WO2009153888A1 - 薬物担体 - Google Patents

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WO2009153888A1
WO2009153888A1 PCT/JP2008/063641 JP2008063641W WO2009153888A1 WO 2009153888 A1 WO2009153888 A1 WO 2009153888A1 JP 2008063641 W JP2008063641 W JP 2008063641W WO 2009153888 A1 WO2009153888 A1 WO 2009153888A1
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WO
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drug carrier
production example
pharmaceutical composition
prepared
preparation
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暁 園家
稔浩 上田
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日本新薬株式会社
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    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system

Definitions

  • the present invention relates to a novel blood retention type drug carrier.
  • RNA interference Nucleic acid drugs such as these have attracted attention and are actively studied. Since the nucleic acid drug is difficult to be transferred to the affected tissue even if it is administered alone in a living body, for example, intravenously, for example, the nucleic acid drug is included in a suitable carrier or administered locally to the affected tissue. It is necessary to administer it with certain measures such as.
  • Examples of drug carriers for transferring nucleic acid drugs to affected tissues include cationic liposomes such as Lipofectin (registered trademark), Lipofectamine 2000 (registered trademark), Oligofectamine (registered trademark), 2-O- (2 -Diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol (hereinafter referred to as "Compound A”) and a phospholipid as essential components (hereinafter referred to as "Compound A liposome”), etc. (For example, see Patent Document 1).
  • Lipofectin registered trademark
  • Lipofectamine 2000 registered trademark
  • Oligofectamine registered trademark
  • 2-O- (2 -Diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol hereinafter referred to as "Compound A”
  • Compound A liposome a phospholipid as essential components
  • cationic liposomes tend to accumulate in the liver and spleen when administered systemically, for example, via veins, and therefore are expected to be applied as therapeutic agents for liver cancer and hepatitis by including a nucleic acid drug therein.
  • a complex of a compound A liposome and a synthetic double-stranded RNA such as poly I / poly C is effective for the treatment of liver cancer and hepatitis (for example, Patent Document 2 and Patent Document 2). 3, see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • these cationic liposomes are useful as carriers for accumulating nucleic acid drugs in the liver and the like, but they stay in the blood and in tissues other than the liver and spleen (for example, lung, kidney, pancreas, heart). It is not sufficient as a carrier to be transferred.
  • An object of the present invention is a blood-retention type drug carrier mainly containing a polyethylene glycol-modified phospholipid and compound A, characterized by containing the polyethylene glycol-modified phospholipid in a specific concentration range. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition containing the drug carrier including the drug carrier and the drug.
  • the present inventors have found that a polyethylene glycol-modified phospholipid having a specific structure and a compound A as essential constituents, the polyethylene glycol-modified phospholipid is contained in the drug carrier. It has been found that when added at a high concentration of 30 to 50% by weight with respect to the total weight of the lipids of the present invention, it has a high blood retention and can exert the medicinal effects of the contained medicine in vivo. completed.
  • a polyethylene glycol-modified phospholipid represented by the following general formula (I) (hereinafter simply referred to as “PEG-modified phospholipid”) or a pharmaceutically acceptable salt thereof: [In formula (I), X represents the following (II) or (III). n represents an integer of 30 to 150. ], [In the formulas (II) and (III), R 1 represents a saturated linear fatty acid residue having 17 to 22 carbon atoms. And the compound A and the PEG-modified phospholipid represented by the general formula (I) in a range of 30 to 50% by weight based on the total weight of the lipid in the drug carrier.
  • a drug-retaining drug carrier in blood hereinafter referred to as “the carrier of the present invention”).
  • a pharmaceutical composition containing the carrier of the present invention, including a medicine hereinafter referred to as “the composition of the present invention”).
  • Examples of the saturated linear fatty acid residue having 17 to 22 carbon atoms according to R 1 include stearoyl, arachidoyl, and behenoyl. Among them, a saturated linear fatty acid residue having 17 to 20 carbon atoms is preferable, and stearoyl is more preferable.
  • N is an integer in the range of 30 to 150, preferably an integer in the range of 30 to 100, and more preferably an integer in the range of 30 to 65.
  • the PEG-modified phospholipid can be used as it is as a free acid, but can also be used in the form of a medically acceptable salt by a known method. Although it does not specifically limit as said medically acceptable salt, For example, a sodium salt and potassium salt can be mentioned. Among them, sodium salt is particularly preferable.
  • Preferred PEG-modified phospholipids include, for example, 1,3-distearoylglycero-2-phosphatidyl-N- (methoxy polyethylene glycol succinyl) ethanolamine and N- (methoxy polyethylene glycol succinyl) distearoyl phosphatidyl ethanolamine. it can.
  • FIG. 1 shows a mass spectrum of the PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3.
  • FIG. 2 represents a mass spectrum of the PEG-modified phospholipid used in Production Examples 12-15.
  • FIG. 3 represents the change over time in the retention in plasma.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hour) after administration.
  • FIG. 4 shows the retention in plasma 24 hours after administration.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the content (% by weight) of the used PEG-modified phospholipid.
  • FIG. 5 shows the retention in plasma 24 hours after administration.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the content (% by weight) of the used PEG-modified phospholipid.
  • FIG. 6 represents the retention in plasma.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hour) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 7 represents the retention in plasma.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hours) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 8 shows the transferability to the liver.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hours) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 9 represents the transferability to the spleen.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hours) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 10 represents the transferability to the lung.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hours) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 11 shows the transferability to the kidney.
  • the vertical axis represents the distribution rate (% of dose), and the horizontal axis represents the time (hours) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 12 shows the migration to the cancer periphery.
  • the vertical axis represents the concentration of drug carrier ( ⁇ g / g), and the horizontal axis represents the time (hour) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 13 shows the transition to cancer nodules.
  • the vertical axis represents the concentration of drug carrier ( ⁇ g / g), and the horizontal axis represents the time (hour) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 14 shows the transferability to plasma.
  • the vertical axis represents the concentration of drug carrier ( ⁇ g / mL), and the horizontal axis represents the time (hour) after administration of the pharmaceutical composition.
  • FIG. 15 represents the anti-tumor effect.
  • the vertical axis represents the tumor volume (mm 3 ), and the horizontal axis represents the time (days) after cancer cell transplantation.
  • FIG. 16 shows the antitumor effect when the composition of the present invention is continuously administered.
  • the vertical axis represents the survival rate (%), and the horizontal axis represents the survival period (days) after transplantation of cancer cells.
  • FIG. 17 shows the antitumor effect when the composition of the present invention is intermittently administered.
  • the vertical axis represents the survival rate (%), and the horizontal axis represents the survival period (days) after transplantation of cancer cells.
  • FIG. 18 represents the anti-tumor effect.
  • the vertical axis represents the survival rate (%), and the horizontal axis represents the survival period (days) after transplantation of cancer cells.
  • FIG. 19 represents the anti-tumor effect.
  • the vertical axis represents pancreas weight (g).
  • PEG-modified phospholipid (Ia) wherein X is the above formula (II) is an amine derivative represented by the following general formula (1a) and a PEG derivative represented by the following general formula (2) in the presence of a suitable base It can manufacture by making these react.
  • the solvent used in the reaction with the PEG derivative represented by the following general formula (2) is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, dimethoxyethane, and a mixture thereof.
  • Examples of the base include triethylamine, pyridine, and an aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used and the reaction temperature, but is usually within the range of 1 to 30 hours.
  • n and R 1 are as defined above.
  • the PEG-modified phospholipid (Ib) in which X is the formula (III) includes an amino group protecting group (R 2 ) and a phosphate protecting group (R 3 ) of the amine derivative represented by the following general formula (1b).
  • X is the formula (III)
  • R 2 amino group protecting group
  • R 3 phosphate protecting group
  • the deprotection of R 2 and R 3 can be performed simultaneously or stepwise.
  • the reagent for deprotecting R 2 include acids such as trifluoroacetic acid, acetic acid and hydrochloric acid.
  • Examples of the reagent for deprotecting R 3 include a mixed solution of pyridine-triethylamine-water (3: 1: 1), acetonitrile solution of triethylamine, pyridine-2-carboxaldoxime and N 1 , N 1 , N 3. , N 3 -tetramethylguanidine in 50% aqueous dioxane, or acids such as trifluoroacetic acid, acetic acid and hydrochloric acid.
  • the solvent used in the reaction with the PEG derivative represented by the general formula (2) is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, dimethoxyethane, and a mixture thereof. .
  • the base examples include triethylamine, pyridine, and an aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used and the reaction temperature, but is usually within the range of 1 to 30 hours.
  • R 2 represents an amino-protecting group, and the protecting group is not particularly limited, and examples thereof include tert-butyloxycarbonyl and benzyloxycarbonyl.
  • R 3 represents a protecting group for phosphoric acid, and the protecting group is not particularly limited, and examples thereof include methyl, cyanoethyl, and tert-butyl.
  • the amine derivative represented by the general formula (1a) is a phosphatidylcholine represented by the following general formula (3), aminoethanol and phospholipase D represented by the following general formula (4), and a method described in the literature ( J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, p.10487-10491).
  • R 1 has the same meaning as described above.
  • an amidite compound represented by the following general formula (5) is converted to an aminoethanol represented by the following general formula (6) in the presence of an appropriate activator.
  • It can be prepared by reacting and then oxidizing with a suitable oxidizing agent.
  • the activator include tetrazole and 5-phenyl-1H-tetrazole.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C to 50 ° C.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and dichloromethane.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used and the reaction temperature, but is usually within the range of 1 to 30 hours.
