WO2009013379A1 - Cepa viva atenuada de salmonella entérica serovar choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino - Google Patents

Cepa viva atenuada de salmonella entérica serovar choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino Download PDF

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Ricardo DE LA FUENTE LÓPEZ
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    • A61K2039/552—Veterinary vaccine

Definitions

  • the present invention falls within the field of Animal Health. More specifically, the invention relates to the production of a live strain of enteric Salmonella serovar Choleraesuis (S. choleraesuis) attenuated by the deletion of a genetically stable gene without antibiotic resistance markers. It constitutes a new vaccine strain against salmonellosis in pigs and a new vaccine vehicle against pig diseases. STATE OF THE TECHNIQUE
  • Salmonella is an intracellular pathogen that can cause gastroenteritis, enteric fever or bacteremia both in animals and in man.
  • the bacteria of the genus Salmonella are mobile bacilli, Gram negative, belonging to the family Enterobacteriaceae and are phylogenetically close to the genera Escherichia, Shigella and Citrobacter.
  • S. choleraesuis In 1980 the name of S. choleraesuis was approved as the only species name and with several subspecies; on the other hand, in 1987, it was proposed that the only species of the genus be called S. enteric because S. choleraesuis is a confusing term as it also belongs to one of the numerous serovars that make up the Salmonella genus; At the same time, other authors recognized several species, and among them S. choleraesuis, while, in 2000, the only species of Salmonella recognized by the Bacteriological Code was 5. choleraesuis. In summary, there has long been a proposal according to the Bacteriological Code that was falling into disuse (S. choleraesuis); and an illegitimate proposal that was increasingly used (S. enteric).
  • the Judicial Commission of the International Prokaryotic Systematic Committee decided that the Salmonella genus is made up of three species: S. enterica, S. bongori and S. subterranean, and among the numerous serovars of the S. enteric species , S. enteric serovar Choleraesuis (Tindall, et al, 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 521-4; Shelobolina, et al, 2004, Appl Environ Microbiol, 70: 2959-65; Euzéby, 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 547-9).
  • Salmonella serovars are divided into three groups: as a restricted host, they are almost exclusively associated with a specific host (such as Typhi -human-, Abortusequi -caballos-, or Abortusovis -ovejas-); adapted to a host, they are mainly associated with one species although they can also cause diseases in others (such as Dublin - cattle - and Choleraesuis - pigs); of unrestricted host, they are ubiquitous (such as Typhimurium and Enteritidis) and can cause diseases in a wide range of unrelated hosts.
  • a specific host such as Typhi -human-, Abortusequi -caballos-, or Abortusovis -ovejas-
  • adapted to a host they are mainly associated with one species although they can also cause diseases in others (such as Dublin - cattle - and Choleraesuis - pigs)
  • unrestricted host they are ubiquitous (such as
  • Salmonellosis is one of the enteric and septicemic diseases with greater economic importance for the pig industry and the most frequently isolated serovar from the affected animals is Choleraesuis.
  • the general concern of the various administrations about the high prevalence of Salmonella in the pig sector has led to the establishment of a European directive (2003/99 / EC) that obliges this sector to apply surveillance measures epidemiological control of Salmonella infections as of January 1, 2007.
  • typhi is used as the alphavirus DNA release system in animal cells
  • US5877159-A1 presents live invasive bacteria to express heterologous genes in animal cells by means of a eukaryotic expression cassette and, among the possible invasive bacteria, names Salmonella
  • US6764687-B1 refers to live attenuated bacteria as vaccines that can also be carriers of heterologous genes, constructed by mutation of the era gene and, therefore, by interference in carbohydrate metabolism, both from Escherichia and Salmonella
  • CNl 730650 describes a recombinant live vaccine against the old fever virus built in S.
  • choleraesuis US6905691-B1 refers to bacteria attenuated by the mutation of the southern A gene, accompanied or not by the mutation in another gene, used as vaccines or as expression vehicles for heterologous antigens and, especially, a fragment of the tetanus toxin;
  • WO9011687 refers to Salmonella mimics in the phoP gene or in the phoP gene and, simultaneously, in the cya and crp genes that are used as vaccines or as carriers of antigens of other pathogenic microorganisms.
  • Both the vaccine and the ideal vaccine vehicle should be safe, strongly immunogenic, well characterized genetically and stable. There is an urgent need to develop strains that function as vaccine vehicles, that offer an excellent safety profile and that are capable of stimulating an effective cellular response.
  • One aspect of this invention relates to a live attenuated strain of enteric Salmonella serovar Choleraesuis constructed by mutation of the RpoS regulator.
  • Live strain is considered to be that strain that maintains its ability to invade and multiply inside its host, but without developing the pathogenic picture.
  • the new strain has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Burjassot Campus, Research Building, 46100 Burjassot (Valencia) where deposit number 7268 has been assigned.
  • Enteric Salmonella has been used serovar Choleraesuis (according to the nomenclature in force since 2005) for being a serovar that is specially adapted to pigs. For convenience, from here we will name it as S. choleraesuis.
  • the strategy chosen for the construction of the mutant is based on the phase deletion of the entire gene encoding the RpoS regulator, rpoS, by double homologous recombination.
  • mutant CECT 7268 the special properties of adaptation to the natural host (pig) of S. choleraesuis are used to be used as a vehicle for heterologous antigens directed to this animal species and as a vaccine against pig salmonellosis.
  • This strain proliferates in fibroblasts and survives in viable macrophages, cells obtained from the lamina intestinal of the small intestine of the pig and that constitute the normal route of entry into the natural host of S. choleraesuis.
  • the construction of the CECT 7268 mutant has allowed us to develop a new concept of attenuation of the virulence of Salmonella.
  • S. choleraesuis fibroblasts of the intestinal lamina propria
  • the constructed strain has a high proliferation phenotype in viable cells, unlike what happens with the wild strain e even with a commercial live attenuated vaccine (SC-54).
  • SC-54 commercial live attenuated vaccine
  • it survives in cultures of primary macrophages obtained from the lamina of the intestinal mucosa, unlike what happens with the commercial live attenuated strain that is eliminated. Both results ensure a greater and more prolonged stimulation of the immune response.
  • the method used to carry out this invention meets the essential requirements of biological safety for new generation vaccines.
  • the constructed strain lacks antibiotic resistance markers.
