attached to a commercially available kit was prepared, and then 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and solidified overnight. The next day, the solution was discarded, 200 ⁇ L of 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • 100 ⁇ L of an antigen solution serially diluted with 1% BSA-PBS from 500 pg / mL to 7.8 pg / mL of recombinant human CXCL1 was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the antigen solution in the well was discarded and washed with PBS-T, and then 100 ⁇ L of 1 ⁇ g / mL biotin-labeled IgG1-10 diluted with 1% BSA-PBS was reacted at room temperature for 1 hour.
  • Example 11 Detection of human CXCL1 by ELISA using the obtained antibody About the five types of antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, IgG2b-1 selected in Example 2, Each 10 ⁇ g / mL PBS solution was prepared, and 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and solidified overnight. The next day, the solution was discarded, 200 ⁇ L of 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 1% BSA-PBS solution manufactured by SIGMA
  • the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • 100 ⁇ L of an antigen solution obtained by serially diluting recombinant human CXCL1 protein from 125 pg / mL to 15 pg / mL with 1% BSA-PBS was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1 of the present invention all have strong signals compared to commercially available antibodies, and human CXCL1 It was found that the detectability of was high.
  • Example 12 Detection of human CXCL1 in plasma using the obtained antibodies Using the five types of antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1 selected in Example 2 Then, human CXCL1 dissolved in plasma was detected.
  • a 10 ⁇ g / mL PBS solution was prepared for each antibody, and then 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and solidified overnight. On the next day, the solution was discarded and 200 ⁇ L of 4% diluted 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • a plasma solution of 500 pg / mL recombinant human CXCL1 protein was prepared, and a dilution series of antigen plasma solution was prepared by serial dilution with the same plasma up to 125 pg / mL. 100 ⁇ L of this was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour, and then the antigen solution was discarded and washed with PBS-T.
  • Example 13 Detection of human CXCL1 in urine using the obtained antibody Using five types of antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1 selected in Example 2 Then, human CXCL1 dissolved in urine was detected.
  • a 10 ⁇ g / mL PBS solution was prepared for each antibody, and then 100 ⁇ L each was put into a well of a 96-well polystyrene plate (manufactured by Greiner) and solidified overnight. On the next day, the solution was discarded and 200 ⁇ L of 4% diluted 1% BSA-PBS solution (manufactured by SIGMA) was poured and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed with PBS-T to obtain a purified antibody-immobilized plate.
  • a urine solution of 500 pg / mL recombinant human CXCL1 protein was prepared, and a dilution series of antigen urine solution was prepared by serial dilution with the same urine up to 125 pg / mL. 100 ⁇ L of this was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour, and then the antigen solution was discarded and washed with PBS-T.
  • Example 14 Neutralization activity measurement experiment of invasive ability of bladder cancer cells using monoclonal antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, IgG2b-1 Five types selected in Example 2 The antibodies IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1 were measured for neutralizing activity to suppress the invasive ability of bladder cancer cells.
  • T24 cells which are bladder cancer cells, were inoculated into RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS and 12.5 mM HEPES at 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and precultured for 40 hours. After the culture, the cells were collected, and the invasive ability of the cell solution mixed with each antibody was measured using a Matrigel invasion chamber (BD Falcon). Details follow the attached protocol. In the Matrigel invasion chamber, each antibody was added to a PBS suspension of 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL so that the final concentration would be 10 ⁇ g / mL. Invasion culture was performed for 5 hours.
  • the lower part of the chamber was stained with a diffic reagent (manufactured by Sysmex), and the number of bladder cancer cells infiltrating to the lower part of the chamber was counted.
  • Example 15 Neutralization activity measurement experiment 2 of bladder cancer cells using monoclonal antibodies IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, IgG2b-1 Among the five types of antibodies selected in Example 2, four types of IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14, and IgG2b-1 were measured for neutralizing activity to suppress the invasive ability of bladder cancer cells. It was. Unlike Example 14, the antibody was mixed from the pre-culture stage, not immediately before the measurement of invasive ability.
  • T24 cells which are bladder cancer cells, were inoculated into RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS and 12.5 mM HEPES so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and each was adjusted to a final concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • the cells were cultured for 40 hours.
  • the cells were collected, and the invasive ability of the cell solution mixed with each antibody was measured using a Matrigel invasion chamber (BD Falcon). Thereafter, the same experiment as in Example 14 was performed, and only the infiltration culture time was changed to 6.5 hours. The number of infiltrated cells was also measured in the same manner as in Example 14, and the results are shown in FIG.
  • Comparative Example 6 Experiment 2 for measuring neutralizing activity of invasive ability of bladder cancer cells using a commercially available antibody With respect to MAB275 (manufactured by R & D SYSTEMS), which is a commercially available anti-human CXCL1 monoclonal antibody, the neutralizing activity for suppressing the invasive ability of bladder cancer cells was measured. Unlike Comparative Example 7, the antibody was mixed from the pre-culture stage, not just before the measurement of invasive ability. The method was the same as in Example 15. The results are shown in FIG.
  • the concentration of human CXCL1 can be measured with higher sensitivity than before, it can be used for detection of cancer such as urothelial cancer.

Abstract

　ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を高感度に検出することを課題とする。 　ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定するヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法及び、配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれか一つの配列領域を特異的に認識する新規なアミノ酸配列を持つモノクローナル抗体又はその断片を提供する。

Description

ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法
　本発明は、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質（以下、ヒトＣＸＣＬ１とする）を測定する方法に関する。より詳細には、ヒトＣＸＣＬ１を測定する方法であって、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列上の特定の３箇所の部分配列領域のいずれかに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を組み合わせた免疫学的測定方法に関する。また、本発明は前述のヒトＣＸＣＬ１タンパク質を測定する方法に用いることができる、ヒトＣＸＣＬ１に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片にも関する。
　ヒトＣＸＣＬ１は、ＣＸＣファミリーに属するケモカインの一種である。このタンパク質は、血中では血小板に存在しており、他のＣＸＣファミリーと同様に炎症反応時に過剰発現することが知られている。
