WO2009119971A2 - 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 - Google Patents

생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 Download PDF

Info

Publication number
WO2009119971A2
WO2009119971A2 PCT/KR2009/000285 KR2009000285W WO2009119971A2 WO 2009119971 A2 WO2009119971 A2 WO 2009119971A2 KR 2009000285 W KR2009000285 W KR 2009000285W WO 2009119971 A2 WO2009119971 A2 WO 2009119971A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reaction
reaction chamber
substrate
fluid
electrode
Prior art date
Application number
PCT/KR2009/000285
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2009119971A3 (ko
Inventor
이재훈
Original Assignee
디지탈 지노믹스(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디지탈 지노믹스(주) filed Critical 디지탈 지노믹스(주)
Priority to EP09724909A priority Critical patent/EP2273263B1/en
Priority to CN2009801108754A priority patent/CN101981445B/zh
Priority to US12/922,934 priority patent/US8354307B2/en
Priority to JP2010549557A priority patent/JP5371061B2/ja
Publication of WO2009119971A2 publication Critical patent/WO2009119971A2/ko
Publication of WO2009119971A3 publication Critical patent/WO2009119971A3/ko
Priority to US13/708,236 priority patent/US9005545B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다. 본 발명에서는 검출대상 시료의 반응은 일반적인 반응용액 하에서 수행하되, 반응 전에 반응 챔버 내에 물과 같은 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하고, 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정한 후, 반응 전후의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교함으로써 검출대상 시료 내에 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인하는 방식을 채택한다.

