WO2009031874A1

WO2009031874A1 - Cepa de bacillus subtilis para uso agrícola

Info

Publication number: WO2009031874A1
Application number: PCT/MX2007/000105
Authority: WO
Inventors: Jorge Olmos Soto
Original assignee: Jorge Olmos Soto
Priority date: 2007-09-04
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2009-03-12
Also published as: MX337319B; MX2010002412A

Abstract

La presente invención corresponde a una nueva cepa de Bacillus subtilis NRRL B- 50055 productora de metabolitos secundarios, sustancias bioactivas y enzimas degradativas. Esta bacteria y/o su sobrenadante tienen propiedades de inhibir el crecimiento de hongos, bacterias, insectos y nematodos, ya sea en la planta, en el fruto, en la raíz o en suelos contaminados por estos patógenos. Asimismo, esta bacteria y/o su sobrenadante tienen la propiedad de promover la germinación de la semilla, el crecimiento de Ia raíz y el crecimiento de las plantas, al actuar como biofertilizante orgánico, induciendo la degradación de nutrientes del suelo y su mejor asimilación por la semilla, la raíz y la planta. Incluidos en la invención hay métodos para proteger y/o tratar plantas, frutos y suelos, de enfermedades que afectan a los cultivos, utilizando la bacteria, el sobrenadante o los metabolitos puros o semipuros. Asimismo, incluidos en la invención hay formulaciones para tratar y proteger plantas, frutos y suelos de enfermedades que afectan a los cultivos, utilizando la bacteria, el sobrenadante o los metabolitos puros o semipuros.

Description

CEPA DE Bacillus subtilis PARA USO AGRÍCOLA

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención es en el área de los biopesticidas y biofertilizantes agrícolas. Específicamente esta invención se basa en el aislamiento de una nueva cepa de Bacillus subtilis, NRRL B-50055, que produce metabolitos secundarios y sustancias bioactivas; que pueden ser usados solos o combinados con otros compuestos orgánicos y/o inorgánicos, para inhibir el crecimiento de una gran variedad de patógenos de plantas, frutos y suelos, entre los que se encuentran los hongos, las bacterias, los insectos y los nematodos. Asimismo, esta bacteria y/o sobrenadante cuenta con enzimas degradadoras que Ie confieren las propiedades de biofertilizante orgánico.

ANTECEDENTES

En los últimos años, se ha dado a conocer que algunos microorganismos exhiben actividad biológica con capacidad de controlar una gran variedad de patógenos de plantas (Asaka, O and Shoda, 1996; Ferrari et al, 1991 ; Jonson et al, 1993). Aunque se han hecho muchos esfuerzos para encontrar y desarrollar pesticidas biológicos que controlen enfermedades de las plantas y no dañen al hombre ni al ambiente, Ia mayoría de los pesticidas que se usan actualmente son compuestos sintéticos altamente tóxicos. Los pesticidas químicos son clasificados como carcinogénicos por Ia EPA, son tóxicos para el medio ambiente y animales. Además, los patógenos de plantas por Io general desarrollan resistencia a estos compuestos (Schwinn eí al, 1991 ).

Cada año cientos de millones de dólares se utilizan para Ia compra de pesticidas químicos en todo el mundo. Aunado a esto, el desarrollo de un nuevo pesticida químico cuesta en promedio de 80 a 100 millones de dólares. En este sentido, el control biológico es una alternativa muy atractiva con respecto a los pesticidas químicos. Los biopesticidas (organismos vivos que producen metabolitos secundarios y sustancias bioactivas), no son tóxicos para el humano, los animales ni el ambiente. Son biodegradables y mucho más económicos para su desarrollo (US 5049379; 5061495; 6060051). El desarrollo y producción de biopesticidas utilizando microorganismos es altamente recomendable para el manejo integrado de las patologías de plantas. Bacillus thuringiensis es el microorganismo mejor conocido para Ia producción de biopesticidas, sin embargo su rango de acción se reduce a un cierto grupo de plaga, principalmente los insectos (Stabb et al 1990). En este sentido, actualmente se han hecho esfuerzos para Ia producción de biopesticidas a partir de Bacillus subtilis, encontrándose ya algunos ejemplos comerciales en los documentos de patentes US 5344647; US 6291426, los que reportan un rango de acción mas amplio afectando a varios grupos de patógenos. Sin embargo, Ia tecnología de producción de biopesticidas sigue teniendo diversos problemas a los que seria muy conveniente dar solución. A Ia fecha, no se cuenta con un producto integral que pueda resolver Ia mayoría cíe los problemas del campo.

