WO2008151512A1 - Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives - Google Patents

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WO2008151512A1
WO2008151512A1 PCT/CN2008/001093 CN2008001093W WO2008151512A1 WO 2008151512 A1 WO2008151512 A1 WO 2008151512A1 CN 2008001093 W CN2008001093 W CN 2008001093W WO 2008151512 A1 WO2008151512 A1 WO 2008151512A1
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cys
sct
val
salmon calcitonin
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PCT/CN2008/001093
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Keliang Liu
Jiankun Qie
Zhixia Yang
Yuanjun Liang
Ying Wang
Zehui Gong
Huajin Dong
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Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A.
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of a localized PEGylated modification of linear salmon calcitonin analogs, pharmaceutical compositions containing the same, and their use in the treatment of diseases such as osteoporosis and related bone metabolic diseases and bone pain. Background technique
  • Calcitonin is secreted by the mammalian thyroid follicular paracancerous cells (C cells) or the posterior corpus callosum of fish and birds, a single-chain peptide compound containing 32 amino acid residues. It is one of the important hormones for maintaining calcium and phosphorus metabolism in the body. Its main function is to inhibit bone resorption and lower blood calcium levels. Natural calcitonin isolated from animals of different species has the following structural features in the molecule, although the composition of the amino acid residues is different: N-terminal 1, disulfide ring formed by cysteine at position 7 Structure and C-terminal proline group.
  • calcitonin secreted by the ridge promoter of fish is the strongest, and the calcitonin secreted by mammals is weak, such as salmon calcitonin (sCT, whose primary sequence is: H-ring (Cys'-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys 7 ) -Va l-Leu-Gly-Lys n -Leu-Ser -Gln-Glu-Leu 16 -Hi s-Lys-Leu-Gln-Thr 21 -Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn 26 -Thr-G 1 y-Ser-G 1 y 30 -Thr 31 -Pr o-NH 2 ) is 30 times more active than human calcitonin (hCT).
  • Calcitonin can effectively prevent osteoporosis, and at the same time reduce the symptoms of bone pain and fatigue in patients with osteoporosis.
  • synthetic analogs of sCT, hCT, and salmon calcitonin (eCT) are clinically used primarily to treat osteoporosis, Paget's disease, hypercalcemia, and osteoporosis in senile and postmenopausal women. Or bone pain caused by bone tumors.
  • sCT is mainly used to treat postmenopausal osteoporosis in women. It is also suitable for estrogen contraindications and male osteoporosis patients. Its injection has been listed in the US in 1986. l ci c ), the usual dose is 10-20ug/day.
  • sCT activates adenylate cyclase (cAMP), and studies have shown that cAMP acts as an important sputum in osteoclasts and is involved in the inhibition of osteoclasts.
  • sCT can also act on human osteoblasts to stimulate the proliferation and differentiation of osteoblasts.
  • s CT reduces blood calcium and phosphorus levels mainly by inhibiting the conversion of bone calcium to blood calcium.
  • sCT can specifically bind to the calcitonin receptors in the brain and hypothalamus, mediating central analgesic effects.
  • disulfide rings have different effects on the activity of different calcitonin.
  • the disulfide ring in sCT is not a necessary group for its activity, and its linear analog, that is, the sCT analog containing no 1,7 disulfide ring, can still maintain good biological activity.
  • the linear salmon calcitonin analogue (hereinafter referred to as sCT (L)) is less difficult to synthesize and the cost is reduced.
  • sCT (L) The linear salmon calcitonin analogue
  • peptide drugs can maintain good biological activity after modification with polyethylene glycol (PEG) and can significantly prolong the half-life in vivo. At present, there have been reports on the PEG modification of sCT.
  • sCT sCT (L) form
  • sCT (L) form the precise sCT analogs
  • Single PEG positioning modification it is necessary to contain or reintroduce amino acid residues containing a specific reactive functional group in a linear sCT analog to increase the specificity of the reaction.
  • the preparation of these linear sCT analogs can be accomplished by any technique conventional in the art, preferably by chemical synthesis.
  • the abbreviations used in the present invention have the following meanings:
  • One of the objects of the present invention is to provide a localized PEGylation modification of a linear salmon calcitonin analog which is structured to alter certain amino acid residues in the amino acid sequence of a linear salmon calcitonin analog.
  • the side chain retains only one amino group, carboxyl group or sulfhydryl group, and the polyethylene glycol modification of the positioning is accomplished on these amino, carboxyl or sulfhydryl groups.
  • the polyethylene glycol modification of the linear salmon calcitonin analog of the present invention is as described in the following formula (1), formula (I I ) or formula (I I I ) and its definition.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of a localized polyethylene glycolated modification of a linear salmon calcitonin analog.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a sterly PEGylated modification of at least one of the above linear salmon calcitonin analogs, or a stereoisomer or pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the invention further relates to the use of a localized PEGylated modification of the linear salmon calcitonin analog of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of osteoporosis, bone pain and the like of a bone metabolic disease or condition.
  • Positioning PEGylation modification of linear salmon calcitonin analog of the present invention There is a structure of formula (I):
  • Cys is a cysteine and can be located at any one of the linear salmon calcitonin analogs, including the N-terminus, the C-terminus, and any one of the sequences;
  • sCT(L) is a linear salmon calcitonin peptide analog having the following structural features: Aai-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Aa 2 -Aa 3 -Leu-Gly-Aa i) -Leu-Ser- Gln-Glu-Aa 5 -Aa 6 -Aa7-Aa8-Pro-Aa9-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Aaio- Thr-Pro-NH 2
  • Aai may be selected from the group consisting of Cys, AcmCys, N-a-pro inol-Cys, Ala, D-Ala, Val, Leu, lie, Gly, Ser, Thr, Phe, Met, Tr of a non-polar amino acid;
  • Aa 2 may be selected from the group consisting of Cys, AcmCys, Ala, D-Ala, Val, Leu, lie, Gly, Ser, Thr, Phe, Met, Trp, and non-polar amino acids, and human & 1 and human & 2 are not Cys at the same time ;
  • Aa 3 is a non-polar amino acid selected from the group consisting of Val, Gly, Met, Leu, lie, Cys, Ala, D-Ala;
  • Aa 4 is a gas-based acid selected from the group consisting of Lys, Cys, Arg, and Gin;
  • Aa 5 is an amino acid selected from the group consisting of Leu, Ala, D-Ala, He, Cys, Val, Gly;
  • Aa 6 is an amino acid selected from the group consisting of His, Cys, Lys, Arg;
  • Aa 7 is an amino acid selected from the group consisting of Lys, Arg, Cys, His, Gin; Aa 8 i ll -Leu-Gln-Thr-Tyr-, -Gln-Thr-Tyr-, -Thr-Tyr-, -Leu-Gln-Thr-, -Leu-Gln-, -Cys-Tyr-, Leu, Tyr, Ala, D-Ala, Cys;
  • Aa 9 may be selected from the amino acids of Arg, Lys, His, Cys;
  • Amino acids may be selected from the group consisting of Gly, Ala, D-Ala, Cys, Pro, D-Pro. Unless otherwise specified, the amino acids are all L-type mercapto acids. According to a preferred embodiment of the invention, sCT (L) in equation (I) has the following structural features:
  • Aa 2 is Cys, Ala, D-Ala, and Aa! and Aa 2 are not Cys at the same time;
  • Aa 3 is Val, Gly, Ala, D-Ala;
  • Aa 4 is Lys, Arg
  • Aa 5 is Leu, Ala, D-Ala, Cys
  • Aa 6 is His, Arg
  • Aa 7 is Lys, Arg
  • Aa 9 is Arg, His
  • Aa 10 is Gly, Ala, D-Ala.
