WO2009088042A1

WO2009088042A1 - インフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤

Info

Publication number: WO2009088042A1
Application number: PCT/JP2009/050149
Authority: WO
Inventors: Kazuo Iwai; Masaaki Oya; Koichi Otsuki; Hiroki Takakuwa; Ryota Tsunekuni; Yoshiyuki Seto; Masafumi Mukamoto
Original assignee: Jcs Inc.; Yahiro Sangyo Co., Ltd.; Kyoto Sangyo University; Osaka Prefecture University
Priority date: 2008-01-10
Filing date: 2009-01-08
Publication date: 2009-07-16

Abstract

【課題】インフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤を提供する。【解決手段】ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール含有率１０ないし６０％のアルコール溶液を含むインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤。

Description

インフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤

　本発明は、インフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤に関するものであり、詳細には、ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール含有率１０ないし６０％のアルコール溶液を含むインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤に関する。

　近年、抗インフルエンザ薬が盛んに研究・開発され、タミフル（登録商標）やザナミヴィル（登録商標）等のインフルエンザウイルスの増殖を抑えることができる薬剤が開発されるに至っている。しかし、これらの抗インフルエンザ薬は、使用可能時期が狭い範囲に限られたり、また、副作用の観点から必ずしも汎用に適した薬剤といえるものではなく、更に、これらの抗インフルエンザ薬はヒトインフルエンザウイルスの増殖を個人レベルで抑える作用を持つものの、ヒトインフルエンザウイルス感染が拡大するのを予防し得るものではない。ヒトインフルエンザウイルスの感染拡大を予防するためには、手洗い、うがい、手の消毒等をまめに行うことが推奨されるものの、ヒトインフルエンザウイルスは、空気中を漂うものであるため、前記の方法だけでは十分に感染を予防することは困難であり、そして感染が拡大した場合は、結果的に職場閉鎖や学級閉鎖を行わざるを得なくなる。

　特開２００７－２３８４７０号公報（特許文献１）は、コレスタノールを部分構造として有する糖脂質誘導体がヒトインフルエンザウイルス等を含むウイルスに対して高い感染阻害活性を有すること及び該誘導体を空気中へ散布する用途に使用し得ることを開示する。
　しかし、上記公報には、ウイルスに対して高い感染阻害活性を有する物質としては、上記誘導体しか開示されておらず、他のウイルス感染阻害活性を有する化合物に付いては何ら記載されていない。
　一方、幅広い抗菌性を有し、天然素材で安全性が高い物質としてヒノキチオールが知られている。しかし、ヒノキチオールは、水溶化が困難であり、紫外線に弱いという欠点を有しているため、溶解性が高いアルコールに混ぜて使用されるのが一般的であり、歯磨き、ヘアートニック等に使用されるに留まっている。
　また、天然ヒノキチオールは食品添加物に指定されているにも拘らず、上記の理由等により、梅干のカビの予防程度にしか使用されていない。

　また、近年、鳥インフルエンザウイルスの被害が報告されている。
　鳥インフルエンザウイルスは、鳥に対する殺傷能力が大きく、感染力も強い。しかしこの鳥インフルエンザウイルスに対抗し得る薬剤は少なく、特に環境に対する影響が少ないと考えられる薬剤は皆無といえる。農薬に順ずるものでポジテイブリストに載っている薬剤はあるものの、鳥インフルエンザウイルスの感染予防には有効ではない。鳥インフルエンザウイルスの最大の予防策は罹患した鶏のみならず、同じ飼育環境の鶏を全数殺傷することであり、またこれが被害の拡大を抑える方法ではあるが、この方法は対処療法に過ぎないものであり、解決策にはなり得ない。また、被害は鳥インフルエンザウイルスへの感染が確認された鶏舎のみならず、未だ鳥インフルエンザウイルスへの感染が確認されていない周辺の鶏舎にも及ぶことになり甚大なものとなる。

　特開２００６－１５８３６１号公報には、鳥インフルエンザウイルスの予防のための、ヒバ油あるいはヒノキチオールを添加或いは含浸させた鶏舎内の家畜敷料が開示されている。ヒノキチオールは、幾つかのウイルスに対する抗ウイルス効果を有し、且つ安全性の高い化合物として知られている。しかし、上記公報には、上記家畜敷料が鳥インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス効果を有することを裏付ける試験データは何ら示されておらず、また、ヒバ油あるいはヒノキチオールを家畜敷料に添加或いは含浸させる具体的な態様も家畜敷料の具体的な製造例及び使用例も示されていない。
　また、鳥インフルエンザウイルスは空中を浮遊することが知られており、従って、上記のように家畜敷料で鳥インフルエンザを予防するためには、相当量のヒバ油あるいはヒノキチオールが該家畜敷料から揮発して空気中に存在する必要があることになるが、そうすると、大量のヒバ油あるいはヒノキチオールの使用が必要となり、実用的ではない。
特開２００７－２３８４７０号公報特開２００６－１５８３６１号公報

　本発明は、鳥インフルエンザウイルスやヒトインフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルスの感染を予防する効果が高く、安全性に優れ且つ実用性の高いインフルエンザウイルス感染の予防剤の提供を課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、安全性に優れる天然素材であるヒノキチオール、若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール溶液を、鳥インフルエンザウイルスやヒトインフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルスの感染が想定される場所に散布することにより、効果的にこれらのインフルエンザウイルスの感染を予防し得ることを見い出し、本発明を完成させた。また、本発明の散布剤は経済性にも優れ、実用性の高い薬剤となり得る。

　即ち、本発明は、
（１）ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール含有率１０ないし６０％のアルコール溶液を含むインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤、
（２）前記ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩において２種以上の金属が使用される前記（１）記載の散布剤、
（３）前記金属が銅、亜鉛、アルミニウム、ビスマス又はこれらの混合物である前記（２）記載の散布剤、
（４）前記金属として、亜鉛を含む前記（３）記載の散布剤、
（５）前記金属錯体として、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を用いる前記（１）記載の散布剤、
（６）アロエ、緑茶、熊笹、及びドクダミからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物抽出物を含む前記（１）ないし（５）の何れか１つに記載の散布剤、
（７）グリセリン及び界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む前記（１）ないし（６）の何れか１つに記載の散布剤、
（８）前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである前記（１）ないし（７）の何れか１つに記載の散布剤、
（９）インフルエンザウイルス感染を予防する方法であって、前記（１）ないし（８）の何れか１つに記載の散布剤をインフルエンザウイルスの感染が想定される場所に散布することからなる方法、
（１０）散布方法が、空気中への噴霧である前記（９）記載の方法、
（１１）前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである前記（９）又は（１０）記載の方法、
に関する。