Description

생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩
본 발명은 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 센싱 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내에서 센싱 전극에 고정된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응에 따른 전기적 특성 변화, 즉 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
바이오 칩은 유전자 정보 및 단백질 정보를 대량으로 그리고 자동화하여 분석할 수 있거나, 생리활성물질의 존재여부 및 기능을 비교적 간단하고 신속하게 분석할 수 있는 장치이다. 이러한 바이오 칩은 유전자 및 단백질 연구분야, 의약분야, 농업, 식품, 환경 및 화학산업 등 다양한 분야에서 응용이 활발하게 이루어지고 있다.
바이오칩은 프로브를 이용하여 특정 유전자의 존재여부를 체크하는 유전자형 DNA 칩(genotyping chip), 특정 질환 관련 유전자의 발현 양상을 체크하는 유전자발현양상 DNA 칩(expression chip) 그리고 혈액이나 소변과 같은 시료 내의 생리활성물질의 존재여부 및/반응여부를 체크하는 마이크로플루이딕스 칩(microfluidics chip)으로 크게 나뉜다. 현재 연구분야 및 의료 진단분야에서 보편적으로 상용화되어 사용되고 있는 것은 유전자형 DNA 칩이다.
일반적으로 마이크로어레이 칩이라 함은 수백에서 수만 종류의 유전자나 단백질을 마이크로어레이 장치를 이용하여 유리 기판 상에 일정 간격으로 찍어서 배열한 칩을 의미한다. 이중 프로브인 올리고뉴클레오티드를 유리 기판 상에 마이크로어레이하여 특정 유전자의 존재여부를 형광 스캐너로 확인하는 것이 DNA 칩이다.
DNA 칩은 연구용 분야와 진단 분야에서 활발히 활용되고 있는데, 유전자발현양상(gene expression profiling) 분야 및 유전자형(genotyping) 분야 등의 기술을 활용하여 세포 내 신진대사, 생리학적 현상 및 각 유전자들 간의 상호연관성 등 유전자기능을 밝혀내는데 활용되거나, 암과 같은 특정 질환의 발병기전 및 진행진단, 약물작용기전 규명, 질병 원인균의 유전자 정보확인 및 변이 색출 등과 같은 진단분야 등에서도 활용되고 있다.
진단용 DNA 칩 개발은 1994년 Affymetrix의 스티브 포더 박사가 개발한 HIV 유전자 칩의 상용화로부터 시장이 형성되기 시작했고, HIV, 류머티즘, 자기면역 질환, 만성 신장염, 동맥경화증, 아토피성 피부 및 알레르기 질환 등의 만성질환 등을 진단할 수 있는 진단용 DNA 칩 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 최근의 DNA 칩 분야의 연구는 연구용 칩 보다는 진단용 칩으로 연구개발 방향이 움직이고 있고, 유전자형, 병원균 또는 바이러스의 진단 분야에만 적용이 가능한 유전자형(genotyping) 칩에서 암, 백혈병 등 다양한 질병의 진단이 가능한 유전자발현양상(expression) 칩 분야에 대한 접근이 이루어지고 있다.
또한, 최근에는 IT 및 나노기술과 접목하여 1개의 칩으로 여러 질병을 동시에 감지하고 각자의 유전정보로부터 발병 가능성까지 예측할 수 있게 해주는 마이크로플루이딕스 칩(Lab-on-a-chip) 기술이 주목을 받고 있다. 생체 바이오 칩이라고도 불리는 마이크로플루이딕스 칩은 미량의 분석대상물질(DNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등)을 칩 내의 챔버로 흘려보내면서 칩 내의 각종 생리활성물질의 반응양상을 분석하는 칩이다. 이러한 생체 바이오 칩은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 반응에 따른 전기적 특성의 변화를 칩 내에 설치된 전극이 감지하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출한다.
이러한 생체 바이오 칩은 전술한 DNA 칩에 비해 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인할 수 있기 때문에 의료진단분야에서 활용도가 높다.
예를 들어, 자궁경부암의 발생 원인 바이러스인 HPV 양성 여부의 진단을 위한 HPV DNA 칩은 HPV 프로브 올리고뉴클레오티드를 준비하고 이를 유리 기판 상에 마이크로어레이한 것이지만, 자궁경부암 의심군으로부터 채취한 시료를 바로 적용해서는 HPV 양성 여부의 진단이 불가능하다. 즉, 형광이 표지된 HPV 바이러스 유전자의 프라이머를 별도로 준비하고 채취된 시료를 PCR 증폭시킨 후 HPV DNA 칩에 뿌려주고 형광의 발광여부를 형광 스캐너로 확인해야 한다. 따라서, DNA 칩을 이용한 하이브리드 확인 방식(레이저유발형광법; laser-induced fluorescence)은 조작상 번거롭고 시간이 소요되는 작업으로서, 형광물질로 시료 DNA를 표지할 때 고비용이 소용되고, 고가의 형광 스캐너의 사용과 이로 인해 휴대가 불가능하다는 점 등 여러 가지 문제점과 단점을 가지고 있다.
이에 비해 생체 바이오 칩은 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인할 수 있다. 즉, 생체 바이오 칩은 형광이 아닌 전기적 신호를 이용하여 하이브리드 형성 여부 내지는 생리활성물질(예를 들어, DNA)의 존재 및 반응 여부를 검출할 수 있다. 즉, 생체 바이오 칩에서는 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 측정하거나 칩 챔버 내에서 생리활성물질들 간의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 전극이 감지하여 이를 전기적으로 검출하는 방식을 이용하고 있다.
예를 들어, PCR 과정에서 dNTP는 dNMP와 디포스페이트로 분해됨과 동시에 dNMP는 주형 DNA 서열에 상보적인 프라이머에 중합되어 DNA가 합성되고, DNA의 농도의 증가에 따라 PCR 반응용액 내의 임피던스는 증가하는 것으로 알려져 있다(한국공개특허공보 제10-2004-0042021호 참조). 따라서, PCR 반응 챔버를 바이오칩 형태로 제작하고 이러한 바이오칩에 제공된 전극에 의해 반응 용액 내의 임피던스 변화를 전기적으로 검출하면 PCR 반응의 유무 및 특정 DNA 염기서열의 존재 유무를 판단할 수 있게 된다.
또한, 바이오 칩의 전극에 프라이머나 프로브와 같은 올리고뉴클레오티드를 고정하고 PCR 반응이나 혼성화 반응을 진행시킨 후 올리고뉴클레오티드가 고정된 전극에서의 커패시턴스 변화 또는 임피던스 변화를 측정하면 PCR 반응이나 혼성화 반응 유무 및/또는 타겟 염기서열의 존재를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있게 된다.
일반적으로 바이오 칩에서는 생리활성물질과 다른 반응물질(예를 들어, 전극에 고정된 수용체)의 반응에 따른 임피던스의 변화를 바이오 칩에 제공된 전극이 감지하여 반응 유무 및 특정 생리활성물질의 존재 여부를 판단하는 방식을 채택하고 있다고 할 수 있다. 따라서, 바이오칩의 신뢰성을 확보하기 위해서는 전극에서 임피던스값 변화의 정밀한 감지가 중요하다. 일반적으로 임피던스(Z)는 실수부인 저항(R)과, 허수부인 리액턴스(X)의 합으로 표시되고(하기 수학식 1 참조), 그 크기는 저항값(R)과 리액턴스값(X)의 제곱근에 해당된다(하기 수학식 2 참조).
[수학식 1]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000001
[수학식 2]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000002
따라서, 임피던스(Z)는 리액턴스(X)와 상관관계를 갖게 된다. 또한, 리액턴스(X)는 ωL-1/ωC이므로 커패시턴스(C)와 상관관계를 갖는다. 따라서, 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 의한 커패시턴스(C)값의 변화는 임피던스값의 변화로 반영되고, 이를 측정함으로써 생리활성물질의 반응여부 및/또는 존재여부를 체크할 수 있다. 결국, 바이오칩에서 커패시턴스값의 변화는 임피던스값의 변화를 유도하고 이는 바이오칩의 검출감도에 영향을 줌을 알 수 있다.
그런데, 생리활성물질과 다른 반응물질(예를 들어, 전극에 고정된 수용체)의 반응에 따른 임피던스의 변화는 2가지 커패시턴스값에 의해 영향을 받을 수 있다. 즉, 바이오칩 내에서 전극에 의해 임피던스값의 변화를 측정할 경우 바이오 칩 내의 전체 커패시턴스 변화값(CT)은 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)과, 상기 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)과는 분리된 가상의 전극판과 다른 센싱 전극 간 커패시턴스값(Ct)을 포함하게 된다(하기 수학식 3 참조).
[수학식 3]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000003
통상, 바이오 칩에서 생리활성물질은 반응 챔버에 수용된 반응용액 하에서 반응이 진행되는데, 상기 반응용액은 일반적으로 완충용액이나 전해질을 포함하고 있다. 완충용액과 전해질은 이온을 포함하고 있기 때문에 바이오 칩의 센싱 전극 간의 도전성에 영향을 주게 된다. 그리고 이러한 완충용액 등의 센싱 전극 간 도전성에 대한 영향은 완충용액을 유전체로 하는 상기 가상의 전극판과 다른 센싱 전극 간 커패시턴스값(Ct)에 영향을 주고, 결국에는 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 영향을 준다.
한편, 하기 수학식 4에 정의된 바와 같이 커패시턴스는 전극 간 물질의 유전상수에 의해 의존하고 전극 간 물질의 유전상수가 작으면 커패시턴스는 작음을 알 수 있다.
[수학식 4]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000004
그런데, 전술한 완충용액과 같은 반응 용액은 이온 성분의 전도성으로 인해 유전상수가 작기 때문에 수학식 3의 전체 커패시턴스 변화값(CT)을 구성하는 성분인 1/Ct는 크게 된다. 따라서, 바이오 칩의 반응 챔버에 수용된 완충용액 환경 하에서 생리활성물질의 반응을 진행시키면 센싱 전극과 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)은 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 버리게 된다. 즉, 상기 수학식 3에서 알 수 있는 바와 같이, 완충 용액과 같은 이온을 포함하는 반응용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)의 역수값(1/Ct)이 크기 때문에 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)은 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 영향을 주지 못하게 된다. 따라서, 바이오칩의 센싱 전극에 의한 전기적 검출로는 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 판단할 수 없게 되는 문제가 발생한다.
이와 관련하여 도1에는 측정대상이 되는 특정 타겟 DNA 템플리트가 존재하는 경우에도 PCR 반응 전후에 있어서 주파수 변화에 대한 임피던스 변화 곡선이 동일한 것이 도시되어 있다. 만약, 종래기술의 바이오 칩이 생리활성물질인 특정 타겟 DNA 템플리트의 PCR 반응을 정밀하게 측정한다면 센싱 전극에 고정된 프라이머와 템플리트 ssDNA 간의 PCR 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)을 전기적으로 검출해야 할 것이다. 그리고, 이러한 PCR 반응에 의한 DNA 증폭 후 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)은 임피던스 변화로 반영되어야 하므로 PCR 반응 전후에 있어서 임피던스 변화 곡선의 패턴도 변화되는 것이 관찰되어야만 할 것이다.
그러나, 앞서 설명한 바와 같이 센싱 전극과 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)은 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 버리기 때문에 바이오칩 전극에 연결된 임피던스 측정장치에서 측정된 임피던스 변화곡선은 PCR 반응 전후에 있어서 변화가 없고 단일 곡선으로만 관찰된다(도1 참조). 따라서, 종래의 바이오 칩에서는 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 의해 묻히게 되어 전체 커패시턴스 변화값(CT)을 반영하는 2개의 임피던스 변화 곡선이 측정되지 않으므로 실제 생리활성분자의 반응여부 및/또는 존재여부를 감지하기가 어려운 문제점이 있었다.
이와 관련하여 미국특허공개 US2004/0110277호에는 바이오센서의 센서 셀의 전극에 프로브 DNA 부착되어 있고 이 프로브와 타겟 DNA와의 혼성화에 의해 커패시턴스가 변화하고 이에 의해 트랜지스트의 전류값이 변동하여 혼성화 반응을 센싱하는 방식이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같은 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 센싱 전극에 부착된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응이 전기적으로 검출되지 못하는 문제에 대해서는 주목하고 있지 않다.
