CN1745091A - 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法 - Google Patents

非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1745091A
CN1745091A CN03825828.5A CN03825828A CN1745091A CN 1745091 A CN1745091 A CN 1745091A CN 03825828 A CN03825828 A CN 03825828A CN 1745091 A CN1745091 A CN 1745091A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nsc
peptide
amido
fmoc
dmf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN03825828.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100357313C (zh
Inventor
李相得
李康春
罗东熙
尹裕锡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pegsphere Co Ltd
Original Assignee
Pegsphere Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pegsphere Co Ltd filed Critical Pegsphere Co Ltd
Publication of CN1745091A publication Critical patent/CN1745091A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100357313C publication Critical patent/CN100357313C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/063—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha-amino functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/064—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amino or -guanidino functions

Abstract

本发明涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽及其制备方法，以及应用该合成肽将PEG特异性地结合至靶位点的方法。本发明能以高得多的收率提供其中PEG与靶位点的胺基特异性地结合的PEG结合肽。

Description

非靶位点胺基被保护的肽，其制备方法 以及使用该肽制备特异性地结合的PEG肽的方法
技术领域
本发明涉及将至少一个PEG(聚乙二醇)特异性地结合到具有至少两个支链胺基的合成肽的靶位点胺基的方法，本发明还进一步涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽及其生产方法，以及将PEG特异性地结合到合成肽的靶位点并通过离子交换色谱法进行纯化的方法。
背景技术
将PEG结合到肽和蛋白质的技术基于Davis和Abuchowski的研究(Abuchowski A.等，J.Biol.Chem.，252，3571-3581，1977；Abuchowski A.等，J Biol.Chem.，252，3582-3586，1977)。PEG是一种具有H(OCH2CH2)nOH结构的亲水性、生物相容性且无害的聚合物，并已知当结合到肽和蛋白质时，其以与糖蛋白中的糖链相同的方式通过位阻抑制酶促代谢，由于结合有PEG的肽和蛋白质的分子尺寸增加而减少肾小球的滤过，从而增加生理活性的持续时间。多肽和PEG之间的共价结合公开于USP No.4179337中，并且据记载以PEG修饰蛋白质和酶可导致免疫原性和抗原性下降及在血液内的半衰期增加。
为使PEG共价键合到多肽上，必须进行将PEG的末端羟基转变为反应性官能基的“活化”过程。作为“经活化的PEG”，可列举烷基化剂如PEG醛、PEG环氧化物和PEG tresylate、酰化剂如PEG酯，且典型实例为PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯。聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺碳酸酯及其生产方法从Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)和USP No.512614等获知。可使用分子范围在2,000-40,000的PEG以及如甲氧基化的PEG和支化PEG等各种PEG。支化PEG可用R(-PEG-OH)m结构代表[其中，R定义为中心基团如季戊四醇或丙三醇，m定义为范围在3-100内的支链数]。羟基可用于化学修饰。还采用其它具有(CH3O-PEG-)pR-X(WO96/21469)结构的支化PEG[其中，p为2至3，R代表中心基团如赖氨酸和丙三醇，X定义为用于活化的官能团如羧基]。另一支化PEG的侧链PEG具有的官能团如羧基是在PEG骨架上，而不是在PEG链的末端。所有这些支化PEG都可通过前述“活化”过程使用。
通常，在将“经活化的”PEG结合到肽胺基上的反应中，PEG非特异性地键合于一个或更多个胺基上，因此该技术的核心就在于将PEG分子特异性地结合到特定位置的胺基上的方法。然而，如果肽的氨基酸序列中包含至少一个赖氨酸，由于其中存在两个或更多个胺基，因此很难将PEG特异性结合到特定位点的胺基上。如果根据一般的方法将PEG结合到肽上则会产生多种结合物，从具有一个结合PEG的结合物到具有和胺的数目一样多的多重结合PEG的结合物，甚至当结合物仅含有一个PEG时(单PEG结合物)，也会形成PEG结合位点互不相同的位置异构体。通常，肽的PEG结合物的活性和酶促代谢根据结合PEG的数目及其结合位点的不同而不同，因此产生这种含有多种结合物的混合物的方法由于活性成分收率很低且又是混合物的原因是不利的。从混合物中分离纯化特定异构体是很复杂的，且收率低、成本高。为弥补这些缺点，已提出多种位点特异性聚乙二醇化的方法，然而，还未开发出将PEG特异性结合到特定位置的胺基上的有效方法。
Chem.Pharm.Bull.39(12)：3373-3375(1991)报道了与纤连蛋白相关的三肽(Arg-Gly-Asp)和氨基聚乙二醇的结合物及其活性。其中，提出一种通过将氨基PEG结合到以二环己基碳二亚胺(DCC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)活化的天冬氨酸而制备PEG结合物的方法。然而，该方法的缺陷在于它仅能用于C-端的修饰，并且在肽的C-端活化期间，可能出现相邻氨基酸的外消旋化。这种外消旋化可能出现于除甘氨酸之外的所有氨基酸中，结果导致肽活性的下降。
用合成树脂将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)结合到肽上的方法发表于Journal of Protein Chemistry 10(6)：623-627(1991)。因为从该方法仅能得到其中单一聚合物结合到肽N-端的结合物，因此其不能提供将PEG结合到能最大化聚乙二醇化效果的位置上的方法(最大化肽活性的持续时间并且最小化酶促代谢)。
PCT专利申请No.PCT/US94/06953(1994)提供在肽合成过程中引入PEG的制备位点特异性PEG肽的方法。更确切地说，它提供一种制备PEG结合肽的方法，其中在序列到达靶位置的赖氨酸以前结合肽是部分合成的，然后结合PEG，最后合成肽的剩余部分得到完整的PEG肽；一种通过使用其中Nα-氨基用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)保护且其支链胺基与PEG结合的赖氨酸作为靶位点赖氨酸制备PEG肽的方法；一种其中单独合成具有PEG结合到靶位点胺基上的肽片段以及其余的肽片段再使之结合生成完整的PEG结合肽的方法。不过，由于先前结合的PEG对后续合成步骤的影响，这些方法可能带来不希望的结果。例如，如果在肽合成期间引入PEG并继续合成剩余部分，可能会产生氨基酸序列缺少至少一个氨基酸的肽，而这种肽可能对活体有害且几乎不可能纯化。因此，该方法作为制备用作药物的PEG结合肽的方法是不可取的。
PCT专利申请No.PCT/EP98/07748提供多种方法用于在有机溶剂中将PEG结合到GRF的胺基上并通过凝胶色谱和反相色谱纯化所得的Lys(PEG)12-GRF、Lys(PEG)21-GRF、Lys(PEG)12，21-GRF以及[Nα-PEG-Try1，Lys(PEG)12，21]-GRF的混合物。然而，该方法在Nα、Lys12和Lys21的胺基之间无特异性。所述专利同样也提供[Lys(Alloc)12，21]-GRF(1-29)与[Nα-异丙基-Try1，Lys(Alloc)12]-GRF(1-29)的合成方法以及用它们进行的特异性聚乙二醇化方法，然而，就[Lys(Alloc)12，21]-GRF(1-29)而言，PEG仅能结合于Nα-胺基，而不能提供如上述专利所述的最有效的Lys21-PEG结合物的制备方法。此外，如果使用[Nα-异丙基-Try1，Lys(Alloc)12]-GRF(1-29)制备PEG结合物，那么所形成的不是GRF(1-29)-NH2的PEG结合物，而是[Nα-异丙基-Try1]-GRF(1-29)-NH2的PEG结合物，即[Nα-异丙基-Try1，Lys(PEG)21]-GRF(1-29)。因此，该方法不能为具有N-端胺基的初始肽GRF(1-29)-NH2提供完全特异性的聚乙二醇化。
本发明的发明者旨在开发通过形成其中PEG仅结合到靶位点胺基上的最终产物同时避免生成PEG结合到非靶位点胺基上的杂质产物的特异性聚乙二醇化方法，从而通过该方法可以明显提高产物收率并降低分离纯化最终产物所需的努力和费用。
本发明提供制备特异性PEG结合肽的方法，其中通过使PEG完全选择性地仅结合于靶位点胺基而使PEG结合的效果最大化。
发明内容
本发明涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽，其制备方法以及将PEG特异性地结合到合成肽的靶位点的方法。更详细而言，本发明涉及(A)制备非靶位点胺基被选择性地保护的肽的方法，其包括：用不同的可在不同的解封闭条件下除去的保护基{如，ivDde[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基]或Mtt(4-甲基一三苯甲基)和Boc(叔丁氧羰基)}分别封闭靶位点胺基和非靶位点胺基，以及用Fmoc或Nsc保护Nα-胺基，从而合成肽，(B)由所述方法制备的非靶位点胺基被选择性地保护的肽，以及(C)制备特异性结合PEG的肽的方法，其中PEG特异性地结合到靶位点胺基上，其包括(1)将所述肽与经活化的PEG反应，以及(2)在酸-碱解封闭条件下除去所述步骤(1)中获得的化合物中的胺基封闭基团。
本发明还涉及制备非靶位点胺基被选择性地保护的肽的方法，其另外还包含用最终胺基保护基(final amine protecting group)取代如上所述合成的肽的非靶位点胺基包括Nα-胺基的保护基的步骤。
作为最终胺基保护基，可以使用至少Fmoc、Nsc、Dde、ivDde以及碱性条件下可除去的其它保护基中之一，或可使用至少Boc以及酸性条件下可除去的其它保护基中之一。
一种合成肽的一般方法是重复下列反应：将Nα-胺基被保护的C-端氨基酸的羧基结合到树脂上，在碱性条件下实施胺基的解封闭，并根据序列结合下一个Nα-胺基被保护的氨基酸，这样达到N-端氨基酸。如果在氨基酸序列中包含带支链胺基的赖氨酸，则可使用其中支链胺基用酸性条件可脱去的Boc保护且Nα-胺基用碱性条件可脱去的Fmoc或Nsc[4-硝基苯基磺酰基乙氧基羰基]保护的赖氨酸，从而使支链胺基在用于结合后续的氨基酸的Nα-胺基解封闭的条件下不会被脱封闭。然而，当肽含有至少两个支链胺基时，由于支链胺基难以区别，故难以合成完全被选择性地保护的肽。在合成含有至少两个支链胺基的肽时，本发明的发明者合成了以下被选择性地保护的肽，其中各支链胺基可基于使用Fmoc或Nsc作为Nα-胺基保护基并使用两种可在不同条件下被除去的胺基保护基即Boc和ivDde或Mtt作为支链胺基保护基的酸-碱解封闭处理而简单地加以区分，且基于这一点，开发出完全特异性的聚乙二醇化方法，从而完成了本发明。区分非靶位点支链胺基和N-端胺基及分别使用不同的保护基的原因是在肽的合成中只有N-端胺基应该选择性地参与反应。根据聚乙二醇化条件下必须具有的稳定性，在肽合成最后一步中可用其他保护基取代非靶位点胺基。因为该方法仅通过改变酸碱条件就能够合成被选择性地保护的肽，所以与基于还原反应或烯丙基取代的方法相比，其优势在于反应简单、经济，所得肽的纯度高。
例如，作为本发明特定的具体实施方案，可列举下列方法。
在其中靶位点支链胺基用Boc保护而非靶位点支链胺基用ivDde保护的方法中，在引入靶位点赖氨酸的步骤中，使用其中Nα-胺基以Fmoc或Nsc保护而支链胺基以Boc保护的赖氨酸合成肽，且在引入其它位点的赖氨酸的步骤中，使用其中Nα-氨基以Fmoc或Nsc保护而支链胺基以ivDde保护的赖氨酸用于肽的合成。在合成过程中，在Fmoc或Nsc的解封闭条件如1％DBU(1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯)-20％哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)下，ivDde没有被除去。就合成的肽-树脂(以Boc保护靶位点支链胺基，以ivDde保护非靶位点支链胺基，以Fmoc或Nsc保护N-端胺基)而言，在于非靶位点支链胺基上的ivDde以及于N-端胺基上的Fmoc被除去后，用Fmoc或Nsc保护由此得到的游离胺基{例如，通过与Fmoc-Osu(9-芴基甲氧羰基一琥珀酰胺)或Nsc-Osu反应}。此时，例如可通过用2％肼溶液处理实施所述解封闭反应。用裂解溶液(例如，三异丙基硅烷(TIS)∶水∶三氟乙酸(TFA)＝2.5∶2.5∶95)处理该肽-树脂，将肽自树脂分离，同时除去靶位点胺基上的Boc，从而获得非靶位点胺基被Fmoc或Nsc保护的肽。
在其中靶位点支链胺基用Boc保护而非靶位点胺基用Mtt保护的方法中，在引入靶位点赖氨酸的步骤中，使用其中以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基并以Boc保护支链胺基的赖氨酸合成肽，在于其它位点引入赖氨酸的步骤中，使用其中以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基且以Mtt保护支链胺基的赖氨酸合成肽。在合成过程中，在用于除去Fmoc或Nsc的碱性条件下Mtt没有被除去。使这样合成的肽-树脂(以Boc保护靶位点支链胺基，以Mtt保护非靶位点支链胺基，以Fmoc或Nsc保护N-端胺基)除去非靶位点支链胺基上的Mtt。例如可通过以1％TFA/MC(二氯甲烷)处理实施所述解封闭。此时，靶位点处的胺基保护基Boc未被除去。将该肽-树脂(以Boc保护靶位点支链胺基，以Fmoc或Nsc保护N-端胺基，且暴露非靶位点支链胺基)与Fmoc-Osu或Nsc-Osu反应以用Fmoc或Nsc保护非靶位点支链胺基，然后通过裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)除去靶位点处的胺基保护基Boc，得到被选择性地保护的肽(靶位点胺基暴露而非靶位点胺基以Fmoc或Nsc保护)。
