WO2008156211A1 - フラボンを含むバラ及びその生産方法 - Google Patents

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WO2008156211A1
WO2008156211A1 PCT/JP2008/061600 JP2008061600W WO2008156211A1 WO 2008156211 A1 WO2008156211 A1 WO 2008156211A1 JP 2008061600 W JP2008061600 W JP 2008061600W WO 2008156211 A1 WO2008156211 A1 WO 2008156211A1
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flavone synthase
flavone
gene
rose
amino acid
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PCT/JP2008/061600
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Yoshikazu Tanaka
Yukihisa Katsumoto
Yuko Fukui
Masako Mizutani
Noriko Nakamura
Junichi Togami
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International Flower Developments Proprietary Limited
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)

Definitions

  • the present invention relates to a rose that artificially contains flavones.
  • the co-pigmentation effect caused by the inclusion of flavones by gene expression manipulation is reduced.
  • Flaponoids are typical secondary metabolites of plants and have the basic skeleton of C6C3C6, as shown below, and are synthesized from phenylalanine and malonyl CoA. Depending on the oxidation state of the C ring, it is classified into flavones and flavonols.
  • flavonoids absorb ultraviolet rays and remove radicals, they were originally supposed to have a function to protect plants from various stresses. In recent years, it has also been attracting attention as a healthy component (see Harborne and Williams 2000 Phytochemistry 55, 481-504).
  • anthocyanidin a lot of orange to red flowers
  • Cyanid in red to red flowers a lot of orange to red flowers
  • delphinidin, petunidin and malvidin a type of delphinidin, petunidin and malvidin, which are common in purple to scarlet flowers, are common.
  • anthocyanin has a great influence on its color. Blueness increases as the number of hydroxyl groups on the B ring of anthocyanin increases. Therefore, Delphindine type anthocyanin is blue compared to pelargonidin type anthocyanin and cyanidin type anthocyanin.
  • the biosynthesis of flavonoids, including anthocyanins, is well preserved across plant species. Flaponoids are biosynthesized in the cytoplasm and transported and accumulated in the vacuole after addition of sugar or acyl groups (Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24, and Tanaka and (See Brugl iera 2006 A inswor th, Flowering and its manipulation, pp.
  • the flower color can be changed (Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, G 24, and Tanaka and Brugl iera 20 06 Ains or th, Flowering and its manipulat ion, pp.201-239, Blackwel 1 Publishing Ltd.).
  • the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (hereinafter abbreviated as "F3' 5'H") required to synthesize delphinidin in roses that cannot produce delphidin with petals. )
  • delphizidine is produced by expressing a gene to produce a blue flower that is not natural (see Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283-291).
  • This method of artificially modifying plant metabolism is sometimes called metabolic engineering.
  • the enzyme gene that produces the target substance may be expressed in a recombinant plant.
  • the target gene often competes with the endogenous enzyme of the plant itself. In many cases, the accumulation of substances does not occur at all or hardly, and it does not result in industrially useful traits.
  • Petunia hybr ida cannot accumulate peralgondin due to its specificity for dihydroflavonol reductase (DFR), so orange flower varieties are naturally not exist.
  • DFR dihydroflavonol reductase
  • Anthocyanins turn blue due to intramolecular pigment action when the number of aromatic acyl groups attached increases.
  • Anthocyans with two or more aromatic acyl groups are called polyacylated anthocyanins and have a stable blue color (see Harborne and Williams 2000 phytochenisty 55, 48 504 504).
  • anthocyanin pigment which is an essential pigment
  • the color of the flower changes depending on the coexisting flavonoids (also called pigments), metal ions, and the pH of the vacuole.
  • flavonol flavonol is a typical pigment, and has the effect of making anthocyanin blue and darker by stacking it with anthocyanin and sandwich (Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl. Prod. 52).
  • flavone is a colorless auxiliary pigment component.
  • isovitexin (isov), a kind of flavone i texin
  • isov has a pigment effect on anthocyanins in Japanese gardenis (Iris ensata Thunb.) and makes the color blue.
  • isopitexin stabilizes the color of flower of the honeysuckle by stabilizing anthocyanins (see Yabuya et al. Euphytica 2000 115, ⁇ 5).
  • flavones often show a stronger pigmentation effect than flavonols.
  • analysis of genetically modified carnations has shown that flavones have a stronger pigment effect than flavonols (see Fukui et al. Phy tochemi stry, 63, 15-23, 2003). Therefore, flavone accumulation is important to make the flower color blue.
  • not all plants can produce flavones, and roses and petunias are known not to accumulate flavones.
  • flavones are also involved in UV absorption, various stresses, and interactions with other microorganisms. By synthesizing flavones, it is possible to obtain plants with new traits. It is also known (see Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Flavon is synthesized from flavanone by a reaction catalyzed by flavone synthase. That is, apigenin is synthesized from naringenin, luteolin Uuteol in is synthesized from eriodictyol, and tricetin is synthesized from pendant hydroflavanone.
  • flavone synthases There are two types of flavone synthases: flavone synthase I and flavone synthase II. Both catalyze the same reaction, but are different types of enzymes.
  • Flavonase I is a 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (Britsch et al. (1981) Z. Na turforsch 36 c pp. 742-750, and Britsch (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282 pp. 152-160), and flavone synthase II is a cytochrome P450 type monooxygenase .
  • the structural gene of flavone synthase II is obtained from Trenya, Kingiyosou, Perilla (Peril la frutescens), Carbera (gerbera (Gerbera hybr ida)), Gentian, etc. (Edited by Tanaka and Brugl iera 2006 Ains orth, Flowering and its manipulat ion> pp. 201-239, Blackwel 1 Publishing Ltd.).
  • flavone synthase gene When the flavone synthase gene is expressed in a transgenic plant that does not produce flavones, flavones are expected to be synthesized. However, there was a report that when the flavone synthase gene of Trenia was expressed in petunia, the color of the dark blue-violet flower became lighter (Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004). In addition, when flavone synthase gene derived from gentian was expressed in tobacco, flavone was synthesized, but there was also a report that the color of the flower was still light (Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breeding 17: 91- 99).
  • the flower color does not necessarily turn blue.
  • factors that do not show the pigment effect include an inappropriate amount and ratio of anthocyanins and flavones, and an inappropriate modification of anthocyanins and flavones with sugar or acyl groups.
  • Roses are the most popular flowering plant and have been cultivated since BC. In addition, artificial breeding has been done for hundreds of years. As a result, roses containing pelargonidin, cyanidin, flavonol and some flavonoids were obtained. In recent years, gene Using recombination techniques, roses have also been produced that produce delphinidin that is not found in natural roses. However, roses that accumulate flavones have not yet been obtained by mating or genetic recombination. Disclosure of the invention
  • flavone synthase gene In order to synthesize flavones in roses, it can be easily analogized that the flavone synthase gene should be expressed, but which flavone synthase should be expressed, dioxygenase type or cytochrome P450 type?
  • the plant origin flavone synthase gene to be expressed cannot be easily analogized, so trial and error is required.
  • the copigment effect is a phenomenon that occurs when anthocyanins and flavones or flavonols coexist in the vacuole at a certain concentration. It has also been clarified that flavones and flavonols must be modified with more suitable modifications such as glycosylation (Nature. 2005 Au 11; 436 (7052): 79K and Nature, 358, 515 -518 (1992)). .
  • anthocyanins and flavones • flavonols must have an optimal structural combination for the desired color development, and how modified anthocyanins and flavone flavonols coexist Trial and error will also be required as to whether it should be done. Furthermore, even if the flavone synthase functions in roses, flavanones such as naringenin are rapidly hydroxylated by flavanone 3-hydroxylase (hereinafter abbreviated as “F3H”) in natural roses. Flavones are not always synthesized from flavanones.
  • the present invention seeks to provide a rose containing a pigment suitable for the desired color development in the rose.
  • the present inventor As a result of various studies, has developed a desired color tone by artificially adding flavones to roses. And the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows:
  • the rose according to 4 above which is a gene encoding any of the above. 7.
  • the flavone synthase gene derived from the above-mentioned Thorniaceae trenya is
  • the change in flower color is the hue angle in the L * a * b color system chromaticity diagram.