또한, 미국특허공개 US2006/0226030호에는 기판, 전극 및 기판에 부착된 캐처 분자로 구성된 센서로서, 캐처 분자가 금속성 볼(다른 분석물질과는 다른 유전상수 지님)로 표지된 DNA 단일 사슬과 혼성화되면 혼성화 결과, 전극을 상기 표지가 둘러싸서 전극 임피던스의 커패시턴스 부분이 변화하고 이를 측정함으로써 혼성화 반응을 센싱하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 이 역시 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 실제 반응에 따른 전기적 특성 변화를 민감하게 체크하지 못하는 문제에 대해서 주목하고 있지 않다.
그 밖에 종래기술은 바이오 칩의 센싱 민감도 향상을 위해서 IDE에서 센서 전극의 폭을 줄여 센싱 민감도를 향상시키는 방식을 개시하고 있을 뿐, 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 커패시턴스 변화 및 임피던스 변화를 민감하게 감지하지 못하는 문제에 대해서는 인식하고 있지 않다.
따라서, 종래의 바이오칩 및 이를 이용하여 생리활성물질의 반응여부 및/또는 존재여부를 확인하는 방법은 개선되어야 할 문제점이 있었다.
이에 본 발명의 발명자들은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극 표면에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영하도록 한 생리활성물질을 검출하는 방법 및 바이오칩을 고안하기에 이르렀다.
본 발명은 전술한 바와 같은 종래기술에 있어서 바이오 센서 전극에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화를 민감하게 감지하지 못하는 문제를 해결하는데 그 목적이 있는 발명으로서, 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 및/또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 센싱 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극 표면에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영하도록 한 생리활성물질을 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩을 제공하는 그 목적이 있다.
전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해서는 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않도록 할 필요가 있다. 이를 위해 1/Ct값을 작게, 즉 Ct값을 크게 할 필요가 있다.
그런데, 전술한 바와 같이 커패시턴스는 상기 수학식 4와 같이 정의된다. 따라서, Ct를 크게 하는 위해서는 전극의 면적을 크게 하거나, 전극 간 간격을 좁게 하거나, 또는 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하는 방법이 있다.
종래 기술은 전술한 바와 같이 바이오 칩의 IDE에서 센서 전극의 폭을 줄여Ct를 크게 함으로써 센싱 민감도를 높이는 방식을 사용하고 있으나 전극의 폭을 줄이는 것은 고도의 미세전극형성 기술이 요구되어 비용 면이나 효율 면에서 바람직하지 못하다.
이러한 점을 감안하여 본 발명에서는 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수 ε(또는 유전율이라고도 함)를 크게 하는 방식을 채택하고 있다. 이러한 방법은 고도의 미세전극 형성기술을 요하지 않으면서도 전극 간 커패시턴스의 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영할 수 있다.
그런데, 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 사이에는 검출대상 시료의 반응을 위한 반응 용액이 채워진다. 따라서, 이러한 반응 용액의 유전 상수를 높이는 것이 필요하다. 그러나, 검출대상 시료의 반응을 위한 반응용액은 이온 성분에 의해 유전상수의 조정이 어렵다.
일반적으로, 유전상수는 전극 사이에 유전체로서 어떤 물질을 넣을 때의 정전 용량과 아무것도 넣지 않은 경우의 정전 용량의 비로 정의되는데, 일반적으로 유전체의 유전율은 항상 1보다 크다. 액체의 경우에는 물이 유전상수가 가장 큰 것으로 알려져 있는데 실온에서 유전상수는 대략 80 정도로 알려져 있다. 그러나, 검출대상 시료의 반응을 위해서는 증류수나 탈이온수와 같은 물을 반응용액으로 직접 사용할 수 없다.
따라서, 본 발명에서는 검출대상 시료의 반응은 일반적인 반응용액 하에서 수행하되, 반응 전에 반응 챔버 내에 물과 같은 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하고, 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정한 후, 반응 전후의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교함으로써 검출대상 시료 내에 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인하는 방식을 채택한다.
구체적으로, 본 발명의 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법은, (a) 검출대상 시료가 수용되는 반응 챔버와, 상기 반응 챔버 내에 위치하고 상기 검출대상 시료 내의 생리활성물질의 검출을 위한 복수개의 센싱 전극을 구비하는 전기적 검출장치를 제공하는 단계와, (b) 상기 반응 챔버 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와, (c) 상기 반응 챔버로부터 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 제거한 후, 상기 반응 챔버 내에 반응용액 및 검출대상 시료를 제공하는 단계와, (d) 상기 반응용액 하에서 상기 검출대상 시료를 상기 반응 챔버 내에서 반응시키는 단계와, (e) 상기 반응용액을 상기 반응 챔버로부터 제거하는 단계와, (f) 상기 반응 챔버 내로 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와, (g) 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값과 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계 및 (f)단계에서는 교류전원을 이용하는 측정장치에 의해 각각의 주파수별로 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정할 수 있다. 이 경우, 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값은 주파수값에 대한 곡선으로 표현될 수 있다. 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선이 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선과 구분되는 경우 상기 검출대상 시료 내에 생리활성물질이 존재하거나 생리활성물질이 센싱 전극과 반응하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 유전상수가 약 4 이상인 유체인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 유전상수가 약 80 이상인 것이 바람직하다. 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체의 예로는 증류수 또는 탈이온수(deionized water)를 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 전술한 바와 같이 유전상수가 약 4이상인 유체이면 적용가능하다.
본 발명의 일실시예에서 있어서, 상기 센싱 전극은 금, 크롬, 구리 또는 알루미늄으로 형성하는 것이 바람직하다. 상기 센싱 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되고, 각 전극 사이의 간격은 대략 1-20μm일 수 있고, 대략 1-4μm인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서 있어서, 상기 복수개의 센싱 전극에는 상기 생리활성물질과 상호작용을 하는 수용체가 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 "생리활성물질(biomolecule)"은 상기 센싱 전극에 결합된 수용체와 상호작용을 하는 물질로서, 하나 내지 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 하나 내지 그 이상의 펩타이드로 구성된 단백질, 아미노산, 당 지질, 또는 저분자 화합물이고, 바람직하게는 항원, DNA, RNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, "수용체"는 상기 센싱 전극에 결합되어 생리활성물질과 상호작용을 하는 물질로서, 하나 내지 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 하나 내지 그 이상의 펩타이드로 구성된 단백질, 아미노산, 당 지질, 또는 저분자 화합물이고, 바람직하게는 항체, 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에서 상기 수용체는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 상기 생리활성물질은 핵산이며, 상기 반응용액은 핵산 혼성화(nucleic acid hybridization) 반응 용액인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서 상기 수용체는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 생리활성물질은 핵산이며, 상기 반응용액은 PCR 반응 용액인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 사용되는 바이오 칩은 단일 기판 형태로 형성될 수 있으나, 두 개의 기판이 접합된 형태일 수도 있다. 이러한 본 발명의 일실시예의 바이오 칩의 예로서 DNA 혼성화 칩 또는 PCR 반응 칩을 들 수 있다.
두 개의 기판이 접합된 형태의 본 발명의 바이오 칩의 일실시예는, 생리활성물질과 상호작용하는 수용체가 결합되어 있는 복수개의 센싱 전극이 형성된 제1기판과, 상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함한다.
상기 제1기판은 N형 또는 P형 실리콘 기판 상의 SiO2 절연층 위에 복수개의 센성 전극이 형성된 것으로서 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부의 확인을 위한 전기적인 검출을 수행한다. 상기 제2기판은 상기 제1기판의 센싱 전극이 외부 환경과 접촉되는 것을 방지하면서 상기 제1기판과 결합하여 반응챔버 공간을 형성한다.
상기 반응챔버는 유전상수가 큰 레퍼런스 유체가 채워진 후 전극 간 임피던스 및/또는 커패시턴스가 측정되는 공간이다. 또한, 상기 반응챔버는 반응용액 및 검출대상 시료가 채워진 후, 검출대상 시료 내에 존재하는 생리활성물질의 반응이 수행되는 공간이다. 상기 센싱 전극에 수용체가 부착되어 있는 경우에는 상기 반응 챔버 내의 생리활성물질과 상기 수용체가 반응하고 이러한 반응 결과로 전극 간 임피던스 및/또는 커패시턴스의 변화가 일어나게 된다.
상기 기판들은 적용되는 수용체의 종류 및 수, 예를 들어 프로브 또는 프라이머의 종류 및 수 등에 따라 다양한 사이즈를 가질 수 있다. 또한, 상기 기판들은 정사각형, 직사각형, 원형의 형상을 가질 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제1기판은 실리콘 기판이고, 상기 제2기판은 유리 기판인 것이 바람직하나, 이들 기판은 이외에도 유리, 실리콘 기판, 융합 실리카, 폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카보네이트, 금, 은, 구리, 또는 백금 중 어느 하나로 구성될 수 있다.
또한, 상기 반응 챔버 공간을 형성하는 상기 제2기판에는 상기 제2기판의 두께 방향으로 유체 유입구가 관통되어 형성되어 있으며, 상기 유체 유입구에 대향하는 위치에 상기 제2기판의 두께 방향으로 유출구가 관통되어 형성되어 있다. 상기 유입구와 상기 반응챔버, 그리고 상기 유출구와 상기 반응챔버는 유체가 유동될 수 있도록 연통된다. 상기 유입구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유출된다.