其中以Boc保护非靶位点胺基的肽可通过以ivDde保护靶位点胺基并以Boc保护非靶位点胺基的方法制备。在引入靶位点赖氨酸的步骤中，使用其中以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基并以ivDde保护支链胺基的赖氨酸合成肽，而在引入其它位点赖氨酸的步骤中，使用其中以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基并以Boc保护支链胺基的赖氨酸用于肽的合成。在合成期间，在Fmoc或Nsc的解封闭条件例如1％DUB-20％哌啶/DMF下，ivDde没有被除去。对于合成的肽-树脂(以ivDde保护靶位点支链胺基，以Boc保护非靶位点支链胺基，以Fmoc或Nsc保护N-端胺基)而言，除去N-端胺基保护基Fmoc(例如，通过1％DBU-20％哌啶的DMF溶液处理)，然后用裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)处理以分离树脂和肽。此时，靶位点的支链胺基保护基Boc被除去。该肽(以ivDde保护靶位点支链胺基，非靶位点支链胺基及N-端胺基暴露)暴露的胺基用Boc保护，并除去靶位点胺基上的ivDde，从而得到其中以Boc保护非靶位点胺基的肽。此时，可例如通过与Boc2O(二叔丁基碳酸氢酯)反应实施该保护，并可例如通过以2％肼溶液处理实施所述解封闭。
以Boc保护非靶位点胺基的肽可通过以Mtt保护靶位点胺基并以Boc保护非靶位点胺基的方法来制备。在该方法中，可使用对酸极为敏感的树脂如2-CLTR(2-氯三苯甲基树脂)，且由于潮湿会降低收率和纯度因此必需留意。在该方法中，在引入靶位点赖氨酸的步骤中，使用以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基并以Mtt保护支链胺基的赖氨酸用于肽的合成，而在引入其它位点赖氨酸的步骤中，使用以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基并以Boc保护支链胺基的赖氨酸用于肽的合成。在合成期间，在用于除去Fmoc或Nsc的碱性条件下，Mtt没有被除去。这样在合成的肽-树脂(以Mtt保护靶位点支链胺基，以Boc保护非靶位点支链胺基，以Fmoc或Nsc保护N-端胺基)中，除去N-端胺基保护基Fmoc或Nsc，并用Boc保护N-端暴露的Nα-胺基。例如，所述解封闭可通过以1％DBU-20％哌啶在DMF中的溶液处理而实施，且所述保护可通过与Boc2O反应进行。将这样合成的肽-树脂(以Mtt保护靶位点支链胺基，以Boc保护非靶位点胺基且C-端结合至树脂)用TFA/MC处理以分离树脂和肽，除去靶位点胺基保护基Mtt，从而获得以Boc保护非靶位点胺基的肽。所获得的被保护的肽处于如下状态中，其中非靶位点胺基以Boc保护，除胺基以外的活性基团即羟基或羧基受到保护，且这些保护基将在聚乙二醇化后通过裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)除去Boc期间的某时刻被除去。
除所述方法外，本发明可衍生出多种方法，而这些方法也包含于本发明中。
此外，根据本发明合成的肽可直接用于聚乙二醇化，或者若有必要，在经过附加的用最终胺基保护基保护非靶位点胺基包括的Nα-胺基的步骤后，应用于聚乙二醇化中。此时，最终胺基保护基可以是至少一种选自以下组中的保护基：Fmoc、Nsc、Dde[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]、ivDde或其它在碱性条件下可除去的保护基，或至少一种选自以下组中的保护基：Boc或其它在酸性条件下可除去的保护基。
本发明还包括通过将肽分成两个或更多个片段分别合成以提高肽合成效率，并将这些片段缩合以产生其中非靶位点胺基得以保护的肽的方法。甚至在这种情况下，胺基的保护一解封闭都与前述相同，然而，由于在片段的缩合期间可能发生外消旋作用，因而该方法可有效地用于氨基酸序列中包含缩合时不会外消旋化的Gly或Pro的肽，并可更有效地用于难以合成或纯化的肽。在该方法中，例如，肽的合成是通过将肽分成两个片段来实施，即一条从N-端到Gly或Pro的片段，以及另一条从随后的氨基酸到C-端的片段，且这两条片段经缩合形成肽。用于合成具有N-端区域的片段的树脂应该对酸极为敏感，从而可使用TRT系列树脂，片段合成一经完成，就于酸性条件下从树脂上分离该片段而同时仍保留其它保护基。可使用常规树脂合成含C-端区域的片段，并在结合于树脂时与N-端片段缩合，然后从树脂上分离，或者用酸敏感型树脂合成C-端片段，从树脂上分离下来而保留保护基，然后在溶液相中与N-端片段进行缩合。如果使用酸敏感型树脂且以Mtt作为支链胺基保护基合成片段，然后从树脂上分离，则该分离可在下列条件下实施以使Mtt不被除去，AcOH∶TFE(2，2，2-三氟乙醇)∶MC(1∶1∶8)或TFE∶MC(2∶8)。如果N-端片段种的非靶位点支链胺基是用ivDde保护，在缩合完成后从树脂上分离具有完整序列的肽之前，可用Fmoc或Nsc取代保护基。另外，如果靶位点胺基出现在N-端片段上，则应该在不会除去Boc的条件下实施从树脂上的分离。通过使用与连续合成中相同的方法来合成C-端片段。
作为可在本发明中使用的肽的合成方法，只要与本发明兼容，就无特殊限制，但优选使用固相肽合成法。
作为本发明可适用的肽，只要是具有至少两个支链胺基的肽就无特殊限制。本发明将有效用于需要通过将PEG结合到其特定位点以延长生物半衰期或降低免疫原性或抗原性的肽类。可列举降钙素或GRF(1-29)为实例。
具有经保护的非靶位点胺基的肽使得能够完全特异性地将肽聚乙二醇化。将以Fmoc、Nsc、Boc或其它在聚乙二醇化条件下稳定的胺基保护基保护非靶位点胺基的肽与经活化的PEG反应导致PEG仅特异性地结合于靶位点处的胺基，且该反应几乎可以根据其当量比和反应条件完成。对这种经保护的肽-PEG结合物(将PEG结合到靶位点胺基而非靶位点胺基被保护基保护)实施解封闭{例如，5％哌啶/DMF条件用于Fmoc或Nsc保护基，裂解溶液(TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)用于Boc保护基}导致生成其中PEG特异性地结合于靶位点胺基的肽。
因此，本发明的另一个具体实施方案为制备其中PEG特异性地结合到靶位点胺基上的特异性PEG结合肽的方法，其包括(1)使其中非靶位点胺基被选择性地保护的肽与PEG反应，以及(2)在酸-碱解封闭条件下除去如此得到的化合物的胺基保护基。
经证实，所述反应混合物不含其它肽衍生物，且经离子交换色谱除去未结合的PEG及被释放的保护基，并经反相树脂(例如，Sep-Pak柱)脱盐并经冷冻干燥可以获得高纯度、特异性结合的PEG肽。
能与根据本发明制备的非靶位点胺基被选择性保护的肽相结合的经活化的PEG无特殊的限制，并包括上述所有的PEG，但优选为线性或支化的羟基或甲氧基型烷基化或酰化的分子量为1,000-40,000的PEG，更优选地，可使用至少一种选自以下组中的物质：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺氨基甲酸酯以及单甲氧基聚乙二醇tresylate。
本发明的特异性地结合的PEG-肽可配制成包含治疗有效量的肽的药物剂型。可使用如注射剂、输液、储库型注射剂、吸入剂等剂型，并且可以添加缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂、着色剂和矫味剂。
附图说明
图1为实施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素和比较例1(A)中单PEG 2K-鲑鱼降钙素的反相色谱图。
图2为鲑鱼降钙素(A)和实施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的Lys-C酶处理片段的MALDI-TOF质谱图。
图3为鲑鱼降钙素(A)和实施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的MALDI-TOF质谱图。
图4为GRF(1-29)(A)和实施例23(B)中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的反相色谱图。
图5为实施例23中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的MALDI-TOF质谱图。
图6为GRF(1-29)(A)以及实施例23中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)(B)的Lys-C酶处理片段的MALDI-TOF质谱图。
具体实施方案
以下通过实施例举例说明本发明的详细方法。然而，这些实施例并非意图限制本发明的范围。
实施例
本发明实施例中使用的缩略语含义如下。
Ac＝乙酰基、Ac2O＝乙酸酐、AcCN＝乙腈、AcOH＝乙酸、Bop＝苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻、Clt＝2-氯三苯甲基、DCM＝二氯甲烷、DIC＝1，3-二异丙基碳二亚胺、DIPEA＝N，N-二异丙基乙胺、DMSO＝二甲基亚砜、EDT＝1，2-乙二硫醇、EtOAc＝乙酸乙酯、HBTU＝N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲烷六氟磷酸铵N-氧化物、HOBt＝1-羟基苯并三唑、Pbf＝2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基、PyBop＝苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)六氟磷酸鏻、SPPS＝固相肽合成、TBTU＝N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基甲烷四氟硼酸铵N-氧化物、tBu＝叔丁基、TEA＝三乙胺，以及Trt＝三苯甲基。
实施例1.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素的连续合成
结构：Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表1]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  -  -  -  -  4.0
DCM*  -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有的洗涤)*  -  -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  -  -  -  -  240
DCM  -  -  -  -  160
Fmoc-Osu  337.3  5.0  10.0  3.37  -
氧化作用
0.1M碘的DMF溶液  -  -  -  -  50.0
DMF(用于氧化)  -  -  -  -  50.0
1.0M抗坏血酸的DMF溶液  -  -  -  -  250
DMF  -  -  -  -  310
DCM  -  -  -  -  60
MeOH  -  -  -  -  60
庚烷  -  -  -  -  60
断裂
TFA  -  -  -  -  86
TIS  -  -  -  -  2.0
水  -  -  -  -  2.0
乙醚  -  -  -  -  1100
*指用于每个偶联周期的量
根据以下反应顺序合成肽。
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Cys(trt)
将2.0g结合-酰胺树脂投入50ml肽反应器中，倒入20ml DCM，放置30min使树脂充分膨胀。以过滤除去溶液。加入20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)，反应5min(该过程重复2次)以除去Fmoc，再用20ml DMF洗涤5至7次。除去剩余哌啶和二苯并富烯，并用氯醌试验确证[该试验可用于测定Nsc或Fmoc相关的加合物及残留哌啶是否被完全除去。通过将一滴饱和氯醌的甲苯溶液滴加到大约1ml丙酮中制得该试液。可通过将一滴洗涤液滴加到氯醌试液中检测DMF洗涤。蓝色或紫色是仲胺存在的阳性标志]。
为引入降血钙素的C-端氨基酸，将Pro、Nsc-Pro-OH(1.5当量)、Bop(1.5当量)、HOBt(1.5当量)以及DIPEA(1.5当量)溶于4ml DMF和8ml DCM中，然后投入含有树脂的所述反应器中。将该反应液再用8ml DCM洗涤、加入至反应器中、另外加入DIPEA(1.5当量)、用适当的搅拌器搅拌并在35℃-40℃下反应1h。通过Kaiser试验确定反应终点[取2-10mg树脂样品并用乙醇洗涤，用定性的茚三酮试验检查反应是否完全。向样品中加入2滴80％苯酚溶液、2滴0.02mM KCN的吡啶溶液和2滴5％的茚三酮乙醇溶液。将样品置于约120℃的 加热块中4至6分钟。蓝色或紫色为存在游离胺基的阳性标记]，如果反应未完成，则使该反应液再反应30分钟至1小时。反应完成时，滤除反应液、用3×20mlDMF洗涤、与解封闭溶液(2×20ml)反应，每次5分钟，并用DMF彻底洗涤。
氨基酸的连续引入是按照上述方法进行的，且该反应从降血钙素的C-端Pro32开始，依次进行，当引入被保护的氨基酸后，使用解封闭溶液反复实施Nsc或Fmoc的除去。当引入Nsc-Cys(Trt)后，将该肽与3×20ml 2％的肼溶液反应10-30分钟以除去ivDde和Nsc，然后过滤树脂，用4×20ml DMF、4×20ml DCM、及4×20ml DMF充分洗涤。将溶于20mlDMF中的Fmoc-Osu(5.0当量)投入反应器中，彻底混合1至2h使Fmoc被分别引入至1位与11位的胺基上。通过Kaiser试验检测反应进程，当确定反应完成时，滤除去反应液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗涤，氮气流下干燥得8.5g结合肽的树脂。
1，7二硫键可通过I2氧化生成。将如上述得到的肽树脂投入至150ml可过滤的肽反应器中，倒入50ml DMF并保持平衡30分钟。再将0.1 MI2在50ml DMF中的溶液加入至反应器中，充分混合2小时以实施氧化。反应进行用HPLC监控，反应完成时，过滤并用5×50ml DMF和5×50ml抗坏血酸洗涤，每次5分钟，以完全除去残留的I2。此外，用3×20ml DMF、3×20ml DCM、3×20ml MeOH以及3×20ml庚烷洗涤该肽树脂，氮气下干燥，真空干燥6小时得8.1g干燥的结合肽的树脂。
将所述干燥的树脂与80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在 常温下反应1.5小时，除去树脂并将所得肽用约10ml TFA洗涤。收集洗液和滤液并加入至500ml乙醚中，经离心沉淀所形成的漂浮物，此外还通过离心用3×200ml乙醚洗涤。沉淀物在氮气下干燥得4.8g干燥的肽混合物，该混合物经制备HPLC纯化，经冷冻干燥得896mg 1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素。该实施例中制备的肽的靶位点是Lys18的胺基。
[制备HPLC的纯化条件]
Vydac protein&peptide-C18，20×250mm，5μ，300A
TFA缓冲的AcCN及水梯度
[肽的分析条件1]
仪器：Waters Alliance
流速：1.0ml/min
梯度：0-45min，B 0-100％(A：0.1％TFA的水溶液，B：0.1％TFA的AcCN溶液)
色谱柱：Nova-Pak-C18，3.9mm×150mm，5μ，100A
[质谱分析条件]
仪器：Voyager DE-STR Maldi Tof Mass(透视(perspective))
操作模式：反射式
提取模式(Extraction mode)：延时的
极性：正极
基质：α-氰基-4-羟基苯乙烯酸