  • amino acids are all L-type amino acids.
  • sCT (L) in the formula ( ⁇ ) has the following structural features:
  • Aa 2 is Cys
  • Aa 3 is Val, Gly; Aa 4 is Lys;
  • Aa 5 is Leu, Ala
  • Aa ⁇ is His
  • Aa 7 is Lys
  • Aa 8 is -!eu- Gln-Thr - Tyr-
  • Aa 9 is Arg
  • Aai 0 is Ala, D - Ala.
  • amino acids are all L-type amino acids.
  • the localized PEGylated modification of the linear salmon calcitonin analog of the present invention may also have the structure of formula (II):
  • PEG is RO (CH 2 CH 2 0) n —CH 2 CH 2 —, RH or CH 3 , n-25-2500;
  • Cys is a cysteine and can be located at any one of the linear salmon calcitonin analogs, including the N-terminus, the C-terminus, and any one of the sequences;
  • sCT (L) is a linear salmon calcitonin peptide analog, the definition of which is described in the same formula (I).
  • a PBG modifier having a carboxyl activating group, an aldehyde group, an isocyano group, an isothiocyanato group or the like is covalently bonded to a terminal amino group of sCT (L), a lysine amino group, a histidine or other introduced amino group. reaction.
  • the localized PEGylated modification of the linear salmon calcitonin analog of the present invention may also have the structure of formula ( ⁇ ): Cys-sCT (L) - [CO-X-PEG] z (III) where,
  • Cys is a cysteine and can be located at any one of the linear salmon calcitonin analogs, including the N-terminus, the C-terminus, and any one of the sequences;
  • sCT (L) is a linear salmon calcitonin peptide analog, the definition of which is described in the same formula (I).
  • a PEG modifier having a carboxyl activating group, an amino group or the like is subjected to a covalent bonding reaction with a terminal carboxyl group of sCT (L), an aspartic acid carboxyl group, a glutamic acid carboxyl group or other introduced carboxyl group.
  • the localized PEGylation modification of the linear salmon calcitonin analog of the present invention also includes that any amino acid residue in the linear amino acid sequence can be replaced by a cysteine followed by mPEG-MAL, PEG-VS or PEG. -I0D0 modified compound.
  • linear salmon calcitonin analogs which can be positioned to be PEGylated are preferred:
  • the preparation of the compound of the present invention adopts a conventional polypeptide synthesis method, including a solid phase polypeptide synthesis method, a liquid phase polypeptide synthesis method, and a solid phase-liquid phase polypeptide synthesis method, and the amino acid adopts Fmoc-eight Bu- or Boc-/Bz l-protection strategy.
  • the connection method adopts a method of sequentially connecting from the N-terminus to the C-terminus, or synthesizing the fragment first, and then connecting the fragments.
  • the solid phase synthesis uses various resins which can form an amide end as a carrier (such as MBHA, PAL, Rink amide resin). Etc.), condensation reaction (such as DCC/HOBT, B0P/DIEA, HBTU/HOBt, TBTU, etc.) with various commonly used condensing agents.
  • the peptide is cleaved from the resin with trifluoroacetic acid or anhydrous HF.
  • the ligation of the peptide with the PEG modifier is carried out in an aqueous solution or a phosphate buffered saline solution, and the pH of the reaction solution is appropriately controlled.
  • the modified product is monitored by RP-HPLC and separated and purified, and the final product is assayed for MALDI-T0F-MS.
  • some of the preferred compounds have better activity in the action of reducing blood calcium in animals, and also exhibit long-acting effects in preliminary animal activity studies.
  • the invention further relates to at least one polypeptide modification and/or a stereoisomer thereof or a non-physiologically toxic salt thereof, and a conventional pharmaceutical composition, which comprise an effective amount as a live fraction A pharmaceutical composition of an agent or adjuvant.
  • conventional pharmaceutical excipients or adjuvants include any or all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial or antifungal agents, isotonic and sustained release agents, and similar physiologically compatible preparations, suitable for intravenous injection. , intramuscular, subcutaneous, or other non-digestive administration is preferred. Depending on the mode of administration, the active compound may be coated to protect the compound from the effects of acid or other natural conditions.
  • physiologically toxic salt means a salt which retains the expected physiological activity of the parent compound without causing any unexpected toxic side effects, or a composition containing the same, for example: hydrochloride, hydrobromide salt , sulphate, phosphate, nitrate, and acetate, oxalate, tartrate, succinate, malate, benzoate, pamoate, alginate, methanesulfonate, Tea sulfonate and the like.
  • the cation according to the salt may be: an inorganic salt such as a potassium salt, a lithium salt, a zinc salt, a copper salt, a cerium salt, a cerium salt or a calcium salt, and may also be an organic salt such as a trialkylammonium salt.
  • an inorganic salt such as a potassium salt, a lithium salt, a zinc salt, a copper salt, a cerium salt, a cerium salt or a calcium salt
  • organic salt such as a trialkylammonium salt.
  • the polypeptide modification of the present invention and a stereoisomer thereof or a pharmaceutical composition containing the same may be administered in any manner known, such as oral, intramuscular, subcutaneous, nasal administration, etc., for administration of a pharmaceutical form such as a tablet or a capsule.
  • a pharmaceutical form such as a tablet or a capsule.
  • buccal tablets, chewable tablets, tinctures, suspensions, transdermal agents, micro-emulsions, implants, syrups, and the like It may be a general preparation, a sustained release preparation, a controlled release preparation, and various microparticle delivery systems.
  • various biodegradable or biocompatible carriers well known in the art can be widely used.
  • the carrier examples include, for example, a saline-based solution and various buffered aqueous solutions, ethanol or other polyols, liposomes, polylactic acid, vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and the like.
  • the dosage of the polypeptide modification in the present invention depends on a number of factors, such as the nature and severity of the disease to be prevented or treated, the sex, age, weight, sensitivity and individual response of the patient or animal, the particular compound used, administration Route, number of doses, and desired therapeutic effect.
  • the above dosage can be in single dose form Or divided into several, for example two, three, four dose forms. detailed description
  • the solid phase synthesis carrier MBHA resin and PAM resin used in the examples are products of Tianjin Nankai Synthetic Co., Ltd.; DCC;, H0BT, BOP, DIEA and Fmoc-protected natural amino acids are products of Shanghai Jill Biochemical Co., Ltd. and Suzhou Tianma New Technology Co., Ltd. .