　本発明のインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤は、少量のヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩の使用においても、インフルエンザの感染を有効に予防することができるため、安全性が高く、また、実用性の高い薬剤となり得る。
　特に、ヒノキチオールの金属錯体は、ヒトインフルエンザウイルスに対して高い抗ウイルス効果を有するため、該金属錯体を用いれば、使用するヒノキチオールの量を削減でき、また、散布方法を噴霧により行うことで更に使用量を削減することができる。この際、金属錯体に含まれる金属も微量となる為に環境だけでなく、例えば、オフィス、教室、トイレ、病院、電車、乗用車、家庭内等に直接噴霧することも問題とはならない。
　更に、本発明のインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤は、ヒトインフルエンザ感染の予防において、人への安全な予防散布剤としての使用が可能である。

　また、鳥インフルエンザ感染の予防のために、抗ウイルス効果の高いヒノキチオールの金属錯体を用いれば、使用するヒノキチオールの量を削減でき、また、散布方法を噴霧により行うことで更に使用量を削減することができる。この際、金属錯体に含まれる金属も微量となる為に環境だけでなく、鶏肉や鶏卵にも影響を与える事はなく、また、鶏舎内の鶏や卵に直接噴霧することも問題とはならない。
　従って、本発明により鶏肉業界でだけでなく、消費者に安全安心を提供することが可能である。
　更に、鳥インフルエンザウイルスは、新型人インフルエンザウイルスに変換する可能性が研究者から指摘されているが、その際、本発明のインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤は、鳥インフルエンザ感染の予防において、人にも安全な予防散布剤としての使用が可能である。

本発明の散布方法に使用可能な噴霧器の１態様を示した概略図である。ヒノキチオール及びヒノキチオール塩化亜鉛混合物の濃度に対する鳥インフルエンザウイルスのウイルス力価を示すグラフである。

　更に詳細に本発明を説明する。
　本発明の、インフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤は、ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール含有率１０ないし６０％のアルコール溶液を含む。

　本発明に使用するヒノキチオールは、タイワンヒノキ、ヒバ、アスナロ等の原料植物に由来する精油から抽出された天然物でもよく、化学合成品でもよい。また、市販品のヒノキチオールをそのまま用いてもよい。原料植物としては、入手容易性の観点から、ヒバが好ましい。原料植物からのヒノキチオールの抽出・精製は公知の方法により行うことができる。前記精油としてはヒバ油が好ましい。化学合成品も公知の方法により得ることができる。市販のものとしては、たとえば、高砂香料（株）や大阪有機化学工業（株）から販売されているものを挙げることができる。

　ヒノキチオールの金属錯体としては、ヒノキチオールと、亜鉛、銅、鉄、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、バリウム、スズ、コバルト、チタン、バナジウム、ビスマスなどとの金属錯体が挙げられる。ヒノキチオールと金属との割合は、特に限定されるものではないが、通常、ヒノキチオール：金属のモル比が２：１のもの、あるいは３：１のものが好ましく用いられる。

　ヒノキチオール若しくはヒノキチオールの金属錯体の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；銅塩、亜鉛塩等の遷移金属塩；ジエタノールアミン塩、２－アミノ－２－エチル－１，３－プロパンジオール塩、トリエタノールアミン塩等のアルカノールアミン塩；モルホリン塩、ピペラジン塩、ピペリジン塩等のヘテロ環アミン塩、アンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩等の塩基性アミン塩等の有機塩類等を挙げることができる。

　これらのヒノキチオール若しくはその金属錯体又はこれらの塩は、１種類だけ単独で含有されていてもよいし、２種類以上併用してもよく、２種以上の金属が使用されるのが好ましい。

　また、好ましくは、前記金属は銅、亜鉛、アルミニウム、ビスマス又はこれらの混合物である。
　また、ヒノキチオール銅錯体、ヒノキチオール亜鉛錯体、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物等が好ましく、また、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が好ましい。

　また、ヒノキチオールの金属錯体又は金属錯体の塩は、耐光性がヒノキチオールよりも優れているので、耐候性が要求される場合には、ヒノキチオールの金属錯体又は金属錯体の塩を用いることが好ましい。
　更に、ヒノキチオールの金属錯体又は金属錯体の塩は、ヒノキチオールよりも低い濃度（例えば、１／１０程度の濃度）で同等の効果を示すことから経済的な面からも好ましい。

　ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩は、媒体１０００ｇに対して、５０μｇないし１００ｇ、好ましくは、０．１ｇないし８０ｇ、より好ましくは、０．１ないし１０ｇの割合で添加される。
　特に、ヒノキチオール銅錯体、ヒノキチオール亜鉛錯体、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物又はこれらの混合物等を用いる場合は、０．１ないし１０ｇであるか又は、１ないし１０ｇであるか又は、１ないし８ｇの割合で添加するのが好ましい。
　尚、上記媒体は、水であるか又はアルコール含有率１０ないし６０％となるアルコール（水溶液）である。

　水溶液に使用する水は、水道水でも脱イオン水や蒸留水等の精製水でも使用できるが、脱イオン水等の精製水を使用するのが好ましい。
　アルコール溶液に使用するアルコールは、たとえば、メタノール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。これらは単独であるいは複数を組み合わせて使用してもよい。好ましいアルコールはエタノールである。

　本発明のインフルエンザ感染を予防するための散布剤は、アロエ、緑茶、熊笹、及びドクダミからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物抽出物を含むこともできる。

　アロエの抽出物とは、主にアロエが葉に持つゼリー状の身（葉肉）を厚搾抽出法で抽出し、熱を加えて濃縮安定化したエキスをいう。このようなアロエエキスに代えて、主成分であるアントラキノン誘導体のアロインやバーバーロインを用いてもよい。アロエ抽出物には、アロインやバーバーロインの他、アロエ‐エモジン、アロエシン、アロエニンなども含まれる。

