CN102046200A - 肝癌治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于治疗或预防肝细胞癌的新型药物组合物及治疗方法。本发明公开了一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物是组合化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的。另外，本发明还公开了含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分、与化疗剂并用的用于治疗或预防肝癌的药物组合物，以及含有化疗剂作为有效成分、与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用的用于治疗或预防肝癌的药物组合物。通过并用化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以发挥比单独给与化疗剂更有效的治疗效果，降低利用化疗剂治疗肝癌所产生的副作用。

Description

肝癌治疗剂
技术领域
相关申请
本申请要求基于日本专利申请2008-98309(2008年4月4日申请)及国际申请PCT/JP2008/002690(2008年9月26日申请)的优先权，将其内容作为参照引入本说明书。
技术领域
本发明涉及一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法的领域，所述药物组合物是对肝癌治疗有效、且组合了化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的。
背景技术
有报道称肝细胞癌引起的死亡每年约有60万，位居世界癌症引起的死亡中的第五位(非专利文献1)。大部分肝细胞癌在诊断为该疾病后1年以内死亡。不幸的是，经常出现在能够治愈的疗法不怎么发挥疗效的后期阶段诊断出肝细胞癌的例子。对上述患者进行包括化学疗法、化学塞栓术、烧灼和电子束疗法的医疗处置所获得的效果依然不充分。大多数患者表现出疾病复发，上述情况伴随血管浸润及多部位肝内转移迅速发展到进行阶段，其5年存活率仅为7％(非专利文献2)。可以进行局部癌切除术的肝细胞癌患者的预后较好，但其5年存活率仍停留在15％至39％(非专利文献3)。本技术领域中，人们寻求对上述恶性疾病即肝细胞癌的新型疗法。
有报道称在日本肝细胞癌占原发性肝癌的90％以上。作为针对上述肝细胞癌的治疗方法，可以采用TAE(经导管动脉栓塞术(Transcatheter arterial embolization))，即，使用化疗剂，将油性造影剂(Lipiodol)、抗癌剂和塞栓物质(Gelfoam)混合后注入对肿瘤供给营养的营养供给通路即肝动脉，使营养动脉阻塞，由此选择性地导致肝细胞癌坏死。另外，作为将化疗剂单独或与IFN(干扰素)并用进行治疗的方法，已经进行了全身化学疗法的临床试验，所述化学剂为5-FU(氟尿嘧啶)、UFT(尿嘧啶和替加氟)、MMC(丝裂霉素C)、DHAD(米托蒽醌)、ADR(阿霉素)、EPI(表柔比星)、CDDP(顺铂)等(非专利文献4)。但是，尚未确立肝癌的标准疗法(非专利文献5)。
近年来，为了达到适于肝癌治疗的目的，研究了以生长因子为靶向的多种药物。上述研究暗示：人肝癌细胞中，上皮因子受体/人上皮因子受体1(EGFR/HER1)以活性型表达。在对肝癌患者进行的Ⅱ期临床试验中已经研究了对上皮因子受体/人上皮因子受体1的抑制剂即厄洛替尼(Erlotinib)、及对上皮因子受体/人上皮因子受体1和ErbB-2(Her2/neu)的双重酪氨酸激酶抑制剂即拉帕替尼(Lapatinib)。给与厄洛替尼的患者的应答比例为4-9％，未恶化时间为2.1个月至3.2个月，存活率为5.8-13个月。另一方面，给与拉帕替尼的患者的应答比例为0％，未恶化生存期为1.8个月(非专利文献6)。另一方面，作为激酶抑制剂的口服活性型索拉非尼(Nexavar，BAY43-9006)通过在Raf激酶的阶段抑制Raf/MEK/ERK信号转导来阻止癌细胞增殖，并且通过将VEGFR-2、VEGFR-3及PDGFR-β酪氨酸激酶作为靶向，发挥抗血管形成效果，与上述化疗剂相比显示出较有利的效果。在以非日本人及日本人为对象的Ⅱ期临床试验中，未恶化时间为4.2至4.9个月，应答比例为2至4％，未恶化生存期为9.2至15.6个月(非专利文献7)。与索拉非尼同样地，具有抑制多种激酶的作用的多激酶抑制剂(Multi-kinase inhibitor)即舒尼替尼(SU11248)(非专利文献8)也被用于肝细胞癌的临床试验。在对34名进展中的肝细胞患者给与舒尼替尼的该试验中，可以确认到12周为止对1名患者部分有效，确认17名患者处于稳定状态。总生存期中间值为9.8个月，另一方面，未恶化生存期中间值为3.9个月(95％可信区间2.6-6.9)，3个月未恶化存活率为56％，6个月未恶化存活率仅为32％，由此暗示舒尼替尼对肝细胞癌发挥抗肿瘤活性(Zhu A，Sahani D，di Tomaso E et al.，；99th AACR annual meeting.San Diego，CA，USA 12-16 April(2008))。通常，伴随肝癌的进展，可以观察到伴有肝功能障碍的肝癌特有的症状，如食欲不振、体重减少、全身倦怠感、可触知的右季肋部肿瘤、右季肋部痛、腹部膨满感、发热、黄疸等。但是，索拉非尼、拉帕替尼等化疗剂存在下述必须克服的课题，即，并发化疗剂固有的副作用，如腹泻或便秘、贫血、引起(致死的严重程度的)感染及败血症程度的免疫系统的抑制、出血、心毒性、肝毒性、肾毒性、食欲不振、体重减少等。
通常，在初期观察不到肝癌特有的初期症状，但伴随肝癌进展，可以观察到伴有肝功能障碍的肝癌特有的症状，如食欲不振、体重减少、全身倦怠感、可触知的右季肋部肿瘤、右季肋部痛、腹部膨满感、发热、黄疸等。在临床上观察到通过使用上述化疗剂可以加剧这些症状。例如，检测出肝癌细胞患者的食欲不振、及伴随食欲不振或与其相独立地产生的体重减少等症状，通过对该患者给与化疗剂，与不给与化疗剂相比，有时会加剧此症状。有时在呈现出这些症状时不得不停止使用该化疗剂，上述症状的加剧成为妨碍使用化疗剂进行治疗的主要原因。
因此，要求确立在治疗效果的提高及接受治疗的患者的QOL改善等方面更优异的治疗方法。
本说明书中引用的参考文献如下所示。这些文献记载的内容作为参照全部引入本说明书。这些文献均不是针对本说明书的现有技术。
专利文献1：WO2003/000883
专利文献2：WO2006/006693
非专利文献1：Llovet，J.M.，Burroughs，A.，Bruix，J.：Lancet(2003)，362，1907-17
非专利文献2：Bosch，F.X.，Ribes，J.，Cleries，R.：Gastroenterology(2004)，127，S5-16
非专利文献3：Takenaka，K.，Kawahara，N.，Yamamoto，K.，Kajiyama，K.，Maeda，T.，Itasaka，H.，Shirabe，K.，Nishizaki，T.，Yanaga，K.，Sugimachi，K.：Arch Surg.(1996)，131，71-6
非专利文献4：Yeo，W.，Mok，T.S.，Zee，B.，Leung，T.W.，Lai，P.B.，Lau，W.Y.，Koh，J.，Mo，F.K.，Yu，S.C.，Chan，A.T.，Hui，P.，Ma，B.，Lam，K.C.，Ho，W.M.，Wong，H.T.，Tang，A.，Johnson，P.J.：J.Natl.Cancer Inst.(2005)，97，1532-8
非专利文献5：Furuse，J.，Ishii，H.，Nakachi，K.，Suzuki，E.，Shimizu，S.，Nakajima，K.：Cancer Sci.，(2007)，Oct.22(E-Pub)
非专利文献6：Philip，P.A.，Mahoney，M.R.，Allmer，C.，Thomas，J.，Pitot，H.C.，Kim，G.，Donehower，R.C.，Fitch，T.，Picus，J.，Erlichman，C.：J.Clin.Oncol.(2005)，23，6657-63
非专利文献7：Thomas，M.B.，Dutta，A.，Brown，T.，Charnsangavej，C.，Rashid，A.，Hoff，P.M.，Dancey，J.，Abbruzzese，J.L.：J.Clin.Oncol.，(2005)，2005 ASCO Annual Meeting Proceedings，23，16S
非专利文献8：Mendel DB，Laird AD，Xin X，Louie SG，Christensen JG，Li G，Schreck RE，Abrams TJ，Ngai TJ，Lee LB，Murray LJ，Carver J，Chan E，Moss KG，Haznedar JO，Sukbuntherng J，Blake RA，Sun L，Tang C，Miller T，Shirazian S，McMahon G，Cherrington JM；Clin Cancer Res(2003)，9，327-37
发明内容
本发明是鉴于上述情况而完成的，本发明的目的在于提供一种肝癌治疗剂，所述肝癌治疗剂针对观察到伴随癌的进展而出现的体重减少等肝癌固有症状的患者，能够降低因给与激酶抑制剂等化疗剂而引起的化疗剂所固有的副作用，即，腹泻或便秘、贫血、引起(致死的严重程度的)感染和败血症程度的免疫系统的抑制、出血、心毒性、肝毒性、肾毒性、食欲不振、体重减少等，且能够增大对肝癌的治疗效果。
本发明人等发现通过组合治疗用抗体和肝癌治疗剂，能够发挥与单独给与肝癌患者该化疗剂时相比更有效的治疗效果，所述治疗用抗体是与肝癌细胞中高度表达的蛋白质结合、且具有对该细胞发挥细胞毒性的能力的治疗用抗体，所述肝癌治疗剂是含有对肝癌细胞有效的化疗剂作为有效成分的肝癌治疗剂。另外，本发明人等还发现本发明的治疗剂不仅发挥上述有效的效果，而且还可以显著地降低在单独给与该化疗剂时出现的化疗剂所固有的副作用，即，腹泻或便秘、贫血、引起(致死的严重程度的)感染和败血症程度的免疫系统的抑制、出血、心毒性、肝毒性、肾毒性、食欲不振、体重减少等，能够发挥有效的治疗效果。
进而，如下述实施例所示，使用移植了HepG2的非人动物肝癌模型作为具有伴随肝癌进展的食欲不振和体重减少等症状的模型时，证实了因给与化疗剂，更具体而言给与索拉非尼导致其体重减少增大，而通过给与本发明的治疗剂，体重减少被抑制。
即，本发明为以下发明：
[1]一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物是组合化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的。
[2]如[1]所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为配合剂。
[3]如[1]所述的药物组合物，其特征在于，并用化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[4]如[3]所述的药物组合物，其特征在于，同时或依次给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[5]如[3]所述的药物组合物，其特征在于，分别给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[6]一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分、且与化疗剂并用。
[7]如[6]所述的药物组合物，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
[8]如[6]所述的药物组合物，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[9]一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物含有化疗剂作为有效成分、且与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用。
[10]如[9]所述的药物组合物，其特征在于，同时给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[11]如[9]所述的药物组合物，其特征在于，在给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体之前或在给与之后，给与化疗剂。
[12]如[1]至[11]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[13]如[12]所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[14]如[12]或[13]所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[15]如[12]或[13]所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[16]如[1]至[15]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为具有细胞毒性的抗体。
[17]如[1]至[16]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[18]如[1]至[17]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[19]如[1]至[16]或[18]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[20]如[1]至[16]或[18]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[21]如[1]至[16]或[18]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[22]如[1]至[21]中任一项所述的药物组合物，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[23]如[22]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[24]如[22]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[25]如[22]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[26]如[22]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
[27]一种副作用降低剂，用于降低化疗剂治疗肝癌而产生的副作用，所述副作用降低剂含有治疗用抗体作为有效成分。
[28]如[27]所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[29]如[27]或[28]所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[30]如[28]或[29]所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[31]如[28]或[29]所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[32]如[27]至[31]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，副作用为体重减少。
