JP2011037747A - 抗インフルエンザウイルス用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】抗インフルエンザウイルス用組成物を提供する。
【解決手段】ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる錯体を、０．０１ないし１質量％含有する抗インフルエンザウイルス用組成物。好ましくは、抗インフルエンザウイルス用組成物のｐＨを５．５ないし７の範囲とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗インフルエンザウイルス用組成物に関するものであり、詳細には、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物を、０．０１ないし１質量％含有する抗インフルエンザウイルス用組成物に関する。

近年、抗インフルエンザ薬が盛んに研究・開発され、タミフル（登録商標）やザナミヴィル（登録商標）等のインフルエンザウイルスの増殖を抑えることができる薬剤が開発されるに至っている。しかし、これらの抗インフルエンザ薬は、使用可能時期が狭い範囲に限られたり、また、副作用の観点から必ずしも汎用に適した薬剤といえるものではなく、更に、これらの抗インフルエンザ薬はインフルエンザウイルスの増殖を個人レベルで抑える作用を持つものの、インフルエンザウイルス感染が拡大するのを予防し得るものではない。
そのため、インフルエンザウイルスの感染拡大を予防するために、手洗い、うがい、手の消毒等をまめに行うことが推奨されている。

一方、ヒノキチオールと亜鉛化合物を含有する組成物が、抗菌剤として有用であることが知られている（例えば、引用文献１参照。）
また、ヒノキチオールと亜鉛化合物を含有する組成物がＨＩＶウイルスに対して抗ウイルス活性を示すことも報告されている（例えば、引用文献２参照。）
しかし、インフルエンザウイルス対して抗ウイルス活性を示し得る組成物に付いては記載されていない。

国際公開第９３／１７５５９号パンフレット 特開平０８−２５９４３９号公報

本発明は、抗インフルエンザウイルス活性及び安全性に優れる抗インフルエンザウイルス用組成物の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒノキチオールと塩化亜鉛とからなる混合物が抗インフルエンザウイルス活性を有すること、その際、ヒノキチオールと塩化亜鉛の使用量をモル比で１：０．４ないし１：０．６の範囲とすると優れた抗インフルエンザウイルス活性を示し、それにより、少ない量で抗インフルエンザウイルス活性を示す組成物の提供が可能となり、結果として、抗インフルエンザウイルス活性及び安全性に優れる抗インフルエンザウイルス用組成物の提供が可能となることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、
（１）ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物を、０．０１ないし１質量％含有する抗インフルエンザウイルス用組成物、
（２）前記混合物が、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４５ないし０．５５モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる前記（１）記載の抗インフルエンザウイルス用組成物、
（３）ｐＨが５．５ないし７となる前記（１）又は（２）記載の抗インフルエンザウイルス用組成物、
（４）前記混合物を０．１５ないし１質量％含有する前記（１）ないし（３）の何れか１つに記載の抗インフルエンザウイルス用組成物、
（５）水及びアルコールを含有する前記（１）ないし（４）の何れか１つに記載の抗インフルエンザウイルス用組成物、
（６）前記（１）ないし（５）の何れか１つに記載の抗インフルエンザウイルス用組成物を含む洗浄剤、
（７）前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである前記（１）ないし（５）の何れか１つに記載の抗インフルエンザウイルス用組成物、
に関する。

本発明により、抗インフルエンザウイルス活性及び安全性に優れる抗インフルエンザウイルス用組成物の提供が可能となる。
従って、本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、例えば、インフルエンザウイルス感染を予防するための洗浄剤等の使用において有用である。

ヒノキチオール及びヒノキチオール塩化亜鉛混合物の濃度に対する鳥インフルエンザウイルスのウイルス力価を示すグラフである。

更に詳細に本発明を説明する。
本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物を、０．０１ないし１質量％含有する。

本発明に使用するヒノキチオールは、タイワンヒノキ、ヒバ、アスナロ等の原料植物に由来する精油から抽出された天然物でもよく、化学合成品でもよい。また、市販品のヒノキチオールをそのまま用いてもよい。原料植物としては、入手容易性の観点から、ヒバが好ましい。原料植物からのヒノキチオールの抽出・精製は公知の方法により行うことができる。前記精油としてはヒバ油が好ましい。化学合成品も公知の方法により得ることができる。市販のものとしては、たとえば、高砂香料（株）や大阪有機化学工業（株）から販売されているものを挙げることができる。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物においては、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物を使用する。
前記混合物は、好ましくは、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４５ないし０．５５モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物であり、より好ましくは、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．５モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物である。

前記混合物の使用量は、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、
０．０１ないし１質量％の範囲であり、好ましくは、０．１５ないし１質量％の範囲である。
また、本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物に使用する塩化亜鉛は、例えば、市
販で入手することができる。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、水及びアルコールを含有することができる。
上記水としては、水道水でも脱イオン水や蒸留水等の精製水でも使用できるが、脱イオン水等の精製水を使用するのが好ましい。
上記アルコールとしては、たとえば、メタノール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。これらは単独であるいは複数を組み合わせて使用してもよい。好ましいアルコールはエタノールである。

