CN116789744A - 一类阿片/神经肽ff受体多靶点分子dn-9的订书肽类似物及其制备和应用 - Google Patents

一类阿片/神经肽ff受体多靶点分子dn-9的订书肽类似物及其制备和应用 Download PDF

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方泉
张梦娜
许彪
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Abstract

本发明设计了一类新型的针对阿片和神经肽FF受体的多靶点肽类分子DN‑9的订书肽类似物，即以DN‑9为化学模板引入两个含有α‑烯基的非天然氨基酸，并通过烯烃复分解反应获得一系列碳碳双键成环的环化类似物。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)与已报道的DN‑9相比，订书肽类似物在体内的镇痛活性有所加强，可产生比母体更高效的镇痛活性；(2)与已报道的二硫键和酰胺键环化的DN‑9类似物相比，其皮下镇痛强度和作用时间均有明显提升；(3)DN‑9的订书肽类似物能产生无耐受镇痛，其便秘和成瘾等阿片样副作用显著降低，相比于母体DN‑9以及二硫键环化的DN‑9类似物，其安全窗口更大。因此，该类DN‑9的订书肽类似物在制备高效、低副作用的镇痛药物方面具有较高的应用价值。

Description

一类阿片/神经肽FF受体多靶点分子DN-9的订书肽类似物及 其制备和应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一类针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽及其制备和用途。
背景技术
疼痛是临床患者最常见的症状之一，现阶段药物治疗是疼痛最有效的治疗手段。吗啡和芬太尼等传统的阿片类镇痛药主要是Mu-阿片受体激动剂，可有效缓解中/重度疼痛，用于临床镇痛的一线治疗。然而，传统阿片类药物除了会引起呼吸抑制和便秘等不良反应外，其长期使用还会产生镇痛耐受、成瘾等副作用，严重限制了其临床应用范围。因此，开发高效、低副作用的新型镇痛药是当前亟待解决的重要科学问题。
近年来，除了发展非阿片靶点的镇痛新药外，研究人员主要是利用多靶点药物、外周限制性分子、G蛋白偏向性阿片激动剂等药物设计新策略来开发新型的阿片类镇痛新药，能有效降低传统阿片类药物的副作用，在高效、低副作用的镇痛新药研发中具有潜在的应用前景。例如，阿片/孤啡肽受体的多靶点分子BU08028和AT-121在猕猴的实验显示：该类多靶点分子在介导高效镇痛的同时，其成瘾、耐受、呼吸抑制等副作用均大幅降低；外周限制性的Kappa阿片受体(KOR)激动剂地非法林(CR845)已于2021年8月作为止痒药被FDA批准上市，同时还作为镇痛药正在开展临床III期试验；Trevena公司开发的G蛋白偏向性阿片受体激动剂奥利替丁(TPV130)已于2020年8月被美国FDA批准上市。此外，非阿片类生长抑素受体SSTR4的激动剂CNTX-0290以及靶向Nav1.7、Nav1.8以及Nav1.9开发的镇痛药在治疗疼痛方面也取得了重要的进展。
神经肽FF(NPFF)是Yang等人在牛脑中发现的一种内源性的阿片调节肽，对阿片镇痛、耐受、成瘾、心血管、焦虑和胃肠道方面具有重要的调节作用(Neuropeptides.2008,42:1-18；ProcNatlAcadSci USA.1985,82:7757-7761)。专利201610252648.7中公开了一种靶向阿片和NPFF受体的全新嵌合肽DN-9(Tyr-D-Ala-Gly-NMe-Phe-Gly-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2)，中枢和外周给药后在不同的痛模型中均可以产生强于吗啡的无耐受镇痛作用，并且其便秘和成瘾等阿片样副作用明显降低(J Med Chem.2016,59:10198-10208；JPain.2020,21:477-493；Br J Pharmacol.2020,177:93-109)。专利201810932993.4和专利2202110272260.4分别公开了一种靶向阿片和NPFF受体的二硫键和酰胺键成环的环化类似物，中枢和外周给药后在不同的痛模型中均可以产生强于吗啡的无耐受镇痛作用，在不同模型痛中口服给药之后同样可以产生很强的镇痛作用，并且其便秘、成瘾和呼吸抑制等阿片样副作用明显降低(ACS Chem Neurosci.2022,13:3078-3092；J Med Chem.2021,64:13394-13409.)