Uno de los principales problemas que se plantea con los biopesticidas actuales, es Ia utilización de cepas microbianas foráneas (no endémicas) a las zonas agrícolas donde se aplican, io que en Ia mayoría de los casos si el producto no está bien formulado, da como resultado un biopesticida poco eficiente.

El segundo problema que existe con Ia mayoría de los biopesticidas de naturaleza bacteriana y que supone una seria limitación para su uso práctico, es Ia baja supervivencia de las células, sobre todo en Ia superficie de las plantas y los frutos.

Además, su eficacia es en general menor que Ia de los biopesticidas químicos, por lo que se requieren concentraciones elevadas del microorganismo en Ia formulación. En

Ia mayoría de los casos Ia dosis efectiva de tratamiento es excesivamente elevada para su producción a escala comercial (5X10^15'20), si se toma en cuenta Ia concentración celular máxima que puede conseguirse por fermentación, Io que hace inviable el sistema industrial. Motivo por el cual, las formulaciones son el resultado de la deshidratación y concentración de Ia biomasa, Io que complica y encarece el proceso. Además, en general, se produce una pérdida elevada de viabilidad bacteriana durante los procedimientos de concentración, por Ia eliminación de agua durante Ia deshidratación.

En este sentido, es muy importante aislar y seleccionar cepas de Bacillus con capacidades no solo de biopesticida, si no también de biofertilizante. Además, es de vital importancia contar con una formulación adecuada para asegurar Ia viabilidad y eficacia de Ia cepa en cualquier superficie, con Io cual no importa tanto Ia sobre- concentración de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC), si no mas bien Ia estabilidad, viabilidad y eficacia de Ia cepa.

Finalmente, existen muchas dificultades para Ia producción industrial de biopesticidas, así como para repetir Ia calidad de los resultados. Sin embargo, los problemas principales son el origen de las cepas, el espectro limitado contra patógenos, el limitado espectro enzimático; Io que limita Ia viabilidad en campo. Además, existen los problemas relacionados con Ia formulación y conservación del preparado, Io que también trae como consecuencia una disminución de Ia viabilidad y eficacia bacteriana.

En este sentido, hemos dirigido nuestra experiencia de innovación y desarrollo biotecnológico a Ia búsqueda de una cepa de Bacillus capaz de superar las dificultades expuestas en los párrafos anteriores. Estos esfuerzos se han visto culminados con el descubrimiento de una cepa regional de Bacillus subtilis, que resuelve muchos de los problemas existentes en el agro, al funcionar como biopesticida de amplio espectro contra patógenos de plantas. Asimismo, esta cepa de Bacillus subtilis también funciona como biofertilizante orgánico, al producir una gran y diversa cantidad de enzimas degradadoras, Io que genera una eficiente asimilación de los sustratos del suelo por Ia planta, estimulando su crecimiento y el de Ia raíz. Además, esta cepa nueva de B. subtilis es eficaz a concentraciones moderadas (1 X 10⁶), en preparaciones no concentradas. Contando con alta viabilidad en plantas, frutos y suelos. Características que en su conjunto no han sido documentadas para una cepa de Bacillus utilizada como biopesticida o biofertilizante, por Io cual esta cepa de Bacillus subtilis es novedosa.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los detalles característicos de Ia presente invención, se muestran claramente en Ia siguiente descripción y en las figuras que se acompañan.

