WO2010010966A1 - ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法 - Google Patents

ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブの製造方法および標的核酸の検出方法 Download PDF

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nucleic acid
phosphorus
conductor
target
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神谷典穂
野地澄晴
平石佳之
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国立大学法人九州大学
国立大学法人徳島大学
アロカ株式会社
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    • C12Q2563/125—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being enzymatic, i.e. proteins, and non proteins, such as nucleic acid with enzymatic activity

Definitions

  • the present invention relates to the production of cleoside phosphorus conductors, nucleic acid probes, rutile label probes, and rutile label probes.
  • nucleic acid probe is labeled with an antigen Otin, hybridized with the target, and then detected by a color method using a body or avid that is recognized by the element or quality. From the point of view, enzymes that can produce a signal result are excellent and are still widely used.
  • Glute label probes are known in which several conductors modified in the order of G) are introduced at random. This The S-hybridization with the label probe is performed with the enzyme that recognizes the antibody position, and the detection is carried out by using the color reaction of the alkaline sphatase with the hybrid.
  • the enzyme that recognizes the antibody position is performed with the enzyme that recognizes the antibody position, and the detection is carried out by using the color reaction of the alkaline sphatase with the hybrid.
  • it has several problems, such as the fact that the recognized body is very expensive and the addition of background due to the attachment of antigens.
  • Novel cleoside phosphoric acid conductor, nucleic acid probe, and rutile label probe capable of detecting acid with high sensitivity and sensitivity, production method of the rutilabel probe, and method of using the rutilabel probe or nucleic acid probe It is.
  • cleoside phosphorus conductor is preferably one represented by the following.
  • A has glutamine (G), and B represents a hydrogen atom or group.
  • the osido phosphorus conductor is as shown in the following (2).
  • A has glutamine G) and the rest represents a hydrogen atom and B is a hydrogen atom or
  • the oside phosphorus conductor is one represented by the following 3).
  • A has glutamine G) and B represents a hydrogen atom or group.
  • the cleoside phosphorus conductor is preferably one represented by the following 4.
  • the cleoside phosphorous conductor is preferably one represented by the following 5).
  • X and Y are each independently a divalent linkage, and Z is a substitution.
  • the X and Y are each preferably an alkylene having a prime number of 48 or a len group having a prime number of 2 to 48, and Z is an alkyl or carbon having a carbon number of 48. It is preferably an alkoxy group having a number of 48 to 48, an aryl having a carbon number of 6 to 48, an aryloxy having a carbon number of 6 to 48, an arylalkyl having a carbon number of 7 to 48, or an arylalkyloxy group having a prime number of 7 to 48.
  • Y is oxyalkylene having 2 to 48 carbon atoms such as oxyethylene and oxypropylene) YZ may be independently substituted at least one with an amino acid other than S.
  • the X is len
  • Y is a tyrene group
  • Z is an oxy group.
  • the present invention is a nucleic acid probe which is a nucleic acid containing a plurality of the cleoside phosphorus conductors as constituents.
  • the present invention is a rutilabel probe in which at least two of glutamine G) in the above probe are combined with lysine S) or a compound having a primary amino acid and containing a component.
  • the component is at least one of elements.
  • the element is
  • the element is preferably an element that is stable to an organic medium or heat.
  • a method for producing a rutilabel probe using transglutaminase Ga Se), at least two of the glutamine G) in the probe have lysine (S) or primary amylase. This is a method for producing a luti-label probe that binds compounds that contain water.
  • the component is at least one of and the component.
  • the element is preferably a conventional element.
  • a method for extracting a target wherein the multi-label probe and a target existing in a target are specifically bound by a nucleic acid component, and the bound multi-label probe is detected by the component. It is a way out.
  • a method for extracting a target wherein after the probe and a target existing in the target are specifically bound to each other by a nucleic acid component, transglutaminase (GaSe) is used to add glutamine G in the probe. ), Lysine (S) or a compound containing lysine (S) or primary amylin and reacting with lysine (S) or primary amyl to introduce a plurality of components, and the bound probe This is the target extraction method.
  • nucleoside phosphoric acid conductor and a nucleic acid probe that can be used to obtain a rutilabel probe in which a plurality of components are covalently introduced.
  • a translutaminase (GaSe) is used to introduce a plurality of components covalently into a nucleic acid probe, which enables simple and high-sensitivity acid detection. Can provide the manufacturing method.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of a creo conductor according to a clear state.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for producing the enzyme rutile label probe according to the light state.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the Z QGP method, which is an example of a creo conductor according to a clear state.
  • FIG. 4A is a diagram showing the results of performing ao a P, P C, and P c).
  • FIG. 4B is a diagram showing the result when reverse P C P C) is performed after synthesizing GP in bright Z.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of reverse P C 2 P C) after the synthesis of Z G P.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of a dot blot using the probe of the experiment in the implementation.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of detection according to the protocol of A o sec using the lutial label probe of Experiment 2 in the implementation.
  • gA is a graph showing the results of electricity in an agarose gel apparatus when RA is prepared by changing the combination of P and ZQGP.
  • FIG. 4B is a diagram showing the result of electricity generated by an ita-chip device in the case where RA is prepared by changing the combination of P and Z QGP.
  • FIG. 0 is a diagram showing the results of electricity using a garose gel apparatus when P f P labeling is performed using MG.
  • FIG. 2 is a diagram showing the value of S by a bell probe prepared with an Aosec kit.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of dot blotting at 50 using a probe of PP rutilabel A probe.
  • Fig. 4 is a diagram showing the spectrum results for the degree of a Oa P in a o a P f e 80).
  • Fig. 5 is a diagram showing a line obtained by calculating the degree of 290 from the spectrum.
  • Fig. 6 is a schematic diagram showing an example of a target extraction method according to the clear state.
  • Fig. 7 is a diagram showing the results of MA O MS analysis of Z QGP synthesized in Akira 3.
  • Fig. 20 is a diagram showing the results of performing the experiment, and Fig. 20 is a diagram showing the results of PCR when changing the combination of Z QGP in the production of ZQG of 3 and 2 is It is the figure which shows the result of MG garos in examination of the PAP burialization of the 3rd QQG of Ming.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of MG gallos in the production of the third P f AP rutile label A probe.
  • Fig. 24 is a diagram showing the results of MG Gallos in the production of 4 PAP Lucille A pros.
  • 25 is a diagram showing the results of dot blots of various PAP label A probes in Section 4.
  • Fig. 26 is a diagram showing the electrical results of the Garosgel apparatus when BAP labeling is performed using G in Section 5.
  • 27 is a diagram showing the results of dot blotting at a temperature using the probe of the BAP rutile label RA probe in Mt. 5 and 28 is A in comparison with Z QG R using MG in Mt. 6 It is a figure which shows the result at the time of performing eao 555 Caaee labeling.
  • FIG. 29 is a diagram showing the results of dot blotting at a temperature using a probe of e ao 555 rutilabel RA in a bright r.
  • G a Se is an enzyme that reacts with, for example, GQ), which is a tampata, and an amino acid that combines with various amino acids of S).
  • GQ is a tampata
  • This GaSe is used to manufacture multi-labeled probes that incorporate multiple elements.
  • ZGPG is synthesized by synthesizing ZGP, which is a conductor to which Z QG has G, and by incorporating Z QGP when preparing R as a nucleic acid probe, a plurality of GaSeG is introduced.
  • Z QG R By using GaS e such as MG and combining compounds such as elements that have introduced GaSe e such as MGS, the R-label label probe in which the R element is an integer above 2) is created. can do.
  • This multi-label probe can be detected immediately after the target target is live. Compared with the existing method, it is a simpler operation, under a batter ground, and a microorganism that is a bulk element. Cost control by using transglutaminase (MG) is expected.
  • MG transglutaminase
  • g may be the opposite of G in the nucleic acid probe and S in the labeled compound. That is, by synthesizing an osidophosphorus conductor having sMGS (recognized by GaSe) and incorporating it when preparing R as a nucleic acid probe, GaSe
  • a compound such as an element in which GaS e S such as MGS is introduced using GaS C such as MG. May be combined.
  • the amount of elements such as RA is adjusted to an integer of 2) .By applying the amount introduced in this way, compared to the existing method, the operation is broadly simplified, under the background, the bulk element It is expected that the cost will be reduced by using microbial transglutaminase (MG).
  • MG microbial transglutaminase
  • a nucleic acid probe containing a plurality of GaS e S is prepared by synthesizing a cleoside phosphorous conductor having s MGS) recognized by GaSe and incorporating it when preparing RA as a nucleic acid probe. . ⁇
  • the compound in which GaS e G such as MGG is introduced may be bound using GaSe such as MTG.
  • the cleoside phosphorus conductor according to the embodiment has glutamine G).
  • the cleoside phosphorus conductor having glutamine (G) includes gin phosphorus having glutamine G).
  • cleoside phosphorous conductor glutamine G
  • uracil, ade, gua, and cytosine are bound directly or through substitution.
  • cleoside phosphorous conductors can be made of PAPGTPCPPAPPGPCP or their conductors.
  • these oside phosphorus conductors are gin, (MP and Phosphorus P), Adesine, Ade's Phosphorus AMP) and Phosphorus (AP), Guanosine, Guano's Phosphorus G MP) and Phosphorus GP), Cytidine, Citi's Phosphorus CMP) and Phosphorus CP), Deoxyzine, Deoxy phosphorus
  • MP and phosphorus P
  • deoxycin deoxy phosphorus AMP
  • deoxyguanosine deoxyguano phosphorus GMP
  • phosphorus GP deoxydine
  • deoxy phosphorus CMP deoxy phosphorus
  • CP phosphorus
  • phosphatase such as gin, adesine, guanosine, cytidine, deoxyzine, deoxycin, deoxyguanosine, deoxy phosphatase, etc., Biotechnology Journal 8 5 9) 39 7 399 20007 oaof B oscecea B oeee 87 6) 732 738 999), etc.), eaeoees 29 36)
  • the cleoside phosphorus conductor according to the embodiment is, for example, the following, and is a gin phosphorus conductor having G which Ga Se can recognize.
  • the cleoside phosphorus conductor according to the embodiment is, for example, a thin phosphorus conductor represented by the following 2 and having G that Ga Se can recognize.
  • A has glutamine G) and the rest represents a hydrogen atom
  • B is a hydrogen atom
  • the oside phosphorus conductor according to the embodiment is, for example, the following 3), and is a gin phosphorus conductor having G which Ga Se can recognize.
  • A represents glutamine (G), and B represents a hydrogen atom or a group.
  • the cleoside phosphorus conductor according to the embodiment is, for example, a guanosine phosphorus conductor represented by the following (4) and having G that Ga Se can recognize.
  • A has glutamine G) and B represents a hydrogen atom or group.
  • the glutamine G) represented by A is not particularly limited, and examples thereof include a branched, cyclic or unsaturated alkyl, aminoalkyl, aryl, and aryl group having glutamine G). It should be decided in consideration of the goodness of synthesis.
  • the oside phosphorus conductor according to the embodiment is represented by, for example, the following 5), and Ga Se having a recognizable G Ga Se
  • X and Y are each independently a divalent linkage, and Z is a substitution.
  • a prime number such as methylene, ethylene, propylene, and a tylene group to a prime number of 48, such as alkylene, lene, propylene, and a butylene group, 2 to 48 len groups.
  • XY stands up respectively.
  • it is an alkylene having a prime number of 48 or a lene having a prime number of 2 to 48, or an alkoxy group having a carbon number of 48, more preferably X is len and Y is a thylene group.
  • XY is len or oxyalkylene, for example, C) or (CO) is a repeating number, and may be substituted with 2 4 8 24) group or the like.
  • an aryl having a prime number of 48 such as methyl, ethyl, and propi group
  • an aryl having a prime number of 48 such as methoxy, toxi, and propioxy group
  • an aryl having 6 to 48 primes such as alkoxy, and a til group
  • Examples include aryloxy groups having 6 to 48 primes such as oxy groups, arylalkyl oxy groups having 7 to 48 primes such as benzyl groups, and arylalkyloxy groups having 7 to 48 primes such as benzyloxy groups.
  • Z is an alkyl having a carbon number of ⁇ 48, an alkoxy having a carbon number of 48, an aryl having a carbon number of 6 to 48, an aryloxy having a carbon number of 6 to 48, an arylalkyl having a carbon number of 7 to 48, or a prime number of 7.
  • An arylalkyloxy group of ⁇ 48 is preferred, and Z is more preferably an oxy group.
  • Z may be further substituted with a nitro group or 34 group. Further, in combination with the above-described substitution represented by Y, Y Z may be independently substituted at least with an amino acid other than S.
  • the structure of the linker position that connects Z QG and P can be optimized, and for example, by introducing a soft linker position, access to the element can be improved.
  • the column can be optimized, and for example, the element can be improved.
  • the organism Gase MG When the organism Gase MG is used, it is preferably present as G that can be recognized by MG, or benzyloxycarboglutamylglycine ZQG).
  • Z QG has a smaller molecular size than Nin G).
  • X is Len
  • Y is Tylene
  • Z is The base Creo conductor is Creo conductor ZGP with PZG bonded.
  • G GQGGG 8 GVGQGGG 9
  • GG QGGG 0 consisting of amino sequences
  • e a e comes from G aS e, Benzyloxycarboglutamyl alanine Z Q), or EAQ VM) consisting of an amino column, or GGGQ G 2, GGGQVG G)
  • the amino group is GaSe, and a by-product due to self-bridge is generated. Therefore, for glycine G) at the end, it is better to protect it from becoming GaSe by replacing the hydrogen of the amino group with an appropriate group so that the desired bond can be formed. . In the description, it is used in this sense except in special cases. It is known that reactivity varies depending on the level of protection. More precisely, regarding milk GaSe, GQQQ G It is known that protection by chilling, ie Ac GQQQ G) and amino acids OPA 3 4 oeae), that is, OP GQQQ G) reactivity is improved. An example of such protection is shown in Fig. 3, which shows how Z QGP can be used in this embodiment. This is an example of a method for producing a cleoside phosphorus conductor according to the present embodiment, and is not limited thereto.
  • Benzyloxycarbo Glutamylglycine Z QG) Z-xysuccin o s c c e S) group and the like are introduced and activated.
  • Z QGP can be obtained by condensing P having a terminal amino group such as amino P with S-modified Z QG.
  • there is a method for introducing Ga having a recognizable G into P reactively with amino For example, if aldehyde, acidide, sulfonyl chloride, epoxy, isocyanate, or netted can be prepared, P having GaS recognizable G can be prepared by reacting it with amino P.
  • the method of activating the C-terminal group apart from G is one of the best in this regard.
  • Z QGP high-speed chromatography (PC), and gel chromatography (GPC). Moreover, it can be performed by using Z QG TP, MA OMS MRR, or the like. In addition, the generation rate and the rate can be obtained by a PC.
  • GaS e Lucille label
  • the GaSe multi-label according to the embodiment is prepared by preparing a TGaS e velcroside phosphorous conductor represented by the formulas) to 5), for example, and then a plurality of the GaSe bercleoside phosphorous conductors. And the minute has a sequence complementary to a part or part of the target column to be detected.
  • PA and RA Includes PA and RA. There are no particular restrictions on the length and length. For example, it may be at least 2 e degrees.
  • GaS e G is introduced into multiple locations using an enzyme with RA polymerase, and GaS e G is introduced at multiple locations.
  • R 2 can be prepared.
  • a multi-label probe uses GaSe such as MG to bind elements such as MGG that are introduced with GaSe e S to a nucleic acid probe Z QGRA into which GaSe e G such as MGG is introduced. Therefore, it is possible to create a rutilabel probe that contains RA, etc. 2)
  • R A there are no particular restrictions on the amount of elements such as R A, as long as it is above 2, and it can be done, but the larger the value, the better. However, if is too large, the rate of hybridization with the target may decrease.