  • Example 1 Synthesis of [D-Ala 1 , Cys 7 (mPEG 5 . . . -MAL), D-Ala 30 ] sCT (Compound 12)
  • Step 1 Solid phase synthesis [D-Ala 1 , Cys 7 , D-Ala 30 ] sCT (Compound 1) 250 mg MBHA resin (0.12ramol) as solid support, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH , Fmoc-D-Ala-OH , Fraoc-Ser (tBu) -OH , Fmoc-Gly-OH , Fmoc-Asn (Trt) -OH , Fraoc-Arg (Pbf) -OH , Fraoc-Tyr (tBu) -OH , Fmoc-Gln (Trt) -OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys (Boc) -OH , Fmoc-Hi s (Trt) -OH , Fmoc-Glu (OtBu) -OH , Fraoc -Va l-OH
  • the peptide was cleaved from the resin by using 10 ml of anhydrous HF as a lysate and reacting at 0 ° C for 1 h.
  • the crude peptide was dissolved in water and lyophilized to give a white dry powder of 400 mg.
  • the crude peptide was purified by RP-HPLC, and the molecular weight was 3415. 52, and the retention time was 11.9 ⁇ .
  • Step 2 Reaction of the polypeptide with the PEG modification
  • the peptide has a molecular weight of 3,287.38 and a retention time of 8.13 min.
  • the PEG-modified product was analyzed by MALDI-TOF-MS, Mn-8465, and the adjacent two peaks had a molecular weight difference of about 44, and had typical structural characteristics of polyethylene glycol.
  • the retention time of RP-HPLC was 13.16 min.
  • Example 3 Synthesis of [Va l 1 , Ala 7 , Cys 16 GnPEG Leak- MAL) , Des-19- 22, Ala 30 ] sCT (Compound 14)
  • the peptide analog had a molecular weight of 2,896.12 and a retention time of 7.87 min.
  • the peptide has a molecular weight of 2,896.30 and a retention time of 8.56 min.
  • Example 5 Synthesis of [Val 1 , Cys 7 (raPEG pass-MAL), Des-19-22, Ala 30 ] sCT (Compound 16)
  • the peptide analog has a molecular weight of 2937.33 and a retention time of 8.87 min.
  • the typical structural characteristics of polydecanediol were RP-HPLC retention time of 11.82 min.
  • Example 6 [Val ⁇ Cys' nPEG Leak-MAL), Des-19, Ala 3 . Synthesis of sCT (Compound 17)
  • the peptide analog had a molecular weight of 3330.8 and a retention time of 10.66 min.
  • the PEG modified product was analyzed by MALDI-TOF-MS, Mn-8476, the molecular weight difference between adjacent two peaks was about 44, and it had typical structural characteristics of polyethylene glycol.
  • the retention time of RP-HPLC was 13.38 min.
  • the peptide analog had a molecular weight of 2938.30 and a retention time of 9.54 min.
  • Example 8 Synthesis of [Val 1 , Cys 7 (mPEG 50 oo-MAL), Gin 11 , Des-19-22, Ala 30 ] sCT (Compound 19)
  • the peptide analog has a molecular weight of 2938.23 and a retention time of 8.95 min.
  • the molecular weight of the peptide analogue was 2937.44, and the retention time was 9.47min.
  • Example 10 Synthesis of [Val 1 , Ala 7 , Cys 19 (mPEG - MAL), Des-20-22, Ala 30 ] sCT (Compound 21)
  • the molecular weight of the peptide analogue was 3008.48, the retention time was 8.77miri.
  • Example 11 Synthesis of [Val 1 , Ala 7 Cys 19 (mPEG 5 - MAL), Des-20-21, Ala 30 ] sCT (Compound 22)
  • the molecular weight of the peptide analogue was 3171.52, and the retention time was 9.46min.
  • Wistar rats Female, 60, weighing (250 ⁇ 280g), 16 weeks old, were randomly divided into 6 groups: ⁇ castration control group (10); castration control group (10); calcitonin group (10, 2 times a week, 0.03 g / kg body weight / time); Compound 12 low dose group (10, 2 times a week, 0.216 g / kg body weight / time); High dose group (10, weekly) Two times, 1.08 ⁇ / kg body weight / time) and high dose group (10 rats, once a week, 1.08 ⁇ ⁇ / kg body weight / time) each group of rats were administered subcutaneously. During the experiment, rats in each group were given free access to standard solid feed and drinking water.
  • rats in the other groups were examined for osteocalcin, serum calcium, and alkaline phosphatase at the 6th week of administration (Table 2); In addition to osteocalcin, serum calcium and alkaline phosphatase (Table 3), rats also measured bone mineral density in the lumbar push, tibia and femur (Table 4).
