CN115044524A - 一种基因工程重组乳酸菌及在抗拟态弧菌感染方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因工程重组乳酸菌及在抗拟态弧菌感染方面的应用。拟态弧菌(Vibriomimicus,V.mimicus)是一种重要的人和水生动物共患病原菌，对水产养殖业的发展和人类健康构成了极大威胁。疫苗接种是防控水产动物疾病的主要措施之一，但目前尚无针对拟态弧菌的商品化疫苗。本发明以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC393为抗原递呈载体，拟态弧菌外膜蛋白OmpU和OmpK为抗原，霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)为分子佐剂，构建了重组乳酸菌口服疫苗，并对其免疫效果进行评价，提供了一种免疫效果良好的拟态弧菌口服疫苗。

Description

一种基因工程重组乳酸菌及在抗拟态弧菌感染方面的应用
技术领域
本发明属于口服疫苗技术领域，具体涉及一种基因工程重组乳酸菌、包含所述菌株的药物组合物及其在抗拟态弧菌感染方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，有关拟态弧菌(Vibrio mimicus,V.mimicus)病例的报道逐渐增多，拟态弧菌在水产养殖中，是一种流行范围广、危害严重的病原菌，其临床分离菌株毒力越来越强，耐药性越来越严重，对水产养殖业的危害和公共健康的威胁也越来越大。而疫苗是预防和控制传染性疾病的重要措施，是解决当前水产养殖中存在的因抗生素过度使用导致药物残留以及环境污染等一系列问题的关键手段。但目前尚无针对拟态弧菌的商品化疫苗，因此，拟态弧菌相关的疫苗研发势在必行。
乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一种安全的食品级微生物，能够在肠道中定植，因此可做为抗原递呈载体。乳酸菌除了自身的安全性，其本身具有的佐剂特性使其作为疫苗载体更具吸引力。利用该菌株制成的微生态制剂，能够提高机体的免疫功能，可预防胃肠道疾病的发生。同时乳酸菌也是良好的外源蛋白运载系统，将外源抗原在乳酸菌表面进行表达，进而开发出口服免疫疫苗，能有效地发挥预防疾病的作用。
免疫佐剂作为一种免疫调节剂，可以通过提高抗原的免疫原性来增强疫苗的免疫效果。通过将免疫佐剂和抗原混合制成的疫苗，能够提高疫苗的免疫原性，延长抗原与黏膜及免疫活性细胞之间交互作用的时间，降低黏膜免疫耐受，从而提高疫苗的免疫效果。霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)是霍乱毒素的无毒亚基，是一种优良的免疫佐剂，与抗原结合后，可提升动物机体免疫应答水平。
发明内容
基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种能够有效抵抗拟态弧菌感染的疫苗产品，基于该技术目的，本发明以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 393作为抗原递呈载体，以拟态弧菌外膜蛋白OmpU和OmpK作为抗原，CTB为免疫佐剂，构建表达拟态弧菌OmpU、OmpK蛋白以及融合OmpU-CTB、OmpK-CTB的重组乳酸菌。基于本发明对上述重组乳杆菌的免疫效果验证，具体提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种基因工程重组乳酸菌，与野生株相比，所述重组乳酸菌被修饰为具有ompU、ompK和/或霍乱肠毒素(CTB)表达。
上述第一方面中，所述“与野生株相比，所述重组乳酸菌被修饰为ompU、ompK和/或霍乱肠毒素(CTB)表达”，意味着修饰后微生物中ompU、ompK和/或CTB基因或蛋白表达增强；并且，应当说明的是，上述ompU、ompK为外源基因，来源于拟态弧菌的外膜蛋白，进一步的，为拟态弧菌Hsy0531-k。
具体的实施方式中，所述ompU序列如SEQ ID NO:1所示，ompK的序列如SEQ ID NO:2所示。
霍乱肠毒素(CTB)是霍乱毒素的无毒亚基，是一种优良的免疫佐剂，与抗原结合后，能刺激机体产生较强的免疫应答；优选的，本发明所采用的CTB基因来源于霍乱弧菌(Vibrio cholera,GenBank:MN912820.1)，具体序列如SEQ ID NO:3所示。
上述优选的技术方案的一种实施方式中，所述重组乳酸菌被修饰为具有拟态弧菌来源的ompU表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为具有拟态弧菌来源的ompK表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为同时具有拟态弧菌来源的ompU及CTB表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为同时具有拟态弧菌来源的ompK及CTB表达。
经验证，上述四种重组乳酸菌均具有良好的遗传稳定性，可实现上述OmpU、OmpK、OmpU-CTB和OmpK-CTB蛋白的稳定表达。四种重组乳酸菌均可显著提高鲫鱼特异性IgM的水平，其中，CTB能够进一步促进水生动物的特异性免疫应答，提高IgM的水平；另外，OmpU-CTB组和OmpK-CTB组的重组乳酸菌还体现出更好的肠道定植效果。
优选的，上述重组乳酸菌被修饰为具有ompU、ompK和/或霍乱肠毒素(CTB)表达可以通过本领域中已知的任何方法执行，例如，通过重组质粒的方式进行构建。
乳酸菌本身具有良好的安全性，还具有抗菌及提高机体免疫力的效果，广泛的作为基因工程改造的研究对象。优选的，上述第一方面所述工程菌的出发菌株为乳杆菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌或瑞士乳杆菌中的一种。
本发明验证的一种具体实施方式中，所述出发菌株为干酪乳杆菌，具体的，为干酪乳杆菌L.casei ATCC393。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括第一方面所述基因工程重组乳酸菌。
优选的，上述药物组合物中，第一方面所述基因工程重组乳酸菌包括但不限于活化的菌株本身，还包括所述菌株的代谢物或培养物；另外，所述重组乳酸菌应当是有效剂量的，所述剂量可根据施用的对象及施用方式进行常规调整。
上述第二方面所述的药物组合物中，还包括药学上所必须的载体；所述载体应当是对受试者无害的，包括但不限于缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、蛋白质、亲水性聚合物、螯合剂、张力调节剂、糖类或表面活性剂等。
本发明第三方面，提供第一方面所述重组乳酸菌、第二方面所述药物组合物在抗拟态弧菌感染方面的应用。
第三方面所述抗拟态弧菌感染方面的应用，至少包括以下方面：
(1)将所述重组乳酸菌、药物组合物应用于制备抗拟态弧菌感染产品；
(2)用于提升受试者对抗拟态弧菌感染的免疫能力。
上述(1)方面中，所述抗拟态弧菌感染的产品包括但不限于药物或水产养殖饲料；所述药物优选为口服药物，例如口服疫苗。
上述(2)方面中，所述受试者为水生动物或哺乳动物；所述水生动物包括海水及淡水动物，进一步，为鱼类或贝类，本发明验证的一种实施方式中，所述鱼类为鲫鱼。
上述(2)方面中，所述提升受试者对抗拟态弧菌感染的免疫能力，具体包括但不限于对血清中ACP(酸性磷酸酶)、AKP(碱性磷酸酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、LYS(溶菌酶)、补体C3、补体C4和Lectin(凝集素)的调节作用，或对组织中IL-10、IL-1β、TNF-α及TGF-β表达量的调节作用。
本发明第四方面，提供一种口服疫苗，所述疫苗中包括第一方面所述重组乳酸菌和/或第二方面所述药物组合物。
