WO2009122667A1 - 肝癌治療剤 - Google Patents

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WO2009122667A1
WO2009122667A1 PCT/JP2009/001249 JP2009001249W WO2009122667A1 WO 2009122667 A1 WO2009122667 A1 WO 2009122667A1 JP 2009001249 W JP2009001249 W JP 2009001249W WO 2009122667 A1 WO2009122667 A1 WO 2009122667A1
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木下恭子
杉本正道
石黒敬弘
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中外製薬株式会社
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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to the field of a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer, or a therapeutic method using the pharmaceutical composition, which is a combination of a chemotherapeutic agent and an anti-glypican 3 antibody effective for treating liver cancer.
  • Non-Patent Document 1 Death due to hepatocellular carcinoma is equivalent to 600,000 throughout the year, and is said to be the fifth among deaths from cancer worldwide.
  • Most hepatocellular carcinomas die within one year after diagnosis of the disease.
  • hepatocellular carcinoma is often diagnosed at a late stage where curable therapies are less successful.
  • the effectiveness of medical procedures, including chemotherapy, chemoembolization, ablation and proton beam therapy for these patients remains inadequate.
  • Many patients show disease recurrence, which progresses rapidly to an advanced stage with vascular invasion and multi-site intrahepatic metastasis, and its 5-year survival rate is only 7% (Non-Patent Document 2).
  • Non-patent Document 3 There is a need in the art for new therapies for such malignant hepatocellular carcinoma.
  • Hepatocellular carcinoma is said to account for over 90% of primary liver cancer in Japan.
  • a chemotherapeutic agent is used to inject a mixture of oil-based contrast agent (lipiodol), anticancer agent, and embolic material (Zelfoam) into the hepatic artery, which is the route of nutrient supply to the tumor.
  • TAE hepatic artery embolization therapy
  • TAE hepatic artery embolization therapy
  • Non-patent Document 4 As chemotherapeutic agents, 5-FU (fluorouracil), UFT (uracil and tegafur), MMC (mitomycin C), DHAD (mitoxantrone), ADR (adriamycin), EPI (epirubicin), CDDP (cisplatin), etc.
  • IFN interferon
  • Non-patent Document 5 the standard therapy for liver cancer has not been established.
  • epithelial factor receptor / human epithelial factor receptor 1 (EGFR / HER1) is expressed in an active form in human hepatoma cells.
  • Erlotinib an inhibitor for epidermal factor receptor / human epithelial factor receptor 1, and lapatinib, a dual tyrosine kinase inhibitor for epithelial factor receptor / human epithelial factor receptor 1 and ErbB-2 (Her2 / neu) It was examined in a phase II clinical trial for patients with liver cancer.
  • the response rate of patients receiving erlotinib was 4-9%, the progression-free period was 2.1 to 3.2 months, and the survival rate was 5.8-13 months. On the other hand, the response rate of patients receiving lapatinib was 0%, and progression-free survival was 1.8 months (Non-patent Document 6).
  • orally active sorafenib (Nexavar, BAY 43-9006), which is a kinase inhibitor, blocks the proliferation of cancer cells by inhibiting Raf / MEK / ERK signaling at the Raf kinase stage, and VEGFR- By targeting 2, VEGFR-3 and PDGFR- ⁇ tyrosine kinase, it exerted an anti-angiogenic effect and showed an advantageous effect compared with the above chemotherapeutic agents.
  • the progression-free period was 4.2 to 4.9 months
  • the response rate was 2 to 4%
  • the progression-free survival period was 9.2 to 15 6 months (Non-patent Document 7).
  • sunitinib (SU11248) (non-patent document 8), which is a multikinase inhibitor having an action of inhibiting a plurality of kinases, is used in clinical trials for hepatocellular carcinoma.
  • sunitinib was administered to 34 patients with advanced hepatocytes, partial response was confirmed in 1 patient by week 12, and 17 patients were in a stable state.
  • the median overall survival was 9.8 months, while the median progression-free survival was 3.9 months (95% confidence interval 2.6-6.9), the 3-month progression-free survival rate was 56%, and the 6-month progression-free survival rate was 32%, suggesting that sunitinib has antitumor activity against hepatocellular carcinoma (Zhu A, Sahani D, di Tomaso E et al., 99th AACR annual meeting. San Diego, CA, USA 12-16 April (2008)).
  • hepatic dysfunction associated with the progression of liver cancer loss of appetite, weight loss, general malaise, palpation of right hip mass, right hip pain, abdominal fullness, fever, jaundice, etc. Symptoms are observed.
  • chemotherapeutic agents such as sorafenib and lapatinib can cause diarrhea or constipation, anemia, suppression of the immune system to cause (fatal severe) infection and sepsis, bleeding, cardiotoxicity, hepatotoxicity, nephrotoxicity, appetite It has a problem to be overcome, such as side effects inherent to chemotherapeutic agents such as poorness and weight loss.
  • liver cancer is not initially observed with any special initial symptoms, but with liver cancer progression, liver dysfunction is accompanied, loss of appetite, weight loss, general malaise, right hip mass palpation, right hip pain Symptoms peculiar to liver cancer such as abdominal fullness, fever and jaundice are observed. It is clinically observed that these symptoms are amplified by the use of the chemotherapeutic agents described above. For example, symptoms such as anorexia in a patient in which hepatoma cells are detected and weight loss that accompanies or independently occur are more amplified by administration of a chemotherapeutic agent to the patient compared to non-administration. Sometimes. When such symptoms appear, the use of the chemotherapeutic agent may have to be abandoned, and the amplification of the symptom is a factor that hinders treatment with the chemotherapeutic agent.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is caused by administration of a chemotherapeutic agent such as a kinase inhibitor to a patient in whom symptoms inherent to liver cancer such as weight loss accompanying cancer progression are observed.
  • a chemotherapeutic agent such as a kinase inhibitor
  • Chemotherapeutics such as diarrhea or constipation, anemia, suppression of the immune system to cause infections and sepsis (of fatal severity), bleeding, cardiotoxicity, hepatotoxicity, nephrotoxicity, loss of appetite, weight loss
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for liver cancer that can reduce intrinsic side effects and increase the therapeutic effect on liver cancer.
  • the inventors of the present invention provide a therapeutic antibody that binds to a protein highly expressed in liver cancer cells and has an ability to exert cytotoxic activity on the cells, and a chemotherapeutic agent effective against liver cancer cells. It has been found that by combining with a therapeutic agent for liver cancer contained as an active ingredient, the chemotherapeutic agent has a more effective therapeutic effect than that prescribed alone for liver cancer patients. Moreover, the therapeutic agent of the present invention not only has the above-mentioned effective effects, but also diarrhea or constipation, anemia, (lethal severity) observed when the chemotherapeutic agent is prescribed alone.
  • the present invention is the following invention; [1] A pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer, comprising a combination of a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody, [2] The pharmaceutical composition according to [1], wherein the pharmaceutical composition is a combination drug, [3] The pharmaceutical composition according to [1], wherein a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody are used in combination.
  • the anti-glypican 3 antibody is an antibody capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the anti-glypican 3 antibody is an antibody capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
  • CDR3 comprising CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, and a CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the anti-glypican 3 antibody is capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • the pharmaceutical composition according to any one of [45] to [52] or [54], which is an antibody comprising [56] anti-glypican 3 antibody;
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the pharmaceutical composition according to any one of [45] to [52] or [54], which is an antibody comprising [57] anti-glypican 3 antibody;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, and a CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the anti-glypican 3 antibody is an antibody capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR3 comprising CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • the method according to any one of [63] to [70] or [72], which is an antibody comprising [74] anti-glypican 3 antibody;
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the method according to any one of [63] to [70] or [72], which is an antibody comprising [75] anti-glypican 3 antibody;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, and a CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the method according to
  • the anti-glypican 3 antibody is an antibody capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR3 comprising CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • the method according to any one of [87], [88] and [90], wherein the method comprises an antibody comprising [92] anti-glypican 3 antibody;
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the method according to any one of [87], [88] and [90], wherein the method comprises an antibody comprising [93] anti-glypican 3 antibody;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, and a CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • anti-glypican 3 antibody A heavy chain variable comprising CDR1, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and CDR3 comprising CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the anti-glypican 3 antibody is an antibody capable of binding to an epitope to which the second antibody can bind, wherein the second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 6, and 7, respectively.
  • CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 And a light chain variable region having 3;
  • the method according to any one of [99] to [106] or [108], which is an antibody comprising [110] anti-glypican 3 antibody;
  • a heavy chain variable comprising CDR1, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and variable light chain having CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the method according to any one of [99] to [106] or [108], which is an antibody comprising [111] anti-glypican 3 antibody;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, and a CDR3 comprising CDR2, including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 region;
  • a CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and a light chain variable having CDRs 1, 2 and 3 of CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 region;
  • the method according to
  • FIG. 1 is a graph showing the growth inhibitory effect of hepatoma cells by the combined administration of doxorubicin (DOX) or mitoxantrone (MX) and GC33 antibody.
  • FIG. 2 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sorafenib on a mouse model transplanted with a human liver cancer cell line Huh-7 cell based on changes in tumor volume.
  • FIG. 3 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sorafenib on a mouse model transplanted with a human liver cancer cell line HepG2 cell based on changes in tumor volume.
  • FIG. 1 is a graph showing the growth inhibitory effect of hepatoma cells by the combined administration of doxorubicin (DOX) or mitoxantrone (MX) and GC33 antibody.
  • FIG. 2 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sorafenib on
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of hGC33 antibody and sorafenib on weight loss in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HepG2 cell according to the change in the body weight of the model.
  • FIG. 5 is a graph showing the antitumor effects of pH7pL16 antibody and sorafenib on mouse model transplanted with human hepatoma cell line HepG2 cell based on changes in tumor volume.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of pH7pL16 antibody and sorafenib on body weight loss in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HepG2 cell according to the change in body weight of the model.
  • FIG. 7 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sunitinib on a mouse model transplanted with a human liver cancer cell line HepG2 cell based on changes in tumor volume (mean + standard deviation).
  • FIG. 8 shows the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of a humanized antibody suitably used in the present invention.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequences of CDRs of the heavy chain variable region and the light chain variable region of a humanized antibody preferably used in the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer comprising a combination of a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer comprising a combination of a chemotherapeutic agent and anti-glypican 3 antibody
  • chemotherapeutic agent and anti-glypican 3 antibody means that the chemotherapeutic agent and anti-glypican 3 antibody are separated separately in the treatment or prevention of liver cancer.
  • a pharmaceutical composition combined for sequential administration can be provided in the form of a combination containing both a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody.
  • a drug containing a chemotherapeutic agent and a drug containing glypican 3 antibody may be provided separately and these agents may be used simultaneously, separately or sequentially.
  • you may provide as a kit comprised from the chemical
  • the dosage forms of these drugs may be the same dosage form but different dosage forms. May be.
  • both are parenteral preparations, injections, infusions, intravenous infusions, and may be in different dosage forms
  • you may combine 1 or more types of different formulation with said pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer in combination with a chemotherapeutic agent comprising glypican 3 antibody as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition of the present invention containing the anti-glypican 3 antibody as an active ingredient can be administered simultaneously with the chemotherapeutic agent or before or after the administration of the chemotherapeutic agent.
  • the administration time can be optimized by measuring the residual concentration of the chemotherapeutic agent in the subject.
  • concentration can be determined based on the analysis method well-known by those skilled in the art using various sorters, such as chromatography, about the sample extract
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer in combination with glypican 3 antibody, which comprises a chemotherapeutic agent as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition containing a chemotherapeutic agent as an active ingredient is used in combination with the anti-glypican 3 antibody, it can be administered simultaneously with the anti-glypican 3 antibody, or before or after administration of the anti-glypican 3 antibody.
  • the administration time can be optimized by measuring the residual concentration of anti-glypican 3 antibody in the subject. The concentration can be determined based on an immunoassay method such as ELISA described later, which is known to those skilled in the art, from a sample collected from a subject.
  • chemotherapeutic agents used in the present invention include any chemotherapeutic agent that has been used or suggested to be useful for cancer chemotherapy.
  • Chemotherapeutic agents may be injected locally or administered systemically. Local injection can be performed using methods known to those skilled in the art. For example, in TAE (hepatic artery embolization therapy), a mixture of an oil-based contrast agent (lipiodol), an anticancer agent, and an embolic material (Zelfoam) is injected into the hepatic artery, which is a nutrient supply route to the tumor, and the feeding artery is occluded. Selectively leading to hepatocellular carcinoma necrosis.
  • TAE hepatic artery embolization therapy
  • chemotherapeutic agent having a mechanism of action that inhibits a kinase such as lapatinib is also preferably used as a chemotherapeutic agent in the present invention.
  • sorafenib having a mechanism of action that inhibits kinases is also preferably used as the chemotherapeutic agent of the present invention.
  • administration to a subject with liver cancer results in suppression of the immune system that causes diarrhea or constipation, anemia, (fatally severe) infection or sepsis in the subject.
  • Chemotherapeutic agents that cause side effects inherent to chemotherapeutic agents such as bleeding, cardiotoxicity, hepatotoxicity, nephrotoxicity, loss of appetite, weight loss and the like are preferably used as chemotherapeutic agents in the present invention.
  • Sorafenib (4- [4-[[4-chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl] carbamoylamino] phenoxy] -N-methylpyridine-2-carboxamide) is an orally active low molecular weight having a molecular weight of 464.7.
  • Sorafenib tosylate BAY 43-9006
  • tosylic acid toluenesulfonic acid
  • sunitinib (SU11248), which has been shown to exhibit antitumor activity against hepatocellular carcinoma in clinical trials for hepatocellular carcinoma, can also be appropriately employed as a chemotherapeutic agent used in the present invention.
  • Sorafenib or sunitinib is also preferably used as a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, and phosphate; sulfonic acids such as methanesulfonate, benzenesulfonic acid, and toluenesulfonate.
  • Salt formate, acetate, oxalate, maleate, fumarate, citrate, malate, succinate, malonate, gluconate, mandelate, benzoate, salicylate , Carboxylates such as fluoroacetate, trifluoroacetate, tartrate, propionate, glutarate; alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt, potassium salt, cesium salt, rubidium salt; magnesium salt, calcium Alkaline earth metal salts such as salts; ammonium salts, alkylammonium salts, dialkylammonium salts, trialkylammonium salts, tetraalkylammonium Ammonium salts such salts can be preferably used.
  • BAY 43-9006 which is a tosylic acid (toluenesulfonic acid) salt, is also preferably used.
  • the administration route of the chemotherapeutic agent used in the present invention is preferably used either orally or parenterally, but oral administration is preferably used.
  • the dosage form used for oral administration can be appropriately selected from arbitrary dosage forms such as liquids, powders, granules, tablets, intestinal solvents and capsules.
  • a chemotherapeutic agent having such a dosage form is formulated by methods known to those skilled in the art.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative , Combined with a binder and the like, mixed in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice, and then formulated by a formulation operation such as lyophilization or tableting.
  • the chemotherapeutic agent can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is appropriately selected so that an appropriate dose within the indicated range can be administered.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • Alcohol specifically ethanol, polyalcohol such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 can be used in combination as appropriate.
  • oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffer such as phosphate buffer, sodium acetate buffer, soothing agent such as procaine hydrochloride, stabilizer such as benzyl alcohol, phenol and antioxidant.
  • the therapeutic antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention is an antibody that binds to a protein expressed in liver cancer cells and can exert cytotoxic activity against the cells. Any antibody can be suitably used.
  • a protein suitable as an antibody target molecule is a protein expressed on the cell surface of hepatoma cells. A larger number of molecules expressing the target molecule on the cell surface is preferable for obtaining the effect of antibody treatment, but the effect does not necessarily depend on the number of molecules. That is, it is preferable to select as a target a molecule that is specifically expressed in cancer cells in comparison with the expression in normal cells.
  • An example of such a protein is preferably glypican 3.
  • Glypican 3 is one of the family of heparan sulfate proteoglycans existing on the cell surface, and it has been suggested that it may be involved in cell division in development and proliferation of cancer cells. It is not well understood yet. It has been found that certain antibodies that bind to glypican 3 exert a cell growth inhibitory action by ADCC activity and CDC activity (WO2003 / 000883: Patent Document 1). In addition, it is known that a GC33 antibody that binds to a specific epitope exhibits stronger ADCC activity and CDC activity against liver cancer cells (WO 2006/006693: Patent Document 2). In the therapeutic agent for liver cancer of the present invention, glypican 3 antibody can be preferably used.
  • the GC33 antibody (WO 2006/006693) can be exemplified as such a suitable glypican 3 antibody.
  • the amino acid sequences of the heavy and light chains of the variable region of the GC33 antibody are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the production method of glypican 3 antibody can be obtained from a hybridoma based on a known method (WO2006006693). Further, the anti-glypican 3 antibody can be produced by genetic engineering. That is, it is possible to clone an antibody gene from a hybridoma, incorporate it into an appropriate vector, introduce it into a host, and produce a recombinant antibody produced using genetic recombination technology (for example, Vandamme, AMet al., Eur. J. Biochem. (1990), 192, 76 7-75). Specifically, mRNA encoding the variable (V) region of the anti-glypican 3 antibody is isolated from the hybridoma producing the anti-glypican 3 antibody.
  • V variable
  • the target mRNA can be prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia) or the like.
  • mRNA can be directly prepared from the hybridoma by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • the cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • the synthesis of cDNA can be carried out using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku).