Maldi Tof；3877.43，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例2.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素的连续合成
结构：Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表2]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂 -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸* -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH 574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA* 129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop* 442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt* 135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF* -  -  -  -  4.0
DCM* -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*   -  -   -   - 40.0
DMF(用于所有洗涤)*   -  -   -   - 20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -  -   -   - 60.0
DMF   -  -   -   - 240
DCM   -  -   -   - 160
Fmoc-Osu   337.3  5.0   10.0   3.37 -
氧化作用
0.1M碘的DMF溶液   -  -   -   - 50.0
DMF(用于氧化)   -  -   -   - 50.0
1.0M抗坏血酸的DMF溶液   -  -   -   - 250
DMF   -  -   -   - 310
DCM   -  -   -   - 60
MeOH   -  -   -   - 60
庚烷   -  -   -   - 60
断裂
TFA   -  -   -   - 86
TIS   -  -   -   - 2.0
水   -  -   -   - 2.0
乙醚   -  -   -   - 1100
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Cys(trt)
如实施例1所述，按照上述表格以及氨基酸的反应顺序实施反应。在实施除去ivDde和引入二Fmoc以及碘氧化时，结合肽的树脂为8.2g，并用实施例1中所述的TFA-裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)处理及用制备HPLC纯化得892mg 1，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3877.33，(M+1＝3877.44)HPLC；97％以上(肽分析条件1)
实施例3.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的11，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素的连续合成
结构：H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表3]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂 -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸* -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH×2 574.6  1.5  1.5  1.72  -
Boc-Cys(trt)-OH 463.6  1.5  1.5  0.695  -
DIPEA* 129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop* 442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt* 135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF* -  -   -  -  4.0
DCM* -  -   -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液* -  -   -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)* -  -   -  -  20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液 -  -   -  -  60.0
DMF -  -   -  -  240
DCM -  -   -  -  160
Fmoc-Osu 337.3  5.0  10.0  3.37  -
氧化作用
0.1M碘的DMF溶液 -  -   -  -  50.0
DMF(用于氧化) -  -   -  -  50.0
1.0M抗坏血酸的DMF溶液 -  -   -  -  250
DMF -  -   -  -  310
DCM -  -   -  -  60
MeOH -  -   -  -  60
庚烷 -  -   -  -  60
断裂
TFA -  -   -  -  86
TIS -  -   -  -  2.0
水 -  -   -  -  2.0
乙醚 -  -   -  -  1100
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Boc-Cys(trt)。
如实施例1所述，按照上表以及氨基酸的反应顺序实施反应。在实施ivDde的除去和二Fmoc的引入以及碘氧化时，结合肽的树脂为8.2g，并用实施例1中所述的TFA-裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)处理及用制备HPLC纯化得890mg 11，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3877.23，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)实施例4.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的连续合成
结构：Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表4]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  73.10  -  -  -  4.0
DCM*  84.93  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10  -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  73.10  -  -  -  240
DCM  84.93  -  -  -  160
Fmoc-Osu   337.3  5.0  10.0   3.37   -
断裂(树脂1g)
TFA   114.02  -  -   -   11.5
TIS   158.36  -  -   -   0.25
水   18.02  -  -   -   0.25
EDT   94.02  -  -   -   0.157
TMS-Br   153.10  -  -   -   0.130
乙醚   74.12  -  -   -   250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
将2.0g结合-酰胺树脂投入50ml肽反应器中，倒入20ml DCM，放置30分钟使树脂充分膨胀。经过滤除去溶液。加入20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)，反应5分钟以除去Fmoc(该过程重复2次)，再用20ml DMF洗涤5-7次。除去剩余的哌啶和二苯并富烯，并通过氯醌试验确证。
将Arg、Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5当量)、Bop(1.5当量)、HOBt(1.5当量)以及DIPEA(1.5当量)溶于2ml DMF和8ml DCM中并投入至包含树脂的反应器中，以引入GRF(1-29)的C-端氨基酸。将该反应液再用8ml DCM洗涤并倒入反应器中，再加入DIPEA(1.5当量)，用适当的搅拌器搅拌并于35℃-40℃下反应1小时。通过Kaiser试验确定反应终点，如果反应未完成，使反应液再反应30分钟至1小时。反应完成时，经过滤除去反应液，用3×20ml DMF洗涤，与解封闭溶液(2×20ml)反应，每次5分钟，并用DMF彻底洗涤。
以如上所述的方法进行氨基酸的连续引入，反应从GRF(1-29)的C-端Arg开始并依次进行，当引入被保护的氨基酸后，反复使用解封闭溶液除去Nsc或Fmoc。当引入Nsc-Tyr(tBU)后，与3×20ml 2％的肼溶液反应，每次10-30分钟以除去ivDde和Nsc，然后过滤树脂，并用4×20mlDMF、4×20ml DCM和4×20ml DMF充分洗涤。将溶于20ml DMF的Fmoc-Osu(5.0当量)投入反应器中，彻底混合1至2小时使Fmoc被分别引入至1位与12位的胺基上。通过Kaiser试验检查反应进程，当确定反应完全时，经过滤除去反应液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗涤，氮气流下干燥得8.5g结合肽的树脂。
取出所述干燥树脂1g并与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应1.5小时，再与TMS-Br和EDT反应15分钟。经过滤除去树脂，并用2ml TFA洗涤该树脂。收集洗液和滤液并加入至100ml乙醚中，经离心以沉淀所形成的漂浮物，此外还通过离心用3×50ml乙醚洗涤。沉淀物在氮气下干燥得690mg干燥的肽混合物，该混合物经制备HPLC纯化、冷冻干燥得116mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.39，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析条件1)
实施例5.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，21-二Fmoc-GRF(1-29)的连续合成
结构：Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表5]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF* 73.10  -  -  -  4.0
DCM* 84.93  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液* -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)* 73.10  -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液 -  -  -  -  60.0
DMF 73.10  -  -  -  240
DCM 84.9933  -  -  -  160
Fmoc-Osu 337.3  5.0  10.0  3.37  -
断裂(树脂1g)
TFA 114.02  -  -  -  11.5
TIS 158.36  -  -  -  0.25
水 18.02  -  -  -  0.25
EDT 94.02  -  -  -  0.157
TMS-Br 153.10  -  -  -  0.130
乙醚 74.12  -  -  -
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Ath(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂实施反应。按照如实施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通过使用Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)实施二Fmoc的引入，且在反应后，得7.9g干燥树脂。取出1g如此得到的肽树脂与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反应1.5h，加入另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)至反应液中并再搅拌15分钟。反应液经如实施例4中所述的乙醚处理得710mg肽混合物，通过制备HPLC纯化，得86mg 1，21-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.59，(M+1＝3803.46)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例6.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的12，21-二Fmoc-GRF(1-29)的连续合成
结构：H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表6]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  - 1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  - 1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6 1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3 3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3 1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1 1.5  1.5  0.135  -
DMF*  73.10 -  -  -  4.0
DCM*  84.93 -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  - -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10 -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液  - -  -  -  60.0
DMF  73.10 -  -  -  240
DCM  84.93 -  -  -  160
Fmoc-Osu  337.3 5.0  10.0  3.37  -
断裂(树脂1g)
TFA  114.02 -  -  -  11.5
TIS  158.36 -  -  -  0.25
水  18.02 -  -  -  0.25
EDT  94.02 -  -  -  0.157