本发明第五方面，提供一种鱼粮，所述鱼粮中包括第一方面所述重组乳酸菌和/或第二方面所述药物组合物。
优选的，所述鱼粮中，所述重组乳酸菌和/或药物组合物通过载体进行固定，所述载体包括但不限于多糖、硅藻土、蛋白质等；本发明一种具体的实施方式中，所述鱼粮的制备方法如下，向活化后的重组乳酸菌中添加海藻酸钠溶液再与普通鱼粮进行混合，干燥后即得。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为ompU和ompK基因PCR扩增结果；
其中，图1(A)ompU PCR扩增结果，图1(B)ompK PCR扩增结果；
图2为重组克隆质粒鉴定结果；
其中，图2(A)pMD-18T-OmpU PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图2(B)pMD-18T-OmpU酶切结果，M：DL 10000DNA Marker；1：酶切产物；
图2(C)pEASY-Blunt-Zero-OmpK PCR结果，M：DL 2000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图2(D)pEASY-Blunt-Zero-OmpK酶切结果，M：DL5000 DNA Marker；1：酶切产物；
图3为OmpU-CTB和OmpK-CTB的PCR扩增结果；
其中，图3(A)OmpU-CTB PCR产物；图3(B)OmpK-CTB PCR产物；M：DL2000 DNAMarker；1：融合基因PCR扩增产物；2：阴性对照；
图4为融合基因的重组克隆质粒鉴定结果；
其中，图4(A)pMD-18T-OmpU-CTB PCR结果，M：DL 2000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图4(B)pMD-18T-OmpU-CTB酶切结果，M：DL 5000DNA Marker；1：酶切产物；
图4(C)pMD-18T-OmpK-CTB PCR结果，M：DL 2000DNA Marker；1：PCR扩增产物；图4(D)pMD-18T-OmpK-CTB酶切结果，M：DL 10000DNA Marker；1：酶切产物；
图5为pCold-TF-OmpU和pCold-TF-OmpK重组质粒鉴定结果；
其中，图5(A)pCold-TF-OmpU PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图5(B)pCold-TF-OmpU酶切结果，M：DL 15000DNA Marker；1：酶切产物；
图5(C)pCold-TF-OmpK PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图5(D)pCold-TF-OmpK酶切结果，M：DL 10000DNA Marker；1：酶切产物；
图6为SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化；
其中，图6(A)M：广谱蛋白marker；1：E.coli BL21；2：未诱导E.coli pCold-TF-OmpU；3：诱导后E.coli pCold-TF-OmpU；
图6(B)M：广谱蛋白marker；1：E.coli BL21；2：未诱导E.coli pCold-TF-OmpK；3：诱导后E.coli pCold-TF-OmpK；
图6(C)M：广谱蛋白marker；1：纯化OmpU蛋白；
图6(D)M：广谱蛋白marker；1：纯化OmpK蛋白；
图7为pPG-OmpU和pPG-OmpK重组质粒鉴定结果；
其中，图7(A)pPG-OmpU PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；图7(B)pPG-OmpU酶切结果，M：DL 5000DNA Marker；1：酶切产物；
图7(C)pPG-OmpK PCR结果，M：DL 2000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图7(D)pPG-OmpK酶切结果，M：DL 15000DNA Marker；1：酶切产物；
图8为pPG-OmpU-CTB和pPG-OmpK-CTB重组质粒鉴定结果；
其中，图8(A)pPG-OmpU-CTB PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图8(B)pPG-OmpU-CTB酶切结果，M：DL 5000DNA Marker；1：酶切产物；
图8(C)pPG-OmpK-CTB PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图8(D)pPG-OmpK-CTB酶切结果，M：DL 5000DNA Marker；1：酶切产物；
图9为Lc-pPG-OmpU和Lc-pPG-OmpK重组质粒鉴定结果；
其中，图9(A)Lc-pPG-OmpU PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图9(B)Lc-pPG-OmpK PCR结果，M：DL 2000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图10为Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB重组质粒鉴定结果；
其中，图10(A)Lc-pPG-OmpU-CTB PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图10(B)Lc-pPG-OmpK-CTB PCR结果，M：DL 5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；
图11为Western blot鉴定结果；
其中，图11(A)M：蛋白Marker；1-3：Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpU-CTB、Lc-pPG表达结果；
图11(B)M：蛋白Marker；1-3：Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpK-CTB、Lc-pPG表达结果；
图12为间接免疫荧光鉴定结果；
图13为重组乳酸菌遗传稳定性检测；
其中，图13(A)Lc-pPG-OmpU遗传稳定性检测结果，M：DL 2000DNA Marker；1-23：PCR扩增结果；24：阴性对照；
图13(B)Lc-pPG-OmpU-CTB遗传稳定性检测结果，M：DL 2000DNA Marker；1-23：PCR扩增结果；24：阴性对照；
图13(C)Lc-pPG-OmpK遗传稳定性检测结果，M：DL 2000DNA Marker；1-23：PCR扩增结果；24：阴性对照；
图13(D)Lc-pPG-OmpK-CTB遗传稳定性检测结果，M：DL 5000DNA Marker；1-23：PCR扩增结果；24：阴性对照；
图14为免疫鲫鱼血清IgM水平；
图15为免疫鲫鱼血清AKP活性；
图16为免疫鲫鱼血清ACP活性；
图17为免疫鲫鱼血清SOD活性；
图18为免疫鲫鱼血清C3活性；
图19为免疫鲫鱼血清C4活性；
图20为免疫鲫鱼血清LYS活性；
图21为免疫鲫鱼血清中Lectin活性；
图22为鲫鱼组织RNA检测；
图23为免疫鲫鱼各组织中IL-1β表达量分析；
图24为免疫鲫鱼各组织中IL-10表达量分析；
图25为免疫鲫鱼各组织中TNF-α表达量分析；
图26免疫鲫鱼各组织中TGF-β表达量分析；
图27为免疫保护率结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、以CTB为分子佐剂4株重组乳酸菌构建及验证
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1菌株与载体