  • 5'-RACE method Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR for cDNA synthesis and amplification. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) etc.
  • the C encoding the V region of the desired anti-glypican 3 antibody is fused in-frame with the DNA encoding the desired antibody constant region (C region). Incorporated into an expression vector comprising the region.
  • a method of incorporating an antibody gene into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region for example, an enhancer or a promoter, can be suitably used.
  • a recombinant cell that expresses DNA encoding glypican 3 antibody is obtained by suitably transforming a host cell using this expression vector.
  • the expression of the antibody gene may be carried out by co-transforming the host cell by separately incorporating DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector, or H chain and L chain.
  • a host cell may be transformed by incorporating a DNA coding for the DNA into a single expression vector (WO1994011523).
  • an antibody gene is once isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody
  • a combination of an appropriate host and an expression vector can be suitably used.
  • animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero, (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) insect cells.
  • mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero
  • amphibian cells such as Xenopus oocytes
  • insect cells for example, sf9, sf21, Tn5 and the like are preferably exemplified.
  • plant cells include cells derived from the genus Nicotiana, for example, Nicotiana tabacum, and these are cultured, for example, by callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces serevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces serevisiae
  • filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • prokaryotic cells production systems using bacterial cells are preferably used.
  • bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • an expression vector containing the target antibody gene is introduced by transformation, and the transformed cells are cultured in vitro to obtain the desired antibody from the transformed cell culture. Can be acquired.
  • an antibody gene can be constructed as a fusion gene by inserting in frame into a gene that encodes a protein (such as goat ⁇ -casein) that is uniquely produced in milk.
  • the DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the injected embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody can be obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones can be used as appropriate in transgenic goats to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • a recombinant antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, or the like can be used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region. Is linked to DNA encoding the constant region of a human antibody and expressed in a suitable host to obtain the chimeric antibody.
  • a suitable example of a humanized antibody is the hGC33 antibody (WO 2006/006693). The H chain and L chain amino acid sequences of the variable region of the hGC33 antibody are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • C region of the chimeric antibody and humanized antibody those of a human antibody can be used.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4 can be used as the H chain
  • C ⁇ , C ⁇ can be used as the L chain.
  • sequences are known.
  • the human antibody C region can be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody is composed of a V region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region (CDR) of a mammal-derived antibody other than a human, a framework region (FR; framework region) derived from a human antibody, and a C region derived from a human antibody. Composed. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful as the active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, which is a non-human mammal, for example, a graft obtained by replacing the CDR of a mouse antibody with the CDR of a human antibody.
  • a reshaped human antibody which is a non-human mammal, for example, a graft obtained by replacing the CDR of a mouse antibody with the CDR of a human antibody.
  • a humanized antibody is produced by inserting the DNA obtained as described above and a DNA encoding the human antibody C region into an expression vector so as to be fused in-frame and expressing it in an appropriate host cell. (See EP239400, WO 96002576).
  • the FR region derived from a human antibody used in the production of a humanized antibody is selected so that the CDR forms a good antigen-binding site when linked via CDR.
  • the human antibody FR can be suitably selected by qualitatively or quantitatively measuring and evaluating the binding activity of the humanized antibody prepared as described above to the antigen. If necessary, FR amino acids in the V region of the antibody can be substituted so that the CDRs of the reshaped human antibody form an appropriate antigen binding site. The above amino acid substitution is easily introduced by a conventional PCR method.
  • a mutant FR sequence having a desired property is selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody substituted with an amino acid (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to thereby have an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (see International Publications WO1993012227, WO199203918, WO19940026025, WO19940340585, WO1996034096, WO19960333735).
  • the V region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the V region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • the scFv DNA sequence that binds to the antigen is determined, and a human antibody is obtained by expressing in a suitable cell a fusion protein in which the V region sequence is fused in-frame with the sequence of the desired human antibody C region.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • the antibody gene can be expressed by functionally binding a commonly used useful promoter, the expressed antibody gene, and a poly A signal downstream thereof 3 '.
  • a promoter / enhancer human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer is preferably mentioned.
  • Other useful promoters / enhancers include viral promoters / enhancers such as retrovirus, polyoma virus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40), or mammalian cell-derived promoters / enhancers such as human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ).
  • An enhancer etc. are mentioned suitably.
  • the gene can be expressed by functionally combining a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • Preferred examples of the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Nature (1989) 341, 544-546; FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427), or when using the araB promoter, the method of Better et al. (Science ( 1988) 240, 1041-1043), the gene is expressed.
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) is used when the antibody is produced in the periplasm of E. coli. obtain. Then, after the antibody produced in the periplasm is separated, the structure of the antibody is refolded so as to have a desired binding activity by using a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride. .
  • an aminoglycoside transferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene or the like can be suitably inserted as a selection marker.
  • any expression system such as a eukaryotic cell or a prokaryotic cell system may be used for the production of the antibody used in the present invention.
  • eukaryotic cells include animal cells such as established mammalian cell lines and insect cell lines, and filamentous fungal cells and yeast cells.
  • Prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells.
  • the antibodies used in the present invention are expressed using mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK, Vero, Hela cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Host cells are cultured according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM are used as the culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by using known methods used in normal protein purification alone or in appropriate combination.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • an antibody having a modified sugar chain can also be suitably used. It is known that the ADCC activity of the antibody described later can be enhanced by modifying the sugar chain of the antibody. That is, when the expression of an antigen to which an antibody binds is not high enough to exert ADCC activity strongly, an antibody with a modified sugar chain can be preferably used.
  • antibodies with modified sugar chains include antibodies modified with glycosylation (such as WO99 / 54342), antibodies lacking fucose added to the sugar chain (such as WO20000061739, WO2002031140), and sugars having bisecting GlcNAc. Antibodies having chains (WO2002079255 and the like) are known.
  • an antibody binds to its target can be suitably evaluated by using a known method.
  • a method for measuring the binding activity of an antibody to cells expressing an antigen see pages 359-420 in Antibodies A Laboratory Manual. (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). The methods described are mentioned. That is, it can be suitably evaluated by the principle of ELISA using cells as an antigen or FACS (fluorescence activated cell sorting). In the ELISA format, the binding activity of an antibody to a cell is quantitatively evaluated by comparing the signal level generated by an enzymatic reaction.
  • a test antibody is added to an ELISA plate on which each forced expression cell is immobilized, and an antibody bound to the cell is detected using an enzyme-labeled second antibody that recognizes the test antibody.
  • the binding activity to cells can be compared by preparing a dilution series of the test antibody and determining the antibody binding titer (titer) for each forcedly expressed cell.
  • the binding between an antigen that is not bound to a carrier such as an ELISA plate and that is expressed on the cell surface suspended in a buffer or the like and an antibody against the antigen is measured.
  • flow cytometers used for measurement in the FACS format include FACSCanto (trademark) II, FACSAria (trademark), FACSArray (trademark), FACSVantage (trademark) SE, FACSCalibur (trademark) (above, BD Biosciences) and EPICS.
  • ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC, Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC (Beckman Coulter).
  • the antigen-expressing cell is reacted with the test antibody, and then the cell is stained with a FITC-labeled secondary antibody that recognizes the test antibody. Thereafter, a method of measuring by FACSCalibur (BD) and analyzing the fluorescence intensity using CELL QUEST Software (BD) can be mentioned. According to this method, by comparing the Geometric Mean value obtained using the test antibody (test Geo-Mean value) with the control Geo-Mean value obtained using the control antibody, Binding activity can be determined. The calculation formula for obtaining the Geo-Mean value (Geometric Mean) is described in CELL QUEST Software User's Guide (BD biosciences).
  • an antibody capable of binding to an epitope to which the GC33 antibody can bind is also preferably used. Whether or not the antibody used in the present invention can bind to the epitope can be tested by the FACS and ELISA described above. Whether the test antibody to be tested binds to the same epitope as that to which the GC33 antibody binds, that is, whether the GC33 antibody shares an epitope with the GC33 antibody, is determined by measuring whether or not both compete with the same epitope. You can investigate. In the present invention, competition between antibodies can be detected by FACS, cross-blocking assay or the like.
  • a GC33 antibody is bound to a GPC3-expressing cell, and a fluorescence signal is measured.
  • the GC33 antibody reacts with the same cells and is similarly analyzed by FACS.
  • the GC33 antibody and the test competitor antibody can be reacted to the same cell at the same time. If the FACS analysis pattern of the GC33 antibody changes in the presence of the competitive antibody, it can be confirmed that the competitive antibody recognizes the same epitope as the GC33 antibody.
  • the cross-blocking assay may be a known method described in, for example, the Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, Harlow and David Lane (1988). It can be adopted as appropriate.
  • the competitive ELISA assay is a preferred cross-blocking assay.
  • cells expressing GPC3 protein are fixed on the wells of a microtiter plate.
  • GC33 antibody is added to the well.
  • the amount of GC33 antibody bound to GPC3 protein-expressing cells in the well is inversely correlated with the binding ability of a candidate competitive antibody (test antibody) that competes for binding to the same epitope. That is, the greater the affinity of the test antibody for the same epitope, the lower the binding amount of the GC33 antibody to the well in which the GPC3 protein-expressing cells are immobilized. Or conversely, the greater the affinity of the test antibody for the same epitope, the greater the amount of binding of the test antibody to the well to which the GPC3 protein-expressing cells are immobilized.
  • the amount of antibody bound to the well can be easily measured by labeling the antibody in advance.
  • biotin-labeled antibodies can be measured by using an avidin peroxidase conjugate and an appropriate substrate.
  • a cross-blocking assay using an enzyme label such as peroxidase is particularly referred to as a competitive ELISA assay.
  • the antibody can be suitably labeled with another labeling substance that can be detected or measured. Specifically, radiolabels or fluorescent labels are known.
  • test antibody has a constant region derived from a species different from the GC33 antibody
  • any antibody bound to the well by using a labeled antibody that specifically recognizes the constant region derived from any species Can be measured.
  • antibodies bound to the wells can be suitably measured by antibodies that specifically identify each class.
  • the binding of the GC33 antibody is at least 20%, preferably at least 20-50%, more preferably at least 50%, compared to the binding activity obtained in a control test performed in the absence of the candidate competing antibody.
  • the candidate competitive antibody is an antibody that binds to substantially the same epitope as the GC33 antibody or competes for binding to the same epitope.
  • CDR1, comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9 to 23, CDR2, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and CDR1, CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25
  • An antibody comprising, or A CDR comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in S
  • the antibody used in the present invention has cytotoxic activity.
  • Cytotoxic activity refers to the activity of an antibody to damage target cells expressing the corresponding antigen.
  • the antigen is an antigen that does not internalize in the cell due to the nature of the antigen-antibody complex formed between the antigen and the antibody
  • the antibody-dependent cytotoxic activity Preferred examples include Antibody-dependent cellular cytotoxicity (hereinafter referred to as “ADCC activity”) or complement-dependent cytotoxic activity (Complement-dependent cellular cytotoxicity; hereinafter referred to as “CDC activity”).
  • the antigen is an antigen that is formed by the nature of the antigen-antibody complex between the antigen and the antibody
  • the antibody is a chemotherapeutic agent, radioisotope, or toxicity.
  • a conjugated antibody to which a substance is bound is preferably used.
  • the cytotoxic activity exhibited by the antibody is the cytotoxic activity exhibited by the chemotherapeutic agent, radioisotope, or toxic substance bound to the conjugated antibody.
  • ADCC activity or CDC activity can be appropriately measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • effector cells are prepared according to the following procedure.
  • Spleens are excised from CBA / N mice and the like, and spleen cells are isolated in RPMI1640 medium (Invitrogen). After washing with the same medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone), effector cells can be prepared by adjusting the cell concentration to 5 ⁇ 10 6 / ml.
  • FBS fetal bovine serum
  • CEDARLANE Preparation of complement solution Baby Rabbit Complement
  • CEDARLANE can be diluted 10-fold in a medium containing 10% FBS (Invitrogen) to prepare a complement solution.
  • Target cells were cultured with 0.2 mCi of 51Cr-sodium chromate (GE Healthcare Bioscience) in 10% FBS-containing DMEM medium at 37 ° C for 1 hour.
  • Target cells can be radiolabeled.
  • cells expressing the antigen cells transformed with a gene encoding the antigen, primary hepatocellular carcinoma, metastatic hepatocellular carcinoma and the like can be suitably used.
  • target cells are prepared by washing the cells three times with 10% FBS-containing RPMI 1640 medium and adjusting the cell concentration to 2 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • ADCC activity or CDC activity can be measured by the method described below.
  • target cells and the antibody according to the present invention are added to a 96-well U-bottom plate (Becton Dickinson) in an amount of 50 ⁇ l per well and reacted on ice for 15 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of effector cells are added per well. Plates are incubated for 4 hours in a carbon dioxide incubator. The final concentration of the antibody is set to 0 or 10 ⁇ g / ml, and is adjusted as appropriate based on the activity of the antibody.
  • A is the radioactivity (cpm) in each sample
  • B is the radioactivity (cpm) in the sample with 1% NP-40 (nacalai tesque) added
  • C is the radioactivity of the sample containing only the target cells (Cpm).
  • target cells and 50 ⁇ l of the antibody of the present invention are added to a 96-well flat bottom plate (Becton Dickinson) at a rate of 50 ⁇ l per well and reacted on ice for 15 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of complement solution is added per well. The plate is incubated for 4 hours in a carbon dioxide incubator, and is appropriately adjusted based on the activity of the antibody. The final concentration of the antibody is set to 0 or 3 ⁇ g / ml, and is adjusted as appropriate according to the activity of the antibody. After the incubation, 100 ⁇ l of supernatant is collected per well, and the radioactivity is measured by a gamma counter. Cytotoxic activity can be calculated similar to the method used to measure ADCC activity.
  • the cytotoxic activity exhibited by the antibody conjugate can be suitably evaluated by measuring the cytotoxic activity exhibited by the chemotherapeutic agent, radioisotope, or toxic substance bound to the antibody conjugate.
  • a 96-well flat-bottom plate (Becton Dickinson) is placed on the target cell and the present invention.
  • the antibody conjugate is added in an amount of 50 ⁇ l per well and reacted on ice for 15 minutes. The plate is then incubated for 1 to 4 hours in a carbon dioxide incubator.
  • the final concentration of the antibody is set to 0 or 3 ⁇ g / ml, and is adjusted as appropriate based on the activity of the antibody conjugate. After incubation, 100 ⁇ l of the supernatant is collected and the radioactivity is measured with a gamma counter. Cytotoxic activity can be calculated similar to the method used to measure ADCC activity.
  • a preferable chemotherapeutic agent is a low-molecular chemotherapeutic agent.
  • Small molecule chemotherapeutic agents are less likely to interfere with antibody function after binding to the antibody.
  • the low molecular weight chemotherapeutic agent usually has a molecular weight of 100 to 2000, preferably 200 to 1000.
  • the chemotherapeutic agents exemplified here are all low-molecular chemotherapeutic agents.
  • These chemotherapeutic agents in the present invention include prodrugs that are converted into chemotherapeutic agents that are active in vivo. Prodrugs can be suitably activated by both enzymatic and non-enzymatic conversion.
  • ricin abrin, ribonuclease, onconase, DNase I, Staphylococcal enterotoxin-A, pokeweed antiviral protein, gelonin, diphtheria toxin, Pseudomonas exotoxin, Pseudomonas endotoxin
  • a toxic peptide such as L-asparaginase or PEG L-asparaginase.
  • one or more small molecule chemotherapeutic agents and toxic peptides can be used in combination to modify the antibody, respectively.
  • a covalent bond or a non-covalent bond can be suitably used for the binding between the antibody according to the present invention and the above-described small molecule chemotherapeutic agent. Methods for producing antibodies bound with these chemotherapeutic agents are known.
  • proteinaceous drugs and toxins can be suitably bound to antibodies by genetic engineering techniques.
  • the DNA encoding the above toxic peptide and the DNA encoding the antibody according to the present invention are fused in frame, and expressed in an appropriate host cell, whereby the toxic peptide is bound.
  • An antibody is suitably obtained as a fusion protein.
  • a proteinaceous drug or toxin is generally arranged on the C-terminal side of the antibody.
  • a peptide linker can be suitably interposed between the antibody and the proteinaceous drug or toxin.
  • compositions for treating or preventing liver cancer which is a combination of a chemotherapeutic agent and an anti-glypican 3 antibody, which is effective for treating liver cancer, or a therapeutic method using the pharmaceutical composition.
  • the use of the anti-glypican 3 antibody enhances the therapeutic effect of the chemotherapeutic agent in treating liver cancer patients with the chemotherapeutic agent, and is attributed to the chemotherapeutic agent.
  • a method is provided that makes it possible to reduce side effects.
  • the enhancement of the therapeutic effect means that the response rate of the treatment increases, the amount of the chemotherapeutic agent administered for the treatment decreases, and / or the treatment period by the chemotherapeutic agent is shortened.
  • a method of using glypican 3 antibody for producing a pharmaceutical composition for treating or preventing liver cancer comprising a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody as active ingredients.
  • the present invention provides a method for treating or preventing liver cancer patients, characterized by using a chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody.
  • the phrase “containing a chemotherapeutic agent and / or glypican 3 antibody as an active ingredient” means that a chemotherapeutic agent and / or glypican 3 antibody is included as a main active ingredient, and the chemotherapeutic agent and / or glypican. It does not limit the content of 3 antibodies.
