WO2009147918A1

WO2009147918A1 - ポリヒドロキシアルカン酸共重合体及びその製造法

Info

Publication number: WO2009147918A1
Application number: PCT/JP2009/058429
Authority: WO
Inventors: 柘植丈治; 山本哲也; 北川敦沙比
Original assignee: 国立大学法人東京工業大学
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2009-12-10
Also published as: EP2289967B1; CN102056962B; US20110081692A1; EP2289967A4; CN102056962A; US8394613B2; JPWO2009147918A1; JP5396639B2; EP2289967A1

Abstract

(R)-3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸単位を含むPHA共重合体、及びその製造法を提供する。少なくとも(R)-3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体；及び、炭素源と、(R)-3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸の前駆物質との存在下に、大腸菌、ラルストニア属菌及びシュードモナス属菌から選ばれる微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から、少なくとも(R)-3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法。

Description

発明の名称

ポリヒドロキシアル力ン酸共重合体及びその製造法

技術分野

本発明は、ポリヒドロキシ明アルカン酸共重合体及びその製造法に関する。本発明は、特に、少なくとも（R) -3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及びその製書

造法に関する。

背景技術

ポリヒドロキシアルカン酸（ΡΗΑ) は微生物が細胞内に蓄積するポリエステルである。近年では、 ΡΗΑは、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。最も一般的な ΡΗΑは、（R) - 3-ヒドロキシブタン酸（3 ΗΒ) を構成単位とするホモポリマー（以下、「Ρ (3ΗΒ) 」）である。しかし、 Ρ (3ΗΒ)は結晶性が高いため、柔軟性がないのが欠点であつた。その後、 3ΗΒと）-3 -ヒドロキシ吉草酸（3HV) とからなる ΡΗ Α共重合体（以下、「P (3HB- C 0-3HV) 」）を、高い PHA蓄積能を示すラルストニア · ユートロファ ( Ra l s t on i a eu t ropha) を用いて製造する方法が開発されたが（特開昭 5 7— 1 5 0 3 9 3号公報又は特開昭 5 9— 2 2 0 1 9 2号公報）、 3HBと 3HVとが共結晶化するために、柔軟性はほとんど向上しなかった。

近年、 3HBと、（R) - 3-ヒドロキシへキサン酸（3HHx) とからなる共重合体（以下、「P (3HB- co- 3HHx)」 ) の製造法が確立され、高い柔軟性を有するポリヒドロキシアルカン酸の製造が可能になった（特開平 5 — 9 3 0 4 9号公報又は特開平 7 — 2 6 5 0 6 5号公報）。これらの公報に記載の方法では、 P (3HB-C0 - 3HHx)は、土壌細菌ァエロモナス · キヤビエ (Aeromonas caviae) を用いて植物油から製造される。

また、本発明者らは、 3HBと、（R)- 3-ヒドロキシアルカン酸（3HA ) とからなる共重合体（以下、「P (3HB- co-3HA)」、但し、 3HA： C₄ 〜C₁₂の（R) - 3-ヒドロキシアルカン酸））が、ラルストニア ' ュ一トロファ (Ralstonia eutropha) 由来の PHA合成酵素遺伝子欠損変異株（PHB— 4株）にシユードモナス · エスピー（Pseudomonas sp. ) 由来の PHA合成酵素遺伝子の変異体を組み込んだ組換え株を用いて、植物油から製造されることを報告している（特開 2 0 0 7 — 1 2 5 0 0 4号公報）。

一方、分岐したアルキル基を有する 3 -ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするホモポリマーやそのコポリマーも報告されている（In t. J. Biol. Macromol. , 1990, Vol. 12, PP.92-101) 。しかし、一般的に、分岐したアルキル基を有する 3-ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするポリマーの製造は、モノマー組成の制御が困難であるために材料物性を考慮したポリマーの合成が難しく、当該公報においても分岐アルキルは分岐オクタン酸に限定されており、その物性についても明らかにされていなかった。発明の概要

従って、本発明は、更に高い柔軟性を有する新規なポリヒドロキシアルカン酸の製造を目的として、少なくとも（R) - 3-ヒドロキシ - 4-メチル吉草酸（以下、「3H4MV」と言うことがある）単位を含むポリヒドロキシアルカン酸の共重合体、及びその製造法を提供することを目的とする。なお、「（R)- 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸」は、「） -3-ヒドロキシイソへキサン酸」と同義である。

本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、炭素源の存在下に、ポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子が導入された宿主微生物を培養する、従来のポリヒドロキシアルカン酸の合成系において、 00-3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含む新規なポリヒドロキシアルカン酸共重合体が得られることを見出し、培養時に、（R)- 3-ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸の前駆物質を添加することにより、（R) -3-ヒドロキシ- 4_メチル吉草酸単位の組成比の高いポリヒドロキシアルカン酸共重合体（以下、単に、 ΓΡΗΑ共重合体」又は「PHA」と言うことがある）が効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、（ 1 ) 本発明は、少なくとも（R) -3 -ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含む、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。

(2) 本発明は、）- 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位と） - 3 -ヒドロキシブタン酸単位とを含む、（ 1 ) 記載のポリヒドロキシアル力ン酸共重合体を提供する。

( 3 ) 本発明は、（R)- 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位と、（R )-3-ヒドロキシブタン酸単位と、（R)- 3-ヒドロキシ吉草酸単位と、場合により（R)- 3 -ヒドロキシへキサン酸単位とを含む、（2) 記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。

(4) 本発明は、（R)- 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を 14 mo 1 以上含む、（ 1 ) 記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。

( 5) 本発明は、（R)- 3-ヒドロキシ- 4_メチル吉草酸単位を 14 mo 〜 40 mol%含む、（ 1 ) 記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を提供する。 ( 6 ) 本発明は、炭素源と、（R)- 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸の前駆物質との存在下に、大腸菌、ラルス卜二ァ属菌及びシユードモナス属菌から選ばれる微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から、少なくとも（R) -3 -ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法を提供する。