拟态弧菌Hsy0531-k、大肠杆菌E.coli MC1061、干酪乳杆菌L.casei ATCC393均由实验室保存。pCold-TF原核表达质粒和乳杆菌锚定表达型质粒pPG612由本实验室保存；克隆载体购自宝日医(北京)生物技术有限公司。
1.1.1.2主要试剂
TCBS培养基、MRS琼脂/肉汤培养基等购自索莱宝(北京)科技有限公司；HRP标记羊抗兔IgG抗体购自索莱宝(北京)科技有限公司。
1.1.1.3试验动物
6周龄新西兰大白兔，质量为1.5kg左右。
1.1.1.4主要仪器与设备
恒温振荡培养箱，电热恒温培养箱，高速微量离心机，凝胶成像分析系统，超声破碎仪，PCR仪，超净工作台，台式低温离心机，水浴锅。
1.1.2方法
1.1.2.1 ompU和ompK基因的扩增及克隆载体的构建
(1)ompU和ompK基因的引物设计
将活化的拟态弧菌Hsy0531-k，接种在TCBS培养基平板中培养，随后将平板中的单菌落接种至LB液体培养基中培养过夜。取2mL菌液，参照细菌基因组DNA提取说明书提取基因组。
根据GenBank数据库上传的拟态弧菌全基因组获得ompU和ompK基因序列，应用Primer Premer 5软件，根据基因序列信息并以pPG612、pCold-TF为表达载体分别设计特异性引物，委托生工(长春)生物工程有限公司合成。
以拟态弧菌Hsy0531-k株基因组DNA为模板，进行ompU基因和ompK基因的PCR扩增，片段大小分别为1032bp和783bp。取3μL的PCR产物进行电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收ompU和ompK基因。
(2)重组克隆质粒pMD-18T-OmpU和pEASY-Blunt-Zero-OmpK的构建及鉴定
将回收的ompU和ompK片段分别与pMD-18T载体和pEASY-Blunt-Zero载体在16℃作用12h，25℃作用30min。将连接产物加到活化的感受态E.coli Trans5α中，冰浴30min后热激90s，再加入800μL液体LB，37℃振荡培养2h，离心后取100μL上清液，涂布于含Amp(50μg/mL)的LB固体培养基中过夜培养，挑取单菌落培养后提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，对疑似阳性质粒进行检测。
1.1.2.2 ompU和ompK与分子佐剂CTB融合基因的扩增及克隆载体的构建
(1)OmpU-CTB和OmpK-CTB基因的融合
委托库美(长春)生物有限公司根据CTB基因序列，合成片段大小为393bp的CTB基因，以pPG612表达载体设计特异性引物。对ompU、ompK和CTB基因分别用各自引物进行PCR的扩增与回收。以回收的目的片段和CTB基因为模板，进行融合PCR并对其进行检测。OmpU-CTB与OmpK-CTB融合片段大小分别为1425bp和1176bp。
(2)重组克隆质粒pMD-18T-OmpU-CTB和pMD-18T-OmpK-CTB的构建及鉴定
回收OmpU-CTB和OmpK-CTB融合片段并与pMD-18T载体进行连接转化，连接转化步骤同1.1.2.1。随后进行PCR和双酶切鉴定，将疑似阳性质粒进行检测。
1.1.2.3原核表达载体pCold-TF-OmpU和pCold-TF-OmpK的构建及诱导表达
(1)原核表达载体pCold-TF-OmpU和pCold-TF-OmpK的构建及鉴定
用限制性内切酶对pMD-18T-OmpU、pEASY-Blunt-Zero-OmpK重组质粒与pCold表达质粒进行酶切，37℃作用6h后取3μL酶切产物进行电泳检测并分别回收ompU、ompK基因和5769bp的pCold-TF载体。将回收的ompU、ompK基因分别与回收的pCold-TF载体进行连接转化。将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21感受态中，测序鉴定后-20℃保存。
(2)大肠杆菌诱导表达
将重组大肠杆菌E.coli pCold-TF-OmpU和E.coli pCold-TF-OmpK接种到含Amp抗性的200mL液体LB中，培养至OD600约为0.6时加入终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG，16℃震荡诱导24h，PBS洗涤后重悬。取200μL重悬液与50μL 5×SDS-PAGE Buffer混匀后煮沸10min，-20℃保存，用于SDS-PAGE检测。
(3)重组蛋白的纯化
分别取诱导后的重组大肠杆菌进行冰浴超声破碎，结束后4℃，7000r/min离心20min。参照Thermo HisPur镍纯化蛋白说明书进行蛋白的纯化。将纯化后的蛋白参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定浓度。
1.1.2.4抗体的制备
将纯化的OmpU蛋白和OmpK蛋白分别与弗氏佐剂等体积乳化，2mL/只皮下注射新西兰大白兔，进行首免，14d后用弗氏不完全佐剂与蛋白等体积乳化，进行加强免疫，加强免疫后14d进行第三次免疫，免疫后3d进行耳静脉采血，37℃静置1h，4℃静置过夜，4℃，6000r/min离心15min，收集血清-80℃保存。
1.1.2.5重组乳酸菌的构建及鉴定
(1)重组表达载体pPG-OmpU、pPG-OmpU-CTB、pPG-OmpK和pPG-OmpK-CTB的构建及鉴定
制备E.coli MC1061感受态：将活化的E.coli MC1061菌液37℃培养至OD600为0.4-0.6，冰浴10min，4℃，5000r/min离心7min，弃去上清，将CaCl2(0.06mol/L)和含15％甘油的CaCl2溶液(0.06mol/L)提前预冷，取15mL CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴8min，离心后弃去上清，重复两次后加入2mL甘油CaCl2溶液，轻轻悬浮感受态细胞，冰浴30min后每管分装100μL于-80℃中保存。
使用限制性内切酶对重组质粒pMD-18T-OmpU、pMD-18T-OmpU-CTB、pEASY-Blunt-Zero-OmpK、pMD-18T-OmpK-CTB和pPG 612质粒进行酶切，37℃水浴作用6h后，分别对目的基因片段和pPG 612载体片段进行回收。
将上述回收的ompU、ompK、OmpU-CTB和OmpK-CTB片段与pPG 612载体胶回收产物用T4 DNA ligase酶16℃过夜连接，随后将连接产物转化至E.coli MC1061感受态中。将离心后的菌体重悬后涂布于含10μg/mL Cm的LB平板上培养，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，将疑似阳性质粒进行检测。
(2)重组乳酸菌的构建及基因水平验证
①制备L.casei ATCC393感受态细胞：活化实验室保存的L.casei ATCC393，37℃厌氧培养至OD600为0.6左右，4℃，4000r/min离心10min，弃上清；用10mL预冷的EPWB缓冲液(0.6mmol/L NaH2PO4.2H2O+0.1mmol/L Mgcl2.6H2O)洗涤菌体2次后，加入2mL预冷的EPB缓冲液(100mL EPWB+0.3mol/L蔗糖)将其重悬，每管100μL分装，-80℃保存。
②将质粒pPG-OmpU、pPG-OmpK、pPG-OmpU-CTB、pPG-OmpK-CTB和pPG 612与制备的L.casei ATCC393感受态混匀，冰浴5min。
③将上述混合物加入预冷的电击杯中电击。
④加入37℃预热的恢复性培养基(含15％蔗糖的MRS液体培养基)800μL，冰浴10min，37℃厌氧培养4h。
⑤将培养后菌液离心重悬后涂布于MRS平板上(含10μg/mL Cm)，厌氧培养至长出单菌落。