上記水及びアルコールは、アルコール含有率１０ないし６０％となるアルコール（水溶液）として使用するのが好ましい。
上記水及びアルコールを使用する際の使用量は、特に限定されるものではないが、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、合計で、例えば、１０ないし９８質量％の範囲で使用し得る。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、グリセリンを含むこともできる。
グリセリンとしては、グリセリンおよびグリセリンの各種誘導体が挙げられる。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、クエン酸及び／又はクエン酸のアルカリ金属塩を含むのが好ましい。クエン酸のアルカリ金属塩としてはクエン酸ナトリウムが好ましい。
本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、エチレンジアミン四酢酸又はそのアルカリ金属塩を含むのが好ましい。エチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩が好ましく、また、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウムが好ましい。
本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、エチドロン酸又はそのアルカリ金属塩を含むのが好ましい。エチドロン酸のアルカリ金属塩が好ましく、また、エチドロン酸４ナトリウムが好ましい。
本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、亜鉛化合物の他に、更に、ナトリウム化合物、アルミニウム化合物を添加することもできる。
上記ナトリウム化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム等が挙げられ、アルミニウム化合物としては、例えば、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミン酸、クロロヒドロキシアルミニウム、塩化アルミニウム、フッ化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硝酸アルミニウム、ホウ酸アルミニウム、リン酸アルミニウム、カリウムミョーバン、アンモニウムミョーバン、ナトリウムミョーバン等が挙げられる。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、アロエ、緑茶、熊笹、及びドクダミからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物抽出物を含むこともできる。
アロエの抽出物とは、主にアロエが葉に持つゼリー状の身（葉肉）を厚搾抽出法で抽出し、熱を加えて濃縮安定化したエキスをいう。このようなアロエエキスに代えて、主成分であるアントラキノン誘導体のアロインやバーバーロインを用いてもよい。アロエ抽出物には、アロインやバーバーロインの他、アロエ‐エモジン、アロエシン、アロエニンなども含まれる。
アロエの抽出物を使用する際の使用量は、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、０．００２ないし１０質量％、好ましくは、０．０１ないし１質量％、より好ましくは、０．０５ないし０．２５質量％の範囲で使用し得る。

緑茶の抽出物としては、粉砕した緑茶を熱湯で抽出し、精製し濃縮した液を使用する。緑茶の抽出物の主成分は茶ポリフェノールである。茶ポリフェノールは、分子内にフェノ
ール性水酸基を複数もつ化合物の総称で、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、エピガテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどを主要成分とする。
緑茶の抽出物を使用する際の使用量は、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、０．００２ないし１０質量％、好ましくは、０．０１ないし１質量％、より好ましくは、０．０５ないし０．２５質量％の範囲で使用し得る。

熊笹の抽出物は、低温高圧圧搾抽出法で、熊笹を抽出することにより得られる。低温高圧圧搾抽出法は、熊笹を高圧に設定した機械装置によって温度を上げずに抽出する方法で、その時にしぼり出された液を濃縮した液が熊笹抽出物となる。熊笹は、日本や中国に広く分布しているイネ科のササの１種である。熊笹の抽出物には、主成分であるトリテルペノール（β−アミリン・フリーデン）の他、リグニン残渣、還元糖、グルコースなどの糖類も含まれている。熊笹の抽出物に代えて、これらの合成品の混合物を用いることもできる。
熊笹の抽出物を使用する際の使用量は、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、０．００１ないし５質量％、好ましくは、０．００５ないし０．３質量％、より好ましくは、０．０１ないし０．１質量％の範囲で使用し得る。

ドクダミは、日本、タイワン、中国、ヒマラヤ、ジャワに分布し、山野や庭などに見られる多年草である。ドクダミの抽出物は、熊笹と同様に、低温高圧圧搾抽出法という方法で抽出する。ドクダミ抽出物には、クエルシトリン（quercitrin）、アフゼニン（afzenin）、ハイぺリン（hyperin）、ルチン、クロロゲン酸、β−シトステロール、cisおよびtrans-Ｎ-(4-ヒドロキシスチリル）が含まれている。熊笹の抽出物に代えて、これらの合
成品の混合物を用いることもできる。
ドクダミの抽出物を使用する際の使用量は、抗インフルエンザウイルス用組成物の質量に基づいて、０．００１ないし５質量％、好ましくは、０．００１ないし０．３質量％、より好ましくは、０．０１ないし０．１質量％の範囲で使用し得る。

前記抽出物を使用する際は、アロエ、緑茶、熊笹及びドクダミの抽出物から選択される１種類だけを用いてもよいが、２種類以上を併用することが好ましく、上記４種の抽出物を全て含むのがより好ましい。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、本発明の効果を阻害しない限り、他の成分を配合してもよく、例えば、ジグリセリン、ジグリセリン誘導体（例えば、ポリオキシプロピレン（９）ジグリセリルエーテル、ポリオキシプロピレン（１４）ジグリセリルエーテル）、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、１，２−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、１，２−ノナンジオール、１，２−デカンジオール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、砂糖、マルチトール、トレハロース、グルコシルトレハロース等の保湿剤、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、キチン、キトサン、アロエエキス、オウレンエキス等の薬効成分、オウゴンエキス、酵母エキス、ユーカリエキス、クジンエキス、ローズマリーエキス、チョウジエキス、アスパラサネリアスエキス、クマザサエキス、イラクサエキス、紅茶エキス、ウーロン茶エキス、甘茶エキス、柿エキス等の消臭エキス等が配合可能である。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、柿の葉、松、杉、あま茶づる、シソ、ワサビ、アカネ、ウメ、ニンニク、ペパーミント、ヨモギ、サンショウ、ダイオウ、アザミ、ハッカ、ビワ、ムラサキ、ラベンダー、レモングラス、及びレンギョウの抽出成分、ハチミツより抽出されるプロポリス等を含有してもよい。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物の最終的なｐＨは、５．５ないし７の範囲とするのが好ましく、より好ましくは、６．０ないし７の範囲である。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物の好ましい態様としては、以下が挙げられる。
０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の抗インフルエンザウイルス用組成物。
０．１５〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の抗インフルエンザウイルス用組成物。
０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化アルミニウム混合物、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール水酸化ナトリウム混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の抗インフルエンザウイルス用組成物。

本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、鳥インフルエンザウイルス及びヒトインフルエンザウイルスの双方に優れた抗ウイルス活性を有するものであるため、種々のインフルエンザウイルス感染を予防するために、ウェットティッシュ、化学雑巾、ペーパータオル、おしぼり、カーペット、フロアー、一般衣類、一般器具類、医療用衣類等に有利に使用し得る。