TMS-Br  153.10 -  -  -  0.130
乙醚  74.12 -  -  -  250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Boc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂实施反应。按照如实施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通过使用Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)实施二Fmoc的引入，且在反应后，得到8.4g干燥树脂。取出1g如此得到的肽树脂与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反应1.5h，并加入另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)至反应液中并再次搅拌15分钟。反应液经如实施例4所述的乙醚处理得710mg肽混合物，通过制备HPLC纯化得86mg 12，21-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.59，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析条件1)
实施例7.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二Nsc-GRF(1-29)的连续合成
结构：Nsc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Nsc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表7]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0   1.0   2.0   -
Nsc-氨基酸*  -  1.5   1.5   -   -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5   1.5   0.861   -
DIPEA*  129.3  3.0   3.0   0.387   0.52
Bop*  442.3  1.5   1.5   0.442   -
HOBt*  135.1  1.5   1.5   0.135   -
DMF*  73.10  -   -   -   4.0
DCM*  84.93  -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10  -   -   -   20.0
二-Nsc的引入
2％水合肼的DMF溶液  -  -   -  -  60.0
DMF  73.10  -   -  -  240
DCM  84.93  -   -  -  160
Nsc-Osu  337.3  5.0  10.0  3.72  -
断裂(树脂1g)
TFA  114.02  -   -  -  11.5
TIS  158.36  -   -  -  0.25
水  18.02  -   -  -  0.25
EDT  94.02  -   -  -  0.157
TMS-Br  153.10  -   -  -  0.130
乙醚  74.12  -   -  -  250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂进行合成。按照如实施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通过使用Nsc-Osu(3.72g在20ml DMF中的溶液)实施二Nsc的引入，且在反应后，得到8.1g干燥树脂。取出1g如此得到的肽树脂与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反应1.5h，将另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)加入至反应液中并再次搅拌15分钟。反应液经如实施例4中所述的乙醚处理得700mg肽混合物，通过制备HPLC纯化得136mg 1，12-二Nsc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3874.46，(M+1＝3874.39)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例8.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二(ivDde)-GRF(1-29)的连续合成
结构：ivDde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20 Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表8]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂 -  1.0  1.0  2.0   -
Nsc-氨基酸* -  1.5  1.5  -   -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH 574.6  1.5  1.5  0.861   -
DIPEA* 129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop* 442.3  1.5  1.5  0.442   -
HOBt* 135.1  1.5  1.5  0.135   -
DMF* 73.10  -  -  -  4.0
DCM* 84.93  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液* -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)* 73.10  -  -  -  20.0
ivDde的引入
DMF 73.10  -  -  -  20
ivDde-OH(2-异戊酰基双甲酮) 226.3  -  -  1.0
断裂(树脂1g)
TFA 114.02  -  -  -  11.5
TIS 158.36  -  -  -  0.25
水 18.02  -  -  -  0.25
EDT 94.02  -  -  -  0.157
TMS-Br 153.10  -  -  -  0.130
乙醚 74.12  -  -  -  250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂进行合成。在与Nsc-Tyr(tBu)反应并除去Nsc后，通过与2-异戊酰基双甲酮(1.0g在20ml DMF中的溶液)反应12小时实现将ivDde引入N-端，反应结果得8.1g干燥树脂。取出1g肽树脂与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反应1.5h，将另外的EDT(0.130ml)和TMS-Br(0.157ml)加入至反应液中并再次搅拌15分钟。该反应液经如实施例4中所述的乙醚处理得680 mg肽混合物，通过制备HPLC纯化得97mg 1，12-二ivDde-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3771.39，(M+1＝3771.55)HPLC；94％以上(肽分析条件1)
实施例9.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二Boc-GRF(1-29)的连续合成
实施例9-1.21-Nsc-GRF(1-29)的合成
结构：H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Nsc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表9]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  73.10  -  -  -  4.0
DCM*  84.93  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10  -  -  -  20.0
Nsc的引入
2％水合肼的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  73.10  -  -  -  240
DCM  84.93  -  -  -  160
Nsc-Osu  372.3  5.0  10.0  3.72  -
断裂(树脂1g)
 TFA  114.02 - - -  80
 TIS  158.36 - - -  2.0
 水  18.02 - - -  2.0
 EDT  94.02 - - -  1.26
 TMS-Br  153.10 - - -  1.04
 乙醚  74.12 - - -  2000
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Boc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂进行合成。按照如实施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通过使用Nsc-Osu(3.72g在20ml DMF中的溶液)完成Nsc的引入，反应后，得7.5g干燥树脂。将如此得到的肽树脂与80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反应1.5h，将另外的EDT(1.26ml)以及TMS-Br(1.04ml)加入至反应液中并再次搅拌15分钟。反应液经如实施例4中所述的乙醚处理得4.1g肽混合物，通过制备HPLC纯化得520mg 21-Nsc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3616.39，(M+1＝3616.17)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例9-2.1，12-二Boc-GRF(1-29)的合成
结构：Boc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表10]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
21-Fmoc-GRF(1-29)  -  1.0   0.1   0.36  -
Boc2O  218.3   1.0
DMF  -  -   -   -  10
5％Na2CO3  -  -   -   -  10
己烷  -  -   -   -  150
甲基叔丁基醚(MTBE)  -  -   -   -  60
将360mg合成的21-Nsc-GRF(1-29)与5ml DMF投入具有磁力搅拌器的25ml单颈反应器中并溶解。通过使用氮气使该反应物被置于隔绝空气的环境中，以冰浴使温度降至0-5℃，0-5℃下向反应液中逐滴加入Boc2O(1g/5ml DMF)，维持该温度约10分钟，移除冰浴使温度缓慢升至常温。维持搅拌3-4小时，每小时收集样品用HPLC(肽分析条件1)监控反应进程。反应完成时，边搅拌边向反应液中逐滴加入10ml 5％Na2CO3以免产生沉淀。反应进行大约30分钟并用HPLC检测Nsc的去除进程。将反应液浓缩至1/4体积，用150ml己烷洗涤得到粘性油状物。向该油状物中倒入20ml MTBE并放置12小时以形成沉淀，该沉淀经离心分离。再用2×20ml MTBE洗涤并在氮气下干燥得330mg 1，12-二Boc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3559.21，(M+1＝3559.20)HPLC；92％以上(肽分析条件1)
实施例10.使用Dde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二(Dde)-GRF(1-29)的连续合成
结构：Dde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Dde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表11]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  - 1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  - 1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(Dde)-OH  532.6 1.5  1.5  0.799  -
DIPEA*  129.3 3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3 1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1 1.5  1.5  0.135  -
DMF*  73.10 -  -  -  4.0
DCM*  84.93 -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  - -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10 -  -  -  20.0
Dde的引入
DMF  73.10 -  -  -  20
Dde-OH(2-乙酰基双甲酮)  184.2 -  -  1.0  -
断裂(树脂1g)
TFA  114.02 -  -  -  11.5
TIS  158.36 -  -  -  0.25
水  18.02 -  -  -  0.25
EDT  94.02  0.157
TMS-Br  153.10  0.130
乙醚  74.12 -  -  -  250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(Dde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
如实施例4所述，用上表给出的试剂和溶剂进行合成。在与Nsc-Tyr(tBu)反应并除去Nsc后，可通过与2-乙酰基双甲酮(1.0g在20ml DMF中的溶液)反应6小时以将Dde引入至N-端，反映后得8.8g干燥树脂。取出1g该肽树脂并与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反应1.5h，将另外的EDT(0.130ml)和TMS-Br(0.157ml)加入至反应液中并再搅拌15分钟。该反应液经如实施例4中所述的乙醚处理得590mg肽混合物，通过制备HPLC纯化得104mg 1，12-二Dde-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3687.69，(M+1＝3687.55)HPLC；95％以上(肽分析条件1)
实施例11.使用Mtt作为非靶位点支链胺基保护基的1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素的连续合成
结构：Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表12]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(Mtt)-OH  624.8  1.5  1.5  0.937  -