⑥取2mL培养菌液用溶菌酶处理后进行质粒提取，进行PCR鉴定。
(4)重组乳酸菌的Western blot鉴定
将重组的Lc-pPG、Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB厌氧培养后，接种于含有2％乳糖和Cm的MRS液体培养基中诱导。离心洗涤后加入溶菌酶破壁1h以上，与50μL 5×SDS-PAGE buffer混匀煮沸后，-20℃保存备用。
根据SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书制备分离胶与浓缩胶，待凝胶凝固后加入10μL蛋白Marker与20μL上述处理好的样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用半干转印仪将蛋白转至被甲醇浸泡过的硝酸纤维素膜上：15V，20min。转印结束后，将硝酸纤维素膜放置5％脱脂牛奶中4℃封闭2h，PBST洗膜后，加入10倍稀释的兔抗OmpU和OmpK血清4℃孵育16h，PBST洗膜后加入1：2000稀释的HRP标记的羊抗兔Ig G抗体，室温孵育2h，PBST洗涤后，进行ECL显色分析蛋白表达情况。
(5)重组乳酸菌的间接免疫荧光检测
将重组的Lc-pPG、Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB接种于含有2％乳糖和Cm抗性的MRS液体培养基中诱导。取2mL诱导后的菌液离心，加入1mL兔抗OmpU蛋白和OmpK蛋白血清(含3％BSA)，37℃孵育60min，用加入0.05％吐温-20的PBS洗涤离心后，加入200μL 1:2000稀释的FITC标记的羊抗兔IgG二抗，37℃避光孵育60min，加4％多聚甲醛固定菌液，取适量重悬液涂片，使用荧光显微镜观察。
(6)重组乳酸菌的遗传稳定性检测
将重组乳酸菌Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB分别接种至带有Cm抗性的MRS液体培养基中厌氧培养，共培养50代，培养期间每隔两代进行PCR鉴定。
1.2结果
1.2.1 ompU和ompK基因的PCR扩增结果
PCR扩增ompU和ompK基因条带为1032bp、783bp，扩增产物片段大小与预期相符，见图1，表明成功扩增ompU和ompK基因。
1.2.2重组克隆质粒pMD-18T-OmpU和pEASY-Blunt-Zero-OmpK的构建及鉴定
PCR扩增片段与酶切产物经凝胶电泳检测，目的条带大小与预期相符，见图2，表明pMD-18T-OmpU和pEASY-Blunt-Zero-OmpK构建成功。
1.2.3 OmpU-CTB和OmpK-CTB基因的融合
PCR产物经凝胶电泳检测得到OmpU-CTB和OmpK-CTB融合基因条带为1425bp、1194bp，扩增产物片段大小与预期结果相符，见图3，表明OmpU-CTB与OmpK-CTB成功融合。1.2.4重组克隆质粒pMD-18T-OmpU-CTB和pMD-18T-OmpK-CTB的构建及鉴定
PCR扩增片段与酶切产物经凝胶电泳检测，目的条带大小与预期相符，条带为1425bp与1194bp，鉴定结果见图4，表明重组克隆质粒pMD-18T-OmpU-CTB和pMD-18T-OmpK-CTB构建成功。
1.2.5 pCold-TF-OmpU和pCold-TF-OmpK重组质粒的构建及鉴定
(1)pCold-TF-OmpU和pCold-TF-OmpK重组质粒的鉴定
将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，目的基因大小分别为1032bp和783bp，与预期结果相符，见图5。表明pCold-TF-OmpU、pCold-TF-OmpK重组质粒构建成功。
(2)重组大肠杆菌E.coli pCold-TF-OmpU和E.coli pCold-TF-OmpK的蛋白表达及纯化
经SDS-PAGE检测结果显示，分别在88kDa、81kDa处出现OmpU和OmpK蛋白条带，纯化蛋白检测结果显示目的条带大小与预期相符，如图6，表明OmpU和OmpK蛋白成功表达。
1.2.6重组乳酸菌的构建及鉴定
(1)pPG-OmpU、pPG-OmpK、pPG-OmpU-CTB和pPG-OmpK-CTB重组表达载体的构建及鉴定
4种重组质粒的PCR扩增结果和双酶切鉴定结果一致，条带大小分别为1032bp、783bp、1425bp和1194bp，鉴定结果如图7-8，与预期结果一致，表明4种重组表达载体构建成功。
(2)重组乳酸菌基因水平验证
4种重组质粒的PCR扩增结果条带大小分别为1032bp、783bp、1425bp和1194bp，鉴定结果如图9-10，与预期结果一致，表明4种重组质粒成功转至乳酸菌中。
(3)重组乳酸菌的Western blot检测
Western blot结果显示，重组乳酸菌Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpU-CTB、Lc-pPG-OmpK和Lc-pPG-OmpK-CTB分别出现43kDa、58kDa、36kDa和51kDa大小的蛋白印记，而阴性对照无明显条带，结果见图11，与预期结果一致，表明目的蛋白可以在重组乳酸菌中表达。
(4)重组乳酸菌的间接免疫荧光检测
间接免疫荧光检测结果显示，4株重组乳酸菌菌体表面均可见绿色荧光，而Lc-pPG表面无荧光信号，结果见图12，与预期结果一致，表明OmpU、OmpK、OmpU-CTB和OmpK-CTB蛋白均锚定表达于乳酸菌表面。
1.2.7重组乳酸菌的遗传稳定性检测结果
遗传稳定性检测结果显示，4株重组乳酸菌经50次传代后测序结果与预期结果相一致，条带大小分别为1032bp、1425bp、783bp和1194bp，结果见图13，表明4株重组乳酸菌具有良好的遗传稳定性。
二、4株重组乳酸菌的免疫效果评价
2.1材料与方法
2.1.1试验材料
2.1.1.1菌株
L.casei ATCC393、拟态弧菌Hsy0531-k，及实施例1制备的重组乳酸菌Lc-pPG、Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB。
2.1.1.2试验试剂
鲫鱼膨化饲料购自通威股份有限公司；氯霉素、乳糖、海藻酸钠等购自北京索莱宝科技有限公司；组织RNA快速提取试剂盒购自BioFlux公司；反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；ELISA试剂盒购自上海奥丁生物科技有限公司。
2.1.1.3试验动物
在某水产养殖场购买360尾健康鲫鱼，平均体长12±2cm，体重50±5g，在本实验室水箱饲养，水温为25±1℃，按试验要求分组，试验前观察2周。
2.1.1.4试验主要仪器
低温台式高速离心机；干燥箱；磁力搅拌器；酶标仪；荧光定量PCR仪。
2.1.2方法
2.1.2.1鱼粮制备
将重组乳酸菌Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB活化后，用含2％乳糖的MRS液体培养基(10μg/mL Cm)诱导12h，同时用Lc-pPG作为对照，4℃，5000r/min离心15min，将重组乳酸菌和Lc-pPG的浓度调整至1.0×108CFU/mL，添加2％海藻酸钠和鱼粮进行混合，37℃烘箱烘干，晾干后平板菌落计数，无菌PBS溶液包被的鱼粮作为对照组。
2.1.2.2试验动物分组及免疫
将试验鲫鱼分为6组，每组60尾：Lc-pPG组、重组乳酸菌组(Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB、Lc-pPG-OmpK-CTB)和PBS对照组。每次口服免疫时，按鲫鱼体重2％饲喂，共免疫3次，每14d免疫一次，每次连续免疫3d，每天免疫2次(早晚各一次)。
2.1.2.3免疫鲫鱼血清中特异性抗体IgM检测
分别于免疫后第0、7、14、21、28、35和42d对各组鲫鱼进行尾静脉采血(每次各组随机选取3尾)。采集的血液37℃静置1h，4℃过夜，次日离心取上清，-80℃保存。