  • P modified with may be prepared depending on the type of GaSe used.
  • amino acid may be introduced into TGaSe to change the isomerism.
  • C sa Maoas Ceea Maks P ezsc E zea M coaecoo Voe 40 sse 6 2 Ma 20007 543 550 Soeeesso O faoasaaseo Seoces oba aesssceca Co), and a mutant library If you can make a G that has been made and heated,
  • the resulting linkage, S G is formed by forming a glutamine) lysine bond.
  • GaSe may be recognizable S or primary amino acid.
  • the description uses the S group as an example. Except in special cases, this also applies to the first-class nets.
  • Fluorescence compounds containing radioactive isotopes, magnetism if magnetically detectable, temperature molecules if thermally detectable, and sensors having high sensitivity if electrically detectable In view of the degree of detection and handling, and at least one of the elements is preferable.
  • the element may be any substance that responds to or emits light of a selected length of external light, visible light, etc., and is not particularly limited.
  • Nin conductors or proteins include proteins and their variants.
  • radioactive isotope examples include deuterium), tritium, B, C, and the like.
  • the label element to be modified may originally have an S that GaSe can recognize, or may include an element that contains an S that GaSe can recognize.
  • S containing a recognizable GaSe can be used for the purpose of linking the labeling element to a desired position of the protein, for example, C or the end.
  • Other types of amino acids containing S that GaS e can recognize include, or modified See GSGM EAR ERA M SGS 9)) MGGS GGS 20), glycine (e a GGG ea GGGGG 2)), M GS target protein Linker position extended
  • SSPGE can be used to purify the protein.
  • the element is not particularly limited as long as it has a property capable of performing detection using color development.
  • alkaline sulfatase AP
  • glutathione S transferase GST
  • luciferase peroxida and the like
  • alkaline sfatase or oxidase are preferred from the standpoint of high catalytic properties and stability.
  • a gene capable of being introduced is preferable from the viewpoint of easy introduction.
  • thermoelements mainly, if cells are heated to a high temperature, 80 to 30), most of the proteins derived from the large intestine can be made and can be easily produced.
  • One of the preferred embodiments of the enzyme rutile label probe according to the embodiment is a combination of PP and ZQGRA. Such a combination is stable as a whole complex because PAP, which is a stable element, and R, which is a stable molecule, are linked by a specific covalent bond, such as an amide bond. There are benefits.
  • the element may be an element that is stable to organic media and heat.
  • stability screens from nature, for example, chemistry and industry 6 o 6) ⁇ 57
  • a labeled compound with lysine S or primary amino acid derived from the fraction can be prepared, for example, by introducing into the group (eg G ⁇ easo 996) B oc oaeeces C ae S eco 4 3 00 04 caec P ess S a
  • transglutaminase Gase the following can be used. At present, it is known that GaSe is derived from milk (ea, human), invertebrates, horseshoe,), plants, protozoa, and so on. Has been found. A good example of GaSe that can be used in the embodiment is the biological organism transglutaminase MG) from the point of view of stability, handling and bulk production.
  • the degree ratio of the labeled compound having S or primary amino which G can recognize to ZQG R A having the above is preferably 2 or more, more preferably 5 or more.
  • the term “ratio” refers to a ratio based on molarity, unless otherwise specified.
  • the degree ratio of 4 P f P to Z QG R A can also be expressed as [4 P f AP] [Z QG R A].
  • 4 PP is a sequence of amino 4 groups with M GGGSGGGSGS sequence at the end of gene engineering P f AP, A tag is introduced at the C end.
  • the vector for PAP was from Professor Kagawa University.
  • two large intestine strains were transformed into tampata E22 so that each was introduced.
  • the resulting transformant was centrifuged at 25 by 25.
  • the cells were collected by sonication and the solubles were collected by centrifugation. Since high-temperature PAP is stable even under high-temperature conditions, the resulting effluent was processed at 80 to 30 to precipitate other proteins.
  • the supernatant was collected by centrifugation and filter, and purified by Sa column. After the preparation, ultra-shortening was performed, the solvent was replaced with MSC 8.0 using P0 color, and the mixture was frozen until it was used in the experiment.
  • a multilabel probe obtained by a method that can achieve such a high response has little ZQGRA), and it is assumed that it was left in the target as described in detail below. However, it is considered that the combination with the rutilabel probe molecule does not substantially occur, or even if it occurs, it does not substantially affect the target detection result. Therefore, there is an advantage that it can be used directly without rutile label solution.
  • a compound such as a label having S or primary amino recognizable by GaSe and a QQR having G recognizable by GaSe is coupled using GaSe.
  • the rutilabel probe formed by the law of the present embodiment can be a novel substance.
  • the enzyme rutile label probe in the embodiment has the following and advantages compared to the prior art.
  • An elephant label an enzyme having S or primary amino which can be recognized by GaSe, and any enzyme capable of introducing S or primary amino which can be recognized by GaSe. Also, it does not require a large tapping tag like intein.
  • New sites can also be modified.
  • the target extraction method according to the embodiment is, for example,
  • At least two of the glutamine G) in the nucleic acid probe which is a nuclear acid containing a plurality of cleoside phosphorus conductors, are labeled with lysine S) or primary amino
  • a rutilabel probe composed of a mixture of compounds, wherein the label has an easily detectable property and the base has a base sequence that can be specifically bound.
  • the target extraction method according to the embodiment can be used for the purpose of target sex, quantification, separation, localization, and the like.
  • the above-mentioned rutilabel probe is used, but it has a column capable of binding to the nucleic acid and the target specific. It has easily detectable properties such as minutes.
  • the target acid is a nucleic acid, a relatively low molecular compound P), a protein, a pep, a metal ion, a multimer with a complex structure, a virus, or the like. , A, or) or an individual piece.
  • the elephant is a target, A or genome amplified by PCR, and if it is (), it is a nucleic acid RA or A) contained in the target, cell or individual.
  • the method is superior to the conventional method using, for example, a nin (G) probe.
  • G nin
  • the G method requires a G nucleic acid probe and a G-form of a nucleic acid probe, and a complicated work is required, but if the rutile label probe according to this embodiment is used, Since the G probe and G body are no longer needed, the reagents, labor, and time can be greatly reduced.
  • a target and a rutile label probe are provided, and a portion having a row of a target rutile label probe is allowed to live.
  • a plurality of multilabel probes having different labels, different elements, etc. may be prepared, and a plurality of acids may be detected simultaneously.
  • the method of emitting the target is
  • (C) A label having lysine S) or a primary amino acid in at least two of glutamine G in a nucleic acid probe which is a nucleic acid containing a plurality of cleoconductors shown in () above.
  • This is a rutilabel probe composed of a combination of these compounds, wherein the labeled component has an easily detectable property, or the nucleic acid component has a sequence complementary to a part or part of the column.
  • Lucifer label probe
  • C) including detecting the child of the sample by detecting the quantity or amount of normalized water based on the quality of the enzyme.
  • nucleic acid may be immobilized based on a nucleic acid prepared in advance, or the acid may be directly synthesized on the nucleic acid.
  • a biotin-coated plate can be fixed using a commercially available plate coated with avid.
  • This method further includes sequencing that is complementary to the immobilization part or part.
  • Nucleic acids relatively low molecular compounds, proteins, peptides, metal ions, multimers with complex structures, viruses, etc.
  • the portion having a row can be produced by using a conventional technique such as SEX in vitro prosthesis, and can have very high sex and isomerism.
  • the portion having a row may be composed of a modified cleo.
  • the above-mentioned rutilabel probe is used, but it has a sequence complementary to the nuclear acid or apta sequence. It has easily detectable properties such as minutes.
  • the target acid-containing nucleic acid, relatively low molecular weight compound (AP), protein, pep, metal ion, complex It can be a multimer with structure or a virus. , ()
  • the aptam acid is immobilized by providing the aptam acid with immobilization and allowing the portion having the immobilized column of the immobilizer to be immobilized. If so, it can be performed according to the nucleic acid used, the base sequence, and the like.
  • a material that may contain an immobilized apta and a target is provided next, and if the target is present, the child and the portion having a column of columns are combined, Provide a probe, and if the target does not exist, allow the ruby label probe to live. It can be a cell or tissue effluent or fluid.
  • the child of the sample can be detected by detecting the amount or amount of the immobilized component based on the quality of the enzyme.
  • the part having the immobilization column and the part having the target column may be overlapped or may be continuous, and both are designed to exist through an appropriate spacer. be able to.
  • portion having columns has a certain three-dimensional structure for molecular knowledge, it is better not to overlap at least with the portion having the fixed columns.
  • immobilization In addition to apta, immobilization, and may further include a row for hybridizing to a multi-label probe if desired.
  • Lucille label In addition to apta, immobilization, and may further include a row for hybridizing to a multi-label probe if desired.
  • the method for extracting a target according to the present embodiment is one in which the nucleic acid has a base sequence capable of specifically binding.
  • a nucleic acid probe which is a nucleic acid containing a plurality of cleoside phosphorous conductors, and a target existing in the target are specifically bound by the nucleic acid, and then transglutaminase Ga Se ) To react with glutamine G, lysine S) or primary amino acids containing nucleic acids in nucleic acid probes and easily react with primary amino acids. And a step of detecting a bound nucleic acid probe with a labeled component 6).
  • the above probe is used, but it has a sequence capable of binding to nucleic acid and target specific.
  • the label has an easily detectable property.
  • the method is superior to the conventional method using, for example, the G) probe.
  • the G method requires the G of the nucleic acid probe and the G-form of the nucleic acid probe, and a complicated operation is required, but if the nucleic acid probe according to the present embodiment is used, the G-probe and the G-form are used. This eliminates the need for a reagent, greatly reducing the amount of reagents, labor, and time. Also
  • the detection level can be improved.
  • Ga Se such as MTG
  • a compound such as a fluorophore, in which Ga Se S has been introduced is bound to a nucleic acid probe Z QG RA in which Ga se G such as MGG has been introduced in multiple places.
  • Lucifera A with the aim of using the S-hybridization S) method.
  • S-hybridization S S-hybridization S
  • a protein of microorganism transglutaminase (MTG) was used as a method of bellization.
  • Z QG P in which Z G which is G was introduced was synthesized, and Z QG R was prepared by reaction with R A o e ase.
  • MG microorganism transglutaminase
  • a rutile label probe was prepared and its ability was evaluated by dot blot.
  • M xysuccin (S) 5 z QG was made at room temperature on the day when it was made 27.0, 20) in methylformamide M) 4 to make S-ZQG5M) 500 at a time. Aliquot, save in C). Its 25 M S z QG and 5 of 5 3 a o a
  • Loxobenzoic acid (DB) 0) was blown, and the obtained sample plate was introduced into the ions of OS and measured.
  • Figure 4 shows the results of reverse PC after the synthesis of Z QGP and the conditions shown in the table. Compared to a Oa's 4), a new pixel 22) has appeared in 4), which is presumed to be Z QGP. However, the separation of the generated pixels was not sufficient, so we examined the PC cases as shown in Table 2Z. The results are shown in FIG.
  • Sense R and Anti-sense RA were prepared by copying with R oase.
  • a protein such as Soceeo S
  • Soceeo S a protein such as Soceeo S
  • PCR was performed using a plus containing a gene encoding S as a template, and an A piece having a length of about 000 was obtained.
  • the ply meter was applied to include 3 promoters upstream and 7 promoters downstream.
  • RA was synthesized using 3 oease sense (S)), and transcription was performed with 3 oease to prepare a sense sequence (g 24).
  • RA was synthesized using 7 oease antisense AS)), and transcription was performed with T7 oease to synthesize an antisense sequence 25). It is shown in 3 below. In 2 The resulting sense R and antisense strands were recovered with ethanol and suspended in E-tufa 20. R ase
  • the R A degree was measured at a o o. As a result, the sense strand was 0 g, and the antisense strand was 85.
  • a probe was prepared at Ao s e, GE Healthcare Biosciences). First, 60 (600) obtained by diluting the above-mentioned antisense RA to 0 using sterilization was rapidly cooled to 999. R e acobfe 60 ab ea and Cosse 60 in the order of the kit were added to the heat RA, and a 30 ink plate and a labeling probe were prepared at 37.
  • the membrane prepared from the membrane for delivery was transferred to the hybridization buffer provided in the kit, and pre-hybridization was performed at 55C.
  • the concentration of the above-mentioned probe is 50
  • Hybridization was carried out at 55 for about 4-6 overnight.
  • the hybridization was performed by transferring the membrane to Wa S buffer 4). This work was repeated 2 times. The Wa S 1 buffer (5). I repeated this work twice.
  • B is a name for tr b u t tr u h r de and BCP is r 0 h r n y Ph ph t t u d n t. 6
  • Probes could detect up to dots in complementary strands of sense strand. In the antisense strand, a signal was observed at the dot of 500. It is possible that the type A used for the target RA could not be processed by aSe. Also, the temperature drops during the cleaning operation, which may be due to stringency.
  • RA was concentrated and suspended in E-tufa 20.
  • R In addition to aseo, a new rutile label probe was created. 7
  • the R A degree was measured at a o o. The results are shown below.
  • GaSe rutilebel acid incorporating Z QGP at different ratios was subjected to interstitial heating and quenching at 99/9.
  • the reaction solution was prepared using the prepared nucleic acid so that the number of cases was 9 and 6 was used to prepare a rutile label 23) 9
  • the degree of color development was set to 50 (8-22V on the day of experiment) and the detection was performed according to the color method of the other experiments.
  • FIG. 8 shows the results of detection according to the Aosec protocol using a rutile label probe.
  • color development it was possible to detect up to zero for the 20 to 40 probe for Z QGP, and up to 0 for the 60 to 0 probe for Z QGP.
  • color development at 50 In the case of Z QG P, it was possible to detect dots of 20 0, 40 to 60 80 to 0.
  • s 000 was obtained by PCR.
  • the ply meter was applied so that the gene contains 3 promoters and the downstream contains 7 promoters.
  • the obtained PCR product was subjected to transcription using the base 7 Po e asse (0).
  • ZQG P synthesized in the experiment was obtained at a ratio of 0 to 0) to prepare ZQG RA of the following.
  • the collected Z QG R is collected by ethanol, and agarose gel and microchip are collected.
  • Ta sc o B e 04 T s C P 80 60 gC2 00 do o o 20 m P AP
  • Fig. 0 shows the results of PAP labeling using MG for each ZQG RA.
  • a e2 is the result of MG and a e3 is the result of MG.
  • Z QG P is not confirmed when it is 0, it can be seen that Z QG Z QGP entered is bellowed.
  • the probe of the probe PAP can be controlled by changing the QGP combination.
  • the probing with a small number of Ps or the decorative probing has a stronger target AS, so it can be inferred that in all cases the level was the same.
  • the performance under the ability of the probe accompanying the entry of P can be attributed to this.
  • PAP labeled with a nucleic acid probe in the light of S by velprob when performing color at high temperature exhibits higher catalytic properties at higher temperatures than at room temperature. Therefore, we evaluated the degree when the temperature was raised from room temperature to 50. bell
  • the final nucleic acid detection step was performed, that is, the degree of color development by the (alkaline sphatase) position.