针对多肽分子成药性的问题，目前已经开发了多种肽类药物修饰策略，Nα-甲基化氨基酸、D-构型氨基酸等非天然氨基酸的替换修饰、脂质化、糖基化、聚乙二醇化和环化修饰等。已有的研究表明多肽环化修饰策略能有效提高其半衰期和酶解稳定性。特别是环化修饰广泛应用于多肽新药研发中，2022年中科院上海药物研究所陈士羽课题组在RCSBiology Review杂志上对近二十年内典型的环肽药物做了总结和介绍，近20年来已有18款环肽类新药上市，并且环化修饰能有效提高阿片肽的成药性(RSC Chem Biol.2021,3:18-31)。
通过全烃化装订策略可合成具有α-螺旋构象的环肽分子，被认为是药物环化修饰的新策略。在抗菌肽的研究中发现，与线性肽相比，二硫键环化修饰抗菌肽的半衰期可延长4.5倍，而全烃化装订肽修饰使其稳定性提高了70倍，抗菌活性提高了10倍左右。与经典的二硫键环化修饰策略相比，全烃化装订肽具有更强的结合能力、更长的半衰期、更高的生物利用度。因此，为了进一步提高多靶点分子DN-9的成药性，在此专利中我们进一步合成了通过碳碳双键成环的订书肽类似物，并对其体内外活性进行了评价。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子。
本发明的另一目的是提供一种上述多靶点订书肽分子的制备方法。
本发明还有一个目的在于提供上述多靶点订书肽分子的治疗用途。
在本发明的第一方面，提供了一种针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子，其特征在于，所述的肽类分子为环肽，并且结构如下所示：
Tyr-cyclo2,5[Xaa2-Gly-NMe-Phe-Xaa5]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
式中，
Xaa2为R5、R6或S3；
Xaa5为R6、S3或S4；
cyclo2,5表示所述氨基酸序列中Xaa2和Xaa5两个烯烃基氨基酸残基之间通过碳碳双键连接的方式成环而形成订书肽结构的环肽。
在另一优选例中，所述肽类分子选自下述化合物：
化合物1：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(cis)
化合物2：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物3：Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物4：Tyr-cyclo2,5[S3-Gly-NMe-Phe-R6]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物5：Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物6：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(cis)
化合物7：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
在本发明的第二方面，提供了一种所述的多靶点订书肽分子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括工艺步骤：
(a)采用Fmoc固相多肽合成法，按照权利要求1结构式的氨基酸序列，进行合成，从而获得线性肽链；
(b)对所述线性肽链进行环化，从而获得权利要求1所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽。
在另一优选例中，步骤(a)中，对Xaa2和Xaa5的侧链进行环化，从而在Xaa2和Xaa5两个氨基酸残基之间形成碳碳双键。
在另一优选例中，所述方法还包括：对于步骤(b)中获得多靶点订书肽分子进行分离，从而获得纯化的多靶点订书肽分子。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的固相合成法包括选自下组的工艺步骤：固相载体的预处理、氨基酸缩合、肽链的延伸和环化、多肽的压缩抽干和切割、萃取、纯化，或其组合。
在另一优选例，所述的固相载体是氨基树脂。
在另一优选例中，所述的氨基酸缩合步骤中使用的缩合试剂为HOBT、HBTU和DIEA的组合或PyBOP和DIEA的组合。。
在另一优选例中，所述的制备方法包括工艺步骤：
i.树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷(DCM)中溶胀30min，抽干后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂。振荡反应速率为600～800r/min。DCM和DMF与树脂的体积质量比为8～12mL/g。茚三酮检验，溶液淡黄色，树脂无色。
ii.循环缩合氨基酸
ii.i脱除芴甲氧羰基(Fmoc)保护基：在溶胀后的树脂中加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、哌啶和DMF(1:1:98)。振荡反应3次，前两次反应时间4～6min，最后一次反应9～11min。反应结束后用DMF洗涤，总共洗涤4次，每次洗涤时间2～4min。振荡反应速率为600～800r/min。茚三酮检验，溶液蓝紫色，树脂蓝紫色。
ii.ii氨基酸缩合：将一定比例(0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2)的N-α-Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Aa)、N-羟基苯并三氮唑(HOBt)、三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶解于少量DMF中，并加入到上述步骤的树脂中，混合溶液与树脂的体积质量比为3～4mL/g。反应时长为0.5～1.5h。反应结束后用DMF洗涤，总共洗涤3次，每次洗涤时间2～4min。振荡反应速率为600～800r/min。茚三酮检验，溶液淡黄色，树脂无色。