  • R 4 represents alkyl. Examples of such alkyl include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl and isopropyl. Can do.
  • the amidite compound represented by the general formula (5) can be produced by amidating an alcohol represented by the following general formula (7) in the presence of an appropriate activator.
  • the activator include diisopropylammonium tetrazolide, tetrazole, 5-phenyl-1H-tetrazole, and diisopropylethylamine.
  • the reagent used for amidation include bis (N, N-diisopropylamino) cyanoethyl phosphite, 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite, and tert-butyl tetraisopropyl phosphoramidite. Can do.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and dichloromethane.
  • the reaction temperature is suitably in the range of 0 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of raw material used and the reaction temperature, but is usually within the range of 1 to 30 hours.
  • the alcohol represented by the general formula (7) uses dimer dihydroxyacetone (8), and is a method described in the literature (for example, The Journal of Organic Chemistry, 1970, vol. 35, p. 2082-2083).
  • Can be manufactured according to Examples of the condensing agent include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and 1-hydroxybenzotriazole.
  • the reducing agent include sodium borohydride.
  • R 1 has the same meaning as described above.
  • the carrier of the present invention comprises PEG-modified phospholipid and compound A as essential components.
  • the carrier of the present invention can take the form of liposome, fat emulsion or the like. Examples of the liposome form include multilamellar vesicles and single lamellar vesicles.
  • Compound A can be synthesized by the method described in WO94 / 19314.
  • the blending amount of the PEG-modified phospholipid in the carrier of the present invention is suitably in the range of 30 to 50% by weight, preferably in the range of 40 to 50% by weight, based on the total weight of the lipid in the carrier of the present invention.
  • the mixing ratio of the PEG-modified phospholipid and the compound A in the carrier of the present invention is suitably in the range of 0.2 to 20 parts by weight of Compound A with respect to 1 part by weight of PEG-modified phospholipid, and 0.5 to 10 parts by weight. Within the range of parts by weight, and more preferably within the range of 0.7 to 1.3 parts by weight.
  • phospholipid can be further added to the carrier of the present invention.
  • Such phospholipids are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable phospholipids. Mention may be made of phosphatidylglycerol. One or more of these can be used. Among them, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, phosphatidylcholine, and soybean lecithin are particularly preferable.
  • the blending ratio of PEG-modified phospholipid and phospholipid in the carrier of the present invention is suitably within the range of 0.03 to 100 parts by weight of phospholipid with respect to 1 part by weight of PEG-modified phospholipid. In the range of 0.05 to 20 parts by weight, more preferably in the range of 0.2 to 1.1 parts by weight.
  • Cholesterol can be added to the carrier of the present invention in addition to PEG-modified phospholipid and compound A, which are essential components.
  • the blending ratio of PEG-modified phospholipid and cholesterol in the carrier of the present invention is suitably in the range of 0.01 to 200 parts by weight of cholesterol with respect to 1 part by weight of PEG-modified phospholipid. A range of 02 to 100 parts by weight is preferable.
  • the dispersion of the carrier of the present invention is prepared by mixing, for example, PEG-modified phospholipid and Compound A, PEG-modified phospholipid, Compound A and phospholipid, or PEG-modified phospholipid, Compound A and cholesterol, It can be prepared by dispersing.
  • dispersion devices such as an ultrasonic dispersion device and an emulsification dispersion device can be appropriately used.
  • the particle diameter of the carrier of the present invention including the pharmaceutical agent according to the composition of the present invention is not particularly limited, but for example, a range of 50 to 200 nm is suitable, and a range of 60 to 150 nm is preferable.
  • Examples of the “medicine” that can be used in the composition of the present invention include water-soluble anionic compounds, antitumor agents, antiviral agents, and antibiotics.
  • nucleic acid compounds such as single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or double-stranded DNA or oligonucleic acid, acidic sugars such as heparan sulfate or dextran sulfate, cytokines, cyclic AMP, ATP, Second messengers such as IP3, penicillins and cephalosporins, vitamins such as vitamin C and retinol, and other known pharmaceuticals having acidic groups, interferon ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ), interleukin (IL-1 IL-2), colony stimulating factor (CSF), tumor necrosis factor (TNF), levamisole, pestatin, retinoic acid, 5-fluorouracil (5-FU), cytosine arabinoside (Ara-C), adenine arabino Sid (A
  • Examples of the synthetic double-stranded RNA include the following. 1. Homopolymer / Homopolymer Complex Polyinosinic acid / Polycytidylic acid, Polyinosinic acid / poly (5-bromocytidylic acid), Polyinosinic acid / poly (2-thiocytidylic acid), Poly (7-deazainosinic acid) polycytidylic acid, Poly (7-deazainosinic acid) poly (5-bromocytidylic acid), Poly (2′-azidoinosinic acid) / polycytidylic acid, Polyinosinic acid / poly (cytidine-5′-thiophosphoric acid). 2.
  • Oligonucleic acid includes RNA, DNA and compounds thereof having a nucleobase within the range of 10 to 3000, preferably 15 to 2000, more preferably 18 to 1000 in one molecule.
  • siRNA, miRNA, shRNA, non-coding RNA, antisense DNA, antisense RNA, DNA enzyme, ribozyme, and aptamer can be mentioned.
  • oligonucleic acid is not limited to a natural type, and in order to improve stability in vivo such as nuclease resistance, at least a part of the sugar or phosphate backbone constituting the nucleotide is modified. May be. Examples of such modifications include modification of the 2 ′ position of ribose, modification of other parts of ribose, and modification of the phosphate backbone. Examples of the modification at the 2 ′ position of ribose include, for example, the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose is H, OR 5 , R 5 , R 6 OR 5 , SH, SR 5 , NH 2 , NHR 5 , N (R 5 ) 2. , N 3 , CN, F, Cl, Br, and I can be substituted.
  • R 5 represents alkyl or aryl.
  • R 6 represents alkylene.
  • the alkyl of R 5 is not particularly limited as being linear or branched, and examples thereof include alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl, and isohexyl. be able to.
  • the alkyl may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • alkoxy is not particularly limited as being linear or branched, and examples thereof include alkoxy having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy Can do. Among these, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is particularly preferable.
  • aryl of R 5 examples include aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Of these, phenyl is particularly preferred.
  • the alkylene of R 6 is not particularly limited as to whether it is linear or branched, and examples thereof include alkylene having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, 2- (ethyl) trimethylene, and 1- (methyl) tetramethylene.
  • Examples of the modification of the other part of ribose include a modification in which the 4 'position is a thio form.
  • Examples of the modification of the phosphoric acid backbone include a modification of phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, or phosphoramidate.
  • the weight ratio of the carrier of the present invention to the drug contained in the composition of the present invention varies depending on the kind of the drug, the blending amount of PEG-modified phospholipid and Compound A in the carrier of the present invention, etc.
  • the range of 0.01 to 1000 is appropriate, the range of 10 to 300 is preferable, and the range of 100 to 200 is more preferable.
  • the contained medicine is an oligonucleic acid, it is suitably in the range of 0.01 to 100, preferably in the range of 1 to 50, and more preferably in the range of 5 to 30.
  • the composition of the present invention can optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • emulsification aids for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran
  • stabilizers for example, cholesterol, phosphatidic acid
  • isotonic agents for example, sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine
  • composition of the present invention can be prepared by adding a drug to the dispersion of the carrier of the present invention and stirring appropriately. It can also be prepared by adding a medicine in the production process of the carrier of the present invention.
  • the above-mentioned additives can be added in an appropriate process before or after dispersion.
  • the composition of the present invention can be, for example, a liquid or a lyophilized preparation thereof.
  • concentration of the carrier of the present invention contained in the composition of the present invention is suitably in the range of 0.001 to 50% w / v, preferably in the range of 0.01 to 25% w / v.
  • a range of 0.1 to 10% w / v is more preferable.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after appropriately sterilizing the composition of the present invention in the form of a solution, a predetermined amount is dispensed into a vial and pre-freezing for about 2 hours at about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. And primary drying under reduced pressure at about 0-10 ° C., followed by secondary drying under reduced pressure at about 15-25 ° C. and lyophilization. In general, the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the freeze-dried preparation of the composition of the present invention can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the use and the like and is not particularly limited, but is suitably 0.5 to 2 times the amount of the solution before lyophilization or 500 mL or less.
  • the disease to which the composition of the present invention is applied is not particularly limited, and examples thereof include cancer, viral diseases, inflammatory diseases, metabolic diseases, and neurological diseases.
  • the dosage form of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable dosage form, and can be selected according to the treatment method.
  • intravenous administration, intraarterial administration, oral administration, transpulmonary administration, tissue administration, transdermal administration, mucosal administration, intrarectal administration, intravesical administration, intraperitoneal administration, intraocular administration, intracerebral administration, intrathoracic administration Administration can be mentioned.
  • intravenous administration, transdermal administration, and mucosal administration are particularly preferred.
  • the dosage form that can be taken by the composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various injections, oral preparations, drops, inhalants, eye drops, ointments, lotions, and suppositories. it can.
  • the dose of the composition of the present invention as a medicament is preferably prepared in consideration of the type of medicament, dosage form, patient condition such as age and weight, administration form, nature and degree of disease,
  • the pharmaceutical amount is generally within the range of 0.01 mg to 10 g / human, preferably within the range of 0.1 mg to 5 g / human per day.
  • the pharmaceutical contained in the composition of the present invention is an oligonucleic acid
  • the amount of oligonucleic acid for an adult is within the range of 0.1 mg to 10 g / human, preferably 1 mg to 5 g / day.