[33]如[27]至[32]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，治疗用抗体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[34]如[33]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为具有细胞毒性的抗体。
[35]如[33]或[34]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2，及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[36]如[33]至[35]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[37]如[33]、[34]或[36]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2，及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[38]如[33]、[34]或[36]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[39]如[33]、[34]或[36]中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[40]如[33]至[39]中任一项所述的副作用降低剂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[41]如[40]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[42]如[40]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[43]如[40]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[44]如[40]所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
[45]一种用于增强化疗剂的肝癌治疗效果的药物组合物，所述药物组合物含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分。
[46]如[45]所述的药物组合物，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
[47]如[45]所述的药物组合物，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[48]如[45]至[47]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[49]如[48]所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[50]如[45]至[49]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[51]如[45]至[49]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[52]如[45]至[51]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
[53]如[45]至[52]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[54]如[45]至[53]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[55]如[45]至[52]或[54]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[56]如[45]至[52]或[54]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[57]如[45]至[52]或[54]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[58]如[45]至[57]中任一项所述的药物组合物，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[59]如[58]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[60]如[58]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[61]如[58]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[62]如[58]所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
[63]一种治疗或预防受试者体内肝癌的方法，所述方法包括将有效量的化疗剂及有效量的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体组合、给与受试者。
[64]如[63]所述的方法，其特征在于，同时或依次给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[65]如[63]所述的方法，其特征在于，分别给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[66]如[63]至[65]中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[67]如[66]所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[68]如[66]或[67]所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[69]如[66]或[67]所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[70]如[63]至[69]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
[71]如[63]至[70]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[72]如[63]至[71]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[73]如[63]至[70]或[72]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[74]如[63]至[70]或[72]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[75]如[63]至[70]或[72]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[76]如[63]至[75]中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[77]如[76]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[78]如[76]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[79]如[76]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[80]如[76]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
[81]一种降低受试者因利用化疗剂治疗肝癌而产生的副作用的方法，所述方法包括给与受试者有效量的治疗用抗体。
[82]如[81]所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[83]如[81]或[82]所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[84]如[82]或[83]所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[85]如[82]或[83]所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[86]如[81]至[85]中任一项所述的方法，其特征在于，副作用为体重减少。
[87]如[81]至[86]中任一项所述的方法，其特征在于，治疗用抗体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[88]如[87]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
[89]如[87]或[88]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[90]如[87]至[89]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[91]如[87]、[88]或[90]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[92]如[87]、[88]或[90]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[93]如[87]、[88]或[90]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[94]如[87]至[93]中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[95]如[94]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[96]如[94]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[97]如[94]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[98]如[94]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
[99]一种在受试者体内增强化疗剂的肝癌治疗效果的方法，所述方法包括给与受试者有效量的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[100]如[99]所述的方法，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
[101]如[99]所述的方法，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
[102]如[99]至[101]中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
[103]如[102]所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
[104]如[99]至[103]中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
[105]如[99]至[103]中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
[106]如[99]至[105]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
[107]如[99]至[106]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[108]如[99]至[107]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
[109]如[99]至[106]或[108]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[110]如[99]至[106]或[108]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[111]如[99]至[106]或[108]中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
[112]如[99]至[111]中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
[113]如[112]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
[114]如[112]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
[115]如[112]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
[116]如[112]所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
附图说明
[图1]图1为表示并用给与阿得里亚霉素(DOX)或米托蒽醌(MX)与GC33抗体产生的肝癌细胞增殖抑制效果的曲线图。
[图2]图2为表示基于肿瘤体积变化的、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株Huh-7细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。
[图3]图3为表示基于肿瘤体积变化的、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。
[图4]图4为表示基于模型的体重变化的、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型体重减少的效果的曲线图。
[图5]图5为表示基于肿瘤体积变化的、pH7pL 16抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。
[图6]图6为表示基于该模型体重变化的、pH7pL16抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型体重减少的效果的曲线图。
[图7]图7为表示基于肿瘤体积变化(平均+标准偏差)的、hGC33抗体及舒尼替尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。
[图8]图8表示本发明中优选使用的人源化抗体的H链可变区及L链可变区的氨基酸序列。
[图9]图9表示本发明中优选使用的人源化抗体的H链可变区及L链可变区的CDR的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明提供一种组合化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的、用于治疗或预防肝癌的药物组合物。