以纯化的OmpU和OmpK蛋白(500ng/100μL)作为抗原包被酶联板，4℃放置12h，加入含2％BSA的1×PBST，37℃封闭2h，PBST洗涤3次后加入一抗血清，37℃孵育2h，加入1:2000稀释的HRP标记兔抗鲫鱼IgM二抗，37℃孵育90min，加入TMB显色液，37℃避光显色15min后测定490nm处吸光值。
2.1.2.4免疫鲫鱼血清中非特异性免疫指标检测
按照ELISA试剂盒说明书对免疫鲫鱼血清中的ACP(酸性磷酸酶)、AKP(碱性磷酸酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、LYS(溶菌酶)、补体C3、补体C4和Lectin(凝集素)等非特异性免疫指标的活性进行检测。
2.1.2.5荧光定量PCR检测
(1)组织RNA提取
分别于免疫后第0、7、14、21、28、35和42d，于各组中随机选取3尾鲫鱼，麻醉后解剖采集肝脏、脾脏、肾、肠道和鳃组织样本，液氮速冻，-80℃保存。按照Bio Flux组织RNA提取试剂盒说明书提取RNA。
(2)反转录试验
测定提取的RNA浓度，将各组鲫鱼不同组织的RNA浓度调整至1000ng/μL作为模板按照全式金反转录试剂盒说明书进行反转录，cDNA保存于-80℃备用。
(3)荧光定量PCR检测
以各组织cDNA作为模板，分别进行qRT-PCR检测免疫鲫鱼各组织IL-10、IL-1β、TNF-α及TGF-β表达量变化。设置3个无cDNA模板的空白孔，以免疫第0d样品作为参照，β-actin为内参基因，每个样品设置3个重复。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃反应30s，40个循环。
2.1.2.6重组乳酸菌的肠道定植情况检测
将重组乳酸菌Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB、Lc-pPG-OmpK-CTB和Lc-pPG分别口服免疫鲫鱼，在第三次免疫后的第1、3、7、12及18d，各组随机选取3尾鲫鱼采集肠道，将鲫鱼肠道分为前肠、中肠和后肠，用无菌PBS反复冲洗和震荡，取适量上清液涂布于含Cm抗性的MRS琼脂平板中，培养后进行菌落计数，并随机挑取菌落进行PCR鉴定。
2.1.2.7攻毒保护性试验
经口服免疫重组乳酸菌的鲫鱼在第三次免疫结束后禁食5d，每组取20尾进行攻毒保护。复苏培养拟态弧菌Hsy0531-k(LD50为1×107CFU/mL)，调整菌液浓度至3×107CFU/mL(3×LD50)，腹腔注射鲫鱼200μL/尾，连续观察14d，记录各组鲫鱼死亡情况，通过免疫保护率公式，得到各组的免疫保护率(RPS)。免疫保护率(％)＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
2.1.2.8数据统计
使用2-△△Ct方法分析相对定量数据，使用GraphPad Prism 5绘制图形并分析数据的差异显著性(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
2.2结果
2.2.1免疫鲫鱼血清中特异性IgM检测结果
特异性抗体IgM检测结果显示，免疫重组乳酸菌的鲫鱼于首免后7d均能产生特异性抗体，显著高于Lc-pPG组和PBS组(P＜0.001)，第28d抗体水平达到最高。其中，Lc-pPG-OmpK组在14d时IgM抗体水平有所下降，加强免疫后抗体水平又有所上升。Lc-pPG-OmpU组与Lc-pPG-OmpK组相比IgM抗体水平无明显差异，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼IgM水平显著高于Lc-pPG-OmpU组与Lc-pPG-OmpK组(P＜0.01)，而Lc-pPG-OmpU组与Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间IgM水平无显著差异，Lc-pPG组和PBS组血清IgM含量无明显变化，见图14。结果表明构建的4株重组乳酸菌均可显著提高鲫鱼特异性IgM的水平，且CTB能够促进鲫鱼的特异性免疫应答，进一步提高IgM的水平。
2.2.2免疫鲫鱼血清中非特异性免疫指标检测结果
2.2.2.1免疫鲫鱼血清中AKP活性检测结果
AKP活性检测结果显示，AKP活性总体呈上升趋势，显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)，35d时达到峰值，42d有所下降。其中，Lc-pPG-OmpK-CTB组AKP活性在21d时高于Lc-pPG-OmpU-CTB组，在14d和28d时AKP活性有所下降。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组AKP活性高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P<0.05)；Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间AKP活性差异不显著，Lc-pPG组和PBS组的AKP活性无明显变化，结果如图15所示。结果表明口服重组乳酸菌可提高鲫鱼体内AKP活性，且添加CTB的重组乳酸菌效果更好。
2.2.2.2免疫鲫鱼血清中ACP活性检测结果
ACP活性检测结果显示，ACP活性总体呈上升趋势，显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)，在35d时ACP活性最高，42d呈下降趋势。其中，Lc-pPG-OmpK组和Lc-pPG-OmpK-CTB组在14d时ACP活性有所下降，加强免疫后，ACP活性开始上升，且逐渐高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpU-CTB组。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组ACP活性显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P＜0.01)，而Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间ACP活性差异不显著，Lc-pPG组和PBS组的ACP活性无明显变化，结果如图16所示。结果表明，重组乳酸菌可增强ACP活性，添加佐剂CTB能刺激鲫鱼产生更高活性的ACP。
2.2.2.3免疫鲫鱼血清中SOD活性检测结果
SOD活性检测结果显示，重组乳酸菌组的SOD活性总体呈上升趋势，且显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)。其中，Lc-pPG-OmpU组SOD活性逐渐升高并在21d时达到最高水平，随后SOD活性逐渐下降；Lc-pPG-OmpK组在7d时SOD活性高于Lc-pPG-OmpU组，随后呈下降趋势，且SOD活性低于Lc-pPG-OmpU组，加强免疫后，Lc-pPG-OmpK组SOD活性又有所升高，在28d时达到最高水平，且高于Lc-pPG-OmpU组，随后呈下降趋势；Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组SOD活性呈先升高后下降趋势，在28d时SOD活性达到峰值，且42d时Lc-pPG-OmpU-CTB组活性低于Lc-pPG-OmpK-CTB组。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组SOD活性高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P＜0.05)，而Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间SOD活性差异不显著，Lc-pPG组和PBS组SOD活性无明显变化，结果见图17。结果表明，重组乳酸菌可提高鲫鱼SOD活性，添加佐剂组能刺激机体产生更高活性的SOD。