  • treatment means that administration of the pharmaceutical composition according to the present invention to a subject causes death or decrease in the number of liver cancer cells, suppression of proliferation of liver cancer cells, It means that various symptoms are improved.
  • prevention means that the decreased number of hepatoma cells is proliferated again to prevent the number from increasing, and the proliferation of liver cancer cells whose proliferation is suppressed is prevented from reproliferating.
  • the administration method of the therapeutic antibody according to the present invention can be carried out either orally or parenterally. Particularly preferred is a parenteral administration method, and specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration the therapeutic antibody of the present invention can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose for example, the dose can be selected in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight per administration. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the therapeutic antibody of the present invention is not limited to these doses.
  • the combined use of the chemotherapeutic agent and the anti-glypican 3 antibody in the present invention means that the chemotherapeutic agent and the anti-glypican 3 antibody are administered or used together (hereinafter simply referred to as “administration”). Therefore, the order of administration, the administration interval, etc. are not construed as being limited. It can also be used as a kit in which the chemotherapeutic agent of the present invention and the anti-glypican 3 antibody are combined. Furthermore, when a chemotherapeutic agent and anti-glypican 3 antibody are used in accordance with the present invention, each can be administered at a lower dose, if desired, than either one used alone.
  • the order of administration of the chemotherapeutic agent according to the present invention and the anti-glypican 3 antibody is such that the chemotherapeutic agent can be administered after the administration of the anti-glypican 3 antibody, the chemotherapeutic agent and the anti-glypican 3 antibody can be administered simultaneously, Glypican 3 antibody can be administered after administration of the therapeutic agent.
  • the administration interval between the chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody is not particularly limited, and is set in consideration of factors such as the administration route and dosage form. obtain. For example, it is 0 to 168 hours, preferably 0 to 72 hours, preferably 0 to 24 hours, and more preferably 0 to 12 hours.
  • the residual concentrations of the chemotherapeutic agent and glypican 3 antibody according to the present invention in the subject can also be taken into consideration.
  • the glypican is detected when the residual concentration of the chemotherapeutic agent in the subject is detected so that the desired effect of the anti-glypican 3 antibody is obtained.
  • Three antibodies can be administered.
  • concentration can be determined based on the result of having analyzed the sample extract
  • the anti-glypican 3 antibody when administered before administration of the chemotherapeutic agent, the residual concentration of the anti-glypican 3 antibody in the subject is detected so that the desired effect of the chemotherapeutic agent is obtained.
  • a chemotherapeutic agent can be administered.
  • concentration can be determined based on the result of having analyzed the sample extract
  • the therapeutic antibody of the present invention is formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, USA) and may contain both pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • pharmaceutically acceptable carriers for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • Preferable examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • Example 1 Effect of combined use of anti-glypican 3 antibody and chemotherapeutic agent (mitoxantrone or doxorubicin hydrochloride) on mouse model transplanted with human liver cancer cell line expressing glypican 3 (1) cell line HuH-7 as human hepatoma cell line expressing glypican 3 Cells (Human Science Research Resource Bank) and HepG2 cells (ATCC) were used.
  • chemotherapeutic agent mitoxantrone or doxorubicin hydrochloride
  • HuH-7 cells are in Dulbecco's Modifid Eagle's Medium medium (SIGMA) containing 10% FBS (BIONET), HepG2 cells are 10% FBS, 1 mmol / l MEM Sodium Pyruvate (Invitrogen), 1 mmol / l MEM Non-Essential Each was maintained and passaged in Minimum Essential Medium Eagle Medium (SIGMA) containing Amino Acid (Invitrogen).
  • Mouse anti-human glypican 3 monoclonal antibody (clone name: described in GC33, WO2006006693) is 0.5 mg / ml (5 mg / kg administration group) using PBS (-) And 0.1 mg / ml (1 mg / kg administration group).
  • Doxorubicin hydrochloride (adriacin injection, Kyowa Hakko) was dissolved in distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical) to a concentration of 10 mg / ml, and then adjusted to a concentration of 0.5 mg / ml using PBS (-). Diluted.
  • Mitoxantrone hydrochloride Novantrone injection, Wyeth was dissolved in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to 10 mg / ml, and then diluted to 0.1 mg / ml with PBS ( ⁇ ).
  • the HuH-7 cell xenograft model is from 11th day after transplantation
  • the HepG2 cell xenograft model is from 20th day after transplantation.
  • the antibody sample prepared in (3) above was administered from the tail vein at a dose of 10 ml / kg once a week for 3 weeks.
  • filter sterilized PBS (-) (Vehicle) was similarly administered from the tail vein at a dose of 10 ml / kg once a week for 3 weeks.
  • FIG. 1A is a graph showing changes in tumor volume when a GC33 antibody and doxorubicin (DOX) are administered in combination in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HuH-7 cell line.
  • the rhombus shows the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered. Circles indicate the change in tumor volume of the group to which only the GC33 antibody was administered.
  • the triangle shows the change in tumor volume of the group that received only doxorubicin (DOX).
  • the cross shows the transition of the tumor volume of the group to which the GC33 antibody and doxorubicin (DOX) were administered in combination.
  • FIG. 1A is a graph showing changes in tumor volume when a GC33 antibody and doxorubicin (DOX) are administered in combination in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HuH-7 cell line.
  • the rhombus shows the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered. Circle
  • 1B is a graph showing changes in tumor volume when a GC33 antibody and mitoxantrone (MX) are administered in combination in a mouse model transplanted with a HepG2 cell line.
  • the rhombus shows the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered. Circles indicate the change in tumor volume of the group to which only the GC33 antibody was administered. The triangle shows the change in the tumor volume of the group to which only mitoxantrone (MX) was administered.
  • the cross shows the transition of the tumor volume of the group to which the GC33 antibody and mitoxantrone (MX) were administered in combination.
  • the tumor growth in the combination administration group of GC33 and doxorubicin (DOX, FIG. 1A) or mitoxantrone (MX, FIG. 1B) is significant as compared with the tumor growth in the GC33 single administration group. Was observed to be suppressed.
  • Example 2 Combined effect of humanized anti-glypican 3 antibody and chemotherapeutic agent (sorafenib) on human liver cancer cell line transplant mouse model expressing glypican 3
  • Male CB-17 SCID mice aged 6 weeks were purchased from CLEA Japan Inc.
  • 200 ⁇ g of anti-asialo GM1 antibody (WAKO) was intraperitoneally administered immediately before tumor implantation, and then 5 ⁇ 10 5 HepG2 cells or HuH-7 cells were dispersed in 50% Matrigel (Becton Dickinson) It was implanted subcutaneously.
  • the tumor volume reached 250 mm 3
  • the mice were grouped and administration was started.
  • a humanized anti-glypican 3 antibody prepared to an appropriate concentration in PBS ( ⁇ ) was intravenously administered once a week for 3 weeks.
  • Sorafenib is synthesized according to the method described in Organic Process Research & Development (2002) 6, 777-781, suspended in pure water containing 10% ethanol and 10% Cremophor EL, 5 times a week for 3 weeks Orally administered.
  • As vehicle control pure water containing PBS (-) and 10% ethanol, 10% Cremophor EL was used.
  • Tumor volume V (mm3) was calculated by the calculation formula described in Example 1. The results are shown in Fig. 2-4.
  • FIG. 2 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sorafenib on a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line Huh-7 cell based on changes in tumor volume (mean + standard deviation).
  • White circles indicate the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered.
  • the black circles indicate the change in tumor volume of the group in which only hGC33 antibody was administered at a dose of 5 mg / kg.
  • the white squares show the change in tumor volume of the group in which only sorafenib was administered at a dose of 80 mg / kg.
  • FIG. 3 is a graph showing the antitumor effects of hGC33 antibody and sorafenib on a mouse model transplanted with a human liver cancer cell line HepG2 cell based on changes in tumor volume (mean + standard deviation).
  • White circles indicate the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered.
  • the black circles indicate the change in tumor volume of the group in which only hGC33 antibody was administered at a dose of 1 mg / kg.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of hGC33 antibody and sorafenib on weight loss in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HepG2 cell by the change in the body weight (mean ⁇ standard deviation) of the model.
  • White circles indicate the change in body weight of the group to which the vehicle was administered.
  • the black circles show the change in body weight of the group in which only hGC33 antibody was administered at a dose of 5 mg / kg.
  • the white squares show the change in body weight of the group in which only sorafenib was administered at a dose of 80 mg / kg.
  • the black squares show the change in body weight of the group in which hGC33 antibody and sorafenib were administered in combination at doses of 5 mg / kg and 80 mg / kg, respectively.
  • the star in the figure indicates that the P value is P ⁇ 0.05 based on Dunnett's test.
  • Tumor growth expressed as tumor volume on the last day of measurement (ie, at time of day 42) in the group administered with the combination of 1 mg / kg of humanized GC33 and 80 mg / kg, the maximum tolerated dose of sorafenib, for the HepG2 xenograft model The inhibitory effect was significantly stronger than that in the group where each was administered alone. In this model, weight loss accompanying tumor growth was observed, but it was observed that administration of sorafenib alone increased this weight loss.
  • sorafenib and humanized GC33 not only increased the efficacy but also significantly reduced body weight loss compared to the sorafenib alone group (especially at the time of day 39 and 42) (FIG. 3)).
  • Reference Example 3 (1) Production of Point Mutation Gene of Humanized H0L0 Antibody Various point mutation genes were prepared using a gene encoding glypican 3 antibody containing CDR of humanized H0L0 antibody as a starting material. Oligo DNAs designed based on the normal and reverse strand sequences including the modification sites were synthesized. A plurality of point mutation genes were prepared using a commercially available QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). The point mutation gene was prepared by PCR according to the following conditions.
  • the point mutation gene confirmed to have been introduced with the point mutation is contained in an expression vector that enables expression of the inserted gene in animal cells. Cloned.
  • the modified gene was obtained by modification having the following constitution.
  • Transient expression of the humanized H0L0 antibody and its point mutation modified antibody was performed by transient expression using Polyethyleneimine (Polysciences Inc.).
  • HEK293 cells exfoliated with Trypsin EDTA (Invitrogen) were seeded in a 10 cm 2 culture dish at 6 ⁇ 10 6 cells / 10 mL.
  • the SFMII medium and Polyetyleneimine were mixed with the H chain expression plasmid DNA and the L chain expression plasmid DNA according to the procedure manual, and then the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The total amount of the mixture was dropped onto a culture dish in which HEK293 cells were seeded as described above.
  • the purified humanized H0L0 antibody and its point mutation-modified antibody were purified from the culture supernatant collected about 72 hours later using rProtein Asepharose TM Fast Flow (GE Healthcare) according to the procedure manual.
  • Tm The thermal denaturation intermediate temperature (Tm) is the denaturation in the thermogram (Cp vs. T) obtained after heating the test sample solution at a constant programmed heating rate. It is grasped as the peak apex.
  • the Tm value of the humanized H0L0 antibody was measured by preparing a sample solution for DSC measurement as follows. First, a 20 mol / l sodium acetate buffer solution (pH 6.0) containing 150 mmol / l sodium chloride is applied to the dialysis membrane, and an antibody solution equivalent to 50-100 ⁇ g enclosed in a dialysis membrane During dialysis. Thereafter, a sample solution prepared using an external solution for dialysis so that the antibody concentration was 50-100 ⁇ g / ml was used as a sample solution for DSC measurement.
  • a suitable DSC device such as DSC-II (Calorimetry Sciences Corporation), is preferably used for this experiment.
  • DSC-II Calorimetry Sciences Corporation
  • each test sample was enclosed in a calorimeter cell and heat-equilibrium was performed at 40 ° C.
  • a DSC scan was then performed from 40 ° C. to 100 ° C. at a scan rate of about 1 K / min.
  • the result of the measurement is expressed as the apex of the denaturing peak as a function of temperature.
  • Fab domain peak assignment was performed with reference to non-patent literature (Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), 47-52), and the heat denaturation intermediate temperature of the humanized H0L0 antibody was calculated.
  • the humanized H0L0 antibody consisting of the H chain represented by SEQ ID NO: 3 and the L chain represented by SEQ ID NO: 4 based on the calculation by the method described above has a Tm value of 76.6 ° C.
  • the Tm values for the exemplified Synagis and Herceptin are measured as 85.4 ° C and 81.8 ° C, respectively. Therefore, it was shown that the Tm value of the humanized H0L0 antibody is lower than that of the existing antibody.
  • a modified antibody of humanized H0L0 antibody was prepared.
  • H15 obtained by modifying V37I, A40P, M48I, and L51I, which modifies the VH1b subclass into the VH4 subclass, to FR2 of the H chain of the humanized H0L0 antibody represented by SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 34) was made. Its Tm value was improved to 79.1 ° C.
  • the pI value of each antibody was calculated based on analysis by isoelectric focusing.
  • the electrophoresis was performed as follows. Phast-Gel Dry IEF (AmerchamBioscience) gel was swollen for about 60 minutes by a swelling liquid having the following composition using Phastsystem Cassette (AmerchamBioscience).
  • the gel was fixed with 20% TCA, and then silver staining was performed using Silver staining Kit, protein (AmerchamBioscience) according to the procedure attached to the kit. After staining, the isoelectric point of each antibody as a test sample was calculated based on the known isoelectric point of the pI marker.
  • Hspd1.8 (Hd1.8) (SEQ ID NO: 27) was prepared by further modifying K19T, Q43E, K63S, K65Q, and G66D on H15.
  • L4 was modified to Q27E, KISRVE, FR3 79-84 sequence comprising L4 was modified to TISSLQ, and S25A modified Lspd1.6 (Ld1.6) (SEQ ID NO: 29) It was made.
  • the pI value of Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) which is an antibody consisting of Hspd1.8 (Hd1.8) and Lspd1.6 (Ld1.6) was measured to be 7.4. Since the pI value of the humanized H0L0 antibody was 8.9, the pI value of the Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) antibody was decreased by 1.5.
  • the plate on which the soluble GPC3 core polypeptide was immobilized and blocked was then washed three times with wash buffer using Skan WASHER400. Thereafter, 200 ⁇ l of a mixed solution in which 100 ⁇ l each of humanized H0L0 antibody having various concentrations or its point mutation modified antibody and biotinylated humanized H0L0 antibody having a final concentration of 0.3 ⁇ g / ml was mixed was added per well of the plate. Biotinylation of the humanized H0L0 antibody was performed using a Biotin Labeling kit (Roche) according to the kit instructions. The plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then washed 5 times with a washing buffer using Skan WASHER400 (Molecular Devices).
  • Skan WASHER400 Molecular Devices
  • the plate containing 100 ⁇ l of Goat anti streptabidin Alkaline phosphatase (ZYMED) diluted 20,000 times with the substrate buffer per well was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then washed with Skan WASHER400. Washed 5 times.
  • Phosphatase Substrate (Sigma) was prepared to 1 mg / ml using a substrate buffer, and 100 ⁇ l per well was added and allowed to stand for 1 hour. Using Benchmark Plus (BIO-RAD), the absorbance at 405 nm of the reaction solution in each well was measured using a control absorbance of 655 nm.
  • the modified site was prepared by performing Assemble PCR using PCR. Oligo DNAs designed based on the normal and reverse strand sequences including the modification sites were synthesized. Reverse-chain oligo DNA containing a modified site and a normal-chain oligo DNA of a vector into which a gene to be modified is inserted, a normal-chain oligo DNA containing a modified site and a reverse-chain oligo DNA of a vector into which a gene to be modified is inserted By performing PCR using PrimeSTAR (TAKARA) for each combination, two fragments containing the modified site, 5 terminal side and 3 terminal side, were prepared. Each mutant was made by joining the two fragments together by Assemble PCR.
  • TAKARA PrimeSTAR
  • the produced mutant was inserted into an expression vector that enables expression of the inserted gene in animal cells, and the base sequence of the obtained expression vector was determined by a method known to those skilled in the art. Based on the determination of the nucleotide sequence of the plasmid DNA, the point mutation gene confirmed to have been introduced with the point mutation was cloned into an expression vector that enables expression of the inserted gene in animal cells. Methods such as antibody expression and purification were performed using the method described in Example 1 or a method analogous thereto.
  • PH7 (sequence) in which the 61st glutamine (Q) based on the kabat numbering present in CDR2 of Hspd1.8 (Hd1.8) was replaced with glutamic acid (E) using Hspd1.8 (Hd1.8) as the starting material No. 31) was produced.
  • the 24th arginine (R) is glutamine (Q)
  • the 37th glutamine (Q) present in FR2 and FR3 is leucine.
  • L 43rd alanine (A) is serine (S), 45th arginine (R) is glutamine (Q), 74th threonine (T) is lysine (K), 77th serine (S) PL14 with arginine (R), 78th leucine (L) with valine (V), and 79th glutamine (Q) with glutamic acid (E), and the kabat numbering present in FR4 of pL14 PL16 (SEQ ID NO: 33) in which the 104th leucine (L) was substituted with valine (V) and the 107th lysine (K) with glutamic acid (E) was prepared.