( 7 ) 本発明は、前記前駆物質が、 4-メチル吉草酸、 4-メチルぺンテン酸又はこれらの混合物から選ばれる、（ 6 ) 記載の製造法を提供する。

( 8 ) 本発明は、前記前駆物質が 0.1〜5.0 g/Lの濃度で添加される、（ 6 ) 又は（ 7 ) 記載の製造法を提供する。

( 9 ) 本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シユードモナス ' エスピー (Pseudomonas sp. ) 6卜 3株、シュ — ドモナス · スッッッエリ (Pseudomonas stutzeri) 、 A33、ァロクロマティゥム ' ピノサム（ Al lochromat ium vinosum) 、ノシルス • メガテリゥム (Bacillus megater ium) 、バシルス ' セレウス（ B acillus cereus) 、バシルス ' エスピー (Bacillus sp. ) INT005、ランプ口システイス · ロゼオペ Jレシシナ ( Lamprocys t i s roseopers icina) 、ノカリレディァ · コラリナ (Nocardia coral 1 ina) 、口ドパクター · シヤエロイデス ( Rhodobactor shaeroides) 、ラルストニァ · ユートロファ (Ralstonnia eutropha) 、ロドコッカス ' ェスピ一 (Rhodococcus SP. ) NCIMB 40126、チォカプサ ' フエニギ一

( Thiocapsa pfennig! i) 、ァェロモナス ' キヤビエ ( Aeromonas c aviae) 、及ぴァエロモナス ' ノヽイドロフイラ（ Aeromonas hydroph ila) から選ばれる微生物に由来する、（ 6 ) 〜（ 8 ) のいずれか 1記載の製造法を提供する。 ( 1 0 ) 本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シユードモナス · エスピー (Pseudomonas SP. ) 6卜 3株（DDB Jァクセシヨン番号： AB014758) 、又はァエロモナス ' キヤビエ（ eromonas caviae) ( GenBankァクセシヨン番号： D88825) に由来する、（ 9 ) 記載の製造法を提供する。

( 1 1 ) 本発明は、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、ァエロモナス ' キヤビエ (Aeromonas caviae) (GenBankァクセション番号： D88825) 由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の 149番のァスパラギンがセリンにかつ 171番のァスパラギン酸がグリシンに置換されたポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異体をコードするものである、（ 1 0 ) 記載の製造法を提供する。

( 1 2 ) 本発明は、前記炭素源が単糖類である、（ 6 ) 〜（ 1 1 ) のいずれか 1記載の製造法を提供する。

( 1 3 ) 本発明は、前記単糖類がフルクトースである、（ 1 2 ) 記載の製造法を提供する。

( 1 4 ) 本発明は、（ 1 ) 〜（ 5 ) のいずれか 1記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を含む成形体を提供する。

( 1 5 ) 本発明は、フィルムである、（ 1 4 ) 記載の成形体を提供する。

本発明の製造法によれば、少なくとも（R)- 3-ヒド口キシ- 4 -メチル吉草酸単位を含む PHA共重合体を安価かつ収率よく製造できる。また、該 PHA共重合体は、十分な強度と柔軟性を有し、フィルム等に加工し易く、工業的に有用な高分子材料である。図面の簡単な説明

図 1は、ラルストニア ' ユートロファ (Ralstonia eutropha) によって合成された PHA共重合体、及び化学的に合成された 3H4MV、の GC-MS分析を示す図である。（a) フルクト一スから合成された PHAの m/z 103ィオンクロマトグラム；（b) フルクトース及び 4-メチル吉草酸（4MV) から合成された PHAの m/z 103イオンクロマトグラム； ( c) 化学的に合成された 3H4MV (3H4MV標品）の m/z 103イオンクロマトグラム；並びに（d) ターポリマー P (3HB-CO-3HV- co- 3HHx)の m/z 103イオンクロマトグラム。 GCにおける温度プログラムは、 1分間、 100Cで開始し、次いで 8 °C/分の連続ステップで 280°Cまで昇温した。

図 2は、シリル化 3HAメチルエステルの GC- MS分析の結果を示す図である。（A) 総イオンクロマトグラム；（B) ピーク 1 (3.5分）、ピーク 2 (4.6分）及びピーク 3 (5.3分）のイオンフラグメントパ夕一ンは、それぞれ、シリル化 3HB、シリル化 3HV及びシリル化 3H4M Vに相当する。

図 3は、フルクトース（20 g/1) 及び 4-メチル吉草酸（4MV) (1 g/1) で培養した R. eutropha (phaCl_P J から単離した P (3HB- co - 3 114¾^)の500 ¾1112 - NMRスペクトルを示す図である。 P (3HB- co- 3H4M V)の化学式において、 X及び yは繰り返し数を示す。

図 4は、フルク卜ース（20 g/1) 及び 4-メチル吉草酸（4MV) (1 g/1) で培養した R. eutropha (phaCl_P J から単離した P (3HB-co_3 H4MV)の 125 MHz ¹³ C- NMRスぺクトルを示す図である。

図 5は、 R. eutropha (phaC_Ac (NSDG変異体））から単離した様々な P (3HB- co- 3H4MV)サンプルの溶液キャストフィルムの DSC熱容量変化を示す図である。加熱温度は、 20 /分である。

図 6は、 1 日、 40日及び 180日保存後の、 L eutropha (phaC_Ac ( NSDG変異体））から製造した、（A) P (3HB-co-7 mol¾ 3H4MV) ； (B) P (3HB-co-9 mol% 3H4MV)； (0 P (3HB-co-14 mol% 3H4MY)； (D) P (3H B - co- 16 mol¾ 3H4MV) ；及び（E) P (3HB-co-22 mol% 3H4MV)の各フィルムの応力-歪み曲線を示す。

図 7は、以下の共重合体： P (3HB- C o - 3H4MV)フラクション（黒三角）、 P (3HB- co- 3HHx)フラクション（白三角）、 P (3HB- co- 3HV)フラクシヨン（黒丸）、及び P (3HB- co- 4HB)フラクション（白丸）についての、（A) 融点（Tm) と第二モノマー単位含量との関係；（B) ガラス転移点（Tg) と第二モノマー単位含量との関係；及び（C) 破壊伸びの割合（％) と第二モノマー単位含量との関係を示す図である。横軸の第二モノマ一フラクションは、 3H4MV単位の含量（mo l % ) を示す。 P (3HB- C 0 - 3H4MV)の傾向線（t rend l i ne) を太線で示す

発明を実施するための形態

本発明の（R) -3-ヒド口キシ- 4_メチル吉草酸単位を含む PHA共重合体は、その（R) - 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸（3H4MV) 単位の組成比が低いながらも、炭素源の存在下に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された宿主微生物を培養する、従来のポリヒドロキシアル力ン酸の合成系によって製造できることが本発明者らにより今回初めて明らかにされた（図 1参照）。更に、培養時に、 3H4MVの前駆物質を添加することにより、 3H4MV単位の組成比が増加した共重合体が製造できることも明らかにされた。