  • a rose J as used herein is a generic name for ornamental plants that are deciduous shrubs of the order of the order of the order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa. It is not intended to be limited to a particular variety, and it means the whole plant or the part that usually contains flowers.
  • high stringent end condition includes, for example, 6 XSSC (composition of 1 XSSC: 0.15 MN a C 1, 0.0 15 M sodium kennate, p H 7.0), 0.5% SDS, 5 X Denhardt, 100 g / m 1 denatured fragmented salmon sperm DNA in a solution containing DNA and 50% formamide, the antisense strand, and the nucleic acid of interest. Incubate at 55 ° C overnight and wash under conditions such as 0.1 XSSC and / or 60 ° C or higher, especially for non-specific background signals. A condition that does not exist substantially.
  • hue angle ( ⁇ ) in the L * a * b color system chromaticity diagram was standardized by the International Certification Committee (CIE) in 1966. This is the hue angle (0) adopted in Japan as JIS 8 7 2 9, where 0 ° is red, 90 ° is yellow, 1800 is green, and 2700 is blue. It is. The color of the flower is such a hue
  • the angle can be expressed by using a combination of RHS (Royal Horticultural Society) color chart data.
  • perilla-derived flavone synthase I I gene was introduced together with pansy-derived F3'5'H gene and the like.
  • flavones were not detected in roses introduced with perilla-derived flavone synthase II gene, indicating that this gene does not function in roses.
  • flavones were detected in para and flavone synthase I I genes derived from trenia or goldfish, and this gene was found to function in the barra.
  • the content (%) of flavones in the total flavonoids may be 1% or more, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and most preferably 30% or more.
  • Roses that accumulate both anthocyanins and flavones have a relatively blue color than roses that contain only the same anthocyanins, and the accumulation of flavones contributes to the provision of a new trait called bluening. all right.
  • the enzymes related to the present invention are typically enzymes having a specific amino acid sequence described in the sequence listing.
  • the desired enzyme activity is maintained even if the amino acid sequence is modified not only in a specific, for example, native amino acid sequence, but also in a region other than the region involved in the enzyme activity. Is well known. Therefore, the enzymes of the present invention have an amino acid sequence modified by addition, deletion and substitution with one or several amino acids and substitution with Z or other amino acids to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: Has the original enzyme activity And a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: and maintaining the original enzyme activity is also the present invention. Contained in the enzymes.
  • a nucleic acid that hybridizes to the gene under highly stringent conditions is likely to encode an enzyme having the same activity as the enzyme. Is known. Therefore, an enzyme encoded by a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions with a nucleic acid having a base sequence represented by a specific sequence number and having the desired enzyme activity is also included in the enzyme of the present invention. .
  • examples of the enzyme gene involved in the present invention include the following.
  • a flavone synthase having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution with Z or other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A flavone synthase having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution with Z or other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
  • Anthocyanins were first prepared to simulate the flavone pigment effect on anthocyanins. Cyan in was extracted from the petals of the rose variety “Rote Rose” (rose cv. “Rote Rose”) and purified. Delphin is a product of the Verbena variety "Evening Violet” (vber bena cv. Tai en Violet or vberbena variety Sunmaref TP V ("Tapien Violet) The pigment extracted from the petals was purified by alkaline hydrolysis and then Malvin and Luteolin 7-O-glucoside were purchased from Funakoshi Corporation.
  • Flavone (Luteol in 7-O-glucoside) was added to the various anthocyanins prepared in this way at a molar concentration ratio of 0, 1, 2, and 4 in a pH 5.0 buffer solution. The spectrum was measured.
  • anthocyanins Cyanin (Cyanidin 3, 5-diglucoside), Delphin (Delphinid in 3, 5-diglucoside) and Malvin (Malvid in 3, 5-diglucoside) were used.
  • the concentration of anthocyanin was ImM for Cyanin, Delphin and Malvin.
  • Example 2 (Reference example): Introduction of pansy F3 '5' H # 40 gene and perilla flavone synthase gene into rose variety "Lavande"
  • PSPB906 described in W02005 / 017147 was digested with Xhol, blunt-ended, and further digested with BamHI. Between this blunt end and the BamHI cleavage site, the above-mentioned perilla flavone synthase gene fragment was inserted to obtain 906-pY FS3.
  • 906-pYES3 is a perilla-derived flavone-synthesizing fermentation between E1 2 35S Promo D1 and D8 Yuichi Mine Ichiichi (both described in W02005 / 017147) It has a prime gene.
  • a plasmid containing the F3 '5'H # 40 gene fragment was designated PSPB575.
  • An approximately 3.4 kb perilla flavone synthase gene expression cassette obtained by digesting the above-mentioned 906-PYFS3 with Ascl was inserted into this Ascl site.
  • PSPB1310 was defined as a vector in which the expression cassette of F3 '5' H # 40 gene and the expression cassette of perilla flavone synthase were linked in the same direction.
  • This plasmid is constitutively expressed in plants in the pansy F3 '5'H # 40 gene and perilla flavone synthase gene.
  • the PSPB1310 thus prepared was introduced into a mauve rose variety “Lavande”, and 55 transformants were obtained. Of the 50 individuals subjected to dye analysis, 49 were able to confirm the accumulation of delphinidin, with a delphidinidine content of up to 70% (26% on average). However, no flavones were detected, suggesting that perilla-derived flavone synthase genes do not function in rose cells.
  • the plasmovirus derived from the flavone synthase gene derived from Torenia described in Akashi et al. (Plant Cell Physiol 40, 1182-1186, 1999) was inserted into the EcoRI and Xhol sites of the plasmid pBlues cript II SK (-). B426. This was digested with Kpnl, blunt-ended, and further digested with BamH I to obtain an approximately 1.7 kb Trenia-derived flavone synthase gene fragment.
  • PSPB906 described in W02005 / 017147 was digested with Xhol, blunt-ended, and further digested with BamHI. Between this blunt end and the BamHI cleavage site, the above-mentioned Trenya flavone synthase gene fragment was inserted to obtain 90 6 -426.
  • W02005 / 017147 PSPB575 was designated as a plasmid in which a fragment of the pange-F3 ′ 5 ′ H # 40 gene excised from PCGP1961 described above by partial digestion of BamHI and Xhol was inserted.
  • Ascl site was inserted an approximately 3.3 kb flavone synthase gene expression cassette obtained by digesting the above-mentioned 906-426 with Ascl.
  • PSPB 1309 a vector in which the F3 ′ 5 ′ M40 gene expression cassette and the flavone synthase expression cassette were linked in the same direction was designated as PSPB 1309.
  • This plasmid is constitutively expressed in plants in the pansy F3 'and 5'H # 40 genes and the trena flavone synthase gene.
  • the PSPB 1309 thus prepared was introduced into a mauve rose variety “Lavande”, and 50 transformants were obtained.
  • 36 were able to confirm the accumulation of delphinidin, with a delphidinidine content of up to 45% (average 12%).
  • accumulation of flavones was confirmed in 35 individuals by the action of the trenia-derived flavone synthase gene. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 1.68 mg per lg fresh petal weight.
  • the pSPB 1309 described in Example 3 was introduced into the salmon-pink rose variety “WKS124” (salmon-pink rose variety IKS 124) to obtain 40 transformants.
  • WKS124 salmon-pink rose variety
  • 26 individuals were able to confirm the accumulation of delphidin and the delphidinidine content was up to 96% (average: 81%), whereas the activity of the trenia-derived flavone synthase gene resulted in 26 individuals.
  • Accumulation of new flavones (tricetin, luteolin, and apigenin) was also confirmed, with the highest total flavone content being 4.41 mg per ig fresh petal weight.
  • the cDNA encoding rose flavonol synthase described in Tanaka et al. is a plasmid vector pBluescript II SK.
  • Hindlll PCR was performed according to a conventional method using RFLS-Hindlll primer (GATCTTGTTAAGCTTGTTGTAGACATAC) (SEQ ID NO: 12) to which a recognition sequence was added, using pRFLS as a saddle type.
  • the fragment obtained was partially digested with Hindi 11 and then digested with Sacl to obtain a fragment derived from about 0.85 kb upstream of the roseflavonol synthase cDNA.