  • Tm value of point mutation pI modified antibody The Tm value of Fab obtained from the Hd1.8Ld1.6 antibody and the pH7pL16 antibody is VP-DSC (Micro Cal) according to the method described in Reference Example 3. Was measured. At this time, PBS was used as an external solution for dialysis. Moreover, the antibody concentration was adjusted to 25-100 ⁇ g / ml as a sample solution for DSC measurement. The reference solution (external dialysis solution) and the sample solution for DSC measurement were measured by DSC scanning set to a scanning speed of about 4 K / min at 20 ° C. to 115 ° C. The Fab heat denaturation intermediate temperatures of the Hd1.8Ld1.6 antibody and the pH7pL16 antibody were measured as 77.5 and 74.7 ° C., respectively.
  • Example 5 Combination test of humanized anti-glypican 3 antibody and chemotherapeutic agent (sorafenib) against mouse model transplanted with human liver cancer cell line expressing glypican 3 6-week-old male CB-17 SCID mice are purchased from CLEA Japan Inc. It was done. Mice were intraperitoneally administered with 200 ⁇ g of anti-asialo GM1 antibody (WAKO) immediately before tumor implantation, and then subcutaneously transplanted with 5 ⁇ 10 5 HepG2 cells dispersed in 50% Matrigel (Becton Dickinson). When the tumor volume reached 250 mm 3 , the mice were grouped and administration was started.
  • chemotherapeutic agent chemotherapeutic agent
  • the pH7pL16 antibody which was adjusted to an appropriate concentration with PBS ( ⁇ ), was intravenously administered once a week for 3 weeks.
  • Sorafenib is synthesized according to the method described in Organic Process Research & Development (2002) 6, 777-781, suspended in pure water containing 10% ethanol and 10% Cremophor EL, 5 times a week for 3 weeks Orally administered.
  • As vehicle control pure water containing PBS ( ⁇ ) and 10% ethanol, 10% CremophorEL was used.
  • Tumor volume V (mm 3 ) was calculated by the calculation formula described in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of pH7pL16 antibody and sorafenib on body weight loss in a mouse model transplanted with a human hepatoma cell line HepG2 cell, by the change in body weight (mean ⁇ standard deviation) of the model.
  • White circles indicate the change in body weight of the group to which the vehicle was administered.
  • the black circle shows the change in body weight of the group in which only pH7pL16 antibody was administered at a dose of 1 mg / kg.
  • the white squares show the change in body weight of the group in which only sorafenib was administered at a dose of 80 mg / kg.
  • the black squares show the changes in body weight of the groups in which pH7pL16 antibody and sorafenib were administered in combination at doses of 1 mg / kg and 80 mg / kg, respectively.
  • the star in the figure indicates that the P value is P ⁇ 0.05 based on Dunnett's test.
  • Example 6 Combination test of humanized anti-glypican 3 antibody and chemotherapeutic agent (sunitinib) against human liver cancer cell line transplant mouse model expressing glypican 3 6-week-old male CB-17 SCID mice purchased from CLEA Japan Inc. It was done. Mice were intraperitoneally administered with 200 ⁇ g of anti-asialo GM1 antibody (WAKO) immediately before tumor implantation, and then subcutaneously transplanted with 5 ⁇ 10 5 HepG2 cells dispersed in 50% Matrigel (Becton Dickinson). When the tumor volume reached 250 mm 3 , the mice were grouped and administration was started.
  • chemotherapeutic agent unitinib
  • Humanized anti-glypican 3 antibody (hGC33, WO2006006693) adjusted to an appropriate concentration with PBS ( ⁇ ) was intravenously administered once a week for 3 weeks.
  • Sunitinib purchased from Sequoia Research Products (catalog number: SRP01785S) was suspended in pure water containing 10% ethanol and 10% Cremophor EL and orally administered 5 times a week for 3 weeks.
  • As vehicle control pure water containing PBS ( ⁇ ) and 10% ethanol, 10% CremophorEL was used.
  • Tumor volume V (mm 3 ) was calculated by the calculation formula described in Example 1.
  • FIG. 7 shows hGC33 antibody and sunitinib against mouse model transplanted with human liver cancer cell line HepG2 cell Is a graph showing the anti-tumor effect of the tumor based on the change in the tumor volume (mean + standard deviation).
  • White circles indicate the change in tumor volume of the group to which the vehicle was administered.
  • the black circles indicate the change in tumor volume of the group in which only hGC33 antibody was administered at a dose of 1 mg / kg.
  • White squares indicate the change in tumor volume of the group in which only sunitinib was administered at a dose of 80 mg / kg.
  • the black squares show the change in tumor volume of the group in which hGC33 antibody and sunitinib were administered in combination at doses of 1 mg / kg and 80 mg / kg, respectively.
  • the star in the figure indicates that the P value is P ⁇ 0.05 based on Dunnett's test.
  • the HepG2 xenograft model As a result, for the HepG2 xenograft model, it was expressed as the tumor volume on the last day of measurement (ie, at the time of day 53) in the group administered with 1 mg / kg of hGC33 antibody and 80 mg / kg, the maximum tolerated dose of sunitinib. The tumor growth inhibitory effect was significantly stronger than that in the group where each was administered alone (FIG. 7).
  • the present invention provides a therapeutic agent, a therapeutic method, a method of manufacturing a therapeutic agent, and a method of using the therapeutic agent, which are used in the medical industry, the pharmaceutical industry, etc. to treat a patient suffering from liver cancer.

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Abstract

　肝細胞癌を治療または予防するための新規医薬組成物および治療方法を提供する。化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物が開示される。また、グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物、ならびに化学療法剤を有効成分として含む、グリピカン３抗体と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物も開示される。化学療法剤とグリピカン３抗体との併用により、化学療法剤が単独で処方されるよりも有効な治療効果を奏し、化学療法剤による肝癌治療の結果生じる副作用を低減させることができる。  

Description

肝癌治療剤
関連する出願
　本出願は，日本特許出願２００８－９８３０９（２００８年４月４日出願）および国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／００２６９０（２００８年９月２６日出願）に基づく優先権を主張しており，これらの内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
　本発明は、肝癌治療に有効な、化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法の分野に関する。
　肝細胞癌に起因する死亡は通年で６０万に相当し、世界の癌による死亡のうちでは五番目に位置するといわれている（非特許文献１）。肝細胞癌の大半はその疾患であるとの診断後１年以内に死亡する。不幸にも、肝細胞癌は治癒可能な療法があまり奏功しない後期ステージで診断される例が頻繁である。こうした患者に対しての化学療法、化学塞栓術、焼灼や陽子ビーム療法を含む医療処置の効果は依然として不十分である。多くの患者が疾患の再発を示し、これは血管浸潤および多部位肝内転移を伴って進行ステージに急速に進行して、その５年生存率は７％に過ぎない（非特許文献２）。局部癌の切除術が可能な肝細胞癌の患者の予後は比較的よいが、その５年生存率は１５％から３９％に留まる（非特許文献３）。当該技術分野においては、このような悪性疾患である肝細胞癌に対する新規療法が求められている。
　肝細胞癌は日本における原発性肝癌の９０％以上の原因を占めると言われている。こうした肝細胞癌に対する治療方法としては、化学療法剤を用いて、腫瘍への栄養供給経路となる肝動脈に油性造影剤（リピオドール）と抗癌剤、塞栓物質（ゼルフォーム）を混和したものを注入し、栄養動脈を閉塞することにより、選択的に肝細胞癌を壊死に導く治療法であるＴＡＥ（肝動脈塞栓療法）が用いられている。また、化学療法剤として、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、ＵＦＴ（ウラシルとテガフール）、ＭＭＣ（マイトマイシンＣ）、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン）、ＡＤＲ（アドリアマイシン）、ＥＰＩ（エピルビシン）、ＣＤＤＰ（シスプラチン）等が単独で、あるいはＩＦＮ（インターフェロン）との併用療法として、全身化学療法の臨床試験が行われている（非特許文献４）。しかし、なお肝癌の標準療法は確立されていない（非特許文献５）。
　近年、生育因子を標的とする複数の薬剤が、肝癌治療に適用する目的で調べられている。これらの研究により、ヒト肝癌細胞においては上皮因子受容体／ヒト上皮因子受容体１（EGFR/HER1）が活性型で発現していることが示唆された。上皮因子受容体／ヒト上皮因子受容体１に対する阻害剤であるエルロチニブ、および上皮因子受容体／ヒト上皮因子受容体１とＥｒｂＢ－２（Her2/neu）に対する二重チロシンキナーゼ阻害剤であるラパチニブが、肝癌患者に対する第二相臨床試験において検討された。エルロチニブが投与された患者の応答割合は４－９％で、無増悪期間は２．１ヶ月から３．２ヶ月であり、生存率は５．８－１３ヶ月であった。その一方でラパチニブが投与された患者の応答割合は０％で、無増悪生存期間は１．８ヶ月であった（非特許文献６）。一方、キナーゼ阻害剤である経口活性型のソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ，ＢＡＹ４３－９００６）は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達をＲａｆキナーゼの段階で阻害することによって癌細胞の増殖をブロックし、かつ、ＶＥＧＦＲ－２，ＶＥＧＦＲ－３およびＰＤＧＦＲ－βチロシンキナーゼを標的とすることによって抗血管形成効果を発揮し、上記の化学療法剤に比べて有利な効果を示した。非日本人および日本人を対象とした第二相臨床試験において、無増悪期間は４．２から４．９ヶ月で、応答割合は２から４％で、無増悪生存期間は９．２から１５．６ヶ月であった（非特許文献７）。ソラフェニブ同様、複数のキナーゼを阻害する作用を有するマルチキナーゼ阻害剤であるスニチニブ（ＳＵ１１２４８）（非特許文献８）は、肝細胞癌の臨床試験に用いられている。34人の進行肝細胞患者にスニチニブが投与された当該試験では、12週までに1人の患者で部分奏効が確認され、17人の患者で安定状態が認められた。全生存期間中央値は9.8カ月であった一方で、無増悪生存期間中央値は3.9カ月（95％信頼区間2.6-6.9）で、3カ月無増悪生存率は56％、6カ月無増悪生存率は32％だったことが示されスニチニブが肝細胞癌に対して抗腫瘍活性を奏することが示唆された（Zhu　A,　Sahani　D,　di　Tomaso　E　et　al.,;　99th　AACR　annual　meeting.　San　Diego,　CA,　USA　12-16　April　(2008)）。一般的に、肝癌の進行に伴い肝機能障害を伴う、食欲不振、体重減少、全身倦怠感、右悸肋部腫瘤触知、右悸肋部痛、腹部膨満感、発熱、黄疸等の肝癌特有の症状が観察される。しかしながらソラフェニブ、ラパチニブ等の化学療法剤は、下痢または便秘、貧血、（致死的な重篤度の）感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、体重減少等の化学療法剤に固有の副作用も併発するという、克服すべき課題を有している。
　一般に、肝癌は初期には特別な初期症状は観察されないが、肝癌の進行に伴い肝機能障害を伴う、食欲不振、体重減少、全身倦怠感、右悸肋部腫瘤触知、右悸肋部痛、腹部膨満感、発熱、黄疸等の肝癌特有の症状が観察される。こうした症状は上記の化学療法剤の使用によって増幅されることが臨床上観察される。たとえば、肝癌細胞が検出される患者の食欲不振、および、それに伴うまたはそれとは独立して生じる体重減少等の症状は、当該患者に対する化学療法剤の投与によって、非投与に比較してより増幅されることがある。こうした症状が表れる場合には当該化学療法剤の使用を断念せざるを得なくなる場合もあり、上記の症状の増幅は化学療法剤による治療を妨げる要因となる。
　したがって、治療効果の向上や治療を受ける患者のＱＯＬの改善等においてより優れた治療法の確立が求められていた。
　本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
WO2003/000883 WO2006/006693 Llovet　JM,　Burroughs　A,　Bruix　J;　Lancet　(2003),　362,　1907-17 Bosch　FX,　Ribes　J,　Cleries　R;　Gastroenterology　(2004),　127,　S5-16 Takenaka　K,　Kawahara　N,　Yamamoto　K,　Kajiyama　K,　Maeda　T,　Itasaka　H,　Shirabe　K,　Nishizaki　T,　Yanaga　K,　Sugimachi　K;　Arch　Surg　(1996),　131,　71-6 Yeo　W,　Mok　TS,　Zee　B,　Leung　TW,　Lai　PB,　Lau　WY,　Koh　J,　Mo　FK,　Yu　SC,　Chan　AT,　Hui　P,　Ma　B,　Lam　KC,　Ho　WM,　Wong　HT,　Tang　A,　Johnson　PJ;　J　Natl　Cancer　Inst　(2005),　97,　1532-8 Furuse　J,　Ishii　H,　Nakachi　K,　Suzuki　E,　Shimizu　S,　Nakajima　K;　Cancer　Sci　(2007),　Oct　22　(E-Pub) Philip　PA,　Mahoney　MR,　Allmer　C,　Thomas　J,　Pitot　HC,　Kim　G,　Donehower　RC,　Fitch　T,　Picus　J,　Erlichman　C;　J　Clin　Oncol　(2005),　23,　6657-63 Thomas　MB,　Dutta　A,　Brown　T,　Charnsangavej　C,　Rashid　A,　Hoff　PM,　Dancey　J,　Abbruzzese　JL;　J　Clin　Oncol　(2005),　2005　ASCO　Annual　Meeting　Proceedings.　23,　16S Mendel　DB,　Laird　AD,　Xin　X,　Louie　SG,　Christensen　JG,　Li　G,　Schreck　RE,　Abrams　TJ,　Ngai　TJ,　Lee　LB,　Murray　LJ,　Carver　J,　Chan　E,　Moss　KG,　Haznedar　JO,　Sukbuntherng　J,　Blake　RA,　Sun　L,　Tang　C,　Miller　T,　Shirazian　S,　McMahon　G,　Cherrington　JM;　Clin　Cancer　Res　(2003),　9,　327-37
　本発明は上記の情況に鑑みてなされたものであり、癌の進行に伴う体重減少等の肝癌固有の症状が観察される患者に対して、キナーゼ阻害剤等の化学療法剤の投与に起因する、下痢または便秘、貧血、（致死的な重篤度の）感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、体重減少等の化学療法剤に固有の副作用を低減し、かつ肝癌に対する治療効果を増大することができる肝癌治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者等は、肝癌細胞において高発現しているタンパク質に結合し、かつ当該細胞に対して細胞傷害活性を発揮する能力を奏する治療用抗体と、肝癌細胞に対して有効な化学療法剤を有効成分として含む肝癌治療剤とを組み合わせることにより、肝癌患者に対して当該化学療法剤が単独で処方されるよりも有効な治療効果を奏することを見出した。また、本発明の治療剤は、上述のような有効な効果を奏するのみならず、当該化学療法剤が単独で処方される際に認められる下痢または便秘、貧血、（致死的な重篤度の）感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、体重減少等の化学療法剤に固有の副作用を有意に低減させ、有効な治療効果を奏することが見出された。
　さらに、下記の実施例において示されるように、肝癌の進行に伴う食欲不振や体重減少等の症状のモデルとして、ＨｅｐＧ２が移植された非ヒト動物肝癌モデルを用いた場合、その体重減少は化学療法剤、より具体的にはソラフェニブの投与によりさらに増幅されたが、本発明の治療剤を投与することにより、体重減少が抑制されることが実証された。
　即ち、本発明は以下の発明；
［１］化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物、
［２］前記医薬組成物が配合剤であることを特徴とする、［１］に記載の医薬組成物、
［３］化学療法剤およびグリピカン３抗体が併用されることを特徴とする、［１］に記載の医薬組成物、
［４］化学療法剤とグリピカン３抗体とが同時または順次に投与されることを特徴とする［３］に記載の医薬組成物、
［５］化学療法剤とグリピカン３抗体とが別々に投与されることを特徴とする［３］に記載の医薬組成物、
［６］グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物、
［７］グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、［６］に記載の医薬組成物、
［８］グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、［６］に記載の医薬組成物、
［９］化学療法剤を有効成分として含む、グリピカン３抗体と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物、
［１０］化学療法剤がグリピカン３抗体と同時に投与されることを特徴とする、［９］に記載の医薬組成物、
［１１］化学療法剤がグリピカン３抗体の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、［９］に記載の医薬組成物、
［１２］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、［１］から［１１］のいずれかに記載の医薬組成物、
［１３］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［１２］に記載の医薬組成物、
［１４］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［１２］又は［１３］に記載の医薬組成物、
［１５］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［１２］又は［１３］に記載の医薬組成物、
［１６］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［１］から［１５］のいずれかに記載の医薬組成物、
［１７］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１］から［１６］のいずれかに記載の医薬組成物、
［１８］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［１］から［１７］のいずれかに記載の医薬組成物、
［１９］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１］から［１６］又は［１８］のいずれかに記載の医薬組成物、
［２０］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１］から［１６］又は［１８］のいずれかに記載の医薬組成物、
［２１］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１］から［１６］又は［１８］のいずれかに記載の医薬組成物、
［２２］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［１］から［２１］のいずれかに記載の医薬組成物、
［２３］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［２２］に記載の医薬組成物、
［２４］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［２２］に記載の医薬組成物、
［２５］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［２２］に記載の医薬組成物、
［２６］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［２２］に記載の医薬組成物、
［２７］治療用抗体を有効成分として含有する、化学療法剤による肝癌治療の結果生じる副作用の低減剤、
［２８］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［２７］に記載の副作用の低減剤、
［２９］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［２７］又は［２８］に記載の副作用の低減剤、
［３０］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［２８］又は［２９］に記載の副作用の低減剤、
［３１］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［２８］又は［２９］に記載の副作用の低減剤、
［３２］副作用が体重減少であることを特徴とする［２７］から［３１］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［３３］治療用抗体がグリピカン３抗体であることを特徴とする［２７］から［３２］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［３４］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［３３］に記載の副作用の低減剤、
［３５］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする［３３］又は［３４］に記載の副作用の低減剤、