  • the compound 12 high-dose group maintained a similar effect to the positive control sCT group in the effects of bone metabolism in rats at 6 and 12 weeks of administration.
  • both the compound 12 high-dose group and the positive control sCT improved the lumbar push bone density of the rat, and the PEG-modified high-dose group (administered once a week)
  • the effect of the calcium sCT group (twice a week) on the lumbar push bone density was comparable, showing the long-term efficacy of the PEG modification.

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Description

线性鲑鱼降钙素类似物的
定位聚乙二醇化修饰物 技术领域
本发明涉及线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物 的制备方法，含它们的药物組合物，以及它们在治疗骨质疏松症及 相关骨代谢疾病以及骨痛等疾病的用途。 背景技术
降钙素 （Ca lci tonin ) 是由哺乳动物甲状腺滤泡旁细胞（C 细胞）或鱼和鸟等脊推动物的后腮体分泌的， 一类含有 32个氨基 酸残基的单链多肽类化合物， 是维持体内钙磷代谢的重要激素之 一， 主要作用是抑制骨吸收， 降低血钙水平。 从不同种属的动物 分离到的天然降钙素虽然氨基酸残基的组成有所差别， 但是其分 子中都具有如下的结构特征： N -端 1， 7位半胱氨酸形成的二硫 环结构和 C-末端的脯氨酰胺基团。 天然降钙素中以鱼等脊推动物 所分泌的降钙素活性最强， 哺乳类动物分泌的降钙素活性较弱， 如 鲑 鱼 降 钙 素 （ sCT， 其 一 级 序 列 为 ： H- 环 (Cys'-Ser-Asn-Leu-Ser -Thr-Cys7) -Va l-Leu-Gly-Lysn-Leu-Ser -Gln-Glu-Leu16-Hi s-Lys-Leu-Gln-Thr21-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn26 -Thr-G 1 y-Ser-G 1 y30-Thr 31-Pr o-NH2 )的活性是人降钙素（hCT )的 30倍。 降钙素可有效预防骨质疏松症， 同时又可减轻骨质疏松症 患者的骨痛、 乏力等症状。 目前， sCT、 hCT和鳗鱼降钙素（eCT ) 的合成类似物在临床上主要用于治疗老年性和绝经后妇女的骨质 疏松症、 Paget' s病、 高血钙症及由骨质疏松或骨肿瘤引起的骨 痛等。
-]- sCT由 Sandoz公司开发， 主要用于治疗妇女绝经后骨质疏松 症等， 还适用于雌激素禁忌及男性骨质疏松症患者， 其注射剂 1986 年就已在美国上市， 商品名密钙息 （Miaca l ci c ) ， 常用剂 量 10-20ug/天。 sCT可激活腺苷酸环化酶（cAMP )，研究表明 cAMP 作为破骨细胞内一种重要的笫二 使， 参与对破骨细胞的抑制作 用。 sCT 还可作用于人成骨细胞， 刺激成骨细胞的增殖和分化。 s CT 降低血中钙磷水平主要是通过抑制骨钙向血钙的转化来完成 的， 同时， 其还促进钙磷在尿及胆汁中的排泄， 并抑制消化道对 钙磷离子的吸收。 此外， sCT还可与大脑及下丘脑的降钙素受体 特异性结合， 介导中枢止痛作用。
然而， 天然 sCT易被体内酶水解失活， 作用时间较短， 需经 非胃肠道给药。在溶液中的稳定性及酶稳定性也较差，有人认为， 这可能与二硫环有关。 因此， 临床应用中需要长期频繁注射给药 以达到治疗效果，从而造成患者的用药顺应性差， 治疗质量下降。 并且， 由于降钩素中二硫环的存在， 合成难度较大， 成本增加， 导致药物价格昂贵， 患者难以承受。
实验证明，二硫环对于不同降钙素的活性产生有不同的作用。 sCT 中的二硫环就不是其活性所必需的基团， 其线性类似物， 即 不含 1， 7位二硫环的 sCT类似物， 仍能够保持较好的生物活性。 线性鲑鱼降钙素类似物 (以下以 sCT (L)表示）在合成上的难度会 降低，成本会下降。此外，研究表明，多肽类药物经聚乙二醇（ PEG ) 修饰后仍能保持好的生物活性，并能显著延长生物体内的半衰期。 目前， 已有对 sCT进行 PEG修饰的研究报道， 得到的三个位点的 PEG 修饰产物在肾匀浆中的代谢研究发现， 代谢半衰期远高于 sCT (4. 8分钟）， N端修饰产物为 125. 5min分钟， Lys11的修饰产 物为 157. 3分钟， Lys18的修饰产物为 281. 5分钟（ C Lee等， Pharm. Res. , 1999 , 16: 813-818 )； 此外， 还报道了对 sCT中 Lys18的 ε -氨基进行定位聚乙二醇修饰的文献报道（ YS Youn等， Pharm. Dev. Technol. , 2005 , 10 ( 3 ) : 389 - 396; J Control led Re lease, 2006，— 114 ( 3 ) : 334 342; 2007 , 117 ( 3 ) : 371 - 379 ) 。
因此， 利用 PEG可延长肽类药物作用时间、 提高生物利用度 等特性， 借助反应专一性的化学修饰方法， 可实现对线性 sCT类 似物 （下文中以 sCT ( L )形式来表示）进行精确的单 PEG定位修 饰。 为此， 需要在线性 sCT类似物中含有或重新引入含有特异性 反应功能基的氨基酸残基， 增加反应的专一性。 这些线性 sCT类 似物的制备可用本领域内常规的任何技术来完成， 优选化学合成 的方法。
本发明的目的在于提供一类 PEG修饰的线性 sCT类似物， 有 助于开发长效的骨质疏松症及相关骨病的治疗药物及制剂。 发明内容 本发明中使用的缩写词具有下面的含义：
sCT - 鲑鱼降钙素
PEG - 聚乙二醇
Ala - 丙氨酸 Arg - - 精氨酸
Asn - 天冬酰胺 Cys - - 半胱氨酸
G in - 谷氨酰胺 Glu - - 谷氨酸
Gly - 甘氨酸 Hi s - - 组氨酸
Leu - 亮氨酸 Lys - - 赖氨酸
Pro - 脯氨酸 Ser - - 丝氨酸
Thr - 苏氨酸 Tyr - - 酪氨酸 Val - 缬氨酸
Fmoc - 芴甲氧羰基
DMF - 二甲基甲酰胺
DCC -. 二环己基碳二亚胺
HBTU - 2- ( 1H- 1-羟基苯并三唑） -1， 1， 3, 3-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt - 1 -羟基苯并三唑
TFA - 三氟乙酸
EDT ― 巯基乙醇
RP - HPLC - 反相高效液相色谱
本发明的目的之一是提供线性鮭鱼降钙素类似物的定位聚乙 二醇化修饰物， 该修饰产物的结构为在线性鲑鱼降钙素类似物的 氨基酸序列中改变某些氨基酸残基使侧链只保留一个氨基、 羧基 或巯基， 并在这些氨基、羧基或巯基上完成定位的聚乙二醇修饰。 本发明的线性鲑鱼降钙素类似物的聚乙二醇修饰物详见如下所述 的式（1)、 式 （I I )或式 （I I I ) 结构及其定义。
本发明的另一目的是提供线性鮭鱼降钙素类似物的定位聚乙 二醇化修饰物的制备方法。
本发明还涉及含有至少一种上述线性鲑鱼降钙素类似物的定 位聚乙二醇化修饰物， 或其立体异构体或可药用盐以及可药用载 体或赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及本发明线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇 化修饰物用于制备治疗和预防骨质疏松症、 骨痛等相关骨代谢疾 病或症状的药物的用途。 本发明的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物具 有式（I)结构:
PEG-M-Cys-sCT(L) (I)
其中，
PEG为 RO (CH2CH20) n-CH2CH2 -， =H或 CH3 , n=25-2500;
Figure imgf000006_0001
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N-末端、 C-末端和序列中的任一位点；