  • P f P which is listed in the present probe, exhibits higher catalytic properties at higher temperatures than at room temperature. So, 0
  • Figure 8 shows the results of reverse PC after synthesis of Z QGP. a O a P 9) In comparison A new pixel appeared in this area, and it was speculated that this pixel was Z QGP. Therefore, collect the peak at 9 minutes and
  • PCR templates include genes that code for usS 990) plus
  • Fig. 20 shows the result of PCR when PCR was performed by changing the combination of Z QG d P. Even when PCR was performed with Z QG P as 50, the band of the amplified fragment was confirmed, indicating that Z QG P was recognized as A oease. In addition, since the band shifts to a macromolecule with the addition of z QG P, it is possible to adjust the ZG by changing the amount of Z QG TP during PCR. all right. As a result of measuring the degree of each Z QG A with a D after preparation, Z QG d P 0 prepared Z QG A was 7 3 8, ZQG TP 50 prepared Z QG A was 6, Z QG P 00 prepared Z QG A is 59 Was.
  • Figure 2 shows the results of MG Garos.
  • Z QG A prepared with 50 cases of Z QG P was used, the polymer shifted to MG, but no molecular shift was confirmed in the control prepared with Z QG Z Q G P 0 cases.
  • high molecular weight was not confirmed in MG compared to Z QG A. From this, it was found that 4 PP was bound to the Z QG part of Z QG A by MG.
  • the use of Z QG P prepared with 0 Z QG P 0 cases compared to Z QG P 50 results in a clearer polymerization. It was shown that it is possible to adjust the P f AP by changing it.
  • Z QG A prepared in 500 cases of Z QG P and 4 P AP were combined with MG to prepare a P AP rutile A probe.
  • various Z QG A were heat treated with g 0 for 5 hours to denature A into a single piece, and then in 0 MSC 80), C in various Z QG DA 25 and P f P 04 G 5 6 G pretreatment probe). Since the probing of a single probe greatly affects the probing of the probing, PP is bell-formed on Z QGA that has not been heat-treated in the same way. (G-treated probe with heat-treated probe prepared). This was carried out with Pf AP labeling of DA probe.
  • each prepared PAP rutile label probe was determined by totting.
  • each kit and protocol at the time of the hybridization was a commercially available kit Aosec GE Healthcare Bioscience) Z.
  • target A 990 S A 30 including probe row, ply
  • the negative control was only 50), and each was fixed to a membrane (Gene Healthcare Bioscience) by heat treatment at 80 for 2 minutes. The membrane was moved to the detection buffer that was detected, and 55 was pre-hybridized for 30 minutes. Then, various P f P multilabel probes prepared by the above method were added to the eve digestion buffer so that the concentration became 50, and 55 (about 4-6 overnight) was performed.
  • the hybridization was performed while the membrane was washed with WaS buffer 9) Z, 55. This work was repeated 2 times. Then, the temperature was set to 5 at W 1 buffer (20) at room temperature (8-22C on the test day). This work was repeated 2 times. 9
  • Fig. 23 shows the results of the dot blot of the PAP-labeled A probe. Since signals were detected in all cases, it was shown that the A probe, which was ZQG APP using MG, had as a nucleic acid probe. In addition, it was found that the MG pretreatment probe), when heat treating ZQG before MG, can improve the detectability than the MG treatment probe, when heat treating MTG. This is because the MG treatment probe heat-treats the A probe labeled with PAP, so the treatment was insufficient due to the addition of the amount of heat treatment, and A was not completely heated. P f AP due to processing in the state can be considered.
  • Z QG P prepared in 500 cases of Z QG P and 4 P AP were combined with MG to prepare a P AP rutile label probe.
  • various Z QGAs were heat-treated at 0 for 5 hours to denature A into a single piece.
  • each of Z QGA 25 and PP 04 MG 5 was changed to 4C and 6 It was. This was done using the A-probe P AP labeling method.
  • Fig. 24 shows the results of MG Gallos.
  • Z QG D A was converted into a P f AP, and these were used as the A probe for dotblowing.
  • a product obtained by purifying P or the like was used as a target R. twenty two
  • the RA was fixed to the membrane by diluting it at a stage of 50 and heat-treating each with a plastic blank, GE Healthcare Bioscience) Z-spot, 80 for 2 minutes.
  • a plastic blank GE Healthcare Bioscience
  • Z-spot 80 for 2 minutes.
  • commercially available RAR bocecoaeas R manufactured by Aldrich
  • diluted to 50 was similarly immobilized with a membrane spot.
  • the membrane was transferred into the hybridization buffer 23) and pre-hybridization was performed for 0 to 30 minutes. Then, various probes prepared by the above method were added so that the concentration became 50, and the incubation was performed at 60 for 4 to 6 nights).
  • FIG. 25 shows the results of a dot blot according to the S protocol of the P f AP-labeled probe.
  • Z QG A probe of both 50 and 00 was able to detect up to the dot, and the signal level was almost the same when using either probe. In addition, no negative control signal was detected. From this, it was clarified that the A probe with PP on Z QG A using MG can be used as a probe for detecting A.
  • probe values were also obtained for a rutilabel probe that had been lutilabeled using an Es Bec a AP BAP) at room temperature.
  • Figure 26 shows the fractionation when the probing ability was evaluated by toblot in the same manner. As a result, remarkable molecular addition occurred in proportion to Z QG. It was also confirmed that the molecular distribution was small when Z QG RA 0) was used. When only RAZ QG P is used, the number and position of Z QGs introduced is simple (above). The addition of a molecule compared to P 0) suggests that BAP is more responsive to ZQGR. It turned out.
  • Z QG R A prepared with zero Z QG P was heated to 99 0 and then rapidly cooled to perform denaturation. 0 Q M T S C 8 0) z QG R A 50 e ao 555 C a a e e 20 is M M G Os R a s e
  • FIG. 28 shows the results when A eao 55 5 C aee labeling is performed on Z QG RA using MG.
  • ae 2 is the decoration RA and A eao 555 C aaee
  • a e3 is the result of a e2 plus MG
  • a e4 is Z QG RA and A eao 555 C aaee
  • a e5 is a e4 plus MG.
  • the signal seen at the same position as RA is considered to be derived from the corresponding A eao 555 C aee.
  • Detection was attempted using a 555 multi-label probe. First, sS of 50 was prepared, added to the membrane, dried, added again 000), and normalized in the oven (80, 2). Then, Table 25 was performed and fluorescent image B

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Abstract

　新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、および簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブ、そのマルチラベル化核酸プローブの製造方法、そのマルチラベル化核酸プローブまたは核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法を提供する。トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、予め共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを使用することにより、または、標的核酸にハイブリダイズさせた核酸プローブに、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる。

Description

細 書 クレオシド リン 導体、 核酸プロ ブ、 ルチラベル プロ ブ ルチラベル プロ ブの製 および の 出方法 術分野
本 、 クレオシド リン 導体、 核酸プロ ブ、 ルチラベル プロ ブ、 ルチラベル プロ ブの製 および の 出方 法に関する。
らかの 識が施されたR A などの プロ ブを用 、 細胞レ ベルにおける AやR Aの バタ ンを検出、 可視 することによって 、 生命現象に関する数多くの 問点を解明することが可能となる。 レベル での 伝子 パタ ンを可視 するこのような手法を S イ ブリダイゼ ション S z a o S ) 言うが、 この際に使用されるプロ ブの 大別して、 射性同位体 、 、 に分類される。 史的には、 放射性同位体を取り込ませた核酸プロ ブが先に確立したが、 近年その り扱 が制限されてきたこともあって、 放射性同位体 素を用いない
が注目されて る。
これらの 、 核酸プロ ブ に抗原 オチンで ベル しておき 、 それらを標的 ハイブリ した後、 素もしくは 質によって 識された 体やアビジ を用いて 色法により検出するといった手法で ある。 度と う 点から見ると、 応によるシグナル 果が得られ る酵素 が優れており、 現在 も広く使用されている。
を利用した核酸プロ ブとしては、 例えば、
G) などの 位で修飾した 導体を 数個ランダ ムに導入した ルチラベル プロ ブが知られている。 この ル ラベル プロ ブ との S イブリダイゼ シ ョンの 、 抗体 位を認識する酵素 体との 原一 応を行 、 アルカリ スファタ ゼ の イブリッドによる発色 応を利用して検 出を行う。 しかしながら、 識された 体が非常に高価であること、 抗原 応に伴 作の 着などによるバックグラウンドの 加など、 幾つかの 題を有している。
方、 トランスグルタミナ ゼ Ga S e) を用いて、 Ga S eが認識 能なリシン S ) または第 級アミ を有する または パク 、 アニオン性であり、 かつ Ga S eが認識 能なグルタミン (G ) を有する外来 子を部位 に連結する方法が知られて る え ば、 特許 )。 術文献 2００8 54658 報 発明の