  • one aspect of this invention includes a vaccination kit for pigs against infectious diseases caused by S. choleraesuis, which comprises the elements and adjuvants necessary to contain and vehicular the vaccine strain.
  • a vaccination kit for pigs against infectious diseases caused by S. choleraesuis which comprises the elements and adjuvants necessary to contain and vehicular the vaccine strain.
  • it is important to be able to differentiate the vaccine strain from the wild strains. Therefore, another aspect of this invention relates to the identification of the mutant strain by a simple PCR reaction using oligonucleotide primers designed from the sequences adjacent to the rpoS gene, such as the primers described in SEQ ID NO: 3 and 4.
  • Another application of this invention consists in the use of the attenuated strain as a vaccine vector for the expression or transport of heterologous antigens favored by its greater persistence in cells of the immune system together with its greater persistence inside fibroblasts with respect to the wild strains of S. choleraesuis.
  • strain GEGT 7268 as a vaccine strain
  • strain GEGT 7268 in its application as a vaccine vehicle it can be differentiated from the wild strains of S. cholerasuis by means of the PCR technique using oligonucleotide primers designed from the sequences adjacent to the rpoS gene; In this case, the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 3 and 4 can also be used as reaction primers.
  • Figure 1 Shows the construction scheme of the mutant strain CECT 7268 as described in example 1.
  • FIG. 3 Intracellular proliferation of the parental wild strain of S. choleraesuis (in black bars), and S. choleraesuis CECT 7268 (in white bars) in primary cultures of fibroblasts obtained from the porcine small intestine lamina (SIF) .
  • the number of intracellular bacteria inside SIFs is represented at 2 hours (panel A) and at 24 hours (panel B) post-infection. It is described in example 5.
  • S. choleraesuis CECT 915 (hereinafter, WT) was used as a wild strain to construct the mutant strain.
  • Example 1 Construction of a mutant by deletion of the S. choleraesuis rpoS gene.
  • the previously described method for Escherichia coli and S. typhimurium was optimized for Salmonella choleraesuis (CECT 915).
  • Figure 1 shows the construction scheme of the mutant strain. The sequences used as templates in the design of the oligonucleotides used to delete rpoS were obtained from the complete genome sequence of S. choleraesuis.
  • the numbers 1, 2, 3, and 4 correspond to the nomenclature of the oligonucleotides used in this invention and described in SEQ ID NO: 1, 2, 3 and 4, respectively, which are represented by arrows in Figure 1
  • Each of the oligonucleotide pair primers described in SEQ ID NO: 1 and 2 is composed of a tandem consisting of: (i) sequences (highlighted in gray) homologous to the region flanking at the 5 'end (oligonucleotide 1) and at the 3 'end (oligonucleotide 2) at rpoS (gray arrow marked with rpoS in Figure 1); (ii) together with sequences (highlighted in black) that hybridize with plasmid pKD4 in the region flanking the 5 'end (oligonucleotide 1) and the 3' end (oligonucleotide 3) of the kanamycin resistance gene.
  • This plasmid encodes a kanamycin resistance cassette (black rectangle marked with km in Figure 1) flanked by repeated sequences called FRT (marked in white at the ends of the kanamycin cassette in Figure 1).
  • pKD4 was used as the template DNA of a PCR in which oligonucleotides 1 and 2 were used as primers and in which a 1.6 kb fragment was amplified, at whose ends the sequences were homologous to the regions flanking the rpoS gene which carried the primers 1 and 2 themselves at one end. This PCR fragment was introduced by electroporation into the WT strain of S.
  • thermosensitive plasmid pKD46 which carries the ⁇ Red system that allows homologous recombination of the PCR fragment with DNA, had also been introduced by electroporation. chromosomal. Subsequently, the colonies in which the recombination phenomenon had occurred and which, therefore, had incorporated the antibiotic resistance marker and had been able to grow in a medium with kanamycin 30 ⁇ g / ml were selected. Subsequently, they were analyzed with the primers described in SEQ ID NO: 3 and 4 to determine if recombination had occurred in the right place. These primers were designed based on the sequence of regions flanking rpoS (the nlpD gene for the design of SEQ ID NO: 3 and the gene SC2853 for the design of SEQ ID NO: 4).
  • the antibiotic resistance gene was removed from the chromosome by flipase encoded in the pCP20 heat sensitive plasmid.
  • This recombinant plasmid was introduced into S. choleraesuis by electroporation. Bacteria transformed, selected on ampicillin media 50 ug / ml, were incubated at 30 0 C in the presence of ampicillin until the stationary growth phase. The temperature was then raised to 43 ° C for 24 hours to avoid the multiplication of the plasmid and allow its cure, that is, its elimination of the bacteria.
  • Example 2 Assessment of attenuation in the experimental minin model of infection.
  • the so-called competition index (CI) was estimated after inoculating BALB / c mice intraperitoneally ( ip) with a bacterial mixture of the strain whose virulence we wanted to analyze and of the wild or control strain.
  • the IC is the relationship between the number of bacteria in each of the two strains obtained after infection ⁇ outpuf), after normalization with the number of bacteria in the inoculum ⁇ input): (M 0 / W 0 ) / (M J / W ⁇ ), where M is the number of bacteria in the mutant strain, W is the number of bacteria in the parental strain, or is the count of the number of bacteria in the output and i is the count of the bacteria in the input.
  • M is the number of bacteria in the mutant strain
  • W is the number of bacteria in the parental strain
  • i is the count of the bacteria in the input.
  • a mutant is considered attenuated using this index if the IC value is ⁇ 0.4.
  • CECT 7268 the wild strain and SC-54 were cultured for 18-20 hours in LB medium at 37 0 C without agitation.
  • the cultures were centrifuged, washed twice with PBS sterile and were resuspended in 5 ml of sterile PBS to obtain the inoculation doses that were adjusted by serial dilutions following the ratio 1 OD 60O equivalent to 10 9 colony forming units (cfu) / ml.
  • the doses used ranged from IxIO 6 cfu for WT and SC-54 and IxIO 7 cfu in the case of CECT 7268.
  • the amount of inoculum of the inoculum was confirmed by sowing serial dilutions in LB plates and PCR reactions from of the colonies obtained, using the primers described in SEQ ID NO: 3 and 4 so that in the case of strains WT and SC-54 a band of 2610 base pairs was obtained and in the mutant strain CECT 7268, which has Deleted the rpoS gene, the band was 1618 base pairs.