  • Within the human range is common. This value may vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required.
  • it can be administered once to several times a day or at intervals of 1 day to several days.
  • Oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2, oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 was synthesized by an amidite method described in the literature (Nucleic Acid Research, 1984, vol. 12, p. 4539-4557) using an automatic nucleic acid synthesizer (Expedite 8909: manufactured by Applied Biosystems). Cleavage from CPG using a concentrated ammonium hydroxide-ethanol (3/1) mixture, followed by reaction at 55 ° C. for 18 hours in the same solution, thereby deprotecting the protecting group of the base moiety.
  • the 2'-position silyl group was deprotected by reacting at room temperature for 20 hours using a tetrahydrofuran solution of 1M tetrabutylammonium fluoride.
  • the obtained oligo RNA was purified by reverse phase chromatography.
  • the 5'-position dimethoxytrityl group was deprotected by reacting with an 80% aqueous acetic acid solution at room temperature for 30 minutes, and then purified again by ion exchange chromatography.
  • the concentration of the obtained oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1, oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2, oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 is: They were 3.37 mg / mL, 3.45 mg / mL, 10.00 mg / mL, and 10.00 mg / mL, respectively. In addition, it was confirmed that 90% or more of the obtained oligo RNA was a full-length substance by capillary electrophoresis.
  • Oligo double-stranded RNA consisting of oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 labeled with tritium is , Synthesized by incorporating [25′8-3H] adenosine 5′-3ammonium phosphate salt (Amersham Biosciences) labeled with tritium using in vitro transcription T7 Kit (Takara Bio Inc.) did. Thereafter, the protein was removed using a phenol / chloroform mixed solution, and unreacted monomers were removed using a G-25 spin column (Pharmacia).
  • the concentration of the obtained oligo double-stranded RNA was 4.07 mg / mL.
  • the specific radioactivity was 5.3 ⁇ 10 5 dpm / ⁇ g.
  • the resulting oligo double-stranded RNA was confirmed to have a chain length of about 21 base pairs by 15% polyacrylamide electrophoresis.
  • Step 2 Synthesis of diisopropylamine tetrazolide 365 mg of tetrazole was dissolved in 8 mL of acetonitrile, and 1.20 g of diisopropylamine was added dropwise. After stirring at room temperature for 20 minutes, the reaction solution was concentrated under reduced pressure and dried to obtain 852 mg of the desired product.
  • Step 3 Synthesis of 1,3-distearoylglycerol 2-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoramidite) 1.39 g of 1,3-distearoylglycerol obtained in Step 1 above was added to 30 mL of acetonitrile.
  • the reaction solution was filtered, and a saturated aqueous sodium thiosulfate solution was added to the filtrate until the iodine color disappeared, followed by extraction with ethyl acetate.
  • the organic layer was dried and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography to obtain 700 mg of the desired product.
  • Step 5 Synthesis of 1,3-distearoylglycerol 2-O- (2-aminoethyl phosphate) 1,3-distearoylglycerol 2-O- (2-cyanoethyl 2-tert-butoxy) obtained in Step 4 above 15 mL of a mixed solution of pyridine-triethylamine-water (3: 1: 1) was added to 660 mg of (carbonylaminoethyl phosphoric acid), and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure and then azeotroped with pyridine three times. Thereafter, it was further azeotroped with dichloromethane three times. The residue was dissolved in 5 mL of dichloromethane, 5 mL of trifluoroacetic acid was added at 0 ° C., and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and then azeotroped with dichloromethane three times to obtain 410 mg of the desired product.
  • the obtained target product is distributed within a molecular weight range of 2,000 to 3,800. Had.
  • Production Example 4 Preparation of Dispersion of Drug Carrier 60 mg of Compound A, 8 mg of PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 92 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) (The same applies hereinafter) was dissolved in 2 mL of chloroform in a vial, and nitrogen gas was blown onto this to remove the chloroform, thereby forming a thin film on the wall of the vial.
  • Production Example 6 Preparation of Drug Carrier Dispersion Production using 60 mg of Compound A, 32 mg of PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 68 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine A drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Example 4.
  • Production Example 7 Preparation of Drug Carrier Dispersion Production using 60 mg of Compound A, 48 mg of PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 52 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine A drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Example 4.
  • Production Example 8 Preparation of Drug Carrier Dispersion Using 60 mg of Compound A, 64 mg of the PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 36 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine A drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Example 4.
  • Production Example 10 Preparation of Drug Carrier Dispersion Using 60 mg of Compound A, 88 mg of the PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 12 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine A drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Example 4.
  • Production Example 11 Preparation of Drug Carrier Dispersion A drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Production Example 4 using 60 mg of Compound A and 100 mg of the PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3.
  • Production Example 13 Preparation of Drug Carrier Dispersion Using 60 mg of Compound A, 48 mg of Compound B and 52 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, the same as in Production Example 4, A dispersion was prepared.
  • Production Example 14 Preparation of Drug Carrier Dispersion Using 60 mg of Compound A, 80 mg of Compound B and 20 mg of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, the same as in Production Example 4, A dispersion was prepared.
  • Production Example 16 Preparation of Dispersion of Drug Carrier Using 60 mg of Compound A, 80 mg of PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 and 20 mg of egg yolk lecithin (manufactured by Kewpie, the same applies hereinafter), the same as in Production Example 4. A dispersion of the drug carrier was prepared.
  • Production Example 17 Preparation of Pharmaceutical Composition
  • Nucleic Acid Solution 36 ⁇ L of tritium-labeled oligo double-stranded RNA synthesized in Production Example 2, oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 synthesized in Production Example 1
  • a nucleic acid solution was prepared by mixing 50 mL of 1.43 mL of the oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 synthesized in Production Example 1 and 2.07 mL of water for injection.
  • (2) Preparation of pharmaceutical composition To the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above, 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 4 was added and subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes.
  • a pharmaceutical composition of 1.0 mg / mL was prepared by performing filtration using a 0.22 ⁇ m filter.
  • (3) Measurement of average particle diameter of drug carrier The average particle diameter (volume average) of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 0.02 mg / kg of the composition of the present invention prepared in (2) above using water for injection. Dilute to mL and measure.
  • a particle size measuring device [Nicomp C380 (registered trademark): Particle Sizing Systems, Inc. Made by company. same as below. The measurement was performed three times with a refractive index of 0.993, a viscosity of 1.333, and a measurement time of 5 minutes. As a result, the average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 102.7 nm.
  • Production Example 18 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 5, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 104.0 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 19 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 6, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 103.4 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 20 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 7, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 102.5 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 21 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 8, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 97.9 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 22 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of Pharmaceutical Composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 9, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 91.6 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 23 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 10, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2). A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 65.1 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 24 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the dispersion of the drug carrier prepared in Production Example 11, 1.0 mg / mL as in Production Example 17 (2). A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 63.5 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 25 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 12, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 97.3 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 26 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the dispersion of the drug carrier prepared in Production Example 13, 1.0 mg / mL as in Production Example 17 (2). A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 97.7 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 27 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 14, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 98.0 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 28 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 15, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 78.2 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 29 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of pharmaceutical composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 16, 1.0 mg / mL as in Production Example 17 (2). A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 92.7 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 30 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of Pharmaceutical Composition Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 9, 1.0 mg / mL of the same as in Production Example 17 (2) A pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the pharmaceutical composition was 84.9 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Production Example 31 Preparation of Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution 0.50 mL of oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 synthesized in Production Example 1 and oligo RNA 0 having the base sequence of SEQ ID NO: 4 synthesized in Production Example 1 A nucleic acid solution was prepared by mixing .50 mL and 4.0 mL of water for injection. (2) Preparation of the Composition of the Present Invention Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5.0 mL of the drug carrier dispersion prepared in Production Example 9, 1.0 mg as in Production Example 17 (2). A pharmaceutical composition of / mL was prepared.
  • an oligo double-stranded RNA composed of an oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and an oligo RNA having the base sequence of SEQ ID NO: 4 is an oligo double-stranded RNA having Bcl-2 expression suppression activity (international (See Publication No. 2004/106511 pamphlet).
  • Comparative Example 1 Preparation of Comparative Drug Carrier Dispersion A comparative drug carrier dispersion was prepared in the same manner as in Production Example 4 using 60 mg of Compound A and 100 mg of egg yolk lecithin.
  • Comparative Example 2 Preparation of Dispersion of Drug Carrier for Comparison Control
  • a dispersion of a drug carrier for comparison and control was prepared using Lipofectin (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) by a preparation method specified by the supplier.
  • Comparative Example 4 Preparation of Comparative Control Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1). (2) Preparation of Comparative Control Composition 1. Using the whole amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5.0 mL of the drug carrier dispersion prepared in Comparative Example 1, 1. A 0 mg / mL comparative pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the comparative pharmaceutical composition was 148.1 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Comparative Example 5 Preparation of Comparative Control Pharmaceutical Composition
  • Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 17 (1).
  • Comparative Control Composition 1 Using the whole amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5.0 mL of the drug carrier dispersion prepared in Comparative Example 1, 1. A 0 mg / mL comparative pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the comparative control pharmaceutical composition was 168.9 nm as measured by the same method as in Production Example 17 (3).