ii.iii肽链延长：根据多肽序列，依次按照上述步骤在步骤ii.ii的肽树脂上接入不同的Fmoc-Aa，为了省去末端氨基酸的脱保护步骤，通常最后一个氨基酸选用N-α-Boc保护的氨基酸。所有氨基酸的缩合方法相同，只要烯烃基氨基酸的缩合时间延长到5～7h，缩合剂使用PyBOP和DIEA的组合。得到带有侧链保护基的肽树脂。
ii.iv多肽的环化：用DCM和甲醇(MeOH)交替洗涤树脂，压缩抽干。将步骤ii.iii的肽树脂转移到高压反应瓶，加入40％的Grubbs2代催化剂，体积比4:1的DCM和DMF混合液，混合液与树脂的体积质量比为3～4mL/g。60℃缓慢搅拌反应24～48h，搅拌速率为100～200r/min。然后将得到的肽树脂转移到合成仪中，用DCM和DMF交替洗涤树脂，得到环化肽树脂。
iii.压缩树脂：依次用DCM和MeOH交替洗涤环化肽树脂，抽干3～5h。
iv.多肽的切割和沉淀萃取：在步骤iii所得的环化肽树脂中加入体积比95:2.5:2.5的三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tis)和水(H2O)混合液。室温振荡反应2～4h，振荡速率为100～200r/min。切割剂与环化肽树脂的体积质量比为15～25mL/g。反应结束后，用圆底烧瓶收集切割液，通过旋转蒸发仪，在不高于40℃的水浴条件下旋干溶液。随后加入冰预冷的乙醚沉淀多肽，并用水萃取冻干，得到粗肽粉末。
v.多肽的纯化和分析：利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)半制备柱分离纯化粗肽，经分离后收集多肽主峰冻干。用RP-HPLC分析柱鉴定纯度，然后用电喷雾质谱(ESI)鉴定多肽的分子量。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
(a)权利要求1所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子作为活性成分；
(b)药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明还有一方面是提供本发明多靶点分子DN-9订书肽类似物的医药用途，研究实验显示，本发明的DN-9订书肽类似物具有高效镇痛，相比传统阿片类镇痛药物耐受、成瘾和便秘等副作用显著降低，在治疗急性痛和病理性疼痛等各类疼痛药物方面具有潜在的用途。
本领域技术人员可以理解，含有本发明的DN-9订书肽类似物的药物组合物可适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、鞘内给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。适当剂型的实例为可用于注射的无菌溶液和干粉针剂，片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、气雾剂、鼻喷剂，以及用于皮肤表面的油膏和药贴。
含有本发明多肽药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或者其他可药用的载体将粉末重新配置，溶液配方一般是缓冲液、等渗溶液或水溶液。
本发明多肽的药用剂量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素，如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
附图说明
图1为小鼠皮下注射化合物1所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图2为小鼠皮下注射化合物2所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图3为小鼠侧脑室注射化合物1所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图4为小鼠侧脑室注射化合物2所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图5为小鼠口服注射化合物1所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图6为小鼠口服注射化合物2所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图7为小鼠注射甲碘化纳洛酮和纳洛酮对皮下注射化合物1的血脑屏障通过性的研究结果；
图8为小鼠注射甲碘化纳洛酮和纳洛酮对皮下注射化合物2的血脑屏障通过性的研究结果；
图9为小鼠连续八天皮下注射化合物1和2所产生的镇痛作用的变化；
图10为小鼠皮下注射化合物1对胃肠运动的调节作用；
图11为小鼠皮下注射化合物2对胃肠运动的调节作用；
图12为小鼠皮下注射化合物1和2对运动活性的调节作用；
图13为小鼠皮下注射化合物1和2的对条件位置偏好性的调节作用；
图14为小鼠皮下注射化合物1和2对纳洛酮诱导的戒断反应的调节作用；
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
术语
本发明以阿片/NPFF受体的多靶点分子DN-9为化学模板，针对阿片药效团通过引入侧链含烯烃基结构的氨基酸残基R-Pentenylglycine(R5)、R-Hextenylglycine(R6)、S-allylglycine(S3)或S-butenylglycine(S4)并进行碳碳双键环化修饰，其中，多靶点分子DN-9母体肽的序列如下：
Tyr-D-Ala-Gly-NMe-Phe-Gly-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
在另一优选例中，所述多靶点分子DN-9订书肽类似物的具体序列如表1所示：
表1多靶点分子DN-9及订书肽类似物的氨基酸序列
如本文所用，采用常规的三字母代码代表天然氨基酸，并采用公认的字母代表非天然氨基酸如NMe-Phe(Nα-甲基苯丙氨酸)。此外，使用常用的缩写代表侧链含有烯烃基结构的非天然氨基酸，如R5(R型戊烯基甘氨酸)、R6(R型己烯基甘氨酸)、S3(S型烯丙基甘氨酸)、S4(S型丁烯基甘氨酸)。其结构式如下所示：