すなわち、本発明の PHA共重合体は、少なくとも、下記式（ I )

で表わされる 3H4MV単位を含む。式（ I ) の PHA共重合体における 3H 4MV単位の含量は、好ましくは 14 mol%以上、より好ましくは 14 mol %〜40 mol%である。 3H4MV単位の含量が 14 mol%未満では、 PHA共重合体の結晶化が進行し易く、得られた PHA共重合体が脆くなりやすい。また、 3H4MV単位の含量が 40 mol%を超えるとエラストマ一状となる。

本発明の PHA共重合体は、好ましくは、下記式（ I I ) ：

[式中、 X及び yは繰り返し数であり、それぞれ独立に 1 〜20， 000 の整数を示す'。 ]

で表わされる、（R) - 3-ヒドロキシブタン酸（3HB) 単位と 3H4MV単位とを含む共重合体 P (3HB-CO-3H4MV)である。

また、本発明の PHA共重合体は、 3HB単位と 3H4MV単位とに加えて（ R) - 3 -ヒドロキシ吉草酸（3HV) 単位を更に含む、下記式（ I I I )

[式中、 x、 y及ぴ z は繰り返し数であり、それぞれ独立に 1 〜20, 000の整数を示す。 ]

で表わされる共重合体 P (3HB-co-3HV-co-3H4MV)も好ましい。共重合体 P (3HB-CO-3HV-CO-3H4MV)において、該共重合体中の 3HVの含量は、共重合体が高い柔軟性を有するためには、できるだけ低いことが好ましく、例えば、 3HVの含量が 1.6 mol%以下であれば柔軟性に支障を与えない。共重合体 P (3HB- co- 3HV- co- 3H4MV)は、場合により、 (R)-3-ヒドロキシへキサン酸単位を更に含んでもよい。

本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、炭素源と、 3H4M Vの前駆物質との存在下に、宿主にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入されてなる形質転換体を培養し、得られた培養物から） -3 -ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することによって製造できる。

ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体は、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域べクタ一に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入して得られるプラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。

宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、例えば、移動能を有する mob領域を持つベクター PBBRIMCS- 2、 p JRD215及び PLA2917が挙げられる。

ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、例えば、シユードモナス · エスピー (Pseudomonas sp. ) 61-3株、シユードモナス ' スッッッエリ ( Pseudomonas stutzeri) 、シユードモナス ' エスピー (Pseudomonas sp. ) A33、ァロクロマティゥム · ピノサム (Al lochromat iuni vinosum) 、ノシルス · メガテリゥム (Bacil lus megater ium) 、ノシルス ' セレウス (Baci 1 lus cereus) 、ノシルス · エスピー (Bacillus sp. ) INT005、ランプ口システィス · ロゼオペ Jレシシナ ( Lamprocys t is roseopers ic ina) 、ノ刀リレアィァ . コラリナ (Nocardia coral 1 ina) 、ロドバク夕一 ' シヤエロイデス (Rhodobactor shaeroides) 、ラルストニア · ュ一トロファ（Sals tonnia eutropha) 、ロドコッカス · エスピー ( Rhodococcus sp. ) NCIMB 40126、チォカプサ ' フエニギ一 (Thiocapsa pfennigi i) 、ァエロモナス · キヤビエ (Aeromonas caviae) 、及びァエロモナス • ハイドロフイラ (Aeromonas hydrop ila) から選ばれる微生物に由来するものが挙げられる。これらの中で、シユードモナス ' エスピ一 (Pseudomonas sp. ) 6卜 3株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、細胞内に共重合体 P (3HB- co- 3HA) ( 3HA： C₄〜 ₂の（R )-3-ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有し、ァエロモナス • キヤビエ (Aeromonas caviae) 由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素は、共重合体 P (3HB- co- 3HA) ( 3HA： C₄〜 C₇の（R) -3-ヒドロキシアルカン酸）を蓄積する能力を有する点で、特に好ましい。

また、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、上記のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の変異体をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、野生型のポリヒドロキシァルカン酸重合酵素のアミノ酸配列において、 1個もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このような変異体としては、具体的には、 Aeromona s. caviae由来のポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素の 149番のァスパラギンがセリンに、かつ 171番のァスパラギン酸がグリシンに置換された変異体（NSDG変異体）が挙げられる。該 NSDG変異体の製造法は、 FEMS Microbiol Lett, 277 (2007), p.217- 222に詳細に記載されている。

公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、 Ralstonia eutrop 由来の PhbA、 phbB、 phaB、 phbB (Peoples, 0. P. and Sinskey, A . J.， J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989) ) 、 Aeromonas cav iae由来の phaJ (Fukui, T. and Doi, Y.， J. Bacteriol. 179: 482 1-4830 (1997) ) 等が挙げられる。

ポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入する微生物発現用べクタ一は、プロモーター、リポゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネータ一等を有する公知のベクタ一を用いることができる。

宿主としては、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安全性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易である点から、例えば、大腸菌、ラルストニア属菌、シユードモナス属菌等の微生物細胞が挙げられる。本発明では、具体的には、 Ralstonia eutropha H16の PHA蓄積能欠損株である Ralstonia eut ropha PHB— 4株を使用することができる。

現在のところ、 Pseudomonas sp. 61 - 3株由来のポリヒドロキシァルカン酸重合酵素遺伝子（phaCl_{P s}) の Ralstonia eutropha PHB" 4 株への効率的な形質転換法は確立されていないが、接合伝達によつて遺伝子 phaCl_{P s}を再現性よく伝達することができる。具体的には、 Ralstonia eutropha中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクタ一に、遺伝子 phaCl_{P s}及び公知のモノマー供給遺伝子を含む上記プラスミドの DNA断片をライゲ一ションし、ライゲ一ションによって得られるプラスミドを、 DNAの移動に直接関わる tra領域が染色体中に組み込まれている大腸菌中で形質転換した後、得られたプラスミドを Ralstonia eutropha PHB— 4株と接触させる。大腸菌の形質転換は、例えば、カルシウム法（Lederberg. E. M. et al. , J. Bacteriol. 119. 1072 (1974) ) やエレクトロボレ一シヨン法（Curr ent Protocols in Molecular Biology, 1 巻， 184頁， 1994年）等によって行うことができる。