  • PRFLS was cleaved with BamHI at the vector multi-cloning site and Hindlll present in the flavonol synthase cDNA to obtain a fragment derived from about 0.6 kM upstream of the roseflavonol synthase cDNA.
  • the goldfish flavon synthase gene ANFNS2 described in JP-A-2000-279182 is excised from BamHI and Xhol from the vector pBluescript II, and this is digested with PSPB906 described in W02005 / 017147 with BamHI and Xhol. Linked to Yuichi and Terminator. This is called p SPB577.
  • p SPB908 is obtained by inserting the Qualcomm flavone synthase expression cassette fragment obtained by cleaving p SPB577 with Ascl into the Ascl site of pSPB575 as described in Example 2.
  • the PSPB908 thus obtained was partially digested with Ascl, and a double-stranded RNA expression cassette derived from the approximately 3.5 kb roseflavonol synthase cMA obtained by digesting pSPB1402 with Ascl was inserted here. .
  • the obtained plasmid p SPB1403 is a binary-vector in which the double-stranded RNA expression cassettes of Pansy F3 '5'H # 40, Goldfish FNS gene, and rose FLS gene are linked in the same direction.
  • This plasmid constitutively expresses F3 '5' H # 40 gene and goldfish flavone synthase gene in plants, and further suppresses the expression of endogenous flavonol synthase gene by RNAi method. Designed.
  • PSPB 1403 was introduced into the mauve rose cultivar "Lavande" and 82 transformants were obtained. Of the 82 individuals subjected to dye analysis, 64 The accumulation of gin was confirmed, and the delphidinidine content was up to 72% (average 19%). On the other hand, the accumulation of flavones ( ⁇ lystine, luteolin, and apigenin) was confirmed in 70 individuals by the action of the flavone synthase gene derived from goldfish. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 2.50 mg per lg fresh petal weight.
  • PSPB 1403 described in Example 5 was introduced into a salmon pink rose variety “WKS124” to obtain 20 transformants.
  • Delphidinidine accumulation was confirmed in all 20 individuals subjected to dye analysis, with a maximum delphidinidine content of 89% (average 55%).
  • a flavone derived from goldfish Due to the action of the synthase gene all 20 individuals were also able to confirm the accumulation of new flavones (luteoline and apigenin). The total amount of flavones was the highest, with a high content of 1.26 mg per lg fresh petal weight.
  • PSPB1309 described in Example 3 was treated with Pacl, and was present in the vicinity of the ligation site between Trenia-derived flavone synthase-expressing cassette and pansy-derived F3 '5' H # 40 gene-expressing cassette (more precisely, Pansy F3 '5'H # 40 by cleaving the Pacl site and the Pacl site in the multicloning site of the vector.
  • the gene expression cassette was cut out.
  • the binary vector pSPB 1530 having the methyltransferase gene expression cassette described in W02003-0662428 was cleaved with Pacl, and the above pansy F3 '5'H # 40 expression cassette was It was inserted in the same direction as the transferase gene expression cassette.
  • This plasmid is called TMT-BP40.
  • PSPB 1309 was cleaved with Ascl to cut out the flavone synthase-expressing cassette of Trelia. This was inserted into the Ascl site of TMT-BP40 in the same direction as these expression cassettes, and the resulting plasmid was designated PSFL535. This plasmid constitutively expresses pansy F3 '5'H # 40 gene, trenia methyltransferase gene and trenia flavone synthase gene in plants.
  • the PSFL535 thus obtained was introduced into a salmon pink rose variety “W KS124” to obtain 173 transformants. Of the 98 transformants that were analyzed for anthocyanidin, 88 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidin methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin). The product showed that the '5'H # 40 gene and the Torenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were functional. The maximum malvidin content was 84% (average 50%).
  • flavones ⁇ lysetin, luteolin, 7pigenin
  • the total amount of flavones was highest, with a high content of 4.58 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin was detected in 51 individuals.
  • Example 8 Introduction of pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, trenia-derived flavone synthase gene and trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "Lavande"
  • PSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety “Lavande” to obtain 130 transformants.
  • 37 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin), and rose petal-derived F3 '
  • the product showed that the 5 'H # 40 gene and the trenia derived anthocyanin methyltransferase gene were functional.
  • the maximum malvidin content was 55.6% (average 20.5%).
  • flavones tricetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, 5.11 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
  • Example 9 Introduction of pansy-derived F3 '5'H # 40 gene, trenia-derived flavone synthase gene and trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "WKS82"
  • PSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety "WKS82" to obtain 250 transformants. 110 of the 232 transformants that were analyzed for anthocyanidin were able to confirm the accumulation of malvidin (anthony dinzine methylated at the 3 'and 5' positions of delphidin), and rose petals. The product showed that the pansy-derived F3 '5' H # 40 gene and the trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were functioning. The maximum malvidin content was 65.2% (average 19.7%).
  • flavones ⁇ lysine, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, with a high content of 4.7 lmg per lg fresh petal weight.
  • tricetin or luteolin methylated in 80 individuals was detected.
  • Example 10 Introduction of Pansy-derived F3 '5' H # 40 gene and Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived an ⁇ ⁇ -cyanine methyltransferase gene into rose variety "WKS140"
  • PSFL535 described in Example 7 was introduced into a mauve rose variety “WKS140” to obtain 74 transformants.
  • 74 transformants that were analyzed for anthocyanidins, 20 were able to confirm the accumulation of malvidin (anthocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin), and pansy in rose petals.
  • the product showed that the F3 '5 ⁇ # 40 gene from origin and the anthocyanin methyltransferase gene from Trenia are functioning.
  • the maximum malvidin content was 51.3% (average 33.5%).
  • flavones ⁇ -lysetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, with a high content of 3.04 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
  • Example 1 Propagation of flavone and malvidin to progeny
  • One pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were introduced Cross between genetically modified roses and cultivated roses
  • Example 1 2 Propagation of flavone synthesis ability to progeny
  • Hue angle (hue): In the L * a * b * color system, the axis of a * (red direction) is 0 °, and the color position is the angle moved from here to the counterclockwise hue. It was made to understand. 90 ° is yellow, 180 ° is green, 270 ° is blue, and 0 ° ( 360 °) is red. In other words, the closer the value is to 270 °, the bluer the hue. Industrial applicability
  • the color of a rose in a buff which is a popular flowering plant as an ornamental plant, can be changed in the blue direction by a pigmentation effect by including a flavone by a genetic recombination technique. Roses with blue flowers are expected to be in demand as ornamental plants.