또한, 상기 제2기판 상에는 제3기판이 적층되어 상기 유입구로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널과, 상기 유출구로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널이 형성될 수 있다. 유입 마이크로 채널에는 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있고, 유출 마이크로 채널에는 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있다.
또한, 상기 유입 마이크로 채널 및/또는 유출 마이크로 채널에는 반응 챔버 내로의 유체의 유입 및 반응 챔버로부터 유체의 유출을 제한할 수 있는 밸브 구조가 제공될 수 있다. 상기 밸브구조는 상기 주입구와 상기 반응챔버 사이에서, 또는 상기 배출구와 상기 반응챔버 사이에서 상기 제3기판의 두께 방향으로 관통된 후 연장된 통로로서 연장된 통로에는 오일이 내장되어 있다. 이러한 밸브구조의 통로에 질소가스(N2)가 주입되면 통로에 내장된 오일이 팽창하고 오일의 팽창에 의해 상기 채널이 막히게 되어 주입구로부터 반응챔버로의 유체의 유입 그리고 반응챔버로부터 배출구로의 유체의 유출이 차단되게 되는 것이다. 상기 제3기판은 PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 형성되는 것이 바람직하다.
전술한 마이크로 채널과 밸브 구조는 당업계에서 널리 사용되고 있는 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-System) 기술을 이용하여 마이크론 단위 내지는 나노 단위로 형성하되, 수용체의 크기, 전극 크기, 또는 반응조건에 따라 채널과 밸브의 크기를 조정할 수 있다.
이러한 채널 구조와 밸브 구조는 전술한 본 발명의 방법에 있어서 반응 전에 는 반응 챔버 내에 유전상수가 큰 유체를 채워 넣는 과정, 반응시에는 반응 챔버에서 유전상수가 큰 유체를 제거하고 반응용액 및 검출대상시료를 채워넣는 과정, 그리고 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 유전상수가 큰 유체를 다시 채워 넣은 과정의 수행을 용이하게 한다. 이를 위해 유체, 반응용액 및 검출대상시료의 주입 및 제거를 위한 주입펌프 및 배출펌프가 본 발명의 바이오칩에 제공될 수 있고 펌프 구동수단으로서 소형모터나 기어박스가 제공될 수 있다.
한편, 상기 복수개의 센싱전극에는 임피던스측정기(Impedence analyzer)가 전기적으로 연결될 수 있다. 바이오 칩이 PCR 반응 칩인 경우에는 PCR 반응을 수행하는 PCR 기기에 바이오 칩이 수용되도록 구성하면 바이오 칩과 PCR 기기가 하나의 세트로서 구성이 가능하다. 이때 PCR 기기는 임피던스 측정 장치를 포함하는 것을 사용하고, 바이오 칩의 센싱 전극에 상기 내장된 임피던스 측정 장치를 전기적으로 연결하도록 세트로서 구성하면 바람직하다.
본 발명은 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되는 문제에도 불구하고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극에 부착된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응에 따른 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 전체 커패시턴스 변화량에 정확하게 반영되어 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도1은 종래의 PCR 반응 검출 방식을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
도2는 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩을 제조하는 공정을 설명하는 공정 순서도이다.
도3은 도2의 공정에 따라 제작된 DNA 혼성화 칩의 전극부분을 도시하는 평면도이다. 도3의 (a)는 DNA 혼성화 칩 전극 부분 전체를 도시하고 있고, 도3의 (b)는 도3의 (a)에 도시된 전극의 일부를 확대하여 모식적으로 도시하고 있으며, 도3의 (c)는 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)을 일부 확대하여 도시하고 있다.
도4는 도3의 (b)의 금속전극(20)을 A-A'선을 따라 절취한 횡단면도이다.
도5는 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩을 제조하는 공정을 설명하는 공정 순서도이다. 도5의 (A)는 PCR 반응 칩의 실리콘 기판을 제조하는 공정을 설명하고 있고, 도5의 (B)는 PCR 반응 칩의 유리 기판을 제조하는 공정을 설명하고 있으며, 도5의 (C)는 실리콘 기판과 유리 기판이 접합된 상태를 나타내는 도면이다.
도6은 PDMS 기반의 유체제어 기판이 부착된 PCR 반응 칩을 도시하는 단면도이다. 도6의 (A)는 유체제어 기판이 앞서 제작된 PCR 반응 칩의 유리기판 상에 부착된 것을 도시하고 있으며, 도6의 (B) 및 (C)는 유체제어 기판의 밸브 기능에 의해 PCR 반응 칩 내에서의 유체의 유동이 제어되는 과정을 설명하고 있다.
도7은 전극 어레이형 칩을 나타내는 도면이다.
도8은 본 발명의 DNA 혼성화 반응 검출 방법을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
도9는 본 발명의 PCR 반응 검출 방법을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: DNA 혼성화 칩의 제작
본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 있어서, 검출대상 생리활성물질이 DNA이고 센싱 전극에 결합되는 수용체가 올리고뉴클레오티드 프로브인 경우 생리활성물질인 DNA와 프로브의 혼성화 반응을 위한 DNA 혼성화 칩을 제작한다.
DNA 혼성화 칩 센서는 당업계에 알려진 일반적인 방법을 이용하여 제작하는데, 산화 실리콘 박막 형성 기술, 포토리소그래피(photolithography)기술, 노광 패너팅 기술, 현상 기술, 습식 및/또는 건식 에칭 기술 등을 사용하여 제작한다. 상세하게는 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 기판 상에 IDE(Interdigitated Electrode)형태의 센싱 금속 전극을 형성한 후, 올리고뉴클레오티드 프로브를 센싱 전극에 고정하는 방식으로 제작된다.
아래에서는 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩의 제조과정을 단계별로 설명한다.
실시예 1-1: 전극이 형성된 실리콘기판의 제작
이하에서는 도2를 참조하여 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩(100)의 기판(10)과 전극(20)을 형성하는 과정을 간략히 설명한다.
두께가 500μm인 N-형 실리콘 웨이퍼(10)를 열산화시켜 산화 절연막층인 약 10,000Å의 SiO2 층(12)을 형성하였다(도2의 (a)단계). 그런 다음, 상기 절연막층(12)을 포토레지스트 AZ 5214(14)로 도포하였다(도2의 (b)단계). 상기 포토레지스트(14) 상에 금속 전극 패턴의 마스크(미도시)를 올려놓고 자외선에 노광시킨 후 상기 실리콘 웨이퍼(10)를 AZ300MIF 현상액에 담가 현상하고 에칭처리하였다(도2의 (c)단계). 상기 에칭된 웨이퍼(10)상에 크롬(Cr)(300Å) 및 금(Au)(3000Å) 박막(20)을 증착시켰다(도2의 (d)단계). 상기 크롬 및 금 박막(20)의 증착은 화학기상증착(chemical vapor deposition; CVD), 진공 증착(vacuum evaporation) 또는 스퍼터링(sputtering)을 이용하여 수행하였다. 그런 다음, 알려진 리프트-오프(lift-off) 공정을 이용하여 남겨진 포토레지스트층(14)과 이 남겨진 포토레지스트층 상의 박막의 일부를 제거하여 금속 전극(20)을 형성하였다(도2의 (e)단계). 그리고, 금속 전극을 IDE 형태로 형성하기 위해 추가적으로 포토레지스트 AZ4620(16)을 도포하고 당업계에 잘 알려진 포토리소그래피 공정을 이용하여 미세한 IDE(Interdigitated Electrode) 형태로 전극(20)을 패터닝하였다(도2의 (f)단계).
완성된 DNA 혼성화 칩(100)은 도3에 도시된 바와 같다. 도3의 (a)에서 도시된 DNA 혼성화 칩(100)은 전극(20) 부분의 직경(R)이 대략 2.4mm이나, 전극 어레이형 DNA 혼성화 칩(도7 참조) 제작을 위해서는 가능한 직경이 작을 수록 좋다. 전극(20) 면적은 대략 3.6 mm2이다.
도3의 (b)는 도3의 (a)에 도시된 전극(20)의 일부를 확대하여 모식적으로 나타낸 도면이다. 이해를 돕기 위해 전극(20)의 형상은 사각형으로 표시하였으나, 실제 전극(20)은 원형 또는 타원형일 수 있다. 도3의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩(100)의 센싱 전극(20)은 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)이 서로 일정한 간격을 두고 엇갈리게 배열되어 있음을 알 수 있다.
한편, 도3의 (c)에는 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)을 일부 확대한 것이 도시되어 있다. 각 전극(20a, 20b) 너비(t)는 대략 10μm이고, 전극 간 간격(d)은 대략 4μm이다.
실시예 1-2: 전극에 올리고뉴클레오티드 프로브 고정
우선, 실시예 1-1에서 제작된 DNA 혼성화 칩(100)의 전극(20)을 산소 플라즈마(150W, 100mtorr)로 10초간 세정하여 전극(20)상의 불순물을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 상기 전극(20)에 프로브 DNA의 한쪽 말단(5' 또는 3')을 고정시킨다. 고정을 위해 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 티올(thiol)기와 탄소사슬(-CH2-)을 결합시킨 5'-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3'의 프로브를 제작하고, 이를 금속 전극(20)의 표면에 SAM(Self- Assembled Method)으로 고정시킨다. 구체적으로 10 pmol/㎕의 SH-ssDNA 프로브를 MgCl2 용액 환경 하에서 18시간 반응시켰다. 그 결과, 프로브의 -SH기와 금속 표면의 반응으로 금속 전극(20) 표면에 프로브 DNA(22)가 고정된다(도4 참조).
한편, 티올기 외에도 프로브 DNA와 전도성 폴리머를 결합시킨 후, DNA와 결합되어 있는 전도성 폴리머를 공지된 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 금속 전극 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 전도성 폴리머로는 공지된 전도성 폴리머가 모두 사용될 수 있으며, 예를 들어, 특히 고전도성 폴리머인 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 폴리(p-페닐렌) (Poly(p-phenylene): PPP), 폴리피롤(Polypyrrole: PPy), 폴리아닐린(Polyaniline), 폴리티오펜(Polythiophene) 등이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머와 프로브 DNA는 폴리머와 DNA간의 공지된 결합방법을 이용하여 결합시킬 수 있다.
도4는 도3의 (b)의 금속전극(20)을 A-A'선을 따라 절취한 횡단면도로서, 산화절연막(12)을 사이에 두고 실리콘 기판(10)상에 형성된 금속전극(20a, 20b)에 프로브 DNA(22)가 고정된 모습이 도시되어 있다.
실시예 2: DNA 혼성화 칩을 이용한 타겟 염기서열의 검출
실시예 1-2에서 제작된 도4의 DNA 혼성화 칩(100)을 이용하여 검출대상 시료 내에 타겟 염기서열(5'-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3')이 존재하는지 여부를 검출하였다.
우선, DNA 혼성화 칩(100)의 전극들(20)간 반응 공간 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 용액인 탈이온수를 도입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
그런 다음, DNA 혼성화 칩(100)에서 레퍼런스 용액을 제거하고, 전술한 타겟 염기서열(10 pmol/㎕의 ssDNA)을 포함하는 검출대상 시료와 TE 완충용액을 DNA 혼성화 칩(100)의 반응 공간 내로 도입하였다. 18시간 동안 실온에서 혼성화 반응조건에 따라 인큐베이션시켜 DNA 혼성화 칩(100)의 전극(20)에 고정된 프로브 DNA(22)와 타겟 염기서열(5'-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3')을 포함하는 ssDNA가 혼성화되도록 하였다.
다시, DNA 혼성화 칩(100)에서 상기 완충용액을 완전히 제거하고 탈이온수를 주입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