3H4MVの前駆物質としては、例えば、 4-メチル吉草酸、 4-メチルペンテン酸、又はこれらの混合物が好ましい。 3H4MVの前駆物質の添加量は、約 0. 1〜約 5. 0 g/Lの範囲が好ましく、約 0. 5〜約 2. 0 g/L の範囲がより好ましい。

炭素源としては、例えば、糖類、油脂類等を用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、ァラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぶん加水分解物等が挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パ一ム核油、又はこれらの分別油、例えばパ一ム Wォレイン油 (パーム油を 2回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油ォレイン（パーム核油を 1回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。

培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは 1 5〜40°C、より好ましくは 20〜40°C、更により好ましくは 28〜34°Cである。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では 1 〜 7 日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸ァンモニゥム、リン酸水素二アンモニゥム等のアンモニゥム塩、ぺプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。

無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリゥム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。

その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、ァラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミン B l、ビタミン B 12、ピオチン、ニコチン酸アミド、パン卜テン酸、ビタミン C 等のビタミン類などが挙げられる。

本発明の PHA共重合体の菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロ口ホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。

本発明の PHA共重合体は、フィルム、シート等の成形体に加工できる。フィルムの厚みは特に特定されないが、通常、 1 m m以下、好ましくは 0 . 5 m m以下である。

本発明のフィルムは、溶液キャスト法、射出成形、プレス成形、ブロー成形等により得られるが、簡便に無色透明なフィルムを得るためにはキャスト法が好ましい。また、本発明のフィルムは機械的特性を向上させることなどを目的として、高温で熱処理してもよい。熱処理温度は共重合体の種類によって異なるが、通常、 5 0〜 2 0 0 X：の範囲で行われる。更に、本発明のフィルムは延伸処理を施すことによって、引張強度、弾性率等の機械的特性などを更に向上させることができる。

また、本発明の成形体には本発明の目的を損なわない範囲内で、通常フィルムに用いられる各種添加剤、例えば紫外線吸収剤、熱安定剤、酸化防止剤、着色剤などを添加してもよい。本発明の（R)-3-ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸単位を含む PHA共重合体は、十分な強度と柔軟性を有し、医療用材料、食品その他の包装材料、農業用ビ二一ルシートゃゴミ袋などに有用である。実施例

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。材料及び調製方法

( 1 ) 微生物

(a) Escherichia col i S17-1株 (H. G. Schlegel (Georg-Augus t-Universitat, ドイツより入手）

(b) Ralstonia eutropha PHB一 4 (Ralstonia eutropha H16のポリヒドロキシアル力ン酸蓄積能欠損株 DSM541、ドィッ DSMより入手

)

( 2 ) 培地

(a) Luria-Bertani (LB) 培地

Bacto trypton 10 g、酵母エキス 5 g、 NaCl 10 gを脱イオン水 1 Lに溶かして、 12 Cで 20分間オートクレープして調製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天 1.5〜2 % (wt/vol) となるよう加ぇォ一トクレーブ処理して調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度 50 n g/mL) は、液体培地、寒天培地ともにォ一トクレーブ処理後に添加した。

(b) Nutrient-rich (N ) 培地 (pH 7.0)

Bacto trypton 10 g、酵母エキス 2 g、肉エキス 10 gを脱ィォン水 1 Lに溶かして、 121でで 20分間オートクレープ処理した後、抗生物質（カナマイシン：終濃度 50 a g/mL) を添加した。 (C) シモンズクェン酸培地

クェン酸ナトリウム二水和物 2g、 NaCl 5 g、 NH₄H₂P0₄ 1 g、 K₂ HP0₄ 1 g、 0.2 g/mL MgS0₄溶液を脱イオン水 1 Uこ溶かして、 121°C で 20分間オートクレープ処理して調製した。寒天培地は、まず液体培地を pH 6.9に調整し、渴変を防ぐため当該液体培地と寒天成分とを別々に 121 で 20分間ォ一トクレーブ処理した後にこれらを混合した。更に、 200 g/Lに調整した MgS0₄、 7H₂0をフィルター滅菌し、培地全量に対し 1/1000量及び抗生物質（カナマイシン：終濃度 50 n g/mL) を加えた。

(d) MS培地

ミネラル培地（pH 7.0) ： K₂HP0₄ 1.5 g、 Na₂HP0₄ · 12H₂0 9.0 g 、 NH₄C1 0.5 g、 NaCl 0.5 gを脱イオン水 1 Uこ溶かして、 121°Cで 2 0分間ォ一トクレーブ処理した後、 MgS0₄ · 7H₂0 0.2 g、微量金属塩培地 1 ml、及びカナマイシン 50 mgを加えて調製した。

なお、微量金属塩培地（0. IN HC1) は、 CoCl₂ · 6H₂0 0.218 g、 F eCl₃ 9.7g、 CaCl₂ 7.8 g、 NiCl₃ · 6H₂0 0.118 g、 CrCl₃ · 6H₂0 0.1 05 g、及び CuS0₄ - 5H₂0 0.156 gを脱イオン水 1 Uこ溶かして調製した。

( 3 ) プラスミド

(a) pBBRl" Cl_PsAB_Re

pGEM- Tベクター（プロメガより入手）に、 Pseudomonas SP. 61-3 株由来の PHA合成酵素遺伝子 phaCl_Ps (DDBJァクセション番号： AB01 4758) と、 alstonia eu t ropha由来のモノマー供給遣伝子 phaAB_{P f} ( GenBankァクセシヨン番号： J04987) とを挿入して、 pGEM" C 1_{P s} AB_{K e} を作製した。

pGEM"Cl_PsAB_Keプラスミドを！^ coli DH5 a株に形質転換し、抗生物質含有 LB寒天培地で 37°C、 12時間培養した。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質含有 LB培地 1.7 mLに植菌し、 37 °C、 160/分で 12時間振盪培養した。当該培養液から E. coli DH5 株を回収し、 75 の TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8. 0) を用い、 Rapid Plasmid Miniprep System (MARLIGEN BIOSCIENC E社製）によりプラスミドを抽出した。

上記の抽出プラスミドを BamHIによって消化し、 0.8 %ァガロースゲル（TaKaRa社製）を用いて電気泳動を行った。その後、分離した目的の MA断片のゲルを切り出し、 Rapid Gel Extraction System ( MARLIGEN BIOSCIENCE社製）を用いて精製した。その際、 50 の T E溶液を用いて溶出した。更に、この DNA断片をエタノール沈殿によつて濃縮し、 10 の TE溶液に溶解した。