　緑茶の抽出物としては、粉砕した緑茶を熱湯で抽出し、精製し濃縮した液を使用する。緑茶の抽出物の主成分は茶ポリフェノールである。茶ポリフェノールは、分子内にフェノール性水酸基を複数もつ化合物の総称で、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、エピガテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどを主要成分とする。

　熊笹の抽出物は、低温高圧圧搾抽出法で、熊笹を抽出することにより得られる。低温高圧圧搾抽出法は、熊笹を高圧に設定した機械装置によって温度を上げずに抽出する方法で、その時にしぼり出された液を濃縮した液が熊笹抽出物となる。熊笹は、日本や中国に広く分布しているイネ科のササの１種である。熊笹の抽出物には、主成分であるトリテルペノール（β－アミリン・フリーデン）の他、リグニン残渣、還元糖、グルコースなどの糖類も含まれている。熊笹の抽出物に代えて、これらの合成品の混合物を用いることもできる。

　ドクダミは、日本、タイワン、中国、ヒマラヤ、ジャワに分布し、山野や庭などに見られる多年草である。ドクダミの抽出物は、熊笹と同様に、低温高圧圧搾抽出法という方法で抽出する。ドクダミ抽出物には、クエルシトリン（quercitrin）、アフゼニン（afzenin）、ハイぺリン（hyperin）、ルチン、クロロゲン酸、β－シトステロール、cisおよびtrans-Ｎ-(4-ヒドロキシスチリル）が含まれている。熊笹の抽出物に代えて、これらの合成品の混合物を用いることもできる。

　前記抽出物としては、アロエ、緑茶、熊笹及びドクダミの抽出物から選択される１種類だけを用いてもよいが、２種類以上を併用することが好ましく、より好ましくは上記４種の抽出物を全て含む。

　前記抽出物を添加する際の配合量は、ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩１質量部に対して、１ないし４質量部使用するのが好ましく、より好ましくは、１．２ないし３．５質量部の範囲である。
　また、添加する際の各抽出物の配合量は以下の通りである。
　例えば、アロエの抽出物は、媒体１０００ｇに対して、２０μｇないし１００ｇ、好ましくは、０．１ｇないし１０ｇ、より好ましくは、０．５ないし２．５ｇの割合で添加される。
　例えば、緑茶の抽出物は、媒体１０００ｇに対して、２０μｇないし１００ｇ、好ましくは、０．１ｇないし５ｇ、より好ましくは、０．２ないし２ｇの割合で添加される。
　例えば、熊笹の抽出物は、媒体１０００ｇに対して、１０μｇないし５０ｇ、好ましくは、０．０５ｇないし３ｇ、より好ましくは、０．１ないし１ｇの割合で添加される。
　例えば、ドクダミの抽出物は、媒体１０００ｇに対して、１０μｇないし５０ｇ、好ましくは、０．０５ｇないし３ｇ、より好ましくは、０．１ないし１ｇの割合で添加される。
　尚、上記媒体は、水又はアルコール含有率１０ないし６０％となるアルコール（水溶液）である。

　本発明のインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤は、グリセリン及び界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むこともできる。

　グリセリンとしては、グリセリンおよびグリセリンの各種誘導体が挙げられる。
　界面活性剤としては、グリセリン脂肪酸エステル類、キラヤサポニン等が挙げられる。これらを含有することにより、ヒノキチオール濃度を１０質量％にまで高めた水溶液とすることができる。
　アルコール溶液を使用する場合は、上記のような添加物を使用することなく高濃度のヒノキチオール溶液とすることができる。

　前記水溶液又はアルコール溶液中には更に、柿の葉、松、杉、あま茶づる、シソ、ワサビ、アカネ、ウメ、ニンニク、ペパーミント、ヨモギ、サンショウ、ダイオウ、アザミ、ハッカ、ビワ、ムラサキ、ラベンダー、レモングラス、及びレンギョウの抽出成分、ハチミツより抽出されるプロポリス等を含有してもよい。これらは、ヒノキチオールの殺菌力を損なうことなく、水に対するヒノキチオールの溶解度を高めることができる。

　上記に加え、さらに必要に応じて、従来使用されている添加剤、例えば金属石鹸、動物抽出物、ビタミン剤、ホルモン剤、アミノ酸等の薬効剤、色素、香料、紫外線吸収剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合することもできる。

　本発明のインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤の好ましい態様としては、以下が挙げられる。
　０．１ないし１％のヒノキチオールナトリウム塩を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオール銅錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオール亜鉛錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし０．８％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオールアルミニウム錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオールビスマス錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオールビスマス錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％のヒノキチオールビスマス錯体を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし１％の、ヒノキチオールナトリウム塩、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物及びヒノキチオールアルミニウム錯体からなる混合物を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。
　０．１ないし３％の、混合物（ヒノキチオール、塩化亜鉛、水酸化ナトリウム及び塩化アルミニウムからなる）を含むアルコール含有率１０ないし６０％のエタノール溶液（水溶液）。

　本発明はまた、インフルエンザウイルス感染を予防する方法であって、前記散布剤をインフルエンザウイルスの感染が想定される場所に散布することからなる方法に関する。
　ヒトインフルエンザウイルスの感染が想定される場所としては、ヒトインフルエンザウイルスが多く存在しそうな場所であれば特に特定しないが、例えば、オフィス、教室、トイレ、病院、電車、乗用車、家庭内等が考えられる。
　また、鳥インフルエンザウイルスの感染が想定される場所としては、主に鶏舎が挙げられるが、これに留まらず、鳥インフルエンザウイルスを運ぶと考えられる野鳥が集まる場所や、鶏舎の近くで野鳥が休息するような場所等が考えられる。
　また、鶏舎に存在する全ての空間、鶏や卵を含む全ての物質が散布する対象として挙げられる。