2.2.2.4免疫鲫鱼血清中C3活性检测结果
C3活性检测结果显示，重组乳酸菌组的C3活性总体呈上升趋势，且显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)。其中，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组在第7d时C3活性达到最高水平，随后活性下降，且Lc-pPG-OmpK-CTB组C3活性高于Lc-pPG-OmpU-CTB组；Lc-pPG-OmpU组在14d时活性下降，第二次加强免疫后，C3活性又有所上升并在28d时达到最高水平，随后又呈下降趋势；Lc-pPG-OmpK组从14d开始C3活性高于Lc-pPG-OmpU组，呈先上升后下降趋势，在第28d C3活性最高，随后呈下降趋势。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组C3活性高于Lc-pPG-OmpU与Lc-pPG-OmpK组(P＜0.05)，而Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间C3活性差异不显著，Lc-pPG组和PBS组C3活性无明显变化，结果见图18。结果表明，重组乳酸菌可提高鲫鱼C3活性，添加佐剂组能刺激机体产生更高活性的C3。
2.2.2.5免疫鲫鱼血清中C4活性检测结果
C4活性检测结果显示，C4活性总体呈上升趋势，且显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)。其中，Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组在28d时C4活性呈下降趋势，第三次免疫后活性有所上升，并在35d时C4活性达到最高水平，且Lc-pPG-OmpK组C4活性高于Lc-pPG-OmpU组；Lc-pPG-OmpU-CTB组在28d时C4活性呈下降趋势，35d时活性又开始上升，42d达到峰值；Lc-pPG-OmpK-CTB组C4活性总体呈先上升后下降趋势，在28d时C4活性达到峰值，且活性高于Lc-pPG-OmpU-CTB组。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组C4活性高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(p＜0.01)，而Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间C4活性差异不显著，PBS组和Lc-pPG组C4活性无明显变化，结果见图19。结果表明，重组乳酸菌可提高鲫鱼C4活性，添加佐剂组能刺激机体产生更高活性的C4。
2.2.2.6免疫鲫鱼血清中LYS活性检测结果
LYS活性检测结果显示，重组乳酸菌组的LYS活性总体呈上升趋势，且显著高于Lc-pPG和PBS组(p＜0.001)。其中Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpU-CTB组在21d时LYS活性呈下降趋势；Lc-pPG-OmpK-CTB组LYS活性在35d时有所下降。Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB组LYS活性高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(p＜0.01)，而Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间LYS活性无显著差异，Lc-pPG组和PBS组LYS活性变化不明显，结果见图20。结果表明，重组乳酸菌可提高鲫鱼LYS活性，添加佐剂组能刺激机体产生更高活性的LYS。
2.2.2.7血清中Lectin活性检测结果
Lectin活性检测结果显示，Lectin活性总体呈上升趋势，且显著高于Lc-pPG组和PBS组(p＜0.001)。其中Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组Lectin活性在21d有所下降，加强免疫后，活性又有所上升，并在第35d达到最高，42d后活性又有所下降；Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组在35d时Lectin活性呈下降趋势。其中Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组Lectin活性高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(p＜0.01)，而Lc-pPG-OmpU组与Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组与Lc-pPG-OmpK-CTB组之间Lectin活性差异不显著，Lc-pPG和PBS组Lectin活性无明显变化，结果见图21。结果表明，重组乳酸菌可增强鲫鱼体内Lectin活性，添加佐剂CTB能刺激鲫鱼产生更高活性的Lectin。
2.2.3荧光定量PCR检测结果
(1)免疫鲫鱼各组织RNA提取结果
RNA提取结果显示，出现清晰的28S、18S、5.8S三条带，与预期结果一致，可以进行后续的反转录试验与荧光定量PCR试验。见图22。
(2)IL-1β基因表达量分析
IL-1β基因表达量检测结果表明，免疫鲫鱼各组织中IL-1β基因表达量均有不同程度的上升，重组乳酸菌组的表达水平显著高于Lc-pPG组和PBS组(P<0.001)。IL-1β在肠道中表达量高于其他组织，而在鳃中的表达量相对较低。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼不同组织中的IL-1β基因表达量均显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P<0.001)，而在脾和肾组织中，Lc-pPG-OmpK组的IL-1β基因表达量高于Lc-pPG-OmpU组，Lc-pPG-OmpK-CTB组的IL-1β基因表达量高于Lc-pPG-OmpU组。Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组与Lc-pPG-OmpK-CTB组之间IL-1β基因表达量无明显差异，Lc-pPG组和PBS组IL-1β基因表达量变化不明显，如图23。结果表明，重组乳酸菌可增强IL-1β基因表达量，且添加免疫佐剂的重组乳酸菌组IL-1β基因表达量明显高于未添加佐剂组。
(3)IL-10基因表达量分析
IL-10基因表达量的检测结果表明，免疫鲫鱼各组织中IL-10基因表达量均有不同程度的上升，重组乳酸菌组的表达水平显著高于Lc-pPG组和PBS组(P<0.001)。IL-10在脾和肾脏中表达量高于其他组织，而在鳃中的表达量相对较低。Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼不同组织中IL-10基因表达量均显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P<0.001)，在肝组织中，Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼IL-10基因表达量在28d之后显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P<0.001)，在肾和肠组织中，Lc-pPG-OmpK组和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼IL-10基因表达量高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpU-CTB组。Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间IL-10基因表达量差异不显著，Lc-pPG组和PBS组IL-10基因表达量变化不明显，如图24。结果表明，重组乳酸菌可增强IL-10基因表达量，且添加免疫佐剂的重组乳酸菌组IL-10基因表达量明显高于未添加佐剂组。