  • Comparative Example 6 Preparation of Comparative Control Pharmaceutical Composition (1) Preparation of Nucleic Acid Solution A nucleic acid solution was prepared in the same manner as in Production Example 31 (1). (2) Preparation of Comparative Control Composition 1. Using the total amount of the nucleic acid solution prepared in (1) above and 5.0 mL of the drug carrier dispersion prepared in Comparative Example 1, 1. A 0 mg / mL comparative pharmaceutical composition was prepared. The average particle size of the drug carrier in the comparative pharmaceutical composition was 138.6 nm as measured by the same method as in Production Example 31 (3).
  • Test Example 1 Evaluation of Retention in Blood The blood retention of the drug carrier containing the PEG-modified phospholipid synthesized in Production Example 3 was evaluated using the radioactivity of the nucleic acid contained in the drug carrier as an index.
  • the pharmaceutical composition prepared in Production Examples 17 to 24 was administered to male mice (C57BL / 6J, 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.) at 2.5 mg / kg (nucleic acid concentration) via the tail vein. did. Two hours, 8 hours and 24 hours after the administration, whole blood was collected from the abdominal aorta under ethlenic anesthesia to obtain plasma. Heparin was used as an anticoagulant to obtain plasma. All administration doses were 10 mL / kg. Four mice were used per group.
  • Test Example 2 Evaluation of Retention in Blood The retention in blood of a drug carrier containing Compound B was evaluated using the radioactivity of the nucleic acid contained in the drug carrier as an index.
  • the pharmaceutical composition prepared in Production Examples 25 to 28 was administered to male mice (C57BL / 6J, 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.) at 2.5 mg / kg (nucleic acid concentration) via the tail vein. did. Twenty-four hours after the administration, whole blood was collected from the abdominal aorta under ethrene anesthesia to obtain plasma. Heparin was used as an anticoagulant to obtain plasma. All administration doses were 10 mL / kg. Four mice were used per group.
  • Test Example 3 Evaluation of Pharmacokinetics of the Carrier of the Present Invention The pharmacokinetics of the carrier of the present invention was evaluated using the radioactivity of the nucleic acid contained in the drug carrier as an index.
  • (1) Experimental method The pharmaceutical composition prepared in Production Example 29 or Comparative Example 4 was applied to male mice (C57BL / 6J, 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.) at 2.5 mg / kg (nucleic acid concentration) in the tail vein. It was administered internally. At 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 hours and 72 hours after administration, whole blood was collected from the abdominal aorta under ethrene anesthesia, and plasma was collected. Got.
  • Test Example 4 Evaluation of Pharmacokinetics of the Carrier of the Present Invention The pharmacokinetics of the carrier of the present invention was evaluated using the radioactivity of the nucleic acid contained in the drug carrier as an index.
  • (1) Experimental method The pharmaceutical composition prepared in Production Example 29 or Comparative Example 4 was applied to male mice (C57BL / 6J, 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.) at 2.5 mg / kg (nucleic acid concentration) in the tail vein. It was administered internally. At 30 minutes, 2 hours, 8 hours, and 24 hours after the administration, the mice were collected from the abdominal aorta under anesthene anesthesia to obtain plasma. Heparin was used as an anticoagulant to obtain plasma.
  • mice were used per group. Each organ was dissolved in a vial by adding 1 mL of tissue solubilizer (Solvable: manufactured by Perkin Elmer) and shaking at 40 ° C. overnight. 10 mL of a scintillator was added to and mixed with a sample in which 50 to 200 mg of each organ was dissolved, and then the radioactivity of each sample was measured using a liquid scintillation counter. From the results, the distribution rate (% of dose) of the drug carrier in each organ was calculated.
  • tissue solubilizer Solvable: manufactured by Perkin Elmer
  • the distribution rate (% of dose) of the drug carrier in plasma was calculated in the same manner as in Test Example 1.
  • Test Example 1 the distribution ratio of the carrier of the present invention in the composition of the present invention according to Production Example 29 in plasma is compared with the control in the pharmaceutical composition for comparison according to Comparative Example 4. It was higher than the drug carrier.
  • FIGS. 8 and 9 the distribution ratio of the carrier of the present invention in the composition of the present invention according to Production Example 29 in the liver and spleen is the drug for comparison in the pharmaceutical composition for comparison according to Comparative Example 4 It was lower than the carrier.
  • FIGS. 10 and 11 the distribution rates in the lungs and kidneys were not different between the drug carriers in the pharmaceutical compositions according to Production Example 29 and Comparative Example 4.
  • Test Example 5 Evaluation of Pharmacokinetics of the Carrier of the Present Invention in Cancer Cell Transplanted Mice The pharmacokinetics of the carrier of the present invention in cancer cell transplanted mice was evaluated using the radioactivity of the nucleic acid contained in the drug carrier as an index.
  • (1) Preparation of Cancer Cell Transplanted Mice Cancer cell transplanted mice were obtained by replacing 1 ⁇ 10 6 cells of A431 cells (human squamous epithelial cells) with male nude mice (BALB / cA Jcl-nu, 9 weeks old, manufactured by CLEA Japan). It was prepared by transplanting subcutaneously and rearing for 9 days after transplantation.
  • the transfer amount ( ⁇ g / g or ⁇ g / mL) of the drug carrier in the cancer peripheral part, cancer nodule and plasma was measured in the same manner as in Test Example 1 or 4.
  • (3) Experimental results As shown in FIG. 12, the amount of transfer of the carrier of the present invention in the composition of the present invention according to Production Example 30 in the cancer peripheral part was compared with that in the comparative pharmaceutical composition according to Comparative Example 5. Higher than control drug carrier.
  • the distribution rate in cancer nodules was not different between the drug carriers in the pharmaceutical compositions according to Production Example 30 and Comparative Example 5.
  • the distribution ratio of the carrier of the present invention in the composition of the present invention according to Production Example 30 in plasma is the drug carrier for comparison and control in the pharmaceutical composition for comparison and control according to Comparative Example 5. Higher than.
  • Test Example 6 Evaluation of hemolysis of the carrier of the present invention
  • Blood collected from male rats (Slc: SD, 7 weeks old, manufactured by SLC Japan) was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and then the upper layer And an erythrocyte suspension was obtained.
  • Two times the amount of physiological saline for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd., the same applies hereinafter) was added to the obtained erythrocyte suspension, mixed, and then centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes. This operation was repeated two more times.
  • the obtained erythrocyte suspension was diluted to 1 ⁇ 10 9 cells / mL with physiological saline for injection.
  • the drug carrier dispersion prepared in Production Example 16 or Comparative Examples 1 to 3 was diluted with 10% maltose so as to obtain a desired concentration within the range of 0.3 ⁇ g / ⁇ L to 30 mg / ⁇ L. After 285 ⁇ L of the diluted drug carrier dispersion was pre-warmed at 37 ° C. for 10 minutes, 15 ⁇ L of erythrocyte suspension was added and mixed, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was centrifuged at 3,000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was collected. The absorbance of the supernatant at 405 nm was measured.
  • the degree of hemolysis was calculated assuming that the absorbance when no drug carrier was added was 0% hemolysis and the absorbance when 0.02% Triton X100 was added was 100% hemolysis. Further, a 50% hemolysis concentration was calculated from the calculated hemolysis degree.
  • Table 2 the 50% hemolysis concentration of the carrier of the present invention according to Production Example 16 was higher than the 50% hemolysis concentration of the comparative drug carrier according to Comparative Examples 1 to 3. .
  • Test Example 7 Evaluation of cytotoxicity of the carrier of the present invention
  • Human umbilical vein endothelial cells manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.
  • the drug carrier dispersion prepared in Production Example 16 or Comparative Examples 1 to 3 was diluted with 10% maltose to a desired concentration within the range of 3 ⁇ g / ⁇ L to 10 mg / ⁇ L. 1/10 volume of the diluted drug carrier dispersion was added to the medium.
  • Test Example 8 Evaluation of Cytokine Inducibility of the Composition of the Present Invention
  • Fresh human blood was collected and mixed with 1 mL of heparin sodium (Ajinomoto Co., Inc.) per 10 mL of blood to prevent clotting.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Ficoll-Paque PLUS manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • 10 mL of blood per 3 mL was gently overlaid so as not to disturb the interface.
  • Centrifugation was performed at 400 ⁇ g and room temperature for 30 minutes to obtain peripheral blood mononuclear cells. The obtained peripheral blood mononuclear cells were washed twice with PBS.
  • RPMI 1640 medium manufactured by Nissui
  • 10% fetal bovine serum manufactured by JRH Bioscience
  • 100 U / mL penicillin manufactured by Nacalai Tesque
  • 100 ⁇ g / mL streptomycin manufactured by Nacalai Tesque
  • the number of cells was measured, and a cell suspension of 2 ⁇ 10 6 cells / mL was prepared.
  • the prepared cell suspension was seeded in a 48-well plate at 300 ⁇ L (6 ⁇ 10 5 cells) / well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 hours, and then Production Examples 17 to 24 and Production Example 31 were performed.
  • the pharmaceutical composition prepared in Comparative Example 6 was added to the medium so as to have a desired concentration (Production Examples 17 to 24: 100 nM, Production Example 31, Comparative Example 3:1, 100, 300 nM). After adding the pharmaceutical composition and culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected and subjected to ELISA. IFN- ⁇ was measured using human interferon-alpha ELISA kit (manufactured by Biosource) according to the attached protocol. (2) Experimental Results As shown in Table 4, the IFN- ⁇ induction ability of the pharmaceutical compositions according to Production Examples 17 to 19 was higher than that of the pharmaceutical compositions according to Production Examples 20 to 24.
  • the amount of IFN- ⁇ induced by treating the composition of the present invention according to Production Example 31 is the same as the amount of IFN induced by treating the comparative pharmaceutical composition according to Comparative Example 6. -Low compared to ⁇ amount.