　近年、このヒトＣＸＣＬ１が腫瘍関連因子として機能することが報告された。それ故、尿中から定量的に検出することにより尿路上皮癌のマーカーとなり得ることが期待されている（非特許文献１、特許文献１）。さらに、ヒトＣＸＣＬ１は、大腸癌や、卵巣癌、悪性黒色腫などその他の悪性腫瘍患者の組織や血中において、遺伝子レベル、タンパク質レベルで変動することが報告されており（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、尿路上皮癌のみならず、これらの癌を極早期及び／又は早期に検出し得る潜在性を秘めている。
　ところが、既存の酵素免疫学的測定法を用いた測定法では、前記癌を検出するには必要な感度が不足している。例えば、特許文献１に記載のＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社（以下Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社）製のヒトＣＸＣＬ１測定用キットは、その検出限界濃度が２０ｐｇ／ｍＬ前後であるのに対し、健常人尿中のヒトＣＸＣＬ１濃度はその検出限界に満たない。よって、より高感度なヒトＣＸＣＬ１の測定法が望まれていた。
ＷＯ２００７／０２６８９５
Ｈｉｒｏａｋｉ　Ｋａｗａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、２００８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．９、２５７９－２５８７ Ｇｏｎｇ　Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　２００６、　ＰＮＡＳ、　ｖｏｌ１０３巻、Ｎｏ．４４号、１６４７２－１６４７７ Ｙｕ　Ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１２巻、Ｎｏ．２０、５９５１－５９５９ Ｊｉｎｇ　Ｌｕａｎ　ｅｔ　ａｌ、１９９７、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ．６２、Ｎｏ．５、５８８－５９７
　そこで本発明の一の態様では、ヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する免疫学的測定法の提供を目的とする。より具体的には、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、特定の３箇所の配列のいずれかに特異的に結合する抗体又は抗原認識部分を組み合わせた免疫学的測定法により、ヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する方法を実現することを目的とする。
　また、本発明のもう一つの態様は、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片の提供も目的とする。より具体的には、前述のヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する方法に用いることが可能な、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識する新規なアミノ酸配列を含み、かつ従来の抗体より高親和性のモノクローナル抗体又はその断片の提供も目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、特定の３箇所の部分配列領域に特異的に結合するモノクローナル抗体又は抗原認識部分を組み合わせて免疫学的に測定することにより、従来よりも高感度にヒトＣＸＣＬ１を検出できることを見出した。また、前述のヒトＣＸＣＬ１上の３箇所の部分配列に特異的に結合する新規なアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体と、該抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功した。さらに、該抗体を構成するアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。これにより、組換え抗体とその組換え断片の作製が可能となった。本願発明は、上記知見に基づいて成されたものであり、すなわち以下を提供することである。
　（１）ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定することを特徴とする、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
　（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
　（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
　（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
　（５）前記試料が術後採取組織、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である（１）～（４）のいずれかに記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
　（６）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（７）軽鎖可変領域に配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、（６）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（８）配列番号１で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号１６示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（９）軽鎖可変領域に配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、（８）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１０）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１１）軽鎖可変領域に配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１２）配列番号２で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１３）軽鎖可変領域に配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、（１２）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１４）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　（１５）軽鎖可変領域に配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、（１４）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
　本発明によれば、ヒトＣＸＣＬ１の濃度を従来よりも高感度に測定することができる。また、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識する高親和性の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を提供することができる。
配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれかを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法と、市販キットを用いた従来法での免疫学的測定。 標識抗体として配列番号３で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ。 配列番号１、又は２で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた尿中ヒトＣＸＣＬ１を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ。 配列番号２で示されるアミノ酸配列を特異的に認識する市販抗体を固相化し、ビオチン化標識した配列番号３で示されるアミノ酸配列を認識する本発明の抗体、又は市販のビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、緩衝液中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。 本発明の５種類の抗体（ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１）、及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、緩衝液中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。 本発明の５種類の抗体及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、血漿中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。 本発明の５種類の抗体及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、尿中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。 本発明の５種類の抗体及び市販抗体の膀胱癌細胞浸潤抑制能を示したグラフ（１）。 本発明の4種類の抗体及び市販抗体の膀胱癌細胞浸潤抑制能を示したグラフ（２）。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　１．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体及びその断片
　本明細書で使用する用語「ヒトＣＸＣＬ１」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ　ＮＭ＿００１５１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその天然変異体を意味する。ここでいう「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するものなどをいう。ここで「同一性」とは、二つのアミノ酸配列にギャップを導入して、又は導入しないで最も高い一致度となるように整列（アラインメント）させたときに、前記ギャップの数を含めた、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。また、「数個」とは、２～１０の整数、例えば、２～７、２～５、２～４、２～３の整数をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体などが挙げられる。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するヒトＣＸＣＬ１と実質的に同等な構造又は性質を有しうるからである。保存的アミノ酸とは、互いに、非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）及び極性アミノ酸（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン））及び非荷電アミノ酸（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐状アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）などが知られている。
　本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、免疫グロブリン若しくはその断片に由来するフレームワーク領域（ＦＲ：Ｆｒａｍｅ　ｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）及び相補鎖決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を含み、抗原に特異的に結合し、かつそれを認識することのできるポリペプチドをいう。したがって、本発明の「抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体」とは、ヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片に特異的に結合し、かつヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片を認識できるポリペプチドをいう。「特異的に結合」とは、標的抗原（本発明においてはヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片）のみと結合することを意味する。
　典型的な免疫グロブリン分子は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる２本のポリペプチド鎖の組がジスルフィド結合によって２組相互接続された四量体として構成される。重鎖は、Ｎ末側の重鎖可変領域（ＶＨ）とＣ末側の重鎖定常領域（ＣＨ）からなり、軽鎖は、Ｎ末側の軽鎖可変領域（ＶＬ）とＣ末側の軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。このうち、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で特に重要である。このＶＨ及びＶＬは、いずれも約１１０個のアミノ酸残基から成り、その内部に抗原との結合特異性に直接関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、可変領域の骨格構造として機能する４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を有している。相補鎖決定領域は、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定することで知られている（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｖｏｌ．１、ｅｄｓ．５、ＮＩＨ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。定常領域のアミノ酸配列が種内抗体間ではほとんど不変なのに対して、相補鎖決定領域のアミノ酸配列は各抗体間において変異性が高く、それ故、超可変領域（Ｈｙｐｅｒ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれている。可変領域において、前記相補性決定領域とフレームワーク領域は、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。ＶＬ及びＶＨは、免疫グロブリン分子内において、相対して二量体を形成することによって抗原結合部位を形成している。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであっても良い。好ましくはＩｇＧである。
　本発明において有用な抗体は、鳥及び哺乳動物を含めたあらゆる動物源由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒトなどが挙げられる。また、本発明の「モノクローナル抗体」は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって合成したものであっても良い。例えば、キメラ抗体、及びヒト化抗体のような組換え抗体も本発明に含まれる。
　キメラ抗体とは、ある抗体の定常領域を他の抗体の定常領域で置換した抗体である。例えば、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体において、その定常領域をヒト抗体の定常領域と置き換えた抗体が該当する。より具体的な例として、ＶＬがそれぞれ配列番号１０、１８、２６、３４、又は４２のいずれかで示される抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体のＶＬにおけるアミノ酸配列を含み、かつＣＬが任意のヒト抗体のＣＬにおけるアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＨがそれぞれ配列番号１１、１９、２７、３５、又は４３のいずれかで示される抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体のＶＨにおけるアミノ酸配列を含み、かつＣＨが任意のヒト抗体のＣＨにおけるアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