sCT(L)为线性鲑鱼降钙素肽类似物， 具有如下的结构特征： Aai-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Aa2-Aa3-Leu-Gly-Aai)-Leu-Ser- Gln-Glu-Aa5-Aa6-Aa7-Aa8-Pro-Aa9-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Aaio- Thr-Pro-NH2
其中，
Aai可选自 Cys, AcmCys , N- a -pro inol-Cys, Ala, D-Ala, Val, Leu, lie, Gly, Ser, Thr, Phe, Met, Tr 的非极性氨基 酸；
Aa2可选自 Cys， AcmCys, Ala, D-Ala, Val, Leu, lie, Gly, Ser, Thr, Phe, Met, Trp的非极性氨基酸， 且人&1和人&2不同时 为 Cys;
Aa3为选自 Val, Gly, Met, Leu, lie, Cys, Ala, D— Ala的 非极性氨基酸；
Aa4为选自 Lys， Cys, Arg, Gin的氣基酸；
Aa5为选自 Leu, Ala, D-Ala, He, Cys, Val, Gly的氨基酸;
Aa6为选自 His, Cys, Lys, Arg的氨基酸；
Aa7为选自 Lys, Arg, Cys, His, Gin的氛基酸； Aa8 i ll -Leu-Gln-Thr-Tyr-, -Gln-Thr-Tyr-, -Thr-Tyr-, -Leu-Gln-Thr-, -Leu-Gln-, -Cys-Tyr-, Leu, Tyr, Ala, D-Ala, Cys;
Aa9可选自 Arg, Lys, His, Cys的氨基酸；
Aa。可选自 Gly, Ala, D-Ala, Cys, Pro, D-Pro的氨基酸。 如未特殊说明， 所缘氨基酸均为 L-型氳基酸。 根据本发明的一个优选实施方式， 式 （I) 中 sCT (L)具有 下的结构特征：
Aa^ Cys, Ala, D-Ala, Val;
Aa2为 Cys， Ala, D-Ala, 且 Aa!和 Aa2不同时为 Cys;
Aa3为 Val, Gly, Ala, D-Ala;
Aa4为 Lys, Arg;
Aa5为 Leu, Ala, D-Ala, Cys;
Aa6为 His, Arg;
Aa7为 Lys, Arg;
Aa8^-Leu-Gln-Thr-Tyr-, - Ala-Gin- Thr- Tyr-;
Aa9为 Arg, His;
Aa10为 Gly, Ala, D - Ala。
如未特殊说明， 所述氨基酸均为 L-型氨基酸。 根据本发明进一步的优选实施方式， 式 （ Γ) 中 sCT (L) 具 有如下的结构特征：
Aa^ D-Ala， Val;
Aa2为 Cys;- ·
Aa3为 Val, Gly; Aa4为 Lys;
Aa5为 Leu, Ala;
Aa^为 His;
Aa7为 Lys;
Aa8为-!eu- Gln-Thr - Tyr-
Aa9为 Arg;
Aai0为 Ala, D - Ala。
如未特殊说明， 所述氨基酸均为 L-型氨基酸。 本发明的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物还 可具有式（II)的结构：
[PEG-X- (CH2) mC0-NH] -Cys-sCT (L) (II)
其中，
PEG为 RO (CH2CH20) n—CH2CH2—， R-H或 CH3 , n-25-2500;
X-0、 NH或 NHCO;
m=0-6;
z=l;
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N-末端、 C-末端和序列中的任一位点；
sCT (L) 为线性鲑鱼降钙素肽类似物， 其定义及其优选实施 方式同式 （I ) 中所述。
具有羧基活化基团、 醛基、 异氰基、 异硫氰基等的 PBG修饰 剂通过与 sCT (L) 的端基氨基、 赖氨酸氨基、 组氨酸或其他引入 的氨基进行共价结合反应。
本发明的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物还 可具有式（ΠΙ)的结构： Cys-sCT (L) - [CO-X-PEG] z (III) 其中，
PEG为 RO (CH2CH20) -CH2CH2一， R=H或 CH3 , n=25-2500;
X-0、 NH或 NHCO;
z=l;
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N-末端、 C-末端和序列中的任一位点；
sCT (L) 为线性鲑鱼降钙素肽类似物， 其定义及其优选实施 方式同式 （I) 中所述。
具有羧基活化基团、 氨基等的 PEG修饰剂通过与 sCT (L)的 端基羧基、 天冬氨酸羧基、 谷氨酸羧基或其他引入的羧基进行共 价结合反应。
本发明的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物还 包括在线性氨基酸序列中的任一氨基酸残基均可被半胱氨酸替换 后经 mPEG-MAL、 PEG-VS或 PEG-I0D0修饰的化合物。
根据本发明， 优选下列可供定位聚乙二醇化的线性鲑鱼降钙 素类似物:
Figure imgf000009_0001
(2) [Val^Cys^Des-l^ Ala3。]sCT;
(3) [Val1, Ala7,Cys16, Ala30 , Des- 19-22] sCT;
(4) [Val1, Ala7, Gin11'18, Cys16, Ala30 , Des-19- 22] sCT;
(5) [Val1, Cys7, Des-19-22, Ala30] sCT;
(6) [Val1, Cys7, Ala30 , Des-19] sCT;
(7) [Val1, Cys7, Gin18, Ala30 , Des-19-22] sCT;
(8) [Val1, Cys7, Gin11, Ala30 , Des-19-22] sCT;
(9) [Val1, Cys7, Gin11'18, Ala30 , Des-19-22] sCT;
(10) [Val^Ala7, Cys' ; A , Des-20-22] sCT; 和
(11) [Val1, Ala7, Cys19, Ala30， Des-20-21] sCT。 根据本发明， 优选下列线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二 醇化修饰物：
1 [D-Ala1,Cys7(mPEG50oo-MAL),D-Ala30]sCT;
2 [ Val1 ,C s7(mPEG50oo-M AL) ,Des-19,AIa30] sCT;
3 [Val1, Ala7, Cys16(mPEG扁 -MAL), Des-19-22, Ala30] sCT;
4 [VaI1,Ala7,Gln11'18,Cys16(mPEG50oo-MAL),Des-19-22,AIa30]sCT;
5 [Val1, Cys7(mPEG5ooo-MAL),Des-19-22, Ala30] sCT;
6 [Val1 ,Cys7 (mPEG5000-M AL)，D es-19， Ala30】 sCT;
7 GIn18,Des-19-22, Ala30] sCT;
8 Gin11 ,Des-19-22, Ala30] sCT;
9
Figure imgf000010_0001
Gln11 18,Des-19-22,Ala30]sCT;
10 [Val1, Ala7, Cys19(mPEG5ooo-MAL), Des-20-22, Ala30] sCT; 和
11 [Val1, Ala7,Cys1!>(mPEG5ooo-MAL), Des-20-21, Ala30] sCT。 本发明化合物的制备采用常规的多肽合成方法， 包括固相多 肽合成方法、液相多肽合成法以及固相-液相多肽合成方法，氨基 酸采用 Fmoc-八 Bu-或 Boc-/Bz l-保护策略，连接方式采用从 N-末 端向 C -末端顺序连接， 或先合成片段， 再将片段连接的方式， 固 相合成采用各种可形成酰胺末端的树脂为载体 （如 MBHA、 PAL, Rink 酰胺树脂等） ， 以各种常用缩合剂进行缩合反应 （如 DCC/HOBT, B0P/DIEA、 HBTU/HOBt , TBTU 等） , 反应完后以三氟 醋酸或无水 HF将肽从树脂上切割,下来。肽与 PEG修饰剂的连接在 水溶液或磷酸緩冲盐溶液中进行，适当控制反应溶液的 pH值， 以 RP - HPLC对修饰产物进行监测，并分离纯化，最终产物测定 MALDI - T0F - MS。
根据本发明， 部分优选化合物在动物降血钙作用中有较好活 性结果， 同时在初步动物体内活性研究中也表现出长效性。