明が解決しようとする課題
、 新規な クレオシド リン 導体、 核酸プロ ブ、 および 便 かつ高感度に 酸を検出することができる ルチラベル プロ ブ、 その ルチラベル プロ ブの製 法、 その ルチラベル プロ ブまたは核酸プロ ブを用 た の 出方法である。 題を解決するための
、 グルタミン G ) を有する クレオシド リン 導体 である。
また、 前記 クレオシド リン 導体が、 下記 ) で示されるもので あることが好ましい。
Figure imgf000005_0001
) 、 Aは、 グルタミン (G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。)
また、 前記 オシド リン 導体が、 下記 (2) で示されるもので あることが好まし 。
Figure imgf000005_0002
2) 、 およびA のうち なくとも つは、 グルタミン G ) を有する で残りは水素原子を表し Bは水素原子または
基を表す。)
また、 前記 オシド リン 導体が、 下記 3) で示されるもので あることが好ましい。
Figure imgf000005_0003
3) 、 Aは、 グルタミン G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。 また、 前記 クレオシド リン 導体が、 下記 4 で示されるもので あることが好ましい。
Figure imgf000006_0001
( 4) 、 は、 グルタミン G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。)
また、 前記 クレオシド リン 導体が、 下記 5) で示されるもので あることが好ましい。
Figure imgf000006_0002
(5) 、 XおよびYは、 それぞれ 立して2価の連 を表し、 Zは、 置換 を表す。)
また、 前記 クレオシド リン 導体において、 前記XおよびYは、 それ ぞれ 立して 素数 ～48のアルキレン または 素数2～48の レン基であることが好ましく、 Zは、 炭素数 ～48のアルキル 、 炭素数 ～48のアルコキシ 、 炭素数6～48のアリ ル 、 炭素数6～48のアリ ルオキシ 、 炭素数7～48のアリ ルアルキル または 素数7～48の アリ ルアルキルオキシ基であることが好まし 。 また、 Yは、 炭素数2～4 8のオキシアルキレン えば、 オキシエチレン 、 オキシプロピレン ) また、 Y Zは独立して S 外のアミノ酸により少なくとも一方が置換さ れていてもよ 。
また、 前記 オシド リン 導体において、 前記Xは レン 、 Yは チレン基であり、 Zは オキシ基であることが好まし 。
また、 、 構成 位として、 前記 クレオシド リン 導体が複数 個 入されて る核酸である核酸プロ ブである。
また、 、 前記 プロ ブにおけるグルタミン G ) のう ち なくとも2つに、 リシン S ) または第 級アミ を有し 分を含む 合物が結合されて構成されている ルチラベル プロ ブ である。
また、 前記 ルチラベル プロ ブにおいて、 前記 分が、 お よび 素のうち なくとも つであることが好ましい。
また、 前記 ルチラベル プロ ブにお て、 前記 素が、
来の 素であることが好ましい。
また、 前記 ルチラベル プロ ブにお て、 前記 素が、 有機 媒や 熱に対して安定な 素であることが好まし 。
また、 、 ルチラベル プロ ブの製 法であって、 トラン スグルタミナ ゼ Ga S e) を用 て、 前記 プロ ブにおけるグルタ ミン G ) のうち なくとも 2つに、 リシン ( S ) または第 一級アミ を有し 分を含む 合物を結合する ルチラベル プ ロ ブの製 法である。
また、 前記マルチラベル プロ ブの製 法にお て、 前記 分 が、 および 素の ち なくとも つであることが好ましい。
また、 前記 ルチラベル プロ ブの製 法にお て、 前記 素が、 来の 素であることが好ましい。
また、 、 標的 の 出方法であって、 前記マルチラベル プ ロ ブ 、 対象 に存在する標的 とを核酸 分により特異 に結合させ 、 結合して る前記 ルチラベル プロ ブを、 前記 分により検出 する標的 の 出方法である。 また、 、 標的 の 出方法であって、 前記 プロ ブ 、 対象 に存在する標的 とを核酸 分により特異 に結合させた後、 トランス グルタミナ ゼ Ga S e) を用 て、 前記 プロ ブにおけるグルタミ ン G ) 、 リシン ( S) または第一級アミ を有し 分を含む 合物のリシン S) または第 級アミ とを反応させ て複数の 分を導入し、 結合している前記 プロ ブを、 前記 分 により検出する標的 の 出方法である。 明の
明では、 共有 合的に複数の 分を導入した ルチラベル プ ロ ブを得るための な クレオシド リン 導体、 核酸プロ ブを提供 することができる。
また、 明では、 ターゲットとなる標的 イブリ する前に、 合的に複数の 分を核酸プロ ブに導入することにより、 簡便 かつ高感度に 酸を検出することができる ルチラベル プローブを 提供することができる。
また、 明では、 トランスグルタミナ ゼ ( Ga S e) を用 て、 共有 合的に複数の 分を核酸プロ ブに導入することにより、 簡便かつ高感 度に 酸を検出することができる ルチラベル プロ ブの製 法 を提供することができる。
また、 明では、 合的に複数の 素を導入した ルチラベル プロ ブを用いることにより、 簡便かつ高感度に 酸を検出すること ができる標的 の 出方法を提供することができる。
また、 明では、 核酸プロ ブをタ ゲットとなる標的 イブリ させた後、 核酸プロ ブにおけるグルタミン G ) 合物 のリシン ( S ) または第 級アミ との 易な反応によって、 共有 合的に複数の 分を導入することにより、 簡便かつ高感度に 酸を検 出することが可能な の 出方法を提供することができる。 面の 単な説明
、 明の 態に係る クレオ 導体の 造の Z Q G P) を示す図である。
2は、 明の 態に係る酵素 ルチラベル プロ ブの 製方 法を示す 略図である。
3は、 明の 態に係る クレオ 導体の 例であるZ QG Pの 法の 例を示す図である。
4Aは、 明の Zお て、 a o a Pの P C の P C ) を行った際の結果を示す図である。
4Bは、 明の Zおいて、 G Pを合成した後、 逆 P C P C ) を行った際の結果を示す図である。 5は、 明の にお て、 Z G Pを合成した後、 逆 P C 2の P C ) を行った際の結果を示す図である。
6は、 明の において合成したZ QG Pの
O MS 析の 果を示す図である。
7は、 実施 における実験 の プロ ブを用 たドットブロットの 果を示す図である。
8は、 実施 における実験2の ルチラベル プロ ブを用 てA o s e c のプロトコ ルに準じて検出した結果を示す 図である。
gAは、 PとZ QG Pの 合を変化させてR Aを調製した 場合の 化について、 アガロースゲル 置にて電気 を行っ た結果を示す図である。
gBは、 PとZ QG Pの 合を変化させてR Aを調製した 場合の 化について、 イタ チップ 置にて電気 を行 った結果を示す図である。
０は、 M Gを用いてP f Pラベル化を行った際の ガロースゲル 置による電気 の 果を示す図である。
は、 P AP ルチラベル R Aプロ ブの プロ ブを用い 温におけるドットブロットの 果を示す図である。
2は、 A o s e c キットにより調製された ベ ル プロ ブによる S の 価を示す図である。
3は、 P P ルチラベル Aプロ ブの プローブを用 た5０ におけるドットブロットの 果を示す図である。
4は a o a P f e 8 ０) におけるa Oa Pの 度に対する スペ トル 果を示す図である。
5は、 スペクトルより 29０ の 度を算出し 線を示す図であ る。
6は、 明の 態に係る標的 の 出方法の 例を示す 略図 である。
7は、 明の 3において合成したZ QG PのMA O MS 析の 果を示す図である。
8は、 明の 3において、 Z QG Pを合成した後、 逆 P C 3の P C を行った際の結果を示す図である 9は、 明の 3にお て、 a Pの P C 3の P C ) を行った際の結果を示す図である 2０は、 明の 3のZ QG の 製にお て、 Z QG Pの 合を変化させてPCRした際の電 の 果を示す図である 2 は、 明の 3のZ QG のP APのうベル化 の検討において、 M G ガロ ス の 果を示す図である。
22は、 明の 3のP f AP ルチラベル Aプロ ブの 製において、 M G ガロ ス の 果を示す図である。
23は、 明の 3において、 各種P APラベル プロ ブのドットブロットの 果を示す図である。 24は、 明の 4のP AP ルチラベル Aプロ の 製にお て、 M G ガロ ス の 果を示す図である。
25は、 明の 4にお て、 各種P APラベル Aプロ ブのドットブロットの 果を示す図である。
26は、 明の 5において、 Gを用いてBAPラベル化を行 った際の ガロ スゲル 置による電気 の 果を示す図である。
27は、 明の 5において、 BAP ルチラベル R Aプロ ブの プロ ブを用いた 温におけるドットブロットの 果を示す図である 28は、 明の 6において、 M Gを用 て、 Z QG R に対してA e a o 555 C a a e eラベル化を 行った際の結果を示す図である。
29は、 明の r お て、 e a o 555 ルチラベル R Aの プロ ブを用いた 温におけるドットブロットの 果を示す図である。 明を実施するための
明の 施の 態について以下 明する。 実施 明を実施する 例であって、 本実施 態に限定されるものではな 。
らは、 核酸プロ ブに複数の 素を共有 合的に導入する手法とし て、 微生物 トランスグルタミナ ゼ M G) などのトランスグルタミナ ゼ GaS e) が有する部位 なタンパク に着目した。 G a S eは 応を する酵素であり、 例えば、 タンパタ の 定 のG Q) の カルボ アミド 、 S ) の ア ミノ 各種 アミ との 合を する酵素である。 この GaS e を用いて、 複数の 素などの 分を導入した ルチラベル プロ ブの 製を行 。
体的には、 例えば、 に示す、 ジン リン e o s a e P) に GaS eが認識するG M G G 有するZ QGを結合させた 導体であるZ G Pを合成し、 2に示すように、 核酸プロ ブとなるR を調製す る際にZ QG Pを取り込ませることによって、 GaS e G が複数 入されたZ QG R を調製する。 その 、 M Gなどの GaS eを用 て、 M G Sなどの GaS e Sを導入した 素などの 合物を結合させることによって、 R 素など の 分が は2 上の整 ) である ルチラベル プロ ブ を創製することができる。
この ルチラベル プロ ブは、 タ ゲットとなる標的 イブリ した後、 直ちに検出 応を行うことができるため、 既存の 法と比較し て、 操作の 幅な 素化、 バッタグラウンドの 下、 バルク 素である微生物 トランスグルタミナ ゼ M G) を用いることによるコストの 制など が見込まれる。
なお、 g お て、 核酸プロ ブにおけるG 、 標識 合物にお ける S とは逆であってもよ 。 すなわち、 GaS eが認識する s M G S) を有する オシド リン 導体を合成し、 核酸 プロ ブとなるR を調製する際に取り込ませることによって、 GaS e
Sが複数 入された核酸プロ ブを調製する。 その 、 M Gな どのTGaS eを用いて、 M G G などの GaS e G を導 入した 合物を結合させることによって、 R A 分が
は2 上の整 ) である ルチラベル プロ ブを創製してもよい。
また、 6に示すように、 Z QG R Aなどの プロ ブをタ ゲ ットとなる標的 イブリ した後、 M Gなどの GaS Cを用い て、 M G Sなどの GaS e Sを導入した 素などの 合物を結合させてもよい。 R A 素などの 分が は2 上の整 ) となり、 このよ に導入した 分の 応を行 こ とにより、 既存の 法と比較して、 操作の 幅な 素化、 バックグラウンドの 下、 バルク 素である微生物 トランスグルタミナ ゼ (M G) を用い ることによるコストの 制などが見込まれる。 なお、 6にお て、 核酸プロ ブにおけるG 、 標識 合物に おける S とは逆であってもよ 。 すなわち、 GaS eが認識する s M G S ) を有する クレオシド リン 導体を合成し、 核 酸プロ ブとなるR Aを調製する際に取り込ませることによって、 GaS e Sが複数 入された核酸プロ ブを調製する。 その ・ プ ロ ブをタ ゲットとなる標的 イブリ した後、 MTGなどの GaS eを用いて、 M G G などの GaS e G を導入した 合物を結合させてもよい。
オシド リン 導体
実施 態に係る クレオシド リン 導体は、 グルタミン G ) を有する。 グルタミン (G ) を有する クレオシド リン 導体 としては、 グルタミン G ) を有する、 ジン リン
e o s a e P) 導体、 アデ シン リン ( a e o s e o s a e A P) 導体、 グアノシ ン リン a o s e o s a e G P
、 シチジン リン c e s a e C P) 導体、 デオキシ ジン リン e o 「 e
o s a e P) 導体、 デオキシ シン リン ( e o a e o e o s a e A P) 導体、 デオキシグアノシン リン ( e o a o s e o s a e G P) 導体、 デオキシ ジン リン deO C e o s a e dC P) 導体などが挙げら れる。 実施 態に係る クレオシド リン 導体において、 グルタミン G ) 、 例えば、 ウラシル、 アデ 、 グア 、 シトシンの 分に 直接または置換 を介して結合されている。
これらの クレオシド リン 導体は、 P A P GTP C P P A P G P C Pまたはそれらの 導体から ることができる。
また、 これらの オシド リン 導体は、 ジン、 の ( MP および リン P)、 アデ シン、 アデ の リン AMP) および リン (A P)、 グアノシン、 グアノ の リン G MP) および リン G P)、 シチジン、 シチ の リン CMP) お よび リン C P)、 デオキシ ジン、 デオキシ の リン
MP) および リン P)、 デオキシ シン、 デオキシ の リン AMP) および リン A P)、 デオキシグアノシン、 デオキシグアノ の リン GMP) および リン G P)、 デオ キシ ジン、 デオキシ の リン CMP) および リン ( C P) ならびにそれらの 導体から てもよい。
えば、 ジン、 アデ シン、 グアノシン、 シチジン、 デオキシ ジン 、 デオキシ シン、 デオキシグアノシン、 デオキシ のリン 化酵 素などによるリン えば、 生物工学会誌 8 5 9) 39 7 399 2００7 o a o f B o s c e c e a B o e e e 87 6) 732 738 999) など ) 、 プロトンスポンジ でのオキシ リンなどによるリン えば e a e o e e s 29 36)
4528 988) など ) などによって、 それらの リン を得る ことができる。
実施 態に係る クレオシド リン 導体は、 例えば、 下記 ) で 示され、 Ga S eが認識 能なG を有する ジン リン 導体 である。
Figure imgf000014_0001
( ( ) 、 Aは、 グルタミン G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。 実施 態に係る クレオシド リン 導体は 例えば、 下記 2 で 示され、 Ga S eが認識 能なG を有する シン リン 導 体である。
Figure imgf000015_0001
( 2) 、 およびA のうち なくとも つは、 グルタミン G ) を有する で残りは水素原子を表し、 Bは水素原子または
基を表す。)
実施 態に係る オシド リン 導体は、 例えば、 下記 3) で 示され、 Ga S eが認識 能なG を有する ジン リン 導体 である。
Figure imgf000015_0002
( 3) 、 Aは、 グルタミン (G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。)
実施 態に係る クレオシド リン 導体は、 例えば、 下記 (4) で 示され、 Ga S eが認識 能なG を有するグアノシン リン 導 体である。
Figure imgf000016_0001
4) 、 Aは、 グルタミン G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。
Aで表されるグルタミン G ) を有する としては、 特に制限 はないが、 例えば、 グルタミン G ) を有する 、 分岐、 環状の または不飽和のアルキル 、 アミノアルキル 、 アリ ル 、 アリ ル基を含む が挙げられ、 合成のし さなどを考慮して決めればよ 。
実施 態に係る オシド リン 導体は、 例えば、 下記 5) で 示され、 Ga S eが認識 能なG を有する Ga S e
導体である。
Figure imgf000016_0002
5) 、 XおよびYは、 それぞれ 立して2価の連 を表し、 Zは、 置換 を表す。
XおよびYで表される 2価の連 としては、 それぞれ 立して、 メチレン 、 エチレン 、 プロピレン 、 チレン基などの 素数 ～48のアルキレ ン 、 レン 、 プロペ レン 、 ブテ レン基などの 素数2～48の レン基などが挙げられる。 これらの ち、 X Yは、 それぞれ 立し 素数 ～48のアルキレン または 素数2～48の レン 、 炭 素数 ～48のアルコキシ基であることが好ましく、 Xは レン 、 Yは チレン基であることがより好まし 。 X Yはさらに レン 、 オキシ アルキレン 、 例えば C ) または (C O) は繰り 返し数であり 2 4 8 24) 基などで 換されていてもよい。