本発明はまた、上記した抗インフルエンザウイルス用組成物を含む洗浄剤にも関する。
本発明の洗浄剤は、通常、上記した抗インフルエンザウイルス用組成物に加えて、界面活性剤を有する。
本発明に使用し得る界面活性剤としては、ノニオン界面活性剤であるポリアルキレングリコールエーテルが好ましい。
本発明で使用するポリアルキレングリコールエーテルとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）の化合物が挙げられる。

（式中、Ｒ¹およびＲ²は、同一または相異なって、それぞれ、水素原子、炭素数１０〜２０のアルキル基または炭素数１０〜２０のアルケニル基を表す。但し、Ｒ¹が水素原子の
時、Ｒ²は水素原子ではない。Ｒ³は水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を表す。ｍは２〜５０の整数を表す。）。

上記一般式（Ｉ）において、Ｒ¹およびＲ²における「炭素数１０〜２０のアルキル基」は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、好ましい炭素数は１２〜１８である。Ｒ¹およびＲ²における「炭素数１０〜２０のアルケニル基」は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、好ましい炭素数は１２〜１８である。また、Ｒ³における「炭素数１〜５のアルキル基」は直鎖状
でも分岐鎖状でもよく、好ましい炭素数は１〜３である。ｍは１０〜３０が好ましい。

上記一般式（Ｉ）のポリアルキレングリコールエーテルにおいては、モノエーテル体とジエーテル体があるが、本発明においては、親水性がより高い点から、モノエーテル体が好適である。また、ポリアルキレングリコールエーテルの中でも、ポリエチレングリコー
ルエーテル（即ち、Ｒ³が水素原子）が好適に使用される。ポリエチレングリコールモノ
エーテルの好適な具体例としては、ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、ポリオキシエチレンモノオレイルエーテル、ポリオキシエチレンモノセチルエーテル、ポリオキシエチレンモノステアリルエーテル、ポリオキシエチレンモノイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンモノベヘニルエーテル等が挙げられ、中でも、起泡性が特に優れている点から、ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、ポリオキシエチレンモノオレイルエーテル、ポリオキシエチレンモノセチルエーテル、ポリオキシエチレンモノイソステアリルエーテルが好適に使用されるが、ポリオキシエチレンモノオレイルエーテルが特に好ましい。

上記のポリアルキレングリコールエーテルは、そのＨＬＢが１０以上、特に１０〜２５であることが好ましい。
上記のポリアルキレングリコールエーテルは、単独で使用しても、あるいは２種以上を併用してもよい。

ポリアルキレングリコールエーテルは、洗浄剤の質量に基づいて、０．０１ないし５．０質量％、好ましくは、０．１ないし１．０質量％の範囲で使用し得る。
その際、洗浄剤中に含まれるヒノキチオールと塩化亜鉛とからなる混合物の使用量は、洗浄剤の質量に基づいて、０．０１ないし１質量％の範囲とする野が好ましく、０．１５ないし１質量％の範囲とするのがより好ましい。

本発明の洗浄剤においては、本発明の効果を阻害しない限り、その他のノニオン界面活性剤、例えば、レシチン、レシチン誘導体、アクリル系の高分子乳化剤等を併用してもよい。
本発明の洗浄剤の最終的なｐＨは、５．５ないし７の範囲とするのが好ましく、より好ましくは、６．０ないし７の範囲である。
本発明の洗浄剤のｐＨを上記範囲に調整する方法としては、一般的に使用されるｐＨ調節剤を添加することにより行うこともできるが、本発明の洗浄剤に使用し得る上述の添加剤の中で、ｐＨ調節能を有する化合物の添加量を調整することにより行うこともできる。
例えば、本発明の洗浄剤に好ましく使用し得る、クエン酸、クエン酸のアルカリ金属塩、例えば、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩、例えば、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム、エチドロン酸、エチドロン酸のアルカリ金属塩、例えば、エチドロン酸４ナトリウム等で調節することができる。
本発明の洗浄剤にクエン酸ナトリウムが添加される場合、このクエン酸ナトリウムの使用量でｐＨを調節するのが好ましい。

本発明の洗浄剤の好ましい態様としては、以下が挙げられる。
０．０１〜５．０質量％の上記のポリアルキレングリコールエーテル、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の洗浄剤。
０．０１〜５．０質量％の上記のポリアルキレングリコールエーテル、０．１５〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の洗浄剤。
０．０１〜５．０質量％の上記のポリアルキレングリコールエーテル、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化亜鉛混合物、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール塩化アルミニウム混合物、０．０１〜１．０質量％のヒノキチオール水酸化ナトリウム混合物、水、エタノール及びグリセリンを含むｐＨ５．５ないし７の洗浄剤。

上記した、本発明の抗インフルエンザウイルス用組成物は、鳥インフルエンザウイルス及びヒトインフルエンザウイルスの双方に抗ウイルス活性を有するものであり、従って、
本発明は、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスを対象とする抗インフルエンザウイルス用組成物にも関する。
鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスを対象とする抗インフルエンザウイルス用組成物の構成としては前記で提示されたものと同様の組成物を用いることができる。

以下の実施例により本発明をより詳しく説明する。但し、実施例は本発明を説明するためのものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意図しない。