Fmoc-Cys(Trt)-OH  585.7  1.5  1.5  0.879  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  -  -  -  -  4.0
DCM*  -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  -  -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
1％TFA的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  -  -  -  -  260
DCM  -  -  -  -  160
Fmoc-Osu  337.3  5.0  10.0  3.37  -
氧化作用
0.1M碘的DMF溶液  -  -  -  -  50.0
DMF(用于氧化)  -  -  -  -  50.0
1.0M抗坏血酸的DMF溶液  -  -  -  -  250
DMF  -  -  -  -  310
DCM  -  -  -  -  60
MeOH - - - -  60
庚烷 - - - -  60
断裂
TFA - - - -  86
TIS - - - -  2.0
水 - - - -  2.0
乙醚 - - - -  1100
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(Mtt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(trt)
将2.0g结合-酰胺树脂投入50ml肽反应器中，倒入20ml DCM，放置30分钟使树脂充分膨胀，经过滤除去溶液。通过与2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)反应，每次5分钟以除去Fmoc，并用20ml DMF洗涤5-7次。除去剩余哌啶和二苯并富烯，并通过氯醌试验确证。
将Pro、Nsc-Pro-OH(1.5当量)、Bop(1.5当量)、HOBt(1.5当量)和DIPEA(1.5当量)溶于4ml DMF和8ml DCM中并投入至包含树脂的反应器中以引入降血钙素的C-端氨基酸。将该反应液再用8ml DCM洗涤并加入至反应器中，加入另外的DIPEA(1.5当量)，用适当的搅拌器搅拌并于35℃-40℃反应约1小时。通过Kaiser试验确定反应终点，如果反应未完成，使反应液再反应30分钟至1小时。反应完成时，经过滤除去反应液，用3×20ml DMF洗涤，与解封闭溶液(2×20ml)反应，每次5分钟并用DMF彻底洗涤。
氨基酸的连续引入如上述方法进行，且反应从降钙素C-端Pro32开始并依次进行，按顺序重复偶联反应与解封闭。上述重复的反应，偶联反应与解封闭可通过自动化仪器进行。最后，在将Fmoc-Cys(Trt)引入至N-端后，用DCM洗涤树脂。将该树脂与3×20ml 1％TFA溶液反应，每次10-30分钟，以除去11位的Mtt。通过基于反应液相对于空白对照对UV和TFA烟雾的反应活性的TLC分析可确证Mtt的除去。反应完成时，将树脂过滤并用4×20ml DMF、4×20ml DCM以及4×20ml DMF充分洗涤。将溶于20ml DMF中的Fmoc-OSu(5.0当量)投入反应器中，彻底混合1-2小时以使Fmoc被引入至11位的Lys。通过Kaiser试验检测反应进程，当确定反应完成时，过滤除去反应液，用4×20ml DMF和4×20mlDCM充分洗涤，并在氮气流下干燥得8.5g结合肽的树脂。
1，7二硫键可通过I2氧化生成。将如上述得到的肽树脂投入至150ml可过滤的肽反应器中，倒入50ml DMF并保持平衡30分钟。将另外的0.1M I2在50ml DMF中的溶液加入至反应器中，充分混合2小时以进行氧化。反应进程用HPLC监控，反应完成时，过滤并用5×50ml DMF和5×50ml抗坏血酸洗涤，每次5分钟，以完全除去残留的I2。此外，将所得产物用3×20ml DMF、3×20ml DCM、3×20ml MeOH以及3×20ml庚烷洗涤，在氮气下干燥，真空干燥6小时得8.1g干燥的结合肽的树脂。
将该干燥树脂与80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应1.5小时，除去树脂并用约10ml TFA洗涤。收集洗液和滤液并加入至500ml乙醚中，离心使形成的沉淀物得以沉淀，再次离心并用3×200ml乙醚洗涤。将沉淀物在氮气下干燥得4.8g干燥的肽混合物，该混合物经制备HPLC纯化、冷冻干燥得896mg 1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3877.43，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例12.使用Mtt作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的连续合成
结构：Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表13]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(Mtt)-OH  624.8  1.5  1.5  0.937  -
Fmoc-Tyr(tBu)-OH  459.6  1.5  1.5  0.689  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  73.10  -  -  -  4.0
DCM*  84.93  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  73.10  -  -  -  20.0
二-Fmoc的引入
1％TFA的DCN溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  73.10  -  -  -  260
DCM  84.93  -  -  -  160
Fmoc-Osu  337.3  5.0  10.0  3.37  -
断裂(树脂1g)
TFA  114.02  -  -  -  11.5
TIS  158.36  -  -  -  0.25
水  18.02  -  -  -  0.25
EDT  94.02  -  -  -  0.157
TMS-Br  153.10  -  -  -  0.130
乙醚  74.12  -  -  -  250
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(Mtt)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Fmoc-Tyr(tBu)
将2.0g结合-酰胺树脂投入50ml肽反应器中，倒入20ml DCM，放置30分钟使树脂充分膨胀。经过滤除去溶液。通过与2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)反应以除去Fmoc，每次5分钟，并用20ml DMF洗涤5-7次。剩余哌啶和二苯并富烯的除去通过氯醌试验确证。
将Arg、Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5当量)、Bop(1.5当量)、HOBt(1.5当量)以及DIPEA(1.5当量)溶于4ml DMF和8ml DCM中，并投入至包含树脂的反应器中，以引入GRF(1-29)的C-端氨基酸。将该反应液再用8ml DCM洗涤并加入反应器中，加入另外的DIPEA(1.5当量)，用适当的搅拌器彻底搅拌并于35℃-40℃下反应1小时。通过Kaiser试验确定反应终点，如果反应未完成，使反应液再反应30分钟至1小时。反应完成时，经过滤除去反应液，用3×20ml DMF洗涤，与解封闭溶液(2×20ml)反应每次5分钟，并用DMF彻底洗涤。
氨基酸的连续引入如上述方法进行，反应从GRF(1-29)C-端Arg开始并依次进行，且按顺序重复偶联反应与解封闭。上述重复的反应，偶联反应与解封闭可使用自动化仪器实施。在Fmoc-Tyr(tBU)被引入至N-端后，用DCM洗涤该树脂并于20ml DCM中浸泡15分钟。除去DCM后，将树脂与3×20ml 1％TFA溶液每次反应10-30分钟以除去12位的Mtt。通过基于反应液相对于空白对照的UV和TFA烟雾反应活性的TLC分析确证Mtt的除去。反应完成时，将树脂过滤，并用4×20ml DMF、4×20ml DCM和4×20ml DMF充分洗涤。将溶于20ml DMF的Fmoc-OSu(5.0当量)投入反应器中，彻底混合1-2小时使Fmoc被引入至12位的Lys。通过Kaiser试验检查反应进程，当确定反应完成时，经过滤除去反应液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗涤，在氮气流下干燥得到8.5g结合肽的树脂。
取出1g干燥的树脂并与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应1.5小时，再与TMS-Br和EDT反应15分钟。经过滤除去树脂，并用2ml TFA洗涤树脂。收集洗液和滤液并加入至100ml乙醚中，经离心沉淀所形成的漂浮物，再次离心并用3×50ml乙醚洗涤。将沉淀物在氮气下干燥得690mg干燥的肽混合物，该混合物经制备HPLC纯化、冷冻干燥得116mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.39，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析条件1)
实施例13.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
实施例13-1.Nsc-Gly-2-ClTrt-树脂的合成
[表14]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
2-氯三苯甲基树脂  -  -  -  10.0  -
Nsc-Gly  332.30  1.0  10.0  3.32
DIPEA  129.30  3.0  30.0  3.88  9.22
DCM  768
MeOH  8
将10g 2-CLTR树脂投入至250ml肽反应器中，倒入100ml DCM，使树脂充分膨胀30分钟，然后经过滤除去溶液。将Nsc-Gly-OH(3.32g)与DIPEA(5.22ml)溶于100ml DCM中，将该溶液投入至包含树脂的反应器中，在常温下混合约1小时以使反应进行。经过滤除去反应液，用100ml DCM洗涤，与80ml DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)反应20分钟从而通过以MeOH取代除去树脂的活性基团。在用4×100ml DCM洗涤后，在氮气下干燥得13.1g Nsc-Gly-CLTR{UV-光谱分析(仪器：BioRad Smart Spec 3000，Nsc的消光系数：300nm处2000cm-1M-1；容量：0.61mmol/g)}。
实施例13-2.Nsc-AAsCt(1-10)-OH的合成
结构：Nsc-Cys1-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys7-Val-Leu-Gly10-OH(1，7-二硫键)
[表15]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
Nsc-Gly-2-CLTR  -   1.0   5.0   8.2
Nsc-氨基酸*  -   1.5   7.5   -  -
DIPEA*  129.3   3.0   15.0   1.94  2.61
Bop*  442.3   1.5   7.5   3.32  -
HOBt*  135.1   1.5   7.5   1.01  -
DMF*  -   -   -   -  4.0
DCM*  -   -   -   -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -   -   -   -  100
DMF(用于所有洗涤)*  -   -   -   -  50.0
氧化作用
0.1M碘的DCM溶液  -   -   -   -  250.0
DCM(用于氧化)  -   -   -   -  250.0
DMF  -   -   -   -  800
MeOH  -   -   -   -  300
DCM  -   -   -   -  300
庚烷  -   -   -   -  300
断裂
TFA  -   -   -   -  2.0
吡啶  2.0
DCM  -   -   -   -  250
乙醇  -   -   -   -  50
水  -   -   -   -  200
将8.2g上述合成的Nsc-Gly-2-CLTR(容量0.61mmol/g)投入至200ml肽反应器中，倒入50ml DCM并放置30分钟使反应混合物达到平衡。经过滤除去DCM，并与2×50ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反应5分钟，再用5×50ml DMF彻底洗涤。根据肽的序列，用上表中所列试剂从C-端开始如实施例1所述重复进行偶联与解封闭。反应顺序为Leu、Val、Cys(Trt)、Thr(tBu)、Ser(tBu)、Leu、Asn(Trt)、Ser(tBu)和Cys(Trt)，并且在Nsc-Cys(Trt)-OH缩合后，不除去Nsc以用于后续反应。
1，7二硫键可通过I2氧化生成。将上述所得的肽树脂投入至800ml可过滤的肽反应器中，倒入250ml DCM，并保持平衡30分钟。将另外的0.1M I2在250ml DCM中的溶液加入至反应器中，充分混合2小时以进行氧化，反应进程用HPLC监控(肽分析条件2)，反应完成时过滤并用5×100ml DMF洗涤，每次10min，以完全除去残留的I2。此外，将该反应产物用3×100ml DMF、3×100ml DCM、3×100ml MeOH以及3×100ml庚烷洗涤，在氮气下干燥，真空干燥6小时得16.9g干燥的结合肽的树脂。
在温和的酸性条件下释放该肽并保留保护基，用150ml 1％TFA在DCM中的溶液处理该肽2分钟并过滤，并将所得溶液用100ml 0.5％TFA的DCM溶液处理1分钟，立即用与TFA消耗量等量的吡啶中和该溶液。溶液经真空浓缩至1/4体积，以50ml乙醇处理，并经再次浓缩至终体积约为50ml。向该溶液中加入水(100ml)生成沉淀，并通过离心分离沉淀，用2×50ml水洗涤沉淀。该沉淀经真空充分干燥得6.8gNsc-AAsCt(1-10)-OH(HPLC纯度93％)。
[肽分析条件2]
仪器：Waters Alliance
流速：1.0ml/min
梯度：0-50min，B 40-100％(A：0.1％TFA水溶液，B：0.1％TFA的AcCN溶液)
色谱柱：Nova-Pak-C18，3.9mm×150mm，5μ，100A
Maldi Tof；1663.23，(M+1＝1662.09)HPLC；93％以上(肽分析条件2)
实施例13-3.11-Nα-Fmoc-11-ivDde-18-Boc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂的合成
结构：Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-结合酰胺树脂
[表16]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  -  -  -  -  4.0
DCM*  -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  -  -  -  -  20.0