Zで表される としては、 メチル 、 エチル 、 プロピ 基などの 素 数 ～48のアルキル 、 メトキシ 、 トキシ 、 プロピオキシ基などの 素数 ～48のアルコキシ 、 、 チル基などの 素数6～48 のアリ ル 、 オキシ基などの 素数6～48のアリ ルオキシ 、 ベンジル基などの 素数7～48のアリールアルキル 、 ベンジ オキシ基な どの 素数7～48のアリ ルアルキルオキシ基などが挙げられる。 これらの うち、 Zは、 炭素数 ～48のアルキル 、 炭素数 ～48のアルコキシ 、 炭素数6～48のアリ ル 、 炭素数6～48のアリ ルオキシ 、 炭素数7 ～48のアリ ルアルキル または 素数7～48のアリ ルアルキルオキシ 基であることが好ましく、 Zは オキシ基であることがより好まし 。 Zはさらに ニトロフ 、 3 4 基などで 換されていてもよい。 また、 上述したYで表される 換との み合わせで、 Y Zは独立して S 外のアミノ酸により少なくとも 方が置換されて てもよい。
Xを 択することにより、 Z QGと Pとを連結するリンカ 位 の 造を最適化し、 例えば 軟なリンカ 位を導入することで、 素などの アクセスを向上することができる。 また、 Y Zを 択することにより、 列を最適化し、 例えば 素などの を向上することができ る。
生物 Ga s e M G) を用いる場合、 M Gが認識 能なG 、 ベンジ オキシカルボ グルタミルグリシン Z QG) と して 在することが好ましい。 Z QGは、 ニン G) などよ りも分子サイズが小さ ため ましい。 5) で示される クレオシド リ ン 導体において、 Xが レン 、 Yが チレン 、 Zが 基である クレオ 導体が、 P Z Gを結合させた クレオ 導体Z G Pである。 また、 オシド リン 導体 には GaS eが認識 能な S または第一級アミ が共存しないよ な ものを選択することが好ましい。 存する場合には、 GaS eにより、 自己 する可能性があり、 目的のマルチラベル プローブの 率に好ましく ない影響を与える場合があるからである。
また、 微生物 GaS eの として、 G )、 AQG g 2 、 3) P A
4 、 Q M 5 もしくは EQ SEE ( 6) のアミノ 列からなる 、 またはG GQGGG
7) G GQGGG 8) GVGQGGG 9)、 もしくはGG QGGG ０) のアミノ 列からなる が知られている。 また、 e a e 来の G aS eの として、 ベンジ オキシカルボ グルタミル ル アラニン Z Q )、 またはEAQ VM ) のアミノ 列からなる 、 またはGGGQ G 2 、 GGGQVG G ) GGGQRGG GQQ
5 P PQ P 6) もしくはP PQQ
7) のアミノ 列からなる が知られて る。 GaS eが認識 能なG 、 用 る GaS eの 類に応じ、 このような として 在してもよい。
なお、 端がグリシン G) である は、 アミノ基が GaS eの になり るため、 自己 橋による副産物が生じ る。 したがっ て、 端がグリシン G) である については、 アミノ基 の水素を適切な基で 換することにより GaS eの とはならないよ に 保護して、 所望の 結を行 ことができるようにするとよい。 なお、 明細書 において とい ときは、 特別な場合を除き、 このよ な意味で 用いて る。 そして、 護の 段により、 反応性が異なることが知られ ている。 細には、 乳類 GaS eに関して、 GQQQ Gの チル化による保護 すなわち、 Ac GQQQ G)・ また アミノ酸を OPA 3 4 o e a e) に する すなわち、 OP GQQQ G) 反応性が向上することが知られ ている。 このよ な保護の例を、 本実施 態にお ても利用することができる Z QG Pの 製方法を図3に示す。 これは、 本実施 態に係る ク レオシド リン 導体の 製方法の 例であって、 これに限定されるもので はな 。
まず、 ベンジ オキシカルボ グルタミルグリシン Z QG) Z キシスクシン o s c c e S) 基などを導入し、 活性化しておく S化Z QG)。 そして、 ア ミノ Pなどの 端をアミノ した を有する Pと、 S 化Z QGとを縮合することにより、 Z QG Pを得ることができる。 また、 C 端の 基を活性エステル する上述の 法に加えて、 GaS eが認識 能なG を有する を P 入する方法 として、 アミノ と反応性の に導入する方法がある。 えば、 アルデヒド 、 アシ ジド 、 スルフォニルクロライド 、 エポキシ 、 イソシアネ ト 、 または ネ ト した を調製 できれば、 これをアミノ P 反応させることにより、 GaS eが認識 能なG を有する Pを調製することができる。 ただし、 これらの 応性 、 にお て GaS e 識に影響がな 部分に導 入する必要がある。 したがって、 上述のように、 G とは離れたC 端 の 基を活性化する方法は、 この 的において最も優れたものの つである。
Z QG Pの 、 高速 クロ トグラフィ P C)、 ゲル クロ トグラフィ (GPC) などにより行うことができる。 また、 Z QG TPの 、 MA O MS MR Rなどにより行う ことができる。 また、 P Cにより、 生成 の および 率を求めること ができる。 GaS e ルチラベル
実施 態に係る GaS e ルチラベル 、 構成 位として、 例えば式 ) ～ 5) で示されるTGaS e ベル クレオシド リ ン 導体を調製したのち、 この GaS e ベル クレオシド リン 導体が複数個 入されて る S e ルチラベル であり・ 分が、 検出 象である標的 の 列の 部または一部 に相補 な配列を有するものである。
には、 P AおよびR Aが含まれる。 の および長さ には特に制限はない。 さに関しては、 例えば少なくとも2 e 度であ ればよい。
えば、 Z QG Pを として、 R Aポリメラーゼ 性のある酵 素を用 て複数のZ QG Pを取り込ませて、 GaS e G が 複数 所に導入され、 所望の 列を有する GaS e ルチラベル プロ ブZ QG R 2) を調製することができる。
ルチラベル プロ ブ
実施 態に係る ルチラベル プロ ブは、 上記 プロ ブにおけ る構成 位である オシド リン 導体のグルタミン G ) の うち なくとも2つに、 リシン S ) または第 級アミ を有し 分を含む 合物が結合されて構成されたものである。 ルチラベル プロ ブは、 例えば、 M Gなどの GaS eを用いて、 M G G などの GaS e G が複数 所に導入された核酸プロ ブZ QG R Aに、 GaS e Sを導入した 素などを結合させることに よって、 R A 素などの 分が である ルチラベル プロ ブを創製することができる 2)
R A 素などの 分との は、 2 上であれば特に制限は なく、 することができるが、 が大き ほど 度が高くなり好ま しい。 ただし、 が大きすぎると、 標的 との イブリダイゼ ションの 率が低下する場合がある。
また、 例えば、 以下の 法により、 異なる標識 、 異なる 素などの なる標識 分を有する複数の ルチラベル プロ ブを調製することが できる。
) GaS eの 来を変える。
2) GaS eの 異性を変える。
) の 法では、 例えば、 用いる GaS eの 類に応じて、 異なる で修飾された Pなどを調製すればよい。
2) の 法では、 例えば、 TGaS eに、 タンパク 学的にアミノ 導入して 異性を変えればよ 。 えば、 M Gを大腸 で調製し えば C s a Ma o a s C e e a Ma k s P e z s c E z e a M c o a e c o o Vo e 4０ s s e 6 2 Ma 2００7 543 55０ S o e e e s s o O f a o a s a a s e o S e o c e s oba a e s s s c e c a C o )、 さらに変異体ライブラリ を作って 熱性の 上した Gを取得することができる えば、
Ma o a s C e e a Ma s P e z s c J o a O B o e c o o V o e 36 s s e s 3 4 ０ S e e e 2 ００8 56 62 Ra o a e e s O f a e c o a c ob a a s a a s e o e e e a o O f e o s a e a e a S e s e a a s )。
明細書において、 GaS eにより結合する とい ときは、 特別な場合 を除き、 得られる連結 、 S G とが、 グルタミ ル) リシン 合を形成することにより 成されている。
実施 態にお ては、 GaS eが認識 能な S 、 第 級アミ であってもよい。 明細書では、 S 基を例に説明するが、 その 、 特別な場合を除き、 第一級アミ にも当てはまる。
リシン S ) または第 級アミ を有し 分を含む 合物 としては、 特に制限はない。
分としては、 、 蛍光 、 放射性同位体を含む 合物、 磁気 に 検出 能な えば、 磁性 )、 熱的に検出 能な えば、 温 度 分子)、 電気 に検出 能な えば、 セン 位を有する 高分子) などが挙げられ、 検出 度、 取り扱い性などの点から、 および 素のうち なくとも つが好ましい。
素としては、 選択された 長の 外光、 可視光などの 射線による 応答して または 光を発する物質であればよく、 特に制限はな が、 例えば、 蛍光 素としてフルオ セイン、 ミン、 ダンシル、
ニン 導体など、 ある は タンパク として タンパク とその 異体などが挙げられる。
射性同位体としては、 例えば、 重水素 )、 三重水素 、 B、 C、 、 などが挙げられる。
GaS eに対し、 S または第一級アミン) となる G となる に比較して構造的な制約が少な と考えられる 。 したがって、 修飾しようとする標識 素が、 GaS eが認識 能な S を元来 して る場合もあり、 GaS eが認識 能な S を含む を 素に付加する場合もある。
GaS eが認識 能な S ( ) は、
8) R GS 35) MRR GS 36) M
37) のアミノ 列を有する として 在して もよ 。 このような GaS eが認識 能な S を含む による 化は、 標識 素を、 タンパク質の所望の 位、 例えばC または 端 に連結する目的で用いることができる。 GaS eが認識 能な S を 含む他のぺ またはそのアミノ 列の としては、 改変型S e e GSGM E A R ERA M SGS 9)) MGGS GGS 20)、 グリシン ( e a GGG e a GGGGG 2 )) 、 M GS 対象タンパク リンカ 位を伸ばした
GGGSGGGSGS 22) などが挙げられる。
C または 端に GaS eが認識 能な S を含む を 付加した 、 遺伝子工学的な手法を用いて、 タンパク として 調製することができる。 C または 端に GaS eの
が導入された タンパク質の精 、 それぞれ またはC 端に 付加した精製 えば、 ) 6 a ヘキサ ジ ンタグ) 利用し GaS eの 応性の 下を回避するために、
を入れた とは異なる 端に精製 を入れるようにデザ インするとよい。)、 ゲル クロ トグラフィなどにより行 ことができ、 ま たアミノ 列の タンパク質をコ ド プラス クタ の 伝子配列を シ ケン にて確認するか、 端に導入された
については 析により直接 することができる。 タンパタ質の精製 の 、 S S P GEなどで行うことができる。
素としては、 発色 応などを利用して検出を行うことができる性質を 有するものであればよく特に制限はない。 えば、 アルカリ スファタ ゼ AP)、 グルタチオン S トランスフ ラ ゼ (GST)、 ルシフ ラーゼ、 ペルオキシダ などが挙げられる。 これらのうち、 高 触媒 性と安定性の 点から、 アルカリ スファタ ゼある は オキシダ 好まし 。
が容易に導入 能との 点からは、 遺伝子 的に 能なタン パク質が好ましい。
ルチラベル プロ ブ 酸の間でより厳密に 基配列 な二本 成を行 ためには、 比較的 えば、 70 上) の 件下 で行 ことがあるため、 常温 来の 素を利用すると活性の 懸念され る。 そこで、 標的 素としては、 P 「 o c o c c s o s S アルカリ スファタ ゼ P AP) が好まし 。
来の 、 一般的に有機 媒や熱に対して高い安定性を示すこ とが知られているため ましく えば、 ・ A o C e O o C e c a o o g 66 3 2００5) )、 さらに、 大腸 主とした大量 比較的容易 に行うことができる点にお ても好まし 。 大 主として 熱性 素を 調製する場合、 細胞 を高温 えば、 8０でで3０ ) するこ とで、 大腸 来の タンパク質のほとんどを させ、 製を容易に行 ことができる。
一般の 物がほとんど生育できない 境で生育することがで きる微生物であるため、 来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有し て る。 さらに、 熱に対する 性だけでなく、 一般的に、 変性 、 有機 、 などに対する 性も 素に比 て極めて高いことから、 P Pを使用することによって、 素の を伴わな 密な二本 成を達成 することができると考えられる。
実施 態に係る酵素 ルチラベル プロ ブの まし 態様の つは P PとZ QG R Aとの 合体である。 このような 合体は、 安 定な 素であるP APと、 安定な分子であるR が、 アミ ド 合と う 定な共有 合で連結されているため、 複合体全体としても安定性であるとい うメリットがある。
また、 ルチラベル プロ ブにお て、 素が有機 媒や熱に対 して安定な 素であってもよ 。 このような安定性の 、 自然界から のスクリ ング えば、 化学と工業 6 o 6) ・ 57
)、 内山 太郎 バイオサイエンス インダスト 6 o 5) 234 239 2００8)
バイオサイエンス インダストリ 6 o ) 66 7 67０ 2００8)) 、 タンパク 学的手法により安定性を高める えば、 荻野博 B O S RY o 25 o 7) 6 23 2００8) 太郎 B O S RY 。 1・ 2 5 o 7) ・ 52 58 2００8)) により得ることができる 。 これらの 法により、 常温 来の 素であっても、 有機 性や 熱性 を有する酵素 と変換することができる。 分を導 した、 リシン S または第一級アミ を有す る標識 合物は、 例えば、 基に を導入する方法で調製す ることができる ( えば、 G・ ・ e a s o 996) B oc o a e e c e s C a e S e c o 4 3 ００ ０4 c a e c P e s s S a
・ を参照)。
トランスグルタミナ ゼ Ga s e) としては、 のものを用 ること ができる。 在、 GaS eとして、 乳類 e a 、 ヒト) 、 無脊椎動物 、 カブト 、 )、 植物、 類、 原生生物 ) 来 のものが知られており、 また の 合につ ては、 8 類のアイソ が 見つかっている。 実施 態にお て ることのできる GaS eの まし い例は、 安定性、 ンドリングの 、 バルク 産が可能などの点から 生 物 生物 トランスグルタミナ ゼ M G) である。
実施 態において Gを用 た場合、 予想されている Gの 応 から、 S を有する標識 素などの 分を含む 合物とZ G R Aとの 、 G 心であるシステイン C S ) 、 Z G R AのG の 応による 合体の 成と、 続 て起こる標識 合物の Sによる 合体 の
応によるM Gの 、 の2 階で進行すると予想される。
実施 態の ましい態様においては、 が認識 能なG
を有するZ QG R Aに対する、 G が認識 能な S また は第一級アミ を有する標識 合物の 度比は、 好ましくは2 上であり 、 より好ましくは5 上である。 なお、 本明細書で単に 度比 とい とき は、 特別な場合を除き、 モル 度による比を指す。 えば、 Z QG R A に対する 4 P f Pの 度比は、 [ 4 P f AP] [ Z QG R A] 表すこともできる。
4 P Pの
4 P Pとは、 M GGGSGGGSGSの 列を有する アミノ 4 基からなる 列を 伝子工学的 P f APの 端に、 タグをC 端に導入したものである。 P APの ベクタ は香川 大学 教授より た。 PCRによりP APをコ ドする 域 を増幅する際、 それぞれの が導入されるようにタンパタ タタ E 22に 、 大腸 2 株を形質 換した。 アン シリンを含む B 地にて 、 養を経て、 得られた形質 換体を遠心 離により 、 25 で2 した。 られた 解させた後 、 超音波 理により細胞を 、 遠心 離により可溶性 を回収した。 高熱 来のP APは高温 件下でも安定であるので、 得られた 出液を80 で3０ 理し、 他のタンパク質を沈 させることによって 製を行った。 製後、 遠心 ・フィルタ によって上澄みを回収し、 S a カラ によって精製した。 製後、 限外 による 縮を行 P ０カラ を用 て溶媒を M S C 8・ 0 ) と置換し、 実験に供するまで凍結 存した。
また、 4 P APの大 での の 上のため、 大腸 ドン 用頻度に合わせて 基配列が改変された 4 P Pの ベ クタ アクセッション A 479383、 配列 26) を用 て もよ 。 この タタ は n v c http d nd v
) に受託 成して得た。 4 P Pをコ ドする遺伝子 域の 端 に適切な制限 サイトを導入しておき、 これらを利用することでタンパク タタ E 22に 、 得られた AP ベク タ により大腸 B 2 株を形質 換した。 アン シリンを含む B 地に て 、 養を経て、 得られた形質 換体を遠心 離により 、 25 M で2 した。 られた 解させた後、 超音波 理により細胞を 、 遠心 離により可溶性 を回収した。 高熱 来 のP f APは高温 件下でも安定であるので、 得られた 出液を8０ でで3０ 理し、 他のタンパク質を沈 させることによって 製を行った 。 製後、 遠心 ・フィルタ によって上澄みを回収し、 S a カラ によって精製した。 製後、 限外 による 縮を行 、 P 0カラ を用いて溶媒を M s C 8 ０) と置換 、 実験に供するまで凍結 存した。