製造例１：抗インフルエンザウイルス用組成物の調製
ヒノキチオール３２．８ｇ（０．２ｍｏｌ）に４０℃ないし５０℃でメタノール１５０ｇを滴下して溶解し、そのままの温度で１時間攪拌した。この溶液に、メタノール１００ｇに塩化亜鉛（ＺｎＣｌ₂）１３．６ｇ（０．１ｍｏｌ）を溶解させた溶液を、３０℃な
いし４０℃で１．６時間かけて滴下し、４０℃ないし４５℃で５時間反応させた。冷却後、析出物を濾取し、濾物をメタノール３０ｇで２回洗浄した。減圧下（１３３．３Ｐａ）１９ないし４８℃で乾燥することにより、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物３７．１ｇを淡黄色塊として得た。
上記で得られたヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ｈｔ−Ｚｎ）を３０％エタノール（水溶液）又は５０％エタノール（水溶液）に溶解して以下の抗インフルエンザウイルス用組成物を調製した。
１．０％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．３％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
２．０％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）
０．１５％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）

製造例２：抗インフルエンザウイルス用組成物の調製
合成ヒノキチオール（JCS、lot＃05928602）と塩化亜鉛を６５：３５の比率（ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．５４）で混合し、これを３０％エタノール（水溶液）又は５０％エタノール（水溶液）に溶解して以下の抗インフルエンザウイルス用組成物を調製した。
１．０％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．３％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．１５％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．１０％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．０５％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
０．０１％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）
１．０％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）
０．８％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）
０．４％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）
０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）
０．１％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）

製造例３：ヒノキチオールナトリウム塩を含む組成物の調製
２５％水酸化ナトリウム水溶液１１２ｇ（０．７ｍｏｌ）を、ヒノキチオール１２１．１ｇ（０．７３８ｍｏｌ）をメタノール１６０ｇに溶解した溶液に、３５℃ないし４０℃でゆっくり滴下した。溶液を３０℃ないし４０℃で２時間反応させた。減圧下で溶媒（メタノール）を留去して黄色塊を沈殿させ、該残渣をアセトン３００ｇで再結晶し、濾過した後、減圧下（１３３．３Ｐａ、７時間）で乾燥することにより、黄色のナトリウム塩（
２水和物、１３３ｇ）を得た。
上記で得られたヒノキチオールナトリウム塩を３０％エタノール（水溶液）に溶解して、３％ヒノキチオールナトリウム塩３０％エタノール（水溶液）を調製した。

試験例１：ヒノキチオール、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物及びヒノキチオールナトリウム塩のインフルエンザウイルス（ＰＲ−８株）に対する抗ウイルス効果
１．検体
製造例１で調製した、１．０％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）及び０．３％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）、製造例３で調製した３％ヒノキチオールナトリウム塩３０％エタノール（水溶液）、及び、ヒノキチオールを３０％エタノール水溶液に溶解して調製した、１％ヒノキチオール３０％エタノール（水溶液）を被検溶液とした。
２．試験目的
上記で調製した検体のインフルエンザウイルス（ＰＲ−８株）に対する不活性化試験を行う。
３．試験概要
検体にインフルエンザウイルス液を添加・混合して作用液とした。室温で６０分間転倒混和を行い、作用後に作用液のウイルス感染価を測定した。尚、対照として３０％エタノール水溶液及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。
４．試験方法
１）試験ウイルス
インフルエンザウイルス（ＰＲ−８株）（Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚ ｖｉｒｕｓ ＰＲ８ ｓｔｒａｉｎ）（発育鶏卵に接種、２日後に回収したもの ＨＡ：２０４８）
２）使用細胞
ＭＤＣＫ細胞（理研バイオリソースセンター）
３）使用培地
（１）細胞増殖培地
ダルベッコ変法ＭＥＭ（シグマ社）にカナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）及びウシ胎児血清（１０％）を加えたものを使用した。
（２）細胞維持培地
ダルベッコ変法ＭＥＭ（シグマ社）にカナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、トリプシン及びＢＳＡ（０．１％）を加えたものを使用した。
４）ウイルス浮遊液
試験ウイルス液をＰＢＳにて１００倍に希釈して用いた。
５）試験操作
検体０．５ｍＬにウイルス浮遊液０．５ｍＬを添加・混合し、作用液とした。室温で６０分間転倒混和により作用させた後、作用液を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０倍段階希釈した。
６）ウイルス感染価の測定
細胞増殖培地を用い、使用細胞をマイクロプレート（９６穴）に単層培養した後、細胞増殖培地を除き、ＭＥＭにて２回洗浄した後に、作用液の各希釈液０．１ｍＬを４穴づつに接種し、３６℃の炭酸ガス（５％）インキュベーターにて１時間反応後、希釈液を取り除き、０．１ｍＬの細胞維持培地を各穴に加え、３６℃の炭酸ガス（５％）インキュベーターにて５日間培養した。培養後、倒立顕微鏡にて細胞変性の有無を観察及び培養液のＨＡの有無をニワトリ赤血球を用いて確認し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法により５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）を算出した。
結果を表１に纏めた。

上記の成績から、ヒノキチオール、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物及びヒノキチオールナトリウム塩を用いた場合、ヒトインフルエンザウイルスは検出されず、これにより、ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することが確認された。