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Abstract

本発明は、遺伝子組換え手法によりフラボンを含むことを特徴とするバラを提供する。当該フラボンは、典型的には、導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現によって生成される。前記フラボン合成酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子であり、具体例として、ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子、及びゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子である。

Description

フラボンを含むバラ及びその生産方法
技術分野
本発明は、 フラボン（flavone)を人為的に含有させたバラ （a rose )に関する。 本発明は、 遺伝子明操作によりフラボンを含めることに より生ずるコピグメンテーション効果（co- pigmentation effect)に 田
よりバラの花色を改変する方法、 特に花色を青色方向に変化させる 書
方法にも関する。
背景技術
花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために 必要である。 種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、 受精 することが必要である。 通常花粉の運搬は、 蜂や蝶などの昆虫や、 ハチドリ、 まれにはコゥモリにより行われる。 花弁の役割は花粉を 運ぶこれらの生物を魅了することにあり、 植物はそのために、 花の 色や形、 模様に工夫を凝らしている。
花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、 古 くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。 しかしながら 、 ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、 たとえば 、 交配により作製されたバラ （rose (Rosa hybrida))、 力一ネ一ショ > (carnat ion (Dianthus caryophyl lus) ) > (chrysanthemum (Chr ysanthemum mori fol ium) ) > ユリ （1 i ly (Li 1 ium spp. ) )などには紫力 ら青の品種がなく、 ノ、ナショウブ（Japanese garden iris (Iris ens at a Thumb. ) )やリ ンドウ (gentian (Gent i ana triflora) )には鮮やか な赤い品種はない。 花色のうち、 淡い黄色から赤色、 青色はフラポノイ ド （flavonoid )及びァン トシァニン （anthocyanin) (フラポノィ ドに属する有色配 糖体） に由来することが多い。 フラポノイ ドは植物の代表的な二次 代謝物で、 以下に示すように、 C6C3C6の基本骨格をもち、 フエニル ァラニンとマロ二ル CoAから合成される。 C環の酸化状態により、 フラボン、 フラポノール（flavonol)などに分類される。
Figure imgf000003_0001
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フラポ /一 フラポン
フラボノィ ドは、 紫外線を吸収したり、 ラジカルを除去したりす るので、 もともとは植物体を様々なス トレスから保護する機能を担 つていたと考えられる。 また健康によい成分としても近年注目され ている （Harborne and Williams 2000 Phytochemi s t ry 55, 481-504 参照）。
有色のアントシァニンには、 数百分子種が知られているが、 以下 に示すように、 その発色団であるアントシァニジン（anthocyanidin )には、 （ 1 ) オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴ二ジン（pela rgonidin) , ( 2 ) 赤色から紅色の花に多いシァニジン（cyanid in) 及びぺォニジン（peonidin)、 並びに （ 3) 紫から胄色の花に多いデ ルフィ二ジン（del phi n id in)、 ペチュニジン（petunidin)及びマルビ ジン（malvidin)の 6種が一般的である。
Figure imgf000005_0001
アントシァニンの構造はその色に大きな影響を与える。 アントシ ァニンの B環の水酸基数が増えると青みが増す。 従って、 デルフィ 二ジン型アントシァニンは、 ペラルゴ二ジン型アントシァニン、 シ ァニジン型アントシァニンに比べ青い。 アントシァニンを含むフラ ポノイ ドの生合成は、 植物種を超えてよく保存されている。 フラポ ノイ ドは細胞質で生合成され、 糖やァシル基が付加した後に、 液胞 へと輸送され蓄積される （Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24, 及び Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th 編、 Flowering and its manipulation, pp.201-239, Bla ckwel 1 Publ ishing Ltd.参照）。 生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされてい る。 組換え植物を作製できれば、 これらの遺伝子の発現を人為的に 調整することにより花で蓄積するフラポノィ ドの構造と量を改変し
、 花色を変えることができる （Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Ti ssue and Organ Culture 80, ト 24、 及び Tanaka and Brugl iera 20 06 Ains or th 編、 Flowering and its manipulat ion、 pp.201-239, Blackwel 1 Publ ishing Ltd.参照）。 たとえば、 花弁でデルフィ二 ジンを生産できない力一ネーションゃバラにおいて、 デルフィニジ ンを合成するために必要なフラポノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素 （以下 、 「F3' 5'H」 と略す。 ） 遺伝子を発現させることにより、 デルフィ 二ジンを生産させ、 自然にはない青い花を作製した例がある （Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283- 291参照）。
このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ば れることがある。 代謝を改変し、 目的の物質を蓄積させるためには 、 目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させ ればよいが、 しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、 目的の物質の蓄積がまったく、 あるいはほとんど起こらず、 産業上 有用な形質を持つに至らないことも多い。
たとえば、 ペチュニア（Petunia hybr ida)はそのジヒ ドロフラボ ノール還元酵素 （以下、 「DFR」 と略す。 ) の特異性のためにペラ ルゴンジンを蓄積できず、 したがってオレンジ色の花色の品種は天 然には存在しない。
バラなどの DFR遺伝子を導入することによりペラルゴ二ジンを蓄 積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、 ペラルゴ二 ジンを蓄積させるためには、 DFRと競合するフラポノィ ド 3'-水酸化 酵素 （以下、 「F3'H」 と略す。 ） 、 F3' 5'H、 フラポノール合成酵素 (以下、 「FLS」 と略す。 ） の遺伝子が欠損しているペチュニア品 種を用いる必要があり、 これらが欠損していないペチュニアにバラ の DFR遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない （Tanaka an d Brugl iera 2006 Ainswor t 編、 Flowering and its manipul at io n、 pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。 したがって目 的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があ らわれるかどうかは予想できない。
さらに、 代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。 た とえば、 トレニァ（Torenia hybr ida)においてフラボン合成酵素遺 伝子の発現を抑制したところ、 フラボン量が減少し、 フラバノン（f lavanone)の蓄積が見られた。 フラパノンが蓄積すればアントシァ ニン量は増加するはずで るが、 実際にはアントシァニン量も減少 した （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002) 。 こ のように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得る ためには鋭意工夫が必要である。
また、 アン卜シァニンは結合する芳香族ァシル基の数が増えると 分子内コピグメント作用により青くなる。 2つ以上の芳香族ァシル 基をもつアントシアンはポリアシル化アントシァニンと呼ばれ、 安 定な青い色を呈する （Harborne and Williams 2000 phy tocheni s t r y 55, 48卜 504参照） 。
必須色素であるアントシァニン色素自体の構造によるほか、 共存 するフラポノイ ド （コピグメントともいう） や金属イオン、 液胞の p Hなどによっても花の色は変化する。 たとえば、 フラボンゃフラ ポノールは、 代表的なコピグメントで、 アントシァニンとサンドィ ツチ状に積み重なることにより、 アン卜シァニンを青く し、 濃く見 えるようにする効果がある （Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl. Prod. 52参照） 。 この点で、 フラボンは無色の補助色素成分であ るといえる。 たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン （isov i texin) はノヽナシ 3ゥブ (Japanese gardeni r is (Iris ensata Thunb . ))においてアントシァニンに対しコピグメント効果を発揮し、 色 を青くする。 また、 イソピテキシンはアン卜シァニンを安定化する ことによりハナショウブの花の色を安定化することも示されている (Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 卜 5参照） 。
また、 フラボンはフラポノールよりも強いコピグメント効果を示 すことが多い。 たとえば遺伝子組換えカーネーションの解析ではフ ラボンがフラポノールよりもコピグメント効果が強いことが示され ている （Fukui et al. Phy tochemi s t ry, 63, 15-23, 2003参照） 。 したがって、 フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要である 。 しかしながら、 すべての植物がフラボンを生産できるわけではな く、 バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しないことが知られて いる。 また、 フラボンは、 花色以外に、 紫外線の吸収、 さまざまな ス トレス、 他の微生物との相互作用などにも関与しており、 フラポ ンを合成させることにより新しい形質を持った植物を得ることがで きることも知られている （フラボン合成酵素をコ一ドする遺伝子に 関する特許文献として、 特開 2000- 279182を参照のこと）。 しかしな がら、 バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていない フラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応によりフラバノンか ら合成される。 すなわち、 ァピゲニン（apigenin)はナリ ンゲニン（n aringenin)から、 ルテオリン Uuteol in)はエリオジクチオール（eri odictyol)から、 トリセチン（tricetin)はペン夕ヒ ドロキシフラバ ノンから合成される。 フラボン合成酵素には、 フラボン合成酵素 I とフラボン合成酵素 IIの 2種類がある。 両者は同じ反応を触媒する が、 異なるタイプの酵素である。 フラボン合成酵素 Iは 2-ォキソグ ルタル酸依存的なジォキシゲナーゼ （Britsch et al. (1981) Z. Na turforsch 36 c pp. 742-750, 及び Britsch (1990) Arch. Bioche m. Biophys.282 pp. 152- 160参照） の 1種であり、 フラボン合成酵 素 IIはチトクローム P450型のモノォキシゲナ一ゼである。 フラボン 合成酵素 IIの構造遺伝子は、 トレニァ、 キンギヨソゥ、 シソ （Peril la frutescens)、 カーべラ (gerbera(Gerbera hybr ida) )、 リンドウ などから得られている （Tanaka and Brugl iera 2006 Ains orth 編 、 Flowering and its manipulat ion> pp.201-239, Blackwel 1 Publ ishing Ltd.参照）。