전술한 바와 같은 혼성화 반응 전의 임피던스 측정값과 혼성화 반응 후의 임피던스 측정값의 결과를 도8에 나타내었다. 도8에서는 종래기술의 도1의 경우와는 달리, 타겟 염기서열을 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우 혼성화 반응 전의 임피던스 측정값 곡선과 혼성화 반응 후의 임피던스 측정값 곡선이 구분되어 2개의 곡선으로 관찰되었다. 도8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혼성화 반응 진행 후 반응 용액 내에 타겟 DNA가 존재할 경우 임피던스값은 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서, ss-DNA가 혼성화 반응을 통하여 ds-DNA로 되었을 때 그 전도성이 증가하여 임피던스값이 감소하였음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 방법에서는 센싱 전극에 고정된 프로브와 타겟 ssDNA의 혼성화 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않고 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 반영된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 도8에 도시된 바와 같이 혼성화 반응 전후에 있어서 임피던스값의 변화곡선이 2개로 관찰되므로 혼성화 반응 여부 및 타겟 DNA 존재여부를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있다.
한편, 타겟 염기서열이 없는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 도8에 도시된 바와 같이 임피던스 측정값이 포지티브인 경우의 임피던스 값 보다 작음을 알 수 있다.
실시예 3: PCR 반응 칩의 제작
본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 있어서, 검출대상 생리활성물질이 DNA이고 센싱 전극에 결합되는 수용체가 올리고뉴클레오티드 프라이머인 경우, 프라이머 및 PCR 반응용액에 의해 생리활성물질인 DNA가 증폭되는 PCR 증폭 반응을 위한 PCR 반응 칩을 제작한다.
PCR 반응 칩 역시 DNA 혼성화 칩 센서와 같이 당업계에 알려진 방법을 이용하여 제작하는데, 실리콘 기판과 전극 부분은 산화 실리콘 박막 형성 기술, 포토리소그래피(photolithography)기술, 노광 패너팅 기술, 현상 기술, 습식 및/또는 건식 에칭 기술 등을 사용하여 제작한다. MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 기판 상에 IDE(Interdigitated Electrode) 형태의 센싱 금속 전극을 형성한 후, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 센싱 전극에 고정하는 방식으로 제작된다. 또한, 실리콘 기판 상에 부착되는 유리 기판 부분은 당업계에 알려진 글래스 습식 에칭(glass wet-etching) 및 샌드 블라스트(sand blasting) 기술을 이용하여 제작한다.
아래에서는 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩의 제조과정을 단계별로 설명한다.
실시예 3-1: 실리콘기판, 전극 및 유리기판 제조
도5를 참조하여 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩(200)의 제조과정을 설명한다.
1. 실리콘 기판 및 금속 전극의 형성
두께가 500μm의 N-형 실리콘 웨이퍼(10)를 열산화시켜 산화 절연막층인 약 5000Å의 SiO2 층(12)을 형성하였다(도5A의 (a)단계). 통상의 포토리소그래피 공정을 이용하여 Ti/Au (300Å/3000Å)의 금속 전극(20)을 패터닝하고, 이온 밀링 공정을 이용한 건식 에칭으로 IDE 전극으로 형성되지 않는 부분을 제거하여 미세한 IDE(Interdigitated Electrode) 전극 부분을 형성하였다(도5A의 (b)단계). 그런 다음, 상기 패터닝된 금속 전극(20)위에 화학기상증착법, 진공 증착법 또는 스퍼터링 등을 이용하여 1μm 이상의 SiO2 막(18)을 증착시킨 후(도5A의 (c)단계), 화학 기계적 연마법(CMP)을 이용하여 절연막인 SiO2 막(18)을 평탄화하였다(도5A의 (d)단계). 그리고 나서, 통상의 포토레지스트와 포토리소그래피 공정을 이용하여 IDE 전극 부분만을 건식 에칭(RIE) 또는 습식 에칭(BOE)을 수행하여 Au 금속 전극 표면이 노출되도록 하였고, 후술하는 유리기판(30)과 접합되는 절연막(18) 부분을 형성하였다(도5A의 (e)단계).
도시하지는 않았으나, 완성된 금속 전극(20)의 패턴은 도3의 (a)에 도시한 DNA 혼성화 칩의 금속 전극(20)의 패턴과 유사하고, 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)이 서로 일정한 간격을 두고 엇갈리게 배열되어 있다. 전극(20) 부분의 직경(R)은 대략 8.6mm이나, 전극 어레이형 PCR 반응 칩(도7 참조) 제작을 위해서는 가능한 직경이 작을 수록 좋다. 각 전극(20a, 20b) 너비(t)는 대략 20μm이고, 전극 간 간격(d)은 대략 20μm이다.
2. 유리 기판의 제작 및 PCR 반응 칩의 제작
도5B에 도시된 바와 같이, 반도체 공정에서 통상 사용되는 유리 기판(Pyrex사 제품)(30)의 상하 면에 Cr/Au (300Å/3000Å)의 금속 박막(32)을 화학기상증착법, 진공 증착법 또는 스퍼터링 등을 이용하여 증착시켰다(도5B의 (a) 단계). 통상의 포토리소그래피 공정을 이용하여 상부에 형성된 금속 박막(32)을 패터닝하고 습식 에칭을 수행하여 유리 기판(30) 중 추후 공정 처리되는 부분에 대한 보호층(32)을 형성하였다(도5B의 (b)단계). 그런 다음, PCR 반응 칩의 반응 챔버 공간 형성을 위해 보호층(32)에 의해 차폐되지 않는 유리기판(32) 부분을 습식 에칭처리하였다(도5B의 (c)단계). 그리고 상부 및 하부에 형성된 금속 박막(32)을 모두 제거하고, PCR 반응 칩의 유입/유출 구멍(36a, 36b)형성을 위해 유리기판(30)의 밑면에는 블루 테이프(패터닝을 할 수 있는 블루 테이프이면 사용가능) 패터닝(34)을 수행하였다(도5B의 (d)단계). 그런 다음, 당업계에 알려진 샌드 블라스트 공법에 의해 유리기판(30)에 대해 두께 방향으로 유입/유출 구멍 등의 관통구를 형성하였다(도5B의 (e)단계).
앞서 제작된 금속 전극(20)이 형성된 실리콘 기판(10)과 유리 기판(30)을 도5C에 도시된 바와 같이 양극 접합법(anodic bonding)을 이용하여 접합하였고, 접합된 실리콘 기판(10)과 유리 기판(20)을 다이싱하여 최종 PCR 반응 칩(200)을 제작하였다.
상기 양극 접합법은 실리콘 기판과 유리 기판을 접합시키기 위한 방법으로서, 높은 전기장과 열을 가하여 유리 기판 내에 존재하는 양전하를 띤 이온(예를 들면, Na+ 이온)들을 실리콘과 유리가 접지하는 반대편으로 이동시켜 실리콘 기판과 유리 기판의 표면에서 수소결합을 형성시켜 두 기판을 접합시키는 방법이다.
두 개의 기판이 접합된 형태의 PCR 반응 칩(200)에서 상기 실리콘 기판(10)에는 복수개의 센싱 금속 전극(20)이 형성되어 있고(도5 및 도6A 참조), 이 금속 전극에는 타겟 DNA 템플리트(target DNA template)에 대한 프라이머(22)가 고정되어 결합되어 있다(도6A 참조). 그리고 이러한 실리콘 기판(10)은 유리기판(30)과 일정한 거리를 두고 접합되어 반응 챔버 공간(46)을 형성한다(도5 및 도6A 참조).
상기 반응 챔버 공간(46)은 탈이온수의 레퍼런스 용액이 채워진 후 전극 간 임피던스값이 측정되는 공간이다. 또한, 상기 반응 챔버 공간(46)은 검출 대상 시료와 PCR 반응 용액이 수용되어 PCR 반응이 수행되는 공간으로서, 실리콘 기판(10)의 금속 전극(20)에 고정된 프라이머(22)에 검출 대상 시료 내에 존재하는 타겟 DNA 템플리트가 상보적 결합을 이루면 PCR 반응이 진행되는 공간이다.
따라서, 이러한 PCR 반응에 따른 금속 전극(20)간 임피던스 변화를 전기적으로 검출하게 되면 검출 대상 시료 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재하는지 여부를 검출할 수 있는 것이다.
유리기판(30)은 반응 챔버 공간(46)을 외부로부터 보호하는 역할을 한다. 또한, 유리기판(30)에는 두께 방향으로 유체 유입구(36a)가 관통되어 형성되어 있으며, 상기 유체 유입구(36a)에 대향하는 위치에 두께 방향으로 유출구(36b)가 관통되어 형성되어 있다(도5 및 도6A 참조). 도5 및 도6A에 도시된 바와 같이, 상기 유입구(36a)와 상기 반응챔버(46), 그리고 상기 유출구(36b)와 상기 반응챔버(46)는 유체가 유동될 수 있도록 연통되어 있다. 상기 유입구(36a)를 통해 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구(36b)를 통해 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 유출된다.
3. PDMS 기반 유체제어 기판의 제작
한편, PCR 반응 칩(200) 내에서의 유체의 유동을 제어하기 위해서 PDMS 기반의 유체제어 기판(40)을 제작하여 앞서 제작된 PCR 반응 칩(200)의 유리기판(30)상에 부착한다.
본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩(200)의 유체제어 기판(40)은 칩 내부를 볼 수 있게 하기 위해 투명 중합체로 제작되는 것이 바람직한데, 특히PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 제작되는 것이 바람직하다. PDMS의 장점은 실리콘보다 값이 싸고 공정이 쉬우며 유연하고 다른 표면과 접합할 때 방수가 가능하다는 것이다. 또한, 생물 친화적이기 때문에 생리활성물질에 부정적인 영향을 주지 않는다. 그러나 단백질과 세포와 같은 소수성 성분의 비특이적 흡착이 발생할 수 있으므로, 반응성 도료의 증착 또는 그라프트 공중합 처리를 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유체제어 기판(40)의 주입구(42), 채널(44a, 44b) 및 배출구(48)를 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅하면 소수성 성분의 비특이적 흡착을 최소화할 수 있다.
먼저, 유체제어 기판(40)을 CAD(computer aided design) 프로그램에 의해 고안한 후, 고안된 디자인을 포토마스크(photomask)에 인쇄하고 불순물을 제거하였다. 실리콘 웨이퍼 위에 네거티브형 포토레지스트인 SU-8을 스핀코팅하고, 유체제어기판(40)의 주입구(42), 밸브구조(52), 마이크로 채널(44a, 44b) 및 배출구(48) 패턴의 포토 마스크를 사용한 노광 및 현상 공정을 통해 주형을 제작하였다. 그리고, 액체 상태의 PDMS를 상기 SU-8 주형에 붓고 열처리를 가해 굳힌 뒤 주형으로부터 분리해 내었다. 분리된 PDMS 유체제어기판(40)을 PCR 반응 칩(200)의 크기에 따라 자른 뒤 펀치를 이용하여 주입구(42)와 배출구(48) 등의 위치에 원하는 크기로 구멍을 뚫었다. 그런 다음, 상기 제작된 유체제어기판(40)을 플라즈마 산화하여 PCR 반응 칩(200)의 유리 기판(30)상의 대응하는 위치에 접착시켰다.
이와 같이 유체제어 기판(40)이 부착되어 최종적으로 제작된 PCR 반응 칩(200)의 종단면도가 도6A에 도시되어 있다.
상기 유체제어 기판(40)이 상기 유리기판(30)상에 부착됨으로써 유입구(36a)로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널(44a)과, 유출구(36b)로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널(44b)이 형성된다. 유체제어 기판(40)에는 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구(42)가 관통되어 형성되어 있는데, 이 주입구(42)는 상기 유입 마이크로 채널(44a)과 연통되어 유체가 반응 챔버(46) 내로 유입될 수 있게 해 준다. 또한, 유체제어 기판(40)에는에는 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구(48)가 관통되어 형성되어 있는데, 이 배출구(48)는 상기 유출 마이크로 채널(44b)과 연통되어 반응 챔버(46)로부터 유체가 외부로 배출될 수 있게 해 준다.
또한, 상기 유체제어 기판(40)에는 상기 주입구(42)와 상기 반응챔버(46) 사이, 그리고 상기 배출구(48)와 상기 반응챔버(46) 사이에서 유체제어 기판(40)의 두께 방향으로 관통된 후 길이방향으로 연장된 통로(52)가 형성되어 있다(도6A 및 도6B 참조). 이러한 통로(52)는 유입 마이크로 채널(44a) 및/또는 유출 마이크로 채널(44b)에 대한 밸브기능을 수행한다. 즉, 상기 통로(52)에는 실리콘 오일(50)이 내장되어 있는데, 도6C에 도시된 바와 같이 실리콘 오일(50)이 내장된 통로(52)에 질소가스(N2)가 주입되면 통로(52)에 내장된 실리콘 오일(50)이 팽창하고 실리콘 오일(50)의 팽창에 의해 상기 채널(44a, 44b)이 막히게 된다. 따라서, 유체제어 기판(40)은 주입구(42)로부터 반응챔버(46)로의 유체의 유입 그리고 반응챔버(46)로부터 배출구(48)로의 유체의 유출을 차단하여 유체의 흐름을 제어하게 되는 것이다.