試験例２：ヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ht-Zn）のヒトインフルエンザウイルスに対
する抗ウイルス効果
（１）薬剤濃度と感作時間および感作温度の検討
最適および最小感作濃度時間の検討（目的 薬剤の濃度と感作時間と感作温度との関係を調べる）
１．試験方法
試験薬剤：製造例２で調製した０．３％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）、０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）、０．１５％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）、０．１０％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）、０．０５％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）及び０．０１％Ｈｔ−Ｚｎ ３０％エタノール（水溶液）を試験に供した。
１）使用細胞および細胞培養用培地：MDCK細胞（理研バイオリソースセンター）より購入し、実験室で継代培養して実験に供した。MDCK細胞は、細胞増殖培地にダルベッコ変法MEM（DMEM、Sigma）にカナマイシン（0.05mg/mL）およびウシ胎児血清（10％）を加えたも
のを使用した。ウイルスの感染時の細胞維持培地としてDMEMにカナマイシン（0.05mg/mL
）、トリプシン（0.625g/mL）およびBSA(0.1%)を加えたものを使用した。試験前日に96穴組織培養用プレートの各穴に2.5×10⁵/mL/細胞増殖培地に調整したMDCK細胞0.1mLを37℃CO₂（５％）インキュベーターで一晩培養し単層培養細胞とした。各穴を血清不含MEMで２
回洗浄し試験に供した。
２）使用ウイルス：ヒトインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1)株は10日齢の発育鶏卵
に接種3日後に回収したウイルス液を使用時に1×10⁶TCID₅₀/0.1mLとなるよう調整して用
いた。
３）ウイルス増殖の確認：ウイルスの増殖確認は、ＭＤＣＫ細胞にウイルスを感作後5日
間培養した後、更に細胞(２代目)に接種・培養し、培養上清中の鶏赤血球凝集能（HA）の有無を調べ最終判定とした。A/PR/8/34(H1N1)株はHAを有しているため、ウイルスが残存
していた場合細胞に感染増殖した子ウイルスが培養上清中に放出され、結果培養上清中にHAが認められる。
ニュートラルレッド取込試験：ニュートラルレッドが精細胞のリボゾームに取り込まれ蓄積される性質を利用した毒性試験を実施した。
被験資料の培養液を取り除き、ニュートラルレッド溶液（150μg/mL/PBS）を0.1mL加え37℃CO₂（（５％）インキュベーターで2時間培養、ニュートラルレッド溶液を取り除き細胞を0.1mLのPBSで２回洗浄した後１%酢酸/50%エタノール溶液0.1mLを加え20分間反応させ細胞に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。抽出液を吸光度測定用マイクロプレートに移し540nmにて吸光度を測定した。

薬剤の最適および最小感作時間を決定するために25℃および10℃にて以下の試験を実施した。
（方法）各濃度のHt-Znを30％エタノール（水溶液）を等量のウイルス液（10⁶ TCID₅₀/0.1mL）と混和し25℃で10分、20分あるいは30分間静置し感作後、直ちに氷冷したPBSにて1,000倍希釈し、0.1mLを2ウエル（96ウェルプレート）のMDCK細胞に接種し1時間反応後、感作希釈液をトリプシン含有細胞維持培地に置き換え37℃で５日間培養すした。培養後、培養液中の赤血球凝集性(HA)を調べ、HA陰性の培養液については、更に細胞(２代目)に接種・培養し、HA性の有無を調べウイルス増殖の最終判定とし、2ウエルともウイルス陰性と
なったものを陰性とした。対照として30%エタノールおよびPBSを用いて同様に行った。
さらに感作温度の影響を検討するために同上の試験を感作温度10℃で行った。
Ht-Znの有効濃度は3回の実験の平均値で表示した。
本試験に用いたHt-Znの最大濃度は0.30％であり最終細胞感作濃度は0.00015%となるた
めHt-Znの細胞毒性が本試験に影響を及ぼさないと考えた。
結果：
感作温度25℃におけるHt-Znの最小感作濃度は、0.15％（10分）、0.22％（20分）、0.15％（30分）であった（表２）
感作温度10℃におけるHt-Znの最小感作濃度は、0.30％（20分）であった（表３）。
感作時間10分では試験に供試した最大濃度0.3％でウイルス不活化効果が試験１では認
められたが試験２では認められず試験３では１ウェルで不活化効果が認められた。また0.3%Ht-Znで感作時間30分では、試験２おいて不活化効果が認められたが試験１および３に
おいて各１ウェルのみ不活化効果が認められた。
感作温度10℃で感作液を静置したところ、感作液中に白濁・沈殿が生じていた。
感作温度10℃における不活化試験の成績の不安定さを検討する目的で、感作液を混和しながら60分間感作したところ、0.3％Ht-Zn溶液においてウイルス不活化効果が認められた。

（２）Ht-Znの抗ウイルス効果の確認
(目的 Ht-Znの抗ウイルス効果を調べる)
薬剤の抗ウイルス効果を確認する目的で、他の薬剤や消毒剤との効果の比較を行った。
Ht-Znの抗ウイルス効果を確認するために、最小有効濃度Ht-Zn（0.15％）A:2mg（力価
）/mLストレプトマイシン0.0525%塩化亜鉛PBS溶液、C１:100％エタノール溶液、C２：50
％エタノール溶液、C3: 30％エタノール溶液、E:0.0975%HT30％エタノール溶液F：0.1％BSA/PBS、H：0.0525%塩化亜鉛30%エタノール溶液と等量のウイルス液（10⁶ TCID₅₀/0.1mL
）と混和し25℃で30分間反応後、直ちに氷冷したPBSにて1,000倍希釈し薬剤の効果をなく
し、0.1mLを2ウエル（96ウェルプレート）のMDCK細胞に接種し1時間反応後、感作希釈液
をトリプシン含有細胞維持培地に置き換え37℃で５日間培養する。培養後、培養液中の赤血球凝集性(HA)を調べる。HA陰性の培養液については、更に細胞(２代目)に接種・培養し、HA性の有無を調べ最終判定とし、2ウエルともウイルス陰性となったものを陰性とする
（陰性確認）。G最小有効濃度Ht-Zn（0.15％）を等量のPBSと混和し25℃で30分間反応後
、同様に1000倍希釈後MDCK細胞に接種した。
参考として７
B:コロナウイルス（インフルエンザウイルス以外の薬剤感受性ウイルス）を用いた試験はMDCK細胞に対して試験に必要とする高いウイルス力価を示さないので実施できなかった（注1）。豚コロナウイルスのMDCK細胞への訓化およびVero細胞を用いて高力価ウイルスの
回収を続けて行っている。
パルボウイルスはMDCK細胞で増殖できないため実施せず（注２）。