フラボン合成酵素遺伝子を、 フラボンを生産しない遺伝子組換え 植物において発現させると、 フラボンが合成されることが予想され る。 しかしながら、 ペチュニアにおいてトレ二ァのフラボン合成酵 素遺伝子を発現させたところ、 濃い青紫色の花の色が薄くなつたと の報告もある （Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004) また、 リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで 発現させたところ、 フラボンが合成されたが、 やはり花の色は薄く なったとの報告もある （Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breed ing 17:91-99) 。 このように、 フラボンが合成されても必ずしも花 色は青くならない。 言い換えれば、 コピグメント効果を示さない原 因として、 アントシァニンとフラボンの量や比が適切でないことや 、 アントシァニンとフラボンの糖やァシル基による修飾が適切では ないことなどが挙げられる。 これらの結果から、 単にフラボン合成 酵素遺伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより 青くすることはできないという ことが示唆される。
バラは最も人気のある花卉植物であり、 紀元前から栽培されてい た記録がある。 また、 数百年にわたり人為的な品種改良がされてき た。 その結果、 ペラルゴ二ジン、 シァニジン、 フラボノールといつ たフラポノイ ドを含むバラが得られている。 また、 近年では遺伝子 組換えの手法を用いて、 自然のバラにはないデルフィ二ジンを生産 するバラも作られている。 しかしながら、 フラボンを蓄積するバラ は、 交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。 発明の開示
植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点 は、 交配による品種改良と異なり、 交配することができない植物や 他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。 すなわ ち、 遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任 意の植物、 たとえばバラに導入し、 その植物に新しい能力を付与す ることができるとされている。 しかしながら、 バ'ラはァラビドプシ ス (Arabidops is thai i ana)や夕ノ^コ (tobacco (Nicot iana tabacum L . ))などのモデル植物とは異なり、 導入した遺伝子が機能するかど うかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存 することが知られている。
W02005/017147によれば、 フラボノィ ド 3'， 5'一水酸化酵素遺伝子 (F3' 5'H)をバラに導入した場合、 遺伝子組換えバラにおいて、 ペチ ュニァやリンドウに由来する同遺伝子は発現せず、 デルフィ二ジン も検出されなかったが、 興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は 発現し、 デルフィ二ジンを生産するという新しい能力をバラに付与 することができた。 この結果はバラにおいては、 どの植物種由来の 遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示して いる。
また、 キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその 遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、 ま た組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなる ことが知られている。 組換え植物において異種の遺伝子の転写によ く使用されるカリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター は、 リンドウにおいては機能しないことも報告されている （Mishiba et al. Plant Journal 2005, 44: 541- 556参照）。
フラボンをバラで合成させるためには、 フラボン合成酵素遺伝子 を発現させればよいことは容易に類推できるが、 ジォキシゲナーゼ 型又はチトク口一ム P450型のいずれのフラボン合成酵素を発現させ ればよいのか、 どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させ ればよいのかなどについては、 容易に類推することはできないので 、 試行錯誤が要求される。 また、 コピグメント効果は液胞中にアン トシァニンとフラボンやフラポノールが一定の濃度で共存すれば生 じる現象であるが、 発色源であるアン トシァニンの配糖化等の修飾 状態に対し、 コピグメントとなるフラボンやフラポノールがより適 合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らか にされている （Nature. 2005 Au 11 ;436 (7052) :79K 及び Nature, 358, 515-518 (1992)参照） 。.
つまり、 必要な色調発現のためには、 アントシァニンとフラボン • フラポノールが、 最適な構造上の組み合わせをとることが必要で あり、 また、 どのように修飾されたアントシァニンとフラボン ' フ ラボノ一ルを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を 要するであろう。 さらに、 フラボン合成酵素がバラで機能したとし ても、 天然のバラではナリ ンゲニンなどのフラバノンはフラパノ ン 3 -水酸化酵素（以下、 「F3H」 と略す。 ）により速やかに水酸化され るため、 フラバノンからフラボンが合成されるとは限らない。
従って、 本発明は、 バラにおける目的とする色調発現のために適 切な色素を含むバラを提供しょうとするものである。
上記の課題を解決するため、 本発明者は、 種々検討の結果、 バラ に人為的にフラボンを含有せしめることにより 目的とする色調発現 が達成されることを見出し、 本発明を完成した。
具体的には、 本発明は以下の通りのものである ：
1. 遺伝子組換え手法によりフラボンを含むことを特徴とするバ ラ (a rose) 0
2. 前記フラボンが、 導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現 によって生成したものである、 前記 1 に記載のバラ。
3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 前記 2に記載のバラ。
4. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノ、クサ科キン干ョソゥ (Scrophul ar iaceae, Ant i rrhinum maj us) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 前記 3 に記載のバラ。
5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノ、クサ科卜レニァ (Scrophular iaceae, Torenia hybr ida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 前記 3に記載のバラ。
6. 前記ゴマノハグサ科キンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 前記 4に記載のバラ。 7. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 前記 5に記載のバラ。
8. フラボン合成酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化 している、 前記 2〜 7のいずれかに記載のバラ。
9. 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 前記 8に記載 のパラ。
1 0. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度
( Θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 前記 8又は 9に記載のバラ。
1 1. 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 前記 8に記載のバラ。
1 2. 前記 1〜 1 1 のいずれかに記載のバラと同じ性質を有する 、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 3. 遺伝子組換え手法によりフラボンを含めることにより生ず るコピグメンテーシヨ ン効果によりパラの花色を改変する方法。 1 4. 前記コピグメンテーシヨン効果が、 花色を青色方向に変化さ せる効果である、 前記 1 3に記載の方法。 発明を実施するための最良の形態
用語の定義
用語 「バラ （a rose) J とは、 本明細書中で使用するとき、 バラ目 ノヾラ科ノ ラ属（Order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa)の 落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、 特定の品種に限定される ことを意図されず、 また、 植物の全体又は通常花を含む部分を意味 する。
用語 「バラ」 の 「部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞」 とは 、 本明細書中に使用するとき、 本願発明に係る 「バラ」 の所望の遺 伝的形質が保持されている限り、 当該 「バラ」 に由来するすべての 物を意味し、 特定のものに限定されることを意図されない。
用語 「高ス トリンジエンド条件」 とは、 本明細書中で使用すると き、 例えば、 6 X S S C ( 1 X S S Cの組成 ： 0. 1 5 M N a C 1 、 0. 0 1 5 M クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0 ) と 0. 5 % S D Sと 5 Xデンハルトと 1 0 0 g /m 1 変性断片化サケ精子 D NAと 5 0 % ホルムアミ ドを含む溶液中、 アンチセンス鎖と、 対象の核酸とを 5 5 °Cで一晩保温し、 0. 1 X S S C等の条件及び /又は 6 0 °C以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、 特に、 バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる 条件をいう。
用語 「L*a*b表色系色度図における色相角度 ( Θ ) 」 とは、 本明 細書中で使用するとき、 1 9 7 6年国際証明委員会 （C I E ) で規 格化され、 日本国においても J I S 8 7 2 9 として採用された色相 角度 （ 0 ) をいい、 0 ° は赤方向、 9 0 ° は黄方向、 1 8 0 ° は緑 方向、 そして 2 7 0 ° は青方向である。 尚、 花の色は、 かかる色相 角度と、 ： R H S (英国王立園芸協会） のカラーチヤ一卜のデータを 併用して、 表すことができる。
フラボン合成遺伝子の導入
バラに公知の方法で、 シソ由来のフラボン合成酵素 I Iの遺伝子を 、 パンジー由来の F3' 5 ' H遺伝子などとともに導入した。 その結果、 シソ由来のフラボン合成酵素 I Iの遺伝子を導入したバラではフラボ ンは検出されず、 この遺伝子はバラの中では機能しないことが示さ れた。 一方、 トレニァ又はキンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素 I I の遺伝子を導入したパラではフラボンが検出され、 この遺伝子はバ ラの中で機能することがわかった。
このようにして、 従来は存在しなかったフラボンを蓄積するバラ を作出することができた。 フラボンの総フラポノイ ド中の含量 （％ ) は、 1 %以上、 好ましくは 5 %以上、 より好ましくは 10 %以上、 そ して最も好ましくは 30 %以上であればよい。 アントシァニンとフラ ボンの両方を蓄積するバラは、 同じアントシァニンのみを含むバラ より も、 相対的に青い色をしており、 フラボンの蓄積が青色化とい う新しい形質の付与に貢献していることがわかった。
また、 交雑試験により、 この形質は子孫にも伝達されることがわ かった。
本発明に関連する酵素類は、 典型的には、 配列表に記載されてい る特定のアミノ酸配列を有する酵素である。 しかしながら、 酵素に おいては、 特定の、 例えば生来の、 アミノ酸配列のみならず、 酵素 活性に関与する領域以外の領域においてァミノ酸配列が修飾されて いても、 所望の酵素活性が維持されることはよく知られている。 従 つて、 本発明の酵素類は、 配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対 して、 1個〜数個のアミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸 による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、 本来の酵素活性 を維持しているタンパク質、 及び配列番号に示す特定のアミノ酸配 列に対して 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、 本 来の酵素活性を維持しているタンパク質も、 本発明の酵素に含まれ る。
また、 ある酵素をコードする遺伝子を手にすれば、 当該遺伝子に 対して高ス トリンジェント条件下でハイブリダィズする核酸は、 当 該酵素と同様の活性を有する酵素をコードしている蓋然性が高いこ とが知られている。 従って、 特定の配列番号で示す塩基配列を有す る核酸と高ス トリ ンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によ りコードされ、 且つ目的の酵素活性を有する酵素も、 本発明の酵素 に含まれる。
従って、 本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げら れる。
( A) キンギヨソゥ （Antirrhinum ma j us)由来のフラボン合成酵 素遺伝子
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
(4) 配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ン卜条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
( B ) トレニァ（Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝 子
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のァミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