  • female B ALB / c mice of 6-8 weeks of age were used, which were arranged in groups of 3 animals each and to which water and food were supplied ad libitum under normal conditions of light and temperature.
  • the CECT 7268 mutant was compared on the one hand with the wild strain (WT) and on the other with the commercial strain SC-54.
  • the animals were inoculated intraperitoneally with 0.2 ml of the bacterial suspensions with the adjusted doses as described above.
  • the mice were sacrificed and necropsied at 72 hours or in a dying state. Spleen and liver samples were aseptically removed to determine the exact content of the 2 strains in each animal.
  • PCRs were carried out, from the colonies obtained, using the primers described in SEQ ID NO: 3 and 4 as just described for the inoculums.
  • the IC in the colonization of the organs was calculated following the formula described above.
  • the data obtained indicated that CECT 7268 had a high degree of attenuation with respect to its wild parental strain (see table 1).
  • CECT 7268 presented a significant reduction in virulence with respect to the commercial live attenuated strain SC-54.
  • the pigs were inoculated orally; two batches with a mixture of CECT 7268 / WT and two other batches with CECT 7268 / SC-54 with doses of 10 8 cfu (WT and SC-54) and 10 9 cfu (CECT 7268).
  • the animals were euthanized at 3 days post-inoculation. After necropsy, mesenteric lymph node samples were aseptically extracted to count the amount of bacteria recovered in each assay for each strain using, as in example 2, the primers described in SEQ ID NO: 3 and 4 in PCR reactions .
  • the IC data obtained, shown in Table 2 confirm an extraordinary attenuation in virulence of CECT 7268 with respect to its parental wild strain in the host to which S. choleraesuis is adapted, the pig.
  • Example 4 Intracellular survival assays in primary cultures of porcine intestinal macrophages (SIM). To determine whether deletion of the rpos gene affects the intracellular survival of S. choleraesuis, intracellular survival studies were carried out in primary cultures of macrophages extracted from the lamina of the small intestine of piglets. Macrophages constitute one of the essential pieces of innate immunity, and actively participate in the presentation of antigens to induce satisfactory acquired immunity.
  • Stable macrophage cell lines are more permissive to Salmonella intracellular proliferation than primary cultures, however, in order to reproduce more reliably what may occur in vivo, we decided to obtain primary cultures of the gut's own lamina thin piglets that expanded to a primary crop.
  • a gentamicin protection test was performed, in which the macrophages were maintained with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) to which It was added 10% fetal bovine serum, 2% L-Glutamine, 2.5% HEPES and 1% Penicillin / Streptomycin / Fungizone Mix (Biowhittaker), performing incubations at 37 0 C with 5% CO 2 .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • HEPES HEPES
  • Penicillin / Streptomycin / Fungizone Mix Biowhittaker
  • the concentration of bacterial inoculums was determined by sowing serial dilutions in LB plates. Intracellular invasion, proliferation and survival assays were performed in 24-well plates. Wells were inoculated with an MOI (multiplicity of infection bacteria: eukaryotic cells) of 10: 1. Then the plates were incubated for 30 minutes at 37 0 C with 5% CO 2. After this incubation, the medium was removed, the cells were washed three times with sterile PBS and macrophage culture medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of gentamicin was added to each well to destroy extracellular bacteria.
  • MOI multiplicity of infection bacteria: eukaryotic cells
  • Ipro proliferation index
  • WT wild strain
  • CECT 7268 mutant in rpoS
  • SIM vaccine strain SC-54 inside primary cultures of intestinal piglet macrophage
  • the Ipro value is represented on the ordinate axis that results from calculating the quotient between the number of viable bacteria at 24 and 2 hours post-infection plus-minus its standard error ( ⁇ ES).
  • ⁇ ES standard error
  • Example 5 Intracellular proliferation assays in primary cultures of porcine intestinal fibroblasts (SIF).
  • fibroblasts were considered a homogenous population of cells with the sole functions of providing structural support to tissues and repair of tissue lesions.
  • fibroblasts constitute a heterogeneous population formed by different subpopulations involved in processes as varied as organogenesis, control of intestinal motility or immune response.
  • Fibroblasts actively participate in the generation of the acute inflammatory response and in their transition to the acquired immune response.
  • Figure 3 shows the percentage of infected cells that contained a low number ⁇ 5, medium 6-20, or high> 20, of bacteria (WT is represented in black; CECT 7268 in white) at 2 hours post-infection (pi) (panel A) and at 24 hours pi (panel B) in three independent experiments.
  • the graphs reflect the mean ⁇ standard error (ES) of the percentage of cells that were infected with various ranges of number of bacteria (1-5, 6-20,> 20).
  • ES standard error

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Abstract

Cepa viva atenuada de Salmonella entérica serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino. La presente invención proporciona una nueva cepa vacunal viva y atenuada, incapaz de producir el factor alternativo sigma (RpoS) y que, además, funciona como vehículo vacunal de antigenos heterólogos. La construcción de la cepa se ha realizado mediante la deleción en fase de la totalidad del gen que codifica el factor alternativo sigma, rpoS, mediante doble recombinación homologa. La cepa es avirulenta, genéticamente estable, sin marcadores de resistencia antibiótica y se diferencia fácilmente de las cepas silvestres.

Description

TÍTULO
Cepa viva atenuada de Salmonella entérica serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se encuadra dentro del campo de la Sanidad Animal. De forma más concreta, la invención se refiere a la producción de una cepa viva de Salmonella entérica serovar Choleraesuis (S. choleraesuis) atenuada mediante la deleción de un gen, genéticamente estable y sin marcadores de resistencia a antibióticos. Constituye una nueva cepa vacunal frente a salmonelosis en porcino y un nuevo vehículo vacunal frente a enfermedades del cerdo. ESTADO DE LA TÉCNICA
Salmonella es un patógeno intracelular que puede ocasionar gastroenteritis, fiebre entérica o bacteriemia tanto en animales como en el hombre. Las bacterias del género Salmonella son bacilos móviles, Gram negativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y se encuentran filogenéticamente próximas a los géneros Escherichia, Shigella y Citrobacter.
En cuanto a su taxonomía, es importante destacar la falta de unanimidad a la hora de denominar a las especies de Salmonella y la notable confusión existente con los nombres S. choleraesuis y S. entérica.