このようにして得られた挿入 DNA断片 4 と pBBRlMCS- 2ベクター (M. E. K. Kovach, Louisiana State University, 米国より入手 ) 1 ^ Lとを混合し、 MA Ligation kit ver.2 (TaKaRa社製）を 5 iL加えた後、 16°Cで約 2〜 3時間反応させ、 pGEM" Cl_{P s} AB_{K e}の BamH I断片（phaCl_{P s}と phaAB_{K e}とを含む）を挿入したプラスミド pBBRl" C l_{P s}AB_{K e}を作製した。

(b) pBBREE32dl3

Pseudomonas sp.6卜 3株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子（phaCl_{P s}) の代わりに Aeromonas caviae由来の PHA合成酵素遺伝子（phaC_{A c}) (GenBankァクセシヨン番号： D88825) を用いる以外は、上記（a) と同様にしてプラスミド pBBREE32dl3を作製した。

( 4 ) PHA共重合体の構造及び物性の分析法

(a) ガスクロマトグラフィー（GC)

菌体内の PHA共重合体含有率とその組成は、ガスクロマトグラフィ一で決定した（Brauneggら， 1978) 。まず、得られた乾燥菌体を耐圧ガラス管に 10〜 15 mg秤量し、ここに硫酸メタノール溶液（硫酸：メ夕ノ一ル = 15 vo l %： 85 vo l %) 2 mL及びク口口ホルム 2 mLを加えて密栓し、 100°C、 140分間ヒートブロックで加熱しメタノール分解した。加熱中は約 30分ごとにサンプルを撹拌した。その後、室温まで冷却し、純水 1 mLを加えて激しく撹拌した。静置後、二層に分離した下層（クロ口ホルム層）をパスツールピペットで吸引し、 0. 45 m径の M i l l ex- FH PVDFフィルター（ミリポア社製）でろ過した。ろ過後のクロ口ホルム層 500 に内部標準物質である 0. 1 vo l %力プリル酸メチル 500 Lを加え混合したものをサンプルとした。 GC装置は島津製作所製のガスク口マトグラフ GC 14Bを用い、カラムには GLサイエンス社製 NEUTRA-BOND- 1 (内径 30 m X O. 25 mm、膜厚 0. 4 m) を用いた。キャリアガスとして He及び N₂を用い、成分の検出には水素炎イオン化検出器を用いた。

( b) PHA共重合体の抽出及び精製

PHA共重合体を蓄積させた乾燥菌体を 100 mgの蓋付ガラス瓶に移し、 100 mLのクロ口ホルムを加えスターラーで 72時間攪拌した。撹拌後の溶液を No. 1濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、口一タリ一エバポレーターで完全に濾液を揮発させ、共重合体を析出させた。

ついで、析出した PHA共重合体を少量のメ夕ノールで洗い取り、約 20 mLのクロ口ホルムに完全に溶解させた後、 400 mLのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い精製した。精製した共重合体を No. 1濾紙で回収し、 48時間ドラフト中で乾燥させた。

( c) GPC (ゲル浸透クロマトグラフィー）

菌体から精製した PHA共重合体の数平均分子量（M_n ) 及び分子量分布（M_w /M_n ) ( M_w ：重量平均分子量）を GPC測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた 5種類のポリスチレンの分子量は、 3, 790、 30, 300、 219, 000、 756， 000及び 4, 230 , 000である。

GPCサンプルは、精製した PHA共重合体を約 l mg/mLとなるようにクロ口ホルムに溶解し、孔径 0.45 mの Millex- FH PVDFフィルタ一 (ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。

GPC測定には島津製作所社製の LC- VPシリーズ（システムコント口一ラー： SCL-10AVP、オートインジェクター： SIL-10A VP、送液ュニット： LC-10AD VP、力ラムオーブン： CTO_10A、ディテクタ一： R ID-10A) を使用し、カラムには Shodex社製の K-806M及び K- 802を用いた。移動層にはクロ口ホルムを用い、総液流量は 0.8 mL/分、力ラム温度は 40 に設定し、サンプル注入量は 50 とした。デ一夕の解析には CLASS- VP用 GPC (島津製作所社製）を用いた。ポリスチレンスタンダ一ドから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した

(d) 示差走査熱量（DSC)

DSCサンプルは、精製した PHA共重合体を約 10 mg秤り取り、 5 mL 容のサンプルバイアルに入れ、約 1〜 2 mLのクロ口ホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で約 3週間乾燥させることによりキヤストフィルムを作製した。このキャストフイルムから約 3 mgを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものを DSC測定サンプルとした。測定には、パーキンエルマ一社製の Pyris 1 DSCを使用した。測定は 20 mL/分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに 25で〜 20 0 ^まで 20で/分の昇温速度で加熱し、 200°Cで 1分間保持した後、 - 500 /分で- 120°Cまで急冷した。次に、 - 120°Cで 1分間保持した後、 20°C/分の昇温速度で 200°Cに加熱した。解析には、パーキンエルマ一社製の解析ソフト Data Analysisを用いた。測定した試料の融点 T_B及び融解ェン夕ルピ一 ΔΗ_ηの決定は、最初に昇温した時のサーモグラムより、ガラス転移温度 T_gは二度目に昇温した時のサーモグラムより求めた。

(e) 3H4MV標品の合成

NaBH₄ 1 gを 100 mLナスフラスコに秤り取り、メタノール 10 mL を加えた。次に、この溶液にイソプチリル酢酸メチル（東京化成ェ業） 3 mL /メタノール 10 mLを氷上で撹拌しながら徐々に滴下した。発熱しなくなるまで氷上で撹拌し、その後室温で 12時間撹拌した。反応終了後、未反応の NaBH₄をろ別し、クロ口ホルム 40 mLを加え、飽和塩化ナトリウム水溶液 40 mLで 3回洗浄した。クロ口ホルム層を乾燥後、ロータリ一エバポレー夕一で濃縮し、無色透明液体を得た。

(f) ガスクロマトグラフィー/マススぺクトロメトリ一 (GC/MS

)

PHA共重合体に含まれる微量の 3 -ヒドロキシアルカン酸の組成は、 GC/MSにより決定した。定性は SCANモード、定量は SIM (selected ion monitoring) モードを使用した。