( C ) シソ （Perilla frutescens)由来のフラボン合成酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたァミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 6に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 5に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリ ンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコ一ドする遺伝子。
(D ) パンジー（pansy (Viola x wi 11 rocki ana) )由来の 3', 5'—水 酸化酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化 酵素、
( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有する 3', 5 '—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ント条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされた 3'， 5'— 水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
(E) トレニァ（Torenia hybrida)由来のメチル基転移酵素遺伝 子
( 1 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移 酵素、
( 2 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個 のアミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により 修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
( 3 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 9示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコードされたメチル基転 移酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。 実施例
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。 本実施例は 、 本発明を例示することのみを目的とし、 本発明の範囲を限定する ものと解されることを意図されない。
実施例 1 ： アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果の シミュレーション
アントシァニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレ —シヨ ンを行うため、 まずアントシァニン類を調製した。 Cyan inは バラ品種 "Rote Rose" (rose cv. "Rote Rose" )の花弁より抽出、 精製した。 Delphinはバーべナ品種 "夕ビアンバイオレッ ト" （vber bena cv. Ta i en Violet or vberbena variety Sunmaref TP V ( "Tapien Violet ) ( "Tap i en" is a Trade Mark registered in J apan) )の花弁より抽出した色素を、 アルカリ加水分解した後精製し た。 Malvin、 及び Luteolin 7- O-glucosideはフナコシ株式会社よ り購入した。
このようにして調製した種々のアントシァニンに対してフラボン (Luteol in 7- O-glucoside) を、 pH5.0の緩衝液中、 0、 1、 2、 4当 量のモル濃度比で添加し、 吸収スペク トルを測定した。 アントシァ ニンとしては、 Cyanin (Cyanidin 3, 5-d iglucos ide) 、 Delphin (D e lphinid in 3， 5 - d iglucos ide) 、 Malvin (Malvid in 3, 5-diglucos ide) を用いた。 アントシァニンの濃度は Cyanin、 Delphinおよび Ma lvinは ImMとした。
以下の表 1 と 2に示すように、 フラボンの添加により、 アントシ ァニン水溶液の吸光度は増大し、 その変化の割合 （吸光度比） は、 Malvinで最大であった。 また、 吸収極大 （ λ max) もフラボンの添 加とともに長波長側へシフ 卜した。 その変化の割合は Malvinで最大 、 次いで Delphinであった。 さらに、 L*a*b*表色系により色彩値の 評価を行ったところ、 フラボンの添加により、 色彩の青色化が観察 され、 彩度も上昇した。 その効果は、 Malvinで最も顕著であった。 すなわち、 Luteolin 7- 0_glucos ideのコピグメント効果を最も受 けるのは Mai vinであることが判明した。
表 1
フラボン添加時のアントシァニン水溶液の吸収極大
Figure imgf000020_0001
λ maxにおけるフラボン無添加に対する吸光度比
Figure imgf000020_0002
実施例 2 (参考例） ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とシソ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
特開 2000- 279182に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含 むプラスミ ド、 pYFS3を Xbalで消化した後、 平滑末端化し、 さらに B amHIで消化して、 約 l. Skbのシソ フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さらに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 906 - pY FS3を得た。 906-pYES3は E1235Sプロモ一夕一と D8夕一ミネ一夕一 （ いずれも W02005/017147に記載） の間にシソ由来のフラボン合成酵 素遺伝子を有するものである。
Ueyama らの報告 （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された pSPB176の BamHIと Sail部位に、 W02005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ — F3' 5'H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とした 。 この Ascl部位に、 上述の 906- PYFS3を Asclで消化して得られる約 3 .4kbのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを揷入した。 得 られたプラスミ ドのうち、 F3' 5' H #40遺伝子の発現カセッ トとシ ソのフラボン合成酵素の発現カセッ トが同じ方向に連結されたべク 夕一を PSPB1310 とした。 本プラスミ ドは植物においてはパンジー の F3' 5'H #40遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現 する。
このようにして作製した PSPB1310を藤色系バラ品種 "Lavande" ( mauve rose variety "Lavande" )へ導入し、 55個体の开質転換体を 得た。 色素分析を行った 50個体のうち 49個体でデルフィ二ジンの蓄 積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 70% (平均 26%) であ つた。 しかしながら、 フラボンは全く検出されず、 シソ由来のフラ ボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察さ れた。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 3に示す。
表 3
Figure imgf000022_0001
対照 ： Lavande対照
De 1 ： デルフィジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン、 M： ミ リセチン、
Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： 卜 リセチン、 Lut ： ルテオリ ン、
Api ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 3 ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3， 5' H #40 遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
Akashiらの報告 （Plant Cell Physiol 40, 1182-1186, 1999) に 記載のトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子が、 プラスミ ド pBlues cript II SK (-) の EcoRIと Xhol部位に揷入されたプラスミ ドを pSP B426とした。 これを Kpnlで消化した後、 平滑末端化し、 さらに BamH Iで消化し、 約 1.7kbのトレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さらに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述のトレニァのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 90 6 - 426を得た。
Ueyama らの報告 （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された pSPB176の BamHIと Sail部位に、 W02005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ -F3' 5' H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とし た。 この Ascl部位に、 上述の 906- 426を Asclで消化して得られる約 3 .3 kbのトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを揷入し た。 得られたプラスミ ドのうち、 F3' 5' M40遺伝子の発現カセッ ト と トレ二ァのフラボン合成酵素の発現カセッ トが同じ方向に連結さ れたベクターを PSPB 1309 とした。 本プラスミ ドは植物においては パンジー F3'， 5'H#40遺伝子とトレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子構 成的に発現する。
このようにして作製した PSPB 1309を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し、 50個体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 38個体の うち 36個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含 有率は最高 45% (平均 12%) であった。 一方、 トレニァ由来フラポ ン合成酵素遺伝子の働きにより、 35個体で新たにフラボン （ルテオ リ ン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新 鮮花弁重量 lgあたり 1.68mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 4に示す。
表 4
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000024_0001
ミ リセチン、
Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri : ト リセチン、 Lut： ルテオリ ン、
A i ： ァピゲニン
Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 4 ： パラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝 子と 卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
サ一モンピンク系のバラ品種 "WKS124" (salmon-pink rose vari ety IKS 124" )へ実施例 3に記載の pSPB 1309を導入し、 40個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 27個体のうち 26個体でデルフィ 二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 96% (平均 81%) であった。 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働 きにより、 26個体で新たにフラボン （トリセチン、 ルテオリ ン、 ァ ピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重 量 igあたり 4.41mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 5に示す。 表 5
Figure imgf000025_0001
対照 ： WKS124対照
Del ： デルフィ ジニジン、 Cya ： シァニジン Pel ： ペラルゴ二ジン、 M： ミ リセチン、
Q： ケルセチン、 K ケンフエロール、 Tri ： ト リセチン、 Lu ルテオリ ン、
Api ： ァピゲニン