Breve descripción de las figuras:

La figura '1 es una gráfica donde se observa el comportamiento del crecimiento de las cepas bacterianas en un medio de cultivo conocido (Olmos eí al, 1997). Esta figura claramente denota Ia gran capacidad de utilizar Ia mayoría de los sustratos por Ia cepa nueva de B. subtilis NRRL B-50055, a diferencia de otras cepas utilizadas, a las cuales se les dificulta el uso de varios sustratos debido a las diferencias enzimáticas entre ellas. En este sentido, esta gráfica claramente diferencia a Ia cepa nueva NRRL B-50055 de las otras cepas utilizadas.

La figura 2 es una gráfica donde se compara por Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC), una fracción de los metabolitos producidos y secretados al medio de cultivo por Ia cepa nueva de β. subtilis NRRL B-50055 y Ia cepa de B. subtilis protegida por Ia patente US 6060051. Es importante hacer notar que los perfijes son muy parecidos, pero no ¡guales, Io que confirma de nuevo que estas cepas son diferentes ecotipos de Bacillus subtilis.

La presente invención describe una novedosa cepa de Bacillus subtilis para uso agrícola, donde dichos usos agrícolas son biopesticidas y biofertilizantes, tanto para plantas y sus órganos y sus frutos, y en suelos.

Dicha cepa fue depositada en el banco del Agricultural Research Service (ARS) Patent Culture Collection de los Estados Unidos de Norteamérica, el 03 de Agosto del 2007, bajo el tratado internacional de Budapest para propósitos de patente, esta cepa recibió el numero de acceso NRRL B-50055. La cepa novedosa de Bacillus subtilis NRRL B- 50055, presenta las siguientes características: La cepa seleccionada fue clasificada como Bacillus subtilis por medio de secuenciación de su 16S rDNA. Esta cepa es Gram positiva, presenta forma bacilar y cuenta con una endoespora lateral. Su morfología colonial es de tipo rugosa, tiene bordes irregulares y presenta una coloración blanco ostión opaca. Durante su crecimiento exponencial presenta crecimiento en cadena, sin embargo, durante Ia fase estacionaria presenta forma bacilar individual.

EJEMPLOS:

Los siguientes ejemplos son una evidencia de un modo de realización de Ia presente invención, los cuales no deben ser considerados como limitativos a dicha invención.

1).- Aislamiento e identificación fenotípica de Ia cepa de B. subtilis Para el aislamiento y selección de las cepas bacterianas que mostraron actividad potencial para ser utilizadas en Ia agricultura orgánica, se utilizaron muestras de suelos y agua. De las cepas purificadas y crecidas en cajas Petri con liuria Bertani (Ib) durante 24 h, se tomaron muestras y se tiñeron con Ia tinción de Gram. Las bacterias Gram positivas de forma bacilar con endoesporas, fueron seleccionadas para corroborar su afiliación al genero Bacillus por medio de secuenciación de su ADN. Dichas bacterias fueron preservadas a -70° C en tubos Eeppendorf de 1.5 mi.

2).- Curvas de crecimiento de Bacillus subtilis.

Se utilizaron medios de cultivo líquido formulados específicamente para determinar Ia capacidad de crecimiento de Ia cepa nueva de β. subtilis NRRL B-50055. Los cultivos se realizaron en matraz de 250 mi a 37° C, a 250 rpm, durante un periodo de tiempo determinado. Se tomaron muestras de los cultivos de las diferentes cepas a intervalos de una hora y se determinó su crecimiento, graficando densidad óptica del cultivo a 600 nm, contra el tiempo de muestreo (figura 1) (Olmos and Contreras, 2003). En esta figura se muestra que Ia cepa de S. subtilis NRRL B-50055 presentó el mayor crecimiento de todas las cepas analizadas, indicando que hubo una mayor utilización de los sustratos por esta cepa, Ia cual es motivo de patente en este documento.