結果：
インフルエンザウイルスと0.15％Ht-Zn30％エタノール溶液を25℃30分間感作しウイル
スの増殖が認められないことを確認した。対照区において、AウイルスとHT以外の薬剤と
塩化亜鉛混合物、C3ウイルスと30％エタノール、EウイルスとHT単身溶液、Fウイルスと希釈液感作液およびHウイルスと塩化亜鉛単身溶液でウイルスの増殖が認められた。また、C1ウイルスと100%あるいはC2ウイルスと50％エタノールの感作液においてウイルスの増殖
は認められなかった。以上の結果、Ht-Znのウイルス不活化効果はヒノキチオールと塩化
亜鉛を混合することにより認められることが明らかになった。

考察
感作温度10℃での試験において試験最大濃度である0.3%Ht-Znとウイルスの感作液は、
反応時間中に感作液に白濁・沈殿が生じ、試験結果に影響を及ぼし抗ウイルス効果の減弱
が認められた。
対照区においてヒノキチオール感受性および非感受性ウイルスを用いた試験は、コロナウイルスがMDCK細胞において抗ウイルス効果試験実施可能なウイルス力価（ウイルス濃度）にまで増殖しなかっため、パルボウイルスにおいてはMDCK細胞でウイルス増殖を示さなかっため、抗ウイルス効果試験を実施していない。コロナウイルスについては高力価ウイルスの作成を試みている。
Ht-Zn溶液あるいは感作液において白濁・沈殿が生じた場合、急激に抗ウイルス効果の
減弱が認められた。これは高濃度Htエタノール溶液のPBS等での希釈液においてHtが分離
し抗ウイルス効果が認められなくなる現象とよく一致していた。Ht-Znのウイルス不活化
作用はHt-Znが溶媒に溶解していることが必要であると考えられた。実用を考えた場合、
エタノール溶液で完全に溶解した状態での使用が考えられる。
Ht-Znの最小感作濃度（感作温度25℃）は0.15％（10分）、0.22％（20分）、0.15％（30分）である。感作温度10℃ではHt-Znの分離が起こり安定した結果が得られなかった。
対照区を用いた試験の結果、ヒノキチオールと塩化亜鉛の混合物溶解液にはウイルス不活化作用が認められた。

試験例３：鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果
１）鳥インフルエンザウイルス
１９８３年大槻等が島根県に飛来したコハクチョウの糞から分離した弱毒のＨ５亜型ウイルスであるＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ／４９９／８３（Ｈ５Ｎ３）株を、ヒナで継代することにより、強毒化させることに成功した。該強毒化させたウイルスを以下の実験に使用した。
２）ＳＰＦ１０日齢発育鶏卵
栃木県青木種鶏場から有精卵を購入し、孵卵して実験に供した。
３）試験
製造例１で調製した、２．０％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）及び０．１５％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）を被検溶液とした。
上記で調製した被検溶液にウイルス液を等量加えよく混合した。陰性対象として、５０％エタノール水溶液を用い、同様にウイルス液を等量加えよく混合した。
それぞれの溶液を室温にて１０分間静置した後、速やかに被検溶液−ウイルス混合液をＰＢＳで１０倍段階希釈し、希釈毎に３個の１０日齢発育鶏卵の漿尿膜腔内に０．２ｍＬづつ接種した。
接種を受けた発育鶏卵は３７℃で４８時間培養した後、０．５％鶏赤血球凝集（ＨＡ）試験により、漿尿液中でのウイルスの増殖の有無を確認した。残存ウイルス価はＲｅｅｄ
ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈの方法により算出した。
各被検溶液−ウイルス混合液における累積陰性数、累積陽性数及び累積陽性率を表５ないし７に示し、ウイルス力価を表８に纏めた。
また、図１にヒノキチオール及びヒノキチオール塩化亜鉛混合物の濃度に対する鳥インフルエンザウイルスのウイルス力価をグラフとして示した。

上記の成績から、両被検体液と鳥インフルエンザウイルスとの室温での１０分間の接触により、検査した限りウイルスの生残は認められず、少なくとも１０００分の１以下にウイルスが不活化されたことが明らかとなった。本被検体は、鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することが確認された。
また、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物は、０．１５％という低濃度においても抗ウイルス効果を示すことが実証された（表６及び図１）。

試験例４：ヒノキチオール塩化亜鉛混合物（Ht-Zn）の鳥インフルエンザウイルスに対す
る抗ウイルス効果
（１）薬剤濃度と感作時間および感作温度の検討
（目的 薬剤の濃度と感作時間と感作温度との関係を調べる）
１）最適および最小感作濃度時間の検討
(目的 抗ウイルス効果の濃度と時間の関係を調べる)
１．試験方法
１）試験薬剤：製造例２で調製した０．８％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）、０．４％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）、０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）及び０．１％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）を試験に供した。使用鶏卵（SPF10日齢発育鶏卵）：栃木県青木種鶏場から有精卵を購入し、本研究センタ
ーで孵卵して実験に供した。
使用ウイルス：鳥インフルエンザウイルスA/Whistling swan/Shimane/499/83(H5N3)株
は10日齢の発育鶏卵に接種２日後に回収したウイルス液（ウイルス力価1×10^8.5EID₅₀/0.1mL）を用いた。
２）ウイルス増殖の確認：ウイルスの増殖確認は、発育鶏卵にウイルスを接種後２日間培養した後、更に発育鶏卵(２代目)に接種・培養し、尿膜腔液中の鶏赤血球凝集能（HA）の有無を調べ最終判定とした。