　また、散布方法としては、薬剤を均一に散布し得る方法であれば特に限定されないが、噴霧器による噴霧で、特に、マイクロミストができる噴霧器による噴霧する方法が挙げられる。
　本発明の散布方法に使用される噴霧器としては、アルコール溶液を安全に噴霧し得る噴霧器であれば、特に限定されないが、例えば、液化炭酸ガスボンベから送出される気化ガスの圧力を利用して噴霧する噴霧器が好ましい。
　本発明の散布方法に使用可能な、具体的な噴霧器の１態様を図１に示した。
　即ち、液化炭酸ガスが充填されかつサイホン式送出機構を備えた炭酸ガスボンベ１０からの送出経路１１に、温度調整可能な加温器１２と圧力調整器１３を設けて、この送出経路１１と薬液タンク（容器）１４とを噴霧手段であるスプレーガン１５に接続してなり、液化炭酸ガスを加温気化して送出するとともに、薬液タンク１４内の薬液を前記気化ガス圧力を利用して噴霧できるようにした噴霧器である。
　図１に示した噴霧器では、薬液タンク１４内の薬液がなくなった場合には、新たに薬液タンクを取換補給すれば、継続的に使用できる。

　上記で記載したような噴霧器を用い、インフルエンザウイルスがいそうな空中や付着しそうな場所に本発明の散布剤を噴霧することにより、抗ウィルス効果を得ることができる。ヒノキチオール（若しくはその金属錯体又はそれらの塩）は分子量が小さいためにマイクロミスト液とともに長時間空中にただようことが解っており、これにより、ヒノキチオールは超微粒子になって煙霧化し、散布空間内の全体に渡って隅々まで万遍に侵入でき、また散布状態も均一化し、長期に亘って抗ウイルス効果を示すことが期待でき、また、これにより、使用する薬量を削減することも可能となる。
　特に、図１で示した噴霧器を使用した場合は、液化炭酸ガスの気化ガスを利用して噴霧するため、散布剤との化学反応を生じることがなく、薬液の性質変化のおそれがない。更に、特に薬液の容器とは別の液化炭酸ガスボンベから送出される気化ガスを利用して噴霧するものであるため、噴霧のためのガス容量が大きく、薬液容器を取換え補給することにより、長時間の継続的な噴霧が可能になり、噴霧能力が最後まで低下することもない。

　以下の実施例により本発明をより詳しく説明する。但し、実施例は本発明を説明するためのものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意図しない。
製造例１：ヒノキチオール銅錯体の製造
　ヒノキチオール１３１．８ｇ（０．８ｍｏｌ）をメタノール１６０ｇに溶解した。この溶液に、水８６ｇに水酸化ナトリウム２９．１ｇ（０．７２ｍｏｌ）を溶解させた水溶液を、４０℃ないし５０℃で３０分かけて滴下し、そのままの温度で１時間反応させた。更に、水２１０ｇに硫酸第二銅（ＣｕＳＯ₄）５水和物９４．２ｇ（０．３７７ｍｏｌ）を溶解させた水溶液を、４０℃ないし５０℃で１．６時間かけて滴下し、そのままの温度で１時間反応させた。冷却後、析出物を濾取し、濾物を水３００ｇで２回洗浄した。減圧下（１３３．３Ｐａ）４０℃で乾燥することにより、ヒノキチオール銅錯体１４７．５ｇを緑色塊として得た。

製造例２：ヒノキチオール塩化亜鉛混合物の製造
　ヒノキチオール３２．８ｇ（０．２ｍｏｌ）に４０℃ないし５０℃でメタノール１５０ｇを滴下して溶解し、そのままの温度で１時間攪拌した。この溶液に、メタノール１００ｇに塩化亜鉛（ＺｎＣｌ₂）１３．６ｇ（０．１ｍｏｌ）を溶解させた溶液を、３０℃ないし４０℃で１．６時間かけて滴下し、４０℃ないし４５℃で５時間反応させた。冷却後、析出物を濾取し、濾物をメタノール３０ｇで２回洗浄した。減圧下（１３３．３Ｐａ）１９ないし４８℃で乾燥することにより、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物３７．１ｇを淡黄色塊として得た。

製造例３：ヒノキチオールナトリウム塩の製造
　２５％水酸化ナトリウム水溶液１１２ｇ（０．７ｍｏｌ）を、ヒノキチオール１２１．１ｇ（０．７３８ｍｏｌ）をメタノール１６０ｇに溶解した溶液に、３５℃ないし４０℃でゆっくり滴下した。溶液を３０℃ないし４０℃で２時間反応させた。減圧下で溶媒（メタノール）を留去して黄色塊を沈殿させ、該残渣をアセトン３００ｇで再結晶し、濾過した後、減圧下（１３３．３Ｐａ、７時間）で乾燥することにより、黄色のナトリウム塩（２水和物、１３３ｇ）を得た。

実施例１：ヒノキチオール、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物及びヒノキチオールナトリウム塩のインフルエンザウイルス（ＰＲ－８株）に対する抗ウイルス効果
１．検体
　製造例２で得たヒノキチオール塩化亜鉛混合物を３０％エタノール水溶液に溶解して、１％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液及び０．３％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を調製し、製造例３で得たヒノキチオールナトリウム塩を３０％エタノール水溶液に溶解して、３％ヒノキチオールナトリウム塩溶液を調製し、ヒノキチオールを３０％エタノール水溶液に溶解して、１％ヒノキチオール溶液を調製し、被検溶液とした。
２．試験目的
　上記で調製した検体のインフルエンザウイルス（ＰＲ－８株）に対する不活性化試験を行う。
３．試験概要
　検体にインフルエンザウイルス液を添加・混合して作用液とした。室温で６０分間転倒混和を行い、作用後に作用液のウイルス感染価を測定した。尚、対照として３０％エタノール水溶液及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。
４．試験方法
１）試験ウイルス
　インフルエンザウイルス（ＰＲ－８株）（Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚ　ｖｉｒｕｓ　ＰＲ８　ｓｔｒａｉｎ）（発育鶏卵に接種、２日後に回収したもの　ＨＡ：２０４８）
２）使用細胞
　ＭＤＣＫ細胞（理研バイオリソースセンター）
３）使用培地
　（１）細胞増殖培地
　ダルベッコ変法ＭＥＭ（シグマ社）にカナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）及びウシ胎児血清（１０％）を加えたものを使用した。
　（２）細胞維持培地
　ダルベッコ変法ＭＥＭ（シグマ社）にカナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、トリプシン及びＢＳＡ（０．１％）を加えたものを使用した。
４）ウイルス浮遊液
　試験ウイルス液をＰＢＳにて１００倍に希釈して用いた。
５）試験操作
　検体０．５ｍＬにウイルス浮遊液０．５ｍＬを添加・混合し、作用液とした。室温で６０分間転倒混和により作用させた後、作用液を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０倍段階希釈した。
６）ウイルス感染価の測定
　細胞増殖培地を用い、使用細胞をマイクロプレート（９６穴）に単層培養した後、細胞増殖培地を除き、ＭＥＭにて２回洗浄した後に、作用液の各希釈液０．１ｍＬを４穴づつに接種し、３６℃の炭酸ガス（５％）インキュベーターにて１時間反応後、希釈液を取り除き、０．１ｍＬの細胞維持培地を各穴に加え、３６℃の炭酸ガス（５％）インキュベーターにて５日間培養した。培養後、倒立顕微鏡にて細胞変性の有無を観察及び培養液のＨＡの有無をニワトリ赤血球を用いて確認し、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法により５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）を算出した。
　結果を表１に纏めた。