本发明还涉及含有作为活 ¾A分的有效剂量的至少一种多肽 修饰物和 /或其立体异构体或其无生理毒性盐以及常规药物赋形 剂或辅剂的药物组合物。 这里 "常规药物赋形剂或辅剂" 包括任 一种或所有溶剂， 分散介质， 包衣， 抗菌剂或抗真菌剂， 等渗及 緩释试剂， 以及类似的生理配伍制剂， 以适合静脉注射， 肌肉注 射， 皮下注射， 或其它非消化道给药方式为佳。 根据给药的方式， 可将活性化合物包衣以保护化合物免受酸或其它自然条件的影响 而失活。
本发明所用术语 "无生理毒性的盐" 是指可保留母体化合物 预期生理活性而不会产生任何意料之外毒副作用的盐， 或者含它 们的组合物， 例如： 盐酸盐， 氢溴酸盐， 硫酸盐， 磷酸盐， 硝酸 盐， 以及醋酸盐， 草酸盐， 酒石酸盐， 琥珀酸盐， 苹果酸盐， 苯 甲酸盐， 双羟萘酸盐， 海藻酸盐， 甲磺酸盐， 茶磺酸盐等。 根据 盐中含有的阳离子又可为： 钾盐， 锂盐， 锌盐， 铜盐， 钡盐， 铋 盐， 钙盐等无机盐， 还可为诸如三烷基铵盐等有机盐。
本发明中多肽修饰物及其立体异构体或含有它的药物组合物 可以以已知的任何方式给药， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔给药等， 给药剂型例如片剂、 胶嚢、 口含片、 咀嚼片、 酏剂、 混悬剂、 透 皮剂、 微嚢包埋剂、 埋植剂、 糖浆剂等。 可以是普通制剂、 緩释 制剂、 控释制剂及各种微粒给药系统。 为了将单位给药剂型制成 片剂， 可以广泛使用本领域公知的各种生物可降解的或生物相容 载体。 关于载体的例子， 如盐水基及各种緩冲水溶液、 乙醇或其 它多元醇、 脂质体、 聚乳酸、 乙酸乙烯酯、 聚酐、 聚羟乙酸、 胶 原、 聚原酸酯等。
本发明中多肽修饰物的给药剂量取决于许多因素， 例如所要 预防或治疗疾病的性质和严重程度， 患者或动物的性别、 年龄、 体重， 敏感性及个体反应， 所用的具体化合物， 给药途径， 给药 次数以及所希望达到的治疗效果等。 上述剂量可以单一剂量形式 或分成几个， 例如二、 三、 四个剂量形式给药。 具体实施方式
下面的实例及生物活性实验用来进一步说明本发明， 但这并 不意味着.对本发明的任何限制。
实施例所用固相合成载体 MBHA树脂以及 PAM树脂为天津南开 合成责任有限公司产品； DCC；、 H0BT、 BOP, DIEA以及 Fmoc -保护 的天然氨基酸由上海吉尔生化公司以及苏州天马新技术有限责任 公司产品。 实施例 1 [D- Ala1, Cys7 (mPEG5。。。-MAL)， D-Ala30] sCT (化合物 12 ) 的合成
步骤 1： 固相法合成 [D-Ala1, Cys7, D-Ala30] sCT (化合物 1 ) 以 250mg MBHA树脂（ 0. 12ramol )为固相载体，以 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH , Fmoc-D-Ala-OH , Fraoc-Ser (tBu) -OH , Fmoc-Gly-OH , Fmoc-Asn (Trt) -OH ， Fraoc-Arg (Pbf) -OH , Fraoc-Tyr (tBu) -OH ， Fmoc-Gln (Trt) -OH ， Fmoc-Leu-OH ， Fmoc-Lys (Boc) -OH , Fmoc-Hi s (Trt) -OH , Fmoc-Glu (OtBu) -OH , Fraoc-Va l-OH, Fmoc- Cys (Tr t) -OH为原料， DCC- HOBt为缩合剂， 根据线性 sCT的氨基酸序列，按标准的 Fmoc固相多肽合成方法合 成肽树脂。 以 10ml无水 HF作裂解液， 0°C反应 lh， 将肽从树脂 上裂解下来。 粗肽溶于水中， 冰冻干燥， 得白色干粉 400mg。 粗 肽经 RP- HPLC纯化， 生物质谱测定分子量为 3415. 52， 保留时间 为 11. 9ηύη。
步糠 2: 多肽与 PEG修饰物的反应
将经 RP-HPLC纯化后的 [D-Ala1, Cys7, D-Ala30] sCT溶于水中， 以磷酸盐緩冲液调 pH7- 8， 加入适量的 mPEG5。。。- MAL， 室温反应， 用 RP-HPLC监测反应进程和分离产物。经 MALDI- T0F-MS分析， Mn = 8550, 相邻两峰分子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特 征， RP-HPLC保留时间 13. 65min。 实施例 2 [Va l^ Cys GnPEGs剛- MAL) , Des-19, Ala30] sCT (化合 物 13)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 3287. 38， 保留时间为 8. 13min。 PEG修饰 产物为经 MALDI-TOF- MS分析， Mn - 8465，相邻两峰分子量相差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 13. 16min。 实施例 3 [Va l1, Ala7, Cys16 GnPEG漏- MAL) ， Des-19- 22, Ala30] sCT (化合物 14)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 2896. 12， 保留时间为 7. 87min。 PEG修饰 产物为经 MALDI-TOF- MS分析， Mn = 8292，相邻两峰分子量相差约 44 ,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP- HPLC保留时间 13. 01min。 实施例 4
[Val1, Ala7, Gin11'18, Cys16 (mPEG5。。。-MAL) ， Des-19-22, Ala30] sCT (化合 物 15)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 2896. 30， 保留时间为 8. 56min。 PEG修饰 产物为经 MALDI-T0F-MS分析， Mn = 8295 ,相邻两峰分子量相差约 44 ,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 13. 26min0 实施例 5 [Val1, Cys7(raPEG通 -MAL),Des-19-22, Ala30] sCT (化合物 16)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 2937.33， 保留时间为 8.87min。 PEG修饰 产物为经 MALDI- T0F-MS分析， Mn = 7907,相邻两峰分子量相差约 44,具有聚 ώ二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 11.82min。 实施例 6 [Val^Cys' nPEG漏 -MAL),Des-19, Ala3。〗sCT (化合物 17)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 3330.8, 保留时间为 10.66min。 PEG修饰 产物为经 MALDI- T0F-MS分析， Mn- 8476,相邻两峰分子量相差约 44,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 13.38min。 实施例 7 [Val1, Cys7(raPEG50oo-MAL), Gin18, Des- 19-22， Ala30] sCT (化合物 18)的合成
合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 2938.30， 保留时间为 9.54min。 PEG修饰 产物为经 MALDI- TOF- MS分析， Mn= 8033，相邻两峰分子量相差约 44，具有聚乙二醇的典型结构特征， RP- HPLC保留时间 11.10rain。 实施例 8 [Val1, Cys7(mPEG50oo-MAL), Gin11 , Des- 19-22， Ala30] sCT (化合物 19)的合成
· 合成方法同实施例 1。
肽类似物分子量为 2938.23， 保留时间为 8.95min。 PEG修饰 产物为经 MALDI-TOF- MS分析， Mn= 7899,相邻两峰分子量相差约 44,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 13.43min
实施例 9 [Val1,Cys7(mPEG50oo-MAL), Gin11'18, Des-19-22, Ala30] sCT (化合物 20)的合成
合成方法同实施例 1
肽类似物分子量为 2937.44， 保留时间为 9.47min PEG修饰 产物为经 MALDI- T0F-MS分析， Mn= 8336，相邻两峰分子量相差约 44,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP- HPLC保留时间 13.69min 实施例 10 [Val1, Ala7, Cys19(mPEG - MAL)， Des-20-22, Ala30] sCT (化合物 21)的合成