製造例２で調製した０．８％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）、０．４％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）、０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）及び０．１％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）を被検溶液とした。また、陰性対照として50%エタノール水溶液を用いた。PBSで100倍に希釈したウイルス液400μLと被
検溶液400μLを混合し25℃または4℃で1、10、20および30分間静置後、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。0.8%被検溶液は鶏卵致死性があるためPBSで10倍に希釈し、陰性対照は30分静置後PBSで10倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集
の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体は、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に接種し、上記と同様の方法でウイルス増殖の有無を判定した。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
（反応温度25℃）
被検溶液とウイルス液を25℃で各時間反応させた場合のウイルス生残率を表９に示す。また、陰性対照とウイルス液を30分間反応させた場合のウイルス力価は10^6.25EID₅₀/0.2mL以上であった。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液が0.4%の濃度の場合、1分間でウイルスを100%不活化することが示された。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液が0.1%未満の場合、30分間の反応でもウイルスを100%不活化することはできなかった。また、0.2%の濃度では1分間の反応時間ではウイルスを100%不活化することはできなかったが、反応時間を10分間以上にのばすことでウイルスを完全に不活化することが可能であることが確認され
た。

（反応温度4℃）
被検溶液とウイルス液を4℃で各時間反応させた場合のウイルス生残率を表１０に示す
。また、陰性対照とウイルス液を30分間反応させた場合のウイルス力価は10^6.42EID₅₀/0.2mL以上であった。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が0.8%の濃度の場合、1分間でウイルスを100%不活化することが示された。ヒノキチオール塩化亜鉛混合物が0.2%未満の場合、30分間の反応でもウイルスを100%不活化することができなかったが、0.4%の濃度では10分間以上反応させることでウイルスを100%不活化することが可能であることが確認された。

＜結論＞
ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液とウイルス液を等量反応された場合、反応時間を長くすることによって、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液の抗インフルエンザウイルス効果が増強されることが確認された。25℃で反応させた場合は0.2%の濃度のヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液を、4℃で反応させた場合は0.4%の濃度のヒノキチオール塩化亜鉛混
合物溶液をウイルス液と10分間反応させることによりインフルエンザウイルスを不活化させることが可能であることが示された。

２）感作温度の検討
(目的 抗インフルエンザウイルス効果の温度との関係を調べる)
製造例２で調製した０．４％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）、０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）及び０．１％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）ヒノキチオール塩化亜鉛混合物を被検溶液とした。また、対照として50%エタノール
水溶液および100%エタノールを用いた。PBSで100倍に希釈したウイルス液400μLと被検溶液400μLを混合した。陰性対照として0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液400μLとPBS400μLを混合した。4℃、10℃、および25℃で10分間静置後、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。50%エタノール水溶液とウイルス液との混合液は10分静置後PBSで10
倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体については、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種し、上記と同様の方法でウイルス増殖の有無を判定し
た。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
被検溶液とウイルス液を10分間、各温度で反応させた場合のウイルス生残率を表１１に示す。また、50%エタノール水溶液とウイルス液を4℃、10℃および25℃で反応させた場合のウイルス力価はそれぞれ10^6.5EID₅₀/0.2mL、10⁶EID₅₀/0.2mLおよび10^6.5EID₅₀/0.2mL以上であった。0.4%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液は4℃および10℃の条件下で、ウイ
ルス液と10分間反応することにより完全にウイルスを不活化した。また、0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液および100%エタノールでは、4℃および10℃の条件下では十分な
抗インフルエンザウイルス効果を示さなかったが、25℃の条件下では完全にウイルスを不活化することが確認された。

＜結論＞
ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液は、反応温度によって抗インフルエンザウイルス効果に違いがあり、反応温度の上昇により効果が増強されることが確認された。

３）Ht−Znの抗ウイルス効果の確認
（目的 Ht−Znの抗ウイルス効果を調べる）
製造例２で調製した０．２％Ｈｔ−Ｚｎ ５０％エタノール（水溶液）を被検溶液とした。対照としてA:ストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液(0.01%ストレプトマイシン:0.06%塩化亜鉛:溶媒50%エタノール水溶液)、C:100%エタノール、E:0.2%ヒノキチオール50%エタノール水溶液およびF:50%エタノール水溶液を用いた。以上は被検ウイルスとして鳥イ
ンフルエンザウイルスを用い、B:ニューカッスル病ウイルス(NDV)-La Sota株、D:鶏伝染
性気管支炎ウイルス(IBV)-Beaudette42株を被検ウイルスとした。PBSで100倍に希釈した
各ウイルス液400μLと被検溶液400μLを混合した。陰性対照として、G:0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液400μLとPBS400μLを混合し用いた。25℃で10分間静置後、10日齢
発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。50%エタノール水溶液とウイルス液との混合液は10分静置後PBSで10倍階段希釈し、10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種した。2日間
培養した後、尿膜腔液を回収し0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ鶏赤血球の凝集の有無によってウイルス増殖の有無を判定した。赤血球凝集試験陰性の検体については、回収した尿膜腔液を再度10日齢発育鶏卵漿尿膜内に0.2mLずつ接種し、上記と同様の方法でウイルス
増殖の有無を判定した。ウイルス価はReed and Muenchの方法により算出した。

＜結果＞
被検溶液と各ウイルス液を10分間反応させた場合のウイルス生残率を表１２に示す。また、50%エタノール水溶液とインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび
鶏伝染性気管支炎ウイルス液を10分間反応させた場合のウイルス力価はそれぞれ10^6.5EID₅₀/0.2mL以上、10^2.5EID₅₀/0.2mL以下および10^3.5EID₅₀/0.2mLであった。0.2%ヒノキチオール塩化亜鉛混合物溶液とインフルエンザウイルスを反応させた場合、わずかに生残するウイルスが存在したが、ニューカッスル病ウイルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスに比べ低い値であったウイルスは不活化された。また、E:0.2%ヒノキチオール溶液およびA:ストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液は、ウイルスを不活化させることはできなかった。
ニューカッスル病ウイルスおよび鶏伝染性気管支炎ウイルスでは0.2%ヒノキチオール塩
化亜鉛混合物溶液と10分間の反応では、ウイルスの生残が認められた（44.4%および66.6%）。