将2.0g结合酰胺树脂投入肽反应器中，倒入20ml DCM并放置30分钟使反应达到平衡。通过与2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反应5min脱去连接在树脂上的Fmoc，并用5×20ml DMF彻底洗涤树脂。根据肽的序列，用上表中所列试剂从C-端开始如实施例1所述重复实施缩合与解封闭。反应顺序为Pro、Thr(tBu)、Gly、Ser(tBu)、Gly、Thr(tBu)、Asn(Trt)、Thr(tBu)、Arg(Pbf)、Pro、Tyr(tBu)、Thr(tBu)、Gln(Trt)、Leu、Lys(Boc)、His(Trt)、Leu、Glu(tBu)、Gln(Trt)、Ser(tBu)、Leu和Lys(ivDde)。在实施Fmoc-Lys(ivDde)-OH的缩合而保留Fmoc后，用4×20ml DMF和4×20ml DCM洗涤树脂，在氮气下干燥得6.5g结合肽的树脂(UV光谱分析；容量0.14mmol/g)。
实施例13-4.基于Nsc-AAsCt(1-10)-OH与Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂的缩合合成1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素
结构：Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表17]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
解封闭
Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) - 1.0 0.5 3.57   -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   180.0
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) -   1.0   0.5 - -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(2.2)   1662   1.5   0.75   1.25   -
DIPEA   129.3   3.0   1.5   0.194   0.26
Bop   442.3   1.5   0.75   0.332   -
HOBt   135.1   1.5   0.80   0.108   -
DMF   -   -   -   -   4.0
DCM   -   -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   20.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -   -   -   -   60.0
DMF   -   -   -   -   240
DCM   -   -   -   -   160
Fmoc-Osu   337.3   5.0   10.0   3.37   -
断裂
TFA   -   -   -   -   38
TIS   -   -   -   -   1.0
水   -   -   -   -   1.0
乙醚   -   -   -   -   500
将如上所述制备的Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.85g)投入肽反应器中，使之于30ml DCM中充分膨胀。除去反应器中的溶液，用2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次处理5分钟以除去Fmoc，并用20ml DMF充分洗涤7-9次同时用氯醌试验检测残留物的除去。
将上述制备的片段Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.25g)溶于4ml DMF中，投入HOBt(0.108g)与DIPEA(0.160ml)，使用冰浴将反应液的温度降至0-5℃。在氮气下，向反应液中投入Bop(0.332g)，充分混合10分钟，同时维持温度于0-5℃。将该反应液倒入含有树脂的肽反应器中，震荡混合10分钟，并加入DIPEA(0.100ml)。反应在常温下进行约12小时并基于Kaiser试验以及分析型HPLC(肽分析条件1)确定反应进程。反应完成时，用3×20ml DMF洗涤树脂，用2％肼3×20ml处理10-30分钟以除去对碱不稳定的Nsc和ivDde。用TLC分析确证ivDde的除去，其中该经处理溶液和2％肼溶液分别点于TLC板上并比较它们的UV吸收度。脱除完成时将树脂过滤并用4×20ml DMF、4×20ml DCM、3×20mlDMF洗涤，并加入Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)反应2小时以引入二Fmoc。通过定性Kaiser试验检测Fmoc的引入，并将该树脂用4×20ml DMF及4×20ml DCM洗涤，在氮气下干燥得4.3g结合肽的树脂。
将通过使如上所述得到的树脂与40ml TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应约2小时所得的反应液过滤，然后加入至300ml冷的乙醚中以生成肽沉淀。该沉淀经离心分离，再用2×100ml乙醚洗涤并干燥得2.6g肽混合物。该肽混合物经制备HPLC纯化、浓缩、并用冷冻干燥器干燥得1036mg 1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof； 3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例14.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，11-二Nsc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
结构：Nsc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表18]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
解封闭
Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(实施例13) - 1.0 0.5 3.57 -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   200
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上)   -   1.0   0.5   -   -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(实施例13)   1662   1.5   0.75   1.25   -
DIPEA   129.3   3.0   1.5   0.194   0.26
Bop   442.3   1.5   0.75   0.332   -
HOBt   135.1   1.5   0.80   0.108   -
DMF   -   -   -   -   4.0
DCM   -   -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   20.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   20.0
二Nsc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -   -   -   -   60.0
DMF   -   -   -   -   240
DCM   -   -   -   -   160
Nsc-OSu   372.3   5.0   10.0   3.72   -
断裂
TFA   -   -   -   -   38
TIS   -   -   -   -   1.0
水   -   -   -   -   1.0
乙醚   -   -   -   -   500
根据实施例13的方法，通过使用实施例13中制备的Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.57g)和Nsc-AAsCt(1-10)-OH以及上表中所列的溶剂和试剂实施片段的缩合，而通过与Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)反应引入二Nsc得到4.8g结合肽的树脂。将由所述结合肽的树脂与TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)所得的肽混合物分离并纯化得到1228mg 1，11-二Nsc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3947.40，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例15.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
实施例15-1.11-Nα-Nsc-11-Boc-18-ivDde-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂的合成
结构：Nsc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-结合酰胺树脂
[表19]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  -  -  -  -  4.0
DCM*  -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  20.0
DMF(用于所有洗涤)*  -  -  -  -  20.0
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)
按照与实施例13中合成Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂相同的方法进行合成，结果得到6.8g充分干燥的树脂，且通过UV光谱分析确定树脂的肽容量为0.13mmol/g(UV-光谱分析；容量0.13mmol/g)。
实施例15-2.基于Nsc-AAsCt(1-10)-OH与Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂的缩合合成1，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素
结构：Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表20]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
解封闭
Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) - 1.0 0.5 3.85 -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   200
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上)   -   1.0   0.5   -   -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(实施例13)   1662   1.5   0.75   1.25   -
DIPEA   129.3   3.0   1.5   0.194   0.26
Bop   442.3   1.5   0.75   0.332   -
HOBt   135.1   1.5   0.80   0.108   -
DMF   -   -   -   -   4.0
DCM   -   -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   20.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -   -   -   -   60.0
DMF   -   -   -   -   240
DCM   -   -   -   -   160
Fmoc-OSu   337.3   5.0   10.0   3.37   -
断裂
TFA   -   -   -   -   38
TIS   -   -   -   -   1.0
水   -   -   -   -   1.0
乙醚   -   -   -   -   500
按照与实施例13相同的方法，使用如上所述制备的Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.85g)与实施例13中合成的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)及上表中所列的溶剂和试剂实施片段的缩合，使用Fmoc-OSu引入二Fmoc得到4.2g结合肽的树脂。将由所述结合肽的树脂和TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反应所得的肽混合物分离并纯化得949mg 1，18-二Fmoc鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例16.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，18-二Nsc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
结构：Nsc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表21]
原料 分子量 当量 毫摩尔数   克数 毫升数
解封闭
Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(实施例15) -  1.0   0.5   3.85- -
DCM  30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -  -   -   -  40.0
DMF(用于所有洗涤)   -  -   -   -  200
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) -  1.0   0.5   -  -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(2.2)   1662  1.5   0.75   1.25  -
DIPEA   129.3  3.0   1.5   0.194  0.26
Bop   442.3  1.5   0.75   0.332  -
HOBt   135.1  1.5   0.80   0.108  -
DMF   -  -   -   -  4.0
DCM   -  -   -   -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -  -   -   -  20.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -  20.0
二-Nsc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -  -   -   -  60.0