如本文所用，采用常规的三字母缩写cis和trans分别表示顺式和反式结构，其结构式如下所示：
与现有技术相比，本发明的主要优点有：
(1)本发明的订书肽类分子皮下和口服镇痛活性相比母体DN-9有显著提高，其中皮下注射的镇痛ED50(半数有效剂量)下降了11000～22000倍，并且口服镇痛活性相对母体也有显著提高；
(2)本发明的订书肽类分子皮下镇痛活性相比二硫键和酰胺键环化分子有显著提高，其皮下注射的镇痛ED50(半数有效剂量)下降了14～196倍。
(3)本发明的订书肽类分子的有效作用时间约为360min，相比母体DN-9以及二硫键和酰胺键环化分子均有延长；
(4)本发明的订书肽类分子可以穿透血脑屏障、无镇痛耐受、无便秘或成瘾性副作用。
所用仪器及主要实验材料如下：
实验试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA树脂(天津南开和成公司)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU，苏州昊帆生物股份有限公司)，N-羟基苯并三氮唑(HOBt，苏州昊帆生物股份有限公司)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA，上海安耐吉化学有限公司)，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU，上海安耐吉化学有限公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，四川西陇科学有限公司)。茚三酮为上海试剂三厂产品。氘代二甲亚砜(美国Cambridge Isotope Laboratories公司)。二氯甲烷(DCM)、六氢吡啶(哌啶)、甲醇(MeOH)和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸(TFA)、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。
实验仪器：固相多肽合成注射器(碧迪医疗器械上海有限公司)，筛板(深圳逗点生物技术有限公司)，旋转蒸发仪(RE-5298A，上海亚荣)，冷冻干燥机(宁波市双嘉仪器有限公司)，质谱仪(ESI-Q-TOF maXis-4G，Bruker Daltonics，德国道尔顿公司)，循环水泵(SHB-Ⅲ型，郑州长城)，高效液相色谱仪(HPLC)为Waters公司的Delta 600；分析柱：XBridge TMBEH 130Prep C18，4.6mm×250mm；制备柱：C18反向色谱柱，19mm×250mm(苏州麦克旺志)。
实施例1.化合物1和化合物2的合成
(1)树脂溶胀：称取0.8g的Rink-Amide-MBHA树脂(取代值为0.4mmol/g)，加入7mL的DCM，700r/min振荡溶胀30min，抽干后用DMF洗涤3次，每次3min。
(2)脱除Fmoc保护基团：在树脂中加入7mL体积比为1:1:98的DBU、哌啶和DMF；按照700r/min振荡5min，重复2次。抽干后，再次加入上述混合溶液，按照700r/min振荡10min。最后加入DMF洗涤4次，每次3min。
(3)茚三酮检验：茚检试剂为体积比为1:2:1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。将20g苯酚溶于5mL无水乙醇中配置苯酚溶液，将0.5g茚三酮溶于10mL无水乙醇中配置茚三酮溶液，其中苯酚、吡啶和无水乙醇均经重蒸处理。茚三酮检验，正常情况下，溶液蓝紫色，树脂蓝紫色。
(4)氨基酸的缩合：称取摩尔比为1:1:1的Fmoc-Phe-OH、HOBt和HBTU，溶解于4mL的DMF中，最后加入2倍摩尔量的DIEA，振荡溶解之后加入步骤(2)已脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护下，室温700r/min搅拌反应。60min之后抽干反应液，按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色、树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。然后再按照步骤(2)脱去Fmoc保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液、树脂均为深蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。
(5)肽链的延伸：
a.将步骤(4)所获得的肽树脂按照步骤(2-4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH和Fmoc-Pro-OH依次缩合到肽树脂上，得到肽树脂Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
b.将步骤a所获得的肽树脂按照步骤(2)脱去Fmoc保护基，按步骤(3)再茚检，若溶液淡黄色、树脂红棕色则表示Fmoc保护基团脱除完全，得到无Fmoc保护基团的树脂肽。称取摩尔比为1:3的Fmoc-S3-OH和PyBOP，溶解于4mL的DMF中，最后加入6倍摩尔量的DIEA，振荡溶解之后加入已脱除Fmoc保护基团的树脂中，在氩气保护下，室温700r/min振荡反应。6h之后抽干反应液，按步骤(3)的方法茚检，若溶液淡黄色树脂为无色则表明氨基酸缩合到树脂上。得到肽树脂Fmoc-S3-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
c.将步骤b所获得的肽树脂按照步骤(2-4)的方法依次将Fmoc-NMe-Phe-OH和Fmoc-Gly-OH缩合到肽树脂上，其中缩合时间为1h，每一个氨基酸缩合两次。得到肽树脂Fmoc-NMe-Phe-Gly-S3-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
d.将步骤c所获得的肽树脂按照步骤b的方法将Fmoc-R6-OH缩合到肽树脂上。得到肽树脂Fmoc-R6-NMe-Phe-Gly-S3-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