合成方法同实施例 1
肽类似物分子量为 3008.48， 保留时间为 8.77miri PEG修饰 产物为经 MALDI- T0F-MS分析， Mn= 8055,相邻两峰分子量相差约 44,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP- HPLC保留时间 I3.36min 实施例 11 [Val1, Ala7 Cys19(mPEG5 - MAL)， Des-20-21, Ala30] sCT (化合物 22)的合成
合成方法同实施例 1
肽类似物分子量为 3171.52， 保留时间为 9.46min PEG修饰 产物为经 MALDI- TOF- MS分析， Mn= 8296，相邻两峰分子量相差约 44,具有聚乙二醇的典型结构特征， RP- HPLC保留时间 1 53min 实施例 12 降钙活性评价
对线性鲑鱼降 素类似物及其 PEG修饰物釆用大鼠腹部皮下 注射给药测定降钩活性， 具体实施方法按文献方法进行（参见钱 德明， 沈根全， 柯若伦； 用大鼠将血钙法测定降钩素生物效价的 探讨， 药物分析杂志， 1994 14 ( 3 ) ： 30-34 )
活性测定结果， 鲑鱼降钙素文献参考值 4500 IU/mg
Figure imgf000016_0001
表中化合物 1-11分别为实施例 1-11中未经聚乙二醇化修饰 的线性鲑鱼降钙素类似物。
从表 1可以看出， 线性鲑鱼降甸素类似物及其 PEG修饰物均 具有有效的降钙活性 实施例 13 PEG修饰的线性 sCT类似物的长效研究。
以表 1中化合物 12为例。
Wistar大鼠， 雌性， 60只， 体重（ 250 ~ 280g ) ， 16周龄， 随机分为 6组： ^^去势对照组（ 10只） ； 去势对照组（ 10只） ； 降钙素組（10只，每周 2次， 0.03 g /kg体重 /次） ； 化合物 12 低剂量组 （10只，每周 2次， 0.216 g /kg体重 /次） ； 高剂量组 (10只，每周 2次， 1.08μ§ /kg体重 /次） 和高剂量组（10只，每 周 1次， 1.08μ§ /kg体重 /次）各组大鼠均采取皮下给药。 实验 期间，各组大鼠自由摄食标准固体饲料和饮水。 除化合物 12每周 给药一次高剂量组外， 其它组大鼠分别于给药第 6周眼眶取血检 测骨钙素、 血清钙和碱性磷酸酶（表 2)； 给药 12周末各組大鼠 除检测骨钙素、 血清钙和碱性磷酸酶（表 3) 外， 还检测腰推、 胫骨和股骨的骨密度（表 4) 。
表 2. 降钙素及同系物给药 6周对大鼠骨代谢的影响
剂量 碱性磷酸酶 血清钙 骨钙素 组 别
(μ g/kg) (u/100ral) (mg/100ml) (ng/100ml) 假手术組 ― 160.3 ±19.0 10.7 ± 0· 3 3.63 ± 0.51 模型組 206.0 ±25.2## 10.4 ± 0.2 4.16 ± 0.25# 降钙素組 179.8 ± 31.4* 9.3 ± 0.2** 3.90±1.1* 化合物 12低 0.216 187.0 ±30· 4 9.8 ± 0.3** 3.77 ± 0.25* 剂量組
化合物 12高 1.08 180.0± 19.4* 9.2 ± 0.2** 3.81 ± 0.24* 剂量组
注： 每周皮下注射 2次； n=10; # p<0.05, ## p<0.01与 _手术组比较； * p<0.05, **p<0.01与模型组比较 表 3. 降钙素及同系物给药 12周对大鼠骨代谢的影响 組.另 ij 剂量（μ 碱性磷酸酶 血清 4丐 骨钙素 g/kg) (u/100ml) (mg/100ml) (ng/100ml) 假手术组 ― 161.4±33.4 10.7±0.3 3.33 + 0.45 模型組 215.6 ±28.2## 10.6 ±0.4 4.10 ± 0.43# 降钙素组 0.036 200.9 ±40.1 9.3 ± 0.2** 3.38 ± 0.17** 化合物 12低剂量組 0.216 202.4 ±44.8 9.8 ± 0.3* 4.01士 0.25 化合物 12高剂量组 1.08 188.2 ± 51.2 9.4 ± 0.4** 3.95士 0.24 注： 每周皮下注射 2次； n=10; # p<0.05, ## p<0.01与假手术组比较； * ρ<0.05, **ρ<0.01与模型组比较
表 4. 降钙素及同系物给药 12周对大鼠骨密度的影响
剂量（μ 腰推 股骨 胫骨 组别
g/kg) ( g/cra2) ( g/cra2 ) ( g/cm2 ) 假手术组 0.189±0.015 0.264 ±0.003 0.256士 0.014 模型组 0.168 ±0.0麵 0.226 ±0.013## 0.242 ±0.022
1^4弓素组 (2次 /周） 0.036 0.181 ±0.013* 0.242 ±0.027 0.247 ±0.127
101低剂量组 (2次 /周） 0.216 0.175 ϊθ.021 0.240±0.028 0.245 ±0.014 化合物 12高剂量组 (2次 /周） 1.08 0.181 ± 0.018* 0.241 ±0.017 0.256 ±0.017 化合物 12高剂量组 (1次 /周） 1.08 0.182 ±0.014* 0.237 ±0.0.022 0.251 ±0.015 注： n=10; ## p<0.01与 足手术組比较； * p<0.05与模型组比较
从表 2、 3、 4中可以看出， 化合物 12高剂量組在给药 6周和 12周对大鼠骨代谢影响实验中基本保持了与阳性对照 sCT組相当的作 用。在为期 12周的对大鼠骨密度影响实验中， 化合物 12高剂量 组和阳性对照 sCT都提嵩了大鼠腰推骨密度， 此外 PEG修饰物高 剂量组 （每周给药一次） 与降钙素 sCT组 （每周给药两次）对腰 推骨密度的影响基本相当， 显示了 PEG修饰物的长效性。

Claims

权利要求
1. 线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可药 用盐， 其中聚乙二醇可在线性鲑鱼降钙素 [sCT (L) ]中的任意一个 位点进行.修饰， 包括 N末端、 C末端及序列中的任意一个位点。
2. 权利要求 1所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇 化修饰物或其可药用盐， 其中所述的聚乙二醇修饰为单聚乙二醇 修饰„
3. 权利要求 1 - 2 任意一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物的 定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其中聚乙二醇的分子量范 围为 2， 000 - 100, 000。
4. 权利要求 3所述的所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚 乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其中聚乙二醇的分子量范围为 5， 000 - 60, 000。
5. 权利要求 1 - 2 任意一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物的 定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其具有式 （I ) 的结构：
PEG-M-Cys-sCT (L)
其中,
PEG为 RO (CH2CH20) n-CH2CH2-, R=H或 CH3， n=25 - 2500;
Figure imgf000019_0001
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N-末端、 C-末端和序列中的任一位点；
sCT (L) 为线性鲑鱼降钙素肽类似物。 6. 权利要求 5所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇 化修饰物或其可药用盐， 其中式 （I ) 中 sCT (L) 具有如下的结 构特征：
Aai-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Aa2-Aa3-Leu-Gly-Aa4-Leu-Ser- Gln-Glu-Aa5-Aa6-Aa7-Aa8-Pro-Aa9-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Aaio- Thr-Pro-NH2
其中，
Aa!为选自 Cys， AcmCys, N- a -pro inol-Cys, Ala, D-Ala, Val, Leu, lie, Gly, Ser, Thr, Phe, Met, Tr 的非极性氨基 酸；