DMF   -  -   -   -  240
DCM   -  -   -   -  160
 Nsc-Osu  372.3  5.0  10.0  3.72  -
断裂(树脂1g)
TFA  -  -  -  -  38
TIS  -  -  -  -  1.0
水  -  -  -  -  1.0
乙醚  -  -  -  -  500
按照实施例13中的方法，使用实施例15中制备的Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.858)、实施例13中制备的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)以及上表中所列的溶剂和试剂实施片段的缩合，使用Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)引入二Nsc得4.2g结合肽的树脂。将由所述结合肽的树脂和TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反应所得的肽混合物分离并纯化得941mg 1，18-二Nsc鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3947.41，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例17.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的11，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
实施例17-1.11-Nα-Fmoc-11，18-二(ivDde)-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂的合成
结构：Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-结合酰胺树脂
[表22]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH×2  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
 HOBt*  135.1   1.5  1.5  0.135 -
 DMF*  -   -  -  - 4.0
 DCM*  -   -  -  - 16.0
 1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -   -  -  - 20.0
 DMF(用于所有洗涤)*  -   -  -  - 20.0
反应顺序：Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)。
按照实施例13中的方法进行合成，结果得到6.1g充分干燥的树脂，并且通过UV光谱分析确定树脂的肽容量为0.15mmol/g(UV-光谱分析；容量0.13mmol/g)。
实施例17-2.通过缩合Nsc-AAsCt(1-10)-OH与Nsc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂合成11，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素
结构：H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表23]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
解封闭
Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) - 1.0 0.5 3.33   -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   180.0
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) - 1.0 0.5 - -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(实施例13)   1662   1.5   0.75   1.25   -
 DIPEA  129.3  3.0  1.5  0.194  0.26
 Bop  442.3  1.5  0.75  0.332  -
 HOBt  135.1  1.5  0.80  0.108  -
 DMF  -  -  -  -  4.0
 DCM  -  -  -  -  16.0
 1％DBU-20％哌啶的DMF溶液  -  -  -  -  40.0
 DMF(用于所有洗涤)  -  -  -  -  20.0
 N-端Boc的引入
 1％DBU-20％哌啶的DMF溶液  40.0
 (Boc)2O  218.3  5.0  2.5  0.55
 DMF  200
 二-Fmoc的引入
 2％水合肼的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
 DMF  -  -  -  -  240
 DCM  -  -  -  -  160
 Fmoc-OSu  337.3  5.0  10.0  3.37  -
 断裂(树脂1g)
 TFA  -  -  -  -  38
 TIS  -  -  -  -  1.0
 水  -  -  -  -  1.0
 乙醚  -  -  -  -  500
按照实施例13中的方法，使用之前合成的Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.33g)与实施例13中制备的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)和上表中所列的溶剂和试剂实施片段的缩合。缩合后，通过与2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反应5分钟除去Nsc，用4×20ml DMF洗涤，与过量的Boc2O(0.55g在20ml DMF中的溶液)反应以使用Boc保护N-末端，并用5×20ml DMF彻底洗涤。然后，将反应产物用3×20ml 2％肼处理10-30分钟以除去对碱不稳定的ivDde，并通过基于将反应液和2％肼的UV吸收度进行对比的TLC分析确证ivDde的除去。ivDde的除去完成时，将树脂过滤并用4×20ml DMF、4×20ml DCM、4×20ml DMF洗涤，加入Fmoc-OSu(3.37g在20ml DMF中的溶液)并反应2小时以引入二Fmoc。通过定性Kaiser试验检测二Fmoc的引入，将树脂用4×20ml DMF和4×20ml DCM洗涤，在氮气下干燥得4.5g结合肽的树脂。
将通过上述所得树脂与40ml TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应约2小时所得的反应液过滤，加入至300ml冷的乙醚中以生成肽沉淀。该沉淀经离心分离，再用2×100ml乙醚洗涤并干燥得2.6g肽混合物。该肽混合物经制备HPLC纯化、浓缩、冷冻干燥得769mg 11，18-二Fmoc-鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例18.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的11，18-二Nsc-鲑鱼降钙素的片段缩合合成
结构：H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫键)
[表24]
原料   分子量 当量 毫摩尔数   克数 毫升数
解封闭
Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(实施例17) - 1.0 0.5 3.33 -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   200
片段缩合
H-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(同上) - 1.0 0.5 -   -
Nsc-AAsCt(1-10)-OH(实施例13)   1662   1.5   0.75   1.25   -
DIPEA   129.3   3.0   1.5   0.194   0.26
Bop   442.3   1.5   0.75   0.332   -
HOBt   135.1   1.5   0.80   0.108   -
DMF   -   -   -   -   4.0
DCM   -   -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   20.0
N-端Boc的引入
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液  40.0
(Boc)2O  218.3  5.0  2.5  0.55
DMF  200
二-Nsc的引入
2％水合肼的DMF溶液  -  -  -  -  60.0
DMF  -  -  -  -  240
DCM  -  -  -  -  160
Nsc-Osu  372.3  5.0  10.0  3.72  -
断裂(树脂1g)
TFA  -  -  -  -  38
TIS  -  -  -  -  1.0
水  -  -  -  -  1.0
乙醚  -  -  -  -  500
按照实施例13的方法，使用实施例17中合成的Fmoc-AAsCt(11-32)-结合酰胺树脂(3.33g)与实施例13中制备的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)和上表中所列的溶剂和试剂实施片段的缩合。如实施例17所述引入Boc(0.55g在20ml DMF中的溶液)，除去ivDde，并使用Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)引入二Nsc得到4.3g结合肽的树脂。将所述结合肽的树脂和TFA裂解溶液反应所得的肽混合物分离并纯化得942mg1，18-二Nsc鲑鱼降钙素。
Maldi Tof；3947.39，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析条件1)
实施例19.使用ivDde作为非靶位点支链胺基保护基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的片段缩合合成
实施例19-1.Nsc-AAGRF(1-15)-OH的合成
结构：Nsc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Tyr10(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-OH
[表25]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
Nsc-Gly-2-氯三苯甲基树脂 -  1.0  5.0  8.2  -
Nsc-氨基酸*  1.5  7.5  -  -
DIPEA* 129.3  3.0  15.0  1.94  2.61
Bop* 442.3  1.5  7.5  3.32  -
HOBt* 135.1  1.5  7.5  1.01  -
DMF* -  -  -  -  4.0
DCM* -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液* -  -  -  -  100
DMF(用于所有洗涤)* -  -  -  -  50.0
断裂
TFE -  -   -  -  10
AcOH -  -   -  -  10
DCM -  -   -  -  280
乙醇  100
水  100
反应顺序：Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)
将实施例13中合成的Nsc-Gly-2-CLTR投入200ml肽反应器中，倒入50ml DCM并放置使树脂充分膨胀。经过滤除去DCM，并用2×50ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次处理5分钟以除去Nsc。然后，用DMF充分洗涤5-7次所得混合物以用于下一步反应。如实施例1所述，按照上述反应顺序使用被Nsc或Fmoc保护的氨基酸(1.5当量)、HOBt(1.5当量)、Bop(1.5当量)以及DIPEA(3.0当量)实施偶联反应。通过Kaiser试验检测反应并通过氯醌试验确证洗液中胺的存在。
将如此得到的结合肽的树脂在肽可从2-CTRL树脂上分离下来其它保护基仍被保留的条件下即，100ml DCM∶TFE∶AcOH(8∶1∶1)的条件下处理3小时，然后经过滤分离反应液并用2×100ml DCM洗涤树脂。收集反应液及洗液并浓缩至1/4体积，用100ml乙醇及100ml水稀释并于冰箱中放置12小时。如此所得的固体经过滤并干燥得12.6gNsc-AAGRF(1-15)-OH。
Maldi Tof；3144.09，(M+1＝3143.95)HPLC；92％以上(肽分析条件2)
实施例19-2.Nsc-AAGRF(16-29)-结合酰胺树脂的合成
结构：Nsc-Gln(Trt)-Leu-Ser(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Ile-Met-Ser(Trt)-Arg(Pbf)-结合酰胺树脂
[表26]
原料 分子量 当量 毫摩尔数 克数 毫升数
链组装(每个偶联周期*)
结合-酰胺树脂  -  1.0  1.0  2.0  -
Nsc-氨基酸*  -  1.5  1.5  -  -
Fmoc-Lys(ivDde)-OH  574.6  1.5  1.5  0.861  -
DIPEA*  129.3  3.0  3.0  0.387  0.52
Bop*  442.3  1.5  1.5  0.442  -
HOBt*  135.1  1.5  1.5  0.135  -
DMF*  -  -  -  -  4.0
DCM*  -  -  -  -  16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液*  -  -  -  -  40.0
DMF(用于所有洗涤)*  -  -  -  -  20.0
反应顺序：Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)
如实施例1所述，根据所述反应顺序，使用2.0g结合酰胺树脂与上表中所列的试剂和溶剂实施偶联与解封闭。通过Kaiser试验检测偶联并通过氯醌试验确证洗液中残留的副反应物(side reactant)。最后得6.5g结合肽的树脂，基于UV分析的反应容量经确定为0.12mmol/g。
实施例19-3.通过缩合Nsc-AAGRF(1-15)-OH与Nsc-AAGRF(16-29)-结合酰胺树脂合成1，12-二Fmoc-GRF(1-29)
结构：Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
[表27]
原料 分子量  当量 毫摩尔数 克数 毫升数
解封闭
Nsc-AAGRF(16-29)-结合酰胺树脂(同上) -   1.0   0.5   4.17   -
DCM   30
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   40.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   200
片段缩合