e.将步骤d所获得的肽树脂按照步骤b的方法将Boc-Tyr(tBu)-OH缩合到肽树脂上。得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-R6-Gly-NMe-Phe-S3-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin。
(6)多肽的环化：将得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-R6-Gly-NMe-Phe-S3-Pro-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Resin依次用DCM(2×3min)，MeOH(1×3min)，DCM(1×3min)，MeOH(2×3min)交替洗涤，压缩，抽干3h。然后将肽树脂转移至高压反应瓶，加入109mg的Grubbs2代催化剂和体积比4:1的DCM和DMF反应溶剂，在60℃反应条件下，按照100r/min的搅拌速度反应48h。得到环化肽Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
(7)肽链的压缩抽干：依次用DCM(2×3min)，MeOH(1×3min)，DCM(1×3min)，MeOH(2×3min)交替洗涤，抽干3h。
(8)肽链的切割：在抽干的肽树脂Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2中加入12mL的切割剂(TFA:H2O:Tis＝95:2.5:2.5)。于室温下按照100r/min的振荡速度反应3h。滤液在不高于40℃的条件下充分减压旋干，加入冰乙醚，充分振荡混匀。粗肽以白色沉淀的形式充分析出。最后将白色沉淀的水溶液通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末250mg，粗肽产率为69％。
(9)粗肽的纯化：用反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(19mm×250mm)对上述粗肽化合物进行分离纯化，利用乙腈(含0.1％TFA)和水(含0.1％TFA)通过梯度洗脱，分离收集色谱主峰样品，得到纯化的化合物1和化合物2，上样量为236.5mg，通过冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末分别为33.9mg和11.6mg，纯肽产率分别为14％和5％。
(10)顺反异构鉴定：通过核磁共振波谱法确定了订书肽的构型。通过BrukerAdvance III核磁共振波谱仪(600MHz)，在500μL DMSO-d6中记录这些订书肽(3-5mg)的核磁共振氢谱图。从而获得乙烯基质子的化学位移(δ)和耦合常数(Hz)数值，以区分这些化合物的顺式和反式构型。质谱、色谱和核磁检测结果如表2和表3所示。
实施例2.化合物3的合成
按照同实施例1的方法，得到环化肽Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，为白色固体粉末，粗肽320mg，粗肽产率为88％，纯化后的纯肽产率14％。质谱、色谱和核磁检测结果如表2和表3所示。
实施例3.化合物4的合成
按照同实施例1的方法，得到环化肽Tyr-cyclo2,5[S3-Gly-NMe-Phe-R6]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，为白色固体粉末，粗肽345mg，粗肽产率为95％，纯化后的纯肽产率16％。质谱、色谱和核磁检测结果如表2和表3所示。
实施例4.化合物5的合成
按照同实施例1的方法，得到环化肽Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，为白色固体粉末，粗肽280mg，粗肽产率为78％，纯化后的纯肽产率10％。质谱、色谱和核磁检测结果如表2和表3所示。
实施例5.化合物6和化合物7的合成
按照同实施例1的方法，得到环化肽Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，为白色固体粉末，粗肽300mg，粗肽产率为82％，纯化后的纯肽产率分别为9％和13％。质谱、色谱和核磁检测结果如表2和表3所示。
基于以上合成步骤，本发明合成了包括如表1所列的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽类分子，其化学表征结果如表2和表3所示。
表2.本发明订书肽类分子的质谱和纯度分析
注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-80％乙腈/水(0.1％TFA)(30min完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130Prep C18，4.6mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-100％乙腈/水(0.1％TFA)(30min完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130Prep C18，4.6mm×250mm。
表3.本发明订书肽类分子的1H-NMR数据
实施例6.订书肽类似物对阿片和NPFF受体的体外功能活性测定：
利用稳定高表达Mu-阿片受体、Delta-阿片受体、Kappa-阿片受体、NPFF1受体的CHO-K1/Gα15细胞系以及稳定高表达NPFF2受体的HEK293细胞系，通过检测订书肽类似物对细胞内钙离子动员的调节来检测化合物对阿片受体的激动活性。
实验方法：96孔板种细胞，每孔种3～5万，培养20h以上。实验开始时，先吸出培养皿中的培养基，然后加入50μL的含有2.5mM丙磺舒、0.9μM的Fluo-4-AM和F127(0.03％)的钙染料储存液，37℃孵育30min。孵育结束后，吸出染料加入75μL的HBSS缓冲液(含有2.5mM的丙磺舒)。然后将96孔加药板、96孔细胞板以及自动加药枪头放入FlexStation 3钙流工作站检测给药之后的钙信号变化。