　ヒト化抗体とは、ある抗体（通常、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体）由来のＣＤＲ群をヒト抗体のＦＲ及び定常領域とを人為的に組合せたモザイク抗体である。例えば、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体の各ＣＤＲと任意のヒト抗体の各ＦＲと定常領域とを組合せた抗体が該当する。抗体の抗原結合特異性は、主として可変領域中のＣＤＲ群が担っていることから、前記ある抗体と同様の結合特性を有する組換え抗体を作製する際には、ある抗体の全アミノ酸配列を得る必要はない。すなわち、既存の組換えＤＮＡ技術を用いて、ある抗体由来の各ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒト抗体由来の対応するＣＤＲをコードするＤＮＡ配列と置き換えたモザイク抗体を調製し、それを発現させることにより、ある抗体の性質を模倣する組換え抗体を得ることができる。このような技術は、ＣＤＲグラフト抗体と呼ばれている。Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、Ｖｏｌ．３２１、５２２。なお、本発明の抗ヒトＣＸＣＬ１抗体又はその断片は、ヒトＣＸＣＬ１又はその断片の検出に使用する場合には、必ずしもヒト化抗体である必要はなく、このグラフト抗体技術を用いて、ＦＲ及び定常領域がヒト以外の任意の動物の抗体由来のものとすることもできる。
　さらに、本発明において「抗体」は、多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、ＩｇＧのように２つの抗原結合部位を有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）が挙げられる。本発明においては、この多重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位がヒトＣＸＣＬ１上に存在する異なるエピトープと結合できることが好ましい。これらの抗体は、組換えＤＮＡ技術を用いて、公知方法によりＩｇＧ等を人工的に改変することにより得ることができる。
　本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体又はその断片」における「その断片」とは、前記抗体の部分領域であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、前述の抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも１つのＶＬと少なくとも１つのＶＨを有するポリペプチド鎖又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。Ｆａｂは、パパインによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＮ末端側で切断されることによって生じる断片であって、ＶＨ及びＣＨを構成する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）のうちＶＨに隣接するＣＨ１からなるポリペプチドと、軽鎖から構成される。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＣ末端側で切断されることによって生じるＦａｂ’の二量体である。Ｆａｂ’は、Ｆａｂよりもヒンジ部を含む分だけＨ鎖が若干長いが実質的にはＦａｂと同等の構造を有する（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ　ｅｄ．、３ｄ　ｅｄ．、１９９３）。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原（すなわち本発明においてはヒトＣＸＣＬ１又はその断片）と特異的に結合する能力を有している。
　本発明の前記「その断片」は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって合成したものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体断片が挙げられる。具体的には、限定はしないが、本発明の抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さ及び配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ　ｃａｔａｌｏｇ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４－１９９５、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ参照）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等の合成抗体等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、ＶＬ及びＶＨは、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Ｆｖは、これらの可変領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基本とした構造を有する分子である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８）。例えば、前記リンカーの長さが約１２アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Ｆｖ内の２つの可変部位は自己集合できないが、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、２つの一本鎖Ｆｖを相互作用させることにより、一方のＦｖ鎖のＶＬが他方のＦｖ鎖のＶＨと集合可能となり、２つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Ｍａｒｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、２００５、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２６：６４９－６５８）。さらに、一本鎖ＦｖのＣ末端にシステイン残基を付加させることにより、２本のＦｖ鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる（Ｏｌａｆｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、２００４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：２１－２７）。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していても構わない。例えば、一方の抗原結合部位が、配列番号３６、３７、３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＬと配列番号３９、４０、４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＨからなり、他方の抗原結合部位が、配列番号２８、２９、３０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＬと配列番号３１、３２、３３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＨからなっていてもよい。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
　さらに、前記「その断片」は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３４８、５２２－５５４参照）であって、かつ抗原結合能力を有しているものが含まれる。この他、例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ　Ｅｄ．、１９９８、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、も参照されたい。
　本発明は、ヒトＣＸＣＬ１に対する望ましい結合活性を備えた可変領域、及びそのＣＤＲを構成するアミノ酸配列を有する抗体又はその断片を提供する。すなわち、本発明は、配列番号４～４３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変領域を含む抗体又はその断片を提供する。
　本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号１０、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、１３、１４で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１５、１６、１７で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号１８、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２０、２１、２２で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２３、２４、２５で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号２６、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２８、２９、３０で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３１、３２、３３で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号３４、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３６、３７、３８で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３９、４０、４１で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号４２、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明の抗体又はその断片は、修飾することができる。ここでいう「修飾」は、本発明の抗体又はその断片がヒトＣＸＣＬ１との特異的結合活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体又はその断片を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。前記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン）による標識が挙げられる。また、本発明の抗体のグリコシル化は、標的抗原に対する抗体の親和性を調整するために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
　本発明の測定方法で使用されるモノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＣＸＣＬ１又はその断片に対する特異的な結合活性を確実にするため、使用前に予め他の抗原（タンパク質又はその断片）との交差反応性を検証しておくことが好ましい。本発明の抗体又はその断片において、交差性を確認すべき抗原は、ＣＸＣファミリーに属するタンパク質、特に、ヒトＣＸＣＬ１と構造的に類似するヒトＣＸＣＬ２タンパク質、ヒトＣＸＣＬ３タンパク質が挙げられる。また、前記タンパク質以外にも、部分構造がヒトＣＸＣＬ１と共通する他のタンパク質についても本発明の測定方法で使用される抗体又はその断片の交差反応性を確認しておくことがより好ましい。交差反応の確認には、ヒトＣＸＣＬ１を抗原としたＥＬＩＳＡ法を使うことが可能である。反応特異性を試験すべき抗体、すなわち、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体、及びその断片とヒトＣＸＣＬ１との反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原タンパク質を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
　２．モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
　Ａ．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体作製方法
　ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を作製するには、ヒトＣＸＣＬ１の全長を免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法と、予め配列番号１、２、又は３で示されるヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原としてモノクローナル抗体を作製する方法がある。
　Ａ１．ヒトＣＸＣＬ１の調製
　まず、免疫原（抗原）として用いるヒトＣＸＣＬ１を調製する。ヒトＣＸＣＬ１は、天然型、組換え型、又はペプチド合成のようにアミノ酸配列の全部又は一部を化学的に合成したヒトＣＸＣＬ１のいずれであってもよい。
天然型ヒトＣＸＣＬ１は、血液若しくは尿のようなヒト体液をはじめとするヒト試料、又はヒト培養細胞の培養上清から公知のタンパク質分離・精製技術、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いて回収することができる。
　組換え型ヒトＣＸＣＬ１は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した微生物、昆虫細胞、又は動物細胞で発現させた後、当該細胞から公知のタンパク質分離・精製技術を用いて回収することができる。
　合成ヒトＣＸＣＬ１は、例えば、公開ヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより合成することができる。なお、ヒトＣＸＣＬ１のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｘ１２５１０として公開されている。この合成ヒトＣＸＣＬ１には、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのキャリアータンパク質に連結させて使用してもよい。
　また、最初から配列番号１～３で示されるヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原とする場合も、免疫原は全長配列を免疫する場合と同様に、天然型であっても、組換え型であっても、又は化学的に合成したものであってもよい。
　例えば、天然型ヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原として用いる場合は、まず、精製したヒトＣＸＣＬ１をトリプシンなどの適切なプロテアーゼで処理した後、逆相カラムでピークを分離分取する。分取した各ピークに含まれるペプチドのアミノ酸配列を質量分析器により決定し、配列番号１、２、又は３で示される部分配列又はその一部であるピークを免疫原として用いることが出来る。
　また、組換え型ヒトＣＸＣＬ１のアミノ酸部分配列を免疫原として用いる場合は、前述したヒトＣＸＣＬ１をコードするＤＮＡ配列のうち、配列番号１～３で示されるアミノ酸部分配列、又はさらにその一部をコードするＤＮＡ配列部分を、全長ヒトＣＸＣＬ１を作製する場合と同様に発現用ベクターに挿入し、各種細胞に導入することで、配列番号１～３で示されるアミノ酸部分配列、又はその一部の組換え型ヒトＣＸＣＬ１を得ることが出来る。
　以下では、配列番号１～３で示される組換え型ヒトＣＸＣＬ１のアミノ酸部分配列（以下、ヒトＣＸＣＬ１部分配列という。）の調製について詳述する。
　（ａ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするポリヌクレオチドの調製