(4)TNF-α基因表达量分析
TNF-α基因表达量检测结果显示，免疫鲫鱼各组织中TNF-α基因表达量均有不同程度的上升，重组乳酸菌组的表达水平显著高于Lc-pPG组和PBS组(P<0.001)。TNF-α在肠道中表达量高于其他组织，而在脾脏中的表达量相对较低。Lc-pPG-OmpU-CTB组与Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼不同组织中的TNF-α基因表达量均显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(P<0.001)；在脾和肠组织中，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼TNF-α基因表达量在21d后显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组；在脾、肾和鳃组织中，Lc-pPG-OmpK组鲫鱼TNF-α基因表达量高于Lc-pPG-OmpU组，Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼TNF-α基因表达量高于Lc-pPG-OmpU-CTB组。Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间，Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间TNF-α基因表达量无显著差异，Lc-pPG组和PBS组TNF-α基因表达量变化不明显，如图25。结果表明，重组乳酸菌可增强TNF-α基因表达量，且添加免疫佐剂的重组乳酸菌组TNF-α基因表达量明显高于未添加佐剂组。
(5)TGF-β基因表达量分析
TGF-β基因表达量检测结果显示，免疫鲫鱼各组织中TGF-β基因表达量均有不同程度的上升，但总体上升幅度与其他细胞因子上升幅度相比幅度变化不大，重组乳酸菌组的表达水平显著高于Lc-pPG组和PBS组(P<0.001)。TGF-β在肾脏中表达量高于其他组织，而在肝脏中的表达量相对较低。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组鲫鱼不同组织中的TGF-β基因表达量均显著高于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组(p＜0.001)，然而在肝脏和肠道组织中，Lc-pPG-OmpK组TGF-β基因表达量高于Lc-pPG-OmpU组，Lc-pPG-OmpU-CTB组TGF-β基因表达量高于Lc-pPG-OmpU-CTB组。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组之间，Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组之间TGF-β基因表达量差异不显著，Lc-pPG组和PBS组TGF-β基因表达量无明显变化，如图26所示。结果表明，重组乳酸菌可增强TGF-β基因表达量，且添加免疫佐剂的重组乳酸菌组TGF-β基因表达量明显高于未添加佐剂组。
2.2.4重组乳酸菌肠道定植能力检测结果
肠道定植能力检测结果显示，Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB、Lc-pPG-OmpK-CTB和Lc-pPG免疫组鲫鱼肠道的重组乳酸菌数量在免疫结束后第1d时最高，随着时间的推移，肠道内重组乳酸菌数量逐渐减少，但在免疫结束第18d免疫组鲫鱼肠道中仍可检测到重组乳酸菌。其中，中肠和后肠中重组乳酸菌数量高于前肠，且后肠中定植数量最高。Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组的重组乳酸菌数量高于Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK和Lc-pPG组，且差异显著(P<0.01)，而Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK和Lc-pPG组之间无明显差异，结果见表1。结果表明，重组乳酸菌可在肠道中定植，且在后肠中定植能力最强。
表1重组乳酸菌肠道定植结果
Figure BDA0003711064510000131
Figure BDA0003711064510000141
注：数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，各组值为平均值±标准差。
2.2.5攻毒保护性试验结果
免疫保护率结果显示：攻毒8d内，PBS组鲫鱼全部死亡，Lc-pPG、Lc-pPG-OmpU、Lc-pPG-OmpK、Lc-pPG-OmpU-CTB和Lc-pPG-OmpK-CTB免疫组鲫鱼的相对保护率分别为12.5％、54.54％、52.08％、59.58％和58.33％，结果见图27。结果表明，重组乳酸菌对拟态弧菌的感染均具有一定的保护作用，且Lc-pPG-OmpU-CTB组和Lc-pPG-OmpK-CTB组的保护效力强于Lc-pPG-OmpU组和Lc-pPG-OmpK组，表明免疫佐剂能够增强鲫鱼重组乳酸菌的免疫保护效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种基因工程重组乳酸菌及在抗拟态弧菌感染方面的应用
<130> 2022805244
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaacaaga ctctgattgc tcttgctgta tcagctgctg cagtggctac tggtgcttac 60
gctgaaggca ttaaccaaag tggtgacaaa gcgggttcaa ccgtttacag cgcgcaagga 120
acttctctgg agatcggtgg ccgtgcagaa gcgcgtctat ctatgaaaga tggtaaagcg 180
gaagacaaat ctcgtgtacg tctgaacttc ttgggtaaag ctgaaatcaa cgacagcctg 240
tacggtgtgg gtttctatga aggcgaattc actactgctg acaacggcag cactgataac 300
aaaggtagcc tagaaaaccg ttacacctac gctggtatcg gcggtacttt tggtgaagtg 360
acttacggta aaaacgacgg cgcactgggc gtaatcactg acttcactga tatcatgtct 420
taccacggta actcagcagc agacaaaatc gctgttgcag accgcgtaga caacatgttg 480
gcatataaag gtcaatttgc tgacctaggc gtgaaagcaa gctaccgttt tgctgatcgt 540
acagaaaata ctgctactga caaatacgaa gacaacggtc aagacggtta ctcactgtct 600
gctatctacg cattcggtga cactggcttc aacgtaggtg ctggttacgc tgatcaagac 660
gagcaaaacg aatacatgct agctgcttct taccgtatgg aaaacctgta cttcgcaggt 720