GaS eとしてM Gを用 て連結 応を行う場合には、 上述のよ に 度比が適切な となるようにすることに加えて、 5 5～8・ ０、 温度4～50「 えば、 室温 えば、 8C～22 )) の 件で行うこと が好まし 。 このようにすれば、 2 間以内、 好ましくは6 間以内、 より 好ましくは3 間以内に、 充分に高い反応 が達成可能である。
このよ な高い反応 が達成できる方法により得られたマルチラベル プロ ブ には、 応の プロ ブ えば、 離のZ QG R A ) がほとんど せず、 以下で詳述する、 標的 の 出にそのまま たと しても、 ルチラベル プロ ブ 応分子との 合が実質的に生じな か、 生じたとしても目的とする検出の 果には実質的な影響を与えないほど な と考えられる。 したがって、 ルチラベル プロ ブ 液を す ることなく、 直接 と利用できるメリットがある。
実施 前に、 GaS eが認識 能な S または第一級アミ を有する標識 素などの 合物と、 GaS eが認識 能なG を 有するZ QG R とを GaS eを用 て連結することにより、 ルチ ラベル プロ ブを得る例は存在しなかった。 したがって、 本実施 態の 法により 結された ルチラベル プロ ブは、 物質として新規なもの と うことができる。
実施 態における酵素 ルチラベル プロ ブの 、 従来 に比較して、 以下の およびメリットを有する。
・ 象となる標識 、 GaS eが認識 能な S または第 級ア ミ を有する酵素、 GaS eが認識 能な S または第一級アミ を 導入することができるあらゆる酵素を包含する。 また、 インテインのような大 きなタンパタ タグを必要としない。
・ 素の 、 C 端に限定されな 。 GaS e 性な S が 存在するか、 そのような S を有する を導入することができる部位 であれ 、 修飾 能である。
・ C 端、 端に加え、 域のようなタンパク の らぎの きな部位も修飾 象となりうる。
合する核酸の 基配列および長さには、 特に制限がな 。
の 出方法
実施 態に係る標的 の 出方法は、 構成 位として例えば
) ～ 5) で示される クレオシド リン 導体が複数個 入されて る核 酸である核酸プロ ブにおけるグルタミン G ) のうち なくとも 2 つに、 リシン S ) または第一級アミ を有する標識 素などの 合物が結合されて構成されている ルチラベル プロ ブであって、 標 識 分が容易に検出 能な性質を有し、 かつ 分が 特異 に結 合 能な 基配列を有するものである ルチラベル プロ ブを準備し、 ルチラベル プロ ブ 対象 に存在する標的 とを核酸 分によ り特異 に結合させ、 結合している ルチラベル プロ ブを、 分 などの 分により検出する工程を含む。
実施 態に係る標的 の 出方法は、 標的 の 性、 定量、 別、 、 局在化の 査などの 的で用 ることができる。
この 法にお ては、 上記 ルチラベル プロ ブが用 られるが、 核 酸 、 標的 特異 に結合 能な 列を有するものとする。 分などの 、 容易に検出 能な性質を有するものである。 この 法 において、 標的 酸を含む 、 核酸、 比較的低 子の 機化合物 P)、 タンパク 、 ペプ 、 金属イオン、 複雑な構造を持つ多量体、 ウイル スなどであり る。 、 A 、 または ) もし くは個体 片などである。
象が ) の 合、 標的 、 PCRにより増幅された Aまた はゲノム などであり、 ( ) の 合、 標的 、 細胞または個体 に含まれる核酸 R Aまたは A) などである。 方法は、 従来 、 例えば ニン ( G) プロ ブを用いる方法に比較して 、 の点で優れている。 えば、 G法では、 核酸プロ ブの G および された G 体が必要であり、 それに伴 雑な 作が 必要となるが、 本実施 態に係る ルチラベル プロ ブを用 れば、 G プロ ブおよび G 体が不要になるため、 試薬、 手間 および 間を大幅に削減することが可能となる。 また・ つの
) Z して複数のシグナル 素など) を配置して るため、 検出 度の 上が可能になる。
この 法においては、 標的 、 ルチラベル プロ ブを供し、 標 的 ルチラベル プロ ブの 列を有する部分とを イブリ させるが、 この イブリ のための 、 当業者であれ ば、 用いる核酸 分の 、 塩基配列などに応じて、 することができ る。
実施 態に係る標的 の 出方法にお て、 異なる標識 、 異なる 素などの なる標識 分を有する複数の ルチラベル プ ーブを準 備して、 同時に複数の 酸を検出してもよ 。
また、 本実施 態にお て、 標的 の 出方法は、
( a ) 面に固定化された核酸、
b 定化された 定化 の 部または 部に相補 な配列 定化
)、 および 特異 に結合 能な配列
) を有する タ 、
( C ) 位として上記 ( ) で示される クレオ 導体が複数個 入されて る核酸である核酸プロ ブにおけるグルタミン G の ち なくとも 2つに、 リシン S ) または第 級アミ を有する標 識 素などの 合物が結合されて構成されている ルチラベル プロ ブであって、 標識 分が容易に検出 能な性質を有し、 又は核酸 分 が タ の 列の 部または一部に相補 な配列を有す るものである ルチラベル プロ ブ、
を準備し、
A) 定化 、 アプタ 酸を供し、 固定化 タ の 定化 列を有する部分とを イプ させることにより、 アプ タ 酸を固定化し、
B ) 定化された 定化アプタ 、 標的 酸を含む 子を含む 能性のある 料を供し・ 子が存在する場合には タ の 列を有する部分とを結合させ、 かつ上記 ルチラベ ル プロ ブを供し、 標的 子が存在しな 場合には ルチラベル プロ ブの 分と タ とを イブリ させることにより、 タ ンパク質を固定化し、
C ) 定化された 分の またはその量を酵素の 質に基づいて検 出することにより、 試料 の 子を検出する 程を含む。
この 法における 面 の の 定化のためには、 従来 術、 例えば A イタ アレイなどを調製する際に用 られる 術を適用することがで きる。 は、 ガラス、 シリコンなどのプラスチック製の、 チップ、 ビ ズ 、 ウ ル、 プレ トなどの 態とすることができ、 核酸は、 従来 術を用 て 、 面に非 ) 的に、 または共有 合で固定することが できる。 あらかじめ 製した核酸を基 に固定化してもよく、 上で直接 酸を合成してもよい。 便には、 アビジ などで被覆された市販のプレ トを 用い、 ビオチン した所望の を固定することができる。
この 法ではさらに、 固定化 の 部または一部に相補 な配列 定化
)、および 子を含まれる標的 特異性的に結合 能な 配列 ) を有する核酸 ( タ が用いられる。
、 核酸、 比較的低 子の 機化合物、 タンパク 、 ペプ 、 金属イ オン、 複雑な構造を持つ多量体、 ウイルスなどであり る。
列を有する部分は、 従来 術、 例えばS E E X 験管内人工 ) 程 を用いることにより産生することができ、 また 子に対して非常に高い 性及び 異性を有するものとすることができる。 列を 有する部分は、 修飾 クレオ で構成されていてもよい。
この 法においては、 上記 ルチラベル プロ ブが用 られるが、 核 酸 、 アプタ の 列の 部または 部に相補 な配 列を有するものとする。 分などの 、 容易に検出 能な性質を 有するものである。 この 法において、 標的 酸を含む 、 核酸、 比 較的低 子の 機化合物 (A P )、 タンパク 、 ペプ 、 金属イオン、 複雑 構造を持つ多量体、 ウイルスなどでありうる。 、 ( )
、 または ) もしくは個体 片などである。
この 法にお ては、 固定化 、 アプタ 酸を供し、 固定化 タ の 定化 列を有する部分とを イブリ させるこ とにより、 アプタ 酸を固定化するが、 このハイブリ のための 、 当業者であれば、 用いる核酸 分の 、 塩基配列などに応じて、 することができる。
また、 この 法にお ては、 次 で固定化アプタ 、 標的 子を含む 可能性のある 料を供し、 標的 子が存在する場合には 子と タ の 列を有する部分とを結合させ、 さらに ルチラベル プロ ブを供し、 標的 子が存在しな 場合には ルチラベル プロ ブの 分と タ とを イブリ させる。 、 細胞もしく は組織 出液、 液などでありうる。
さらにこの 法においては、 固定化された 分の またはその量を酵 素の 質に基づ て検出することにより、 試料 の 子を検出することが できる。
アプタ にお ては、 固定化 列を有する部分と、 標的 列を有する部分とは、 重複してもよく、 連続してもよく、 また 当な スペ サを介して両者が存在するように設計することができる。
列を有する部分 タ ) が分子 識のためにある立体構造をとる ことを考慮すると、 、 固定化 列を有する部分とは少なく とも重複しないようにするのがよい。
アプタ 、 固定化 および 外に、 所望の 合には ルチラベル プロ ブ 切にハイブリ するため の 列をさらに含んでいてもよい。 ルチラベル プロ ブの
、 アプタ の 列の 部または一部に相補 な配列を有す るが、 この 列の 部または一部に相補 な配列からなる 域が長い 重複が多い) と、 かえって タ とは イブリ できない場合が生じうる。 また 少な ) と、 標的 子が存在 、 アプタ 結合して る場合にも、 ルチラベル プロ タ とが イブリ してしまう場合が生じうる。 業者であれば、 このよ なことを考慮して、 固定化 、 アプタ 、 ルチラベル プロ ブの 分を、 することができる。
また、 本実施 態に係る標的 の 出方法は、 核酸 分が 特異 に結合 能な 基配列を有するものである、 構成 位として、 例えば
) ～ 5) で示される クレオシド リン 導体が複数個 入されてい る核酸である核酸プロ ブ 、 対象 に存在する標的 とを核酸 分によ り特異 に結合させた後、 トランスグルタミナ ゼ Ga S e) を用 て、 核酸プロ ブにおけるグルタミン G 、 リシン S ) ま たは第一級アミ を有し 分を含む 合物のリシン S ) ま たは第一級アミ とを反応させて、 容易に検出 能な性質を有する複数の 分を導入し、 結合して る核酸プロ ブを、 標識 分により検出する工程を 含む 6 )。
この 法においては、 上記 プロ ブが用 られるが、 核酸 、 標的 特異 に結合 能な 列を有するものとする。 また、 標識 、 容易に検出 能な性質を有するものである。
方法は、 従来 、 例えば G) プロ ブを用 る方法に比較して、 の点で優れている。 えば、 G法では、 核酸プロ ブの G および された G 体が必要であり、 それに伴 雑な 作が必要となるが、 本実施 態に係る核酸プロ ブを用いれば、 G プロ ブおよび G 体が不要になるため、 試薬、 手 間および 間を大幅に削減することが可能となる。 また、 つの
) Z して複数のシグナル ) を配置することにより、 検 出 度の 上が可能になる。
えば、 MTGなどの Ga S eを用いて、 M G G などの Ga s e G が複数 所に導入された核酸プロ ブZ QG R Aに、 Ga S e Sを導入した 、 蛍光 素などの 合物を結合させる 以下、 実施 および を挙げ、 明をより具体的に詳細に説明するが 、 、 以下の に限定されるものではな 。
実施 では、 S ハイブリダイゼ ション S ) 法 の 用を目指して、 ルチラベル Aの 発を行った。 ベル化の手法としては、 微生物 トランスグルタミナ ゼ MTG) の タンパク を利用した。 Gの であるZ Gを導入したZ QG Pを合成し、 R A o e a s eによる 応によっ てZ QG R を調製した。 さらに、 M Gを用いて
ルチラベル プロ ブを調製し、 その 能をドットブロットによって評価 した。 Z QG Pの
Z QG Pの スキ は、 3 りである。
まず ０ M ソプロピ C
M キシスクシン ( S) 5 z QGを、 室 温 製した日は2 7・ ０ ) で メチルホルムアミド M ) 4 中で2０ させることにより、 S化Z QG 5 M) を調 製した の 階で5００ ずつに分注 、 Cで保存)。 その 、 25 Mの S z QGと 5 の5 3 a o a
P 下、 a Oa P 記、 S GMA ) とを、 ０ mM 8 8) と M の (
) ０ 32 中において2 5 で 2 させた。 了後、 サンプ ルをM Qで ０ 釈し、 P C 本分光製) クロ トグラフ・ポンプ R AR V 、 バリアブル・ル プ・インジ ク V 6 3 、 紫外 EC ００ V 型) によって精製を行った。 P Cの りとした。
の 、 レ ザ イオン 行時間 量分析 置であるM O MS 津製作所 AX M C R P によ って行った。 なお、 サンプル 、 まず、 試料 をMA
プレ トの上に 、 次にその上から、 トリックス 2
ロキ 息香酸 (D B) の ０ ) を 、 その 、 風 して、 得られた試料プレ トを O S 置のイオン に導入して計測した。
Z QG Pを合成した後、 表 に示す 件で逆 P Cを行った際 の結果を図4に示す。 a Oa の 4 ) 比較 して、 に新たなピ ク 22 ) が出現しており 4 )、 このピ クがZ QG Pであると推測される。 しかし、 生成 ピ クの 離が 十分でなかったので、 P C 件を表2 Z すよ に変えて検討を行った。 果を図5に示す。
HPLC
ne s ODS 3 46 mmx250mm
A 5０ mM TEAA pH 7０ B ace on e
グラジ ント A 98 58 (4０mn)
・０ mL mn
260nm
2
HP」C
ne s ODS 3(10 mmx250 mm
A ００ m AA pH 7０ B ace o Ⅲe
グラジ ント A=98 88 (5mn)
88 73 (30mn)
73 98 (10mn)
5０ L mn
260nm そこで、 保持 8・ 8分のピ タを回収して A O MS 行った 6 )。 その 果、 856 89のピ クが確認され、 理論 857 良く一致した結果が得られたため、 Z QG P の 成が示された。
o s e c キットの 度の
センス R A、 アンチセンス R Aの
R o e a s eにより 写を行うことによって・ センス R 、 アンチセンス R Aを調製した。 (タ ゲット) としては、 ウス中にて発現パタ ンが既知であるSo c e e o S ) と うタンパク質をコ ド R A s ) をモデルとした。 そこ でまず、 S をコードした遺伝子を含むプラス をテンプレ トとしてP CRを行い、 長さ約 ０００ の A 片を得た。 この 、 上流には 3 プロモ タ、 下流には 7プロモ タが含まれるよ にプライ 計を施し た。 次に得られたPCR 物を基に、 3 o e a s e センス (S) ) を用いてR A 成を行い、 3 o e a s eで 転写 応を行ってセンス 列を調製した (g 24)。 様に 7 o e a s e アンチセンス AS) ) を用いてR A 成 を行い、 T7 o e a s eにで転写 応を行ってアンチセンス 列を合成した 25)。 以下の 3に示す。 で2 得られたセンス R 、 アンチセンス鎖は タノ ル によっ て回収し、 E ツファ 2０ で懸濁した。 R a s e
o と を添加し R による分解を抑えた。 3
nV o ansc p o
Tempa e 22０ ng 2 」
０ X Ru e 2 HL
0 x NTPMx 2 」
RNase nhb o 4０ 」
T3o T7 poyme ase 2 R A 度の
、 a o o に R A 度を測定した。 その 果、 セ ンス鎖は ０ g 、 アンチセンス鎖は8 5 であった。
プロ ブの
A o s e c 、 GEヘルスケアバイオサイエンス ) のキットに付随する にて プロ ブを調製した。 まず、 上述したア ンチセンス R Aを滅菌 を用 て ０ に希釈したもの6０ ( 6００ ) を99 9 で 、 急冷した。 キットに されて いるR e a c o b f e 6０ ab e a 、 C o s s e 6０ の順に熱 R Aに添加し、 37 で3０ インキ ベ ト 、 標識プロ ブを作製 した。
検出用メンブレンの
まず、 タ ゲットとなるセンス R A、 アンチセンス R Aを
～5０ 6 階の 度に を用いて 釈したものを、 それ ずつプラスのチヤ 持つ ンブレン ・、 GE ヘルスケアバイオサイエンス にアプライした。 その 、 80Vで2 キングした。
ハイブリダイゼ ション
出用メンブレンの 製で作製した ンブレンをキットに されてい るハイブリダイゼ ションバッファ に移し、 55Cで 5 プレハイブリ ダイゼ ションを行った。 その 、 上述した プロ ブを濃度が5０
となるよ に添加して55 で一晩 4 ～ 6 間程度) ハイブリ ダイゼ ションを行った。
ンブレンの
イブリダイゼ ション 、 メンブレンをWa S バッファ 4) に 移し、 55 で と しながら 5 した。 この 作を2 繰り返した。 その 、 Wa S 1バッファ ( 5) にて した。 この 作を2 繰り 返した。 4
Wash 、ソファーの
Uea 2M
SDS 0
Naphos ha e pH70 50mM
NaC 150mM
M CU M
Bockn ea en ０2 5
Wash フアーの
Figure imgf000037_0001
発色法による検出
M バッフ 6) で室温 験した日は 8～22C )、 S した ンブレンを 375
8 BC P M ) に移し、 室温で2 間、 で発色させた。 なお、 B とは、 tr b u t tr u h r de の 称であり BC Pは r 0 h r n y Ph ph t t u d n tのことである。 6
NTMTx 、ソファ の
Figure imgf000038_0001