本发明中，所谓“组合化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的、用于治疗或预防肝癌的药物组合物”，是指为了在肝癌的治疗或预防中同时、分别或依次给与化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而组合得到的药物组合物。本发明的药物组合物可以以同时含有化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的配合剂的形式提供。另外，分别提供了含有化疗剂的药物和含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的药物，也可以同时、分别或依次使用这些药物。进而，还可以提供由含有化疗剂的药物和含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的药物构成的试剂盒。
上述药物组合物中，化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体以含在分别的药物中的形式进行提供时，上述药物的剂型可以为相同剂型，也可以为不同的剂型。例如，双方可以为互不相同的剂型，为非口服制剂、注射剂、点滴剂、静脉内点滴剂中的一种，双方可以也可以为同类剂型，为非口服制剂、注射剂、点滴剂、静脉内点滴剂中的一种。另外，还可以进一步将不同的一种以上的制剂与上述药物组合物组合。
从另一观点考虑，本发明提供一种含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分、与化疗剂并用的用于治疗或预防肝癌的药物组合物。含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分的本发明的药物组合物与化疗剂并用时，可以与化疗剂同时给与，也可以在化疗剂给与之前或给与之后给与。在化疗剂给与之前或给与之后给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体时，通过测定受试者中的该化疗剂的残留浓度，可以使其给与时间最佳化。该浓度可以基于本领域技术人员公知的分析方法使用各种色谱法等分离装置对从受试者采集的试样进行分析来确定。
从另一观点考虑，本发明提供一种含有化疗剂作为有效成分、与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用的用于治疗或预防肝癌的药物组合物。含有化疗剂作为有效成分的药物组合物与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用时，可以在给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的同时给与，可以在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体给与之前或给与之后给与。在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体给与之前或给与之后给与化疗剂时，通过测定受试者中的该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的残留浓度，可以使其给与时间最佳化。该浓度可以基于本领域技术人员公知的下述ELISA等免疫的测定法对从受试者采集的试样进行分析来确定。
化疗剂
本发明中使用的化疗剂还包括在癌的化学疗法中使用的或暗示对癌的化学疗法有用的化疗剂。化疗剂可以局部注入，或者也可以全身给与。局部注入可以采用本领域技术人员公知的方法进行。例如，TAE(经导管动脉栓塞术)中，将油性造影剂(Lipiodol)、抗癌剂和塞栓物质(Gelfoam)混合后注入对肿瘤供给营养的营养供给通路即肝动脉，使营养动脉阻塞，由此选择性地使肝细胞癌坏死。另一方面，全身化学疗法中，5-FU(氟尿嘧啶)、UFT(尿嘧啶和替加氟)、MMC(丝裂霉素C)、DHAD(米托蒽醌)、ADR(阿霉素)(作为别名也指DXR(阿得里亚霉素))、EPI(表柔比星)、CDDP(顺铂)等可以单独使用，并且还可以与IFN(干扰素)适当并用。进而，拉帕替尼等具有抑制激酶的作用机制的化疗剂也优选用作本发明中的化疗剂。进而，具有抑制激酶的作用机制的索拉非尼也优选用作本发明的化疗剂。另外，无论作用机制如何，给与患有肝癌的受试者、结果使该受试者产生化疗法固有的副作用的化疗剂，优选用作本发明中的化疗剂，所述副作用包括腹泻或便秘、贫血、引起(致死的严重程度的)感染及败血症程度的免疫系统的抑制、出血、心毒性、肝毒性、肾毒性、食欲不振、体重减少等。
索拉非尼(4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺)是具有分子量464.7的摩尔重量的口服活性型低分子化合物，其甲基苯磺酸(甲苯磺酸)盐即索拉非尼甲基苯磺酸盐(BAY43-9006)作为肝癌全身化学疗法中使用的治疗剂已经在欧洲及美国得到认可。另外，肝细胞癌的临床试验中对肝细胞癌发挥抗肿瘤活性的舒尼替尼(SU11248)，也可以与索拉非尼同样地适当用作本发明中使用的化疗剂。索拉非尼或舒尼替尼也可以优选以药学上能够允许的盐的形式进行使用。作为盐，例如可以优选举出盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等磺酸盐；甲酸盐、乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、葡萄糖酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、氟乙酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、丙酸盐、戊二酸盐等羧酸盐；锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、铷盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土类金属盐；铵盐、烷基铵盐、二烷基铵盐、三烷基铵盐、四烷基铵盐等铵盐等。其中，还优选使用甲基苯磺酸(甲苯磺酸)盐即BAY43-9006。
本发明中使用的化疗剂的给与途径可以适当地使用口服或非口服中的任一种，优选采用口服给与。作为用于口服投与的剂型，例如可以从液体制剂、散剂、颗粒剂、片剂、肠溶剂及胶囊剂等任意剂型中适当选择。具有上述剂型的化疗剂可以采用本领域技术人员公知的方法进行制剂化。例如，可以将其与药理学上允许的载体或介质适当组合，具体而言，与灭菌水、生理食盐水、植物油、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂及粘合剂等适当组合，以通常认可的制药过程所要求的单位用量的形式混合后，采用冻干、压片成型等制剂化操作进行制剂化。
化疗剂也可以以与水或除此之外的药学上能够允许的液体形成的无菌性溶液或混悬液剂等注射剂的形式，通过非口服使用。可以适当选择上述制剂中的有效成分量，使其能够给与指示的范围内的适当用量。可以使用注射用蒸馏水之类载体，按照通常的制剂过程，得到用于注射的无菌组合物。作为注射用水溶液，例如可以举出含有生理食盐水、葡萄糖及其他辅药的等渗液例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可以与适当的助溶剂例如醇，具体而言，乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂例如聚山梨酸酯80(TM)、HCO-50适当并用。作为油性液，可以举出芝麻油、大豆油，作为助溶剂，也可以与苯甲酸苄酯、苄醇并用。另外，可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，镇痛剂例如盐酸普鲁卡因，稳定剂例如苄醇、苯酚，抗氧化剂适当地配合。
治疗用抗体
本发明的药物组合物中使用的治疗用抗体只要是与肝癌细胞中表达的蛋白质结合、可以对该细胞发挥细胞毒性的抗体即可，还可以适当地使用任意抗体。优选为抗体靶分子的蛋白质是在肝癌细胞的细胞表面表达的蛋白质。从可以得到抗体治疗的效果的方面考虑，优选靶分子在细胞表面表达的分子数较多，但该效果并不一定依赖于分子数。即，与正常细胞内的表达相比，优选在癌细胞中特异性地表达的分子作为靶分子。作为上述蛋白质的例子，优选举出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的家族之一，暗示其可能与产生的细胞分裂、及癌细胞的增殖有关，但其机制尚不明确。已经发现与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的某种抗体具有ADCC活性及CDC活性发挥细胞增殖抑制作用(WO2003/000883：专利文献1)。另外，已知与特定表位结合的GC33抗体对肝癌细胞发挥较强的ADCC活性及CDC活性(WO2006/006693：专利文献2)。本发明的肝癌治疗剂中，可以优选使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。作为上述优选的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以举出GC33抗体(WO2006/006693)。GC33抗体可变区的H链及L链的氨基酸序列分别如序列号1及2所示。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可以基于公知的制备方法从杂交瘤中获得(WO2006006693)。另外，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可以通过基因工程学方法制作。即，从杂交瘤中克隆抗体基因，组入适当的载体中，将其导入宿主，利用基因重组技术制作重组型抗体(例如参见Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)，192，767-75)。具体而言，从产生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的杂交瘤中，分离编码抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可变(V)区的mRNA。mRNA的分离可以如下进行：采用公知的方法例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等从该杂交瘤细胞中制备后，使用mRNA Purification Kit(Pharmacia制)等，制备目标mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia制)，可以从该杂交瘤中直接制备mRNA。
使用逆转录酶，由所得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可以采用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生物化学工业)等来进行。另外，为了合成及扩增cDNA，还可以优选利用使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制)及PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002、Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等，在上述cDNA的合成过程中，在cDNA的两末端导入下述合适的限制性内切酶位点。确认所得cDNA的序列后，插入包含该C区的表达载体，使编码目标磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的V区的cDNA与编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA以符合读框的方式融合。
为了制备本发明中使用的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以优选使用下述方法，即，将抗体基因组入表达载体，使抗体基因在表达控制区域例如增强子、启动子的控制下表达。接着，使用上述表达载体，适当地转化宿主细胞，由此获得重组细胞，所述重组细胞表达编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的DNA。
抗体基因的表达，可以通过将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别组入表达载体使宿主细胞同时转化，或者也可以通过将编码H链及L链的DNA组入单一表达载体使宿主细胞转化(WO1994011523)。
将抗体基因分离导入合适的宿主制作抗体时，可以优选使用合适的宿主和表达载体的组合。使用真核细胞作为宿主时，优选使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，可以优选举出(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero；(2)两栖类细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞；或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，可以举出来自烟草(Nicotiana)属例如烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，对它们进行例如愈伤组织培养。作为真菌细胞，可以举出酵母，例如酵母属(Saccharomyces)例如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)；丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。使用原核细胞时，优选利用使用细菌细胞的生产系统。作为细菌细胞，可以举出大肠杆菌(Ecoli)、枯草杆菌。将包含目标抗体基因的表达载体通过转化导入这些细胞中，将转化后的细胞在体外进行培养，由此可以从该转化细胞的培养物中得到所期望的抗体。
另外，为了产生重组型抗体，不仅可以使用上述宿主细胞，还可以适当使用转基因动物。例如将抗体基因以框内的方式插入编码乳汁中本身产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因内部，由此构筑融合基因。将包含插入了抗体基因的融合基因的DNA片断注入山羊胚胎，将该注入胚胎导入雌性山羊。可以从乳汁中获得所期望的抗体，所述乳汁是由接受了胚胎的山羊生出的转基因山羊或其子孙产生的。另外，为了增加含有由转基因山羊产生的所期望的抗体的乳汁量，可以对转基因山羊适当使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)121，699-702)。
本发明中，为了降低对人的异种抗原性，可以使用经过人为改变的基因重组型抗体，例如嵌合抗体(Chimeric antibody)、人源化抗体(Humanized antibody)等。上述改变抗体可以利用公知的方法制备。嵌合抗体是包含人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链可变区和人抗体的重链、轻链恒定区的抗体，将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其在适当的宿主中表达，由此可以得到该嵌合抗体。人源化抗体的优选例为hGC33抗体(WO2006/006693)。hGC33抗体可变区的H链及L链的氨基酸序列分别如序列号3及4所示。
嵌合抗体及人源化抗体的C区中可以使用人抗体的C区，例如可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4作为H链，使用Cκ、Cλ作为L链。上述序列是公知的。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。
嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。另一方面，人源化抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补性决定区(CDR：complementarity determining region)、来自人抗体的构架区(FR：framework region)及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体的人体内的抗原性降低，所以作为本发明的治疗剂的有效成分有用。
人源化抗体可以称作重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的CDR变为人抗体的CDR并移植得到的，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，以使小鼠抗体的CDR和人抗体的FR框内融合的方式进行设计得到的DNA序列，可以通过使用多个寡核苷酸作为引物的PCR法合成上述DNA序列，所述多个寡核苷酸被设计成末端部具有重叠部分。使如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA框内融合，插入表达载体中，使其在适当的宿主细胞中表达，由此可以制备人源化抗体(参见EP239400、WO96002576)。
选择人源化抗体的制作中使用的来自人抗体的FR区，在通过CDR进行连接时使该CDR形成良好的抗原结合部位。通过对如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性进行定性或定量地测定、评价，可以适当地选择人抗体的FR。可以根据需要，取代抗体V区中的FR的氨基酸，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。上述氨基酸的取代可以通过常用的PCR法容易地导入。通过对取代了氨基酸的变异型抗体对抗原的结合活性进行测定、评价，可以选择具有所期望的性质的变异FR序列(Sato，K.et al.，Cancer Res，1993，53，851-856)。
另外，人抗体的取得方法也是已知的。例如在体外利用所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞将人淋巴细胞致敏后，将致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，由此可以得到对抗原具有结合活性的所期望的人抗体(参见日本特公平1-59878)。另外，通过对具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物用所期望的抗原进行免疫，可以得到所期望的人抗体(国际公开WO1993012227、WO199203918、WO1994002602、WO1994025585、WO1996034096、WO1996033735)。进而，使用人抗体库，通过淘选获得人抗体的技术也是已知的。例如利用噬菌体展示法，将人抗体V区以单链抗体(scFv)的形式表达在噬菌体表面，可以选择得到与抗原结合的噬菌体。通过分析被选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区的序列与所期望的人抗体C区的序列框内融合得到的融合蛋白质在适当的细胞中表达，由此得到人抗体。上述方法已经是公知的，可以参考国际公开WO1992001047、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、WO1993019172、WO1995001438、WO1995015388进行。
如上所述构筑的抗体基因可以通过公知的方法表达并获得。使用哺乳类细胞时，通过将常用的有用的启动子、表达的抗体基因及其3’侧下游的poly A信号功能性地结合，可以使该抗体基因表达。例如作为启动子/增强子，优选举出人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。作为其他有用的启动子/增强子，可以优选举出逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴肾病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子、或者人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子等。
使用SV40启动子/增强子时，利用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)可以容易地使基因表达，另外，使用HEF1α启动子/增强子时，利用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地使基因表达。
使用大肠杆菌时，通过功能性地结合常用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号序列及表达的抗体基因，可以使该基因表达。作为启动子，例如可以优选举出IacZ启动子、araB启动子。使用IacZ启动子时利用Ward等的方法(Nature(1989)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)可以使该基因表达，或者使用araB启动子时利用Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)可以使该基因表达。
作为用于抗体分泌的信号序列，当该抗体产生于大肠杆菌的周质时，可以使用pe1B信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)。然后，将在周质中产生的抗体分离后，使用如尿素及盐酸胍之类蛋白质变性剂，由此改组(重折叠)抗体的结构使其具有所期望的结合活性。
作为插入表达载体中的复制起源，优选使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起源，进而，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，可以优选向表达载体中插入选择标记，所述选择标记为氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制备本发明中使用的抗体，可以使用任意表达体系、例如真核细胞或原核细胞体系。作为真核细胞，例如可以优选举出已经被确立的哺乳类细胞体系、昆虫细胞体系等动物细胞等、以及丝状真菌细胞及酵母细胞，作为原核细胞，例如可以优选举出大肠杆菌细胞等细菌细胞。本发明中使用的抗体优选使用哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、Hela细胞进行表达。
然后，将转化的宿主细胞在体外或体内培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养按照公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液。
如上所述表达、产生的抗体可以通过单独或者适当组合使用通常在蛋白质纯化中采用的公知方法进行纯化。例如，通过对A蛋白柱等亲和柱、色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析等进行适当选择、组合，可以分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
作为本发明中使用的抗体，也可以优选使用糖链被改变的抗体。已知通过改变抗体的糖链，可以增强下述的抗体的ADCC活性。即，抗体结合的抗原在肝癌细胞中的表达没有达到能够较强地发挥ADCC活性的程度的情况下，可以优选使用糖链被改变的抗体。作为糖链被改变的抗体，例如已知有经糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)、糖链中附加的岩藻糖缺失的抗体(WO2000061739、WO2002031140等)、具有含有截开型GlcNAc的糖链的抗体(WO2002079255等)等。
抗体与其目标(即，抗原)是否结合可以通过使用公知的方法适当地进行评价。具体而言，作为测定抗体对表达抗原的细胞的结合活性的方法，可以举出在Antibodies A Laboratory Manual.(Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)中359-420页中记载的方法。即，可以根据以细胞作为抗原的ELISA或FACS(荧光激活细胞分选术)的原理适当地进行评价。在ELISAformat中，通过比较由酶反应产生的信号水平，可以定量地评价抗体对细胞的结合活性。即，将受试抗体加到固定化有各过量表达细胞的ELISA板上，利用识别受试抗体的酶标志第2抗体，能够检测与细胞结合的抗体。或者在FACS中，制备受试抗体的稀释系列，确定抗体对各过量表达细胞的结合效价(titer)，由此可以比较其对细胞的结合活性。
在FACS format中，测定在细胞表面上表达的抗原与对应于该抗原的抗体之间的结合，所述细胞不与ELISA板等载体结合并悬浮于缓冲液等中。作为利用FACS format测定中使用的流式细胞仪，例如可以举出FACSCanto(商标)II、FACSAria(商标)、FACSArray(商标)、FACS Vantage(商标)SE、FACSCalibur(商标)(以上BD Biosciences)和EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上Beckman Coulter)等。
作为受试抗体对抗原的结合活性的优选测定方法之一例，可以举出如下方法：使表达抗原的细胞与受试抗体反应，接着用识别受试抗体的经FITC标记的二次抗体对上述细胞染色后，采用FACSCalibur(BD)进行测定，利用CELL QUEST Software(BD)解析其荧光强度。将根据本方法使用受试抗体得到的几何平均值(受试Geo-Mean值)与利用对照抗体得到的对照Geo-Mean值进行比较，由此可以判断受试抗体的结合活性。求出Geo-Mean值(几何平均值)的计算式记载在CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)中。
本发明中使用的抗体还优选使用下述抗体，即，可以与GC33抗体能够结合的表位相结合的抗体。本发明中使用的抗体是否能与该表位结合，可以通过以上所述的FACS及ELISA进行试验得到。可以通过测定试验的受试抗体是否和与GC33抗体结合的表位相同的表位结合，即是否与GC33抗体共有表位，两者是否对相同的表位竞争来进行研究。本发明中，抗体间的竞争可以利用FACS及交叉阻断测定(cross-blocking assay)等检测。FACS中，首先使GC33抗体与GPC3表达细胞结合，测定荧光信号。然后，使候选竞争抗体反应后，使GC33抗体与相同的细胞反应，同样地利用FACS进行解析。或者，可以使GC33抗体和受试竞争抗体同时与相同的细胞反应。在竞争抗体存在下如果GC33抗体的FACS的解析图发生变化，则可以确认竞争抗体识别与GC33抗体相同的表位。交叉阻断测定除本说明书中具体记载的方法之外，还可以适当采用例如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow及David Lane编(1988)等中记载的公知的方法。
例如竞争ELISA测定为优选的交叉阻断测定。具体而言，在交叉阻断测定中，在微量滴定板的孔上固定已表达了GPC3蛋白质的细胞。在候选竞争抗体的存在下或不存在下，对该孔进行预培养后，向该孔中添加GC33抗体。与孔中的GPC3蛋白质表达细胞结合的GC33抗体的量，与对相同表位的结合发生竞争的候选竞争抗体(受试抗体)的结合能反相关。即，受试抗体对同一表位的亲合性越大，GC33抗体对固定有GPC3蛋白质表达细胞的孔的结合量越低。或者，相反地受试抗体对同一表位的亲合性越大，受试抗体对固定有GPC3蛋白质表达细胞的孔的结合量越大。
与孔结合的抗体量可以通过预先标记抗体而容易地测定。例如，生物素标记的抗体，可以通过使用亲和素过氧化物酶缀合物和适当的基质进行测定。将利用过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定特别地称作竞争ELISA测定。抗体可以用能够检测或者测定的其他标记物进行标记。具体而言，公知的有放射标记或者荧光标记等。
进而，当受试抗体具有来自与GC33抗体不同的种的恒定区时，通过使用特异性地识别来自任意的种的恒定区的标记抗体，可以测定与孔结合的任一种抗体。或者，为来自相同种的抗体，但类别不同时，通过特异性地识别各类别的抗体，可以较好地测定与孔结合的抗体。
与在不存在候选竞争抗体下实施的对照试验中得到的结合活性相比，如果候选抗体能够以至少20％、优选至少20-50％、更优选至少50％阻断GC33抗体结合，则该候选竞争抗体和GC33抗体与实质相同的表位结合的抗体、或者该候选竞争抗体对与相同表位的结合产生竞争。
作为和GC33抗体与实质相同的表位结合、或者对与相同表位的结合产生竞争的抗体，在本发明的实施例中，可以优选举出下述抗体：
一种抗体，包含H链可变区和L链可变区，所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3，
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3；和
一种抗体，包含H链可变区和L链可变区，所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3，
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列额CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3；或者
一种抗体，包含H链可变区和L链可变区，所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3，
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3，
但不限定于此，可以通过上述交叉阻断测定等适当选择。本发明中优选使用的示例人源化抗体的H链可变区及L链可变区以及各CDR的氨基酸序列如图8及图9所示。
本发明中使用的抗体具有细胞毒性。所谓细胞毒性，是指抗体对表达其对应抗原的靶细胞产生伤害的活性。抗原在其性质上为在抗原与抗体之间形成的抗原抗体复合体在细胞内不发生内化的抗原时，作为抗体发挥的细胞毒性，可以优选举出抗体依赖性细胞毒性(Antibody-dependent cellular cytotoxicity，以下称作“ADCC活性”)或补体依赖性细胞毒性(Complement-dependent cellular cytotoxicity，以下称作“CDC活性”)。另一方面，抗原在其性质上为在抗原与抗体之间形成的抗原抗体复合体在细胞内发生内化的抗原时，优选使用化疗剂、放射性同位元素或毒性物质与抗体结合的缀合抗体(conjugated antibody)。上述情况下，抗体发挥的细胞毒性是与缀合抗体结合的化疗剂、放射性同位元素或毒性物质所发挥的细胞毒性。
可以通过公知的方法适当测定本发明中使用的抗体是否发挥ADCC活性或者是否发挥CDC活性(例如，Current protocols in Immunology，Chapter 7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan et al.，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。