  • n. d. Indicates that it was below the detection limit.
  • Test Example 9 Efficacy Evaluation of the Composition of the Present Invention
  • PC-3 cells human prostate cancer cells
  • -Nu male nude mice
  • the composition of the present invention prepared in Production Example 31 was applied to the mouse prepared in (1) above at 10 mg / kg (nucleic acid concentration) once a day for 5 days from 10 days after transplantation. It was administered internally. Furthermore, it administered similarly for 5 days from the 17th day after transplantation. All administration doses were 10 mL / kg. Six mice were used per group.
  • a mouse administered with 10% maltose was used as a negative control.
  • the tumor volume was calculated by the formula of “(minor axis) 2 ⁇ (major axis) ⁇ 2” after measuring the minor axis and major axis of the tumor 10, 13, 17, 20 and 24 days after transplantation.
  • (3) Experimental Results As shown in FIG. 15, the increase in tumor volume was suppressed by administering the composition of the present invention prepared in Production Example 31.
  • Test Example 10 Evaluation of Medicinal Effects of the Composition of the Present Invention (1) Preparation of Cancer Cell Transplanted Mice Cancer cell transplanted mice consisted of 7 ⁇ 10 5 cells of MCAS cells (human ovarian cancer cells) and female nude mice (BALB / cA Jcl-nu). , 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.). (2) Experimental method Evaluation was performed when the composition of the present invention was continuously administered and when it was intermittently administered. In the continuous administration schedule, the composition of the present invention prepared in Production Example 31 was administered once a day on days 3 to 7 and 10 to 14 after transplantation.
  • the composition of the present invention prepared in Production Example 31 was administered once a day on days 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, and 35 after transplantation.
  • the composition of the present invention was administered into the tail vein at 10 mg / kg (nucleic acid concentration). All administration doses were 10 mL / kg.
  • Six mice were used per group.
  • a mouse administered with 10% maltose was used as a negative control.
  • (3) Experimental Results As shown in FIGS. 16 and 17, the survival rate was prolonged by administering the composition of the present invention prepared in Production Example 31.
  • Test Example 11 Efficacy Evaluation of the Composition of the Present Invention
  • (1) Preparation of Cancer Cell Liver Metastasis Mice Cancer cell liver metastasis mice were obtained from 1 ⁇ 10 6 cells of A549 cells (human non-small cell lung cancer) in male nude mice (BALB / cA). Jcl-nu, 6 weeks old, manufactured by CLEA Japan, Inc.) and transplanted to the spleen 10 minutes after transplantation.
  • Test Example 12 Efficacy Evaluation of the Composition of the Present Invention
  • HPAC cells human pancreatic cancer cells
  • Mice that were subjected to the same operation using a medium instead of HPAC cells were designated as a sham operation group.
  • Experimental method The composition of the present invention prepared in Production Example 31 was applied to the mouse prepared in (1) above at 10 mg / kg (nucleic acid concentration) on the 6th to 10th day and the 13th to 17th day after transplantation. It was administered intravenously once a day.
  • mice were dissected 29 days after transplantation, the weight of the pancreas was measured, and the antitumor effect was evaluated. In addition, 8 mice were used per group. A mouse administered with 10% maltose was used as a negative control. (3) Experimental results As shown in FIG. 19, the administration of the composition of the present invention prepared in Production Example 31 suppressed the increase in pancreatic weight.

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Abstract

　本発明の目的は、主として、ポリエチレングリコール修飾リン脂質とカチオン性脂質とを含有し、かつ当該ポリエチレングリコール修飾リン脂質をある特定の濃度範囲で含有することを特徴とする薬物担体を提供することにある。 　本発明は、次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質又はその医薬上許容される塩： ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、 ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び ２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体に関するものである。

Description

薬物担体
　本発明は、新規な血中滞留型薬物担体に関するものである。
　近年、ポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡや、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用したｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の核酸医薬が注目され、盛んに研究されている。当該核酸医薬は、単独で生体内に、例えば静脈から全身投与しても患部組織に移行され難いため、例えば、核酸医薬を適当な担体に包含して投与したり、患部組織に局所投与したりするなど、一定の工夫を施して投与する必要がある。
　核酸医薬を患部組織に移行させるための薬物担体としては、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）、オリゴフェクトアミン（登録商標）等のカチオン性リポソームや、２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール（以下、「化合物Ａ」という）とリン脂質とを必須構成成分として含有するカチオン性リポソーム（以下、「化合物Ａリポソーム」という）等を挙げることができる（例えば、特許文献１を参照）。そして、これらカチオン性リポソームは、例えば静脈から全身投与すると肝臓や脾臓に集積し易い傾向にあるため、そこに核酸医薬を包含し肝癌や肝炎の治療剤として応用することが期待されている。実際に、例えば、化合物ＡリポソームとポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡとの複合体が肝癌や肝炎の治療に有効であることが報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
　しかしながら、これらカチオン性リポソームは、核酸医薬を肝臓等に集積させるための担体としては有用であるが、血中に滞留させると共に肝臓や脾臓以外の組織（例えば、肺、腎臓、膵臓、心臓）に移行させる担体としては十分ではない。
　リポソームを構成する脂質をポリエチレングリコールで修飾することにより、細網内皮系への取り込みが抑えられるため、血中での滞留性が向上することが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
　しかしながら、ポリエチレングリコールで修飾された脂質をリポソームの構成成分として用いる場合、当該脂質の含有量を上げることにより含有医薬の薬効が発現し難くなるため、血中滞留性を付与することができる最小限の量を添加することが重要となる（例えば、特許文献４を参照）。
　ポリエチレングリコールで修飾されたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンをリポソームの構成成分として用いた場合、リポソームを構成する全脂質に対して、４ｍｏｌ％程度配合した場合に血中滞留性が最も延長されることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
　一方で、ポリエチレングリコールで修飾された脂質を１０又は１５ｍｏｌ％程度で配合した場合に血中滞留性が延長する例も報告されている（例えば、特許文献５～９を参照）。当該特許文献５～９の記載によれば、リポソームの構成成分として用いる、ポリエチレングリコールで修飾された脂質やカチオン性脂質の構造の違いにより、得られる血中滞留性の延長効果や含有医薬の薬効発現の程度が異なる。
ＷＯ　９４／１９３１４　Ａ１ ＷＯ　９９／２０２８３　Ａ１ ＷＯ　９９／４８５３１　Ａ１ ＷＯ　２００５／０５１３５１　Ａ２ ＷＯ　２００６／０７４５４６　Ａ１ ＷＯ　２００６／００７７１２　Ａ１ ＷＯ　２００５／１２０１５２　Ａ２ ＣＡ　２２７１５８２　Ａ１ ＵＳ　２００４／０１６６１５０　Ａ１ Ｋａｚｕｋｏ　Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．５９、ｐ．４３２５－４３３３ Ｋａｚｕｋｏ　Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．１１、ｐ．４９７－５０４ 石田　竜弘ら、リポソーム応用の新展開、２００５年６月、ｐ．５２８－５３８
　本発明の目的は、主として、ポリエチレングリコール修飾リン脂質と化合物Ａとを含有する血中滞留型の薬物担体であって、当該ポリエチレングリコール修飾リン脂質をある特定の濃度範囲で含有することを特徴とする薬物担体、及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ある特定の構造を有するポリエチレングリコール修飾リン脂質と化合物Ａとを必須の構成成分として含有する薬物担体において、ポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％という高濃度で添加した場合に、高い血中滞留性を有し、且つＩｎ　ｖｉｖｏにおいて含有医薬の薬効を発揮し得ること見出し、本発明を完成した。
　本発明として、例えば、下記１及び２に記載の発明を挙げることができる。
　１．次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質（以下、単に「ＰＥＧ修飾リン脂質」という）又はその医薬上許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び
化合物Ａを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるＰＥＧ修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体（以下、「本発明担体」という）。
２．医薬を包含する、本発明担体を含有する医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。
　Ｒ1に係る炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基としては、例えば、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１７～２０の飽和の直鎖脂肪酸残基が好ましく、ステアロイルがより好ましい。
　ｎは、３０～１５０の範囲内の整数であるが、３０～１００の範囲内の整数が好ましく、３０～６５の範囲内の整数がより好ましい。
　ＰＥＧ修飾リン脂質は、遊離の酸のままで用いることができるが、公知の方法により医学上許容される塩の形にして用いることもできる。
　当該医学上許容される塩としては、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。それらの中で、特にナトリウム塩が好ましい。
　好ましいＰＥＧ修飾リン脂質としては、例えば、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。
図１は、製造例３で合成したＰＥＧ修飾リン脂質のマススペクトルを表す。
図２は、製造例１２～１５で使用したＰＥＧ修飾リン脂質のマススペクトルを表す。
図３は、血漿中の滞留性の経時変化を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は投与後の時間（時間）を、それぞれ示す。
図４は、投与２４時間後における血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は使用したＰＥＧ修飾リン脂質の含有量（重量％）を、それぞれ示す。
図５は、投与２４時間後における血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は使用したＰＥＧ修飾リン脂質の含有量（重量％）を、それぞれ示す。
図６は、血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図７は、血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図８は、肝臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図９は、脾臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１０は、肺への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１１は、腎臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１２は、癌周辺部への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｇ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１３は、癌結節への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｇ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１４は、血漿への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｍＬ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１５は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）を、横軸は癌細胞を移植してからの時間（日）を、それぞれ示す。
図１６は、本発明組成物を連続投与した場合の抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１７は、本発明組成物を間欠投与した場合の抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１８は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１９は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は膵臓重量（ｇ）を示す。
Ｉ．ＰＥＧ修飾リン脂質の製造方法
