CN102911266A - 新型鲑鱼降钙素类似物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的鲑鱼降钙素的类似物及其制备方法，与天然鲑鱼降钙素相比，本发明的化合物的化学稳定性得以提高，同时保留了天然鲑鱼降钙素的药理活性。本发明的鲑鱼降钙素类似物具有如下化学结构：

Description

新型鲑鱼降钙素类似物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及鲑鱼降钙素的类似物及其制备方法。

背景技术

天然降钙素是由哺乳动物的甲状旁腺细胞或脊椎动物的后腮所分泌的一种生物活性多肽，是生物体内钙代谢的主要调节因子。其中鲑鱼降钙素(Calcitonin(Salmon))具有显著的疗效，已经作为治疗骨质疏松等代谢骨病的防治药在临床广泛使用。

天然降钙素都具有酰胺化的羧基末端，第1位和第7位的半胱氨酸残基之间具有分子内二硫键。天然鲑鱼降钙素的化学结构为：

天然降钙素在体内代谢稳定性较差，鲑鱼降钙素肌内或皮下注射后，半衰期70～90分钟，需要每日注射，给患者的治疗带来不便和痛苦。

为了使降钙素更好的用于临床，客观上需要一种能够延长半衰期，同时疗效不低于原有降钙素活性的降钙素类似物。

发明内容

本发明的目的是提供一种鲑鱼降钙素的类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁、R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R₁、R₂优选烷基，更优选C₁-C₄的烷基，最优选甲基；

R₃选自烷基、烯基、炔基、[R₁’-K-R₁’]_n；

所述的R₁’选自烷基、炔基(烯基)或炔基；

所述的K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂、CONR₂’、或

所述的R₂’是H或烷基；

n是2-7的整数。

R₃优选烯基。

本发明鲑鱼降钙素的类似物优选具有下列结构的化合物：

其中每个R₁、R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；优选烷基，更优选C₁-C₄的烷基，最优选甲基；

n选自2-7的整数，优选n是3-6。

本发明鲑鱼降钙素的类似物更优选具有下列结构的化合物：

本发明的鲑鱼降钙素类似物具有天然的多肽二级结构，α螺旋程度增加，使其更接近于鲑鱼降钙素的四级结构特点，更容易与靶位相结合，降低了在体内被降解的可能。与天然鲑鱼降钙素序列相比，本发明的多肽化合物的化学稳定性得以提高。而且本发明的多肽化合物保留了天然鲑鱼降钙素的药理活性。

本发明鲑鱼降钙素类似物尤其优选分别以具有光学活性的(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸(即图1中的S₅)取代序列中的天然氨基酸，所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的多肽化合物。

所述的取代基以Fmoc进行保护，参与多肽的合成，所述的Fmoc-(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸具有如下结构：

本发明的另一方面提供了制备上述鲑鱼降钙素类似物的方法。可以采用本领域技术人员熟知的方法，选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质：

所述的合成方法包括：例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备，优选SPPS。所述的固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等，例如：王氏树脂(Wang Resin)，Fmoc-Rinke Amide MBHA树脂等，优选Fmoc-RinkeAmide MBHA树脂。本发明化合物的环状结构是通过催化环合的方式制备的，所述的催化剂可以是：钌催化剂，优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs 1^st)，或Grubbs 2^st。

本发明另一方面提供了包括上述鲑鱼降钙素类似物的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体，所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备，例如与常规的药用辅料进行混合，制备成注射剂、注射液，或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等，或具有缓释效果的制剂，例如微球、脂质体等。

本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等；还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。

本发明还提供了所述的鲑鱼降钙素类似物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，所述的疾病包括骨代谢和/或钙代谢障碍、骨痛及相关疾病的药物中的应用，如骨折、骨质疏松、骨关节炎、强直性脊柱炎、风湿性关节炎，佩吉特病(Paget’s disease)；高钙血症；甲状旁腺功能亢进等。