Del (%) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 5 ： バラ品種 "Lavande" でのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺 伝子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在 性フラポノール合成酵素遺伝子の抑制
Tanakaらの報告 (Encyclopedia of rose science vol. 1, pp.34 1-350, ISBN 0-12-227621-3) に記載のバラのフラポノール合成酵 素をコードする cDNAが、 プラスミ ドベクター pBluescript II SK -に クローニングされたものを pRFLSとする。 ベクタ一のマルチクロ一 ニングサイ ト上流の配列に由来する Reverseプライマー （AACAGCTAT GACCATG) (配列番号 1 1 ) と、 バラのフラボノール合成酵素 cDNA の配列の 5'末端から約 0.8kb下流の配列に加えて Hindlll認識配列を 付加した RFLS- Hindlllプライマ一 ( GATCTTGTTAAGCTTGTTGTAGACATAC ) (配列番号 1 2) を用い、 pRFLSを铸型として常法に従い PCRを行 た。 得られた断片を Hindi 11で部分消化し、 続いて Saclで消化するこ とにより、 バラフラポノ一ル合成酵素 cDNAの上流約 0.85kbに由来す る断片を得た。 一方、 PRFLS をべクタ一のマルチクローニングサイ トの BamHIとフラボノール合成酵素 cDNA内に存在する Hindlllで切断 し、 バラフラボノール合成酵素 cDNAの上流約 0.6kMこ由来する断片 を得た。 フラポノール合成酵素 cDNAに由来するこれら約 0.6kbの断 片並びに約 0.85kbの断片を、 W02005/059141に記載の PSPB184 を、 B amHIおよび Saclにて消化し得られる BamHI/SacI部位に挿入し、 pSPB 1402を得た。
次に、 特開 2000-279182に記載のキンギヨソゥ由来フラボン合成 酵素遺伝子 ANFNS2をベクター pBluescript II から BamHIと Xholから 切り出し、 これを W02005/017147に記載の PSPB906を BamHIと Xholで 消化して得られるプロモ一夕一とターミネータ一に連結した。 これ を p SPB577とする。 p SPB577を Asclで切断して得られるキンギヨソ ゥのフラボン合成酵素発現カセッ ト断片を実施例 2に記載の p SPB5 75の Ascl部位に挿入したものを p SPB908とする。
このようにして得られた PSPB908を Asclで部分消化し、 ここに、 p SPB1402を Asclで消化して得られる約 3.5kbのバラフラボノール合成 酵素 cMAに由来する二本鎖 RNA発現カセッ トを挿入した。 得られた プラスミ ド p SPB1403は、 パンジー F3' 5'H #40、 キンギヨソゥ FNS遺 伝子、 バラ FLS遺伝子の二本鎖 RNA発現カセッ トが同方向に連結され たバイナリ -ベクターである。 本プラスミ ドは植物においては F3' 5' H #40遺伝子遺伝子とキンギヨソゥフラボン合成酵素遺伝子を構成 的に発現し、 さらに RNAi法により内在性のフラポノール合成酵素遺 伝子の発現を抑制するようデザィンされている。
藤色系バラ品種 "Lavande" へ pSPB 1403を導入し、 82個体の形質 転換体を得た。 色素分析を行った 82個体のうち 64個体でデルフィ二 ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 72% (平均 19 %) であった。 一方、 キンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の 働きにより、 70個体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁 重量 lgあたり 2.50mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 6に示す。
表 6
Figure imgf000027_0001
対照 ： vande対
De 1 ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン、 M： ミ リセチン、
Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： ト リセチン、 Lut ： ルテォリ ン、
Api ： ァピゲニン
Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 6 ： バラ品種 "WKS124" でのパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝 子とキンギヨソゥ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性 フラポノール合成酵素遺伝子の抑制
実施例 5に記載の PSPB 1403をサーモンピンク系バラ品種 "WKS124 " へ導入し、 20個体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 20個体 全てでデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は 最高 89% (平均 55%) であった。 一方、 キンギヨソゥ由来フラボン 合成酵素遺伝子の働きにより、 20個体全てで新たにフラボン （ルテ ォリン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で 新鮮花弁重量 lgあたり 1.26mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 7 に示す。
表 7
Figure imgf000028_0001
De 1 ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン、 M： ミ リセチン、
Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri ： ト リセチン、 Lut ： ルテオリ ン、
A i ： ァピゲニン
Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ 二ジンの割合 実施例 7 ： バラ品種 "WKS124" へのパンジ一由来 F3' 5'H #40遺伝 子と 卜レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及び卜レニァ由来アント シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 3に記載の PSPB1309を Pacl処理し、 トレニァ由来のフラポ ン合成酵素発現カセッ 卜とパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子発現カセ ッ トの連結部位付近に存在する （より厳密には、 フラボン合成酵素 発現カセッ 卜の D8夕一ミネ一夕一 3'末端付近に存在する） Pacl部位 とベクターのマルチクローニングサイ ト内の Pacl部位を切断するこ とにより、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子発現カセッ 卜を切り出した。 一方、 W02003- 062428に記載されたトレニァのメチル基転移酵素 遺伝子発現カセッ トを有するバイナリ一ベクター pSPB 1530を Paclで 切断し、 そこに上記のパンジー F3' 5'H #40発現カセッ トを、 メチル 基転移酵素遺伝子発現カセッ トと同じ方向に挿入した。 本プラスミ ドを TMT-BP40とする。
一方、 PSPB 1309を Asclで切断し、 トレ二ァのフラボン合成酵素発 現カセッ トを切り出した。 これを TMT- BP40の Ascl部位に、 これらの 発現カセッ トと同じ方向に挿入し、 得られたプラスミ ドを PSFL535 とした。 本プラスミ ドは植物において、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子 と トレニァのメチル基転移酵素遺伝子、 及びトレ二ァのフラボン合 成酵素遺伝子を構成的に発現する。
このようにして得られた PSFL535をサーモンピンク系バラ品種 "W KS124" へ導入し、 173個体の形質転換体を得た。 アントシァニジン 分析を行った 98個体の形質転換体のうち 88個体でマルビジン （デル フィニジンの 3'位と 5 '位がメチル化されたアントシァニジン) の蓄 積を確認でき、 バラの花弁においてパンジ一由来 F3' 5'H #40遺伝 子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能し ていることが生成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最 高 84% (平均 50%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 77個 体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリン、 7ピゲニン) の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4.58 mgという高い含有量であった。 また、 51個体でメチル化されたトリ セチンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 8に示す。
Figure imgf000030_0001
Mai： マルビジン、
M： ミリセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut： ルテオリン、 Api： ァピゲ二
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合、
Mai (%) ： 総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 8 ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アント シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し 、 130個体の形質転換体を得た。 アントシァニジン分析を行った 118 個体の形質転換体のうち 37個体でマルビジン （デルフィ二ジンの 3' 位と 5'位がメチル化されたアントシァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由 来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生 成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最高 55.6% (平均 20.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 78個 体で新たにフラボン （トリセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できだ。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 5.11 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 9に示す。
表 9
Figure imgf000032_0001
対照 ： ラバンデ対照
De I ： デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pe t ： ペチュニジン、 Pel ： ペラルゴ二ジン ： Peo： ぺォニジン、 Mai ： マル ビジン、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン ： K： ケンフエロール、 Tri ： トリセチン、 Lu t ： ルテオリ ン、 Ap i： ァピゲ二 ン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （テルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合 Mai (%) ： 総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 9 ： バラ品種 " WKS82" へのパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子 と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アントシ ァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "WKS82" (mauve ros e variety "WKS82" )へ導入し、 250個体の形質転換体を得た。 アン トシァニジン分析を行った 232個体の形質転換体のうち 110個体でマ ルビジン (デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシ 了二ジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3 ' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素 遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マルビ ジン含有率は最高 65.2% (平均 19.7%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 125 個体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン) の 蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 7 lmgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形 質転換体のうち 80個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリ ン が検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 0に示す。
表 10
Figure imgf000034_0001
対照 · WKS82対昭