本ポリヌクレオチドの調製方法については、下記実施例１において詳述しているため、ここでは省略する。
　ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現に用いるベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ１６ｂ、ｐＧＥＸ６ｐ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。又はジとしては、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
　上記ベクターにヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするポリヌクレオチドを挿入するには、例えば、精製した該ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当な制限酵素で切断したベクター内部にＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法がある。
　（ｂ）ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターの宿主内への導入
得られたヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターを、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を発現し得る宿主中に導入して、ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現形質転換体を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ヒトＣＸＣＬ１を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母、昆虫細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．１６０、３３９３－３４０２）などが好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．　ｅｔ．ａｌ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ、１９８９、Ｖｏｌ．８６、６０７７）、（ＰＮＡＳ、１９８７、Ｖｏｌ．８４、７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３、Ｖｏｌ．５２、４５６－４６７）、ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
　細菌を宿主とする場合は、ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよい。
酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞を宿主とする場合にも、同様に当技術分野で公知の手法に従ってヒトＣＸＣＬ１部分配列発現形質転換体を得ることができる。真核細胞において用いられるヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターには、プロモーター配列、ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするＤＮＡ配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
　（ｃ）形質転換体の培養及び組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現
　続いて、上記作製した形質転換体を培養する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、微生物を宿主とする場合、培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、ＬＢ培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６～２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。形質転換体がＣＨＯ細胞等の動物細胞である場合には、Ｇｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　前記ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターがタンパク質発現制御システム（例えば、宿主が微生物の場合、リプレッサー遺伝子及びオペレーター等が該当する）を含むタンパク質発現誘導型ベクターである場合には、前記形質転換体に所定の処理を行い、ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現を誘導させる必要がある。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現制御システムは、ｌａｃリプレッサー遺伝子及びｌａｃオペレーターからなるシステムである。本システムは、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）処理により発現を誘導することが可能である。このシステムを含むヒトＣＸＣＬ１発現ベクターを有する形質転換体において、目的とするヒトＣＸＣＬ１を発現させるためには、培地中に適当量（例えば、終濃度１ｍＭ）のＩＰＴＧを添加すればよい。
　（ｄ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列の抽出及び／又は回収
　培養後、ヒトＣＸＣＬ１部分配列が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することによりタンパク質を抽出することができる。また、ヒトＣＸＣＬ１部分配列が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からヒトＣＸＣＬ１を単離精製することができる。ヒトＣＸＣＬ１部分配列が得られたか否かは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
　Ａ２． 抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列抗体の産生細胞の作製
　Ａ１で得られた免疫原を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
次に、前記調製した免疫原溶液を哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与し、免疫する。免疫原の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約３０～２００μｇである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１～４週間間隔で、２～６回、好ましくは３～４回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法等により行い、抗体価がプラトーに達すれば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２～５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
　Ｂ．抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ作製方法
　Ｂ１．免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウスなど由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６２－Ａｇ．８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１－Ａｇ４－１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳｐ２／０－Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）などが挙げられる。
　上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させるには、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１～２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤としては、平均分子量１，５００～４，０００Ｄａのポリエチレングリコール等を約１０～８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ、１９７７、Ｖｏｌ．２６６、５５０－５５２）。
　Ｂ２．目的とするハイブリドーマの選抜
　細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に２×１０６個／ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は２０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
　ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマは、まず、天然型又は組換え型ヒトＣＸＣＬ１、又は配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでヒトＣＸＣＬ１への結合活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマについては、交差性の試験を行う。すなわち、他のＣＸＣファミリー等への結合活性を検証し、許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナル強度が、バックグラウンドレベルから特異的反応によるシグナル強度の１％未満に抑えられれば、事実上交差反応しないということができる。
　ヒトＣＸＣＬ１への反応性や、他のＣＸＣファミリーとの交差反応性を確認するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。ＥＬＩＳＡ法では、抗原となるヒトＣＸＣＬ１又はその断片を固相化したマイクロプレートを用意し、これに前記ハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウェルを洗浄し、免疫グロブリンに対する２次抗体の標識体を加えて更に反応させる。再度ウェルを洗浄し、最終的にウェルに結合した２次抗体の標識を利用して測定すれば、培養上清中に存在する抗体の、抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。
　Ｂ３．ハイブリドーマを用いた抗体産生
　本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、ハイブリドーマを作製する際に用いた融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、Ｓｐ／０細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後１０日間を経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
　また、本発明におけるハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、Ｇｉｂｃｏ社製のハイブリドーマＳＦＭ培地中に１×１０５細胞／ｍＬとなるようにハイブリドーマを接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来るが、この限りではない。
　３．組換え抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体の作製方法
本発明の抗体又はその断片は、本発明で開示されたヒトＣＸＣＬ１部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を利用して、組換えＤＮＡ操作によって得ることもできる。
　例えば、Ｂ２．の手法で取得した抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の該抗体の可変領域をコードするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、ＶＨ及びＶＬの塩基配列を任意のＣＬ、及びＣＨをコードする塩基配列にそれぞれ連結し、それぞれのポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させることもできる。また、ＣＤＲグラフト抗体技術を用いて、Ｂ２．の手法で取得した可変領域内のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、任意の免疫グロブリンの各ＦＲをコードするポリヌクレオチドを連結して適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させてもよい。各ポリヌクレオチドは、化学的に合成することもできるし、長鎖ＤＮＡの合成法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７　植物ＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５－１００）を採用することもできる。また、本発明で開示したＣＤＲはもともとマウスのイムノグロブリンに由来するので、連結するＣＬ、ＣＨ、及びＦＲ領域の配列はマウス由来が好適であるが、ヒトなど他の任意の動物由来であってもよい。このとき重鎖と軽鎖とが同一宿主細胞内で発現し、重鎖／軽鎖からなる２量体として産生できるようにすると便利である。具体的には、例えば、軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることもできる。又は、上記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそのまま適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、免疫グロブリン分子の断片として発現させることもできる。あるいは、上述したように、前記アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨ、又は軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適当なリンカーで連結してファージに組み込んだ一本鎖Ｆｖとして、又はダイアボディ等の合成抗体断片として発現させてもよい。その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体をファージ表面に発現させるファージディスプレイ抗体技術（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、１９９５、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１－５０、国際公開ＷＯ９７／１３８４４号、同９０－０２８０９号）により、人工的に重鎖、軽鎖をコードする遺伝子をシャッフリングさせ多様化した一本鎖Ｆｖ抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。
　組換え抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの調製、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターの宿主導入法については、上記「Ａ．ヒトＣＸＣＬ１抗体作製方法」に記載したような当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて行えばよい。目的とする組換え抗ヒトＣＸＣＬ１抗体又はその断片は、形質転換細胞の培養液中又は当該細胞内から得ることができる。