3).- Identificación molecular de las cepas

Para el aislamiento del ADN cromosomal se utilizó el método de lisis alcalina y fenol- cloroformo (Sambrook et al, 1989). La presencia del ADN fue verificada en un gel de agarosa ál 1.2 %. Del ADN de las cepas seleccionadas se amplificó el gen 16S rDNA por medio de Ia técnica de PCR, con las siguientes condiciones de reacción: 1 μl de

ADN de Ia cepa, 1μl de los oligonucleótidos universales sentido y antisentido para procariotas (Arellano and Olmos, 2002). El producto de PCR ' de las cepas seleccionadas fue posteriormente purificado por el método de fenol-cloroformo

(Sambrook eí al., 1989) y se realizó el análisis de las secuencias en San Diego State

University, Microchemical Core Facility. Por último, sus secuencias fueron comparadas con secuencias conocidas y registradas en el Gene Bank, del National Center for

Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La cepa secuenciada fue identificada como Bacillus subtilis, conteniendo una identidad mayor al 95% comparada con las secuencias del Gene Bank (SEQ ID 1).

4).- Perfil cromatografico de HPLC de Ia cepa nueva de B. subtilis NRRL B-50055

A manera de comparar los metabolitos secundarios secretados al medio de cultivo entre Ia cepa nueva de Bacillus subtilis NRRL B-50055 y otras cepas de Bacillus subtilis; el sobrenadante obtenido del crecimiento de las cepas, fue filtrado y sometido a cromatografía liquida de fase reversa (HPLC). El cromatograma típico de los sobrenadantes se muestra en Ia figura # 2. Otras cepas de Bacillus crecidas en el mismo medio de cultivo, presentaron un cromatograma parecido, pero no igual (datos no mostrados). En este sentido, este cromatograma junto con las otras características descritas en los párrafos anteriores, representa una excelente huella digital para el reconocimiento y tipificación de Ia cepa, ya que esta produce un perfil cromatografico tipo, dependiendo de las condiciones de cultivo y el medio utilizado, haciendo 100% seguro su reconocimiento y diferenciación de otras cepas.

5).- Actividad de biopesticida in-vitro e in-vivo;

En medios sólidos conteniendo una gran variedad de patógenos de plantas, se probaron alícuotas del precipitado y el sobrenadante, así como el caldo de cultivo completo de las fermentaciones de las cepas de Bacillus seleccionadas. Las cepas que presentaron Ia mejor bioactividad contra los patógenos, fueron seleccionadas para desarrollar los experimentos en campo con diferentes variedades de cultivo (uva, albaca, tomate, cebolla, pepino, calabaza, chiles de diferentes variedades, fresa, etc). Los cultivos fueron inoculados por goteo y por aspersión con las cepas de Bacillus subtilis seleccionadas, varias presentaron Ia capacidad de inhibir el crecimiento de hongos, bacterias, insectos y nematodos, produciendo un cultivo sin enfermedades. Sin embargo, todos los cultivos tratados con Ia cepa nueva de Bacillus subtilis NNRL B-50055, fueron los únicos que no presentaron ninguna enfermedad en campo abierto ni en invernadero (ver Tabla 1 ).

6).- Actividad de biofertilizante de Ia cepa de B. subtilis NRRL B-50055 Además de presentar un espectro amplio como biopesticida, Ia cepa nueva de B. subtilis B-50055, presentó una excelente capacidad para auxiliar en Ia degradación de los nutrientes del suelo, en Ia germinación de las semillas, en el crecimiento de Ia raíz y de las plantas; en comparación con los cultivos tratados con otros Bacillus y con los controles no tratados. Además, los cultivos tratados con Ia cepa nueva de B. subtilis B-50055 prolongaron su tiempo de producción y el rendimiento de Ia cosecha.

Por todo Io anterior Ia cepa de Bacillus subtilis B-50055 motivo de esta patente es novedosa, ya que cuenta con actividad biopesticida y de biofertilizante al mismo tiempo y es eficaz a concentraciones moderadas de 5X10⁶. Además, tiene Ia capacidad de sobrevivir largo tiempo en Ia superficie de las plantas y de los frutos, aumenta Ia germinación de Ia semilla, aumenta el crecimiento de Ia raíz y de las plantas. Evita Ia aparición de una gran cantidad de enfermedades, protegiendo en un 100 % todos los cultivos evaluados.

Tabla 1.- Cultivos y las enfermedades que los afectan. La cepa novedosa de S. subtilis NRRL B-50055, mostró actividad tanto in-vitro como in-vivo para todos los patógenos evaluados y mostrados en esta tabla. Los cultivos no evaluados se muestran en negritas.