ドットブロットの 果を図7に示す。 プロ ブ 相補 なセンス鎖の ンブ レンでは のドットまで検出できた。 また、 アンチセンス鎖 でも 5０ ０ のドットに シグナルがみられた。 なお、 この 、 タ ゲ R Aの に使用した 型の Aが aS e で 処理できず って た可能性が考えられる。 また、 洗浄 作の際に温度が低下 し、 ストリンジ ンシ の 下による 考えられる。
2 D O S e c のプロトコ ルに準じた系における G S e ルチラベル プロ ブを用いた場合の 度の
GaS e ルチラベル の
のセンス R A、 アンチセンス R Aの 製に加え、 7、 t じて G S ルチラベル 7 o e a s eを用いて同様に調製した。 製後、 aS e で処理し、 タノ ル
R Aを濃縮 製して E ツファ 2０ にて懸濁した。 また、 R a s e o と も 加し、 新規 ルチラベル プロ ブを作製した。 7
TGase ルチラベル nV o ansc p on
Tempa e DNA SHHPCRP oduc 400n L) 2
x e 2 」
NTP Mx 2
RNa e b U ) 」
」
T7 e a e 」
T 8
NTPMXの
Figure imgf000039_0001
R A 度の
、 a o o に R A 度を測定した。 下に 果を示す。
) z QG P ０ 4 ０
2) z QG P 2０ 424 (3) z QG P 4０ 37 8
4) z QG P 6０ 368
5) z QG P 8０ 3
6) z QG P ００ 2 56
プロ ブの
Z QG Pを異なる割合で取り込んだ Ga S e ルチラベル 酸を99・ 9 でS 間熱 、 急冷した。 した核酸を用いて 9 の 件となるよ に反応 液を調製し で6 させて ルチラ ベル プロ ブを作製した 23) 9
Z QG RNA 5０ n u」
puAP ０・4 m mL
MTG 5 U mL
T s HC pH80 100 mM
RNase nhb o U u」 下、 上述した実験 の 出用メンブレンの 、 イブリダイゼ ション 、 メンブレン 行った。
発色法による検出
発色 の 度を ( 験した日は 8～22V ) と 50 に設 定し、 それ以外の 実験 の 色法による検出 作に準じて行った。 その 果、 ルチラベル プロ ブを用 てA o s e c のプロトコ ルに準じて検出した結果を図8に示した。 発色 応を行 った場合には、 Z QG Pの 合が2０～4０ プロ ブでは ０ まで、 Z QG Pの 合が6０～ ０ プロ ブでは のドットまで検出することができた。 また、 5０でで発色 応を行っ 場合では、 Z QG Pの 合が2０ ０ 、 4０～6 ０ 8０～ ０ のドットまで検 出できた。
上より、 Z G 合の 加に伴って・ 向上することが分 かった。 また、 室温での 件下ではZ QG P 6０ 上の時、 のターゲット の 出に成功した。 また、 発色 の 度を新規 アルカリ スファタ ゼ P AP) の 温度に近づけると、 Z Q G P 8０ 上で市販のA o s D e c の
００ ) 同等の 度で、 コントラストの 像を得ることがで きた。
( 2 ドットブロットによる S プロトコ ルに準じた検出 度の )
P AP ルチラベル R Aプロ ブの および
胞組織 での 伝子 バタ ンが既知であるソニックヘッジホッグ 伝 子 (s ) をタ ゲットの R Aとする。 まず、 PCRによってs を コ ドする ０００ ) を得た。 この 、 遺伝子の に は 3プロモ タ 、 下流 には 7プロモ ターが含まれるよ プライ 計を施した。 次に、 得られたPCR 物を基 7 Po e a s eを 用 て転写 応を行った ( ０)。 この 、 Pの わりに、 実験 で合成 したZ QG Pを 割合 ０～ ０ ) にて えることで、 の なるZ QG R Aを調製した。 られたZ QG R は タノ ル によって回収し、 アガロ スゲル および イクロチップ
(B o Ra E e o ) により 価した。
nv o ansc p o c 0XTa sc p o B e XB e
PCR 20 g
ATP CTP GTP TP Z QG TP
R ase b o ０ s
T7R A oy e ase ０ s
Ta sc o B e =０4 T s C P 8０ 6０ gC2 ００ d o e o 2０m P AP ルチラベル R Aの
伝子工学的手法により、 が認識する を含んだ
M GGGS) 2GS) を導入した 4 P APが M G によってZ QG R A 結合するか検討するために、 まず、 割合の Z QG TPを用 て調製したZ QG R Aを、 99 9 まで加熱 した後、 急冷することによって、 変性 理を行った。 て、 ０ M 「 S C P 8 ０) 中にて、 各種Z QG R A5０
4 P f P ０ G5 R a s e o ０ の 件下にて、 6 応を 行った。 コントロ ルとして、 M G 加の 合にも同様の 作を行い、 反 応は ガロ スゲル によって評価した。
トブロットによるプロ ブ
s S タ ゲ ) を ンブレン上に固定化し、 P f AP ルチラ ベル プロ ブ s アンチセンス、 AS) を用いて検出を試みた。 まず、 S S 3 PO e a S eにより調製) の
(5０ 、 ０ 、 ・ ) を 調製し、 メンブレンに ずつスポット 、 オ ブンにて 定した 80 、 2 )。 その 、 表 に示す 作を行 、 P P ルチラベル プロ ブを用いてS Sの 出を行った。 コントロールとして、 S AS 鎖を同様にして 定化した ンブレンを調製し、 これを用 て行った。 、 の 2に記す。 SHプロト によるターゲット 作条件
Te T e
PBSTx R・T 0 3 yb dza o yb dza o e R・T・ 2 b dza o e 6 60
50 p obe b dza o B e 60 0 o s
P obe Was 6０ 20 3
Was 2 55 20 3 T Tx RT・ 5 2
A S a g R・T 2 o ・
2
B。 e の
PBSTx PBS 0 T o X 00
b dza o 50 Fo a de 5XSSC p 70 2 Case 0 T o X 00
0 C APS o a eas R A 5 EDTA 50 g epa
Was 50 o a de 5XSSC 45 0 T o X 00 0
C APS
Was 2 50 Fo a de 5XSSC 70
T Tx m aC 00 T s C 95 50 gC12 0
T o X 00
Sa 375 g BT 88 C P T Tx Z QG ルチラベル R の
PとZ QG Pの 合を変化させてR Aを調製した際の結果を 、 gA gBに示す。 より、 いずれの 件にお てもR の 成に 成功して ることから、 合成したZ QG Pは、 比較的 な とし て、 7 Po e a s e 識されることが分かる。 また、 Z QG Pの 加とともに高分子 とシフトしていることから、 Z Q G Pの 度を変化させることによって、 Z QG R A のZ QG P が調節 能である。
P f AP ルチラベル プロ ブの
それぞれ の なる、 Z QG R Aに対して、 M Gを用 てP APラベル化を行った際の結果を図 ０に示す。 a e2はM G 、 a e3はM G の 果である。 2０ ～ ０ 件では、 M G にお て高分子 側 のシフトが見られるが、 Z QG P が０ 際には確認されないために、 入したZ QG Z QG Pが ベル されたことが分かる。 また、 Z QG の 加とともに 側 のシフトも大きくなって ることから QG Pの 合を変 化させることによって、 プロ ブのP APのうベル が制御 能である ドットブロットによるプロ ブ
製したP f AP ルチラベル R Aプローブの プロ ブとしての 能につ て検討するためにドットブロットを行った ) AS アンチ センス) 鎖を ンブレンに固定化した際にはスポットが確認されな ことから 、 塩基配列 な検出ができている。 2０～ ０ プロ ブにおいて のセンス鎖の検出が可能であった。 上のことから、 転写 Z QG P 度を変化させることによって、 得られる R A中の Z QG 、 その後のM GによるP f Pラベル が制御 能なこ とが示された。 なお、 実施 とは異なり、 Z QG 加に伴う検出 上は確認されなかった。 この 由としては、 上記 に示す様に 、 ハイブリ イズ および 件が、 A o s e c 件 に比 るとかなり厳しい条件であることが挙げられる。 ０に示すように ずれの 合にお ても、 P APラベル した際のバンドはブロ ド して おり、 P Pが 一に導入されて るとは言えな 。 そのため P の 数が少な プロ ブ、 ある は 飾のプロ ブの方がより強固にタ ゲット AS イブリ するため、 いずれの 合にお ても同等の 度となったのではな かと推察される。 また、 Pの 入に伴うプロ ブの 成能 下の 能性も、 その 因として げられる。
方、 超 素であるP APを活性化させるために、 の 度を 温から 50 度まで上昇させれば、 現段階においても更なる感度 上が見込まれる。
高温 件での 色を行 場合の ベル プロ ブによる S の 明における核酸プロ ブに ベル されたP APは、 室温よりも高 温 件でより高 触媒 性を発現する。 そこで、 の の 度を、 室温から 5０でに上げた場合の 度を評価した。 ベル プロ ブとしての 能を評価するため、 まず、 A o s e c キットにより得られる酵素 プロ ブ 、 明のP APラベ ル プロ ブの 、 S 件にお て検討した。 、 プロ ブをキットにより調製する以外は、 上述 様の 作により ドッ トブロットを行った。 その 果、 のセンス鎖の検出が可能であっ た 2)。 このことから、 今回 たに調製されたP P ルチラベル プロ ブは、 S 件下にお て、 市販のA o s e c により調製されたプロ ブ 同等の 度を有するプロ ブとして利用で きることが示唆された。 そこでは、 最終的に核酸を検出するステップ、 すなわ ち、 (アルカリ スファタ ゼ) 位による発色 応における 度を 行って た。 方、 本 明の プロ ブに ベル されたP f Pは、 室温よりも高温 件でより高 触媒 性を発現する。 そこで、 ０の
の 度を、 室温から 50 に上げた場合の 度を評価した。 その 果、 図 3 すように、 検出 Z QG 合により異なり、 Z QG8０ ０ から z QG6 ０ にお ては ０ の 酸を検出することが可能であり、 上述した 実験 のA o s e c プロ ブを用 た場合 (
より、 少なくとも 2 度、 検出 度の 上が可能なことが明らかとなった 上述した実施 では、 以下に示すような 度決定したサンプルを用 て実験 を行った。
Z QG Pの
a oa Pの (⑥ 29０ )
am Pを E B f f e 8 ０) 解 した後、 0、 ０ ０2 ０ ０4 ０ ０6 ０ ０8 ０ Mとなるよ うに調製し、 吸収スペクトル 定を行った 4)。 スペ より 29０ の 度を算出し 線を作成した 5)。 、 4のスペクトルは、 スペ ヤ トの 度の いのが０・ Mであり、 以下 0 ０8 M ０6 M ０ ０4 M ０2 M M が下がって る。
5より、 29０ の 数が 出される E 29０ 576０M c 、 市販のa o a P S G A ) の 度が 84 であることを考慮すると、 29０ 686０ c となる。 なお、 29０ におけるZ Gの はほとんどな ため、 Z G Pサ ンプル中に 応のZ QGが混入していたとしても、 濃度決定 の 無 視できる。
Z QG Pストツクサンプルの
P Cによる精製後、 凍結 によって溶媒を除去し、 2 ) に溶解した。 その 、 S e e a cを用 て した この 、 出物 が見られたため、 応のZ QGが 出して ると考えられる。 縮に伴い a 同形の は増加したため、 Z QG Pの 出ではな と考える)。 、 上 回収し、 E f f e Zよって 0 釈した後、 a o o ) を用 て 度測定を行った所、 吸収 ABS ・ ０6 であった。 したがって、 希釈前のZ QG P Cは により算出される。
)
０6 686０ c X０ XC ０ したがって、 C 5 である。
( 3)
Z QG Aを用 たP f AP ルチラベル Aプロ ブの ドットブロットによる検出 度の
Z QG Aを用いたP f APマルチラベル Aプロ ブの トブロ による検出 度の 価を行った。
Z QG Pの ・
まず、 メチルホルムアミ ド M ) 4 中にて、 ０ M ソプロピ C M キシスタシン S) 5 M z QGを、 室温 製した日は 8～22 ) で2０ させることによって、 S化Z QG 5 M 調製した。 5０ M 5 3 a o a ) P a Oa P S M を含む 0 s C 7 5) A O ) 6 と2０ M ( 8 8) 4０ 、 6 とを混合し、 M a o a P 液を8０ 製 した。 この 対して、 上記で調製した S化Z QG 液を8０ 加し、 25 で一晩 させた。 了後、 サンプルをM Qで ０ 釈し、 P C 本分光製、 高速 クロ トグラフ・ポンプ R R R V 、 バリアブル ル プ・インジ ク 型 、 紫外 EC ００ V型) によって、 3に 示す 件で 製を行った。 の MA O MS BR ER A CS 、 a o e 1 ) によって行った 。 果を図 7に示す。 この 、 3 コリン 3 PA) を トリック として使用した。 3
PLC
ne s ODS 3 10mmx250mm
A ００ mM T AA pH 7０) B ace o Ⅲe
A 98 88 5mn
A 88 7 3０mn)
グラジ ント
A 73 63 ０mn
A 63 98 5mn
5０ mL n
260 nm
Z QG Pを合成した後、 逆 P Cを行った際の結果を図 8 に示す。 a O a Pの 9 ) 比較して、 に新たなピ クが出現しており、 このピ タがZ QG Pであ ると推測された。 そこで、 保持 9・ 分のピークを回収して A
O MS 行った。 その 果、 図 7に示すよ に、 84 46の ピ クが確認され、 理論 842 良く一致した結果が得られた ため、 Z QG Pの 成が示された。
PC よるZ QG Aの
まず、 ウス 来のSo c S ) をコ ドする 遺伝子中の 3００b 27) をPCR 幅するプライ を設 計した 4、 配列 28 29) PCRのテンプレ トには ウス 来のS をコ ドする遺伝子の 99０ ) を組み込んだプラス
Aを用い A o e a s eとして O YOBO ) を使用して反応 を調製した 5、 ) PCR 94CX2分を サイタル、 94 X2０ 、 52CX2０ 、 72でX 5 秒を3０サイクルとした。 PCR後、 アガロ ス で増幅 片を確認し た。 られた増幅 、 M E e PCR P f c a
Q GE ) で 製し、 a o o に Z G Aの 度を測定した。 4
Sh 3 bp プライマー プライ ー
Sh 3００ me 5 AGGAAAACACGGGAGCAGAC 3
Sh 3 ０ me 2 5 TCTCTGCTTTCACAGAACAG 3
O
PCR 2n プラス DNA 8 」 24ng
1０ M S 3００ me 3 L ０・3 M
1０ M S 3００ rme 2 3 03 M
KOD Fx 2 2Un
5mM dATP dCTP dGTP 1０ 」 5m
5mMdTTP Z QG dUTP 3 ０ 」 ０ 5mM
2xBu fe 5０ x
24
To a 1００ 6
Z QG dUTP 0 Z QG dUTP 50 Z QG dUTP 100 dTTP 5 mM ０75 mM
QG dUTP 075 m 5 mM
Z QG d Pの 合を変化させてPCRした際の電 の 果を図 2０ 。 Z QG Pの 合を5０ ０ としてPCRした 場合でも増幅 片のバンドが確認されたことから、 Z QG Pは A o e a s eの として認識されていることが示された。 また z QG Pの 合の 加に伴ってバンドが高分子 シフトしてい ることから、 PCRを行 際のZ QG TPの量を変化させることで、 Z Gの を調節することが可能であることがわかった。 製後に a D でそれぞれのZ QG Aの 度を計った結果、 Z QG d P ０ 調製したZ QG Aは7 3 8 、 Z Q G TP 5０ 調製したZ QG Aは 6 、 Z QG P ００ 調製したZ QG Aは59・ は であった。
Z QG A のP APのうベル化の検
伝子 的にM Gが認識 能な ジン ) を含む を 導入した 4 P APがMTGによってZ G Aに結合する かを、 Z QGの が異なるZ QG を用 て検討した。 まず、 ０ M s C 8 ０) 中にて、 各種Z QG A 5 4 P f AP ０ 4m M G 5 の 件下で4 、 6 させた。 M G 加の 合 も同様に検討した。 P APのうベル化の確 ガロ ス で行っ た。
M G ガロ ス の 果を図2 に示す。 Z QG P 5０ ０ 件で調製したZ QG Aを用 た場合はM G に高分子 シフトして るが、 Z QG Z Q G P ０ 件で調製した 対照 ) では分子 シフトが確 認されなかった。 また、 Z QG Aに対して、 M G にも高分 子 確認されなかった。 この より、 4 P PはM G よってZ QG AのZ QG部 に結合して ることがわかっ た。 また、 Z QG P 5０ 合より Z QG P ０ ０ 件で調製したZ QG Aを用 たほうが、 より明確に高分子 化が進んで ることから、 PC よる増幅の際のZ QG Pの 合 を変えることによって、 P f APの を調節することが可能なことが示 された。
P AP ルチラベル Aプロ ブの
Z QG P 5０ ０ 件で調製したZ QG A と 4 P APをM G 結合し、 P AP ルチラベル Aプロ ブを調製した。 まず、 各種Z QG Aをg ０でで5 間熱処理 して Aを一本 に変性させた後、 ０ M S C 8 ０) 中にて、 各種Z QG D A 25 、 P f P ０ 4 G 5 で C 、 6 させた G 前 処理プロ ブ)。 プロ ブは熱処理 で一本 にすることがプロ ブの に大きく影響することから、 熱処理し ていないZ QG Aにつ ても同様の 件でP Pのうベル化を行 、 その 、 90 で5 間熱処理を施したプロ ブも調製した G 処理プロ ブ)。 D Aプロ ブのP f APラベル化の確 ガロ ス で行った。