　Ｘが前記式（ＩＩ）であるＰＥＧ修飾リン脂質（Ｉａ）は、適当な塩基の存在下、下記一般式（１ａ）で表されるアミン誘導体と下記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体とを反応させることにより製造することができる。
　下記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させる際に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ジメトキシエタン若しくはこれらの混合液を挙げることができる。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン或いは炭酸水素ナトリウム水溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、ｎ、Ｒ１は前記と同義である。）
　Ｘが前記式（ＩＩＩ）であるＰＥＧ修飾リン脂質（Ｉｂ）は、下記一般式（１ｂ）で表されるアミン誘導体のアミノ基の保護基（Ｒ２）、リン酸の保護基（Ｒ３）を常法により脱保護した後に、適当な塩基の存在下、前記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させることにより製造することができる。
　Ｒ２、Ｒ３の脱保護は、両者を同時に、或いは段階的に行うことができる。Ｒ２を脱保護する試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸等の酸を挙げることができる。Ｒ３を脱保護する試薬としては、例えば、ピリジン－トリエチルアミン－水（３：１：１）の混合液、トリエチルアミンのアセトニトリル溶液、ピリジン－２－カルボキサアルドキシムとＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３－テトラメチルグアニジンの５０％ジオキサン水溶液、或いはトリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸等の酸を挙げることができる。
　前記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させる際に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ジメトキシエタン若しくはこれらの混合液を挙げることができる。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン或いは炭酸水素ナトリウム水溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、ｎ、Ｒ１は前記と同義である。Ｒ２はアミノ基の保護基を表し、かかる保護基としては、特に制限されないが、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルを挙げることができる。Ｒ３はリン酸の保護基を表し、かかる保護基としては、特に制限されないが、例えば、メチル、シアノエチル、ｔｅｒｔ－ブチルを挙げることができる。）
　前記一般式（１ａ）で表されるアミン誘導体は、下記一般式（３）で表されるホスファチジルコリン、下記一般式（４）で表されるアミノエタノール及びホスホリパーゼＤを用いて、文献記載の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５、ｐ．１０４８７－１０４９１）に従い製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１は前記と同義である。）
　前記一般式（１ｂ）で表されるアミン誘導体は、下記一般式（５）で表されるアミダイト化合物を、適当な活性化剤の存在下、下記一般式（６）で表されるアミノエタノールと反応させ、次いで、適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
　活性化剤としては、例えば、テトラゾール、５－フェニル－１Ｈ－テトラゾールを挙げることができる。酸化剤としては、例えば、ヨウ素溶液（０．１Ｍ　ヨウ素/テトラヒドロフラン：ピリジン：水＝７：１：２）、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができる。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は前記と同義である。Ｒ４はアルキルを表す。かかるアルキルとしては、特に制限されないが、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピルを挙げることができる。）
　前記一般式（５）で表されるアミダイト化合物は、適当な活性化剤の存在下、下記一般式（７）で表されるアルコールをアミダイト化することにより製造することができる。
　活性化剤としては、例えば、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド、テトラゾール、５－フェニル－１Ｈ－テトラゾール、ジイソプロピルエチルアミンを挙げることができる。アミダイト化する際に使用する試薬としては、例えば、ビス（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイト、２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、ｔｅｒｔ－ブチル　テトライソプロピルホスホロアミダイトを挙げることができる。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４は前記と同義である。）
　前記一般式（７）で表されるアルコールは、二量体のジヒドロキシアセトン（８）を用い、文献記載の方法（例えば、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７０、ｖｏｌ．３５、ｐ．２０８２－２０８３）に従い製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウムを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｒ１は前記と同義である。）
II．本発明担体
　本発明担体は、ＰＥＧ修飾リン脂質と化合物Ａとを必須の構成成分とするものである。具体的には、本発明担体は、リポソームや脂肪乳剤等の形態をとることができる。リポソームの形態としては、マルチラメラベシクル、シングルラメラベシクルを挙げることができる。
　化合物Ａは、国際公開第９４／１９３１４号パンフレットに記載の方法により合成することができる。
　本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質の配合量は、本発明担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内が適当であり、４０～５０重量％の範囲内が好ましい。
　本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質と化合物Ａとの配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、化合物Ａ０．２～２０重量部の範囲内が適当であり、０．５～１０重量部の範囲内が好ましく、０．７～１．３重量部の範囲内がより好ましい。
　本発明担体には、必須の構成成分であるＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ以外にリン脂質を更に加えることができる。かかるリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ホスファチジルコリン、大豆レシチンが好ましい。
　リン脂質を加える場合、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質とリン脂質との配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、リン脂質０．０３～１００重量部の範囲内が適当であり、０．０５～２０重量部の範囲内が好ましく、０．２～１．１重量部の範囲内がより好ましい。
　本発明担体には、必須の構成成分であるＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ以外にコレステロールを添加することができる。コレステロールを加える場合、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質とコレステロールとの配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、コレステロール０．０１～２００重量部の範囲内が適当であり、０．０２～１００重量部の範囲内が好ましい。
　本発明担体の分散液は、例えば、ＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ、ＰＥＧ修飾リン脂質、化合物Ａ及びリン脂質、又はＰＥＧ修飾リン脂質、化合物Ａ及びコレステロールを混合し、常法により、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。
III．本発明組成物
　本発明組成物に係る医薬を包含する本発明担体の粒子径は、特に制限されないが、例えば、５０～２００ｎｍの範囲内が適当であり、６０～１５０ｎｍの範囲内が好ましい。
　本発明組成物に用い得る「医薬」としては、例えば、水溶性陰イオン性化合物、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質を挙げることができる。具体的には、核酸化合物である一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡあるいはオリゴ核酸、酸性糖であるヘパラン硫酸やデキストラン硫酸等、サイトカイン類、サイクリックＡＭＰ、ＡＴＰやＩＰ３等のセカンドメッセンジャー類、ペニシリン類やセファロスポリン類、ビタミンＣやレチノール類等のビタミン類、その他酸性基をもった既知の医薬、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レバミゾール、ペスタチン、レチノイックアシッド、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、アデニンアラビノシド（Ａｒａ－Ａ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、アジドチミジン（ＡＺＴ）等を挙げることができる。
　合成二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．ホモポリマー・ホモポリマー複合体
　ポリイノシン酸・ポリシチジル酸、
　ポリイノシン酸・ポリ（５－ブロモシチジル酸）、
　ポリイノシン酸・ポリ（２－チオシチジル酸）、
　ポリ（７－デアザイノシン酸）・ポリシチジル酸、
　ポリ（７－デアザイノシン酸）・ポリ（５－ブロモシチジル酸）、
　ポリ（２’－アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸、
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジン－５’－チオリン酸）。
２．ホモポリマー・コポリマー複合体
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、４－チオウリジン酸）。
３．合成核酸とポリカチオンとの複合体
　ポリイノシン酸・ポリシチジル酸・ポリ－Ｌ－リジン。
４．その他
　ポリイノシン酸・ポリ（１－ビニルシチジル酸）。
　オリゴ核酸としては、一分子内に１０～３０００、好ましくは１５～２０００、より好ましくは１８～１０００の範囲内の核酸塩基を有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの化合物を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、非コードＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマーを挙げることができる。
　上記オリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。かかる修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基をＨ、ＯＲ５、Ｒ５、Ｒ６ＯＲ５、ＳＨ、ＳＲ５、ＮＨ２、ＮＨＲ５、Ｎ（Ｒ５）２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒ５はアルキル又はアリールを表す。また、Ｒ６はアルキレンを表す。
　Ｒ５のアルキルとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。かかるアルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。かかるアルコキシとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルコキシを挙げることができる。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、特に炭素数１～３のアルコキシが好ましい。
　Ｒ５のアリールとしては、例えば、炭素数６～１０のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。それらの中で、特にフェニルが好ましい。
　Ｒ６のアルキレンとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルキレンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２－（エチル）トリメチレン、１－（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。
　本発明組成物中に含まれる本発明担体と医薬との重量比（本発明担体／医薬）は、医薬の種類、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質や化合物Ａの配合量等によって異なるが、０．０１～１０００の範囲内が適当であり、１０～３００の範囲内が好ましく、１００～２００の範囲内がより好ましい。更に、含有医薬がオリゴ核酸である場合には、０．０１～１００の範囲内が適当であり、１～５０の範囲内が好ましく、５～３０の範囲内がより好ましい。
　本発明組成物には、上述した本発明担体と医薬以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。
　本発明組成物は、本発明担体の分散液に医薬を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、本発明担体の製造過程において、医薬を加えることによっても調製することができる。上述した添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
　本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。液剤の場合、本発明組成物中に含まれる本発明担体の濃度は、０．００１～５０％ｗ／ｖの範囲内が適当であり、０．０１～２５％ｗ／ｖの範囲内が好ましく、０．１～１０％ｗ／ｖの範囲内がより好ましい。
　上記凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
　本発明組成物の適用疾患は、特に制限されず、例えば、癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経疾患を挙げることができる。
　本発明組成物の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができる。例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、直腸内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与、胸腔内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜投与が好ましい。また、本発明組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤を挙げることができる。
　本発明組成物の医薬としての用量は、医薬の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与形態、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して医薬量として、１日当たり０．０１ｍｇ～１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。更に、本発明組成物に含有されている医薬がオリゴ核酸である場合には、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇ～１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とする場合もある。また、１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。
　以下に、製造例、比較例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記に示される範囲に限定されるものではない。
製造例１　オリゴＲＮＡの合成
　配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの合成は、核酸自動合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　８９０９：アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、ｖｏｌ．１２、ｐ．４５３９－４５５７）に記載のアミダイト法により合成した。
　濃水酸化アンモニウム－エタノール（３／１）混合液を用いてＣＰＧより開裂させ、更に同溶液中で、５５℃で１８時間反応させることにより、塩基部分の保護基を脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて、室温で２０時間反応させることにより、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴＲＮＡを逆相クロマトグラフィーにて精製した。更に、８０％酢酸水溶液を用いて、室温で３０分間反応させることにより、５’位のジメトキシトリチル基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。得られた配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの濃度は、それぞれ３．３７ｍｇ／ｍＬ、３．４５ｍｇ／ｍＬ、１０．００ｍｇ／ｍＬ、１０．００ｍｇ／ｍＬであった。
　なお、得られたオリゴＲＮＡは、キャピラリー電気泳動により９０％以上が全長物質であることを確認した。
製造例２　トリチウムで標識されたオリゴ二本鎖ＲＮＡの合成
　トリチウムで標識された、配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡからなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｔ７　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、トリチウムで標識された［２５’８－３Ｈ］アデノシン５’－３リン酸アンモニウム塩（アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませることにより合成した。