ctattcactg acggtgaaaa agctgcaact aacggtgatt acactggtta cgagctggct 780
gctgcataca aactaggcca agcagcgttc actactactt acaacaacgc agaaactaac 840
agcgaaactt cagcaaataa ctttgctatc gacgcgactt actacttcaa gcctaacttc 900
cgtacttaca tctcttacaa cttcaacatg attgattctg gcgatgtgtt gggtaaagtt 960
ggtaataacg gtgtagcaac taagatcgac gctgaagacg aactggctat cggtctacgt 1020
tacgacttct aa 1032
<210> 2
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcgtaaat cacttttagc tttgagccta ttagcagcaa cttcagcccc agttatggcc 60
gctgactact cagatggcga tatccataaa aacgattaca agtggatgca atttaacctg 120
atgggtgcat tcgatgaact tccaggcaaa tcatctcatg attacctaga aatggaattt 180
ggtggtcgtt ctggcatctt tgatctgtat ggctacgttg atgtattcaa cctagcaact 240
aacaagagca gcgacaaagt tggcgatcca aaaatcttca tgaagtttgc tccacgtatg 300
tctctggatg cactgactgg cgttgatatg tctttcggtc cagtacaaga agtgtacgtt 360
gcatctctat tcgaatggga tggtacagat tttgacacta acgcattttc tgtaaacaac 420
caaaaaatcg gtctaggttc tgatgtaatg gttccatggt taggcaaaat tggcctgaac 480
ctatacggta cttatgatgg caaccgcaaa gattggaacg gtttccaaat ctctactaac 540
tggttcaaac ctttctactt cttcgagaac ggttcattca tctcttacca aggttacatt 600
gattaccaat ttggtatgaa agatgagtac tcaacagcaa gcaacggcgg cgctatgttt 660
aacggtatct actggcactc agatcgcttc gctgtgggtt acggcctgaa aggctacaaa 720
gatgtttacg gtatcaaaga ctctgatggc ttcaagtcaa ctggctttgg tcattacgtc 780
gcagtaactt acaagttgta a 801
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60
ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatacatacg 120
ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180
attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240
tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300
gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360
agtatggcaa attaa 375

Claims (10)

1.一种基因工程重组乳酸菌，其特征在于，与野生株相比，所述重组乳酸菌被修饰为具有ompU、ompK和/或霍乱肠毒素表达。
2.如权利要求1所述基因工程重组乳酸菌，其特征在于，所述ompU、ompK为外源基因，来源于拟态弧菌，进一步的，为拟态弧菌Hsy0531-k；更进一步的，所述ompU序列如SEQ ID NO:1所示，ompK序列如SEQ ID NO:2所示；
或，所述CTB基因来源于霍乱弧菌，序列如SEQ ID NO:3所示。
3.如权利要求2所述基因工程重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌被修饰为具有拟态弧菌来源的ompU表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为具有拟态弧菌来源的ompK表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为同时具有拟态弧菌来源的ompU及CTB表达；
或，所述重组乳酸菌被修饰为同时具有拟态弧菌来源的ompK及CTB表达。
4.如权利要求1所述基因工程重组乳酸菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株为乳杆菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌，德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌或瑞士乳杆菌中的一种；
进一步的，所述出发菌株为干酪乳杆菌，具体的，为干酪乳杆菌L.casei ATCC393。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求1-4任一项所述基因工程重组乳酸菌。
6.如权利要求5所述药物组合物，其特征在于，所述基因工程重组乳酸菌包括但不限于活化的菌株本身，还包括所述菌株的代谢物或培养物；另外，所述重组乳酸菌是有效剂量的，所述剂量可根据施用的对象及施用方式进行常规调整
或，所述药物组合物中还包括药学上所必须的载体；所述载体应当是对受试者无害的，包括但不限于缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、蛋白质、亲水性聚合物、螯合剂、张力调节剂、糖类或表面活性剂。
7.权利要求1-4任一项所述重组乳酸菌、权利要求5或6所述药物组合物在抗拟态弧菌感染方面的应用；
优选的，所述抗拟态弧菌感染方面的应用，至少包括以下方面：
(1)将所述重组乳酸菌、药物组合物应用于制备抗拟态弧菌感染产品；
(2)用于提升受试者对抗拟态弧菌感染的免疫能力；
进一步的，(1)方面中，所述抗拟态弧菌感染的产品包括但不限于药物或水产养殖饲料；所述药物优选为口服药物；
进一步的，所述受试者为水生动物或哺乳动物；所述水生动物包括海水及淡水动物，进一步，为鱼类或贝类，本发明验证的一种实施方式中，所述鱼类为鲫鱼；
进一步的，所述提升受试者对抗拟态弧菌感染的免疫能力，具体包括但不限于对血清中ACP、AKP、SOD、LYS、补体C3、补体C4和Lectin的调节作用，或对组织中IL-10、IL-1β、TNF-α及TGF-β表达量的调节作用。
8.一种口服疫苗，其特征在于，所述疫苗中包括权利要求1-4任一项所述重组乳酸菌和/或权利要求5或6所述药物组合物。
9.一种鱼粮，其特征在于，所述鱼粮中包括权利要求1-4任一项所述重组乳酸菌和/或权利要求5或6所述药物组合物。
10.如权利要求9所述的鱼粮，其特征在于，所述重组乳酸菌和/或药物组合物通过载体进行固定，所述载体包括但不限于多糖、硅藻土、蛋白质；
进一步的，所述鱼粮的制备方法如下，向活化后的重组乳酸菌中添加海藻酸钠溶液再与普通鱼粮进行混合，干燥后即得。
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