　上記の成績から、ヒノキチオール、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物及びヒノキチオールナトリウム塩を用いた場合、ヒトインフルエンザウイルスは検出されず、これにより、ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することが確認された。

実施例２：ヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ht-Zn）のヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果
（１）薬剤濃度と感作時間および感作温度の検討
最適および最小感作濃度時間の検討（目的　薬剤の濃度と感作時間と感作温度との関係を調べる）
１．試験方法
　試験薬剤：合成ヒノキチオール（JCS、lot＃05928602）と塩化亜鉛を６５：３５の比率で30％エタノールに溶解し、1.0％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ht-Zn）30％エタノール溶液を希釈して試験に供した。
１）使用細胞および細胞培養用培地：MDCK細胞（理研バイオリソースセンター）より購入し、実験室で継代培養して実験に供した。MDCK細胞は、細胞増殖培地にダルベッコ変法MEM（DMEM、Sigma）にカナマイシン（0.05mg/mL）およびウシ胎児血清（10％）を加えたものを使用した。ウイルスの感染時の細胞維持培地としてDMEMにカナマイシン（0.05mg/mL）、トリプシン（0.625g/mL）およびBSA(0.1%)を加えたものを使用した。試験前日に96穴組織培養用プレートの各穴に2.5×10⁵/mL/細胞増殖培地に調整したMDCK細胞0.1mLを37℃CO₂（５％）インキュベーターで一晩培養し単層培養細胞とした。各穴を血清不含MEMで２回洗浄し試験に供した。
２）使用ウイルス：ヒトインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1)株は10日齢の発育鶏卵に接種3日後に回収したウイルス液を使用時に1×10⁶TCID₅₀/0.1mLとなるよう調整して用いた。
３）ウイルス増殖の確認：ウイルスの増殖確認は、ＭＤＣＫ細胞にウイルスを感作後5日間培養した後、更に細胞(２代目)に接種・培養し、培養上清中の鶏赤血球凝集能（HA）の有無を調べ最終判定とした。A/PR/8/34(H1N1)株はHAを有しているため、ウイルスが残存していた場合細胞に感染増殖した子ウイルスが培養上清中に放出され、結果培養上清中にHAが認められる。
　ニュートラルレッド取込試験：ニュートラルレッドが精細胞のリボゾームに取り込まれ蓄積される性質を利用した毒性試験を実施した。
　被験資料の培養液を取り除き、ニュートラルレッド溶液（150μg/mL/PBS）を0.1mL加え37℃CO₂（（５％）インキュベーターで2時間培養、ニュートラルレッド溶液を取り除き細胞を0.1mLのPBSで２回洗浄した後１%酢酸/50%エタノール溶液0.1mLを加え20分間反応させ細胞に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。抽出液を吸光度測定用マイクロプレートに移し540nmにて吸光度を測定した。

　薬剤の最適および最小感作時間を決定するために25℃および10℃にて以下の試験を実施した。
（方法）Ht-Znを30％エタノールを用いて希釈（0.3～0.01％）後等量のウイルス液（10⁶TCID₅₀/0.1mL）と混和し25℃で10分、20分あるいは30分間静置し感作後、直ちに氷冷したPBSにて1,000倍希釈し、0.1mLを2ウエル（96ウェルプレート）のMDCK細胞に接種し1時間反応後、感作希釈液をトリプシン含有細胞維持培地に置き換え37℃で５日間培養すした。培養後、培養液中の赤血球凝集性(HA)を調べ、HA陰性の培養液については、更に細胞(２代目)に接種・培養し、HA性の有無を調べウイルス増殖の最終判定とし、2ウエルともウイルス陰性となったものを陰性とした。対照として30%エタノールおよびPBSを用いて同様に行った。
　さらに感作温度の影響を検討するために同上の試験を感作温度10℃で行った。
　Ht-Znの有効濃度は3回の実験の平均値で表示した。
　本試験に用いたHt-Znの最大濃度は0.30％であり最終細胞感作濃度は0.00015%となるためHt-Znの細胞毒性が本試験に影響を及ぼさないと考えた。
結果：
　感作温度25℃におけるHt-Znの最小感作濃度は、0.15％（10分）、0.22％（20分）、0.15％（30分）であった（表２）
　感作温度10℃におけるHt-Znの最小感作濃度は、0.30％（20分）であった（表３）。
　感作時間10分では試験に供試した最大濃度0.3％でウイルス不活化効果が試験１では認められたが試験２では認められず試験３では１ウェルで不活化効果が認められた。また0.3%Ht-Znで感作時間30分では、試験２おいて不活化効果が認められたが試験１および３において各１ウェルのみ不活化効果が認められた。
　感作温度10℃で感作液を静置したところ、感作液中に白濁・沈殿が生じていた。
　感作温度10℃における不活化試験の成績の不安定さを検討する目的で、感作液を混和しながら60分間感作したところ、0.3％Ht-Zn溶液においてウイルス不活化効果が認められた。