실시예 3-2: 전극에 올리고뉴클레오티드 프라이머 고정
우선, 실시예 3-1에서 제작된 PCR 반응 칩(200)의 전극(20)을 Pirahna 용액 (H2SO4 및 H2O2 을 70:30으로 혼합한 것)으로 30분간 세정하여 전극(20)상의 불순물을 완전히 제거하였다.
그런 다음, 상기 전극(20)에 업스트림 프라이머(upstream primer)와 다운스트림 프라이머(downstream primer)의 한쪽 말단(5' 또는 3')을 전극(20)에 고정시킨다. 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머 모두를 전극(20)에 고정시킬 수도 있고, 이중 하나의 프라이머만을 전극에 고정시키고 나머지 하나의 프라이머는 PCR 반응용액에 섞어서 PCR 반응을 진행할 수 있다. 고정을 위해 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 티올(thiol)기와 탄소사슬(-CH2-)을 결합시킨 5'-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3'의 업스트림 프라이머와 5'-SH-(CH2)24-AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G-3'의 다운스트림 프라이머를 제작하고, 이를 금속 전극(20)의 표면에 SAM(Self- Assembled Method)으로 고정시킨다. 구체적으로 10 pmol/㎕의 SH-ssDNA 업스트림 프라이머 및/또는 다운스트림 프라이머를 TE 완충용액(TE buffer) 환경 하에서 18시간 반응시켰다. 그 결과, 프라이머의 -SH기와 금속 표면의 반응으로 금속 전극(20) 표면에 프라이머 ssDNA(22)가 고정된다. 본 실시예에서 수행된 금속 표면으로의 프라이머의 고정 과정은 도4에 도시된 바와 같은 실시예 1-2에서의 프로브의 고정 과정과 실질적으로 동일하다.
실시예 4: PCR 반응 칩을 이용한 PCR 반응의 분석
실시예 3-2에서 제작된 프라이머가 고정된 PCR 반응 칩(200)(도6 참조)을 이용하여 검출대상 시료 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재하는지 여부 및 PCR 반응 수행여부를 검출하였다.
우선, PCR 반응 칩(200)의 반응 챔버(46) 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 용액인 탈이온수를 도입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
그런 다음, PCR 반응 칩(200)에서 레퍼런스 용액을 제거하고, Promega의 PCR Core System Ⅱ PCR 키트(PCR 반응을 간편하게 수행하기 위해 판매하는 PCR 반응 용액; 미국 Promega사 제품)와 DNA 템플리트를 PCR 반응 칩(200)의 반응 챔버(46) 내로 도입하였다. Promega에서 권장하는 각 PCR 사이클 마다의 PCR 반응시간과 반응온도에 맞추어 PCR 반응을 25 내지 35 사이클 진행하였다.
다시, PCR 반응 칩(200)에서 상기 PCR 반응용액을 완전히 제거하고 탈이온수를 주입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
전술한 바와 같은 PCR 반응 전의 임피던스 측정값과 PCR 반응 후의 임피던스 측정값의 결과를 도9에 나타내었다. 도9에서는 종래기술의 도1의 경우와는 달리, 타겟 DNA 템플리트를 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우 PCR 반응 전의 임피던스 측정값 곡선과 PCR 반응 후의 임피던스 측정값 곡선이 구분되어 2개의 곡선으로 관찰되었다. 도9에서 확인할 수 있는 바와 같이, PCR 반응 진행 후 반응 용액 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재할 경우 임피던스값은 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서, ss-DNA가 PCR 반응을 통하여 ds-DNA로 되었을 때 그 전도성이 증가하여 임피던스값이 감소하였음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 방법에서는 센싱 전극에 고정된 프라이머와 타겟 DNA 템플리트의 PCR 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않고 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 반영된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 도9에 도시된 바와 같이 PCR 반응 전후에 있어서 임피던스값의 변화곡선이 2개로 관찰되므로 PCR 반응 여부 및 타겟 DNA 템플리트 존재여부를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있다.
한편, 타겟 DNA 템플리트가 없는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 도9에 도시된 바와 같이 임피던스 측정값이 포지티브인 경우의 임피던스 값 보다 작음을 알 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 검출대상 시료가 수용되는 반응 챔버와, 상기 반응 챔버 내에 위치하고 상기 검출대상 시료 내의 생리활성물질의 검출을 위한 복수개의 센싱 전극을 구비하는 전기적 검출장치를 제공하는 단계와,
    (b) 상기 반응 챔버 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와,
    (c) 상기 반응 챔버로부터 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 제거한 후, 상기 반응 챔버 내에 반응용액 및 검출대상 시료를 제공하는 단계와,
    (d) 상기 반응용액 하에서 상기 검출대상 시료를 상기 반응 챔버 내에서 반응시키는 단계와,
    (e) 상기 반응용액을 상기 반응 챔버로부터 제거하는 단계와,
    (f) 상기 반응 챔버 내로 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와,
    (g) 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값과 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교하는 단계를 포함하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계 및 (f)단계에서는 교류전원을 이용하는 측정장치에 의해 각각의 주파수별로 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값은 주파수값에 대한 곡선으로 표현되고, 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선이 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선과 구분되는 경우 상기 검출대상 시료 내에 생리활성물질이 존재하거나 생리활성물질이 상기 센싱 전극과 반응하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 유전상수가 4 이상인 유체인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 증류수 또는 탈이온수(deionized water)인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센싱 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 센싱 전극의 각각의 전극 사이의 간격은 1-4μm인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센싱 전극에는 상기 생리활성물질과 상호작용을 하는 수용체가 결합되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 수용체는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  10. 복수개의 센싱 전극이 형성된 제1기판과,
    상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함하고,
    상기 반응 챔버 공간을 형성하는 상기 제2기판에는 상기 제2기판의 두께 방향으로 유체 유입구가 관통되어 형성되어 있고 상기 유체 유입구에 대향하는 위치에 상기 제2기판의 두께 방향으로 유출구가 관통되어 형성되어 있으며,
    상기 유입구와 상기 반응 챔버 공간, 그리고 상기 유출구와 상기 반응 챔버공간은 유체가 유동될 수 있도록 연통되고,
    상기 유입구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유출되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제2기판 상에는 제3기판이 적층되어 상기 유입구로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널과, 상기 유출구로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널을 형성하고,
    상기 유입 마이크로 채널에는 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있으며,
    상기 유출 마이크로 채널에는 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유입 마이크로 채널 또는 상기 유출 마이크로 채널에는 상기 반응 챔버 공간 내로의 유체의 유입 또는 상기 반응 챔버 공간으로부터 유체의 유출을 제한할 수 있는 밸브 구조가 제공되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 밸브구조는 상기 주입구와 상기 반응 챔버 공간 사이에서, 또는 상기 배출구와 상기 반응 챔버 공간 사이에서 상기 제3기판의 두께 방향으로 관통된 후 연장된 통로로서, 이러한 연장된 통로에는 오일이 내장되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3기판은 PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 형성되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
PCT/KR2009/000285 2008-03-24 2009-01-20 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 WO2009119971A2 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09724909A EP2273263B1 (en) 2008-03-24 2009-01-20 Method for electrically detecting physiologically active materials and biochip for the same
CN2009801108754A CN101981445B (zh) 2008-03-24 2009-01-20 电学地检测生理活性物质的方法和用于该方法的生物芯片
US12/922,934 US8354307B2 (en) 2008-03-24 2009-01-20 Method for detecting biomolecules electrically and biochip therefor
JP2010549557A JP5371061B2 (ja) 2008-03-24 2009-01-20 生理活性物質を電気的に検出する方法およびこれのためのバイオチップ
US13/708,236 US9005545B2 (en) 2008-03-24 2012-12-07 Method for detecting biomolecules electrically and biochip therefor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080027099A KR100969667B1 (ko) 2008-03-24 2008-03-24 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한바이오칩
KR10-2008-0027099 2008-03-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/922,934 A-371-Of-International US8354307B2 (en) 2008-03-24 2009-01-20 Method for detecting biomolecules electrically and biochip therefor
US13/708,236 Division US9005545B2 (en) 2008-03-24 2012-12-07 Method for detecting biomolecules electrically and biochip therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009119971A2 true WO2009119971A2 (ko) 2009-10-01
WO2009119971A3 WO2009119971A3 (ko) 2009-11-19