具体而言，首先，按照下述要领，配制效应细胞、补体溶液、靶细胞。
(1)效应细胞的配制
从CBA/N小鼠等中摘出脾脏，在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中分离脾脏细胞。用含有10％胎牛血清(FBS、HyClone)的相同培养基清洗后，将细胞浓度配制成5×106/ml，由此可以配制效应细胞。
(2)补体溶液的配制
可以将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)用含有10％FBS的培养基(Invitrogen)稀释10倍，配制补体溶液。
3)靶细胞的配制
将表达抗原的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GE HealthcareBiosciences)一起在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃下培养1小时，由此可以将该靶细胞进行放射性标记。作为表达抗原的细胞，可以优选使用用编码抗原的基因转化得到的细胞、原发性肝细胞癌、转移性肝细胞癌等。放射性标记后，将细胞用含有10％FBS的RPMI 1640培养基清洗3次，将细胞浓度配制成2×105细胞/ml，由此可以配制靶细胞。
ADCC活性或者CDC活性可以根据下述方法测定。测定ADCC活性时，在96孔U底培养板(Becton Dickinson)中加入靶细胞和本发明的抗体，每1个孔各50μl，在冰上使其反应15分钟。然后，在每1个孔中各加入100μl效应细胞，将板在二氧化碳培养箱内培养4小时。设定抗体的最终浓度为0或10μg/ml，但可以基于该抗体的活性适当调整。培养后，每1个孔中回收100μl上清液，用γ计数器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)测定放射活性。可以使用所得的放射活性的值根据计算式(A-C)/(B-C)×100，计算细胞毒性(％)。上述计算式中，A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入1％NP-40(nacalai tesque)的试样的放射活性(cpm)，C表示只含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
测定CDC活性时，在96孔平底培养板(Becton Dickinson)中加入靶细胞和本发明的抗体，每1个孔各50μl，在冰上使其反应15分钟。然后，在每1个孔中加入100μl补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时，但可以基于该抗体的活性适当调整。设定抗体的最终浓度为0或3μg/ml，但可以基于该抗体的活性适当调整。培养后，每1个孔中回收100μl上清液，用γ计数器测定放射活性。可以与ADCC活性测定中使用的方法同样地计算细胞毒性。
缀合抗体所发挥的细胞毒性，优选通过测定与缀合抗体结合的化疗剂、放射性同位元素或毒性物质所发挥的细胞毒性来评价。测定与缀合抗体结合的化疗剂、放射性同位元素或毒性物质所发挥的细胞毒性时，在96孔平底培养板(Becton Dickinson)中加入靶细胞和本发明的缀合抗体，每1个孔各50μl，在冰上使其反应15分钟。然后，在二氧化碳培养箱内培养1至4小时。设定抗体的最终浓度为0或3μg/ml，但可以基于该缀合抗体的活性适当调整。培养后，回收100μl的上清液，用γ计数器测定放射活性。可以与ADCC活性测定中使用的方法同样地计算细胞毒性。
作为与本发明的抗体结合、发挥细胞毒性的化疗剂，例如可以举出以下化疗剂。即，阿扎立平(azaribine)、阿纳托唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)、卡氮芥(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、依立替康(irinotecan)、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素葡萄糖苷酸(daunomycin glucuronide)、柔红霉素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、阿得里亚霉素(doxorubicin)、阿霉素葡萄糖苷酸(doxorubicin glucuronide)、表柔比星(epirubicin)、乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷葡萄糖苷酸(etoposide glucuronide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他滨(gemcitabine)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、羟基脲(hydroxyurea)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、亚叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯(phenylbutyrate)、泼尼松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷类(taxanes)、紫杉酚(taxol)、丙酸睾丸酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、乌拉莫司丁(uracil mustard)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)。
本发明中，优选的化疗剂为低分子化疗剂。低分子化疗剂即使与抗体结合后，影响抗体功能的可能性也低。本发明中，低分子化疗剂通常具有100～2000、优选200～1000的分子量。此处列举的化疗剂均为低分子化疗剂。上述本发明中的化疗剂中包含在生物体内转化为活性的化疗剂的前药。前药通过酶的转化、也可以通过非酶的转化被适当地活化。
另外，优选使用蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白质、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、L-天门冬酰胺酶、PEG L-天门冬酰胺酶等毒性肽，对抗体进行修饰。另外，在其他方案中，可以将一个或二个以上低分子化疗剂和毒性肽分别组合，用于抗体修饰。本发明的抗体和上述低分子化疗剂的结合可以适当地使用共价键或非共价键。结合有这些化疗剂的抗体的制作方法是公知的。
进而，蛋白质性的药物和毒素可以优选通过基因工程学方法与抗体结合。具体而言，例如使编码上述细胞毒性肽的DNA与编码本发明的抗体的DNA框内融合，在合适的宿主细胞中表达，由此可以优选以融合蛋白质的形态得到结合了毒性肽的本发明的抗体。得到与抗体形成的融合蛋白质时，通常在抗体的C末端侧配置蛋白质性的药物或毒素。在抗体与蛋白质性药物或毒素之间优选通过肽连接体连接。
药物组合物
本发明中，提供用于治疗或预防肝癌的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法，所述药物组合物对肝癌治疗有效、且组合了化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。另外，本发明的其他方案中，提供一种方法，即，利用化疗剂对肝癌患者进行治疗时，通过使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以增强该化疗剂的治疗效果，且降低由该化疗剂引起的副作用。此处，所谓治疗效果的增强，是指治疗的效率提高、降低为了治疗而给与的化疗剂的量、及/或缩短使用化疗剂的治疗时间。另外，在本发明的其他方案中，提供一种用于制备药物组合物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的使用方法，所述药物组合物是含有化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分、用于治疗或预防肝癌的药物组合物。进而，本发明提供一种治疗或预防肝癌的方法，其特征在于使用化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
本发明中，所谓含有化疗剂及/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分，是指含有化疗剂及/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为主要活性成分，对化疗剂及/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的含有率没有限制。另外，所谓“治疗”，是指通过给与受试者本发明的药物组合物，使肝癌细胞凋亡或其细胞数减少、抑制肝癌细胞的增殖、改善由肝癌引起的各种症状。另外，所谓“预防”，是指防止由减少的肝癌细胞再次增殖导致的其数量增加，防止增殖被抑制的肝癌细胞的再次增殖。
本发明的治疗用抗体的给药方式可以通过口服给药、非口服给药中的任一种方法给药。特别优选非口服给药的给药方式，作为相关的给药方式，具体而言，可以优选举出注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部地给药本发明的治疗用抗体。另外，可以根据患者的年龄、症状适当选择给药方式。作为给药量，例如，可以在每一次给与、每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围内选择给药量。或者，例如，在每位患者0.001至100000mg/body的范围内选择给药量。但是，本发明的治疗用抗体并不限定于上述给药量。
本发明中的化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用，是指同时给与或使用(以下简称作“给与”)化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，给药顺序和给药间隔等不作限定性解释。另外，还可以以本发明的组合有化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的试剂盒形式进行使用。进而，根据本发明，并用化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体时，可以根据期望，与任意一方单独使用的给药量相比分别以较少的给药量给与。
本发明的化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的给与顺序，可以在给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体后给与化疗剂，也可以同时给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，还可以在给与化疗剂后给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
分别给与本发明的化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体时，化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的给与间隔没有特别限定，可以根据给药方式和剂型等主要因素设定。例如为0小时～168小时，优选为0小时～72小时，较优选为0～24小时，更优选为0小时～12小时。另外，除给药方式和剂型等主要因素之外，还可以考虑本发明的化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体在受试者体内的残留浓度。即，在给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体前给与化疗剂时，可以在下述时刻给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，即，检测到受试者体内的该化疗剂的残留浓度满足于能够得到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的所期望的效果的时刻。使用各种色谱法等分离装置、采用本领域技术人员公知的分析方法对从受试者采集的试样进行分析，基于此结果可以确定该浓度。
与此相反地，给与化疗剂前给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体时，可以在下述时刻给与化疗剂，即，检测到受试者体内的该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的残留浓度满足能够得到化疗剂的所期望的效果的时刻。采用本领域技术人员公知的ELISA等免疫的测定法对从受试者采集的试样进行分析，基于此结果可以确定该浓度。
本发明的治疗用抗体可以按照常规方法进行制剂化(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，Latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，也可以同时含有药物中允许的载体或添加物。例如可以举出表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限定于此，可以适当地使用其它常用的载体。具体而言，可以优选举出轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯(polyvinyl acetal diethylamino acetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
本说明书中明确引用的全部专利及参考文献的内容作为参照全部引入本说明书。
以下，根据实施例的记载具体地说明本发明，但本发明对于该记载不作限定性解释。
实施例
实施例1
并用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与化疗剂(米托蒽醌或盐酸阿得里亚霉素)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的效果
(1)细胞株
使用HuH-7细胞(Human Science Research Resource Bank)及HepG2细胞(ATCC)作为表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株。HuH-7细胞用含有10％FBS(BIONET)的Dulbecco’s Modifid Eagle’s Medium培养基(SIGMA)维持并传代培养，HepG2细胞用含有10％FBS、1mmol/l MEM的丙酮酸钠(Invitrogen)、1mmol/l MEM的非必需氨基酸(Invitrogen)的Minimum Essential Medium Eagle培养基(SIGMA)维持并传代培养。
(2)人肝癌细胞株移植小鼠模型的制作
使用含有等量各继代培养用培养基与MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)的溶液，制备各细胞，使之为5×107细胞/ml。向SCID小鼠(雄性、5周龄)(日本CLEA)的腹部皮下移植100μl该细胞悬浮液(即，每只小鼠5×106个细胞)，所述SCID小鼠在细胞移植的前一天已经预先向腹腔内给与了100μl抗脱唾液酸GM1抗体(和光纯药，将1安瓿中的内容物溶解成5ml)。肿瘤体积使用下述公式算出，在肿瘤体积的平均值达到237-298mm3的时刻，判断完成模型。