［３６］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［３３］から［３５］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［３７］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［３３］、［３４］又は［３６］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［３８］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［３３］、［３４］又は［３６］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［３９］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［３３］、［３４］又は［３６］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［４０］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［３３］から［３９］のいずれかに記載の副作用の低減剤、
［４１］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４０］に記載の副作用の低減剤、
［４２］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４０］に記載の副作用の低減剤、
［４３］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４０］に記載の副作用の低減剤、
［４４］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４０］に記載の副作用の低減剤、
［４５］グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤による肝癌治療の効果を増強させるための医薬組成物、
［４６］グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、［４５］に記載の医薬組成物、
［４７］グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、［４５］に記載の医薬組成物、
［４８］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［４５］から［４７］のいずれかに記載の医薬組成物、
［４９］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［４８］に記載の医薬組成物、
［５０］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［４５］から［４９］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５１］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［４５］から［４９］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５２］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［４５］から［５１］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５３］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする［４５］から［５２］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５４］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［４５］から［５３］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５５］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４５］から［５２］又は［５４］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５６］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４５］から［５２］又は［５４］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５７］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［４５］から［５２］又は［５４］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５８］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［４５］から［５７］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５９］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［５８］に記載の医薬組成物、
［６０］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［５８］に記載の医薬組成物、
［６１］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［５８］に記載の医薬組成物、
［６２］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［５８］に記載の医薬組成物、
［６３］被験者において肝癌を治療または予防する方法であって、被験者に有効量の化学療法剤および有効量のグリピカン３抗体を組み合わせて投与することを含む方法、
［６４］化学療法剤とグリピカン３抗体とが同時または順次に投与されることを特徴とする［６３］に記載の方法、
［６５］化学療法剤とグリピカン３抗体とが別々に投与されることを特徴とする［６３］に記載の方法、
［６６］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、［６３］から［６５］のいずれかに記載の方法、
［６７］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［６６］に記載の方法、
［６８］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［６６］又は［６７］に記載の方法、
［６９］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［６６］又は［６７］に記載の方法、
［７０］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［６３］から［６９］のいずれかに記載の方法、
［７１］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［６３］から［７０］のいずれかに記載の方法、
［７２］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［６３］から［７１］のいずれかに記載の方法、
［７３］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［６３］から［７０］又は［７２］のいずれかに記載の方法、
［７４］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［６３］から［７０］又は［７２］のいずれかに記載の方法、
［７５］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［６３］から［７０］又は［７２］のいずれかに記載の方法、
［７６］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［６３］から［７５］のいずれかに記載の方法、
［７７］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［７６］に記載の方法、
［７８］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［７６］に記載の方法、
［７９］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［７６］に記載の方法、
［８０］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［７６］に記載の方法、
［８１］被験者において化学療法剤による肝癌治療の結果生じる副作用を低減する方法であって、被験者に有効量の治療用抗体を投与することを含む方法、
［８２］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［８１］に記載の方法、
［８３］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［８１］又は［８２］に記載の方法、
［８４］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［８２］又は［８３］に記載の方法、
［８５］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［８２］又は［８３］に記載の方法、
［８６］副作用が体重減少であることを特徴とする［８１］から［８５］のいずれかに記載の方法、
［８７］治療用抗体がグリピカン３抗体であることを特徴とする［８１］から［８６］のいずれかに記載の方法、
［８８］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［８７］に記載の方法、
［８９］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする［８７］又は［８８］に記載の方法、
［９０］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［８７］から［８９］のいずれかに記載の方法、
［９１］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［８７］、［８８］又は［９０］のいずれかに記載の方法、
［９２］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［８７］、［８８］又は［９０］のいずれかに記載の方法、
［９３］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［８７］、［８８］又は［９０］のいずれかに記載の方法、
［９４］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［８７］から［９３］のいずれかに記載の方法、
［９５］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９４］に記載の方法、
［９６］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９４］に記載の方法、
［９７］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９４］に記載の方法、
［９８］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９４］に記載の方法、
［９９］被験者において化学療法剤による肝癌治療の効果を増強させる方法であって、被験者に有効量のグリピカン３抗体を投与することを含む方法、
［１００］グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、［９９］に記載の方法、
［１０１］グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、［９９］に記載の方法、
［１０２］化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［９９］から［１０１］のいずれかに記載の方法、
［１０３］化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする［１０２］に記載の方法、
［１０４］化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする［９９］から［１０３］のいずれかに記載の方法、
［１０５］化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする［９９］から［１０３］のいずれかに記載の方法、
［１０６］グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする［９９］から［１０５］のいずれかに記載の方法、
［１０７］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする［９９］から［１０６］のいずれかに記載の方法、
［１０８］グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、［９９］から［１０７］のいずれかに記載の方法、
［１０９］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９９］から［１０６］又は［１０８］のいずれかに記載の方法、
［１１０］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９９］から［１０６］又は［１０８］のいずれかに記載の方法、
［１１１］グリピカン３抗体が；
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［９９］から［１０６］又は［１０８］のいずれかに記載の方法、
［１１２］グリピカン３抗体がヒト化抗体である［９９］から［１１１］のいずれかに記載の方法、
［１１３］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１１２］に記載の方法、
［１１４］グリピカン３抗体が；
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１１２］に記載の方法、
［１１５］グリピカン３抗体が；
配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１１２］に記載の方法、
［１１６］グリピカン３抗体が；
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
を含む抗体であることを特徴とする、［１１２］に記載の方法、
を提供するものである。
図１は、ドキソルビシン（DOX）またはミトキサントロン（MX）とＧＣ３３抗体との併用投与による肝癌細胞の増殖抑制効果を表すグラフである。 図２は、ヒト肝癌細胞株Huh-7細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化に基づいて示されたグラフである。 図３は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化に基づいて示されたグラフである。 図４は、ｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブによるヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルの体重減少に対する効果がモデルの体重の推移によって示されたグラフである。 図５は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するpH7pL16抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化に基づいて示されたグラフである。 図６はpH7pL16抗体およびソラフェニブによるヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルの体重減少に対する効果が当該モデルの体重の推移によって示されたグラフである。 図７は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびスニチニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化（平均＋標準偏差）に基づいて示されたグラフである。 図８は、本発明において好適に用いられるヒト化抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 図９は、本発明において好適に用いられるヒト化抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
発明を実施するための形態
　本発明は、化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物を提供する。
　本発明において、「化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物」とは、化学療法剤およびグリピカン３抗体を、肝癌の治療または予防において同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせた医薬組成物を意味する。本発明の医薬組成物は、化学療法剤およびグリピカン３抗体が共に含有される配合剤の形で提供することができる。また、化学療法剤を含有する薬剤とグリピカン３抗体を含有する薬剤とが別々に提供され、これらの薬剤が、同時に、別々に、または順次に使用されてもよい。さらに、化学療法剤を含有する薬剤とグリピカン３抗体を含有する薬剤から構成されるキットとして提供してもよい。
　上記の医薬組成物において、化学療法剤とグリピカン３抗体とが別々の薬剤に含有されて提供される場合には、これらの薬剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。また、上記の医薬組成物には、さらに異なる一種以上の製剤を組み合わせてもよい。
　別の観点においては、本発明は、グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物を提供する。グリピカン３抗体を有効成分として含む本発明の医薬組成物が化学療法剤と併用される際には、化学療法剤と同時に投与され得るし、化学療法剤の投与前または投与後に投与され得る。化学療法剤の投与前または投与後にグリピカン３抗体が投与される場合には、被験者における当該化学療法剤の残留濃度を測定することにより、その投与時期が最適化され得る。当該濃度は、被験者から採取された試料を各種のクロマトグラフィー等の分離装置を用いた当業者において公知の分析方法に基づいて決定され得る。
　別の観点においては、本発明は、化学療法剤を有効成分として含む、グリピカン３抗体と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物を提供する。化学療法剤を有効成分として含む医薬組成物がグリピカン３抗体と併用される際には、グリピカン３抗体と同時に投与され得るし、グリピカン３抗体の投与前または投与後に投与され得る。グリピカン３抗体の投与前または投与後に化学療法剤が投与される場合には、被験者における当該グリピカン３抗体の残留濃度を測定することにより、その投与時期が最適化され得る。当該濃度は、被験者から採取された試料を当業者において公知の後述されるＥＬＩＳＡ等の免疫的測定法に基づいて決定され得る。
化学療法剤
　本発明に用いられる化学療法剤には、癌の化学療法に用いられているかまたは有用であることが示唆されているいずれの化学療法剤も含まれる。化学療法剤は、局所注入されるものであってもよいし、全身的に投与されるものであってもよい。局所注入は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＴＡＥ（肝動脈塞栓療法）では、腫瘍への栄養供給経路となる肝動脈に油性造影剤（リピオドール）と抗癌剤、塞栓物質（ゼルフォーム）を混和したものが注入され、栄養動脈が閉塞されることにより、選択的に肝細胞癌を壊死に導く。一方、全身化学療法においては、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、ＵＦＴ（ウラシルとテガフール）、ＭＭＣ（マイトマイシンＣ）、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン）、ＡＤＲ（アドリアマイシン）（別名としてＤＸＲ（ドキソルビシン）とも指称される。）、ＥＰＩ（エピルビシン）、ＣＤＤＰ（シスプラチン）などが単独で使用されるほか、適宜ＩＦＮ（インターフェロン）と併用される。さらに、ラパチニブ等のキナーゼを阻害する作用機序を有する化学療法剤も、本発明において化学療法剤として好適に使用される。さらに、キナーゼを阻害する作用機序を有するソラフェニブも、本発明の化学療法剤として好適に使用される。また、作用機序のいかんに関わらず、肝癌を有する被験者に投与された結果、当該被験者に下痢または便秘、貧血、（致死的な重篤度の）感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、体重減少等の化学療法剤に固有の副作用をもたらす化学療法剤は、本発明において化学療法剤として好適に用いられる。
　ソラフェニブ（4-[4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide）は、分子量４６４．７のモル重量を有する経口で活性型の低分子化合物であり、そのトシル酸（トルエンスルホン酸）塩であるSorafenib　tosylate（ＢＡＹ４３－９００６）は肝癌の全身化学療法に用いられる治療剤として欧州および米国において承認されている。また、肝細胞癌の臨床試験において肝細胞癌に対して抗腫瘍活性を奏することが示されたスニチニブ（ＳＵ１１２４８）もまた、本発明に用いられる化学療法剤としてソラフェニブ同様適宜採用され得る。ソラフェニブ又はスニチニブは薬学上許容しうるその塩としても好適に用いられる。塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、グルコン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、フルオロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酒石酸塩、プロピオン酸塩、グルタル酸塩等のカルボン酸塩；リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、ルビジウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩等のアンモニウム塩等が好適に挙げられる。中でもトシル酸（トルエンスルホン酸）塩である、ＢＡＹ４３－９００６もまた好適に用いられる。
　本発明で使用される化学療法剤の投与経路は、経口または非経口のいずれでも好適に使用されるが、好ましくは経口投与が好適に使用される。経口投与のために使用される剤型としては、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、腸溶剤およびカプセル剤等の任意の剤型から適宜選択され得る。こうした剤型を有する化学療法剤は当業者に公知の方法で製剤化される。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わされ、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和された後に、凍結乾燥、打錠成型等の製剤化作業によって製剤化される。
　化学療法剤は、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁液剤等の注射剤の形で、非経口的にも使用され得る。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量を投与し得るように適宜選択される。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが例示され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）　、ＨＣＯ－５０と適宜併用され得る。油性液としてはゴマ油、大豆油が例示され、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と好適に配合され得る。
治療用抗体
　本発明の医薬組成物において用いられる治療用抗体は、肝癌細胞において発現するタンパク質に結合するものであって、当該細胞に対して細胞傷害活性を発揮することができる抗体であれば、いかなる抗体も好適に使用され得る。抗体の標的分子として好適なタンパク質は、肝癌細胞の細胞表面に発現しているタンパク質である。標的分子が細胞表面に発現している分子数が多いほうが抗体治療の効果が得られる上で好ましいが、当該効果は必ずしも分子数に依存するものではない。すなわち、正常細胞での発現との比較において癌細胞に特異的に発現している分子を標的として選択することが好ましい。そのようなタンパク質の例としてグリピカン３が好適に挙げられる。
　グリピカン３は細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの１つであり、発生における細胞分裂や、癌細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。グリピカン３に結合するある種の抗体が、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性により細胞増殖抑制作用を奏することが見いだされている（ＷＯ２００３／０００８８３：特許文献１）。また、特定のエピトープに結合するＧＣ３３抗体が肝癌細胞に対してより強いＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を発揮することが知られている（ＷＯ２００６／００６６９３：特許文献２）。本発明の肝癌治療剤においては、グリピカン３抗体が好適に使用され得る。ＧＣ３３抗体（ＷＯ２００６／００６６９３）はこうした好適なグリピカン３抗体として例示され得る。ＧＣ３３抗体の可変領域のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。
　グリピカン３抗体の作製方法は公知の方法に基づいてハイブリドーマから取得され得る（ＷＯ２００６００６６９３）。また、グリピカン３抗体は遺伝子工学的に作製され得る。すなわち、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である（　例えば、Vandamme,A.M.et　al.,Eur.J.Biochem.(1990),　192,　76　7-　75参照）。具体的には、抗グリピカン３　抗体を産生するハイブリドーマから、抗グリピカン３　抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡが単離される。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin,　J.　M.　et　al.,　Biochemistry（1979）18,　5294-5299）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski,　P.et　al.,　Anal.　Biochem.（1987）162,　156-159）等によって該ハイブリドーマ細胞から調製した後に、mRNA　Purification　Kit　（Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡが調製され得る。また、QuickPrep　mRNA　Purification　Kit　（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡが該ハイブリドーマから直接調製され得る。
　得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡが合成される。ｃＤＮＡの合成は、AMV　Reverse　Transcriptase　First-strand　cDNA　Synthesis　Kit（生化学工業）等を用いて実施され得る。また、ｃＤＮＡの合成および増幅のために、5'-Ampli　FINDER　RACE　Kit（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５’－ＲＡＣＥ法（Frohman,　M.　A.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA（1988）85,　8998-9002、Belyavsky,　A.et　al.,　Nucleic　Acids　Res.（1989）17,　2919-2932）等もまた好適に使用され、こうしたｃＤＮＡの合成の過程においてｃＤＮＡの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入される。得られたｃＤＮＡの配列を確認した後、目的とするグリピカン３抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡが所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡとインフレームで融合されるように、当該Ｃ領域を含んでなる発現ベクターに組み込まれる。
　本発明で使用されるグリピカン３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターによる制御の下で発現するように発現ベクターに組み込む方法が好適に使用され得る。次いで、この発現ベクターを用いて好適に宿主細胞を形質転換することによって、グリピカン３抗体をコードするＤＮＡを発現する組換え細胞が取得される。
　抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ１９９４０１１５２３）。
　抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせが好適に使用され得る。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が好適に使用される。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK　（baby　hamster　kidney　）、Hela、Vero、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、または（３）昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5等が好適に例示される。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana　）属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana　tabacum）由来の細胞が例示され、これらが例えばカルス培養される。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces　）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus　）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus　niger　）等が例示される。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系が好適に使用される。細菌細胞としては、大腸菌（E.　coli　）、枯草菌が例示される。これらの細胞中に、目的とする抗体遺伝子を含んでなる発現ベクターを形質転換により導入し、形質転換された細胞をin　vitroで培養することにより所望の抗体が、当該形質転換細胞の培養物から取得され得る。
　また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物も好適に使用され得る。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体が取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用され得る（Ebert,　K.M.　et　al.,　Bio/Technology（1994）12,　699-702）。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体等が使用され得る。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造され得る。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結させ、これを適当な宿主で発現させることにより、当該キメラ抗体が取得され得る。ヒト化抗体の好適な例は、ｈＧＣ３３抗体（ＷＯ２００６／００６６９３）である。ｈＧＣ３３抗体の可変領域のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。
　キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖としては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４が、Ｌ鎖としてはＣκ、Ｃλが使用され得る。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾され得る。
　キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域とから構成される。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；complementarity　determining　region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ；framework　region）およびヒト抗体由来のＣ領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲに換えて移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のＦＲをインフレームで融合するように設計されたＤＮＡ配列が、末端部にオーバーラップする部分を有するように設計された数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法により合成される。上記のように得られたＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞で発現させることにより、ヒト化抗体を製造することができる（ＥＰ２３９４００　、ＷＯ　９６００２５７６参照）。
　ヒト化抗体の作製において用いられるヒト抗体由来のＦＲ領域は、ＣＤＲを介して連結されたときに当該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するように選択する。上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性が定性的または定量的に測定され、評価されることによって、ヒト抗体のＦＲが好適に選択され得る。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体のＶ領域中のＦＲのアミノ酸が置換され得る。上記のアミノ酸置換は慣用のＰＣＲ法により容易に導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性が測定され評価されることによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列が選択される（Sato,　K.et　al.,　Cancer　Res,　1993,　53,　851-856）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin　vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球がヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合されることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得され得る（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより、所望のヒト抗体が取得され得る（国際公開ＷＯ１９９３０１２２２７、ＷＯ１９９２０３９１８、ＷＯ１９９４００２６０２、ＷＯ１９９４０２５５８５、ＷＯ１９９６０３４０９６、ＷＯ１９９６０３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列が決定され得る。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が決定され、当該Ｖ領域配列が所望のヒト抗体Ｃ領域の配列とインフレームで融合された融合タンパク質を適当な細胞中で発現させることにより、ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知であり、国際公開ＷＯ１９９２００１０４７、ＷＯ１９９２０２０７９１、ＷＯ１９９３００６２１３、ＷＯ１９９３０１１２３６、ＷＯ１９９３０１９１７２、ＷＯ１９９５００１４３８、ＷＯ１９９５０１５３８８を参考に実施され得る。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現され、取得され得る。哺乳類細胞が用いられる場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、およびその３’側下流にポリＡシグナルが機能的に結合されることによって、当該抗体遺伝子が発現され得る。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human　cytomegalovirus　immediate　early　promoter/enhancer）が好適に挙げられる。その他の有用なプロモーター／エンハンサーとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（SV40）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が好適に挙げられる。
　SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,　108）により、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic　Acids　Res.（1990）18,　5322）により、容易に遺伝子発現が実施され得る。
　大腸菌が用いられる場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子が機能的に結合されることによって、当該遺伝子が発現され得る。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターが好適に挙げられる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,　544-546　;　FASEBJ.（1992）6,　2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240,　1041-1043）により当該遺伝子が発現される。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、当該抗体が大腸菌のペリプラズムに産生される場合には、pelBシグナル配列（Lei,　S.　P.　et　al　J.　Bacteriol.（1987）169,　4379）が使用され得る。そして、ペリプラズムに産生された抗体が分離された後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤が使用されることによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。
　発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものが好適に用いられ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等が好適に挿入され得る。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系が使用され得る。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系などの動物細胞等、ならびに真糸状菌細胞および酵母細胞が好適に挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が好適に挙げられる。好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、Hela細胞を用いて発現される。
　次に、形質転換された宿主細胞がin　vitroまたはin　vivoで培養されて目的とする抗体が産生される。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMが使用され、牛胎児血清（FCS）等の血清補液が併用され得る。
　上記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法が単独でまたは適宜組み合わせて使用されることによって精製され得る。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等が適宜選択、組み合わされることにより、抗体を分離、精製され得る（Antibodies　A　Laboratory　Manual.　Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）。
　本発明において用いられる抗体として、糖鎖が改変された抗体も好適に使用され得る。抗体の糖鎖を改変することにより、後述する抗体のＡＤＣＣ活性が増強され得ることが知られている。すなわち、抗体が結合する抗原の肝癌細胞における発現がＡＤＣＣ活性を強力に発揮できる程度に高くない場合には、糖鎖が改変された抗体が好適に使用され得る。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、グリコシル化が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（ＷＯ２００００６１７３９、ＷＯ２００２０３１１４０など））、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（ＷＯ２００２０７９２５５など）などが知られている。
　抗体がその標的（すなわち、抗原）と結合するか否かは公知の方法を使用することによって好適に評価され得る。具体的には、抗原を発現している細胞に対する抗体の結合活性を測定する方法としては、Antibodies　A　Laboratory　Manual.（Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）中の３５９－４２０ページに記載されている方法が挙げられる。即ち、細胞を抗原とするＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ（fluorescence　activated　cell　sorting）の原理によって好適に評価され得る。ＥＬＩＳＡフォーマットにおいては、細胞への抗体の結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを比較することによって定量的に評価される。すなわち、各強制発現細胞を固定化したＥＬＩＳＡプレートに被験抗体を加え、細胞に結合した抗体が、被験抗体を認識する酵素標識第２抗体を利用して検出される。あるいはFACSにおいては、被験抗体の希釈系列を作成し、各強制発現細胞に対する抗体結合力価（titer）を決定することにより、細胞に対する結合活性が比較され得る。
　ＦＡＣＳフォーマットにおいては、ＥＬＩＳＡプレート等の担体に結合していない、緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原と当該抗原に対する抗体との結合を測定する。ＦＡＣＳフォーマットによる測定に使用するフローサイトメーターとしては、例えば、FACSCanto（商標）　II,　FACSAria（商標）,　FACSArray（商標）,　FACSVantage（商標）　SE,　FACSCalibur（商標）　（以上、BD　Biosciences）や、EPICS　ALTRA　HyPerSort,　Cytomics　FC　500,　EPICS　XL-MCL　ADC,　EPICS　XL　ADC,　Cell　Lab　Quanta　/　Cell　Lab　Quanta　SC（以上、Beckman　Coulter）などが挙げられる。
　被検抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、抗原を発現する細胞と被検抗体とを反応させ、次にこの細胞を被検抗体を認識するＦＩＴＣ標識した二次抗体で染色後、FACSCalibur（BD）　により測定を行い、その蛍光強度をCELL　QUEST　Software　（BD）を用いて解析する方法を挙げることができる。本方法によれば、被検抗体を用いて得られるGeometric　Meanの値（被検Geo-Mean値）を、対照抗体を用いて得られる対照Geo-Mean値と比較することによって、被検抗体の結合活性を判定することが出来る。Geo-Mean値　(Geometric　Mean)　を求める計算式は、CELL　QUEST　Software　User’s　Guide　(BD　biosciences)に記載されている。
　本発明において用いられる抗体はＧＣ３３抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体も好適に用いられる。本発明において用いられる抗体が当該エピトープに結合できるか否かは、前記記載のＦＡＣＳやＥＬＩＳＡによって試験され得る。試験される被験抗体が、ＧＣ３３抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するか、即ちＧＣ３３抗体とエピトープを共有か否かは、両者が同じエピトープに対して競合するか否かを測定することにより調べることができる。本発明において、抗体間の競合は、ＦＡＣＳや交叉ブロッキングアッセイなどによって検出することができる。ＦＡＣＳにおいては、まずＧＣ３３抗体をＧＰＣ３発現細胞に結合させて蛍光シグナルが測定される。次に、候補の競合抗体を反応後にＧＣ３３抗体が同じ細胞と反応され、同様にＦＡＣＳにより解析される。あるいは、ＧＣ３３抗体と被験競合抗体とが同時に同じ細胞に反応され得る。競合抗体の存在下でＧＣ３３抗体のＦＡＣＳの解析パターンが変化すれば、競合抗体がＧＣ３３抗体と同じエピトープを認識することが確認できる。交叉ブロッキングアッセイは、本明細書で具体的に記載される方法の他、例えば、Antibodies,　A　Laboratory　Manual,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　Harlow及びDavid　Lane編(1988)等に記載されている公知の方法が適宜採用され得る。
　例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にＧＰＣ３タンパク質を発現した細胞が固定される。候補の競合抗体の存在下、または非存在下で当該ウェルがプレインキュベートされた後に、当該ウェルにＧＣ３３抗体が添加される。ウェル中のＧＰＣ３タンパク質発現細胞に結合したＧＣ３３抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能と逆相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、ＧＣ３３抗体のＧＰＣ３タンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は低下する。あるいは逆に、同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、被験抗体のＧＰＣ３タンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は増加する。
　ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定され得る。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定され得る。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ＥＬＩＳＡアッセイという。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で好適に標識され得る。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
　更に被験抗体がＧＣ３３抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、いずれかの種に由来する定常領域を特異的に認識する標識抗体が用いられることによってウェルに結合したいずれかの抗体が測定され得る。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを特異的に識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体が好適に測定され得る。
　候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０-５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、ＧＣ３３抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体はＧＣ３３抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
　ＧＣ３３抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体として、本発明の実施例において、
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号９からから２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体や
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体、又は、
配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
を含む抗体等が好適に挙げられるが、これに限定されるものではなく、前記の交叉ブロッキングアッセイ等により適宜選択され得る。本発明において好適に用いられる例示的なヒト化抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域ならびに各ＣＤＲのアミノ酸配列を図８および図９に示す。
　本発明において用いる抗体は細胞傷害活性を有する。細胞傷害活性とは、抗体がその対応する抗原を発現している標的細胞に対して傷害を与える活性を意味する。抗原がその性質上、抗原と抗体との間に形成される抗原抗体複合体が細胞内に内在化されない抗原である場合には、抗体が発揮する細胞傷害活性として、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ。以下、「ＡＤＣＣ活性」と指称される。）または補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ。以下、「ＣＤＣ活性」と指称される。）が好適に挙げられる。一方、抗原がその性質上、抗原と抗体との間に形成される抗原抗体複合体が細胞内に内在化される抗原である場合には、抗体に化学療法剤、放射性同位元素、または、毒性物質が結合されたコンジュゲート抗体が好適に用いられる。この場合において、抗体が発揮する細胞傷害活性は、コンジュゲート抗体に結合された化学療法剤、放射性同位元素、または、毒性物質が発揮する細胞傷害活性である。
　本発明において用いられる抗体がＡＤＣＣ活性を発揮するか否か、またはＣＤＣ活性を発揮するか否かは、公知の方法により適宜測定され得る（例えば、Current　protocols　in　Immunology,　Chapter7.　Immunologic　studies　in　humans,　Editor,　John　E,　Coligan　et　al.,　John　Wiley　&　Sons,　Inc.,(1993)等）。
　具体的には、まず、下記の要領に従って、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
（１）エフェクター細胞の調製
　CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
（２）補体溶液の調製
　Baby　Rabbit　Complement（CEDARLANE）を10％　FBS含有培地（Invitrogen）にて10倍希釈し、補体溶液が調製され得る。
（３）標的細胞の調製
　抗原を発現する細胞を、0.2　ｍCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス）とともに、10％　FBS含有DMEM培地中で37℃にて１時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。抗原を発現する細胞としては、抗原をコードする遺伝子で形質転換された細胞、原発性肝細胞癌、転移性肝細胞癌等が好適に利用され得る。放射性標識後、細胞が10％　FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄され、細胞濃度が2×105細胞/mlに調製されることによって、標的細胞が調製される。
　ＡＤＣＣ活性、またはＣＤＣ活性は下記に述べる方法により測定できる。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton　Dickinson）に、標的細胞と本発明に係る抗体が１ウェル当たり50μlずつ加えられ、氷上にて15分間反応される。その後、エフェクター細胞が１ウェル当たり100　μlずつ加えられる。プレートは炭酸ガスインキュベーター内で4時間インキュベートされる。抗体の終濃度は0または10μg/mlと設定されるが、当該抗体の活性に基づいて適宜調整される。インキュベートの後、１ウェル当たり100μlの上清が回収され、ガンマカウンター（COBRAII　AUTO-GAMMA、MODEL　D5005、Packard　Instrument　Company）によって放射活性が測定される。細胞傷害活性（%）は得られた放射活性の値が使用され、(A-C)　/　(B-C)　x　100の計算式に基づいて計算され得る。上記計算式において、Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％　NP-40（nacalai　tesque）が加えられた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。
　ＣＤＣ活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson）に、標的細胞と、本発明に係る抗体が１ウェル当たり50　μlずつ加えられ、氷上にて15分間反応される。その後、補体溶液が１ウェル当たり100　μlを加えられる。プレートは炭酸ガスインキュベーター内で４時間インキュベートされるが、当該抗体の活性に基づいて適宜調整される。抗体の終濃度は0または3　μg/mlと設定されるが、当該抗体の活性に従って適宜調整される。インキュベートの後、１ウェル当たり100　μlの上清が回収され、ガンマカウンターによって放射活性が測定される。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定に使用された方法と同様に計算され得る。
　抗体コンジュゲートが発揮する細胞傷害活性は、抗体コンジュゲートに結合された化学療法剤、放射性同位元素、または、毒性物質が発揮する細胞傷害活性が測定されることにより好適に評価され得る。抗体コンジュゲートに結合された化学療法剤、放射性同位元素、または、毒性物質が発揮する細胞傷害活性を測定する場合には、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson）に、標的細胞と、本発明に係る抗体コンジュゲートが１ウェル当たり50　μlずつ加えられ、氷上にて15分間反応される。その後、プレートが炭酸ガスインキュベーター内で１から４時間インキュベートされる。抗体の終濃度は0または3　μg/mlと設定されるが、当該抗体コンジュゲートの活性に基づいて適宜調整される。インキュベートの後、100　μlの上清が回収され、ガンマカウンターで放射活性が測定される。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定に使用された方法と同様に計算され得る。
　本発明に係る抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる。アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾニブ（bortezomib）、ブリスタチン－１（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、１０－ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin　glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシングルクロニド（doxorubicin　glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl　estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide　glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone　caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone　acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol　acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、マイトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾロン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone　propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil　mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
　本発明において、好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常１００～２０００、好ましくは２００～１０００の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤には、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグが含まれる。プロドラッグは酵素的な変換によっても、非酵素的な変換によっても好適に活性化され得る。