＜結論＞
0.2%ヒノキチオール溶液およびストレプトマイシン塩化亜鉛混合体溶液では本試験条件において抗ウイルス効果が確認されなかったことから、本試験で確認された抗ウイルス効果はヒノキチオール単体および塩化亜鉛単体の作用ではなくヒノキチオール塩化亜鉛混合物によるものであることが確認された。

試験例５：安全性試験
ヒノキチオール塩化亜鉛混合物に付き、以下に示す安全性試験を実施した。
ｉ）ラットを用いる２８日間混餌投与毒性試験
ｉｉ）ラットにおける急性経口投与毒性試験
ｉｉｉ）ウサギを用いる皮膚刺激性試験
ｉｖ）ウサギを用いる眼刺激性試験
ｖ）細菌を用いる復帰突然変異試験
結論として、ヒノキチオール塩化亜鉛混合物の毒性は、安全性の高いヒノキチオールと変わらないことが解り、環境、安全性に付いても問題が無いことが分った。尚、全試験において異常は認められなかった。

試験例６：洗浄剤の抗菌効果試験
本発明の洗浄剤の抗インフルエンザウイルス活性の指標として、抗菌効果試験を行なった。
試験においては、ヒノキチオールと塩化亜鉛の混合比を種々変化させた洗浄剤を調製し、抗菌効果を測定した。
洗浄剤は、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（ＥＯ：２０、ＨＬＢ＝１７．０）０．５質量％、ヒノキチオール０．０２５質量％及び種々の量の塩化亜鉛の他に、エタノール、グリセリン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、エチドロン酸４ナトリウム、エチレン
ジアミン四酢酸２ナトリウムを含む水溶液として調製した。
尚、各洗浄剤を調製する際、溶液のｐＨが６．５となるように、クエン酸ナトリウムの添加量を調節した。
上記で得られた洗浄剤（泡立性）を以下の方法により評価試験を行なった。

＜各被験試料＞
ヒノキチオールと塩化亜鉛の割合（モル比）が以下のようになる上記成分を有するの洗浄剤を調製して被験試料として用いた。
１．ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．３（モル比）
２．ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．４（モル比）
３．ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．５（モル比）
４．ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．６（モル比）
５．ヒノキチオール：塩化亜鉛＝１：０．７（モル比）
＜使用菌株＞
大腸菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＭＫ１２５４
病原性大腸菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７Ｈ７
黄色ブドウ球菌 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２５９２３。
＜寒天培地＞
ＭａｃＣｏｎｋｅｙ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）：
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＭＫ１２５４および
病原性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７Ｈ７に使用
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）：
黄色ブドウ球菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２５９２３に使用。
＜実験操作＞
１）各菌株をＴＳＢにて３７℃で１晩培養した。菌液を生理食塩水で希釈し、約１０⁴Ｃ
ＦＵ／ｍｌの菌液を調製した。
２）ポリシャーレに各被験試料をそれぞれ４．５ｇずつ加え、上記１）の菌液を０．５ｍｌずつ各シャーレに接種して十分混合した、各被験試料につき２セットずつ作製した。
３）各試験液について、菌液の接種直後、並びに３７℃で1時間および２時間保温した後
に菌数を測定した。保温は孵化器中でシャーレのふたを少し浮かせた状態で行った。菌数の測定は、菌液０．１ｍｌを２枚の寒天培地にコンラージした後、それぞれ３７℃で２４時間培養してコロニー数を計測し、平均値を算出した。
４）上記２）で作製した２セット目の試料液については、菌液の接種後に３７℃で２時間保温し、再び菌液を０．５ｍｌ接種して十分に混合した。その後、上記３）と同様の方法により、菌液の再接種直後、並びに３７℃で1時間および２時間保温した後に菌数を測定
した。
これらの抗菌効果試験の結果を表１３〜１５に示す。

なお、表１３〜１５中の「Ｂ」は菌液と各被験試料との混合液における計算上の菌数を示し、「＊」は再接種した時点を示す。
表１３〜１５から明らかなように、１〜５の洗浄剤は、いずれの菌に対しても接種後２時間でまた再接種後２時間でも抗菌効果が認められたが、１及び５の洗浄剤では、多少抗菌効果が低下する傾向にあることが明らかとなった。
これにより、ヒノキチオールと塩化亜鉛の使用量をモル比で１：０．４ないし１：０．６の範囲とすると優れた抗菌効果が得られることが判った。
上記から、ヒノキチオールと塩化亜鉛の使用量のモル比が１：０．４ないし１：０．６となる範囲において、優れた抗インフルエンザウイルス活性が得られるであろうことが示唆される。

Claims (7)

1. ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４ないし０．６モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる混合物を、０．０１ないし１質量％含有する抗インフルエンザウイルス用組成物。
2. 前記混合物が、ヒノキチオールと該ヒノキチオールの０．４５ないし０．５５モル当量となる量の塩化亜鉛とからなる請求項１記載の抗インフルエンザウイルス用組成物。
3. ｐＨが５．５ないし７となる請求項１又は２記載の抗インフルエンザウイルス用組成物。
4. 前記混合物を０．１５ないし１質量％含有する請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗インフルエンザウイルス用組成物。
5. 水及びアルコールを含有する請求項１ないし４の何れか１項に記載の抗インフルエンザウイルス用組成物。
6. 請求項１ないし５の何れか１項に記載の抗インフルエンザウイルス用組成物を含む洗浄剤
7. 前記インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスである請求項１ないし５の何れか１項に記載の抗インフルエンザウイルス用組成物。

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