钙动员效应用药物对胞内钙离子的增加百分比(％control)表示，％control＝(检测值-基础值)/基础值*100。相关的％control数据用平均值±标准误差(Means±S.E.M.)表示。化合物的剂量效应关系用非线性回归模型统计，利用统计软件GraphPadPrism 8.0.1版本，分别计算出该多靶点订书肽类分子对细胞内钙离子动员的调节的EC50值，实验结果见表4和表5。
表4本发明订书肽类分子在阿片受体上的钙动员实验
如表4所示，在稳定高表达Mu-阿片受体、Delta-阿片受体和Kappa-阿片受体、的CHO-K1/Gα15细胞系中，化合物1-7都剂量依赖的引起胞内钙离子的动员，从而说明所有类似物均对阿片受体表现出浓度依赖的激动活性。对于Mu-阿片受体,与母肽DN-9相比，除化合物1，2，3和6的激动活性基本保持不变，其他类似物的Mu-阿片受体激动活性均有不同程度降低。对于Kappa-阿片受体，与母体DN-9相比，化合物的激动活性基本保持不变。对于Delta-阿片受体，除化合物4没有改变，其他化合物的激动活性均有大幅度提高(53-896倍)。
表5本发明订书肽类分子在NPFF受体上的钙动员实验
如表5所示，在稳定高表达NPFF1受体的CHO-K1/Gα15细胞系以及稳定高表达NPFF2受体的HEK293细胞系中，化合物1-7都剂量依赖的引起胞内钙离子的动员，从而说明所有类似物均对阿片受体表现出浓度依赖的激动活性。对于NPFF1受体，与母体DN-9相比，化合物3、5、6和7的激动活性有大幅度提高(10-52倍)，其他化合物的激动活性基本保持不变。对于NPFF2受体，与母体DN-9相比，化合物3、4、6和7的激动活性有大幅度降低(23-212倍)，其他化合物的激动活性基本保持不变。
实施例7.订书肽类似物体内镇痛活性测定：
实验通过光热甩尾镇痛模型对化合物的镇痛活性进行评价。首先选取皮下给药的方式，对比评价所有化合物的镇痛效果，随后选取镇痛活性强的化合物，对其皮下、侧脑室以及口服镇痛活性进行进一步评价。
皮下给药使用1mL无菌注射器，按照0.1mL/10g的体积给药。皮下给药位置为小鼠背部皮肤，左手抓起小鼠，然后将药物注射到小鼠背部皮下。
侧脑室给药需要提前进行侧脑室埋管手术，以确保给药位点的准确性和精确性。埋管选择18～20g的昆明系雄性小鼠。开始手术前，对实验中用到的所有手术器械以及脑立体定位仪进行消毒。首先腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉实验小鼠，然后剔除小鼠头顶部的毛发。将小鼠的头部固定在脑立体定位仪上，然后用碘伏对头顶进行消毒，沿失状缝剪开头皮，暴露颅骨找到前囟位置。从前囟的位置向后3毫米，向右1毫米，同时用针在此处做标记，然后将带有PE10的不锈钢针管向下移3毫米，此处为侧脑室，随后使用胶水和牙托粉将针固定，缝合皮肤组织，并于手术区域涂抹红霉素软膏，背部皮下注射青霉素以防感染。做完手术的小鼠恢复3～4天之后进行实验。侧脑室给药使用微量进样器，每次注射4μl药物，然后用1μl生理盐水冲洗钢管，给药总体积5μL。
口服给药使用1mL无菌注射器(带有12号灌胃针)，按照0.1mL/10g的体积给药。左手抓住小鼠颈背部皮肤，使小鼠的身体在一条线上，然后将灌胃针从舌面沿上颚进去食管，进针2.5cm可注射灌胃液。
光热甩尾实验选择体重22～25g的昆明系雄性小鼠，环境温度控制在22±2℃。开始实验前将小鼠放在实验环境中适应30min，并用手抓小鼠，让小鼠适应手的力度，减少压力对镇痛活性评价的影响。实验开始前将距离小鼠尾巴根部2～3mm的背侧放在辐射光源上，辐射热的强度调整到基础甩尾阈值3～5s。实验中小鼠尾巴处于辐射光源的时间不能超过10s，避免烫伤小鼠尾巴，即光热甩尾的最大潜伏期。测完基础值之后，注射药物，然后测定给药后10、20、30、45、60、90、120、180、240、300、360和420min之后小鼠的甩尾潜伏期。
药物的镇痛效果通过甩尾潜伏期的变化作图表示。此外，我们用最大镇痛效应MPE(％)来计算药物的半数有效剂量(ED50)，MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。使用统计学软件GraphPad Prism 8.0.1来计算药物的ED50。镇痛作用的差异使用单因素方差分析(one-wayANOVA的Dunnett检验)进行统计，*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001表示只注射相关药物组与盐水组差异显著性。
在小鼠光热甩尾实验中，皮下注射所有订书肽类似物的最高镇痛剂量如表6所示。母肽DN-9的最高镇痛剂量为9480nmol/kg，镇痛持续时间90min。表中所列7个DN-9订书肽类似物的最高镇痛剂量均低于母肽DN-9分子，并且有效镇痛时间延长至360min。其中化合物1和化合物2的镇痛效果最佳，因此对其镇痛量效曲线进行了进一步评价，其镇痛ED50分别为0.01nmol/kg和0.02nmol/kg。化合物1和化合物2皮下镇痛效应曲线如图1-2所示。
进一步侧脑室注射化合物1和化合物2产生剂量依赖的镇痛效果，镇痛时长360min，其镇痛ED50分别为0.91pmol和1.05pmol。化合物1和化合物2侧脑室镇痛效应曲线如图3-4所示。
口服侧脑室注射化合物1和化合物2产生剂量依赖的镇痛效果，镇痛时长360min，其镇痛ED50分别为1.35nmol/kg和1.95nmol/kg。化合物1和化合物2口服镇痛效应曲线如图5-6所示。
表6.本发明订书肽类分子所产生的镇痛活性
实施例8.订书肽类似物的血脑屏障通过性测定：
订书肽化合物的血脑屏障通透性通过一种不能通过血脑屏障的药物甲碘化纳洛酮进行评价。实验中甲碘化纳洛酮选取皮下和侧脑室两种给药方式，化合物选择皮下给药的方式，最终通过光热甩尾实验来检测不同甲碘化纳洛酮处理情况下化合物镇痛活性的改变来判断化合物的血脑屏障通透性。
实验选用22～25g的昆明系雄性小鼠，环境温度控制在22±2℃，小鼠可自由进食、饮水。甲碘化纳洛酮选择侧脑室和皮下两种给药方式，纳洛酮和不同的化合物主要选择皮下水平给药，然后通过光热甩尾实验来检测预处理拮抗剂和预处理盐水之后，药物镇痛活性的改变。