（２）Ht-Znの抗ウイルス効果の確認
(目的　Ht-Znの抗ウイルス効果を調べる)
　薬剤の抗ウイルス効果を確認する目的で、他の薬剤や消毒剤との効果の比較を行った。
　Ht-Znの抗ウイルス効果を確認するために、最小有効濃度Ht-Zn（0.15％）A:2mg（力価）/mLストレプトマイシン0.0525%塩化亜鉛PBS溶液、C１:100％エタノール溶液、C２：50％エタノール溶液、C3: 30％エタノール溶液、E:0.0975%HT30％エタノール溶液F：0.1％BSA/PBS、H：0.0525%塩化亜鉛30%エタノール溶液と等量のウイルス液（10⁶TCID₅₀/0.1mL）と混和し25℃で30分間反応後、直ちに氷冷したPBSにて1,000倍希釈し薬剤の効果をなくし、0.1mLを2ウエル（96ウェルプレート）のMDCK細胞に接種し1時間反応後、感作希釈液をトリプシン含有細胞維持培地に置き換え37℃で５日間培養する。培養後、培養液中の赤血球凝集性(HA)を調べる。HA陰性の培養液については、更に細胞(２代目)に接種・培養し、HA性の有無を調べ最終判定とし、2ウエルともウイルス陰性となったものを陰性とする（陰性確認）。G最小有効濃度Ht-Zn（0.15％）を等量のPBSと混和し25℃で30分間反応後、同様に1000倍希釈後MDCK細胞に接種した。
参考として７
B:コロナウイルス（インフルエンザウイルス以外の薬剤感受性ウイルス）を用いた試験はMDCK細胞に対して試験に必要とする高いウイルス力価を示さないので実施できなかった（注1）。豚コロナウイルスのMDCK細胞への訓化およびVero細胞を用いて高力価ウイルスの回収を続けて行っている。
　パルボウイルスはMDCK細胞で増殖できないため実施せず（注２）。

結果：
　インフルエンザウイルスと0.15％Ht-Zn30％エタノール溶液を25℃30分間感作しウイルスの増殖が認められないことを確認した。対照区において、AウイルスとHT以外の薬剤と塩化亜鉛混合物、C3ウイルスと30％エタノール、EウイルスとHT単身溶液、Fウイルスと希釈液感作液およびHウイルスと塩化亜鉛単身溶液でウイルスの増殖が認められた。また、C1ウイルスと100%あるいはC2ウイルスと50％エタノールの感作液においてウイルスの増殖は認められなかった。以上の結果、Ht-Znのウイルス不活化効果はヒノキチオールと塩化亜鉛を混合することにより認められることが明らかになった。

考察
　今回の試験・調査において高濃度薬剤（2％Ht-Zn/50％エタノール溶液）の段階希釈の使用が求められていたが、高濃度薬剤をPBSにて希釈すると薬剤が析出・分離し、抗ウイルス効果が消失した。このため0.3％Ht-Zn30％エタノール溶液を出発材料として希釈を行い試験を実施した。
　高濃度薬剤（2％Ht-Zn/50％エタノール溶液）は常温保存中に沈殿（ヒノキチオールと思われる）が生じ、その上清には抗ウイルス効果は認められないことがわかった。また、感作温度10℃での試験において試験最大濃度である0.3%HTZとウイルスの感作液は、反応時間中に感作液に白濁・沈殿が生じ、試験結果に影響を及ぼし抗ウイルス効果の減弱が認められた。
　対照区においてヒノキチオール感受性および非感受性ウイルスを用いた試験は、コロナウイルスがMDCK細胞において抗ウイルス効果試験実施可能なウイルス力価（ウイルス濃度）にまで増殖しなかっため、パルボウイルスにおいてはMDCK細胞でウイルス増殖を示さなかっため、抗ウイルス効果試験を実施していない。コロナウイルスについては高力価ウイルスの作成を試みている。
　Ht-Zn溶液あるいは感作液において白濁・沈殿が生じた場合、急激に抗ウイルス効果の減弱が認められた。これは高濃度HTエタノール溶液のPBS等での希釈液においてHTが分離し抗ウイルス効果が認められなくなる現象とよく一致していた。Ht-Znのウイルス不活化作用はHt-Znが溶媒に溶解していることが必要であると考えられた。実用を考えた場合、エタノール溶液で完全に溶解した状態での噴霧が考えられ、対象物は固形物であることから、Ht-Znの再分離等の問題は発生しないと思われる。
　Ht-Znの最小感作濃度（感作温度25℃）は0.15％（10分）、0.22％（20分）、0.15％（30分）である。感作温度10℃ではHt-Znの分離が起こり安定した結果が得られなかった。
　対照区を用いた試験の結果、ヒノキチオールと塩化亜鉛の混合物溶解液にはウイルス不活化作用が認められた。

実施例３：鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果
１）鳥インフルエンザウイルス
　１９８３年大槻等が島根県に飛来したコハクチョウの糞から分離した弱毒のＨ５亜型ウイルスであるＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ　ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ／４９９／８３（Ｈ５Ｎ３）株を、ヒナで継代することにより、強毒化させることに成功した。該強毒化させたウイルスを以下の実験に使用した。
２）ＳＰＦ１０日齢発育鶏卵
　栃木県青木種鶏場から有精卵を購入し、孵卵して実験に供した。
３）試験
　製造例１で得たヒノキチオール銅錯体、製造例２で得たヒノキチオール塩化亜鉛混合物をそれぞれ、５０％エタノール水溶液に溶解して、１％ヒノキチオール銅錯体溶液、２％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液及び０．１５％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を調製し、被検溶液とした。
　上記で調製した被検溶液にウイルス液を等量加えよく混合した。陰性対象として、５０％エタノール水溶液を用い、同様にウイルス液を等量加えよく混合した。
　それぞれの溶液を室温にて１０分間静置した後、速やかに被検溶液－ウイルス混合液をＰＢＳで１０倍段階希釈し、希釈毎に３個の１０日齢発育鶏卵の漿尿膜腔内に０．２ｍＬづつ接種した。
　接種を受けた発育鶏卵は３７℃で４８時間培養した後、０．５％鶏赤血球凝集（ＨＡ）試験により、漿尿液中でのウイルスの増殖の有無を確認した。残存ウイルス価はＲｅｅｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈの方法により算出した。
　各被検溶液－ウイルス混合液における累積陰性数、累積陽性数及び累積陽性率を表５ないし８に示し、ウイルス力価を表９に纏めた。
　また、図２にヒノキチオール及びヒノキチオール塩化亜鉛混合物の濃度に対する鳥インフルエンザウイルスのウイルス力価をグラフとして示した。