　また、リシン（ricin）、アブリン（abrin）、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ（onconase）、DNase　I、Staphylococcal　エンテロトキシン-A、ヤマゴボウ（pokeweed　）抗ウイルス蛋白質、ゲロニン（gelonin）、ジフテリア毒素、Pseudomonas　外毒素、Pseudomonas　内毒素、L-アスパラギナーゼ、PEG　L-アスパラギナーゼなどの毒性ペプチドを用いて、抗体が好適に修飾され得る。また別の態様では、一または二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用され得る。本発明に係る抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合または非共有結合が好適に利用され得る。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
　更に、タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって好適に抗体と結合され得る。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするＤＮＡと本発明に係る抗体をコードするＤＮＡをインフレームで融合させて、適切な宿主細胞で発現させることにより、毒性ペプチドを結合した本発明に係る抗体が融合タンパク質として好適に得られる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のＣ末端側にタンパク質性の薬剤や毒素が配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーが好適に介在され得る。
医薬組成物
　本発明において、肝癌治療に有効な、化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法が提供される。また、本発明の別の態様においては、グリピカン３抗体を使用することにより、化学療法剤による肝癌患者に対する治療に際して、当該化学療法剤の治療効果を増強し、かつ、当該化学療法剤に起因する副作用を低減することを可能とする方法が提供される。ここで、治療効果の増強とは、治療の奏功率が上昇すること、治療のために投与される化学療法剤の量が低減すること、および／または、化学療法剤による治療期間が短くなることをいう。また、本発明の別の態様においては、化学療法剤およびグリピカン３抗体を有効成分として含む、肝癌を治療または予防するための医薬組成物を製造するためのグリピカン３抗体の使用方法が提供される。さらに、本発明は化学療法剤、および、グリピカン３抗体を用いることを特徴とする、肝癌患者に対する治療または予防の方法を提供する。
　本発明において、化学療法剤および／またはグリピカン３抗体を有効成分として含むとは、化学療法剤および／またはグリピカン３抗体を主要な活性成分として含むという意味であって、化学療法剤および／またはグリピカン３抗体の含有率を制限するものではない。また、「治療」という用語は本発明に係る医薬組成物が被験者に投与されることによって、肝癌細胞が死滅またはその細胞数が減少すること、肝癌細胞の増殖が抑制されること、肝癌に起因する様々な症状が改善されることを意味するものである。また、「予防」という語は、減少した肝癌細胞が再度増殖することによりその数の増加を防止すること、増殖が抑制された肝癌細胞の再増殖を防止することを意味する。
　本発明に係る治療用抗体の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施され得る。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが好適に例示される。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の治療用抗体が全身または局部的に投与され得る。また、投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1　kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択され得る。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択され得る。しかしながら、本発明の治療用抗体はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本発明における化学療法剤とグリピカン３抗体との併用とは、化学療法剤とグリピカン３抗体とが共に投与または使用（以下、単に「投与」と指称される。）されることを意味するものであって、投与の順番や投与間隔等が限定されて解釈されるものでない。また、本発明の化学療法剤とグリピカン３抗体とが組み合わされたキットとしても使用され得る。さらに、本発明にしたがって、化学療法剤とグリピカン３抗体が併用される場合には、いずれか一方が単独で用いられる投与量よりも、所望により各々が少ない投与量で投与され得る。
　本発明に係る化学療法剤とグリピカン３抗体の投与の順番は、グリピカン３抗体の投与後に化学療法剤が投与され得るし、化学療法剤とグリピカン３抗体とが同時に投与され得るし、また、化学療法剤の投与後にグリピカン３抗体が投与され得る。
　本発明に係る化学療法剤とグリピカン３抗体がそれぞれ投与される場合には、化学療法剤とグリピカン３抗体の投与間隔は特に限定されず、投与経路や剤型等の要因が考慮されて設定され得る。例えば、０時間～１６８時間であり、好ましくは０時間～７２時間であり、また好ましくは０～２４時間であり、さらに好ましくは０時間～１２時間である。また、投与経路や剤型等の要因のほか、本発明に係る化学療法剤とグリピカン３抗体の被験者におけるそれぞれの残留濃度も参酌され得る。すなわち、グリピカン３抗体の投与前に化学療法剤が投与される場合には、グリピカン３抗体による所望の効果が得られるような、被験者における当該化学療法剤の残留濃度が検出される時点で、グリピカン３抗体が投与され得る。当該濃度は、被験者から採取された試料を各種のクロマトグラフィー等の分離装置を用いた当業者において公知の分析方法で分析した結果に基づいて決定され得る。
　これとは逆に、化学療法剤の投与前にグリピカン３抗体が投与される場合には、化学療法剤による所望の効果が得られるような、被験者における当該グリピカン３抗体の残留濃度が検出される時点で、化学療法剤が投与され得る。当該濃度は、被験者から採取された試料を当業者において公知のＥＬＩＳＡ等の免疫的測定法で分析した結果に基づいて決定され得る。
　本発明の治療用抗体は、常法に従って製剤化され（例えば、Remington's　Pharmaceutical　Science,　latest　edition,　Mack　Publishing　Company,　Easton,　U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物が共に含まれ得る。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用され得る。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が好適に挙げられる。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　以下、本発明を実施例の記載によって具体的に説明するが本発明は当該記載によって限定して解釈されるものではない。
実施例１
　グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するグリピカン３抗体と化学療法剤（ミトキサントロンまたは塩酸ドキソルビシン）との併用効果
（１）細胞株
　グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株としてHuH-7細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）およびHepG2細胞（ATCC）が用いられた。HuH-7細胞は10%FBS（BIONET）を含むDulbecco’s　Modifid　Eagle’s　Medium培地（SIGMA）にて、HepG2細胞は10%FBS、1　mmol/l　MEM　Sodium　Pyruvate（Invitrogen）、1　mmol/l　MEM　Non-Essential　Amino　Acid（Invitrogen）を含むMinimum　Essential　Medium　Eagle培地（SIGMA）にて、それぞれ維持継代された。
（２）ヒト肝癌細胞株移植マウスモデルの作製
　各細胞が各継代用培地とMATRIGEL　Matrix（BD　Bioscience）を等量含む溶液にて1ml当たり5×107細胞になるように調製された。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬、１バイアル中の内容物が5ｍlに溶解されたもの）100μlが腹腔内へ投与されたＳＣＩＤマウス（オス、5週齢、日本クレア）の腹部皮下へ、細胞懸濁液100　μl（すなわち、マウス一頭当たり5×106細胞）が移植された。腫瘍体積は以下の式にて算出され、腫瘍体積の平均が237-298　mm3になった時点でモデルが成立されたものと判断された。
腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（３）抗体および化学療法剤の調製
　マウス抗ヒトグリピカン３モノクローナル抗体（クローン名：ＧＣ３３,　ＷＯ２００６００６６９３に記載されたもの）はＰＢＳ（－）を用いて、0.5　mg/ml（5　mg/kg投与群）および0.1　mg/ml（1　mg/kg投与群）になるように調製された。塩酸ドキソルビシン（アドリアシン注、協和発酵）は注射用蒸留水（大塚製薬）にて10　mg/ml濃度となるように溶解された後に、ＰＢＳ（－）を用いて0.5　mg/ml濃度となるように希釈された。塩酸ミトキサントロン（ノバントロン注、Wyeth）は生理食塩水（大塚製薬）にて10　mg/mlに溶解された後に、ＰＢＳ（－）を用いて0.1　mg/mlとなるように希釈された。
（４）化学療法剤の投与
　（２）で作製されたヒト肝癌移植マウスモデルに対し、HuH-7細胞xenograftモデルは移植後11日目より、HepG2細胞xenograftモデルは移植後20日目より、それぞれ週に1回ずつ、三週間の間にわたって、上記（３）で調製された抗体試料が10　ml/kgの用量で、尾静脈より投与された。陰性対照として、濾過滅菌したＰＢＳ（－）（Vehicle）が同様に週に1回ずつ、三週間の間にわたって、10　ml/kgの用量で、尾静脈より投与された。また、HuH-7細胞xenograftモデルに対しては移植後10日目に1回、上記（３）で調製された塩酸ドキソルビシン（DOX）もしくは、陰性対照としてＰＢＳ（－）がそれぞれ10　ml/kgの用量で、尾静脈より投与された。またHep　G2細胞xenograftモデルに対しては移植後20日目より、上記（３）で調製された塩酸ミトキサントロン（MX）もしくは、陰性対照としてＰＢＳ（－）がそれぞれ週に1回ずつ、三週間の間にわたって、10　ml/kgの用量で、尾静脈より投与された。いずれの群も、１群当たり6匹で構成された。また、化学療法剤の詳細な処置方法は表１および２に示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）抗腫瘍効果の評価
　ヒト肝癌移植マウスモデルにおけるＧＣ３３抗体と化学療法剤との組み合わせによる抗腫瘍効果は、最終投与日より一週間後の腫瘍体積で評価された。統計解析は最終測定日の腫瘍体積を用いて、t検定にて実施された。統計解析のためにSAS前臨床パッケージ（SAS　Institute　Inc.）が用いられた。結果を図１に示す。
　図１Ａは、ヒト肝癌細胞株HuH-7細胞株が移植されたマウスモデルにおける、ＧＣ３３抗体とドキソルビシン（DOX）が併用投与された際の腫瘍体積の変化を示すグラフである。菱形はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。丸はＧＣ３３抗体のみが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。三角はドキソルビシン（DOX）のみが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。クロスはＧＣ３３抗体とドキソルビシン（DOX）が併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。図１Ｂは、HepG2細胞株が移植されたマウスモデルにおける、ＧＣ３３抗体とミトキサントロン（MX）が併用投与された際の腫瘍体積の変化を示すグラフである。菱形はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。丸はＧＣ３３抗体のみが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。三角はミトキサントロン（MX）のみが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。クロスはＧＣ３３抗体とミトキサントロン（MX）が併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。
　図１に示されるように、ＧＣ３３単独投与群での腫瘍増殖に比べて、ＧＣ３３とドキソルビシン（DOX、図１Ａ）もしくはミトキサントロン（MX、図１Ｂ）との併用投与群での腫瘍増殖は有意に抑制されたことが観察された。
実施例２
グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するヒト化グリピカン３抗体と化学療法剤（ソラフェニブ）との併用効果
　６週齢のオスのCB-17　SCIDマウスはCLEA　Japan　Inc.より購入された。マウスには腫瘍移植直前に200μgの抗アシアロGM1抗体（WAKO）が腹腔内投与され、その後5×105細胞のHepG2細胞あるいはHuH-7細胞が50%マトリゲル（Becton　Dickinson）に分散されたものが皮下移植された。腫瘍体積が250mm3に達した時点でマウスが群分けされ、投与が開始された。ヒト化抗グリピカン３抗体（hGC33、ＷＯ２００６００６６９３）は、PBS(-)にて適切な濃度に調製されたものが週1回、3週間静脈内投与された。ソラフェニブはOrganic　Process　Research　&　Development　(2002)　6,　777-781に記載された方法に従って合成されたソラフェニブが、10%　エタノール、10%　Cremophor　ELを含む純水に懸濁され、週5回、3週間経口投与された。ベヒクルコントロールとして、PBS(-)と、10%　ethanol,　10%　Cremophor　ELを含む純水が用いられた。腫瘍体積V　(mm3)は実施例１に記載された計算式によって算出された。結果を図２－４に示す。
　図２は、ヒト肝癌細胞株Huh-7細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化（平均＋標準偏差）に基づいて示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒丸はｈＧＣ３３抗体のみが5mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。白四角はソラフェニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒四角はｈＧＣ３３抗体とソラフェニブがそれぞれ5mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。図３は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化（平均＋標準偏差）に基づいて示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒丸はｈＧＣ３３抗体のみが1mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。白四角はソラフェニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒四角はｈＧＣ３３抗体とソラフェニブがそれぞれ1mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。図中の星印はDunnett’s　testに基づいてP値がP<0.05であることが示されている。図４は、ｈＧＣ３３抗体およびソラフェニブによるヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルの体重減少に対する効果が当該モデルの体重の推移（平均±標準偏差）によって示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の体重の推移が示されている。黒丸はｈＧＣ３３抗体のみが5mg/kgの用量で投与された群の体重の推移が示されている。白四角はソラフェニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の体重の推移が示されている。黒四角はｈＧＣ３３抗体とソラフェニブがそれぞれ5mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の体重の推移が示されている。図中の星印はDunnett’s　testに基づいてP値がP<0.05であることが示されている。
　その結果、HuH-7　xenograftモデルにおける5mg/kg用量でのhGC33、あるいは80mg/kg用量でのソラフェニブのそれぞれ単独の投与によって腫瘍増殖が抑制された。さらに、両者が併用投与されることによって、単独投与による腫瘍増殖抑制活性よりもその腫瘍増殖の抑制が強まることが観察された（図２）。
　HepG2　xenograftモデルに対して、ヒト化GC33　1mg/kgとソラフェニブの最大耐用量である80mg/kgとが併用投与された群における測定最終日（すなわちday　42の時点）の腫瘍体積で表した腫瘍増殖抑制効果は、それぞれが単独に投与された群におけるそれよりも有意に強かった。また、このモデルにおいては腫瘍の増殖に伴う体重減少が観察されるが、ソラフェニブ単独投与によってこの体重減少が亢進されることが観察された。一方、ソラフェニブとヒト化GC33との併用投与によって、ソラフェニブ単独投与群に比較して薬効が強まるのみならず、体重減少が有意に軽減されることが示された（特に、day　39および42の時点を参照（図３））。
参考実施例３
（１）ヒト化H0L0抗体の点変異遺伝子の作製
　ヒト化H0L0抗体のCDRを含むグリピカン３抗体をコードする遺伝子を出発材料として、各種の点変異遺伝子を作製した。改変部位を含む順鎖および逆鎖の配列に基づいて設計されたオリゴDNAが合成された。市販のQuikChange　Site-Directed　Mutagenesis　Kit（Stratagene）を用いて複数の点変異遺伝子が作製された。点変異遺伝子の作製は以下の条件に従ってPCR法によって実施された。10　ngの鋳型プラスミドと、10　pmolの順鎖および逆鎖の合成オリゴDNA、キットに添付された10x　Buffer、dNTP　mixおよびPfu　turbo　DNA　polymeraseからなる反応混合物を、95℃にて30秒間加熱した後、95　℃にて30秒、55　℃にて1分、68　℃にて4分から構成されるPCR反応サイクルが18回実施された。キットに添付されたDpnIが反応混合物に添加された後に37℃にて1時間の制限酵素による制限消化反応が継続された。当該反応液によってDH5αコンピテント細胞（TOYOBO）が形質転換された結果、形質転換体が得られた。当該形質転換体から単離されたプラスミドDNAの塩基配列の決定に基づいて、点変異が導入されたことが確認された点変異遺伝子は、動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクター中にクローン化された。改変遺伝子は以下に示す構成を有する改変により取得された。
　ヒト化H0L0抗体およびその点変異改変抗体の一過性発現はPolyethyleneimine（Polysciences　Inc.）を用いた一過性発現により実施された。Trypsin　EDTA（Invitrogen）にて剥離されたHEK293細胞が、10cm2培養ディッシュに6　x　106　cells/10mLとなるように播種された。翌日、手順書に従い、H鎖発現プラスミドDNAおよびL鎖発現プラスミドDNAに、SFMII培地およびPolyetyleneimineが混合された後、当該混合液は室温にて10分間静置された。混合液の全量は、HEK293細胞が前記記載の通り播種された培養ディッシュに滴下された。その約72時間後に回収された培養上清から、発現したヒト化H0L0抗体およびその点変異改変抗体の精製がrProteinA　sepharoseTM　Fast　Flow（GE　Healthcare）を用いて、その手順書に従い実施された。
（１－１）ヒト化H0L0抗体のTm値の改変
　熱変性中間温度（Tm）は、一定のプログラムされた加熱速度で被検試料溶液を加熱した後に得られるサーモグラム（Cp対T）における変性ピークの頂点として把握される。DSC測定用試料溶液の調製を以下の様に実施することによって、ヒト化H0L0抗体のTm値が測定された。まず、150　mmol/lの塩化ナトリウムを含む20　mol/lの酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH6.0）を透析外液に対して、透析膜に封入された50-100μg相当量の抗体溶液が一昼夜の間、透析に供された。その後、透析外液を用いてその抗体濃度が50-100μg/mlに調製された試料溶液がDSC測定用試料溶液として使用された。
　適切なDSC装置、例えばDSC-II（Calorimetry　Sciences　Corporation）が、この実験のために好適に使用される。前記方法により調製された試料溶液およびリファレンス溶液（透析外液）が十分に脱気された後に、それぞれの被験検体が熱量計セルに封入され40℃にて熱充分な平衡化が行われた。次にDSC走査が40℃～100℃にて約1K/分の走査速度で行われた。当該測定の結果は、温度の関数としての変性ピークの頂点として表される。非特許文献（Rodolfoら、Immunology　Letters　(1999),　47-52）を参考にしたFabドメインのピークアサインが行われ、ヒト化H0L0抗体の熱変性中間温度が算出された。
　前記記載の方法による算出に基づいた配列番号３で表されるH鎖、および、配列番号４で表されるL鎖からなるヒト化H0L0抗体のTm値は76.6℃であるが、既存の抗体として例示されるSynagisおよびHerceptinのTm値はそれぞれ85.4℃および81.8℃と計測される。したがってヒト化H0L0抗体のTm値は既存の抗体のそれよりも低いことが示されたこととなる。
　そこで、そのTm値の向上を目的として、ヒト化H0L0抗体の改変抗体を作製した。配列番号３で表されるヒト化H0L0抗体のH鎖のFR2に対して、そのVH1bのサブクラスをVH4のサブクラスに改変するV37I、A40P、M48I、L51Iの改変が加えられたH15（配列番号３４）が作製された。そのTm値は79.1℃に改善された。配列番号4で表されるヒト化H0L0抗体のL鎖のFR2をVK2からVK3のサブクラスに改変するL42Q、S48A、Q50Rの改変、および、FR1のV2を生殖細胞系列の配列であるIに置換するV2Iの改変が実施されたL4（配列番号３５）が作製された。各抗体のTm値の測定は前記の記載の方法により実施された。その結果、H15L0及びH0L4のTm値はそれぞれ、79.2℃及び77.2℃と測定され、H0L0のTm値である76.6℃よりも改善された。この2つの改変体が組み合わされたH15L4抗体のTm値は80.5℃に改善された。
（１－２）ヒト化H0L0抗体のpI値の改変
　抗体が有するpI値が減少することにより、抗体の血漿中半減期が伸長する。そこで、pI値が減少したヒト化H0L0抗体の改変抗体を作製し、高い腫瘍抑制効果をもたらすか否かが検証された。
　各抗体のpI値は等電点電気泳動による分析に基づいて算出された。当該電気泳動は以下のとおり行われた。Phastsystem　Cassette（AmerchamBioscience社製）を用いて以下の組成を有する膨潤液によって60分ほどPhast-Gel　Dry　IEF（AmerchamBioscience）ゲルが膨潤された。
（ａ）高pI用の膨潤液の組成：
1.5　mlの10%　Glycerol
100μlのPharmalyte　8-10.5　for　IEF（AmerchamBioscience）
（ｂ）低pI用の膨潤液の組成：
1.5　mlの精製水
20μlのPharmalyte　8-10.5　for　IEF（AmerchamBioscience）
80μlのPharmalyte　5-8　for　IEF（AmerchamBioscience）
　約0.5μgの抗体が膨潤したゲルに供され、以下のプログラムにより制御されたPhastSystem（AmerchamBioscience）を用いることによって等電点電気泳動が行われた。サンプルは下記プログラムにおけるStep　2の段階でゲルに添加された。pIマーカーとして、Calibration　Kit　for　pI（AmerchamBioscience）が使用された。
　　　Step　1：2000　V、2.5　mA、3.5　W、15℃、75　Vh
　　　Step　2：200　V、2.5　mA、3.5　W、15℃、15　Vh
　　　Step　3：2000　V、2.5　mA、3.5　W、15℃、410　Vh
　泳動後のゲルが20　％　TCAによって固定化された後、Silver　staining　Kit,　protein（AmerchamBioscience）を用い、キットに添付されている手順書に従って銀染色が行われた。染色後、pIマーカーが有する既知の等電点を基準にして被験試料である各抗体の等電点が算出された。
　H15にK19T、Q43E、K63S、K65Q、G66Dの改変が更に施されたHspd1.8（Hd1.8）（配列番号２７）が作製された。L4にQ27Eの改変が施され、L4を構成するFR3の79-84の配列であるKISRVEがTISSLQに改変され、S25Aの改変が施されたLspd1.6（Ld1.6）（配列番号２９）が作製された。Hspd1.8（Hd1.8）およびLspd1.6（Ld1.6）からなる抗体であるHspd1.8Lspd1.6（Hd1.8Ld1.6）のpI値は7.4と計測された。ヒト化H0L0抗体のpI値は8.9であることからHspd1.8Lspd1.6（Hd1.8Ld1.6）抗体のpI値は1.5減少した。
（２）競合ELISAによるヒト化H0L0抗体の点変異改変抗体の結合活性の評価
　（１）で精製されたヒト化H0L0抗体およびその点変異改変抗体の競合ELISAによる評価が行われた。1μg/mlとなるように調製された可溶型GPC3コアポリペプチド（配列番号３６）が96穴プレートに１ウエル当たり100μl加えられた。当該プレートは4℃にて終夜静置され、可溶型GPC3コアポリペプチドが当該プレートに固相化された。当該プレートに固相化された可溶型GPC3コアポリペプチドはSkan　WASHER400（Molecular　Devices）を用いて洗浄緩衝液にて3回洗浄され200μlのブロッキング緩衝液が加えられ4℃にて３０分以上ブロックされた。当該可溶型GPC3コアポリペプチドが固相化されブロックされたプレートは次にSkan　WASHER400を用いて洗浄緩衝液にて3回洗浄された。その後、種々の濃度のヒト化H0L0抗体またはその点変異改変抗体と終濃度0.3μg/mlのビオチン化されたヒト化H0L0抗体がそれぞれ100μl混合された混合液200μlがプレート１ウエル当たり加えられた。ヒト化H0L0抗体のビオチン化はBiotin　Labelingキット（Roche）を用いてキットの手順書に従い実施された。当該プレートは室温にて1時間静置された後、Skan　WASHER400（Molecular　Devices）を用いて洗浄緩衝液にて5回洗浄された。その１ウエル当たり基質緩衝液によって20,000倍に希釈された100μlの　Goat　anti　streptabidin　Alkaline　phosphatase（ZYMED）が加えられた当該プレートは、室温にて1時間静置された後Skan　WASHER400を用いて洗浄緩衝液にて5回洗浄された。基質緩衝液を用いて1　mg/mlとなるようにPhosphatase　Substrate（Sigma）が調製され、１ウエル当たり100μl加えられ1時間静置された。Benchmark　Plus（BIO-RAD）を用いて655　nmの対照吸光度を用いて、各ウエル中の反応液の405　nmにおける吸光度が測定された。
　H15L4抗体及びHspd1.8Lspd1.6　（Hd1.8Ld1.6）抗体の抗原に対する結合活性は改変に供したヒト化H0L0抗体のそれとほぼ同等であることが示された。
参考実施例４
（１）点変異pI改変抗体の作製に使用されるpI低下のための改変箇所の選定
　Hd1.8Ld1.6抗体の腫瘍抑制効果をさらに向上するために、可変領域のpIの低下を可能とする改変箇所の検討が行われた。その結果、可変領域のpIの低下を可能とするアミノ酸残基が見出された。それらの改変のうちpI低下の具体例として、pH7pL16抗体が挙げられる。pH7pL16抗体の作製は以下のように実施された。
　改変部位の作製はPCRを用いたAssemble　PCRを行うことによって行われた。改変部位を含む順鎖および逆鎖の配列に基づいて設計されたオリゴDNAが合成された。改変部位を含む逆鎖オリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターの順鎖オリゴDNA、改変部位を含む順鎖オリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターの逆鎖オリゴDNAをそれぞれ組み合わせ　、PrimeSTAR(TAKARA)を用いてPCRを行うことによって、改変部位を含む断片を5末端側と3末端側の2つが作製された。その2つの断片をAssemble　PCRによりつなぎ合わせることによって、各変異体が作製された。