药物的拮抗作用利用相关药物镇痛效应的曲线下面积来进行比较，镇痛作用的差异使用单因素方差分析(one-way ANOVA的Bonferroni检验)进行统计，*P<0.05，**P<0.01以及***P<0.001表示只注射相关药物组与共注射拮抗剂组和相关化合物的差异显著性。
化合物1和化合物2的血脑屏障渗透性检测结果分别如图7和图8所示，侧脑室注射甲碘化纳洛酮能拮抗皮下注射化合物1和2所引起的外周镇痛，皮下注射甲碘化纳洛酮却不能拮抗皮下注射化合物1和2所引起的外周镇痛，从而说明化合物1和2均能穿透血脑屏障。
实施例9.订书肽类似物的镇痛耐受现象测定：
镇痛耐受实验是通过观察连续8天给药之后，药物在光热甩尾实验中光热甩尾潜伏期的变化，从而评价本专利中化合物在镇痛耐受方面的药理活性。
实验选用20～22g的昆明系雄性小鼠。小鼠连续8天每天同一时间皮下注射一次同一浓度的药物，并利用光热甩尾仪来检测每天注射药物之后甩尾潜伏期的变化。第一天测定甩尾潜伏期(3～5s)及给药之后不同时间点的镇痛，后面几天一般测定最高镇痛作用点的甩尾潜伏期。
实验数据用甩尾时间表示。药物的镇痛耐受作用利用不同化合物的最大镇痛效应时间点的甩尾潜伏期来进行比较。甩尾潜伏期数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)来表示，小鼠皮下连续给药八天镇痛作用的差异使用单因素方差分析(one-way ANOVA的Tukey HSD检验)进行统计，*P<0.05，**P<0.01以及***P<0.001表示与第一天注射该药物的镇痛作用相比有极显著性差异。实验结果如图9所示。
图9是皮下注射盐水、芬太尼、化合物1和化合物2的耐受结果。连续注射8天之后，芬太尼在第四天镇痛出现了明显的下降，甩尾阈值从9.8s降到8.7s，而化合物1和化合物2没有出现甩尾阈值的下降，即没有出现镇痛耐受现象。
实施例10.订书肽类似物的便秘副作用测定：
便秘是临床上常见的阿片样副作用，一般利用胃肠运动实验来评价药物的便秘副作用。小鼠胃肠运动实验一般选用体重25～27g的昆明系雄性小鼠，实验小鼠需要禁食16h，可自由饮水。实验开始皮下注射不同剂量的化合物1和2，给药15min之后，口服活性炭悬浮液250μl(0.1μl/10g)(一种含5％活性炭和10％阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液)。灌胃30min之后，颈椎脱臼处死小鼠，马上解剖，取小肠全长，从胃幽门到盲肠这段距离。然后测量小肠总长以及碳粉移动的长度。
胃肠运动实验结果用胃肠运动百分比来表示，具体计算方法为碳粉移动的距离除以小肠总长之后的百分比来表示。数据用胃肠运动百分比的平均值±标准误(Means±S.E.M.)来表示，化合物与盐水之间的差异用单因素方差分析(one-way ANOVA的Dunnett检验)进行数据统计和分析，*P<0.05，**P<0.01以及***P<0.001表示只注射盐水与注射相关化合物的差异显著性。化合物1和2的胃肠运动实验结果如图10-11所示。
在图10中，生理盐水组为空白对照组，皮下分别注射8.8、88以及880nmol/kg的化合物1。实验结果表明空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为73.7％，注射8.8、88以及880nmol/kg的化合物1之后胃肠运动百分比分别为74.5％、43.8％和32.3％，胃肠抑制的ED50值为84.0nmol/kg。化合物1的镇痛ED50为0.01nmol/kg，即胃肠运动的便秘副作用ED50值是镇痛ED50的8400倍，也就是说在有效镇痛剂量范围内，化合物1无便秘副作用。
在图11中，生理盐水组为空白对照组，皮下分别注射8.8、88以及880nmol/kg的化合物2。实验结果表明空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为73.7％，注射8.8、88以及880nmol/kg的化合物2之后胃肠运动百分比分别为72.6％、41.9％和38.4％，胃肠抑制的ED50值为95.4nmol/kg。化合物2的镇痛ED50为0.02nmol/kg，即胃肠运动的便秘副作用ED50值是镇痛ED50的4770倍，也就是说在有效镇痛剂量范围内，化合物2无便秘副作用。
实施例11.订书肽类似物的成瘾性测定：
药物成瘾性一般通过开放场、条件位置偏爱实验(CPP)和纳洛酮戒断实验来评价。实验选用22～25g的昆明系雄性小鼠，运动活性通过开放场实验来检测，实验装置由一个50×50×50cm的无顶黑色有机玻璃盒及一套运动监测系统组成。实验室温控制在22±1℃之间，实验之前要用75％酒精将盒子擦干净，以免其他气味影响小鼠的运动活性。实验开始后首先记录小鼠30min内自由运动的路程，随后皮下注射化合物1和2，并记录给药之后150min之内小鼠的运动情况。小鼠运动活性用运动总路程来表示，即小鼠运动总路程±标准误(Means±S.E.M.)来表示，化合物与盐水对照组之间的差异用单因素方差分析(one-wayANOVA的Bonferroni检验)进行数据统计和分析，*P<0.05，**P<0.01以及***P<0.001表示表示只注射盐水与注射相关化合物的差异显著性。
条件位置偏爱实验(CPP)是一种测试小鼠心理成瘾的实验方法。CPP实验装置由三个盒子组成，两个大盒子(20×20×20cm)中间被一个小盒子(5×20×20cm)分开。两个大盒子底部开一个5×5的小门供小鼠出入，小门可以关闭。两个大盒子一个是黑色的一个是白色的，而且两个盒子四周都是光滑的。实验选用20～22g的雄性小鼠。实验开始前一天将小鼠置于CPP盒中适应15min，不做记录，排除陌生环境对小鼠造成的干扰。实验第一天将小鼠放在CPP装置中，中间的小门打开，小鼠可以在两个盒子中间自由移动，小鼠在盒子中测定的总时间为15min，记录小鼠在两个盒子中逗留的时间，剔除有偏向性的小鼠(一个盒子逗留时间超过9min)，将挑选出的小鼠编号，每组10只。实验第2-4天，连续药物处理，中间的小门关闭，每天上午将小鼠放在一侧的偏爱箱注射化合物1和2，每天下午将小鼠放在另一侧的偏爱箱注射盐水，小鼠在盒子里停留40min。第五天将中间的小门打开，记录15min内小鼠在注射药物的盒子中停留的时间。实验的相关数据用平均值±标准误(Means±S.E.M.)表示，CPP实验的结果用条件位置偏爱分数表示，每只小鼠第5天在注射药物的偏爱箱停留的时间减去第一天在此偏爱箱的时间。化合物与盐水对照组之间，化合物之间的差异用单因素方差分析(one-wayANOVA的Bonferroni检验)进行数据统计和分析，*P<0.05，**P<0.01以及***P<0.001表示只注射盐水与注射相关化合物的差异显著性。