En 1980 se aprobó el nombre de S. choleraesuis como único nombre de especie y con varias subespecies; por otro lado, en 1987, se propuso que la única especie del género se llamara S. entérica por ser S. choleraesuis un término confuso al pertenecer también a uno de los numerosos serovares que integran el género Salmonella; al mismo tiempo, otros autores reconocían varias especies, y entre ellas S. choleraesuis, mientras que, en 2000, la única especie de Salmonella reconocida por el Código Bacteriológico era 5. choleraesuis. En resumen, ha habido durante mucho tiempo una propuesta acorde al Código Bacteriológico que iba cayendo en desuso (S. choleraesuis); y una propuesta ilegítima que se iba utilizando cada vez más (S. entérica).
Por fin, en 2005, la Comisión Judicial del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas decidió que el género Salmonella está formado por tres especies: S. entérica, S. bongori y S. subterránea, y entre los numerosos serovares de la especie S. entérica, se encuentra S. entérica serovar Choleraesuis (Tindall, et al, 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 521-4; Shelobolina, et al, 2004, Appl Environ Microbiol, 70: 2959-65; Euzéby, 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 547-9).
Debido a esta confusión, muchos de los documentos anteriores a 2005 en los que se cita a S. choleraesuis no se refieren a este serovar en concreto sino a la especie tipo tal y como se denominaba anteriormente y que ahora es S. entérica.
El tipo de enfermedad causada por Salmonella depende del serovar y del hospedador implicados, por lo que una clasificación práctica de serovares se basa en su espectro de hospedador. Siguiendo este criterio, los serovares de Salmonella se dividen en tres grupos: de hospedador restringido, se asocian casi exclusivamente con un hospedador concreto (como Typhi -humanos-, Abortusequi -caballos-, o Abortusovis —ovejas-); adaptados a un hospedador, se asocian principalmente con una especie aunque también pueden causar enfermedades en otras (como Dublin -ganado vacuno- y Choleraesuis —cerdos-); de hospedador no restringido, son ubicuos (como Typhimurium y Enteritidis) y pueden causar enfermedades en una amplia gama de hospedadores no relacionados.
La salmonelosis es una de las enfermedades entéricas y septicémicas con mayor importancia económica para la industria porcina y el serovar más frecuentemente aislado a partir de los animales afectados es Choleraesuis. La preocupación generalizada de las diversas administraciones por la elevada prevalencia de Salmonella en el sector porcino ha originado el establecimiento de una directiva europea (2003/99/CE) que obliga a este sector a aplicar medidas de vigilancia epidemiológica para controlar las infecciones por Salmonella a partir de enero de 1 2007.
Actualmente, existe una cepa vacunal frente a esta enfermedad, carente del plásmido de virulencia, (Enterisol SC-54) comercializada por Boehringer Ingelheim (patente US5436001) cuya utilización ha sido aprobada en EEUU y Alemania, pero no en otros países, como Taiwán, donde la incidencia de S. choleraesuis es enorme y no se ha aprobado el uso de la vacuna por problemas de seguridad (Ku, et al, 2005, Infecí Immun, 73: 8194-203).
Debido, fundamentalmente, a la posibilidad de trabajar con el ratón como modelo experimental sencillo y económico, gran parte de los trabajos realizados en cuanto a la atenuación de las cepas de Salmonella se han basado en el serovar Typhimurium. Sin embargo, los expertos están de acuerdo en que los factores de virulencia no se pueden extrapolar de un serovar a otro y, mucho menos, de un hospedador a otro. Por eso, recientemente, se han abierto líneas de investigación que han dado lugar a cepas vacunales contra Salmonella para cerdos basadas en genes metabólicos (Kelly, et al , 1992, Infecí Immun, 60: 4881-90) o a mutantes atenuados afectados en genes esenciales para la persistencia de Choleraesuis en cerdo (Ku, et al, 2005, Infecí Immun, 73: 8194-203).
Por otro lado, se han utilizado bacterias invasivas vivas como vehículos vacunales de expresión de antígenos heterólogos (es decir, de antígenos procedentes de otros organismos) y entre las bacterias utilizadas se encuentran algunos casos del género Salmonella (Daudel, et al, 2007, Expert Rev Vaccines, 6: 97-110). Así, en la solicitud de patente US20030170211-A1, entre otras bacterias, se utiliza una cepa de S. typhi como sistema de liberación de ADN de alphavirus en células animales; la patente US5877159-A1 presenta bacterias invasivas vivas para expresar genes heterólogos en células animales mediante un cásete de expresión eucariota y, entre las posibles bacterias invasivas, nombra a Salmonella; la patente US6764687-B1 se refiere a bacterias vivas atenuadas como vacunas que también pueden ser portadoras de genes heterólogos, construidas mediante la mutación del gen era y, por lo tanto, por interferencia en el metabolismo de los carbohidratos, tanto de Escherichia como de Salmonella; en CNl 730650 se describe una vacuna viva recombinante contra el virus de la fiebre añosa construida en S. choleraesuis; US6905691-B1 hace referencia a bacterias atenuadas mediante la mutación del gen sur A, acompañada o no de la mutación en otro gen, utilizadas como vacunas o como vehículos de expresión de antígenos heterólogos y, especialmente, de un fragmento de la toxina tetánica; WO9011687 se refiere a imitantes de Salmonella en el gen phoP o en el gen phoP y, simultáneamente, en los genes cya y crp que se emplean como vacunas o bien como portadores de antígenos de otros microorganismos patógenos.
Tanto la vacuna como el vehículo vacunal ideal deberían ser seguros, fuertemente inmunogénicos, bien caracterizados genéticamente y estables. Existe una necesidad urgente de desarrollar cepas que funcionen como vehículos vacunales, que ofrezcan un excelente perfil de seguridad y que sean capaces de estimular una respuesta celular efectiva.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de esta invención se refiere a una cepa viva atenuada de Salmonella entérica serovar Choleraesuis construida mediante la mutación del regulador RpoS. Se considera cepa viva atenuada aquella estirpe que mantiene su capacidad de invadir y multiplicarse en el interior de su hospedador, pero sin desarrollar el cuadro patogénico. La nueva cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado el número de depósito 7268. Se ha utilizado Salmonella entérica serovar Choleraesuis (según la nomenclatura vigente desde 2005) por ser un serovar que está especialmente adaptado al ganado porcino. Por comodidad, a partir de aquí la nombraremos como S. choleraesuis.