发明人发现，本发明的鲑鱼降钙素类似物具有与天然鲑鱼降钙素等同的生物活性，且具有比天然鲑鱼降钙素更好的稳定性。

附图说明

图1是本发明优选的鲑鱼降钙素类似物的制备流程，其中S₅是(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯基

具体实施例

以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可从相关公司购买获得，未注明具体条件的试验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。

实施例1 鲑鱼降钙素类似物的制备

按照固相合成的常规方法，将带保护基的氨基酸逐一接在树脂上，然后用催化剂催化环合，接着脱去保护基并将多肽从树脂上切下，制备如下式的优选鲑鱼降钙素类似物：

1、固相合成

选择0.402g Fmoc-Rinke Amide MBHA树脂(取代度：0.373mmol/g)制备，在室温条件下用DMF浸泡树脂60min，将带有Fmoc保护的氨基酸按照顺序排列在合成仪中进行活化连接，获得如图1中化合物2的产物，结构为：

2、催化环合

将上述步骤所得的化合物依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次，然后用DCE(8ml)浸泡30min，接着将Grubbs 1^st(25mg x 2，20mg/0.1mmol)加入反应混合物中，室温振摇3小时。用MS检测环化情况，如果环化不完全，重复该步骤，通常重复2次，获得目标多肽化合物(0.894g)。

3、切除树脂

将步骤3获得的反应混合物放在E溶液(10ml)中，氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤，去除滤液，滤饼用TFA(4ml)冲洗，接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀，离心；得到的滤饼用冷的乙醚(100ml)冲洗两次，真空干燥。

将获得的产物溶解于乙腈水(1mg/ml)，氨水调节PH至8，，空气氧化24小时，获得本发明的多肽化合物421mg，产率81.5％，MW＝3444.1

4、纯化

将上述粗品用HPLC进行纯化，获得纯度95％以上的纯品15mg。

实施例2 鲑鱼降钙素类似物(由实施例1的方法制得)降低血钙的药效实验

取健康Wistar大鼠30只(雌性)，体重200±15g，实验前禁食16小时，随机分为3组，空白组、鲑鱼降钙素组和鲑鱼降钙素类似物组各10只。腹部皮下注射给药，空白对照组注射生理盐水，鲑鱼降钙素组和鲑鱼降钙素类似物组的给药剂量为0.05μg/kg。分别在给药前和给要后的1、2、4、8、12小时，眼眶取血，以邻甲酚酞络合剂测定样品中的血钙值。按照：

(空白组血钙值-给药组血钙值)/空白组血钙值的计算方法计算降低血钙的水平。结果显示(表1)，本发明的鲑鱼降钙素仍然具有良好的降血钙活性，且延长了降低血钙的作用时间。

表1 鲑鱼降钙素和鲑鱼降钙素类似物降低大鼠血钙的试验比较

Claims (10)

1.一种鲑鱼降钙素类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁、R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；

R₃独立的选自烷基、烯基、炔基、[R₁’-K-R₁’]_n；

所述的R₁’选自烷基、炔基(烯基)或炔基；

所述的K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂、CONR₂’、或

所述的R₂’是H或烷基；

n是2-7的整数。

2.如权利要求1所述的鲑鱼降钙素类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁、R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；

n是2-7的整数。

3.如权利要求2所述的鲑鱼降钙素类似物，其化学结构式如下：

4.一种制备权利要求3所述鲑鱼降钙素类似物的方法，其特征在于：

(1)制备具有下述结构的物质

(2)通过催化剂处理步骤(1)的化合物，使其环合。

5.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(1)通过固相合成技术制备。

6.如权利要求5的方法，其特征在于，步骤(1)采用Fmoc保护的固相合成技术。

7.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(2)的催化剂是钌催化剂。

8.如权利要求7的方法，其特征在于，所述的钌催化剂是Grubbs 1^st。

9.权利要求1-3任一项的鲑鱼降钙素类似物在制备治疗骨代谢和/或该代谢障碍、骨痛及相关疾病的药物中的应用。

10.一种由权利要求1-3任一项的鲑鱼降钙素类似物和一种或多种药用载体组成的药物组合物。