　免疫グロブリン発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、ＳＶ４０　ｖｉｒｕｓ　ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ　ｖｉｒｕｓ　ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ　ｂａｓｅｄベクター）等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＶ　ｂａｓｅｄベクターの１種であるＢＣＭＧＳ　Ｎｅｏベクターは、ＣＯＳ７細胞などに形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」、村松正実及び岡山博人編、実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック、１９９１、羊土社（日本）、２９７－２９９）。
　前記ベクターは、抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの他に、前記抗体又はその断片を発現する上で必要な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、スプライシング部位）、又は、必要であれば選択マーカーを含むことができる。
　形質転換の宿主としては、上記「Ａ．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体作製方法」に記載した宿主の他、Ｓｐ２／０（マウスミエローマ）細胞（Ｅｕｒｏｐｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓａｒｃｈ　Ｐｒｅｖｉｅｗ（１９９６）　Ｖｏｌ．５、５１２－５１９；Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓａｒｃｈ（１９９０）Ｖｏｌ．５０、１４９５－１５０２）が好適に用いられる。
　本発明における、抗体又はその断片を発現するベクターを含有する宿主細胞は、常法に従って培養を行うことにより、その培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。具体的には、ＣＨＯ細胞を宿主とした場合にはＧｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来る。また、例えば宿主細胞を大腸菌とした場合には、ＬＢ培地など大腸菌の培養に用いられる一般的な培地に接種して培養し、タンパク質の発現を誘導することにより、培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。
　なお、発現産物である抗体又はその断片が定常領域を含む場合には、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて培養液上清や、細胞破砕液から精製・回収することができる。一方、可変領域のみで構成され、定常領域を含まない状態で発現させた場合には、前記精製方法は適用できないので、他の適当な精製方法を応用する。例えば、そのＣ末端にヒスチジンタグなどの精製に有利なタグ配列を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが可能である。タグ融合タンパク質ではない場合は、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったタンパク質精製の常法に従って精製することができる。
　４．得られた抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープの確認
　得られた抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープは、次のような方法によって確認することもできる。
　まず、還元アルキル化したヒトＣＸＣＬ１と、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を反応させて抗原抗体複合体を形成させた後、トリプシンなどの適切なプロテアーゼを用いて分解処理を行う。分解処理を受けても、抗体はトリプシン消化されにくいため、ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース等を用いて抗原抗体複合体を回収することができる。この際、抗原はプロテアーゼ処理により、抗体と結合して保護された部分以外は消化されているため、回収された抗原抗体複合体を、ＬＣ－ＭＳにより分析することで、抗体と結合して保護された部分、すなわち抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープを同定することが出来る。
　また、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープは、例えば、合成ペプチドを用いた競合法によっても確認することが出来る。まず、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち４～８アミノ酸ずつの固相合成法等により合成ペプチドを調製する。前述のＥＬＩＳＡ法を利用したヒトＣＸＣＬ１に対する結合性を確認する実験において、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を固相ヒトＣＸＣＬ１と反応させる際にこの合成ペプチドを作用させ、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の結合が阻害されることが確認されれば、当該合成ペプチドのアミノ酸配列が抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の認識するエピトープであると判断できる。
　５．ヒトＣＸＣＬ１検出方法
　本発明では、このようにして得られたモノクローナル抗体、あるいはその断片を用いることにより、ヒトＣＸＣＬ１の免疫学的測定方法を実現できる。本発明の測定方法はヒトＣＸＣＬ１に対する特異性に優れ、ヒトＣＸＣＬ１の理想的な免疫学的測定方法を提供することができる。
　本発明の測定方法で使用する「試料」とは、ヒトＣＸＣＬ１を含み得る様々な試料をいう。例えば、ヒトＣＸＣＬ１をコードするＤＮＡ又はその断片を含む培養細胞、培養細胞破砕液、培養液上清、あるいはヒト試料である。ヒト試料とは、ヒトから採取される組織（例えば、術後採取組織）や、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液、精液等の体液等のあらゆるヒト由来の生体試料であり、好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。また、本発明における試料は、液体試料のみならず固体試料であっても良い。たとえば、組織切片標本等を用いることができる。組織切片標本に本発明のヒトＣＸＣＬ１測定方法を行えば、ｉｎ　ｓｉｔｕでヒトＣＸＣＬ１の有無や局在を観察することができるので便利である。
　本発明においては、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ互いに異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の、好ましくは２種類の前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片を組み合わせて、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を含む組み合わせで使用することを特徴としている。それぞれがヒトＣＸＣＬ１の異なるアミノ酸配列領域を認識する抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片を組合せることで、ヒトＣＸＣＬ１の検出感度の向上に寄与する。
　本発明の免疫学的測定は、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた公知の免疫学的測定法、あるいは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）により実施することができるが、標識抗体を用いた免疫学的測定法において好ましく適用される。
　ＥＬＩＳＡ法は、酵素免疫吸着分析法とも呼ばれ、試料中に含まれる微量の標的抗原を、酵素標識した抗体又は抗原を用いて、当該酵素の作用を利用して抗原抗体反応を発色濃度や蛍光強度として検出し、標的抗原を定量する方法である。すなわち、本発明の抗体若しくはその断片、又はヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片を固相担体に固定して、当該抗体等及びヒトＣＸＣＬ１等との免疫学的反応を酵素的に検出する方法である。直接法、間接法、サンドイッチ法等の方法があり、本発明はサンドイッチ法に適用される。ＥＬＩＳＡ法の測定方法については、公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」、臨床病理刊行会、１９８３年、石川榮治ら編「酵素免疫測定法」、第３版、医学書院、１９８７年、北川常廣ら編「タンパク質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１酵素免疫測定法」、共立出版、１９８７年、入江實編「ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７４年、入江實編「続ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７９年）を参照されたい。前記固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明の抗体若しくはその断片又はヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片の固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより達成できる。
　前記標識物質としては、例えばＥＬＩＳＡ法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン－アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ４８０又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができるが、この限りでない。
　また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ－ＦＭＮＨ２－ルシフェラーゼ系、ルミノール－過酸化水素－ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。標識抗原と抗体との結合法は、ＥＬＩＳＡ法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
　さらに、本発明の免疫学的測定方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施することもできる。その場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
　本発明の免疫学的測定方法では、前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片の３種類の中から２種類を選択して使用することが好ましい。具体的方法について、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いる場合を例に挙げて述べるが、本発明の実施の態様はこの限りでない。
　例えば、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法に適用する場合は、まず配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を不溶性の担体に固相化する。固相化する抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するものであれば、１種類であっても数種類であっても良い。次に、抗体の固相化表面に、ヒトＣＸＣＬ１を含む試料を作用させ、固相化抗体とヒトＣＸＣＬ１の複合体を担体の表面に形成させる。その後、洗浄液を用いて十分に洗浄することで、試料中に存在するヒトＣＸＣＬ１以外の未結合の物質が除去される。さらに、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の標識体を作製し、該標識抗体を、固相化抗体とヒトＣＸＣＬ１の複合体が結合した担体に作用させ、洗浄液を用いて十分に洗浄した後、標識を利用して検出することで試料中に存在したヒトＣＸＣＬ１を検出することができる。この際、標識抗体は配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体であれば、１種類であっても数種類であってもよいが、２種類以上使用することが好ましく、２種類使用することがより好ましい。また、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の由来する動物種が異なる場合は、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を標識しなくても、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗体を認識する標識二次抗体を使用して、検出することもできる。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた場合についても上記と同様である。また、固相化に用いた抗体と標識に用いた抗体は、それぞれ逆に、標識と固相化に用いることも可能である。
　また、先に標識抗体とヒトＣＸＣＬ１を含む試料を混合して抗原抗体複合体を形成した後、固相化抗体に作用させることもできる。固相化する抗体をビオチン標識すれば、ビオチン化固相化抗体、ヒトＣＸＣＬ１を含む試料、ビオチン以外の標識を施した抗体を全て混合して抗原抗体複合体を形成した後、アビジンを固相化した担体に作用させることで、ビオチン化以外の標識を利用して抗原抗体複合体を検出することができる。
　さらに、本発明の免疫学的測定方法は、免疫クロマト用テストストリップを用いることもできる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、標識した本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を捕捉して呈色する提示部などから構成される。市販の妊娠診断薬等がこれと同様の形態を有する。本測定方法の原理は、以下の通りである。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は、試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において試料中のヒトＣＸＣＬ１と標識した前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片が抗原抗体反応し、形成された反応複合体が展開部を移動して提示部に到達する。提示部では、上記反応複合体と標識されたモノクローナル抗体とは別のＣＸＣＬ１部分配列を認識するもう１種類の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体との反応が生じて捕捉され、反応複合体の標識による呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、侵襲性がきわめて低く、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストストリップは、例えば特開平１０－５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できるものである。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いる場合を例に挙げて説明すると、まず、試料受容部にヒトＣＸＣＬ１を含む試料を与えると、試料受容部は該試料を吸収して該試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の尿路上皮癌細胞由来のヒトＣＸＣＬ１と標識された本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体との反応が起こり、反応した複合体が展開部を移動して提示部に到達する。提示部においては、上記反応複合体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体との反応が起こって、呈色が認められることになる。