纳洛酮戒断实验是一种经典的评价药物生理成瘾性的实验。每隔8h注射一次化合物1和2，药物的剂量是逐渐增加的，参考吗啡(20、40、60、80、100、100、100mg/kg)的给药剂量，即剂量依次是吗啡镇痛ED50(1.68mg/kg)的10、20、30、40和50倍。化合物1的ED50分别为0.01nmol/kg，因此其逐渐递增的给药剂量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5和0.5nmol/kg。化合物2的ED50分别为0.02nmol/kg，因此其逐渐递增的给药剂量为0.2、0.4、0.6、0.8、1、1和1nmol/kg。最后一次给药2h后，腹腔注射10mg/kg的纳洛酮，然后将小鼠立即放入内径9cm、高32cm的不透明桶状结构中，记录30min内小鼠的跳跃次数。
如图12所示，皮下注射盐水对照组的总路程分别为143.2±19.4m，皮下注射化合物1和2之后，其总路程分别为126.6±12.6m和133.5±26.2m，与盐水对照组相比，小鼠的运动活性没有显著改变。
如图13所示，与注射盐水对照组相比，而皮下注射化合物1和2之后，未出现明显的条件位置偏爱或者厌恶现象。
如图14所示，注射盐水组、化合物1和2的跳跃次数分别为14、7和6次。与盐水组相比，皮下注射化合物1和2未出现明显的戒断现象。
以上对本发明的具体描述并不限制本发明，本领域技术人可以根据本发明做出各 种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一类基于阿片受体和神经肽FF受体多靶点激动剂DN-9的订书肽类似物，其特征在于，所述的肽类分子为订书肽类似物，并且氨基酸序列特征如下所示：
Tyr-cyclo2,5[Xaa2-Gly-NMe-Phe-Xaa5]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
式中，
Xaa2为R-Pentenylglycine(R5)、R-Hextenylglycine(R6)或S-allylglycine(S3)；
Xaa5为R-Hextenylglycine(R6)、S-allylglycine(S3)或S-butenylglycine(S4)；
cyclo2,5表示所述氨基酸序列中Xaa2和Xaa5两个非天然氨基酸的侧链末端的烯烃基之间通过碳碳双键连接的方式成环而形成订书肽结构的环肽。
2.根据权利要求1所述的多靶点肽类分子DN-9的订书肽类似物，其特征在于所述的多靶点肽类分子DN-9订书肽类似物选自下述化合物：
化合物1：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(cis)
化合物2：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物3：Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物4：Tyr-cyclo2,5[S3-Gly-NMe-Phe-R6]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物5：Tyr-cyclo2,5[R5-Gly-NMe-Phe-S3]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)
化合物6：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(cis)
化合物7：Tyr-cyclo2,5[R6-Gly-NMe-Phe-S4]-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(trans)。
3.根据权利要求1所述DN-9订书肽类似物的合成方法，其特征在于，包括步骤：
(a)采用Fmoc固相多肽合成法，按照权利要求1结构式的氨基酸序列，进行合成，从而获得线性肽链；
(b)对所述线性肽链进行环化，从而获得权利要求1所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽。
4.根据权利要求3所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽的制备方法，其特征在于，所述的Fmoc固相多肽合成法包括如下所述的工艺步骤：树脂的溶胀、氨基酸缩合、肽链的延伸、肽链环化、肽链的压缩抽干和切割、多肽的纯化和化学鉴定，或其组合。
5.根据权利要求3所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子的制备方法，其特征在于，所述的固相载体是Rink-Amide-MBHA树脂。
6.根据权利要求3所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸缩合步骤中使用的缩合试剂为HOBt、HBTU和DIEA的组合或PyBOP和DIEA的组合。
7.根据权利要求3所述的针对阿片受体和神经肽FF受体的多靶点订书肽分子的制备方法，其特征在于，所述的环化步骤中使用的环化试剂为Grubbs 2代催化剂、DCM和DMF的组合。
8.一种药物组合物，含有权利要求1所述的多靶点肽类分子DN-9的订书肽类似物。
9.权利要求1所述的多靶点肽类分子DN-9的订书肽类似物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于需要的对象缓解和/或治疗各类病理性疼痛，包括急性痛和慢性疼痛。
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