Si bien los mutantes en rpoS de S. typhimurium y de S. typhi son menos virulentos para el ratón y el hombre, respectivamente (Rychlik and Barrow, 2005, FEMS Microbiol Rev, 29: 1021-40; Robbe-Saule, et al., 1995, FEMS Microbiol Lett, 126: 171-6), también se ha descrito, en ensayos de inhibición competitiva, cómo la deleción del gen rpoS en S. typhimurium y S. enteritidis no modifica la virulencia de las cepas en pollos (Rychlik and Barrow, 2005, FEMS Microbio! Rev, 29: 1021-40). Por otro lado, se ha demostrado que cepas atenuadas de Salmonella entérica serovar Typhi por modificación de uno o más genes, con fenotipo RpoS+ son prometedoras como vacunas y vehículos vacunales porque el fenotipo RpoS+ incrementa su poder inmunogénico (US7083794-B2). Queda claro, por lo tanto, que el comportamiento de los mutantes en rpoS de Salmonella depende del serovar y del hospedador estudiados. En el área que nos ocupa, es fundamental trabajar con cepas específicas para el cerdo.
La estrategia elegida para la construcción del mutante se basa en la deleción en fase de la totalidad del gen que codifica el regulador RpoS, rpoS, mediante doble recombinación homologa.
Con el mutante CECT 7268 se aprovechan las especiales propiedades de adaptación al hospedador natural (cerdo) de S. choleraesuis para ser utilizada como vehículo de antígenos heterólogos dirigidos a esta especie animal y como vacuna frente a la salmonelosis del cerdo. Esta cepa prolifera en fibroblastos y sobrevive en macrófagos viables, células obtenidas a partir de la lámina propia del intestino delgado del cerdo y que constituyen la vía normal de entrada en el hospedador natural de S. choleraesuis.
La construcción del mutante CECT 7268 nos ha permitido desarrollar un nuevo concepto de atenuación de la virulencia de Salmonella. Así, empleando cultivos celulares primarios de cerdo normalmente no permisivos para el crecimiento de S. choleraesuis (fibroblastos de la lámina propia intestinal) la cepa construida presenta un fenotipo de proliferación elevado en células viables, a diferencia de lo que ocurre con la cepa silvestre e incluso con una vacuna viva atenuada comercial (SC-54). Además, sobrevive en cultivos de macrófagos primarios obtenidos de la lámina propia de la mucosa intestinal, a diferencia de lo que ocurre con la cepa viva atenuada comercial que es eliminada. Ambos resultados aseguran una mayor y más prolongada estimulación de la respuesta inmune. El método utilizado para realizar esta invención cumple los requerimientos indispensables de seguridad biológica en cuanto a vacunas de nueva generación. Por un lado, asegura la estabilidad de la mutación puesto que la reversión al fenotipo silvestre está totalmente impedida debido a la ausencia de dianas requeridas para la recombinación homologa o ilegítima a partir de poblaciones naturales de bacterias. Por otro lado, la cepa construida carece de marcadores de resistencia a antibióticos.
La avirulencia de esta cepa evidencia su empleo como cepa vacunal. Por lo tanto, un aspecto de esta invención incluye un kit de vacunación para cerdos contra las enfermedades infecciosas producidas por S. choleraesuis, que comprende los elementos y adyuvantes necesarios para contener y vehicular la cepa vacunal. Además, para el control veterinario de la salmonelosis, es importante poder diferenciar la cepa vacunal de las cepas silvestres. Por ello, otro aspecto de esta invención se refiere a la identificación de la cepa muíante mediante una sencilla reacción de PCR utilizando como cebadores oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias adyacentes al gen rpoS, como pueden ser los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4.
Otra aplicación de esta invención consiste en la utilización de la cepa atenuada como vector vacunal de expresión o transporte de antígenos heterólogos favorecido por su mayor persistencia en células del sistema inmune junto a su mayor persistencia en el interior de fibroblastos con respecto a las cepas silvestres de S. choleraesuis. Tal y como ocurre en el caso del -uso de la cepa GEGT 7268 como cepa vacunal, en su aplicación como vehículo vacunal puede diferenciarse de las cepas silvestres de S. cholerasuis mediante la técnica de la PCR utilizando como cebadores oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias adyacentes al gen rpoS; en este caso también pueden utilizarse los oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 como cebadores de la reacción. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para facilitar la comprensión de las principales características de la invención y formando parte integrante de esta memoria descriptiva, se acompañan una serie de figuras. Con carácter ilustrativo y no limitativo se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Muestra el esquema de la construcción de la cepa muíante CECT 7268 según se describe en el ejemplo 1.
Figura 2. Supervivencia intracelular de S. choleraesuis CECT 7268 en cultivos primarios de macrófagos obtenidos a partir de la lámina propia del intestino delgado porcino, tal y como se describe en el ejemplo 4.
Figura 3. Proliferación intracelular de la cepa silvestre parental de S. choleraesuis (en barras negras), y S. choleraesuis CECT 7268 (en barras blancas) en cultivos primarios de fibroblastos obtenidos a partir de la lámina propia del intestino delgado porcino (SIF). Se representa el número de bacterias intracelulares en el interior de SIFs a las 2 horas (panel A) y a las 24 horas (panel B) postinfección. Se describe en el ejemplo 5.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Las cepas de S. choleraesuis empleadas se cultivaron rutinariamente a 370C con agitación en medio LB (Luria-Bertani). Las cepas transformadas con plásmidos termosensibles se incubaron a 300C para evitar la pérdida del plásmido. Los medios se complementaron con kanamicina (30μg/ml) o ampicilina (50μg/ml) cuando fue necesario. Para obtener medio sólido se añadió agar (15g/l).
Se utilizó S. choleraesuis CECT 915 (en adelante, WT) como cepa silvestre para construir la cepa muíante.
Habiendo descrito la presente invención, se ilustra adicionalmente medianle los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance, que viene definido exclusivamente por la nota reivindicatoría adjunta. Ejemplo 1: Construcción de un muíante por deleción del gen rpoS de S. choleraesuis. Para la construcción de las cepas vacunales, se optimizó para Salmonella choleraesuis (CECT 915) el método previamente descrito para Escherichia coli y S. typhimurium (Datsenko and Wanner, 2000, Proc Nati Acad Sd U S A, 97: 6640-5). En la figura 1 se representa el esquema de la construcción de la cepa muíante. Las secuencias empleadas como moldes en el diseño de los oligonucleótidos utilizados para delecionar rpoS se obtuvieron a partir de la secuencia completa del genoma de S. choleraesuis. En la figura 1, los números 1, 2, 3, y 4 se corresponden con la nomenclatura de los oligonucleótidos utilizados en esta invención y descritos en SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4, respectivamente, que se representan con flechas en la figura 1.