　また、本発明の測定方法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いることもできる。表面プラズモン共鳴現象とは、金属薄膜に特定の入射角度（共鳴角）でレーザー光を照射すると反射光強度が著しく減衰する現象をいう。ＳＰＲ現象の原理を利用したＳＰＲセンサは、金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。したがって、該金属薄膜表面上に予め抗体及び／又は標的抗原を固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させることにより、抗原抗体反応の結果生じた試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することができる。置換法、間接競合法等が知られるが、いずれを用いてもよい。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏、生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京、東京、２０００を参照されたい。
　さらに、本発明の測定方法は、水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）を用いることもできる。この方法は、晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用するものである。該方法を用いたＱＣＭセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定センサである。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｌｏｖｅ、Ｌ．Ａ．Ｅｓｔｒｏｆｆ、Ｊ．Ｋ．Ｋｒｉｅｂｅｌ、Ｒ．Ｇ．Ｎｕｚｚｏ、Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、２００５、Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ　ｏｆ　ａ　Ｆｏｒｍ　ｏｆ　Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ、１０５：１１０３－１１６９；森泉豊榮、中本高道、１９９７、センサ工学、昭晃堂、等を参照されたい。
　６．ヒトＣＸＣＬ１検出キット
　また、本発明は、これら免疫学的な測定方法を実施するためのキットとして使用することができる。すなわち、本発明による抗体やその断片をはじめとして、該抗体や該断片、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組合せてキットとすることができる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
　（実施例１）　大腸菌による組換え型ヒトＣＸＣＬ１の調製
　（ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の調製）
　抗体の免疫原として用いる組換え型ヒトＣＸＣＬ１を調製するために、まず、ＨＥＫ２９３細胞より、ヒトＣＸＣＬ１ ｍＲＮＡの調製を行った。ｍＲＮＡの調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。
　次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、得られたトータルｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを作製した。逆転写反応は、前記酵素に付属のプロトコールに従った。
　続いて、得られたヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、配列番号４４及び４５に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。配列番号４４で示した塩基配列は、ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の５’末端領域の一部とその上流側にＮｄｅＩ認識配列を含む。配列番号４５で示した塩基配列は、ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の３’末端領域の一部とその下流側にＢａｍＨＩ認識配列を含む。ＰＣＲの反応液は、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリー１０ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを含むようにＫＯＤに添付のプロトコールに従い調製した。反応条件は、９４℃の温度で１０分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間保つサイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、Ｑｕａｎｔｕｍ　ｐｒｅｐ　ＰＣＲ　Ｋｌｅｅｎ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いて精製した。この反応により全長約３００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。
　得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｃＩＩ切断及びＢＡＰ処理した開環ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）内に組み込むためライゲーション反応を行った。ＤＮＡリガーゼにはＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。形質転換処理後の菌は、抗生物質アンピシリンを１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とするｐＵＣ１１８＿ＣＸＣＬ１を得た。
　次に、ｐＵＣ１１８＿ＣＸＣＬ１を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、反応溶液のアガロース電気泳動を行った。泳動後、紫外線照射によって確認した約３００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ断片の抽出を行った。抽出はＰＣＲ　ＧＦＸ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。抽出したＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩによる切断処理した発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（約６ｋｂ断片）内に組み込むため、ライゲーション反応を行った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いたＤＨ５αの形質転換、形質転換体の培養、及びミニプレップを行い、目的とするｐＥＴ１６ｂ＿ＣＸＣＬ１を得た。それぞれの工程は前述の方法に従った。
（組換え型ヒトＣＸＣＬ１の調製）
　組換え型ヒトＣＸＣＬ１を調製するために、ｐＥＴ１６ｂ＿ＣＸＣＬ１を用いて、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ－Ｇａｍｉ　２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の形質転換を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３０ｍＬで３７℃にて一晩前培養を行った。次に、３Ｌの同培地に前培養を接種し、３７℃にて３時間培養し、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して３２℃にて６時間培養を行い、目的の組換え型ヒトＣＸＣＬ１の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。
　得られた菌体をＰＢＳにて洗浄した後、Ｂ－ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて不溶性画分を沈殿として調製した。詳細は付属のプロトコールに従った。次に不溶性画分をＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて可溶化した後、ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いてヒスチジンタグ融合ヒトＣＸＣＬ１を吸着させた。タンパク質の吸着したレジンを、１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳにて洗浄した後、１Ｍイミダゾール溶液を用いて溶出した。
　次に得られた溶出画分から、タンパク質のリフォールディングを行った。まず、６Ｍ　Ｕｒｅａを加えたＰＢＳ溶液に一晩透析した後、透析液中のＵｒｅａの終濃度が１ＭになるまでＰＢＳを透析液に段階的に添加して、希釈した。最後に新たに調製したＰＢＳ溶液に一晩透析し、得られたリフォールディング溶液についてアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー染色により分子量約１０、０００Ｄａのヒスチジンタグ融合ヒトＣＸＣＬ１の精製を確認した。
　（実施例２）　ヒトＣＸＣＬ１に対するマウスモノクローナル抗体の作製と選抜
　（抗ヒトＣＸＣＬ１抗体産生マウスの作製）
　実施例１で得られた１００μＬの０．３ｍｇ／ｍＬヒトＣＸＣＬ１溶液を１００μＬのＭＰＬ＋ＴＤＭ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｃｏｒｉｘａ社製）と混合し、全量を７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。２週間後、及び４週間後に同様に調製したヒトＣＸＣＬ１溶液を同量投与した。続いて、マウス尾部静脈より血液を１００μＬ採取し、一晩清置した後、５０００×ｇで５分遠心して上清を血漿として回収した。
　９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬの１μｇ／ｍＬ　ヒトＣＸＣＬ１溶液を入れ、一晩固相化した。ウェル中のタンパク溶液を廃棄後、４倍に希釈したＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液（大日本住友製薬社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートとした。上記で得られた血漿を１００倍希釈し、前記ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートのウェルに１００μＬ入れ、室温で１時間静置した。その後、ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ溶液（Ｄａｋｏ社製）を１００μＬ入れ、さらに室温で１時間静置した。ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた。反応によって生じる発色を４５０ｎｍの吸光度で確認し、発色した血液試料中において、ヒトＣＸＣＬ１に対する抗体が産生されていると判断した。
　（抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の作製）
　ヒトＣＸＣＬ１に対する抗体の産生が確認されたマウスについて、上記と同様に調製したヒトＣＸＣＬ１溶液を腹腔投与し、３日後に脾臓の摘出を行った。摘出した脾臓にシリンジで穴を開け、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）を注入して脾臓細胞を押し出し、脾臓細胞液を得た。得られた脾臓細胞液を１２００ｒｐｍで７分間遠心した後に上清を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した。再びＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して細胞数をカウントし、脾臓細胞数の１／１０量のＳＰ２／０ミエローマ細胞液を調製した。両細胞液を混合し、２２００ｒｐｍで１０分遠心し、上清を廃棄した。細胞をタッピングしてほぐし、ＰＥＧ（ＲＯＣＨＥ社製）とＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を５：１で混合した溶液を１ｍＬ添加して攪拌した。以降の作業では、特に断りがない限り、溶液や培地は全て３７℃で保温したものを用いた。
　ＰＥＧとＨＢＳＳを加えた細胞溶液に、ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍＬを５分かけて添加し、ゆっくり混合した後、２２００ｒｐｍで１０分遠心し、上清を除去した。得られた沈殿細胞を、１５％ＦＣＳとＨＡＴ（ＲＯＣＨＥ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（グライナー社製）に１ウェルあたり２００μＬ注ぎ、３７℃、５％ＣＯ２下で１週間培養した。
　ＨＡＴ添加条件下で生育したコロニーを脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマと判断し、コロニーの生育しているウェルの上清を５倍希釈して、前記ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートのウェルに１００μＬ添加し、前記と同様の方法で抗体産生の有無を確認した。抗体の産生が確認できたウェルを陽性とした。陽性ウェルのコロニーを１５％ＦＣＳとＨＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ培地に懸濁し、限界希釈法によって陽性クローンのクローニングを行った。クローニングの結果得られたハイブリドーマ７５種類について、ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に馴化し、抗体の産生を行った。１００％ＳＦＭ培地６０ｍＬにハイブリドーマを１×１０５細胞／ｍＬになるように接種し、細胞が死滅するまで１０日間培養を行った後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた培養上清について、ＭａｂＴｒａｐＫｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて含まれている抗体を精製した。
　（抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の選抜）
　前記７５種類の精製抗体について、次のような手法でヒトＣＸＣＬ１と親和性の高い抗体を選抜した。まず、それぞれの精製抗体について１０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、４倍に希釈したＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液（大日本住友製薬社製）を２００μＬ注ぎ、１時間、室温で静置した。その後、溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄したものを精製抗体固相化プレートとした。次に、組換え型ヒトＣＸＣＬ１を１０００ｐｇ／ｍＬから１５ｐｇ／ｍＬまで段階希釈した抗原溶液を前記精製抗体固相化プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間、室温で反応させた。続いて、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、１００μＬの５０μｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）をウェルに入れ、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を３０分間室温で反応させた。さらに、ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認した。発色反応が強かったウェルの精製抗体をヒトＣＸＣＬ１との親和性が高い抗体と判断した。この結果、ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１の５種類の抗体を選抜した。
　（ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定）