　作製された変異体を動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクターに挿入され、得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。プラスミドDNAの塩基配列の決定に基づいて、点変異が導入されたことが確認された点変異遺伝子は、動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクター中にクローン化された。抗体の発現、精製等の方法は、実施例１記載の方法又はそれに順ずる方法を用いて実施された。
　Hspd1.8(Hd1.8)を出発物質に用いてHspd1.8(Hd1.8)のCDR2に存在するkabatナンバリングに基づく61番目のグルタミン(Q)がグルタミン酸(E)に置換されたpH7（配列番号３１）が作製された。Ld1.6を出発物質に用いてLd1.6のCDR1に存在するkabatナンバリングに基づく24番目のアルギニン(R)がグルタミン(Q)に、FR2及びFR3に存在する37番目のグルタミン(Q)がロイシン(L)、43番目のアラニン(A)がセリン(S)、45番目のアルギニン(R)がグルタミン(Q)、74番目のスレオニン(T)がリジン(K)、77番目のセリン(S)がアルギニン(R)、78番目のロイシン(L)がバリン(V)、79番目のグルタミン(Q)がグルタミン酸(E)にそれぞれ置換されたpL14が作製され、更にpL14のFR4に存在するkabatナンバリングに基づく104番目のロイシン(L)がバリン(V)、107番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)にそれぞれ置換されたpL16（配列番号３３）が作製された。
（２）点変異pI改変抗体のpI値の測定
　参考実施例３に記載あるいは参考実施例３に準じた方法によりPhastGel　IEF　4-6.5（GE　Healthcase）を用いた泳動によりHd1.8Ld1.6抗体及びpH7pL16抗体のpI値が測定された。Hd1.8Ld1.6抗体及びpH7pL16抗体のpI値は、それぞれ、7.47及び6.52と測定され、pH7pL16抗体のpI値はHd1.8Ld1.6抗体のpI値より0.95減少したことが示された。
（３）点変異pI改変抗体のTm値の測定
　Hd1.8Ld1.6抗体及びpH7pL16抗体から得られたFabのTm値が参考実施例３に記載の方法に準じて、VP-DSC（Micro　Cal）を用いて測定された。この際、透析外液としてPBSが用いられた。また、DSC測定用試料溶液として抗体濃度が25-100μg/mlに調製された。20℃～115℃にて約4K／分の走査速度となるよう設定されたDSC走査によって、リファレンス溶液（透析外液）およびDSC測定用試料溶液が測定された。Hd1.8Ld1.6抗体及びpH7pL16抗体の　Fab熱変性中間温度は、それぞれ77.5及び74.7℃と測定された。
（４）競合ELISAによる点変異pI改変抗体の抗原に対する結合活性の評価
　参考実施例３に記載された方法を用いて、抗原であるグリピカン３に対する各点変異pI改変抗体の結合活性が測定された。pH7pL16抗体のグリピカン３に対する結合活性はヒト化H0L0抗体のそれとほぼ同等であることが示された。
実施例５
（１）グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するヒト化グリピカン３抗体と化学療法剤（ソラフェニブ）との併用試験
　６週齢のオスのCB-17　SCIDマウスはCLEA　Japan　Inc.より購入された。マウスには腫瘍移植直前に200μgの抗アシアロGM1抗体（WAKO）が腹腔内投与され、その後5×105細胞のHepG2細胞が50%マトリゲル（Becton　Dickinson）に分散されたものが皮下移植された。腫瘍体積が250mm3に達した時点でマウスが群分けされ、投与が開始された。pH7pL16抗体は、PBS(-)にて適切な濃度に調整されたものが週1回、3週間静脈内投与された。ソラフェニブはOrganic　Process　Research　&　Development　(2002)　6,　777-781に記載された方法に従って合成されたソラフェニブが、10%　エタノール、10%　Cremophor　ELを含む純水に懸濁され、週5回、3週間経口投与された。ベヒクルコントロールとして、PBS(-)と、10%　ethanol,　10%　CremophorELを含む純水が用いられた。腫瘍体積V　(mm3)は実施例１に記載された計算式によって算出された。
（２）グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するヒト化グリピカン３抗体と化学療法剤（ソラフェニブ）との併用効果
　図５は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するpH7pL16抗体およびソラフェニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化（平均＋標準偏差）に基づいて示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒丸はpH7pL16抗体のみが1mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。白四角はソラフェニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒四角はpH7pL16抗体とソラフェニブがそれぞれ1mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。図中の星印はDunnett’s　testに基づいてP値がP<0.05であることが示されている。図６は、pH7pL16抗体およびソラフェニブによるヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルの体重減少に対する効果が当該モデルの体重の推移（平均±標準偏差）によって示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の体重の推移が示されている。黒丸はpH7pL16抗体のみが1mg/kgの用量で投与された群の体重の推移が示されている。白四角はソラフェニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の体重の推移が示されている。黒四角はpH7pL16抗体とソラフェニブがそれぞれ1mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の体重の推移が示されている。図中の星印はDunnett’s　testに基づいてP値がP<0.05であることが示されている。
　その結果、HepG2　xenograftモデルに対して、pH7pL16抗体1mg/kgとソラフェニブの最大耐用量である80mg/kgとが併用投与された群における測定最終日（すなわちday　47の時点）の腫瘍体積で表した腫瘍増殖抑制効果は、それぞれが単独に投与された群におけるそれよりも有意に強かった（図５）。また、このモデルにおいては腫瘍の増殖に伴う体重減少が観察されるが、ソラフェニブ単独投与によってこの体重減少が亢進されることが観察された。一方、ソラフェニブとpH7pL16との併用投与によって、ソラフェニブ単独投与群に比較して薬効が強まるのみならず、体重減少が有意に軽減されることが示された（図６）。
実施例６
（１）グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するヒト化グリピカン３抗体と化学療法剤（スニチニブ）との併用試験
　６週齢のオスのCB-17　SCIDマウスはCLEA　Japan　Inc.より購入された。マウスには腫瘍移植直前に200μgの抗アシアロGM1抗体（WAKO）が腹腔内投与され、その後5×105細胞のHepG2細胞が50%マトリゲル（Becton　Dickinson）に分散されたものが皮下移植された。腫瘍体積が250mm3に達した時点でマウスが群分けされ、投与が開始された。ヒト化抗グリピカン３抗体（ｈＧＣ３３、ＷＯ２００６００６６９３）は、PBS(-)にて適切な濃度に調整されたものが週1回、3週間静脈内投与された。Sequoia　Research　Products（カタログナンバー：SRP01785S）より購入されたスニチニブは、10%　エタノール、10%　Cremophor　ELを含む純水に懸濁され、週5回、3週間経口投与された。ベヒクルコントロールとして、PBS(-)と、10%　ethanol,　10%　CremophorELを含む純水が用いられた。腫瘍体積V　(mm3)は実施例１に記載された計算式によって算出された。
（２）グリピカン３を発現するヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対するヒト化グリピカン３抗体と化学療法剤（スニチニブ）との併用効果
　図７は、ヒト肝癌細胞株HepG2細胞移植マウスモデルに対するｈＧＣ３３抗体およびスニチニブの抗腫瘍効果が腫瘍体積の変化（平均＋標準偏差）に基づいて示されたグラフである。白丸はベヒクルが投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒丸はｈＧＣ３３抗体のみが1mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。白四角はスニチニブのみが80mg/kgの用量で投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。黒四角はｈＧＣ３３抗体とスニチニブがそれぞれ1mg/kgおよび80mg/kgの用量で併用投与された群の腫瘍体積の推移が示されている。図中の星印はDunnett’s　testに基づいてP値がP<0.05であることが示されている。
　その結果、HepG2　xenograftモデルに対して、hGC33抗体1mg/kgとスニチニブの最大耐用量である80mg/kgとが併用投与された群における測定最終日（すなわちday　53の時点）の腫瘍体積で表した腫瘍増殖抑制効果は、それぞれが単独に投与された群におけるそれよりも有意に強かった（図７）。
　本発明は、肝癌に羅患した患者を治療するために、医療業、薬業等において使用される治療剤、治療方法、治療剤の製造方法、治療剤の使用方法を提供する。

Claims (116)

  1. 化学療法剤およびグリピカン３抗体を組み合わせてなる、肝癌を治療または予防するための医薬組成物。
  2. 前記医薬組成物が配合剤であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 化学療法剤およびグリピカン３抗体が併用されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 化学療法剤とグリピカン３抗体とが同時または順次に投与されることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 化学療法剤とグリピカン３抗体とが別々に投与されることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
  6. グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物。
  7. グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 化学療法剤を有効成分として含む、グリピカン３抗体と併用して肝癌を治療または予防するための医薬組成物。
  10. 化学療法剤がグリピカン３抗体と同時に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 化学療法剤がグリピカン３抗体の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
  12. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の医薬組成物。
  13. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
  15. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
  16. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の医薬組成物。
  17. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれかに記載の医薬組成物。
  18. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項１から１７のいずれかに記載の医薬組成物。
  19. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１から１６又は１８のいずれかに記載の医薬組成物。
  20. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１から１６又は１８のいずれかに記載の医薬組成物。
  21. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１から１６又は１８のいずれかに記載の医薬組成物。
  22. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項１から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
  23. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
  25. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
  26. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
  27. 治療用抗体を有効成分として含有する、化学療法剤による肝癌治療の結果生じる副作用の低減剤。
  28. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項２７に記載の副作用の低減剤。
  29. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項２７又は２８に記載の副作用の低減剤。
  30. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項２８又は２９に記載の副作用の低減剤。
  31. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項２８又は２９に記載の副作用の低減剤。
  32. 副作用が体重減少であることを特徴とする請求項２７から３１のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  33. 治療用抗体がグリピカン３抗体であることを特徴とする請求項２７から３２のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  34. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項３３に記載の副作用の低減剤。
  35. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする請求項３３又は３４に記載の副作用の低減剤。
  36. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項３３から３５のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  37. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項３３、３４又は３６のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  38. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項３３、３４又は３６のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  39. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項３３、３４又は３６のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  40. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項３３から３９のいずれかに記載の副作用の低減剤。
  41. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の副作用の低減剤。
  42. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の副作用の低減剤。
  43. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の副作用の低減剤。
  44. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の副作用の低減剤。
  45. グリピカン３抗体を有効成分として含む、化学療法剤による肝癌治療の効果を増強させるための医薬組成物。
  46. グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  48. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項４５から４７のいずれかに記載の医薬組成物。
  49. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項４５から４９のいずれかに記載の医薬組成物。
  51. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項４５から４９のいずれかに記載の医薬組成物。
  52. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項４５から５１のいずれかに記載の医薬組成物。
  53. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする請求項４５から５２のいずれかに記載の医薬組成物。
  54. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項４５から５３のいずれかに記載の医薬組成物。
  55. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４５から５２又は５４のいずれかに記載の医薬組成物。
  56. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４５から５２又は５４のいずれかに記載の医薬組成物。
  57. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項４５から５２又は５４のいずれかに記載の医薬組成物。
  58. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項４５から５７のいずれかに記載の医薬組成物。
  59. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項５８に記載の医薬組成物。
  61. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項５８に記載の医薬組成物。
  62. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項５８に記載の医薬組成物。
  63. 被験者において肝癌を治療または予防する方法であって、被験者に有効量の化学療法剤および有効量のグリピカン３抗体を組み合わせて投与することを含む方法。
  64. 化学療法剤とグリピカン３抗体とが同時または順次に投与されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
  65. 化学療法剤とグリピカン３抗体とが別々に投与されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
  66. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項６３から６５のいずれかに記載の方法。
  67. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
  68. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項６６又は６７に記載の方法。
  70. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項６３から６９のいずれかに記載の方法。
  71. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項６３から７０のいずれかに記載の方法。
  72. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項６３から７１のいずれかに記載の方法。
  73. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項６３から７０又は７２のいずれかに記載の方法。
  74. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項６３から７０又は７２のいずれかに記載の方法。
  75. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項６３から７０又は７２のいずれかに記載の方法。
  76. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項６３から７５のいずれかに記載の方法。
  77. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
  78. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
  79. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
  80. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
  81. 被験者において化学療法剤による肝癌治療の結果生じる副作用を低減する方法であって、被験者に有効量の治療用抗体を投与することを含む方法。
  82. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項８１に記載の方法。
  83. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項８１又は８２に記載の方法。
  84. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項８２又は８３に記載の方法。
  85. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項８２又は８３に記載の方法。
  86. 副作用が体重減少であることを特徴とする請求項８１から８５のいずれかに記載の方法。
  87. 治療用抗体がグリピカン３抗体であることを特徴とする請求項８１から８６のいずれかに記載の方法。
  88. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項８７に記載の方法。
  89. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項８７から８９のいずれかに記載の方法。
  91. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項８７、８８又は９０のいずれかに記載の方法。
  92. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項８７、８８又は９０のいずれかに記載の方法。
  93. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項８７、８８又は９０のいずれかに記載の方法。
  94. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項８７から９３のいずれかに記載の方法。
  95. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
  96. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
  97. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
  98. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
  99. 被験者において化学療法剤による肝癌治療の効果を増強させる方法であって、被験者に有効量のグリピカン３抗体を投与することを含む方法。
  100. グリピカン３抗体が化学療法剤と同時に投与されることを特徴とする、請求項９９に記載の方法。
  101. グリピカン３抗体が化学療法剤の投与前または投与後に投与されることを特徴とする、請求項９９に記載の方法。
  102. 化学療法剤がキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項９９から１０１のいずれかに記載の方法。
  103. 化学療法剤がマルチキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１０２に記載の方法。
  104. 化学療法剤がソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）であることを特徴とする請求項９９から１０３のいずれかに記載の方法。
  105. 化学療法剤がスニチニブであることを特徴とする請求項９９から１０３のいずれかに記載の方法。
  106. グリピカン３抗体が細胞傷害活性を有する抗体であることを特徴とする請求項９９から１０５のいずれかに記載の方法。
  107. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする請求項９９から１０６のいずれかに記載の方法。
  108. グリピカン３抗体が、第２の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第２の抗体はそれぞれ配列番号５，６，および７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＨ鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号８，２４，および２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，２，および３を有するＬ鎖可変領域を含むことを特徴とする抗体である、請求項９９から１０７のいずれかに記載の方法。
  109. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号９から２３のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９９から１０６又は１０８のいずれかに記載の方法。
  110. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号２８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９９から１０６又は１０８のいずれかに記載の方法。
  111. グリピカン３抗体が；
    配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号３０に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＨ鎖可変領域；
    配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１，配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２，および配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のＣＤＲ１，２および３を有するＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項９９から１０６又は１０８のいずれかに記載の方法。
  112. グリピカン３抗体がヒト化抗体である請求項９９から１１１のいずれかに記載の方法。
  113. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
  114. グリピカン３抗体が；
    配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち、３４番目のＧｌｙが異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
  115. グリピカン３抗体が；
    配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
  116. グリピカン３抗体が；
    配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域；
    配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域；
    を含む抗体であることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
     
     
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