Aa2为选自 Cys, AcmCys, Ala, D-Ala, Val, Leu, He, Gly,
Ser, Thr, Phe, Met, Trp的非极性氨基酸， 且人&1和人&2不同时 为 Cys;
Aa3为选自 Val, Gly, Met, Leu, lie, Cys, Ala, D-Ala的 非极性氨基酸；
Aa4为选自 Lys， Cys, Arg, Gin的氨基酸；
Aa5为选自 Leu, Ala, D-Ala, He, Cys, Val, Gly的氨基酸； Aa6为选自 His， Cys, Lys, Arg的氨基酸；
Aa7为选自 Lys， Arg, Cys, His, Gin的氣基酸；
Aa8选自- Leu - Gln-Thr-Tyr -， -Gln-Thr-Tyr-5 -Thr-Tyr-, -Leu-Gln-Thr-, -Leu-Gin-, -Cys-Tyr-, Leu, Tyr, Ala, D-Ala, Cys; Aa9为选自 Arg， Lys, His, Cys的氯基酸；
Aa。为选自 Gly， Ala, D-Ala, Cys, Pro, D— Pro的氨基酸， 如未特殊说明， 均为 L-型氨基酸。
7. 权利要求 6所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇 化修饰物或其可药用盐， 其中，
Aa^ Cys, Ala, D-Ala, Val;
Aa2为 Cys， Ala, D-Ala, 且 Aa和 Aa2不同时为 Cys;
Aa3为 Val, Gly, Ala, D-Ala;
Aa4为 Lys, Arg;
Aa5为 Leu, Ala, D-Ala, Cys;
Aa6为 His, Arg;
Aa为 Lys, Arg;
Aa8 ^ -Leu-Gln-Thr-Tyr-, -Ala-Gln-Thr-Tyr-;
Aa9为 Arg, His;
Aaio为 Gly, Ala, D-Ala,
如未特殊说明， 均为 L-型氨基酸。
8. 权利要求 7所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇 化修饰物或其可药用盐， 其中：
Figure imgf000021_0001
Aa2为 Cys;
Aa3为 Val, Gly;
Aao为 Lys;
Aa5为 Leu, Ala;
Aa6 His; Aa7为 Lys ;
Aa8 ^ -Leu-G ln-Thr-Tyr-;
Aa9为 Arg;
Aai。为 Al a , D-Al a,
如未特殊说明， 均为 L-型氨基酸。
9. 权利要求 1-8任一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位 聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其选自：
( I ) [D-Ala,,Cys7(mPEG5ooo-MAL),D-Ala30]sCT;
( 2 ) [Val1, Cys 7(mPEG50oo-MAL) ,Des-19,AIa30] sCT;
( 3 ) [Val1, Ala7, Cys16(mPEG50oo- AL), Des-19-22, Ala30] sCT;
( 4 ) [ValI,Ala7,Gln11 18,Cys16(mPEGsooo-MAL),Des-19-22,Ala30]sCT;
( 5 ) [Val1, Cys7(mPEG50oo-MAL),Des-19-22, Ala30] sCT;
( 6 ) [Val1,Cys7(mPEG5ooo-MAL),Des-19,Ala30]sCT;
( 7 ) [Val1 ,Cys7(mPEG5ooo-M AL), Gin18, Des-19-22, Ala30] sCT;
( 8 ) [Val1 ,Cy s7(mPEG5ooo-M AL), Gin" ,Des-19-22, Ala30] sCT;
( 9 )
Figure imgf000022_0001
Gln11 18，Des-19-22，Ala30]sCT;
( 10 ) [Val1, Ala7 , Cys19(mPEGSOoo-MAL), Des-20-22, Ala30] sCT; 和
( I I ) [Val1, Ala7,Cys19(mPEG50oo-MAL), Des-20-21, Ala30] sCT。
10. 线性鮭鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可 药用盐， 其具有式 （Π) 的结构：
[PEG-X- (CH2) O-NH] -Cys-sCT (L) ( Π ) 其中，
PEG为 R0 (CH2CH20) n-CH2CH2— , R=H或 CH3， n=25-2500; X=0、 NH或 NHCO;
m=0-6 ; z=l ;
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N -末端、 C -末端和序列中的任一位点； sCT (L) 为线性鲑鱼降钙素肽类似物
11. 线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可 药用盐， 其具有式 （ΙΠ) 的结构:
Cys-sCT (L) - [CO-X-PEG] z (III)
其中， .
PEG为 RO (CH2CH20) n— CH2CH2 -， R-H或 CH3 , n=25 - 2500;
X=0、 NH或 NHCO;
z=l;
Cys 为半胱氨酸， 可位于线性鲑鱼降钙素类似物的任意一个 位点， 包括 N-末端、 C-末端和序列中的任一位点；
sCT (L) 为线性鲑鱼降钙素肽类似物。
12. 权利要求 10或 11所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定位聚 乙二醇化修饰物或其可药用盐, 其中的 sCT (L) 如权利要求 6-8 任一项所定义。
13. 线性鲑鱼降钙素类似物或其药用盐， 其选自：
(1) [D-Ala ,Cys ,D-Ala ]sCT;
(2) [Val l，Cys7,Des-19, Ala3。]sCT;
( 3) [Val , Ala7, Cys16, Ala30 , Des - 19-22] sCT;
(4) [Val , Ala7, Gin11'18, Cys", Ala30 , Des - 19— 22】 sCT;
( 5) [Val ， Cys7, Des-19-22,Ala30]sCT;
(6) [Val Cys7, Ala30 ,Des-19]sCT;
(7) [Val ,Cys7, Gin18, Ala30 , Des-19-22] sCT;
(8) [Val , Cys7, Gin11, Ala30 , Des-19-22] sCT;
(9) [Val , Cys7, Gin11'18, Ala30 , Des-19-22] sCT;
( 10) [Val ,Ala', Cys19, Ala30 , Des-20-22] sCT; 和
(11) [Val ， Ala7, Cys19, Ala30 , Des-20— 21] sCT。
14. 权利要求 1-13任一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物或其 定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其中所述的线性鲑鱼降钙 素类似物的部分氨基酸可缺失。
15. 权利要求 1-13任一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物或其 定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 其中线性氨基酸序列中的 任一氨基酸残基可被半胱氨酸替换。
16. 药物组合物， 其中含有权利要求 1-15任一项所述的线性 鲑鱼降钙素类似物或其定位聚乙二醇化修饰物， 或它们的可药用 盐， 以及可药用载体或赋形剂。
17. 权利要求 1-15任一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物的定 位聚乙二醇化修饰物， 或它们的可药用盐用于制备治疗或预防与 骨代谢相关的疾病和症状的药物的应用。
18. 权利要求 17所述的应用， 其中与骨代谢相关的疾病为老 年性和绝经后妇女的骨质疏松症、 Paget/ s 病、 高血钙症， 或由 骨质疏松或骨肿瘤引起的骨痛。
19. 权利要求 13-15任一项所述的线性鲑鱼降钙素类似物，或 它们的可药用盐用于制备治疗或预防与骨代谢相关的疾病和症状 的药物的应用。
20. 权利要求 19所述的应用， 其中与骨代谢相关的疾病为老 年性和绝经后妇女的骨质疏松症、 Paget' s 病、 高血钙症， .或由 骨质疏松或骨肿瘤引起的骨痛。
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