Family

ID=41114429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2009/000285 WO2009119971A2 (ko) 2008-03-24 2009-01-20 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩

Country Status (6)

Country Link
US (2) US8354307B2 (ko)
EP (1) EP2273263B1 (ko)
JP (1) JP5371061B2 (ko)
KR (1) KR100969667B1 (ko)
CN (1) CN101981445B (ko)
WO (1) WO2009119971A2 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012028719A3 (en) * 2010-09-02 2012-06-07 Heed Diagnostics Aps Electrochemical detection of analyte
US20130196878A1 (en) * 2010-11-01 2013-08-01 Lg Electronics Inc. Apparatus and method for detecting multiplex target nucleic acids in real time
US11465141B2 (en) 2016-09-23 2022-10-11 Alveo Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting analytes
US11473128B2 (en) 2014-10-06 2022-10-18 Alveo Technologies, Inc. System and method for detection of nucleic acids

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120077206A1 (en) 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
WO2005027714A2 (en) 2003-07-12 2005-03-31 Accelr8 Technology Corporation Sensitive and rapid biodetection
PL2395353T3 (pl) * 2010-06-09 2019-02-28 Apex Biotechnology Corp. Urządzenie i sposób pomiaru czasu protrombinowego i hematokrytu poprzez analizę zmiany reaktancji w próbce
KR101726238B1 (ko) 2010-10-15 2017-04-12 (주) 하임바이오텍 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트
KR101667648B1 (ko) * 2010-12-01 2016-10-20 (주) 하임바이오텍 전도성 입자를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오 칩
US10254204B2 (en) 2011-03-07 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Membrane-assisted purification
EP2683831B1 (en) 2011-03-07 2015-09-23 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid cell purification systems
KR101729489B1 (ko) 2011-03-11 2017-04-24 (주) 하임바이오텍 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법
EP2807475A4 (en) * 2012-01-27 2015-10-07 Univ Tennessee Res Foundation METHODS AND APPARATUS FOR DETECTION OF AN ALTERNATING CURRENT ELECTROKINETIC BIOMARKER
US9677109B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility
CN105247561A (zh) 2013-05-23 2016-01-13 艾弗诺泰普有限责任公司 用于协助个人、产品提供者和/或服务提供者的方法和系统
US10167501B2 (en) * 2014-06-12 2019-01-01 Auckland Uniservices Limited Methods and apparatus for quantification of nucleic acid amplification by monitoring impedances
WO2016040490A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-17 Perosphere, Inc. Microfluid chip-based, universal coagulation assay
KR101709762B1 (ko) * 2015-02-09 2017-02-23 광운대학교 산학협력단 생체분자 농축 기능 일체형 센서 및 그 제조방법
AU2016243656A1 (en) 2015-03-30 2017-11-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
US10253355B2 (en) 2015-03-30 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
KR101754239B1 (ko) * 2015-12-28 2017-07-06 한국과학기술연구원 수용체와 표적 생체물질의 반응을 이용한 교차 전극 바이오센서
KR101727107B1 (ko) 2016-02-19 2017-04-17 한국과학기술연구원 유전체 전기영동을 이용한 마이크로 전극 바이오 센서
TWI620932B (zh) * 2016-06-08 2018-04-11 立錡科技股份有限公司 生醫檢測裝置以及生醫檢測裝置之製造方法
US10012645B2 (en) * 2016-08-24 2018-07-03 The Florida International University Board Of Trustees Rapid zika virus detection using nano-enabled electrochemical sensing system
KR101912890B1 (ko) * 2016-10-04 2018-10-29 한국과학기술연구원 표적 생체물질과 수용체의 반응을 개선한 교차 전극 바이오센서
US11480567B2 (en) 2017-02-15 2022-10-25 New Jersey Institute Of Technology Enhanced sensitivity and specificity for point-of-care (POC) micro biochip
US11020740B2 (en) * 2017-10-24 2021-06-01 New Jersey Institute Of Technology Microfluidic biochip with enhanced sensitivity
CN110385150A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 成功大学 介电微粒操控芯片
EP3775832B1 (en) * 2018-08-09 2021-12-22 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Conductivity-based reaction chamber control
CN113970670B (zh) * 2021-09-29 2022-08-09 西安电子科技大学 箔条空气混合介电常数测量方法、系统、设备、介质及终端