　選抜した５種類の抗体について、軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を決定した。まず、それぞれの抗体を産生するハイブリドーマを、１５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で１×１０６細胞／ｍＬになるまで培養した。その後、培養液を１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、細胞を回収した。回収したハイブリドーマよりｍＲＮＡを調製した。調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｚｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製））を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））を用いて、得られたＴｏｔａｌ　ｍＲＮＡを鋳型にＯｌｉｇｏ　ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
　次に、各ハイブリドーマごとに得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の提供するＺＥＲＯ　ＢＬＵＮＴ　ＰＣＲ　ＴＯＰＯ　ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩサイトに挿入してライゲーションを行った。ライゲーションはＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、付属のプロトコールに従った。ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。形質転換処理後の菌は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。各増幅産物由来の形質転換体を４クローンずつ１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養した。各培養液からミニプレップによってベクターＤＮＡ溶液を調製した結果、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを組み込んだベクター溶液を各増幅産物につき４種類ずつ得た。
　得られたベクター溶液について、Ｍ１３プライマーを用いて、モノクローナル抗体をコードする領域のＤＮＡ配列解析を行った。解析は、３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。挿入領域に停止コドンのないクローンを目的のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ配列として判断し、前記５つの抗体（ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１）の軽鎖、重鎖のＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列について、大腸菌のコドン使用頻度にしたがってコードするアミノ酸配列を決定し、配列番号４～４３に示す配列を得ることができた。
　配列番号３６～４３に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１－１をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号３６、３７、３８はそれぞれＩｇＧ１－１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードする。また、配列番号３９、４０、４１はそれぞれ、同じＩｇＧ１－１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードする。また、配列番号４２、４３はそれぞれＩｇＧ１－１の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。
　配列番号２８～３５に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１－３をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２８～３３は、順にＩｇＧ１－３の軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＣＤＲ１～３をコードする。また、配列番号３４、３５はそれぞれＩｇＧ１－３の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。
　配列番号４～１１に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１－１０をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号４～９は、順にＩｇＧ１－１０の軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＣＤＲ１～３をコードする。配列番号１０、１１はそれぞれＩｇＧ１－１０の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。
　配列番号２０～２７に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１－１４をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２０～２５は、順にＩｇＧ１－１４の軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＣＤＲ１～３をコードする。配列番号２６、２７はそれぞれＩｇＧ１－１４の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。
　配列番号１２～１９に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ２ｂ－１をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号１２～１７は、順にＩｇＧ２ｂ－１の軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＣＤＲ１～３をコードする。配列番号１８、１９はそれぞれＩｇＧ２ｂ－１の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。
　（実施例３）　選抜した抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列の解析
　実施例２にて選抜した５つの抗体について、認識するヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。
　まず、１μｇ／μＬヒトＣＸＣＬ１溶液１００μＬに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴを添加し、９５℃、５分間反応させてＣＸＣＬ１内のジスルフィド結合の還元を行い、次に、終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミドを添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ヒトＣＸＣＬ１２μｇに、実施例２にて選抜した抗体をそれぞれ２０μｇ添加し、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬにメスアップして攪拌混合しながら室温で１時間反応させた。
　次に、トリプシン（プロメガ社製）、アミノペプチダーゼＭ（ＲＯＣＨＥ社製）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＲＯＣＨＥ社製）を、それぞれ終濃度０．２μｇ、０．５μＵ、０．０２μｇとなるように添加し、３７℃で２時間以上反応させた後、予め１％ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングしＰＢＳで洗浄しておいたＰｒｏｔｅｉｎＡ－ガラスビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）とＮＰ－４０緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０）中で混合し、４℃で３０分間反応させた。
　反応液を２５ｍＭ　炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％ギ酸　１００μＬを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ－ＴＯＦ　Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ－ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ－ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコールに従った。
　その結果、実施例２で得られた各抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列が判明したので表１に示す。
　（参考例１）　市販抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列の解析
　市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）に固相化用抗体として添付されているモノクローナル抗体について、実施例３と同様に認識するヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。
　その結果、市販抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列が判明したので表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例４）　モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ－１とモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１０を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１０のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１－１０のビオチン化はＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ　Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、ＩｇＧ２ｂ－１の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を５００ｐｇ／ｍＬ～７．８ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１－１０　１００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。
　（実施例５）　モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ－１とモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１－１４のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。結果を図１に示す。
　（実施例６）　モノクローナル抗体ＩｇＧ１－３とモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－３と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１－１４のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。結果を図１に示す。
　（比較例１）　市販キットを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１検出
　市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて組換え型ヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。当該キットは、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体（配列番号２で示されるアミノ酸配列を認識する。）を固相化し、検出はビオチン化標識ヤギポリクローナル抗体を用いるものである。固相化は、グライナー社製の９６ウェルポリスチレンプレートに行い、詳細な実験操作は付属のプロトコールに従った。結果を図１、図４及び図５に示す。
　実施例４～６、比較例１より、従来法の市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットに比較して、本発明の免疫学的測定法では７．８ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能になっており、測定感度が上昇していることが判明した。
　（実施例７）　モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、モノクローナル抗体ＩｇＧ１－１０及びＩｇＧ１－１４の混合液を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１０のビオチン標識体、又はＩｇＧ－１０とＩｇＧ１－１４をそれぞれビオチン標識したビオチン標識体の混合液を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。その結果を図２に示す。
　同じ配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を標識抗体として２種類用いることで、同じ濃度の１種類の抗体よりも各濃度におけるシグナルが上昇しており、同じ配列を認識する標識抗体を１種類用いるよりも２種類用いた方がヒトＣＸＣＬ１の測定感度が上昇することが判明した。
　（実施例８）　モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、モノクローナル抗体ＩｇＧ１－１０又はＩｇＧ１－１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ－１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１０のビオチン標識体、又はＩｇＧ１－１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１－１０及びＩｇＧ１－１４のビオチン化はＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ　Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、ＩｇＧ２ｂ－１の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を当日採取したヒト尿に２５０ｐｇ／ｍＬとなるように添加し、３．９ｐｇ／ｍＬまで同ヒト尿を用いて段階希釈した抗原添加尿を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１－１０　１００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
　（実施例９）　モノクローナル抗体ＩｇＧ１－３とモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例３より、配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－３と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例８と同様に実施した。結果を図３に示す。
　（比較例２）　市販キットを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中ヒトＣＸＣＬ１の検出
　市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて尿中に添加した組換え型ヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。詳細な実験操作は付属のプロトコールに従い、ヒト尿に添加したＣＸＣＬ１溶液は実施例８と同様に調製した。結果を図３に示す。