Cada uno de los cebadores de la pareja de oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO: 1 y 2 se encuentra integrado por un tándem formado por: (i) secuencias (destacadas en gris) homologas a la región que flanquea en el extremo 5' (oligonucleótido 1) y en el extremo 3' (oligonucleótido 2) a rpoS (flecha gris marcada con rpoS en la figura 1); (ii) junto a secuencias (destacadas en negro) que hibridan con el plásmido pKD4 en la región que flanquea el extremo 5' (oligonucleótido 1) y el extremo 3' (oligonucleótido 3) del gen de resistencia a kanamicina. Este plásmido codifica un cásete de resistencia a kanamicina (rectángulo negro marcado con km en la figura 1) flanqueado por secuencias repetidas denominadas FRT (marcadas en blanco en los extremos del cásete de kanamicina en la figura 1). pKD4 se utilizó como DNA molde de una PCR en la que se utilizaron los oligonucleótidos 1 y 2 cómo cebadores y en la que se amplificó un fragmento de 1,6 kb, en cuyos extremos se encontraban las secuencias homologas a las regiones flanqueantes al gen rpoS que portaban los propios cebadores 1 y 2 en uno de sus extremos. Este fragmento de PCR fue introducido mediante electroporación en la cepa WT de S. choleraesuis en la que previamente se había introducido, también por electroporación, el plásmido termosensible pKD46, que porta el sistema λRed que permite la recombinación homologa del fragmento de PCR con el DNA cromosómico. A continuación se seleccionaron las colonias en las que se había producido el fenómeno de recombinación y que, por lo tanto, habían incorporado el marcador de resistencia a antibiótico y habían sido capaces de crecer en un medio con kanamicina 30 μg/ml. Posteriormente, fueron analizadas con los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 para determinar si se había producido la recombinación en el lugar adecuado. Estos cebadores se diseñaron basándose en la secuencia de las regiones flanqueantes a rpoS (el gen nlpD para el diseño de SEQ ID NO: 3 y el gen SC2853 para el diseño de SEQ ID NO: 4).
Finalmente, el gen de resistencia antibiótica fue eliminado del cromosoma mediante la flipasa codificada en el plásmido termosensible pCP20. Este plásmido recombinante se introdujo en S. choleraesuis mediante electroporación. Las bacterias transformadas, seleccionadas en medio con Ampicilina 50μg/ml, se incubaron a 300C en presencia de ampicilina hasta la fase estacionaria de crecimiento. A continuación se elevó la temperatura a 43°C durante 24 horas para evitar la multiplicación del plásmido y permitir su curación, es decir, su eliminación de las bacterias. Por último se confirmó la desaparición del cásete de resistencia a kanamicina y la deleción del gen rpoS mediante PCR utilizando los cebadores flanqueantes, descritos en SEQ ID NO 3 y 4 (señalados como 3 y 4 en la figura 1), obteniendo así la cepa CECT 7268 de S. choleraesuis.
Ejemplo 2: Valoración de la atenuación en el modelo minino de infección experimental. Con el fin de evaluar el efecto en la virulencia del muíante construido y compararlo con la cepa silvestre parental WT y la cepa atenuada comercial SC-54, se estimó el denominado índice de competición (CI) tras inocular ratones BALB/c por vía intraperitoneal (ip) con una mezcla bacteriana de la cepa cuya virulencia queríamos analizar y de la cepa silvestre o control. El CI es la relación entre el número de bacterias de cada una de las dos cepas obtenidos tras la infección {outpuf), previa normalización con el número de bacterias del inoculo {input): (M0/W0)/(MJ/WÍ), donde M es el número de bacterias de la cepa mutante, W es el número de bacterias de la cepa parental, o es el recuento del número de bacterias del output e i es el recuento de las bacterias del input. Un mutante se considera atenuado empleando este índice si el valor de CI es < 0,4.
CECT 7268, la cepa silvestre y SC-54 se cultivaron durante 18-20 horas en medio LB a 370C sin agitación. Los cultivos se centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron en 5 mi de PBS estéril para obtener las dosis de inoculación que se ajustaron mediante diluciones seriadas siguiendo la relación 1 DO60O equivale a 109 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml. Las dosis utilizadas oscilaron entre IxIO6 ufe para WT y SC-54 y IxIO7 ufe en el caso de CECT 7268. La cantidad de ufe de los inóculos se confirmó mediante la siembra de diluciones seriadas en placas de LB y reacciones de PCR a partir de las colonias obtenidas, utilizando los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 de manera que en el caso de las cepas WT y SC-54 se obtenía una banda de 2610 pares de bases y en la cepa muíante CECT 7268, que tiene delecionado el gen rpoS, la banda era de 1618 pares de bases. Para el ensayo se utilizaron ratones B ALB/c hembras de 6-8 semanas de edad, que se dispusieron en grupos de 3 animales cada uno y a los que se suministró agua y comida ad libitum bajo condiciones normales de luz y temperatura. Se comparó el mutante CECT 7268 por un lado con la cepa silvestre (WT) y por otro con la cepa comercial SC-54. Los animales se inocularon intraperitonealmente con 0,2 mi de las suspensiones bacterianas con las dosis ajustadas según se acaba de describir. Los ratones fueron sacrificados y necropsiados a las 72 horas o en estado moribundo. Se extrajeron asépticamente muestras de bazo e hígado para determinar el contenido exacto de las 2 cepas en cada animal. Para ello se realizaron PCRs, a partir de las colonias obtenidas, utilizando los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 tal y como se acaba de describir para los inóculos. Se calculó el CI en la colonización de los órganos siguiendo la fórmula descrita anteriormente. Los datos obtenidos indicaron que CECT 7268 presentaba un alto grado de atenuación con respecto a su cepa parental silvestre (véase tabla 1). Además, CECT 7268 presentó una significativa reducción de la virulencia con respecto a la cepa viva atenuada comercial SC-54.
Tabla 1 índice de competición en ratones BALB/c
CI1
Cepas comparadas .