公式：肿瘤体积＝长径×短径×短径/2
(3)抗体及化疗剂的制备
使用PBS(-)，将小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3克隆抗体(克隆名称：GC33，记载于WO2006006693)配制成0.5mg/ml(5mg/kg给药组)及0.1mg/ml(1mg/kg给药组)。将盐酸阿霉素(Adriacin注射、协和发酵)用注射用蒸馏水(大塚制药)溶解使其浓度为10mg/ml后，使用PBS(-)稀释使其浓度为0.5mg/ml。将盐酸米托蒽醌(Novantrone注射、Wyeth)用生理食盐水(大塚制药)溶解至10mg/ml后，使用PBS(-)稀释至0.1mg/ml。
(4)化疗剂的给与
对于(2)中制作的人肝癌移植小鼠模型，HuH-7细胞xenograft模型从移植后第11日开始、HepG2细胞xenograft模型从移植后第20日开始，将上述(3)中配制的抗体试样以10ml/kg的用量通过尾静脉进行给与，每周各1次、共三周。作为阴性对照，同样地将经过滤灭菌的PBS(-)(载体)以10ml/kg的用量通过尾静脉进行给与，每周1次、共三周。另外，HuH-7细胞xenograft模型在移植后第10日分别以10ml/kg的用量通过尾静脉给与上述(3)中配制的盐酸阿霉素(DOX)或作为阴性对照的PBS(-)，1次。另外，Hep G2细胞xenograft模型从移植后第20日开始分别以10ml/kg的用量通过尾静脉给与上述(3)中配制的盐酸米托蒽醌(MX)或作为阴性对照的PBS(-)，每周各1次、共三周。各组的构成均为每1组6只。另外，化疗剂的详细处置方法如表1及2所示。
[表1]
HuH-7 Xenograft模型
[表2]
HepG2 Xenograft模型
Figure BPA00001258816400432
(5)抗肿瘤效果的评价
人肝癌移植小鼠模型中GC33抗体与化疗剂的组合的抗肿瘤效果，基于从最后给与日开始一周后的肿瘤体积进行评价。统计解析使用最后测定日的肿瘤体积利用t检验实施。统计解析中使用SAS临床前软件包(SAS Institute Inc.)。结果示于图1。
图1A为表示对移植了人肝癌细胞株HuH-7细胞株的小鼠模型并用给与GC33抗体和阿得里亚霉素(DOX)时的肿瘤体积的变化的曲线图。菱形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。圆形表示只给与GC33抗体的组的肿瘤体积的变化。三角形表示只给与阿得里亚霉素(DOX)的组的肿瘤体积的变化。交叉符号表示并用给与GC33抗体和阿得里亚霉素(DOX)的组的肿瘤体积的变化。图1B为表示对移植了HepG2细胞株的小鼠模型并用给与GC33抗体和米托蒽醌(MX)时的肿瘤体积的变化的曲线图。菱形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。圆形表示只给与GC33抗体的组的肿瘤体积的变化。三角形表示只给与米托蒽醌(MX)的组的肿瘤体积的变化。交叉符号表示并用给与GC33抗体和米托蒽醌(MX)的组的肿瘤体积的变化。
如图1所示，与单独给与GC33的组中的肿瘤增殖相比，观察到GC33和阿得里亚霉素(DOX、图1A)或米托蒽醌(MX、图1B)的并用给与组中的肿瘤增殖显著地被抑制。
实施例2
并用人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂(索拉非尼)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的效果
6周龄的雄性CB-17SCID小鼠购自CLEA Japan Inc.。在即将肿瘤移植前，对小鼠腹腔内给与200μg的抗脱唾液酸GM1抗体(WAKO)，之后，皮下移植将5×105个HepG2细胞或HuH-7细胞分散在50％基质胶(Becton Dickinson)中得到的分散物。在肿瘤体积达到250mm3的时刻，对小鼠进行分组，开始给药。将人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(hGC33、WO2006006693)用PBS(-)配制成适当浓度后进行静脉内给与，每周1次、共3周。索拉非尼是按照Organic Process Research & Development(2002)6，777-781中记载的方法合成得到的，将其混悬于含有10％乙醇、10％Cremophor EL的纯水中，进行口服给与，每周5次、共3周。作为载体对照，使用含有PBS(-)、10％乙醇，10％Cremophor EL的纯水。肿瘤体积V(mm3)根据实施例1中记载的计算式算出。结果示于图2-4。
图2为表示基于肿瘤体积变化(平均+标准偏差)的、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株Huh-7细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。白色圆形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。黑色圆形表示以5mg/kg的用量仅给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的变化。白色四边形表示以80mg/kg的用量仅给与索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。黑色四边形表示分别以5mg/kg及80mg/kg的用量并用给与hGC33抗体和索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。图3为表示基于肿瘤体积变化(平均+标准偏差)的、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果。白色圆形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。黑色圆形表示以1mg/kg的用量仅给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的变化。白色四边形表示以80mg/kg的用量仅给与索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。黑色四边形表示分别以1mg/kg及80mg/kg的用量并用给与hGC33抗体和索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。图中的星号表示基于Dunnett’s test，P值为P＜0.05。图4为表示基于模型的体重变化的(平均±标准偏差)、hGC33抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型体重减少的效果的曲线图。白色圆形表示给与载体的组的体重变化。黑色圆形表示以5mg/kg的用量仅给与hGC33抗体的组的体重变化。白色四变形表示以80mg/kg的用量给与索拉非尼的组的体重变化。黑色四边形表示分别以5mg/kg及80mg/kg的用量并用给与hGC33抗体和索拉非尼的组的体重变化。图中的星号表示基于Dunnett’s test，P值为P＜0.05。
结果，在HuH-7 xenograft模型中，通过分别单独以5mg/kg用量给与hGC33、或者以80mg/kg的用量给与索拉非尼，肿瘤增殖被抑制。进而，观察到将两者并用给与时，其肿瘤增殖抑制活性比单独给与产生的肿瘤增殖抑制活性强(图2)。
在HepG2 xenograft模型中，并用给与1mg/kg人源化GC33和最大耐用量即80mg/kg的索拉非尼的组中，以最后测定日(即，42天的时刻)的肿瘤体积表示肿瘤增殖抑制效果，该肿瘤增殖抑制效果明显强于分别单独给与的组中的肿瘤增殖抑制效果。另外，在该模型中观察到伴随肿瘤增殖的体重减少，单独给与索拉非尼时，其体重减少亢进。另一方面，表明并用给与索拉非尼和人源化GC33时，与索拉非尼单独给与组相比，不仅药效增强，体重减少也显著地轻减(特别参照39天及42天的时刻(图3))。
参考实施例3
(1)人源化H0L0抗体的点突变基因的制作
以编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的基因为起始材料，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包含人源化H0L0抗体的CDR，由此制作各种点突变基因。合成寡DNA，所述寡DNA是基于包含改变部位的正义链及反义链的序列进行设计的。利用市售的QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)，制作多个点突变基因。点突变基因的制作按照以下条件利用PCR法进行。将由10ng模板质粒、10pmol正义链及反义链的合成寡DNA、试剂盒中所添加的10×Buffer、dNTP混合物及Pfu turbo DNA聚合酶形成的反应混合物在95℃下加热30秒后，进行18次由95℃下30秒、55℃下1分钟、68℃下4分钟构成的PCR反应循环。将添加到试剂盒中的DpnI加到反应混合物中后，在37℃下继续进行1小时利用限制性内切酶进行的限制性内切酶酶切消化反应。利用该反应液DH5α将感受态细胞(TOYOBO)转化，结果得到转化体。基于由该转化体分离得到的质粒DNA的碱基序列的确定，确认导入了点突变，将该点突变基因克隆到在动物细胞中可以表达插入基因的表达载体中。通过具有如下所示构成的改变，取得改变基因。
人源化H0L0抗体及其点突变改变抗体的瞬时表达通过利用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)的瞬时表达来进行。将用胰蛋白酶EDTA(invitrogen)剥离的HEK293细胞接种到10cm2的培养皿中，使之为6×106细胞/10mL。次日，根据说明书将SFMII培养基及聚乙烯亚胺与H链表达质粒DNA及L链表达质粒DNA混合后，将该混合液在室温下静置10分钟。将全部混合液滴入如上所述接种了HEK293细胞的培养皿中。在约72小时后从回收的培养上清液中，利用rProteinA sepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，按照说明书将表达的人源化H0L0抗体及其点突变改变抗体进行纯化。
(1-1)人源化H0L0抗体Tm值的改变
按照以一定程序化的加热速度加热受试试样溶液后，将所得的温度记录图(Cp对T)中的变性峰的顶点确定热变性中间温度(Tm)。如下所述地进行DSC测定用试样溶液的制作，由此测定人源化H0L0抗体的Tm值。首先，以含有150mmol/l氯化钠的20mol/l乙酸钠缓冲溶液(pH为6.0)为透析外液，相对于该透析外液将被封入透析膜中的相当于50-100μg量的抗体溶液透析一昼夜。之后，使用试样溶液作为DSC测定用试样溶液，所述试样溶液是利用透析外液将其抗体浓度调制为50-100μg/ml而得到的。
将合适的DSC装置例如DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation)优选用于上述实验。将利用上述方法制作得到的试样溶液及对照溶液(透析外液)充分脱气后，将各受试样品封入热量计单元中，在40℃下进行充分的热平衡化。然后，在40℃～100℃下以约1K/分钟的扫描速度进行DSC扫描。该测定结果以作为温度函数的变性峰顶点的形式表示。参考非专利文献(Rodolfo等，Immunology Letters(1999)，47-52)进行Fab区的峰归属，算出人源化H0L0抗体的热变性中间温度。
基于通过上述方法进行的计算，含有序列号3表示的H链及序列号4表示的L链的人源化H0L0抗体的Tm值为76.6℃，但作为现有抗体举出的Synagis及Herceptin的Tm值分别计量为85.4℃及81.8℃。因此，可知人源化H0L0抗体的Tm值低于现有抗体的Tm值。
因此，以提高上述Tm值为目的，制作人源化H0L0抗体的改变抗体。对于序列号3表示的人源化H0L0抗体H链的FR2进行V37I、A40P、M48I、L51I的改变制作H15(序列号34)，即，将上述VH1b亚类改为VH4亚类。其Tm值被改善为79.1℃。对于序列号4表示的人源化H0L0抗体L链的FR2进行将VK2亚类改变为VK3亚类的L42Q、S48A、Q50R的改变，及将FR1的V2取代为作为生殖系细胞序列I的V2I的改变，从而制作L4(序列号35)。各抗体Tm值的测定根据上述记载的方法进行。结果，测定H15L0及H0L4的Tm值分别为79.2℃及77.2℃，与H0L0的Tm值76.6℃相比进一步得到改善。将上述两种改变体组合得到的H15L4抗体的Tm值被改善为80.5℃。
(1-2)人源化H0L0抗体pI值的改变
通过减少抗体所具有的pI值，延长抗体的血浆中半衰期。由此，制作pI值减少的人源化H0L0抗体的改变抗体，验证是否能获得高的肿瘤抑制效果。
各抗体的pI值基于利用等电点电泳进行的分析而算出。该电泳如下进行。利用盒式快速电泳系统(PhastSystem Cassette)(Amercham Bioscience公司制)，使用具有以下组成的膨润液将Phast-Gel Dry IEF(Amercham Bioscience)凝胶膨润60分钟左右。
(a)高pI用膨润液的组成：
1.5ml 10％ 丙三醇
100μl Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amercham Bioscience)
(b)低pI用膨润液的组成：
1.5ml精制水
20μl Pharmalyte 8-10.5 for IEF(Amercham Bioscience)
80μl Pharmalyte 5-8 for IEF(Amercham Bioscience)
将约0.5μg抗体用于膨润后的凝胶，通过使用根据以下程序控制的快速电泳系统(Amercham Bioscience)，进行等电点电泳。在下述程序中的步骤2阶段中将样品添加到凝胶中。作为pI标志物，可以使用pI校正用试剂盒(Calibration Kit for pI)(Amercham Bioscience)。
步骤1：2000V、2.5mA、3.5W、15℃、75Vh
步骤2：200V、2.5mA、3.5W、15℃、15Vh
步骤3：2000V、2.5mA、3.5W、15℃、410Vh
电泳后用20％TCA对凝胶进行固定化后，使用蛋白银染色试剂盒(Silver staining Kit，protein)(Amercham Bioscience)根据附在试剂盒中的说明进行银染色。染色后以pI标志物所具有的已知等电点为基准，算出作为受试试样的各抗体的等电点。
制作Hspd1.8(Hd1.8)(序列号27)，其中对H15进一步进行了K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D的改变。制作Lspd1.6(Ld1.6)(序列号29)，其中进行了下述改变，即，在L4中进行了Q27E的改变、将构成L4的FR3的序列79-84即KISRVE改变为TISSLQ、和S25A的改变。由Hspd1.8(Hd1.8)及Lspd1.6(Ld1.6)组成的抗体即Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)的pI值经计算为7.4。由于人源化H0L0抗体的pI值为8.9，所以Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体的pI值减少1.5。