　その後、フェノール／クロロホルム混合溶液を用いてタンパク質を除去し、更にＧ－２５スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて未反応モノマーの除去を行った。得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡの濃度は４．０７ｍｇ／ｍＬであった。また、その比放射活性は、５．３×１０５ｄｐｍ／μｇであった。
　なお、得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１５％ポリアクリルアミド電気泳動により、その鎖長が２１塩基対付近であることを確認した。
製造例３　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンの合成
工程１　１，３－ジステアロイルグリセロールの合成
　３．０ｇの二量体のジヒドロキシアセトン、２２．７ｇのステアリン酸、１６．８ｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０．８ｇの４－ジメチルアミノピリジンを１００ｍＬのジクロロメタン中、室温で終夜攪拌した。反応液に０．５Ｌのメタノールを加えて生じた粉末をろ取し、更にメタノールで洗浄した後、乾燥させた。かかる粉末６ｇを、４００ｍＬのテトラヒドロフランと２０ｍＬの１０％酢酸水溶液との混合液に懸濁し、０℃にて１．１ｇの水素化ほう素ナトリウムを少しずつ加えた。室温で６時間攪拌後、反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出操作を行い、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を３．５ｇ得た。
工程２　ジイソプロピルアミンテトラゾリドの合成
　３６５ｍｇのテトラゾールを８ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１．２０ｇのジイソプロピルアミンを滴下した。室温で２０分間攪拌した後、反応液を減圧下で濃縮し、乾燥して目的物を８５２ｍｇ得た。
工程３　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
　上記工程１で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール１．３９ｇを、３０ｍＬのアセトニトリルと１０ｍＬのジクロロメタンとの混合液に懸濁し、４５６ｍｇの上記工程２で得られたジイソプロピルアミンテトラゾリド、１ｇのビス（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン）シアノエチルホスファイトを加えて４０℃にて１．５時間攪拌した。反応液をろ過し、ろ液を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を８００ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: １５２．２８３
工程４　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　２－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノエチルリン酸）の合成
　上記工程３で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）７００ｍｇ、１１４ｍｇのＮ－（２－ヒドロキシエチル）カルバミン酸　ｔｅｒｔ－ブチル、１１９ｍｇのテトラゾールを、０．５ｇのモレキュラーシーブス４Ａと共に５ｍＬのアセトニトリルと５ｍＬのジクロロメタンとの混合液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。反応液に２０ｍＬのヨウ素溶液（０．１Ｍ　ヨウ素/テトラヒドロフラン：ピリジン：水＝７：１：２）を加え、更に室温で２０分間攪拌した。反応液をろ過し、ろ液に飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液をヨウ素の色が無くなるまで加えた後、酢酸エチルで抽出操作を行った。有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を７００ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: ０．１２４５３
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝９２３．５６４（［Ｍ+Ｎａ］+）
工程５　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－アミノエチルリン酸）の合成
　上記工程４で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　２－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノエチルリン酸）６６０ｍｇにピリジン－トリエチルアミン－水（３：１：１）の混合液１５ｍＬを加え、室温で２時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、ピリジンで３回共沸した。その後、更にジクロロメタンで３回共沸した。残渣を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、５ｍＬのトリフルオロ酢酸を０℃にて加え、室温で３０分間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、ジクロロメタンで３回共沸して目的物を４１０ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: －０．０８３３
工程６　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンの合成
　上記工程５で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－アミノエチルリン酸）４００ｍｇ、１．２４ｇのα－スクシンイミジロキシスクシニル－ω－メトキシ－ポリオキシエチレン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）　ＭＥ－０２０ＣＳ：日本油脂社製］に４０ｍＬのジメトキシエタン、４０ｍＬのジクロロメタン、１０ｍＬの飽和重曹水を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えた後ジクロロメタンで３回抽出操作を行った。有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を９５０ｍｇ得た。
　得られた目的物の分子量を、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより測定した結果、図１に示すように、得られた目的物は、分子量２，０００～３，８００の範囲内で分布を有していた。
製造例４　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び９２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（日本油脂社製。以下同じ。）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１，０００ｍｇのマルトース（大塚製薬社製）、４．０ｍＬの注射用水（大塚製薬社製。以下同じ。）及び８１μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１０分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの薬物担体の分散液を調製した。その後、注射用水を用いて５．０ｍＬにメスアップした。
製造例５　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した１６ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び８４ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例６　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した３２ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び６８ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例７　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した４８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び５２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例８　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した６４ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び３６ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例９　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８０ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１０　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び１２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１１　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ及び製造例３で合成した１００ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質を用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１２　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、３２ｍｇのＮ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）　ＤＳＰＥ－０２０Ｃ：日本油脂社製。以下同じ。］（以下、「化合物Ｂ」という）及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
　なお、使用した化合物Ｂの分子量を、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより測定した結果、図２に示すように、使用した化合物Ｂは、分子量２，２００～３，６００の範囲内で分布を有していた。
製造例１３　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、４８ｍｇの化合物Ｂ及び５２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１４　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、８０ｍｇの化合物Ｂ及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１５　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、８８ｍｇの化合物Ｂ及び１２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１６　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８０ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び２０ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製。以下同じ。）を用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１７　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例２で合成した、トリチウムで標識されたオリゴ二本鎖ＲＮＡ３６μＬ、製造例１で合成した配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ１．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ１．４３ｍＬ、及び２．０７ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量に、製造例４で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを添加し、５分間の超音波処理を行った。５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った後、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過を行うことにより、１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
（３）薬物担体の平均粒子径の測定
　医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径（体積平均）は、注射用水を用いて、上記（２）で作成した本発明組成物を０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈して測定した。具体的には、粒子径測定装置［Ｎｉｃｏｍｐ　Ｃ３８０（登録商標）：Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製。以下同じ。］を用い、屈折率を０．９９３に、粘度を１．３３３、測定時間を５分間に設定して、３回測定を行った。その結果、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、１０２．７ｎｍであった。
製造例１８　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例５で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０４．０ｎｍであった。
製造例１９　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例６で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０３．４ｎｍであった。
製造例２０　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例７で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０２．５ｎｍであった。
製造例２１　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例８で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．９ｎｍであった。
製造例２２　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９１．６ｎｍであった。
製造例２３　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１０で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、６５．１ｎｍであった。
製造例２４　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１１で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、６３．５ｎｍであった。
製造例２５　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１２で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．３ｎｍであった。
製造例２６　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１３で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．７ｎｍであった。
製造例２７　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１４で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９８．０ｎｍであった。
製造例２８　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１５で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、７８．２ｎｍであった。
製造例２９　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１６で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９２．７ｎｍであった。
製造例３０　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、８４．９ｎｍであった。
製造例３１　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１で合成した配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ０．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ０．５０ｍＬ及び４．０ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９５．７ｎｍであった。
　また、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡからなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂｃｌ－２の発現抑制活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡである（国際公開第２００４／１０６５１１号パンフレットを参照）。
比較例１　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ及び１００ｍｇの卵黄レシチンを用い、製造例４と同様に比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例２　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　リポフェクチン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例３　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　オリゴフェクトアミン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例４　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１４８．１ｎｍであった。