REFERENCIAS

Arellano, C.F., Olmos, SJ. , (2002). Thermostable α-1 , 4- and α-1-6-glucosidase enzymes from Bacillus sp. ¡solated from a marine environment. Word Journal of Microbiol and Biotechnol. 18:791-795.

Asaka, O. And Shoda, M. (1996). Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14. Appl Environ Microbiol. 62:4081-4085. Ferrari et al., (1991). Biological control of Eutypa lata on grapevine by an antagolistic strain of Bacillus subtllis. Phytopathology 81:283-287. Johnson eta al., (1993). Insecticidal activity of EG4961 , a novel strain of Bacillus thuringiensis toxic to larvae and adults of Southern corn rootworm (Coleóptera: Chrysomelldae) and Colorado potato beetle (Coleóptera: Chrysomelidae). J.

Econ. Entomol. 86:330-333. Olmos SJ'and Contreras FR (2003). Genetic system constructed to overproduce and secrete prolnsulln in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol 62:369-373 Olmos, SJ. , De Anda, R., Ferrari, E., Bolívar, F., Valle, F., 1997. Effects of the sinR and degU32_{Hy) mutations on the regulation of the aprE in Bacillus subtilis. Mol.

Gen. Genet. 253:562-567. Sambrook KT, Frisch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory Manual,

2nd edn. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY. Schwinn et al., (1991 ) Control with chemicals. Advances in Plant Pathology: VoI. 7, Phytophtohora ¡nfestans, The cause of late blight of potato. Academic Press, San

Diego Chapter 8, pp. 225-265.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa aislada de Bacillus subtilis para uso agrícola, depositada con el número de acceso NRRL B-50055, así como también sus mutantes.

2. Un cultivo de Ia cepa de Ia reivindicación 1 , que exhibe actividad de biopesticida y biofertilizante para plantas y suelo.

3.-El sobrenadante obtenido de Ia fermentación de Ia cepa de Ia reivindicación 1 , que exhibe actividad fungicida, bactericida e insecticida, contra enfermedades y plagas en plantas y suelo.

4.-El sobrenadante obtenido de Ia fermentación de Ia cepa de Ia reivindicación 1 , que exhibe propiedades de biofertilizante.

5. -Los metabolitos secundarios y sustancias bioactivas puras o parcialmente puras, producidas por Ia cepa de Ia reivindicación 1 , que exhiben propiedades biopesticidas y biofertilizantes en plantas y suelo.

6. -Una formulación para uso agrícola, caracterizada porque se contiene: al menos, uno de los componentes provenientes del cultivo de Ia cepa de Ia reivindicación 1 ; y, al menos, un compuesto orgánico y/o inorgánico.

7.- Una formulación, tal como se reclama en Ia reivindicación 6, donde el compuesto orgánico y/o inorgánico es un pesticida químico y/o biológico.

8.- Una formulación, tal como se reclama en Ia reivindicación 6, donde el compuesto orgánico y/o inorgánico es un microorganismo y/o sus partes.

9.- Una formulación, tal como se reclama en Ia reivindicación 6, donde el compuesto orgánico y/o inorgánico es un extracto de planta y/o animal.

10. Una formulación, tal como se reclama en Ia reivindicación 6, donde el compuesto orgánico y/o inorgánico es una combinación con los compuestos mencionados en las reivindicaciones 7, 8 y 9.

11.-Un método para tratar o proteger plantas, frutos, raíces y/o suelos, de patologías causadas por bacterias, hongos, insectos y/o nematodos, caracterizado porque se aplica una cantidad efectiva del cultivo de Ia cepa NRRL B-50055, de Ia reivindicación 2; o al menos, un componente de dicho cultivo, de las reivindicaciones 1 , 3 y 5.

12.-EI método de Ia reivindicación 11 , donde el componente del cultivo es únicamente Ia cepa NRRL B-50055.

13 El método de Ia reivindicación 11 , donde el componente del cultivo es únicamente el sobrenadante de Ia reivindicación 3.

14.- El método de Ia reivindicación 11 , donde el componente del cultivo es únicamente los metabolitos de Ia cláusula 5.