Del ： デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pet ： ペチュニジン、 Pel ： ペラルゴ二ジン ： Peo ： ぺォニジン、 Mai ： マル ビジン、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン ： K： ケンフエロール、 Tri : トリセチン、 Lu t ： ルテオリ ン、 Ap i ： ァピゲ二
Del (%) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン) の割合 Mai (%) ： 総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 0 ： バラ品種 "WKS140" へのパンジー由来 F3' 5' H # 40遺 伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン 卜シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 7 に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "WKS140" (mauve ro se variety "WKS140" )へ導入し、 74個体の形質転換体を得た。 ァ ントシァニジン分析を行った 74個体の形質転換体のうち 20個体でマ ルビジン （デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアントシ ァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3 ' 5Ή #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素 遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マルビ ジン含有率は最高 51.3% (平均 33.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 29個 体で新たにフラボン (卜リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 3.04 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 1 1 に示す。
表 11
Figure imgf000036_0001
対照 ： WKS140対照
Del ： デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pet ： ペチュニジン、 Pel ： ペラルゴ二ジン ： Peo： ぺォニジン、 Mai ： マル ビジン、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン ： K： ケンフエロール、 Tri : ト リセチン、 Lu t： ルテオリ ン、 Ap i ： ァピゲ二 ン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合 Mai (%) ： 総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 1 ： フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播一パン ジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺 伝子と トレニァ由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子を導入 した遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 7で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ （ 表 8中、 植物 No.6) を花粉親として用いた交配を行った。 種子親に は、 中輪系栽培バラ "Medeo (メデォ） " （flor: bunda rose varie ty "Medeo" )を用いた。
取得した形質転換体 Fl雑種後代のうち 10個体の色素分析を行った ところ、 7個体でマルビジンの蓄積が確認され、 バラの花弁におい てパンジ一由来 F3' 5Ή #40遺伝子と トレニァ由来アントシァニン メチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示され た。 なお、 マルビジン含有率は最高 68.2% (平均 46.6%) であった 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 8個 体の形質転換体後代でフラボン （トリセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲ ニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lg あたり 7.35mgという極めて高い含有量であった。 また、 フラボンを 生産していた形質転換体後代のうち 6個体でメチル化されたトリセ チンが検出された。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 2に示す。 表 12
Figure imgf000038_0001
Del ： デ 二ジン Cya シァニジン Pet ペチュ二ジン Pel Peo： ぺ 二 ン、 a マル ビジン、 M： ミ リセチン、 Q ケルセチン K： ケンフエ口—ル Tri ト リセチン、 Lut ： ルテオリ ン、 A i： ァピゲ二 ン
Del {%) ： 総ァン トシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ ジン、 ペチュニジン、 マ の割合 Mai (%) ： 総ァン トシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 2 ： フラボン合成能の後代への伝播
パンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子及びトレニァ由来アントシァニ ンメチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種 "WKS124" と、 パン ジー由来 F3' 5'H # 40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝 子を導入したバラ品種 "Lavande" の交配
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 3で作出したフラボン生産株 （表 4中、 植物 No.4) を花 粉親として用いた交配を行った。 種子親には、 バラ品種 WKS124へ pS PB 1532を導入し、 パンジー由来 F3' 5'H # 40遺伝子およびトレニァ 由来アントシァニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマ ルビジンを高蓄積した形質転換体 124/1532-12-1 (W02003/06242 8に記載） を用いた。
取得した形質転換体後代のうち 149個体の色素分析を行ったとこ ろ、 88個体でフラボン （トリセチン、 ルテオリン、 ァピゲニン） の 蓄積が確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 09mgという高い含有量であった。 また、 42個体でメチル化されたト リセチンが検出され、 11個体でメチル化されたルテオリン （Chryso eriol (3'Met-Lut) ) が検出された。 なお、 色素分析を行った 149' 個体のうち、 129個体でマルビジンの蓄積が確認できた。 マルビジ ン含有率は最高 79% (平均 36%) であった。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 3に示す。
表 13
Figure imgf000040_0001
Del ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pet： ペチュニジン、 Pel： ペラルゴ二ジン、 Peo： ぺォニジン 、 Mai： マルビジン、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエ口一ル、 Tri： トリセチン、 Lut： ルテ ォリ ン、 Ap i： ァピゲニン
Del (%) ： 総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン ) の割合、
Mai (%) ： 総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 3 ： フラボンを含むバラの花色の評価
実施例 4及び 7 に いて作出された形質転換体 （パラ品種 "WKS1
24" を宿主とする） について、 （ 1 ) 主な色素としてデルフィニジ ヽ
ン 蓄積し、 フラポノを含まないもの、 （ 2 ) 主な色素としてデル フィニジンを蓄積し 、 フラボンを含むもの、 及び （ 3 ) 宿主 （主な 色素としてペラハゴ一ンンを蓄積） というグループに分類し、 それ ぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行った （n ==
10) 。
~>、、
主色素がデルフィ一ンンタイプのバラ、 マルビジンタイプのバラ いずれにおいても、 フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青 色方向へシフ 卜していた 。 また、 主色素がマルビジンタイプのバラ においては、 その傾向がより顕著であり、 反射スペク トルの極小 （ λ Min) も長波長側へ大きくシフ トしていた。 以上の結果から、 フ ラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。 結果を以下の表 1 4に示す。 表 14
Figure imgf000041_0001
色相角度 （hue) ： L*a*b*表色系において、 a* (赤方向） の軸を 0° とし て、 ここから反時計方向の色相に対して移動した角度で、 色の位置がわか るようにしたもの。 90° であれば黄方向、 180° であれば、 緑方向、 270 ° であれば青方向、 0° (= 360° )であれば赤方向という ことになる。 すなわ ち、 数値が 270° に近いほど色相は青い。 産業上の利用の可能性
本発明により、 鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバフ において、 遺伝子組換え手法によりフラボンを含ませることで ビグメンテ —ショ ン効果によりバラの花色を青色方向に変化させる ことができる。 青色の花色を つバラは観賞用植物としての商品需 要が見込まれる。
本明細書中に引用した特許文献、 非特許技術文献の全て を、 個別に又はそれらを全体として、 本明細書中に援用する
これまで 、 本発明を説明してきたが、 本発明は、 その本質から 脱せずに、 修正又は変更されうると解されるべきであり、 本発明の 範囲は、 実施例の記載に基づ のではな 添付の請求の範囲によ り画されるべきことはいうまでもない。

Claims

1. 遺伝子組換え手法によりフラボンを含むことを特徴とするバ ラ (a rose)。
2. 前記フラボンが、 導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現 によって生成したもので一一口ある、 請求項 1 に記載のバラ。
青
3. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 請求項 2に記載のバラ。
4. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノ、クサ科キンギヨソゥ (Scrophular iaceae, Antirrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 請囲求項 3に記載のバラ。
5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハグサ科卜レニァ（Scrophulariaceae, Torenia hybrida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 請求項 3に記載のパラ。
6 . 前記ゴマノハグサ科キンギヨソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリ ンジェ ント条件下で八イブリダィズする核酸によりコードされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 請求項 4に記載のバラ。
7 . 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び/又は他のァミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリンジェ ン卜条件下でハイブリダィズする核酸によりコ一ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、 請求項 5に記載のバラ。
8 . フラボン合成酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化 している、 請求項 2〜 7のいずれか 1項に記載のバラ。
9 . 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 請求項 8に記 載のバラ。
1 0 . 前記花色の変化が、 L *b表色系色度図における色相角度 ( Θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 請求項 8又 は 9に記載のバラ。
1 1 . 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 請求項 8に記載のバラ。
1 2 . 請求項 1 〜 1 1のいずれか 1項に記載のバラと同じ性質を 有する、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 3 . 遺伝子組換え手法によりフラボンを含めることにより生ず るコピグメンテーシヨン効果によりバラの花色を改変する方法。
1 4 . 前記コピグメンテーシヨン効果が、 花色を青色方向に変化 させる効果である、 請求項 1 3に記載の方法
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