<装置 >

ガスクロマトグラフ： GC-2010 (島津製作所）

ガスクロマトグラフ質量分析計： GCMC- QC2010 (島津製作所）カラム： Inert Cap 1 (GLサイエンス）

検出器：質量分析計（MS)

イオン化源：電子衝撃イオン化法（EI)

分析ソフト： GC MS Solution (島津製作所）

<サンプル調製 > • メチルエステル化

ネジロ耐圧試験管に PHAを所定量秤量し、硫酸メタノール溶液 2 m L及びクロ口ホルム 2 mLを加え、 100°Cで 140分間、数回攪拌しながら加熱した。反応終了後、室温まで冷却し超純水 1 mLを加え激しく撹拌し、静置後下層をサンプルとした。

• トリメチルシリル化

メチルエステル化サンプル 2 0 0 Lにジメチルホルムアミド 3 0 0 nしビス（トリメチルシリル）トリフルォロアセトアミド 100 Lを加え、 70°Cで 30分間、数回攪拌しながら加熱した。反応終了後、室温まで冷却し、超純水 l mL、へキサン 1 mLを加え激しく撹拌し、静置後上層をサンプルとした。

ぐ測定条件 >

MSの質量数較正にはパ一フルォロトリプチルァミンを用いた。キャリアガスとしてヘリウムを用い、入り口圧は 120 kPaとした各装置の分ネ斤ラインの温度条件 GC：試料気化温度 280°C ；力ラム初期温度 100°C ；カラム最終温度 280°C ；カラム昇温速度 V I 分；注入モードスプリット、 GC-MS：イオン源温度 230°C ；インタ一フェース温度 250 ；溶媒溶出時間 1. 7分；検出器ゲイン 0. 8kV 。測定条件 MS SCAN：開始時間 2分；終了時間 24分；スキャン速度 1250；開始 m/z 45. 00 ；終了 m/z 600. 00。

サンプル注入量は 1 とした。

( g) -NMR及び^{1 3} C -匪 R測定

CDC 1₃に 3 % ( w t/vo l ) となるよう PHA共重合体を溶解し、測定サンプルとした。核磁気共鳴分光装置を使用し、室温で測定を行った

( 5 ) PHA共重合体の力学的強度の測定 PHAフィルムを作製し、 PHAのフィルムのヤング率、破壊応力、破壞伸びを、引張試験によって決定した。

ぐ装置 >

引張試験機： AGS- H/EZTe s t (島津製作所）

分析ソフト ·· TRAPEZ IUM 2 (島津製作所）

<サンプル調製 >

( a) キャストフィルムの作製

精製したポリマーを適量のクロ口ホルムの溶解し、フラットシヤーレに展開した。ここで用いたポリマ一重量は、シャーレの面積を考慮して、厚さが 150 になるように計算した。展開後、穴をあけたアルミホイルでシャーレにふたをして、クロ口ホルムが完全に気化するまで、平滑な場所に室温で静置した。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、一週間、室温で静置した。シャーレから剥がれにくいポリマ一は、シャーレとポリマ一の間に超純水を滴下することにより、剥離した。

( b) 引張試験片の作製

作製したキャストフィルムを縦 20 mm、横 3 mmに切断したものをサンプルとした。切断には剃刀を使用し、ポリマーの真上から押さえつけるように切断した。

<測定条件 >

つかみ間距離 10 mm、引張速度 10 nun/分とし、室温で測定した。 <データ解析 >

ポリマーが破断しときの応力を破断応力、伸び率を破壊伸びとした。ヤング率は、応力—歪み曲線における開始点の傾きとした。以下、実施例において用いる語句、「本発明の PHA共重合体」、 Γ ΡΗΑϋ 又は r p (3HB-c o-3H4MV) J は、 Γ Ρ (3HB-c o-3H4MV) J 及び/又は「P (3HB-CO- 3HV- C o- 3H4MV)」を意味するものとする。実施例 1〜 2 Pseudomonas sp.61-3株由来重合酵素を用いる P (3H B-CO-3H4MV)の製造

( 1 ) 形質転換体 Ralstonia eutropha PHB— 4株の作製

L_ coii S 17-1株のコンビテントセルは、対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得た。当該処理細胞にプラスミド pBBRl" Cl_{P s}AB_Reの DNAを加え、 42°Cに温度を上げるヒートショックによって細胞内への取り込みを促進させた。

Ralstonia eutropha PHB— 4株に遺伝子を導入するために接合伝達を行った。プラスミド1^8111"( 1^ 81^が導入された1^ coli SI 7-1 株を 1.7 mL LB培地に植菌し、 37°Cで 15時間振盪培養した。また、導入する宿主（Ralstonia eutropha PHB— 4株) も 1.7 mL NR培地に植菌し、 30°Cで 15時間培養した。培養後、それぞれの培養液全量をオートクレープ済みエツペンチューブに移し、 12, 000 rpmで 2分間遠心した。抗生物質を含む L_ il S17-1株には、 500 LB培地を加えて更に遠心して、抗生物質を完全に除去した。上清を 50 l ほど残るように捨てて、 E. coli S17-1株と Ralstonia eutropha PH B一 4株を混合し、 LB寒天培地に滴下し、乾燥後、 30°Cで 5時間培養した。その後、抗生物質を含むシモンズクェン酸寒天培地にストリークし、 30でで 2 日間培養した。ここで得られた単一コロニーを再度シモンズクェン酸培地にストリークし、 30°Cで 2 日間培養した。これにより単離したコロニー (形質転換体 Ralstonia eutropha株) を以降の実験で使用した。

( 2 ) 形質転換体 Ralstonia eutropha株の培養

形質転換体 Ralstonia eutropha株の培養には MS培地を用いた。シモンズクェン酸培地上で単離した単一コロニーを白金耳を用いて 1. 7 mLの NR培地に植菌し、 30でで 12時間振盪培養した（前培養）。この培養液 l mLを、フルクト一ス 20 g/L、抗生物質、 3H4MVの前駆物質として 4-メチル吉草酸又は 4-メチルペンテン酸（いずれも、 1 g/ L) を含む 100 mLの MS培地に植菌し、 30°C、 130/分で 72時間振盪培養を行った（本培養）。また、比較のために、 L-バリン又は L-ロイシンを添加して同様に培養を行った。