　実施例８～９、比較例２より、従来法の市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットに比較して、本発明の免疫学的測定法では尿中でも３１．２５ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能になっており、測定感度が上昇していることが判明した。
　（実施例１０）　市販キットモノクローナル抗体とモノクローナル抗体ＩｇＧ１－１０を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＣＸＣＬ１の検出
　実施例３において配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した市販キットＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）付属のマウスモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１－１０のビオチン標識体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による緩衝液に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１－１０のビオチン化はＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ　Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、市販キット付属のマウスモノクローナル抗体の４μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を５００ｐｇ／ｍＬ～７．８ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１－１０　１００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。
　配列番号２を認識する抗体として市販キット付属のモノクローナル抗体を用いた場合でも、配列番号３を認識する抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法においては、７．８ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能であることが判明した。また、市販キット付属のモノクローナル抗体と配列番号３を認識する抗体とを組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、市販キットで測定した場合（比較例１）よりも測定感度が上昇していることが判明した。
　（実施例１１）　取得した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１について、それぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を１２５ｐｇ／ｍＬから１５ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ－Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図５に示す。
　実施例１０、１１、及び比較例１より本発明の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１は、いずれも市販抗体に比較してシグナルが強く、ヒトＣＸＣＬ１の検出能が高いことが判明した。
　（実施例１２）　取得した抗体を用いた血漿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１を用いて、血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。
　まず、各抗体についてそれぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れて、一晩固相化した。翌日前記溶液を廃棄し、４倍に希釈した１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。
　次に５００ｐｇ／ｍＬの組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の血漿溶液を調製し、１２５ｐｇ／ｍＬまで同じ血漿で段階希釈した抗原血漿溶液の希釈系列を作製した。これを各ウェルに１００μＬずつ添加して１時間室温で反応させた後、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ－Ｔで洗浄した。
　続いて、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。洗浄後、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈したａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。
　（比較例３）　市販抗体を用いた血漿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
　市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて、血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのＭＡＢ２７５溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例６と同様の方法で行った。結果を図６に示す。
　実施例１２、比較例３より、本発明の５種類の抗体が血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１についても検出可能なことがわかった。
　（実施例１３）　取得した抗体を用いた尿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
　実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１を用いて、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。
　まず、各抗体についてそれぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れて、一晩固相化した。翌日前記溶液を廃棄し、４倍に希釈した１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。
　次に５００ｐｇ／ｍＬの組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の尿溶液を調製し、１２５ｐｇ／ｍＬまで同じ尿で段階希釈した抗原尿溶液の希釈系列を作製した。これを各ウェルに１００μＬずつ添加して１時間室温で反応させた後、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した。
　続いて、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。洗浄後、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて希釈したａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させ、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させて、４５０ｎｍの吸収を測定した。結果を図７に示す。
　（比較例４）　市販抗体を用いた尿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
　市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのＭＡＢ２７５溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例１３と同様の方法で行った。結果を図７に示す。
　実施例１３、比較例４より、本発明の５種類の抗体のうち、４種類の抗体が、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１についても検出可能なことがわかった。
　（実施例１４）　モノクローナル抗体ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験
　実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１－１、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。
　まず、膀胱癌細胞であるＴ２４細胞を１０％ＦＣＳ、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように接種し、４０時間前培養を行った。培養後細胞を回収し、各抗体と混合した細胞溶液について、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤファルコン）を用いて浸潤能を測定した。詳細は付属のプロトコルに従った。マトリゲルインベージョンチャンバーには、２．０×１０５細胞／ｍＬのＰＢＳ懸濁液を１００μＬと終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように各抗体を添加し、３７℃、５％二酸化炭素の下、５時間浸潤培養を行った。培養後、チャンバー下部をディフクィック試薬（シスメックス社製）で染色し、チャンバー下部まで浸潤した膀胱癌細胞数を計測した。計測は顕微鏡で行い、０．８ｃｍ×０．６ｃｍを１視野として、５視野計測して合計した。測定はｎ＝２で行い、合計値を平均した結果を図８に示す。
　（比較例５）　市販抗体を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験
　市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。方法は実施例１４と同様に行った。結果を図８に示す。
　実施例１４及び比較例５より、本発明の５抗体は、市販抗体と同等または高い中和活性を示し、特にＩｇＧ１－１，ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１は高い活性を示した。
　（実施例１５）　モノクローナル抗体ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験２
　実施例２にて選抜した５種類の抗体のうち、ＩｇＧ１－３、ＩｇＧ１－１０、ＩｇＧ１－１４、ＩｇＧ２ｂ－１の４種類について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。なお実施例１４とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。
　まず、膀胱癌細胞であるＴ２４細胞を１０％ＦＣＳ、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように接種し、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように各抗体を添加した後、４０時間培養を行った。培養後細胞を回収し、各抗体と混合した細胞溶液について、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤファルコン）を用いて浸潤能を測定した。以降は実施例１４と同様の実験を行い、浸潤培養時間のみ６．５時間に変更した。浸潤した細胞数の計測も実施例１４と同様に行い、結果を図８に示す。
　（比較例６）　市販抗体を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験２
　市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。比較例７とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。方法は実施例１５と同様に行った。結果を図９に示す。
　実施例１５、比較例６より、本発明に含まれる４抗体は全て、市販抗体より高い中和活性を示した。
　本発明によれば、ヒトＣＸＣＬ１の濃度を従来よりも高感度に測定することができるため、尿路上皮癌等の癌の検出に利用することができる。

Claims (15)

  1. 　ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１～３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定することを特徴とする、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
  2. 　配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
  3. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
  4. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
  5. 　前記試料が術後採取組織、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である、請求項１～４のいずれかに記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
  6. 　前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
    軽鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、
    重鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  7. 　軽鎖可変領域に配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  8. 　前記配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
    軽鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、
    重鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  9. 　軽鎖可変領域に配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  10. 　前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
    軽鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含み、
    重鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  11. 　軽鎖可変領域に配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  12. 　前記配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
    軽鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、
    重鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  13. 　軽鎖可変領域に配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  14. 　前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
    軽鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、
    重鎖において、
    　ＣＤＲ１が配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ２が配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　ＣＤＲ３、が配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
  15. 　軽鎖可変領域に配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
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