15.- Un método para tratar o proteger plantas, frutos, raíces y/o suelos, de patologías causadas por bacterias, hongos, insectos y/o nematodos, caracterizado porque se aplica una cantidad efectiva de las formulaciones de las cláusulas 6, 7, 8, 9 y 10.

16. Los métodos de las reivindicaciones 11-15, donde los productos utilizados son aplicados en forma de líquido, polvo, granulos, microencapsulados y/o cualquier otra presentación.

17.- Un método para fertilizar plantas y suelos, caracterizado porque se aplica una cantidad efectiva del cultivo de Ia cepa de Bacillus subtilis de Ia reivindicación 2, o al menos, uno de los componentes de dicho cultivo, mencionados en las reivindicaciones 1 , 3 y 5, sean

18. Un método para fertilizar plantas y suelos, caracterizado porque se aplica una cantidad efectiva de las formulaciones de las reivindicaciones 6, 7, 8, 9 y 10.

19. Los métodos de las reivindicaciones 17 y 18, donde los productos utilizados son aplicados en forma de líquido, polvo, granulos, microencapsulados y/o cualquier otra presentación. LISTA DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1

No. DE SECUENCIAS: 1

INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1500 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (gen 16S rDNA) (vi) FUENTE ORIGINAL

(A) ORGANISMO: Bacillus subtilis

(B) CEPA: B-50055

(viii) POSICIÓN EN EL GENOMA (ix) CARACTERÍSTICAS

(A) NOMBRE/CLAVE: ADNr

(B) LOCALIZACION: 1-1500 pares de bases

(C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: Secuenciación

(D) OTRA INFORMACIÓN: Bacteria aislada en Ia región de Baja California, México.

GTACGCTGGC GTGCGTGACT RRWACAGTGC AAGTCGAGCG GACAGATGGG AGCTTGCTCC 60

CTGATGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA CGTGGGTAAC CTGCCTGTAA GACTGGGATA 120

ACTCCGGGAA ACCGGGGCTA ATACCGGATG GTTGTCTGAA CCGCATGGTT ₄ CAGACATAAA 180

AGGTGGCTTC GGCTACCACT TACAGATGGA CCCGCGGCGC ATTAGCTAGT TGGTGAGGTA 240

ACGGCTCACC AAGGCGACGA TGCGTAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC ACACTGGGAC 300

TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCGC AATGGACGAA 360

AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGTTTTC GGATCGTAAA GCTCTGTTGT 420

TAGGGAAGAA CAAGTGCCGT TCAAATAGGG CGGCACCTTG ACGGTACCTA ACCAGAAAGC 480

CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG TGGCAAGCGT TGTCCGGAAT 540

TATTGGGCGT AAAGGGCTCG CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA 600

ACCGGGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGGAAC TTGAGTGCAG AAGAGGAGAG TGGAATTCCA 660

CGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATGTGG AGGAACACCA GTGGCGAAGG CGACTCTCTG 720

GTCTGTAACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT 780

AGTCCACGCC GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA 840

GCTAACGCAT . TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA AGACTGAAAC TCAAAGGAAT 900

TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGAAGAACC 960

TTACCAGGTC TTGACATCCT CTGACAATCC TAGAGATAGG ACGTCCCCTT CGGGGGCAGA 1020

GTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC 1080

AACGAGCGCA CCCTTGATCT TAGTGCCAGC ATTCAGTTGG GCACTCTAAG .GTGACTGCCG 1140

GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC 1200

TACACACGTG CTACAATGGA CAGAACAAAG GGCAGCGAAA CCGCGAGGTT AAGCCAATCC 1260

CACAAATCTG TTCTCAGTTC GGATCGCAGT CTGCAACTCG ACTGCGTGAA GCTGGAATCG 1320

CTAGTAATCG CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC 1380

CGTCACACCA CGAGAGTTTG TAACACCCGA AGTCGGTGAG GTAACCTTTT AGGAGCCAGC 1440

CGCCGAAAGG TGGGACAGAT GATTGGGGTG AAGTCGTACA SRRGGGTGGA ATCCCGAAGA 1500