比較例５　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１６８．９ｎｍであった。
比較例６　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例３１の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例３１の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例３１の（３）と同様の方法により測定したところ、１３８．６ｎｍであった。
試験例１　血中滞留性の評価
　製造例３で合成したＰＥＧ修飾リン脂質を含有する薬物担体の血中滞留性を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例１７～２４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与から２時間、８時間及び２４時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーター（Ｈｉｏｎｉｃ－Ｆｌｕｏｒ：パーキンエルマー社製。以下同じ。）を加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。
（２）実験結果
　図３及び図４に示すように、製造例３に係るＰＥＧ修飾リン脂質の含有量が３０～５０重量％の範囲内にある場合に、血中での滞留性が最も高かった。
試験例２　血中滞留性の評価
　化合物Ｂを含有する薬物担体の血中滞留性を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２５～２８で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与から２４時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーターを加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。
（２）実験結果
　図５に示すように、化合物Ｂの含有量が３０重量％以上である場合に血中での滞留性が高かった。
試験例３　本発明担体の体内動態の評価
　本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２９又は比較例４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間及び７２時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３又は４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーターをそれぞれ加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、血漿における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）、及び分布容積（Ｌ／ｋｇ）、消失半減期（ｈｏｕｒｓ）、血漿中濃度下面積（μｇ・ｈｏｕｒｓ／ｍＬ）、クリアランス（Ｌ／ｈｏｕｒｓ・ｋｇ）を算出した。
（２）実験結果
（ｉ）血漿中濃度
　図６に示すように、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも血漿中での滞留性が高かった。
（ｉｉ）薬物動態学的パラメータ値
　表１に示すように、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の血漿中濃度下面積（ＡＵＣ０－８）は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体の血漿中濃度下面積（ＡＵＣ０－８）と比較すると、約５倍高かった。また、本発明担体の分布容積は、比較対照用薬物担体の分布容積と比較すると、約１／８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
試験例４　本発明担体の体内動態の評価
　本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２９又は比較例４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、３０分、２時間、８時間及び２４時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。また、採血と同時に肝臓、肺、脾臓及び腎臓を摘出し、それぞれの湿重量を秤量した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３又は４匹のマウスを用いた。
　各臓器は、バイアル中で１ｍＬの組織溶解剤（ソルバブル：パーキンエルマー社製）を加え、４０℃で二晩振とうさせることにより溶解させた。
　５０～２００ｍｇの各臓器を溶解させた試料に１０ｍＬのシンチグラフィレーターをそれぞれ加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、各臓器における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。なお、血漿における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）は、試験例１と同様に算出した。
（２）実験結果
　図７に示すように、血漿中での製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。図８、９に示すように、肝臓及び脾臓における、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも低かった。図１０、１１に示すように、肺及び腎臓における分布率は、製造例２９及び比較例４に係る医薬組成物中の薬物担体の間で差はなかった。
試験例５　癌細胞移植マウスにおける本発明担体の体内動態の評価
　癌細胞移植マウスにおける本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＡ４３１細胞（ヒト扁平上皮細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、９週齢、日本クレア社製）の皮下に移植し、移植後９日間飼育することにより作成した。
（２）実験方法
　製造例３０又は比較例５で調製した医薬組成物を、上記（１）で作成したマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、８時間、２４時間及び７２時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。また、採血と同時に癌周辺部、癌結節を摘出し、それぞれの湿重量を秤量した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３匹のマウスを用いた。
　癌周辺部、癌結節及び血漿における薬物担体の移行量（μｇ／ｇ又はμｇ／ｍＬ）は、試験例１又４と同様に測定した。
（３）実験結果
　図１２に示すように、癌周辺部における、製造例３０に係る本発明組成物中の本発明担体の移行量は、比較例５に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。一方、図１３に示すように、癌結節における分布率は、製造例３０及び比較例５に係る医薬組成物中の薬物担体の間で差はなかった。なお、図１４に示すように、血漿中での製造例３０に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例５に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。
試験例６　本発明担体の溶血性の評価
（１）実験方法
　雄性ラット（Ｓｌｃ：ＳＤ、７週齢、日本エスエルシー社製）より採取した血液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層を除き、赤血球懸濁液を得た。得られた赤血球懸濁液に対し２倍量の注射用生理食塩水（大塚製薬工場社製。以下同じ。）を加え、混和した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この操作を更に２回繰り返した。得られた赤血球懸濁液は、注射用生理食塩水を用いて１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように希釈した。
　製造例１６又は比較例１～３で調製した薬物担体の分散液を、０．３μｇ／μＬ～３０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。２８５μＬの希釈した薬物担体の分散液を３７℃で１０分間予備加温した後、１５μＬの赤血球懸濁液を加え混和し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。４０５ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。
　溶血度は、薬物担体を加えなかった場合の吸光度を溶血度０％とし、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えた場合の吸光度を溶血度１００％として算出した。また、算出した溶血度より、５０％溶血濃度を算出した。
（２）実験結果
　表２に示すように、製造例１６に係る本発明担体の５０％溶血濃度は、比較例１～３に係る比較対照用薬物担体の５０％溶血濃度と比較して高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
試験例７　本発明担体の細胞毒性の評価
（１）実験方法
　ヒトさい帯静脈内皮細胞（三光純薬社製）を３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。製造例１６又は比較例１～３で調製した薬物担体の分散液を、３μｇ／μＬ～１０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。希釈した薬物担体の分散液を培地の１／１０容量添加した。７２時間培養後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（ＷＳＴ－８：同仁化学社製）を用いて、生存細胞数を測定し、その値より５０％細胞増殖阻害濃度を算出した。なお、ヒトさい帯静脈内皮細胞の培養には、Ｍ１９９培地（ニッスイ社製）を用いた。
（２）実験結果
　表３に示すように、製造例１６に係る本発明担体の５０％細胞増殖阻害濃度は、比較例１～３に係る比較対照用薬物担体の５０％細胞増殖阻害濃度と比較して高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
試験例８　本発明組成物のサイトカイン誘導能の評価
（１）実験方法
　ヒト新鮮血を採取し、凝固を防ぐため血液１０ｍＬあたり１ｍＬのヘパリンナトリウム注 (味の素社製) を混合した。等量のＰｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ (ＧＥ　ヘルスケア　バイオサイエンス社製)３ｍＬあたり１０ｍＬの血液を、界面を乱さないよう穏やかに重層した。４００×ｇ、室温で３０分間遠心し、末梢血単核球を得た。得られた末梢血単核球をＰＢＳで２度洗浄した。その後、末梢血単核球を１０％牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ナカライテスク社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）に浮遊させ、細胞数を測定し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
　調製した細胞懸濁液を４８穴プレートに３００μＬ (６×１０５ｃｅｌｌｓ)／ｗｅｌｌ で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３時間培養した後、製造例１７～２４、製造例３１又は比較例６で調製した医薬組成物を所望の濃度（製造例１７～２４：１００ｎＭ、製造例３１、比較例６：３０、１００、３００ｎＭ）になるように培地中に添加した。医薬組成物を添加してから２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡを行った。ＩＦＮ－αの測定はヒトインターフェロン－ａｌｐｈａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ (バイオソース社製) を用いて添付のプロトコールに従い行った。
（２）実験結果
　表４に示すように、製造例１７～１９に係る医薬組成物のＩＦＮ－αの誘導能は、製造例２０～２４に係る医薬組成物と比較して高かった。
　表５に示すように、製造例３１に係る本発明組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ－α量は、比較例６に係る比較対照用医薬組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ－α量と比較して低かった。
　なお、表４及び表５中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
試験例９　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、３×１０５ｃｅｌｌｓのＰＣ－３細胞（ヒト前立腺癌細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の皮下に移植することにより作成した。
（２）実験方法
　移植１０日後から５日間連続で、製造例３１で調製した本発明組成物を、上記（１）で作成したマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。更に、移植１７日後から５日間連続で同様に投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
　腫瘍体積は、移植１０、１３、１７、２０及び２４日後に、腫瘍の短径と長径とを測定し、「（短径）２×（長径）÷２」の式により算出した。
（３）実験結果
　図１５に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、腫瘍体積の増加が抑制された。
試験例１０　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、７×１０５ｃｅｌｌｓのＭＣＡＳ細胞（ヒト卵巣癌細胞）を雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の腹腔内に移植することにより作成した。
（２）実験方法
　評価は、本発明組成物を連続投与した場合と間欠投与した場合とで行った。連続投与スケジュールでは、移植後３～７日目及び１０～１４日目に、製造例３１で調製した本発明組成物を１日１回投与した。間欠投与スケジュールでは、移植後４、７、１１、１４、１８、２１、２５、２８、３２及び３５日目に、製造例３１で調製した本発明組成物を１日１回投与した。本発明組成物は１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１６及び図１７に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、生存率が延長した。
試験例１１　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞肝転移マウスの作成
　癌細胞肝転移マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＡ５４９細胞（ヒト非小細胞肺癌）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の脾臓に移植し、移植１０分後に脾臓を摘出することにより作成した。
（２）実験方法
　上記（１）で作成したマウスに、製造例３１で調製した本発明組成物を、移植７日後から５日間連続で、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。更に、移植１４日後から５日間連続で同様に投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１８に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、生存率が延長した。
試験例１２　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＨＰＡＣ細胞（ヒト膵臓がん細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、７週齢、日本クレア社製）の膵臓に移植することにより作成した。ＨＰＡＣ細胞の代わりに培地を用いて同様の操作を行ったマウスを偽手術群とした。
（２）実験方法
　上記（１）で作成したマウスに、製造例３１で調製した本発明組成物を、移植後６～１０日目及び１３～１７日目にかけて、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。移植２９日後にマウスを解剖し、膵臓重量の測定を行い、抗腫瘍効果を評価した。なお、１群あたり８匹のマウスを用いた。また、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１９に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、膵臓重量の増加が抑制された。

Claims (6)

  1. 　次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質又はその医薬上許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び
    ２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体。
  2. 　ポリエチレングリコール修飾リン脂質が１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン又はＮ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の血中滞留型薬物担体。
  3. 　更にリン脂質を含有する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の血中滞留型薬物担体。
  4. 　医薬を包含する、請求項１～３のいずれか１項に記載の血中滞留型薬物担体を含有する医薬組成物。
  5. 　医薬が、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸、又は水溶性陰イオン化合物である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　オリゴ核酸が、ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマー又は非コードＲＮＡである、請求項５に記載の医薬組成物。
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