Medias (± ES)2 Atenuación rpoS versus WT 0.0028 (± 0.0016) Sí rpoS versus SC-54 0.018 (± 0.010) Sí únicamente se tuvieron en cuenta los animales que se encontraban en estado moribundo. Los datos de CI < 0,4 indican atenuación 2ES: error estándar Ejemplo 3: Valoración de la atenuación de CECT 7268 en el hospedador natural, el cerdo. Una vez comprobada la drástica atenuación en el modelo murino, profundizamos en el análisis de la virulencia realizando ensayos en el modelo porcino mediante infecciones mixtas por vía oral entre la cepa silvestre, CECT 7268 y la vacuna viva atenuada comercial (SC-54), calculando los niveles de competición en la colonización de los nodulos linfáticos mesentéricos mediante el cálculo del índice de competición (CI) tal y como se ha detallado en el ejemplo 2 para el ratón. Para ello, se inocularon oralmente 3 cerdos cruces de Landrace con Large White de entre 5 y 6 semanas de edad. Los animales se agruparon aleatoriamente en cuatro lotes de 3 animales cada uno. Los cerdos se inocularon por vía oral; dos lotes con una mezcla de CECT 7268/WT y otros dos lotes con CECT 7268/SC-54 con dosis de 108 ufe (WT y SC-54) y 109 ufe (CECT 7268). Los animales fueron eutanasiados a los 3 días postinoculación. Tras la necropsia, se extrajeron asépticamente muestras de nodulos linfáticos mesentéricos para hacer recuento de la cantidad de bacterias recuperadas en cada ensayo para cada cepa utilizando, como en el ejemplo 2, los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 en reacciones de PCR. Los datos de CI obtenidos, mostrados en la Tabla 2, confirman una extraordinaria atenuación en la virulencia de CECT 7268 con respecto a su cepa silvestre parental en el hospedador al que S. choleraesuis está adaptado, el cerdo.
Tabla 2. índice de competición en nodulos mesentéricos de lechones
CI1 Cepas comparadas
Medias (± ES2) Atenuación CECT 7268 versus WT 0,022 (± 0,006) Sí
CECT 7268 versus SC-54 1,31(± 1,5) Ño
Los datos de CI < 0,4 indican atenuación 2ES: error estándar Ejemplo 4: Ensayos de supervivencia intracelular en cultivos primarios de macrófagos intestinales porcinos (SIM). Para determinar si la deleción del gen rpos afecta a la supervivencia intracelular de S. choleraesuis, se realizaron estudios de supervivencia intracelular en cultivos primarios de macrófagos extraídos a partir de la lámina propia del intestino delgado de lechones. Los macrófagos constituyen una de las piezas esenciales de la inmunidad innata, y participan activamente en la presentación de antígenos para inducir una inmunidad adquirida satisfactoria.
Las líneas celulares de macrófagos estables resultan más permisivas a la proliferación intracelular de Salmonella que los cultivos primarios, no obstante, con el fin de reproducir de una forma más fiable lo que puede ocurrir in vivo, decidimos obtener cultivos primarios de la lámina propia del intestino delgado de lechones que se expandieron hasta conseguir un cultivo primario.
Para examinar el comportamiento de las cepas atenuadas en cultivos primarios de macrófagos intestinales porcinos (SIM) de la lámina propia se realizó un ensayo de protección a gentamicina, en el que los macrófagos se mantuvieron con Dulbecco 's modified Eagle médium (DMEM) al que se añadió un 10% de suero fetal bovino, 2% de L-Glutamina, 2,5% HEPES y 1% de Penicilina/Estreptomicina/Fungizona Mix (Biowhittaker), realizando las incubaciones a 370C con un 5% de CO2. La cepa silvestre WT, el mutante CECT 7268, así como la cepa vacunal comercial SC-54, se cultivaron durante 18-20 horas en medio LB a 370C sin agitación. Se determinó la concentración de los inóculos bacterianos sembrando diluciones seriadas en placas de LB. Los ensayos de invasión, proliferación y supervivencia intracelular se realizaron en placas de 24 pocilios. Se inocularon los pocilios con una M.O.I. (multiplicidad de infección bacterias: células eucariotas) de 10:1. A continuación, las placas se incubaron durante 30 minutos a 370C con 5% de CO2. Tras esta incubación, se retiró el medio, se lavaron las células tres veces con PBS estéril y se añadió medio de cultivo de macrófagos suplementado con 100 μg/ml de gentamicina a cada pocilio para destruir las bacterias extracelulares. Después de la incubación con gentamicina durante 1 hora y media, (2 horas después de la infección), se retiró el medio y se sustituyó por medio con 10 μg de gentamicina/ml y se mantuvieron incubándose 24 horas más. En aquellos tiempos en los que se necesitaba realizar un recuento del número de bacterias intracelulares (al cabo de las 2 ó 24 horas posinfección), se realizaron tres lavados con PBS estéril y se Usaron las células añadiendo Tritón x-100 al 1% en PBS estéril. Se hicieron diluciones seriadas de los Usados y se sembraron en placas de LB para hacer el recuento de ufe.
La tasa de crecimiento o supervivencia de la bacteria en el interior de estas células se expresó como "índice de proliferación" (Ipro), que se calculó como el cociente del número de bacterias intracelulares a las 24 y 2 horas postinfección. En la figura 2 se representa el Ipro de la cepa silvestre (WT), su mutante en rpoS, CECT 7268, y la cepa vacunal SC-54 en el interior de cultivos primarios de macrófagos intestinales de lechón (SIM). En el eje de ordenadas se representa el valor de Ipro que resulta de calcular el cociente entre el número de bacterias viables a las 24 y a las 2 horas postinfección más-menos su error estándar (± ES). Los valores mostrados son la media y el error estándar de un mínimo de tres experimentos independiente. En el eje de abscisas se representan los valores de la cepa silvestre WT (2,1 ± 1,3), el mutante CECT 7268 (3,8 ± 1,5) y SC-54 (0,2 ± 0,4). La comparación de los valores de Ipro de las tres estirpes, mostró que la tasa de crecimiento intracelular del mutante CECT 7268 era ligeramente superior a la de la estirpe silvestre WT (figura 2) y, especialmente destacable, que las dos cepas lograron sobrevivir e incluso proliferar en macrófagos extraídos de la lámina propia intestinal mientras que la cepa vacunal comercial SC-54 es prácticamente eliminada al cabo de las 24 horas postinfección (figura 2).
Ejemplo 5: Ensayos de proliferación intracelular en cultivos primarios de fibroblastos intestinales porcinos (SIF).