　上記の成績から、両被検体液と鳥インフルエンザウイルスとの室温での１０分間の接触により、検査した限りウイルスの生残は認められず、少なくとも１０００分の１以下にウイルスが不活化されたことが明らかとなった。本被検体は、鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することが確認された。
　また、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物は、０．１５％という低濃度においても抗ウイルス効果を示すことが実証された（表９及び図２）。

実施例４：ヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ht-Zn）の鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果
（１）薬剤濃度と感作時間および感作温度の検討
（目的　薬剤の濃度と感作時間と感作温度との関係を調べる）
１）最適および最小感作濃度時間の検討
(目的　抗ウイルス効果の濃度と時間の関係を調べる)
１．試験方法
１）試験薬剤：合成ヒノキチオール（JCS、lot＃05928602）と塩化亜鉛を６５：３５の比率で50％エタノールに溶解し、1.0％ヒノキチオール亜鉛混合物（Ht？Zn）50％エタノール溶液を基本濃度として希釈して試験に供した。
使用鶏卵（SPF10日齢発育鶏卵）：栃木県青木種鶏場から有精卵を購入し、本研究センターで孵卵して実験に供した。
　使用ウイルス：鳥インフルエンザウイルスA/Whistling swan/Shimane/499/83(H5N3)株は10日齢の発育鶏卵に接種２日後に回収したウイルス液（ウイルス力価1×10^8.5EID₅₀/0.1mL）を用いた。
２）ウイルス増殖の確認：ウイルスの増殖確認は、発育鶏卵にウイルスを接種後２日間培養した後、更に発育鶏卵(２代目)に接種・培養し、尿膜腔液中の鶏赤血球凝集能（HA）の有無を調べ最終判定とした。

　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を50%エタノール水溶液に溶解し、0.8%、0.4%、0.2%および0.1%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を作成し、被検溶液とした。また、陰性対照として50%エタノール水溶液を用いた。PBSで100倍に希釈したウイルス液400μLと被検溶液400μLを混合し25℃または4℃で1、10、20および30分間静置後、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。0.8%被検溶液は鶏卵致死性があるためPBSで10倍に希釈し、陰性対照は30分静置後PBSで10倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体は、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に接種し、上記と同様の方法でウイルス増殖の有無を判定した。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
（反応温度25℃）
　被検溶液とウイルス液を25℃で各時間反応させた場合のウイルス生残率を表１０に示す。また、陰性対照とウイルス液を30分間反応させた場合のウイルス力価は10^6.25EID₅₀/0.2mL以上であった。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液が0.4%の濃度の場合、1分間でウイルスを100%不活化することが示された。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液が0.1%未満の場合、30分間の反応でもウイルスを100%不活化することはできなかった。また、0.2%の濃度では1分間の反応時間ではウイルスを100%不活化することはできなかったが、反応時間を10分間以上にのばすことでウイルスを完全に不活化することが可能であることが確認された。

（反応温度4℃）
　被検溶液とウイルス液を4℃で各時間反応させた場合のウイルス生残率を表１１に示す。また、陰性対照とウイルス液を30分間反応させた場合のウイルス力価は10^6.42EID₅₀/0.2mL以上であった。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が0.8%の濃度の場合、1分間でウイルスを100%不活化することが示された。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が0.2%未満の場合、30分間の反応でもウイルスを100%不活化することができなかったが、0.4%の濃度では10分間以上反応させることでウイルスを100%不活化することが可能であることが確認された。

＜結論＞
　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液とウイルス液を等量反応された場合、反応時間を長くすることによって、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液の抗インフルエンザウイルス効果が増強されることが確認された。25℃で反応させた場合は0.2%の濃度のヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を、4℃で反応させた場合は0.4%の濃度のヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液をウイルス液と10分間反応させることによりインフルエンザウイルスを不活化させることが可能であることが示された。

２）感作温度の検討
(目的　抗インフルエンザウイルス効果の温度との関係を調べる)
　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を50%エタノール水溶液に溶解し、0.4%、0.2%および0.1%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を作成し、被検溶液とした。また、対照として50%エタノール水溶液および100%エタノールを用いた。PBSで100倍に希釈したウイルス液400μLと被検溶液400μLを混合した。陰性対照として0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液400μLとPBS400μLを混合した。4℃、10℃、および25℃で10分間静置後、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。50%エタノール水溶液とウイルス液との混合液は10分静置後PBSで10倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体については、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種し、上記と同様の方法でウイルス増殖の有無を判定した。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
　被検溶液とウイルス液を10分間、各温度で反応させた場合のウイルス生残率を表１２に示す。また、50%エタノール水溶液とウイルス液を4℃、10℃および25℃で反応させた場合のウイルス力価はそれぞれ10^6.5EID₅₀/0.2mL、10⁶EID₅₀/0.2mLおよび10^6.5EID₅₀/0.2mL以上であった。0.4%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液は4℃および10℃の条件下で、ウイルス液と10分間反応することにより完全にウイルスを不活化した。また、0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液および100%エタノールでは、4℃および10℃の条件下では十分な抗インフルエンザウイルス効果を示さなかったが、25℃の条件下では完全にウイルスを不活化することが確認された。

＜結論＞
　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液は、反応温度によって抗インフルエンザウイルス効果に違いがあり、反応温度の上昇により効果が増強されることが確認された。