(2)利用竞争性ELISA对人源化H0L0抗体的点突变改变抗体的结合活性的评价
利用竞争性ELISA对(1)中纯化得到的人源化H0L0抗体及其点突变改变抗体进行评价。将制作得到的1μg/ml可溶型GPC3核心多肽(序列号36)加入到96孔板中，使每1个孔为100μl。将该板在4℃下静置一夜，将可溶型GPC3核心多肽固相化在该板上。利用Skan WASHER400(Molecular Devices)将固相化在该板上的可溶型GPC3核心多肽用清洗缓冲液清洗3次，加入200μl封闭缓冲液，在4℃下进行封闭30分钟以上。然后，利用Skan WASHER400，将该可溶型GPC3核心多肽经固相化且被封闭的板用清洗缓冲液清洗3次。之后，将各种浓度的人源化H0L0抗体或其点突变改变抗体与最终浓度为0.3μg/ml的被生物素化的人源化H0L0抗体各100μl进行混合，将混合得到的200μl混合液加入到板的每个孔中。人源化H0L0抗体的生物素化利用生物素标记试剂盒(Roche)按照试剂盒说明书进行。将该板在室温下静置1小时后，利用Skan WASHER400(Molecular Devices)用清洗缓冲液清洗5次。向每1个孔中加入了用基质缓冲液稀释至20,000倍的100μl碱性磷酸酯酶标记山羊抗链霉亲和素(Goat anti streptabidin Alkaline phosphatase)(ZYMED)，将该板在室温下静置1小时后，利用Skan WASHER400将其用清洗缓冲液清洗5次。使用基质缓冲液制备磷酸酯酶基质(Sigma)使之为1mg/ml，在每1个孔中加入100μl静置1小时。利用Benchmark Plus(BIO-RAD)，采用655nm的对照吸光度，测定各孔中的反应液在405nm处的吸光度。
H15L4抗体及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体对抗原的结合活性与用于改变的人源化H0L0抗体的结合活性基本等同。
参考实施例4
(1)点突变pI改变抗体的制作中使用的用于降低pI的改变位点的选定
为了进一步提高Hd1.8Ld1.6抗体的肿瘤抑制效果，对可以降低可变区pI的改变位点进行研究。结果发现可以降低可变区pI的氨基酸残基。上述改变中，作为pI降低的具体例，可以举出pH7pL 16抗体。pH7pL16抗体的制作如下所述地进行。
改变部位的制作通过采用PCR的Assemble PCR进行。合成寡DNA，所述寡DNA是基于含有改变部位的正义链及反义链的序列设计得到的。将含有改变部位的反义链寡DNA和插入进行改变的基因的载体的正义链寡DNA、含有改变部位的正义链寡DNA和插入进行改变的基因的载体的反义链寡DNA分别进行组合，使用PrimeSTAR(TAKARA)进行PCR，由此使片段5’末端和3’末端均含有改变部位。通过将上述2个片段用Assemble PCR进行连结，制作各突变体。
将制作得到的突变体插入动物细胞中可以表达插入基因的表达载体中，得到的表达载体的碱基序列可以采用本领域技术人员公知的方法确定。基于质粒DNA的碱基序列的确定，确认为导入了点突变，将该点突变基因克隆到动物细胞中可以表达插入基因的表达载体中。抗体的表达、纯化等方法使用实施例1记载的方法或基于上述方法的方法进行。
使用Hd1.8(Hd1.8)作为起始物质，将存在于Hd1.8(Hd1.8)CDR2中的基于kabat编号的第61号谷氨酰胺(Q)取代为谷氨酸(E)，制作pH7(序列号31)。使用Ld1.6作为起始物质，将存在于Ld1.6 CDR1中的基于kabat编号的第24号精氨酸(R)取代为谷氨酰胺(Q)，将存在于FR2及FR3中的第37号谷氨酰胺(Q)取代为亮氨酸(L)、第43号丙氨酸(A)取代为丝氨酸(S)、第45号精氨酸(R)取代为谷氨酰胺(Q)、第74号苏氨酸(T)取代为赖氨酸(K)、第77号丝氨酸(S)取代为精氨酸(R)、第78号亮氨酸(L)取代为缬氨酸(V)、第79号谷氨酰胺(Q)取代为谷氨酸(E)，制作pL14；进而，将存在于pL14的FR4中的基于kabat编号的第104号亮氨酸(L)取代为缬氨酸(V)、第107号赖氨酸(K)取代为谷氨酸(E)，制作pL16(序列号29)。
(2)点突变pI改变抗体的pI值的测定
根据参考实施例3中记载的或基于参考实施例3的方法，通过使用PhastGel IEF 4-6.5(GE Healthcase)的电泳，测定Hd1.8Ld1.6抗体及pH7pL16抗体的pI值。测定Hd1.8Ld1.6抗体及pH7pL16抗体的pI值分别为7.47及6.52，可知pH7pL16抗体的pI值比Hd1.8Ld1.6抗体的pI值减少0.95。
(3)点突变pI改变抗体的Tm值的测定
基于参考实施例3中记载的方法，使用VP-DSC(Micro Cal)测定由Hd1.8Ld1.6抗体及pH7pL16抗体得到的Fab的Tm值。此时，使用PBS作为透析外液。另外，制备抗体浓度为25-100μg/ml的溶液，作为DSC测定用试样溶液。DSC扫描设定为在20℃～115℃下扫描速度约4K/分钟，通过该DSC扫描测定对照溶液(透析外液)及DSC测定用试样溶液。测定Hd1.8Ld1.6抗体及pH7pL16抗体的Fab热变性中间温度分别为77.5℃及74.7℃。
(4)利用竞争性ELISA进行的点突变pI改变抗体对抗原的结合活性的评价
用参考实施例3中记载的方法，测定各点突变pI改变抗体对作为抗原的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合活性。表明pH7pL16抗体对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合活性与H0L0抗体基本等同。
实施例5
(1)并用人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂(索拉非尼)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的试验
6周龄的雄性CB-17SCID小鼠购自CLEA Japan Inc.。在即将肿瘤移植前，对小鼠腹腔内给与200μg的抗脱唾液酸GM1抗体(WAKO)，之后，皮下移植将5×105个HepG2细胞分散在50％基质胶(Becton Dickinson)中所得的分散物。在肿瘤体积达到250mm3的时刻，对小鼠进行分组，开始给药。将pH7pL16抗体用PBS(-)配制成适当浓度后进行静脉内给与，每周1次、共3周。索拉非尼是按照Organic Process Research & Development(2002)6，777-781中记载的方法合成得到的，将其混悬于含有10％乙醇、10％Cremophor EL的纯水中，进行口服给与，每周5次、共3周。作为载体对照，使用含有PBS(-)、10％乙醇，10％Cremophor EL的纯水。肿瘤体积V(mm3)根据实施例1中记载的计算式算出。
(2)并用人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂(索拉非尼)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的效果
图5为表示基于肿瘤体积变化(平均+标准偏差)的、pH7pL16抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。白色圆形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。黑色圆形表示以1mg/kg的用量仅给与pH7pL16抗体的组的肿瘤体积的变化。白色四边形表示以80mg/kg的用量仅给与索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。黑色四边形表示分别以1mg/kg及80mg/kg的用量并用给与pH7pL16抗体和索拉非尼的组的肿瘤体积的变化。图中的星号表示基于Dunnett’s test，P值为P＜0.05。图6为表示基于模型的体重变化的(平均±标准偏差)、pH7pL16抗体及索拉非尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型体重减少的效果的曲线图。白色圆形表示给与载体的组的体重的变化。黑色圆形表示以1mg/kg的用量仅给与pH7pL16抗体的组的体重的变化。白色四边形表示以80mg/kg的用量仅给与索拉非尼的组的体重的变化。黑色四边形表示分别以1mg/kg及80mg/kg的用量并用给与pH7pL16抗体和索拉非尼的组的体重的变化。图中的星号表示基于Dunnett’s test，P值为P＜0.05。
结果，在HepG2xenograft模型中，并用给与1mg/kg pH7pL16抗体和最大耐用量即80mg/kg的索拉非尼的组中，以最后测定日(即47天的时刻)的肿瘤体积表示肿瘤增殖抑制效果，该肿瘤增殖抑制效果明显强于分别单独给与的组中的肿瘤增殖抑制效果(图5)。另外，在该模型中观察到伴随肿瘤增殖的体重减少，单独给与索拉非尼时，其体重减少亢进。另一方面，表明并用给与索拉非尼和pH7pL16时，与索拉非尼单独给与组相比，不仅药效增强，体重减少也显著地轻减(图6)。
实施例6
(1)并用人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂(舒尼替尼)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的试验
6周龄的雄性CB-17SCID小鼠购自CLEA Japan Inc.。在即将肿瘤前，对小鼠腹腔内给与200μg的抗脱唾液酸GM1抗体(WAKO)，之后，皮下移植将5×105个HepG2细胞分散在50％基质胶(Becton Dickinson)中所得的分散物。在肿瘤体积达到250mm3的时刻，对小鼠进行分组，开始给药。将人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(hGC33、WO2006006693)用PBS(-)配制成适当浓度后进行静脉内给与，每周1次、共3周。将购自Sequoia Research Products的舒尼替尼(产品编号：SRP01785S)，混悬于含有10％乙醇、10％Cremophor EL的纯水中，进行口服给与，每周5次、共3周。作为载体对照，使用含有PBS(-)、10％乙醇，10％Cremophor EL的纯水。肿瘤体积V(mm3)根据实施例1中记载的计算式算出。
(2)并用人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂(舒尼替尼)对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的效果
图7为表示基于肿瘤体积变化(平均+标准偏差)的、hGC33抗体及舒尼替尼对人肝癌细胞株HepG2细胞移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。白色圆形表示给与载体的组的肿瘤体积的变化。黑色圆形表示以1mg/kg的用量仅给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的变化。白色四边形表示以80mg/kg的用量仅给与舒尼替尼的组的肿瘤体积的变化。黑色四边形表示分别以1mg/kg及80mg/kg的用量并用给与hGC33抗体和舒尼替尼的组的肿瘤体积的变化。图中的星号表示基于Dunnett’s test，P值为P＜0.05。
结果，在HepG2xenograft模型中，并用给与1mg/kg hGC33抗体和最大耐用量即80mg/kg的舒尼替尼的组中，以最后测定日(即，53天的时刻)的肿瘤体积表示肿瘤增殖抑制效果，该肿瘤增殖抑制效果明显强于分别单独给与的组中的肿瘤增殖抑制效果(图7)。
产业上的可利用性
本发明提供用于治疗患有肝癌的患者的在医疗业、药业等中使用的治疗剂、治疗方法、治疗剂的制备方法、治疗剂的使用方法。
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Claims (116)

1.一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物是组合化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体而形成的。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为配合剂。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，并用化疗剂及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，同时或依次给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，分别给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
6.一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分且与化疗剂并用。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
9.一种用于治疗或预防肝癌的药物组合物，所述药物组合物含有化疗剂作为有效成分且与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并用。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，同时给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，在给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体之前或在给与之后，给与化疗剂。
12.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
14.如权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
15.如权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
16.如权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为具有细胞毒性的抗体。
17.如权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
18.如权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
19.如权利要求1至16或18中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
20.如权利要求1至16或18中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
21.如权利要求1至16或18中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
22.如权利要求1至21中任一项所述的药物组合物，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
24.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
26.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
27.一种副作用降低剂，用于降低化疗剂治疗肝癌而产生的副作用，其中含有治疗用抗体作为有效成分。
28.如权利要求27所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