MTG ガロ ス の 果を図22に示した。 M G 前 に熱処理したZ QG およびM G に熱処理したZ QG Aとも高分子 シフトして ることから、 Z QG のP A Pのうベル化が確認された。
ドットブロットによる検出 度の
それぞれ調製したP AP ルチラベル プロ ブの 度の 価を トブロットで行った。 なお、 イブリダイゼ ション時の各 およびプ ロトコ ルは、 市販の キットA o s e c GEヘルス ケアバイオサイエンス ) Z した。 タ ゲット Aとして、 プローブ 列を含む99０ のS の A 3０、 プライ
7 3 ))、 およびプロ ブ 同じ 3００ の S の A 片を用 た。 また、 ネガティブコントロ ルとして、 P APをコ ドする遺伝子 ・ の A ( 32、 プライ
8 ( 33 34)) を用いた。 7
Figure imgf000052_0001
プライマー
PuAPP me 5 TAATACGACTCACTATAGGG 3
P uAPP me 2 5 TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3 それぞれのタ ゲ Aを E B を用いて5０
と 5０ 釈し ネガティブコントロールは5０ のみ) 、 それぞれを ずつプラスチヤ ンブラン 、 G Eヘルスケアバイオサイエンス ) に 、 8０でで2 間熱処理す ることで を ンブランに固定した。 その 、 検出 に されて る イブリダイゼ ションバッファ に ンブランを移し、 55 で3０ 間 、 プレ イブリダイゼ ションを行った。 そして、 上記 法で調製した各種P f P ルチラベル プロ ブを 5０ となるように イブ ダイゼ ションバッファ に添加して、 55 で一晩 4 ～ 6 間 程度) イブリダイゼ ションを行った。
イブリダイゼ ション 、 メンブレンをWaS バッファ 9 ) Z 、 55 で しながら 5 した。 この 作を2 繰り返し た。 その 、 室温 ( 験した日は 8～22C ) でW 1 バッフ ァ 2０) に 5 した。 この 作を2 繰り返した。 9
Figure imgf000053_0001
2０
Figure imgf000054_0001
フア ( 2 ) で室温、 5 した ンブランをS a (375 8 BC
) に移し x Z2 間、 で静 して発色さ せた。 2
Figure imgf000054_0002
P APラベル Aプロ ブのドットブロットの 果を図23に 示した。 どの 用 た場合も のシグナルが検出されてい ることから、 M Gを用いてZ QG A P Pで した Aプロ ブは、 核酸プロ ブとしての を有していることが示された。 ま た、 MTG に熱処理する場合 M G 処理プロ ブ) よりも、 M G 前にZ QG を熱処理する場合 M G 前 処理プロ ブ) の方が、 検出 度を向上できることがわかった。 これはM G 処理プロ ブでは、 P APが ベル された Aプロ ブを熱処理する ことになるため、 熱処理 の 量の 加により 処理が不十分となり Aが完全に熱 されなかったことや、 ラベル された状態での 処理による P f APの が考えられる。
M G 前 処理プロ ブでは、 Z QGの 5０ および ０ プロ ブのどちらも 5０ のドットまで検出することができた。 ネガティブコントロ ルにおけるタ ゲット 度が5０ 高 場合には、 なシグナルも 出されたが、 相補 な Aを明確に 判別することができた。 また、 タ ゲット の の いは、 検出 度に 大きな影響を与えなかった。
4)
Z QG Aを用 たP AP ルチラベル Aプロ ブの S プロトコ ルに準じたR A
3では、 検出 Aであった。 実施 4では、 検出 酸をR Aとした場合の、 P P ルチラベル プロ ブの プロ ブとしての 能について評価した。
PC よるZ QG D の
3 同様にして、 PCRによるZ QG の 製を行った。 P AP ルチラベル Aプロ ブの
Z QG P 5０ ００ 件で調製したZ QG A と 4 P APをM Gにて結合し、 P AP ルチラベル プロ ブを調製した。 まず、 各種Z QG Aを 0 で5 間熱処理 して Aを一本 に変性させた後、 ０ M C 8 ０) 中にて、 各種Z QG A 25 、 P P ０ 4 M G 5 の で4C 、 6 させた。 Aプロ ブのP APラベル化の確 ガロ ス で行った。
M G ガロ ス の 果を図24 した。 Z QG Pを5０ ０ 入したZ QG D AはどちらもM G に高分子 バンドがシフトしていた。 この より Z QG D A のP f APのうベル化が確認されたため、 これらをドットブロ の Aプロ ブとして使用した。
S プロトコ ルに準じたドットブロットによる検出 度の
3 同様にして、 PCRによってプロ ブ 列を含む99０ のS の A 3０) を得た。 この 、 S 伝子の
[ 7プロモ タ が含まれるようプライ ( 3 7 ) を施した。 次に 得られたPCR 物を基に 7 P e aS eを用いて転写 応を行った 22)。 、 ゲル カラム M Q c S Co s Ro c e ) で
P等を精製したものをタ ゲットR として た。 22
Figure imgf000056_0001
られたタ ゲットR を を用 て5 、
5０ の 段階に希釈し、 それぞれを ずつプラ スチヤ ンブラン 、 GEヘルスケアバイオサイエン ス ) Zスポット 、 80 で2 間熱処理することでR Aを ンブラン に固定した。 ネガティブコントロ ルとして、 市販の R A R bo c e c o a e a s R 、 ・アルドリッチ製 ) を5０ に希釈したものを同様に ンブラン スポット 、 固定化した。 その 、 ハイブリダイゼ ションバッファ 23) 中に ン ブランを移し、 0 で3０ 間、 プレハイブリダイゼ ションを行った。 そ して、 上記 法で調製した各種 プロ ブを 5０ となるように 添加し、 60 で一晩 4 ～ 6 間程度) イブリダイゼ ションを 行った。 23
Fomamde 50
SSC pH70 5x
Casen 2
T onX 100 ０
CHAPS ０
o ayeas RNA mが L
DTA 5mM
Hepa n 50ug mL イブリダイゼ ション 、 メンブレンの 作を行った。 液 を表24に示す。 メンブランをW 1バッフア に移し、 60Xで しながら 2０ した。 この 作を3 繰り返した。 そして、 55 でW フア に 2０ した。 この 作を3 繰り返した。 て フア を用いて 験した日は 8～22X ) で5 間、 2 、 洗浄した ンブランを (375
B 8 M ) に移し、 0 で2 間、 して発色させた。 24
Figure imgf000057_0001
P f APラベル プロ ブの S プロトコ ルに準じたドッ トブロットの 果を図25に示した。 Z QGの 5０ および ００ のどちらの Aプロ ブも のドットまで検出することができ 、 シグナルの 度もどちらのプロ ブを用いた場合もほぼ同等であった。 また、 ネガティブコントロ ルの なシグナルは検出されなかった。 こ のことより、 M Gを用 てZ QG AにP Pを した Aプロ ブは、 Aを検出するプロ ブとして利用 能であることが明らか となった。
( 5)
2 同様にして、 常温 であるE s c e c a C o 来のAP BAP) を用 て ルチラベル した ルチラベル プローブ につ ても、 プロ ブ 価を行った。
BAP ルチラベル R の
2 同様にして、 R の 理を行った後に、 続 て、 ０ M S C 8 ０) 中にて、 各種Z QG R A 5 ０ 4 BAP ０ 4 G 5
、 R a s e b o ０ の 件下にて、 6 応を行った。 コントロ ルとして、 M G 加の 合にも同様の 作を行い 、 反応は ガロ スゲル によって評価した。
ドットブロットによるプロ ブ
2 同様にして、 トブロットによりプロ ブ能につ て評価した うベル した際の分 化を図26に示す。 より、 Z QG に 比例して 顕著な分子 加が生じた。 また、 Z QG R A ０ ) を用 た際には、 分子 分布が小さくなっていることが確認された。 R A Z QG Pのみを使用した場合には、 Z QGが導入される数や 位置が単 となるため 上 ての )、 ほぼ 一にうベル化が進行したと 考えられる。 P ０) に比 て しい分子 加が見られた点か ら、 Z QG R との 応性はBAPの方が優れて ることが示唆される 果となった。
方で、 得られた AP ルチラベル R を用 、 ドットブロットによ ってプロ ブ能を評価した 27 )。 より、 Z QG 6０ 8０ ０ R に対してBAPラベル化を行った際にお て、 度のR Aが検出 能であった。 2０ 4０ おいてほとんど 出されなかった理由としては、 BAP 飾のR が残存して るためであ ると予想される 26 )。 P Pを ベル した際のプロ ブ
０ ) 比較すると、 における標識 素としてはP APの 方が適して ることが示された。
6 M GによるZ QG R の ベル およびドット ブロットによる標的 の )
A e a o 555 ルチラベル R の
素として、 一級アミン された e a o
) 555 C a a e e o e ) が M GによってZ QG R A 結合するかについて検討した。 まず、 Z QG P ０ 件で調製したZ QG R Aを、 99 0 ま で加熱した後、 急冷することによって、 変性 理を行った。 て、 ０ M T S C 8 ０) 中にて z QG R A 5０ e a o 555 C a a e e 2０ はM M G o s R a s e
０ の 件下にて、 6 応を行った。 コントロ ルとして、 M G 加の およびZ QGを導入していない R Aに対しても同様 の 作を行い、 反応は ガロースゲル によって評価した。
M Gを用いて、 Z QG R Aに対してA e a o 55 5 C a a e eラベル化を行った際の結果を図28に示す。 ここで a e 2は 飾のR AとA e a o 555 C a a e eを、 a e3は a e2の 件にM Gを加えたものを、 a e4にはZ QG R AとA e a o 555 C a a e eを、 a e5には a e4にM Gを加えたものを示す。 a e4 Sにお て R Aとほぼ同等の 置に見られるシグナルは 応のA e a o 555 C a a e eに由来するも のと考えられる。 このことは、 エチジウム 前に a e2～4の いずれの においても同様のバンドが確認されたことからも支持される a e2と a e3では変化が見られな のに対して、 a e4と a e5とを 較すると、 G にはZ QG R A 来のバンドが 消失し、 側 のシフトが確認された。 このことは、 負電荷を帯びた e a o 555 C a a e eがZ QG R Aに 結合したことを示しており、 A e a o 555 ルチラベル R Aの 成が示唆された。
ドットブロットによるプロ ブ
s S タ ゲ ) を ンブレン上に固定化し、
555 ルチラベル プロ ブを用 て検出を試みた。 まず、 5０ の s Sを調製し、 メンブレンに 加し、 乾燥 させた後、 再度 加し ０００ )、 オ ブンにて 定化した ( 80 、 2 )。 その 、 表25 作を行 、 蛍光イメ ジ B
RA Mo e c a a e X P o 532 e xc a o 555 o a s s ) を用いて e a o 555 ルチラベル プロ ブによる s Sの 出を行った。 コントロ ルとして、 s AS鎖を同様にして 定化した ンブレンに対しても同様の 作を行った。 なお、 の 26に示す。
25
Aexa Fou 555 ルチラベル NAをプロー として た際の トブロ
Tem T e
P STx R・T ０ 3 yb dza o B e
RT 2 yb dza o B e
b za o 6０で 60
500 g obe yb dza o
60C 0 o s e
Was 60T 20 3
P obe Was 2 55で 2０ 3
T Tx RT 5 2 26
用した各種 u e の
P STx P S 0 T o X 00
50 Fo mamde 5XSSC 70 2 Case 0 T o X 00 b dza o 0 C APS g o ayeas R A 5 EDTA 50 e a
50 o amde 5XSSC 45 0 T o X 00 0
Was
C APS
Was 2 50 Fo amde 5XSSC 70
m aC 00 T s C 95 50m gC12 0 T Tx
T o X 00 製したA e a o 555 ルチラベル R Aの プロ ブとしての 用性について検討するためにドットブロットを行った ( 29 )。 AS鎖を固定化した際にはシグナルが得られなかったのに対して、 S を固定化した場合には 光が確認されたことから、 A e a O「 O ルチラベル R Aはプロ ブとして応用 能であることが示された
。 また、 塩基配列 異性を保持して るため、 今後、 イブリダイゼーション 程の 度やホルムアミド 度を最適化することによって、 より高感度な検出 が期待される。

Claims

求 の ・ グルタミン G ) を有することを特徴とする クレオシド リン 導体。
2 求の 項に記載の オシド リン 導体であって、 下記 ) で示されることを特徴とする オシド リン 導体。
Figure imgf000063_0001
) 、 Aは、 グルタミン G ) を有する 、 は水素原 子または 基を表す。
3・ 求の 項に記載の クレオシド リン 導体であって、 下記 2) で示されることを特徴とする オシド リン 導体。
2
Figure imgf000063_0002
2) 、 およびA の ち なくとも つは、 グルタミン G ) を有する で残りは水素原子を表し Bは水素原子または
基を表す。 4・ 求の 項に記載の クレオシド リン 導体であって、 下記 3) で示されることを特徴とする クレオシド リン 導体
Figure imgf000064_0001
( (3) 、 Aは、 グルタミン (G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。
5・ 求の 項に記載の クレオシド リン 導体であって、 下記 (4) で示されることを特徴とする クレオシド リン 導体。
Figure imgf000064_0002
4) 、 は、 グルタミン G ) を有する 、 Bは水素原 子または 基を表す。
6・ 求の 項に記載の クレオシド リン 導体であって、 下記 (5) で示されることを特徴とする クレオシド リン 導体。
Figure imgf000065_0001
( 5) 、 XおよびYは、 それぞれ 立して2価の連 を表し、 Zは、 置換 を表す。) 7 求の 6項に記載の オシド リン 導体であって、 前記XおよびYは、 それぞれ 立して 素数 ～48のアルキレン または 素数2～48の レン基であり、 Zは、 炭素数 ～48のアルキル 、 炭素数 ～48のアルコキシ 、 炭素数6～48のアリ ル 、 炭素数6～ 48のアリ ルオキシ 、 炭素数7～48のアリ ルアルキル または 素数 7～48のアリ ルアルキルオキシ基であることを特徴とする クレオシド リン 導体。 8・ 求の 7項に記載の クレオシド リン 導体であって、
は レン 、 Yは チレン基であり、 Zは オキシ基であ ることを特徴とする クレオシド リン 導体。 9・ 位として、 請求の 項から 求の 8項のいずれか 項 に記載の クレオシド リン 導体が複数個 入されている核酸であること を特徴とする核酸プロ ブ。 ０・ 求の 9項に記載の プロ ブにおけるグルタミン (G ) の ち なくとも2つに、 リシン S ) または第 級アミ を有 し 分を含む 合物が結合されて構成されて ることを特徴とする ルチラベル プロ ブ。 ・ 求の ０項に記載の ルチラベル プロ ブであって、 前記 分が、 および 素のうち なくとも つであることを特 徴とする ルチラベル プロ ブ。 2・ 求の 項に記載の ルチラベル プロ ブであって、 前記 素が、 来の 素であることを特徴とする ルチラベル プロ ブ。 3・ マルチラベル プロ ブの製 法であって、
トランスグルタミナ ゼ Ga S e) を用 て、 請求の 9項に記載 の プロ ブにおけるグルタミン G ) のうち なくとも 2つに、 リシン ( S) または第 級アミ を有し 分を含む 合物を 結合することを特徴とする ルチラベル プロ ブの製 。 4・ 求の 3項に記載の ルチラベル プロ ブの製 法で あって、
前記 分が、 および 素の ち なくとも つであることを特 徴とするマルチラベル プロ ブの製 。 5 求の 4項に記載の ルチラベル プロープの製 法で あって、
前記 素が、 来の 素であることを特徴とする ルチラベル プロ ブの製 。 6 の 出方法であって、
請求の ０項から 求の 2項のいずれか 項に記載の ルチ ラベル プロ ブ 、 対象 に存在する標的 とを核酸 分により特 異 に結合させ、 結合している前記 ルチラベル プロ ブを、 前記 分により検出することを特徴とする標的 の 出方法。 7・ の 出方法であって、
請求の 9項に記載の プロ ブ 、 対象 に存在する標的 と を核酸 分により特異 に結合させた後、
トランスグルタミナ ゼ Ga S e) を用 て、 前記 プロ ブにおけ るグルタミン G ) 、 リシン S) または第一級アミ を 有し 分を含む 合物のリシン ( S) または第 級アミ と を反応させて複数の 分を導入し、 結合して る前記 プロ ブを、 前 記 分により検出することを特徴とする標的 の 出方法。
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