３）Ht-Znの抗ウイルス効果の確認
（目的　Ht－Znの抗ウイルス効果を調べる）
　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を50%エタノール水溶液に溶解し、0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を作成し、被検溶液とした。対照としてA:ストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液(0.01%ストレプトマイシン:0.06%塩化亜鉛:溶媒50%エタノール水溶液)、C:100%エタノール、E:0.2%ヒノキチオール50%エタノール水溶液およびF:50%エタノール水溶液を用いた。以上は被検ウイルスとして鳥インフルエンザウイルスを用い、B:ニューカッスル病ウイルス(NDV)-La Sota株、D:鶏伝染性気管支炎ウイルス(IBV)-Beaudette42株を被検ウイルスとした。PBSで100倍に希釈した各ウイルス液400μLと被検溶液400μLを混合した。陰性対照として、G:0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液400μLとPBS400μLを混合し用いた。25℃で10分間静置後、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。50%エタノール水溶液とウイルス液との混合液は10分静置後PBSで10倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体については、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種し、上記と同様の方法でウイルス増殖の有無を判定した。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
　被検溶液と各ウイルス液を10分間反応させた場合のウイルス生残率を表１３に示す。また、50%エタノール水溶液とインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルス液を10分間反応させた場合のウイルス力価はそれぞれ10^6.5EID₅₀/0.2mL以上、10^2.5EID₅₀/0.2mL以下および10^3.5EID₅₀/0.2mLであった。0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液とインフルエンザウイルスを反応させた場合、わずかに生残するウイルスが存在したが、ニューカッスル病ウイルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスに比べ低い値であったウイルスは不活化された。また、E:0.2%ヒノキチオール溶液およびA:ストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液は、ウイルスを不活化させることはできなかった。
　ニューカッスル病ウイルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスでは0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液と10分間の反応では、ウイルスの生残が認められた（44.4%および66.6%）。

＜結論＞
　0.2%ヒノキチオール溶液およびストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液では本試験条件において抗ウイルス効果が確認されなかったことから、本試験で確認された抗ウイルス効果はヒノキチオール単体および塩化亜鉛単体の作用ではなくヒノキチオール塩化亜鉛混合物によるものであることが確認された。

実施例５：散布剤の噴霧試験（ヒトインフルエンザウイルス）
　噴霧器を用いて噴霧した際のヒノキチオール（金属錯体）の散布・残存状態を評価するために、以下の試験を行った。
　実施例２にて調製した１％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を、液化炭酸ガスボンベの圧力を利用して噴霧する噴霧器（シャットノクサス（登録商標）、新耕産業（株）社製）を用いて部屋内に噴霧し、部屋内で無作為に選ばれた４箇所における噴霧前と噴霧後の採菌による一般生菌、黄色ブドウ球菌及び真菌の菌数の減少度合いを、ヒノキチオール（金属錯体）の散布・残存状態の評価とした。噴霧は、おおよそ１０ｍ³当りに、１％ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液４０ｍＬを部屋内にまんべんなく噴霧し、２０分後に採菌した。
　結果を表１４に纏めた。

　表１４から、液化炭酸ガスボンベの圧力を利用する噴霧器による噴霧により、何れの採菌箇所においても細菌の繁殖が抑えられており、このことより、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が部屋内において、まんべんなく散布・残存していることが判った。
　上記の噴霧試験結果は、実施例１、２において実証されたヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果が、噴霧により部屋内でもまんべんなく発揮されるであろうことを明確に示すものである。

実施例６：散布剤の噴霧試験（鳥インフルエンザウイルス）
　噴霧器を用いて噴霧した際のヒノキチオール（金属錯体）の散布・残存状態を評価するために、以下の試験を行った。
　実施例１にて調製した１％ヒノキチオール銅錯体溶液を、液化炭酸ガスボンベの圧力を利用して噴霧する噴霧器（シャットノクサス（登録商標）、新耕産業（株）社製）を用いて鶏舎内に噴霧し、鶏舎内で無作為に選ばれた４箇所における噴霧前と噴霧後の採菌による一般生菌、黄色ブドウ球菌及び真菌の菌数の減少度合いを、ヒノキチオール（金属錯体）の散布・残存状態の評価とした。噴霧は、おおよそ１０ｍ³当りに、１％ヒノキチオール銅錯体溶液４０ｍＬを鶏舎内にまんべんなく噴霧し、２０分後に採菌した。
　結果を表１５に纏めた。

　表１５から、液化炭酸ガスボンベの圧力を利用する噴霧器による噴霧により、何れの採菌箇所においても細菌の繁殖が抑えられており、このことより、ヒノキチオール銅錯体が鶏舎内において、まんべんなく散布・残存していることが判った。
　上記の噴霧試験結果は、実施例３，４において実証された鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果が、噴霧により鶏舎内でまんべんなく発揮されるであろうことを明確に示すものである。

実施例７：安全性試験
　ヒノキチオール塩化亜鉛混合物に付き、以下に示す安全性試験を実施した。
ｉ）ラットを用いる２８日間混餌投与毒性試験
ｉｉ）ラットにおける急性経口投与毒性試験
ｉｉｉ）ウサギを用いる皮膚刺激性試験
ｉｖ）ウサギを用いる眼刺激性試験
ｖ）細菌を用いる復帰突然変異試験
　結論として、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物の毒性は、安全性の高いヒノキチオールと変わらないことが解り、環境、安全性に付いても問題が無いことが分った。尚、全試験において異常は認められなかった。

符号の説明

１０：炭酸ガスボンベ
１１：送出経路
１２：温度調整可能な加温器
１３：圧力調整器
１４：薬液タンク（容器）
１５：スプレーガン

Claims

ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩を含む水溶液又はアルコール含有率１０ないし６０％のアルコール溶液を含むインフルエンザウイルス感染を予防するための散布剤。
前記ヒノキチオール若しくはその金属錯体又はそれらの塩において２種以上の金属が使用される請求項１記載の散布剤。
前記金属が銅、亜鉛、アルミニウム、ビスマス又はこれらの混合物である請求項２記載の散布剤。
前記金属として、亜鉛を含む請求項３記載の散布剤。
前記金属錯体として、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を用いる請求項１記載の散布剤。
アロエ、緑茶、熊笹、及びドクダミからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物抽出物を含む請求項１ないし５の何れか１項に記載の散布剤。
グリセリン及び界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む請求項１ないし６の何れか１項に記載の散布剤。
前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである請求項１ないし７の何れか１項に記載の散布剤。
インフルエンザウイルス感染を予防する方法であって、請求項１ないし８の何れか１項に記載の散布剤をインフルエンザウイルスの感染が想定される場所に散布することからなる方法。
散布方法が、空気中への噴霧である請求項９記載の方法。
前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである請求項９又は１０記載の方法。