29.如权利要求27或28所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
30.如权利要求28或29所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
31.如权利要求28或29所述的副作用降低剂，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
32.如权利要求27至31中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，副作用为体重减少。
33.如权利要求27至32中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，治疗用抗体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
34.如权利要求33所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为具有细胞毒性的抗体。
35.如权利要求33或34所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2，及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
36.如权利要求33至35中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
37.如权利要求33、34或36中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2，及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
38.如权利要求33、34或36中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
39.如权利要求33、34或36中任一项所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
40.权利要求33至39中任一项所述的副作用降低剂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
41.如权利要求40所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
42.如权利要求40所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
43.如权利要求40所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
44.如权利要求40所述的副作用降低剂，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
45.一种用于增强化疗剂的肝癌治疗效果的药物组合物，所述药物组合物含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
47.如权利要求45所述的药物组合物，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
48.如权利要求45至47中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
50.如权利要求45至49中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
51.如权利要求45至49中任一项所述的药物组合物，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
52.如权利要求45至51中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
53.如权利要求45至52中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
54.如权利要求45至53中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
55.如权利要求45至52或54中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
56.如权利要求45至52或54中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
57.如权利要求45至52或54中任一项所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
58.如权利要求45至57中任一项所述的药物组合物，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
59.如权利要求58所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
60.如权利要求58所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
61.如权利要求58所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
62.如权利要求58所述的药物组合物，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
63.一种治疗或预防受试者体内肝癌的方法，所述方法包括将有效量的化疗剂及有效量的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体组合、给与受试者。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，同时或依次给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，分别给与化疗剂和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
66.如权利要求63至65中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
68.如权利要求66或67所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
69.如权利要求66或67所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
70.如权利要求63至69中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
71.如权利要求63至70中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
72.如权利要求63至71中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
73.如权利要求63至70或72中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
74.如权利要求63至70或72中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
75.如权利要求63至70或72中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
76.如权利要求63至75中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
78.如权利要求76所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
79.如权利要求76所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
80.如权利要求76所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
81.一种降低受试者因利用化疗剂治疗肝癌而产生的副作用的方法，所述方法包括给与受试者有效量的治疗用抗体。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
83.如权利要求81或82所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
84.如权利要求82或83所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
85.如权利要求82或83所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
86.如权利要求81至85中任一项所述的方法，其特征在于，副作用为体重减少。
87.如权利要求81至86中任一项所述的方法，其特征在于，治疗用抗体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
88.如权利要求87所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
89.如权利要求87或88所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
90.如权利要求87至89中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
91.如权利要求87、88或90中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
92.如权利要求87、88或90中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
93.如权利要求87、88或90中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
94.如权利要求87至93中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
96.如权利要求94所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
97.如权利要求94所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号29表示的氨基酸序列。
98.如权利要求94所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号31表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号33表示的氨基酸序列。
99.一种在受试者体内增强化疗剂的肝癌治疗效果的方法，所述方法包括给与受试者有效量的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
100.如权利要求99所述的方法，其特征在于，同时给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和化疗剂。
101.如权利要求99所述的方法，其特征在于，在给与化疗剂之前或在给与之后，给与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
102.如权利要求99至101中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为激酶抑制剂。
103.如权利要求102所述的方法，其特征在于，化疗剂为多激酶抑制剂。
104.如权利要求99至103中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为索拉非尼(BAY43-9006)。
105.如权利要求99至103中任一项所述的方法，其特征在于，化疗剂为舒尼替尼。
106.如权利要求99至105中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是具有细胞毒性的抗体。
107.如权利要求99至106中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号8表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
108.如权利要求99至107中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是可以与第2抗体能够结合的表位相结合的抗体，所述第2抗体是包含H链可变区及L链可变区的抗体，所述H链可变区具有分别包含序列号5、6及7表示的氨基酸序列的CDR1、2及3，所述L链可变区具有分别包含序列号8、24及25表示的氨基酸序列的CDR1、2及3。
109.如权利要求99至106或108中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号6表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号9至23中任一个表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
110.如权利要求99至106或108中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号26表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号28表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
111.如权利要求99至106或108中任一项所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区具有包含序列号5表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号30表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号7表示的氨基酸序列的CDR3；
所述L链可变区具有包含序列号32表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列号24表示的氨基酸序列的CDR2、及包含序列号25表示的氨基酸序列的CDR3。
112.如权利要求99至111中任一项所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
113.如权利要求112所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列。
114.如权利要求112所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号3表示的氨基酸序列；
所述L链可变区包含序列号4表示的氨基酸序列中的第34号Gly被不同的氨基酸取代的氨基酸序列。
115.如权利要求112所述的方法，其特征在于，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含H链可变区和L链可变区的抗体，
所述H链可变区包含序列号27表示的氨基酸序列；
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