培養後、 250 mL遠心管に培養液を移し、 4 °C、 6, 000 rpm ( 4, 050 X g) で 10分間遠心し集菌した。菌を遠心分離した後、約 20 mLの水に菌体を懸濁させ、再度 4 t：、 6, 000 rpmで 10分間遠心し集菌を行い、上清を取り除いた。集菌した菌のペレットを 2〜 3 mLの超純水に懸濁させ、 5 mLのポリプロピレン容器に移し、風穴を開けたパラフィルムを貼り付け、 - 80°Cで凍結乾燥し、 72時間真空乾燥させることにより乾燥菌体を得た。

乾燥菌体を前記のようにして精製して PHAを得、 GC-MS (図 1 、 2 ) 、 ¹ H-NMR (図 3 ) 及び^{1 3} C-匪 R (図 4 ) によりその構造を分析した。表 1 に、 3HAメチルエステルの各々の分子量及び GC保持時間を示す。表 1 3HAメチルエステルの分子量及びガスクロマトグラフィー（G 0

保持時間

a ) 3HB： (R) - 3-ヒドロキシブタン酸； 3HV： (R) -3-ヒドロキシ吉草酸； 3H4MV： (R) - 3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸； 3HHx： (R) - 3-ヒド W 200 ロキシへキサン酸

b) GC温度プログラムは、 1分間 100°Cで開始し、次いで 8 °C/分の連続ステップで 280°Cめで昇温した。図 1より、前駆物質の非存在下でも、 3H4MVを構成単位とする P (3 HB - Co- 3H4MV)が得られることが初めて見出された（図 1の（a) ) 。以下に、 P (3HB- co- 3H4MV)の¹ H-NMRデータ、及び¹³ C-匪 Rのデータを示す。

Ή-NMR (500 MHz, CDC1₃) δ (ppm) ： 5.30-5.23 (m, 3HBの CC CH ₃)， 5.13 (d, 3H4MVの CCHCH , 2.67-2.44 (m, 3HBの CCH₂C0), 1.8 9 (dd， 3H4MVの CCj^CO)， 1.27 (dd, 3HBの CCH₃), 0.90 (d, 3H4MV の C (C]^)₂)。 ¹³C -匪 R (125 MHz, CDC1₃) δ (ppm) :169. 1 (3HB単位のカルポニル炭素）， 169.7 (3H4MV単位のカルボニル炭素）。

また、前駆物質の存在下では、 3H4MVの組成比が高い P (3HB_co_3H 4MV)が得られることが明らかになった（図 1 の（b) ) 。結果を表 2 に纏めた。一方、前駆物質の代わりに L-ロイシン又は L-バリンを添加した場合には、 P (3HB-CO-3H4MV)は全く検出されなかった。

表 2 フルクト一ス及び 3H4MVアナログから Ralstonia eutropha PHB—4株 (phaCl_{P s})

によつて合成された PHAの組成 ^a)

3H4MVアナログは、最終濃度が 1.0 g/Lとなるように、フルクト一ス（20 g/L) を含む MS培地に加え

実施例 3〜 6 Aeromonas caviae由来重合酵素を導入した Ral s ton i a eutrouha株によるフルクト一ス及び 4-メチル吉草酸からの P (3HB- CO-3H4MV)の製造

プラスミド pBBRl" Cl_{P s} AB_Reの代わりにプラスミド pBBREE32dl3を用いる以外は実施例 2 と同様にして、 Aeromonas caviae由来のポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子が 3H4MVを取り込むか否かについて検討した。また、 Aeromonas caviae由来のポリヒドロキシァルカン酸重合酵素の 149番のァスパラギンがセリンに、かつ 171番のァスパラギン酸がグリシンに置換された変異体（NSDG変異体）を、 FEMS Microbiol Lett, 277 (2007) , p.217-222に記載の方法に準じて製造し、該変異体をコードする重合酵素遺伝子が 3H4MVを取り込むか否かについても検討した。結果を表 3に示す。

表 3 Ralstonia eutropM株によるフルクトース及び 4 -メチル吉草酸からの PHA生合成 ^{a }}

a) 乾燥菌体重量、 PHA含有率、及び PHA組成結果は、少なくとも 3つ独立した培養物からの平均及ぴ標準偏差である。細胞は、フルクトース（20 g/L) 及び 4 -メチル吉草酸を含む MS培地で培養した。

b ) シユードモナス · エスピー（Pseu4omo¾as s¾. ) 61- 3株由来の PHA合成酵素遺伝子

c ) ァエロモナス . キヤビエ (Aeromonas caviae) 株由来の PHA合成酵素遺伝子

d ) ァエロモナス ' キヤビエ (Aeromonas caviae) 株由来の PHA合成酵素変異体（N149— S及び D171→G) 遺伝子

表 3より、野生型の Ralstonia eutropha H16由来の PHA合成酵素遺伝子でも 3H4MVを取り込んだが、 Pseudomonas sp. 61- 3株由来の P HA合成酵素遺伝子、 Aeromonas caviae株由来の PHA合成酵素遺伝子、及び Ae r omonas cav i ae株由来の PHA合成酵素変異体遺伝子では、更に取り込み率が高くなることが分かった。実施例 7 4 -メチル吉草酸の濃度の影響

4 -メチル吉草酸の濃度を変える以外は、実施例 4、 6 と同様にして P (3HB- co_3H4MV)を製造した。結果を表 4に示す。表 4 様々な Ralstonia eut ropha株によるフルクト一ス及び 4 -メチル吉草酸（4MV) からの P (3HB-C0- 3H4MV)の製造 ^a

a) 乾燥菌体重量、 PHA含有率及び PHA組成の値は、少なくとも 3つ独立した培養物からの平均及び標準偏差である。細胞は、フルクトース（20 g/L) 及び異なった濃度の 4MVを含む MS培地で培養した。 b ) 微量のため定量できず。実施例 8 P (3HB- C O - 3H4MV)の分子量、並びに P (3HB- co- 3H4MV)を含む溶液キャストフィルムの熱的特性及び力学的特性

実施例 7で作製したサンプル番号（1)〜（18)の共重合体を含む溶液キャストフィルムを前記のようにして作製し（得られたフィルムのサンプル番号（Γ )〜（18 ' )とする）、熱的特性及び力学的特性を測定した（表 5 ) 。