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110277A1 (en) 2002-04-12 2004-06-10 Seiko Epson Corporation Sensor cell, bio-sensor, capacitance element manufacturing method, biological reaction detection method and genetic analytical method
US20060226030A1 (en) 2003-06-23 2006-10-12 Hans-Christian Hanke Capacitative biosensor element and method for detecting hybridization events

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4023096A (en) * 1976-02-17 1977-05-10 Shell Oil Company Method and apparatus for determining physical characteristics of emulsions
JPS63231256A (ja) * 1987-03-19 1988-09-27 Jeol Ltd イオン選択性電極を用いた検体電解質測定の校正デ−タ処理法
US5587128A (en) * 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
CA2250212C (en) * 1996-04-03 2010-02-09 The Perkin-Elmer Corporation Device and method for multiple analyte detection
GB9622304D0 (en) * 1996-10-26 1996-12-18 Univ Manchester Sensor
US6686150B1 (en) * 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
US6169394B1 (en) * 1998-09-18 2001-01-02 University Of The Utah Research Foundation Electrical detector for micro-analysis systems
CN1129669C (zh) * 2000-08-18 2003-12-03 莫志宏 原位生物芯片及其制备方法
EP1331997B1 (en) 2000-11-06 2004-06-16 Nanostream, Inc. Microfluidic flow control devices
KR100438828B1 (ko) * 2001-11-08 2004-07-05 삼성전자주식회사 칩 상의 전기적 미세 검출기
DE10211358B4 (de) * 2002-03-14 2006-10-26 Siemens Ag Vertikal-Impedanz-Sensor-Anordnung und Verfahren zum Herstellen einer Vertikal-Impedanz-Sensor-Anordnung
CN100487133C (zh) * 2002-07-20 2009-05-13 艾森生物(杭州)有限公司 基于阻抗的检测装置和方法
KR100858080B1 (ko) 2002-11-12 2008-09-10 삼성전자주식회사 전기적 신호를 측정하는 ｐｃｒ 증폭 산물을 검출하는 방법
ATE544867T1 (de) * 2002-12-11 2012-02-15 Centre Nat Rech Scient Methode zur elektronischen detektion wenigstens einer spezifischen interaktion zwischen einem proben- und einem zielmolekül
DE10324912A1 (de) * 2003-05-30 2005-01-05 Siemens Ag Verfahren zur Detektion von DNA-Punktmutationen (SNP-Analyse) sowie zugehörige Anordnung
US20050059105A1 (en) * 2003-07-25 2005-03-17 Board Of Trustees Of Michigan State University Impedimetric biosensor and its use for rapid detection of bacterial pathogens in solution
WO2005031352A1 (en) * 2003-09-29 2005-04-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Label-free detection of biomolecules
US20050266571A1 (en) 2004-03-26 2005-12-01 Phil Stout Method for feedback control of a microfluidic system
US6990849B2 (en) * 2004-03-26 2006-01-31 Lifescan, Inc. Microfluidic analytical system with position electrodes
KR100613612B1 (ko) * 2004-04-27 2006-08-18 삼성전자주식회사 인덕턴스 소자 및 캐패시턴스 소자를 이용한 바이오결합검출 장치 및 방법
WO2007040558A2 (en) * 2004-11-19 2007-04-12 The Trustees Of Boston College Method of fabricating nanowires and electrodes having nanogaps
JP4806548B2 (ja) * 2005-03-10 2011-11-02 長野計器株式会社 マイクロ流路の流体制御構造、マイクロ流路の流体制御構造の製造方法、および閉塞部材操作装置
JP4616124B2 (ja) * 2005-08-23 2011-01-19 セイコーインスツル株式会社 マイクロリアクタ、マイクロリアクタシステム、および該マイクロリアクタシステムを用いた分析方法
JP4660768B2 (ja) * 2006-03-28 2011-03-30 国立大学法人 筑波大学 微小分析装置及び微少試料の分析方法
EP2047157A1 (en) * 2006-08-02 2009-04-15 The Regents of the University of Michigan Multiplexed microfluidic valve activator

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110277A1 (en) 2002-04-12 2004-06-10 Seiko Epson Corporation Sensor cell, bio-sensor, capacitance element manufacturing method, biological reaction detection method and genetic analytical method
US20060226030A1 (en) 2003-06-23 2006-10-12 Hans-Christian Hanke Capacitative biosensor element and method for detecting hybridization events

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2273263A4

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012028719A3 (en) * 2010-09-02 2012-06-07 Heed Diagnostics Aps Electrochemical detection of analyte
CN103261892A (zh) * 2010-09-02 2013-08-21 海徳诊断学有限责任公司 分析物的电化学检测
US20130196878A1 (en) * 2010-11-01 2013-08-01 Lg Electronics Inc. Apparatus and method for detecting multiplex target nucleic acids in real time
US11473128B2 (en) 2014-10-06 2022-10-18 Alveo Technologies, Inc. System and method for detection of nucleic acids
US11465141B2 (en) 2016-09-23 2022-10-11 Alveo Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting analytes

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090101764A (ko) 2009-09-29
JP2011517769A (ja) 2011-06-16
US8354307B2 (en) 2013-01-15
EP2273263B1 (en) 2013-03-20
CN101981445A (zh) 2011-02-23
EP2273263A4 (en) 2011-05-11
WO2009119971A3 (ko) 2009-11-19
US20130143775A1 (en) 2013-06-06
US9005545B2 (en) 2015-04-14
US20110024309A1 (en) 2011-02-03
CN101981445B (zh) 2013-09-04
JP5371061B2 (ja) 2013-12-18
KR100969667B1 (ko) 2010-07-14
EP2273263A2 (en) 2011-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009119971A2 (ko) 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩
EP1392860B1 (en) Method for fabricating a molecular detection chip
US7220344B2 (en) Film based addressable programmable electronic matrix articles and methods of manufacturing and using the same
JP4562914B2 (ja) 化学的または生物学的分析マルチポイントマイクロシステム
US20100273166A1 (en) biosensor device and method of sequencing biological particles
WO2009107965A1 (ko) 다중 크기 압전 마이크로 칸티레버 공진자 어레이를 이용한 물리/생화학 센서 및 그 제작방법
TWI723321B (zh) 生物場效電晶體感測器、微流體系統及其使用方法
US20100197524A1 (en) Electrochemical biosensor arrays and instruments and methods of making and using same
KR20010090446A (ko) 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법
KR100969671B1 (ko) 고감도 바이오 센서 및 이를 포함하는 바이오 칩 그리고이를 제조하는 방법
EP2036119A2 (en) Three-dimensional integrated circuit for analyte detection
JP2001510564A (ja) 生物学的分析用のマイクロシステム及びその製造方法
KR20110126942A (ko) 바이오칩 및 그 제조 방법, 이를 이용한 분석 대상 물질 검출 방법
US11280758B2 (en) Single-particle bridge assay for amplification-free electrical detection of ultralow-concentration biomolecules and non-biological molecules
EP2095120A2 (en) Biological assay substrate and method and device for producing such substrate
WO2019200164A1 (en) Devices and methods for detecting/discriminating complementary and mismatched nucleic acids using ultrathin film field-effect transistors
KR100530085B1 (ko) 미소전극어레이형 디엔에이 칩 제조방법
WO2004088298A1 (ja) キャビティ電極構造体並びにそれを用いたセンサー及び蛋白質検出デバイス
KR20210149468A (ko) 재사용 가능한 바이러스 신속 검출용 dna 바이오 센서

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980110875.4

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09724909

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010549557

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12922934

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009724909

Country of ref document: EP