Hasta hace poco tiempo, los fibroblastos eran considerados una población homogénea de células con las únicas funciones de prestar un soporte estructural a los tejidos y de reparación de lesiones tisulares. Sin embargo, en la actualidad se sabe que los fibroblastos constituyen una población heterogénea formada por distintas subpoblaciones que intervienen en procesos tan variados como la organogénesis, el control de la motilidad intestinal o la respuesta inmune. Los fibroblastos participan activamente en la generación de la respuesta inflamatoria aguda y en su transición hacia la respuesta inmune adquirida. La abundancia de fibroblastos en la zona de entrada de Salmonella y su función moduladora de la respuesta inmune, sumado a la capacidad de Salmonella para infectar fibroblastos in vitro, muestran la importancia de estas células en la infección natural por Salmonella.
La capacidad de las estirpes para proliferar en el interior de estos fibroblastos en cultivo primario se examinó mediante un ensayo de protección a gentamicina tal y como se describe en el ejemplo 4. La tasa de crecimiento de la bacteria en el interior de estas células no se pudo expresar como "índice de proliferación" (Ipro) calculado como se describe anteriormente en el caso de los macrófagos (recuento bacteriológico en medios de cultivo) porque comprobamos que existía un porcentaje de células muertas en las que las bacterias crecían considerablemente y que enmascaraba el comportamiento de lo que ocurría en las células vivas que son las que interesan como dianas de los vehículos vacunales. Con estos precedentes se decidió determinar de forma más precisa el número de bacterias en el interior de células vivas individuales a las 2 y 24 horas postinfección (p.i.) mediante observación microscópica de 100 células infectadas de tres experimentos independientes. Las bacterias se detectaron mediante inmunofluorescencia indirecta. Para ello, se realizaron los cultivos celulares sobre lentillas de 11 mm antes de las infecciones, posteriormente, las células fueron fijadas con paraformaldehido al 3% y permeabilizadas con saponina al 0,2% según protocolos estándares. Para detectar Salmonella se utilizaron anticuerpos primarios policlonares de conejo anti-LPS (Lipopolisacarido) (Difco) y anticuerpos secundarios anti-conejo marcados con isotiocianato de fluoresceina (FITC; Sigma, Chemicon, Alexa 488 — verde- y alexa 594 —rojo-; Molecular Probes). Finalmente se usó DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindole; lμg/ml) para teñir los núcleos celulares. En la figura 3 se muestra el porcentaje de células infectadas que contenían un número bajo <5, medio 6-20, ó elevado >20, de bacterias (en negro se representa WT; y en blanco, CECT 7268) a las 2 horas postinfección (p.i.) (panel A) y a las 24 horas p.i (panel B) en tres experimentos independientes. Las gráficas reflejan en ordenadas la media ± el error estándar (ES) del porcentaje de células que estaban infectadas con diversos intervalos de número de bacterias (1-5, 6-20, >20). En la infección con la cepa silvestre WT, casi la totalidad de las células infectadas (95,1%) contenían 1-5 bacterias a las 2 horas p.i, y un pequeño porcentaje (4,9%) 6-20 bacterias (figura 3A). A las 24 horas p.i., la proporción de células infectadas con bajo número de bacterias (1-5) disminuyó hasta el 63,1%, aumentando el número de células que presentaban un número medio de bacterias intracelulares (6-20) (24,2%) y apareciendo un pequeño porcentaje de células con un elevado número de bacterias (12,7%) (figura 3B). Cuando se analizó la población de células infectadas con el imitante CECT 7268 a las 2 horas p.i., la mayoría (71,9%) presentaron 1-5 bacterias en su interior. Sin embargo, a las 24 horas p.i., un gran número de estas células (79,9%) presentaban más de 20 bacterias intracelulares (figura 3B). Estas bacterias se alojaban en grandes vacuolas.
Finalmente, en cuanto a la cepa vacunal comercial SC-54, no se pudieron encontrar células vivas infectadas tras 24 horas p.i, incluso a las 2 horas p.i. el número de células infectadas era muy reducido y todas ellas presentaban un número entre 1-5 de bacterias.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Cepa viva atenuada de Salmonella entérica serovar Choleraesuis caracterizada porque carece de la actividad del regulador RpoS.
2.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 1, caracterizada por la deleción del gen rpoS que codifica el regulador RpoS.
3.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 2, caracterizada porque la deleción del gen rpoS es una deleción en fase.
4.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 3, caracterizada porque la deleción en fase del gen rpoS se realiza mediante una estrategia que evita la reversión de la cepa mutada al fenotipo silvestre.
5.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 4, caracterizada porque la estrategia elegida para evitar la reversión de la cepa mutada al fenotipo silvestre es la doble recombinación homologa.
6.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque la deleción de rpoS no deja en la bacteria marcadores de selección por resistencia a antibióticos.
7.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta mayor supervivencia en cultivos primarios de macrófagos de cerdo que la cepa parental.
8.- Cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta mayor capacidad de proliferación en fibroblastos de lámina propia intestinal de cerdo que la cepa parental.
9.- Cultivo biológicamente puro de S. entérica serovar Choleraesuis cepa CECT 7268.
10.- Uso de una cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis como la que se describe en las reivindicaciones 1 a 9, como vacuna frente a enfermedades infecciosas producidas por S. entérica serovar Choleraesuis en el cerdo.
11.- Kit de vacunación para cerdos contra las enfermedades infecciosas producidas por S. entérica serovar Choleraesuis que comprenda un contenedor que incluya una cepa viva atenuada como la descrita en las reivindicaciones 1 a 9.
12.- Uso de una cepa viva atenuada de S. entérica serovar Choleraesuis como la que se describe en las reivindicaciones 1 a 9, como vehículo vacunal de antígenos heterólogos.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 12, caracterizado porque la diferenciación entre la cepa viva atenuada y las cepas silvestres de S. entérica serovar
Choleraesuis se realiza mediante cebadores diseñados en las regiones adyacentes a la secuencia del gen rpoS de S. entérica serovar Choleraesuis.
14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque los cebadores utilizados son los descritos en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque la técnica utilizada para la diferenciación entre la cepa viva atenuada y las cepas silvestres de S. entérica serovar Choleraesuis es la técnica de la PCR.
PCT/ES2008/000518 2007-07-24 2008-07-24 Cepa viva atenuada de salmonella entérica serovar choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino Ceased WO2009013379A1 (es)

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