表 5 組換え Ralstonia eut ropha株によつて合成された P (3HB-CO-3H4MV)の分子量、並びに P (3HB- co - 3H4MV)溶液キャストフィルムの熱特性及び力学特性 ^a)

M_ff/ M_n ：多分散度； Tg：ガラス転移点； Tm：融点； ΔΗ_Β ：結晶融解ェンタルピー。共重合体 Ρ (3ΗΒ- co - 3H4MV)サンプルが、 phaCl_{P s}を有する PHB— 4、及び NSDG変異体遺伝子を有する PHB から取得した。

b ) ND：非検出。

結晶融解ェンタルピー（ΔΗιη) が高い値ほど、得られた ΡΗΑ共重合体の結晶性は高くなる。結晶性が高くなると、該 ΡΗΑ共重合体の硬度は増すが、脆くなる。

本発明において、特に 3H4MVを 14 mol%以上含むサンプル（6)、 (7 ) 及び（14)〜（18)では、 PHA共重合体の結晶性が低く、その内のサンプル（6' )、（7') 及び（14' )〜（16' )は、ヤング率及び破壊伸びの値から、高い柔軟性を有することが実際に確認された。サンプル（9 ')〜（16') 及び（18')の DSC熱容量変化を図 5に示す。また、 P(3HB - CO-3H4MV) , P (3HB - co- 3HHx)、 P (3HB- co - 3HV)、及び P (3HB_co - 4HB) についての、（A) 融点（Tm) と第二モノマー単位含量との関係；（B ) ガラス転移点（Tg) と第二モノマー単位含量との関係；及び（C) 破壊伸びの割合（％) と第二モノマー単位含量との関係を図 7に示す。

参考として、 3HV組成が 14 mo^である P (3HB- co- の融点は、 1 50°C (P. Holms, in Development in Crystalline Polymers-2, D. C. Bassett, Ed. , Elsevier, London, 1988, pp.1-65) 、 3HHx組成が 15 mol%である P (3HB- co- 3HHx)の融点は、 115°C (Macromolecul es, 1995, Vol.28, pp.4822-4828) 、 3HBのホモポリマーの融点は、 174°Cである。実施例 9 経時的な（3HB- co- 3H4MV)の力学的特性の変化

実施例 8で得られたサンプル '）〜（18' )を室温で 1 日、 40日、 1 80日保存した後に、引張強度及び破壊伸びを測定した（表 6、図 6 表 6 1 日、 40日及び 180日保存された P (3HB- co- 3H4MV)溶液キャストフィルムの力学特性

表 6及び図 6より、本発明の PHA共重合体を含む溶液キャストフイルムは、 180日保存後も製造時の力学的特性を有することから、安定性が高いことが分かった。

Claims

請求項 1

少なくとも（R) -3-ヒドロキシ- 4-メチル吉草酸単位を含む、ポリヒドロキシァルカン酸共重合体。

請求項 2 請

(10 -3-ヒドロキシ -4-メチル吉草酸単位と（R) - 3-ヒドロキシブ夕ン酸単位とを含む、請求項 1記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。

請求項 3

(R) -3-ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸単位囲と、（R) - 3-ヒド口キシブタン酸単位と、（R) - 3-ヒドロキシ吉草酸単位と、場合により（R) - 3- ヒドロキシへキサン酸単位とを含む、請求項 2記載のポリヒドロキシァルカン酸共重合体。

請求項 4

(R) - 3-ヒドロキシ -4-メチル吉草酸単位を 14 mo 1 %以上含む、請求項 1記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。

請求項 5

(10 -3-ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸単位を 14 mo l %〜40 mo l %含む、請求項 1記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。

請求項 6

炭素源と、（R) -3-ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸の前駆物質との存在下に、大腸菌、ラルストニア属菌及びシユードモナス属菌から選ばれる微生物にポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から、少なくとも（R) _3 - ヒド口キシ- 4-メチル吉草酸単位を含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法。

請求項 7

前記前駆物質が、 4-メチル吉草酸、 4-メチルペンテン酸又はこれらの混合物から選ばれる、請求項 6記載の製造法。

請求項 8

前記前駆物質が 0. 1〜5.0 g/Lの濃度で添加される、請求項 6又は 7記載の製造法。

請求項 9

前記ポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子が、シユードモナス · エスピー (Pseudomonas sp. ) 6卜 3株、シユードモナス · スッッッエリ (Pseudomonas stutzer i) 、 A33、ァロクロマティゥム ' ピノサム (Allochromatium vinosum) 、バシルス ' メガテリゥム（ Bac i 1 lus megater ium) 、ノシ Jレス . セレウス (Bac i 1 lus cereus) 、バシルス ' エスピー (Bacillus sp. ) INT005, ランプ口システィス · ロゼオペルシシナ ( Lamprocys t i s roseopers ic ina) 、ノカルディア · コラリナ（ Nocardia coral 1 ina) 、口ドノクタ一 · シヤエロイデス (R odobactor shaeroides) 、ラルストニア ' ュ一トロファ（ Ralstonnia eutropha) 、ロドコッカス ' エスピー ( hodococc us sp. ) NCIMB 40126、チォカプサ，フエニギー (T iocapsa pfenn igi i) 、ァエロモナス ' キヤビエ (Aeromonas caviae) 、及びァェロモナス · ハイドロフイラ（ Aeromonas ydrophila) から選ばれる微生物に由来する、請求項 6〜 8のいずれか 1項記載の製造法。請求項 1 0

前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、シユードモナス · エスピー (Pseudomonas sp. ) 6卜 3株（DDBJァクセション番号： AB014758) 、又はァエロモナス，キヤビエ (Aeromonas caviae) (GenBankァクセシヨン番号： D88825) に由来する、請求項 9記載の製造法。

請求項 1 1

前記ポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素遺伝子が、ァエロモナス

' キヤビエ ( Ae romonas c av i ae) ( GenB ankァクセシヨン番号： D88 825) 由来のポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素の 149番のァスパラギンがセリンにかつ 17 1番のァスパラギン酸がグリシンに置換されたポリヒドロキシアル力ン酸重合酵素変異体をコードするものである、請求項 1 0記載の製造法。

請求項 1 2

前記炭素源が単糖類である、請求項 6〜 1 1のいずれか 1項記載の製造法。

請求項 1 3

前記単糖類がフルクトースである、請求項 1 2記載の製造法。請求項 1 4

請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体を含む成形体。

請求項 1 5

フィルムである、請求項 1 4記載の成形体。