H-AAGRF(16-29)-结合酰胺树脂(同上)   -   1.0   0.5   -   -
Nsc-AAGRF(1-15)-OH(同上)   3143   1.5   0.75   2.36   -
DIPEA   129.3   3.0   1.5   0.194   0.26
Bop   442.3   1.5   0.75   0.332   -
HOBt   135.1   1.5   0.80   0.108   -
DMSO   -   -   -   -   10
DCM   -   -   -   -   16.0
1％DBU-20％哌啶的DMF溶液   -   -   -   -   20.0
DMF(用于所有洗涤)   -   -   -   -   20.0
二-Fmoc的引入
2％水合肼的DMF溶液   -   -   -   -   60.0
DMF   -   -   -   -   240
DCM   -   -   -   -   160
Fmoc-OSu   337.3   5.0   10.0   3.37   -
断裂(树脂1g)
TFA   -   -   -   -   11.5
TIS   -   -   -   -   0.25
水   -   -   -   -   0.25
乙醚   -   -   -   -   400
将上述合成的Nsc-AAGRF(16-29)-结合酰胺树脂(4.17g)置于适宜的的肽反应器中。向该反应器中倒入30ml DCM并使树脂充分膨胀，经过滤除去溶液，用2×20ml解封闭溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次处理5分钟以除去Nsc。将树脂用DMF彻底洗涤，将之前制备的Nsc-AAGRF(1-15)-OH(2.36g)溶于10ml DMSO并投入反应器中。将上表所列的HOBt、DIPEA、Bop等加入至反应液中并反应12小时。通过HPLC每2小时检查反应进程，当确证反应完成时，将反应液用DMF彻底洗涤。
片段缩合完成后，将树脂用2％肼的DMF溶液(3×20ml)每次处理20分钟以除去ivDde与Nsc。通过如实施例4中所述的TLC分析确证ivDde的除去，并将所得产物用清洗溶剂彻底洗涤。通过以Fmoc-OSu(3.37g在20ml DMF中的溶液)处理2小时将Fmoc引入1位与12位，充分洗涤，经真空干燥得4.3g结合肽的树脂。
取1g所述干燥的树脂并与10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常温下反应约90分钟，再与TMS-Br及EDT反应15分钟。经过滤除去树脂，将树脂用2ml TFA洗涤。收集洗液和滤液并加入至100ml乙醚中，经离心以使所形成的沉淀物得以沉淀，再次离心并用3×50ml乙醚洗涤。该沉淀物经氮气干燥得654mg干燥的肽混合物，该混合物经制备HPLC纯化、冷冻干燥得141mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.49，(M+1＝3803.46)HPLC；97％以上(肽分析条件1)
实施例20.用1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素制备Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素
将10mg当量的1，11-二Fmoc鲑鱼降钙素溶于1ml DMF中，加入0.2％TEA后，加入5当量的聚乙二醇2,000琥珀酰亚胺丙酸酯并于45℃下反应1小时。加入50μl哌啶并反应5分钟以除去Fmoc，然后通过加入500μl10％三氟乙酸/乙腈酸化。将该反应液用20mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)稀释10倍并于下述条件下用离子交换色谱纯化。加入流出液并使之附着于C-18 Sep-Pak柱，用20ml蒸馏水洗涤，用5ml 70％乙腈洗脱。在氮气下蒸发流出液中的乙腈并冷冻干燥。
当如试验例1所述测定时，所述样品的反相色谱图(图1-B)呈现单峰，除单PEG 2K鲑鱼降钙素外，未反应的鲑鱼降钙素、二PEG 2K鲑鱼降钙素、三PEG 2K鲑鱼降钙素等未能通过MALDI-TOF质谱检测出来(图2)。此外，如试验例1所述测得的Lys-C酶处理片段的MALDI-TOF质谱仅出现与碎片Lys18-PEG 2K-GRF(1-29)对应的峰(图3-B)。当样品溶于蒸馏水中并如试验例1所述的基于反相色谱相对于鲑鱼降钙素标准品测定时，收率为87.6％。
[离子交换色谱条件]
色谱柱：TSK SP-5PW(55×200mm，15μm)(强阳离子交换介质)洗脱液
洗脱液A：20mM乙酸钠(pH4.5)
洗脱液B：300mM氯化钠/20mM乙酸钠(pH4.5)
洗脱液C：1M氯化钠/20mM乙酸钠(pH4.5)
00-10min：100％A
10-40min：0％A→100％B
40-50min：100％C
流速：3ml/min
检测：UV215nm
比较例1.使用鲑鱼降钙素制备单-PEG 2K-鲑鱼降钙素
将鲑鱼降钙素10mg溶于5ml的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，加入1.5当量的聚乙二醇2,000琥珀酰亚胺丙酸酯，并于常温反应20分钟，然后加入50μl 1M甘氨酸溶液并放置30分钟以完成反应。用分子排阻色谱将该反应液分成5份以分离单PEG结合物。收集流出液并使之附着于C-18 Sep-Pak柱，用20ml蒸馏水洗涤，并用5ml 70％乙腈洗脱。在氮气下蒸发流出液中的乙腈并冷冻干燥。
当如试验例1所述测定时，该样品的反相色谱图呈现分别指示Cys1-Nα-PEG 2K-鲑鱼降钙素、Lys11-PEG 2K-鲑鱼降钙素和Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的三个峰(图1-A)，且峰面积之比大约为1∶1∶1。将样品溶于蒸馏水并如试验例1所述基于反相色谱图相对于鲑鱼降钙素标准品测定，得到收率为28.4％。
[分子排阻色谱条件]
色谱柱：Superose 12 HR 10/30(Amersham pharmacia)
洗脱液：10mM PBS(pH7.4)
流速：0.4ml/min
检测：UV 215nm
试验例1.Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的鉴定
试验例1-1.基于反相色谱的异构体的鉴定及测定
按照Pharm.Res.，16(6)，813-818，1999中所述的方法，在下列条件下用反相色谱比较实施例20和比较例1中获得的样品。实施例20的样品显示代表Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的单峰(图1-B)，而比较例1的样品显示比例为1∶1∶1的对应于Cys1-Nα-PEG 2K-鲑鱼降钙素、Lys11-PEG 2K-鲑鱼降钙素以及Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素的多个峰(图1-A)。当换算为Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素峰面积与鲑鱼降钙素标准品峰面积的比时，实施例20的收率为87.6％。在比较例1中，当基于三种不同位置的异构体的总峰面积与鲑鱼降钙素标准品峰面积的比计算时，单PEG结合物的总收率为28.4％，而Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素(峰2)的收率为10.2％。
[反相色谱条件]
色谱柱：Lichrospher 100 RP-8(4mm ID×250mm L，5μm，Merck)
流动相
洗脱液A：0.1％TFA/D.W.
洗脱液B：0.1％TFA/AcCN
00-30min：  36％B→44％B
流速：1ml/min
检测：UV 215nm
试验例1-2.以MALDI-TOF质谱分析鉴定副反应物和异构体
在下列MALDI-TOF质谱分析条件下，实施例20的样品仅出现一个对应于单PEG 2K-鲑鱼降钙素的峰，而未反应的鲑鱼降钙素、二PEG2K鲑鱼降钙素、三PEG 2K鲑鱼降钙素等都均未出现(图2)。使用Lys-C酶处理得自实施例20的样品所得片段的MALDI-TOF质谱图与以同样方法处理的鲑鱼降钙素标准品的对比见图3。通过将10μl样品与5μl 5mM含有Lys-C酶(0.1μg/ml)的tris缓冲液(pH8.5)于37℃下反应1小时，并与基质溶液以1∶2的比例混合制备以Lys-C酶处理的样品。经以Lys-C酶处理的鲑鱼降钙素片段的MALDI-TOF质谱图(图3-A)确证各峰对应于Pro1-Gly10片段，Lys11-His17片段以及Lys18-pro32片段，而以Lys-C酶处理的实施例20样品的片段的MALDI-TOF质谱图(图3-B)仅显示对应于Pro1-Gly10片段和结合PEG的Lys11-pro32片段，而未检测到Lys11-His17片段和Lys18-pro32片段的峰。基于此结果可以确证，实施例20中的样品是PEG仅结合于Lys18位置的Lys18-单-PEG 2K-鲑鱼降钙素。
[MALDI-TOF质谱分析条件]
离子选择：正离子
基质溶液：α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液(0.1％TFA/50％AcCN/DW)
模式：线性
样品∶基质＝1∶2
加速电压：25kV
实施例21.使用1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素制备Lys18-PEG 1K-鲑鱼降钙素、Lys18-PEG 5K-鲑鱼降钙素以及Lys18-PEG 10K-鲑鱼降钙素
按照实施例20种所述的方法，使用1，11-二Fmoc-鲑鱼降钙素与聚乙二醇1,000琥珀酰亚胺丙酸酯、聚乙二醇5,000琥珀酰亚胺丙酸酯及聚乙二醇10,000琥珀酰亚胺丙酸酯制备Lys18-PEG 1K-鲑鱼降钙素、Lys18-PEG 5K-鲑鱼降钙素和Lys18-PEG 10K-鲑鱼降钙素。当用实施例1所述程序测定各样品时，其产率分别为86.9％、81.5％及82.7％，并且除Lys18-PEG结合物外，未检测到其它肽衍生物或异构体。
实施例22.使用1，11-二Nsc-鲑鱼降钙素制备Lys18-PEG 2K-鲑鱼降钙素
将10mg当量的1，11-二Nsc-鲑鱼降钙素溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5当量的聚乙二醇2,000琥珀酰亚胺丙酸酯并于45℃下反应1小时。加入100μl哌啶并反应5分钟以除去Nsc，然后用500μl 10％三氟乙酸/乙腈酸化。在与实施例20中相同的条件下纯化该反应液，并以试验例1中所述的方法相对鲑鱼降钙素计算得到收率为84.8％。此外，对于如试验例1所述获得的经Lys-C酶处理的片段的反相色谱和MALDI-TOF质谱图而言，除Lys18-pEG 2K-鲑鱼降钙素外，未检测到其它肽衍生物或异构体。
实施例23.使用1，12-二Fmoc-GRF(1-29)制备Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)
将10mg当量的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5当量的聚乙二醇5,000琥珀酰亚胺丙酸酯并于45℃下反应1小时。加入50μl哌啶并反应5分钟以除去Fmoc，然后用500μl10％三氟乙酸/乙腈酸化。用与实施例20中相同的条件纯化该反应液得结合PEG的肽。当如试验例2所述测定该样品时，样品的反相色谱图(图4-B)仅出现一单峰，且其MALDI-TOF质谱图也只出现对应于单PEG5K-GRF(1-29)的峰，而未检测到未反应的GRF(1-29)、二PEG 5K-GRF(1-29)以及三PEG 5K-GRF(1-29)(图5)。此外，如试验例2所述获得的以Lys-C酶处理的片段的MALDI-TOF质谱图仅显示对应于Lys21-PEG5K-GRF(1-29)片段的峰(图6-B)。当样品溶解于蒸馏水并经基于如试验例2所述的反相色谱相对于GRF(1-29)标准品进行分析时，其收率为91.2％。
试验例2.Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的鉴定
根据在下列条件得到的反相色谱图，实施例23的样品显示对应于单PEG 5K-GRF(1-29)的单峰(图4-B)，而未出现对应于未反应的GRF(1-29)的峰(图4-A)或其它峰。此外，以如试验例1所述的方法得到的MALDI-TOF质谱图除单PEG 5K-GRF(1-29)外未显示其他肽衍生的峰(图5)。此外，以如试验例1所述的方法得到的以Lys-C酶处理的片段的MALDI-TOF质谱图(图6-B)也仅出现Try1-Arg11片段或结合有PEG 5K的Lys21-Arg29片段的峰，而未能检测出在经同样方法处理的GRF(1-29)的MALDI-TOF质谱图(图6-A)鉴定的Lys12-Arg20片段或Lys21-Arg29片段。基于此结果可以确证，实施例23的样品是PEG仅结合到Lys21位置的Lys21-单-PEG 5K-GRF(1-29)。
[反相色谱色谱条件]
色谱柱：Lichrospher 100 RP-8(4mm ID×250mmL，5μm，Merck)
流动相
洗脱液A：0.1％TFA/D.W.
洗脱液B：0.1％TFA/AcCN
00-15min：34％B→55％B
流速：1ml/min
检测：UV 215nm
实施例24.使用1，12-二Nsc-GRF(1-29)制备Lys21-PEG 1K-GRF(1-29)
将10mg当量的1，12-二Nsc-GRF(1-29)溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5当量的聚乙二醇1,000琥珀酰亚胺丙酸酯并于45℃下反应1小时。加入100μl哌啶并反应5分钟以除去Nsc，然后用500μl 10％三氟乙酸/乙腈酸化。在与实施例20相同的条件下纯化该反应液，并如试验例2所述相对于GRF(1-29)标准品进行反相色谱分析，得收率为92.8％。此外，如试验例1所述得到的MALDI-TOF质谱图仅显示对应于单-PEG 1K-GRF(1-29)的峰，而经Lys-C酶处理的片段的MALDI-TOF质谱图也仅显示对应于Lys21-PEG 1K-GRF(1-29)片段的峰。
工业应用性
本发明仅仅通过改变酸-碱条件便能合成非靶位点胺基被选择性地保护的肽。因此，在与常规的生产其中PEG特异性地结合于靶位点胺基的结合PEG的肽的方法相比时，本发明具有以下优点：终产物能以更高的收率获得，不需要复杂的分离纯化，因而本发明提供了经济的方法，能防止生成常规工艺中不可避免的副产物，因此本发明的产物更适于临床使用。因此，当本发明的结合PEG的肽用于临床应用时，聚乙二醇化效果能被最大化。
                                  序列表
<110>派格斯菲尔有限公司
<120>非靶位点胺基被保护的肽，其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的pEG肽的方法
<130>03op101p
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>32
<212>PRT
<213>Oncorhynchus keta
<300>
<301>O′Dor，RK
     Parkes，CO
     Copp，DH
<302>Amino acid composition of salmon calcitonin
<303>Can.J.Biochem.
<305>47
<306>823-825
<307>1969-01-01
<400>1
Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu
  1               5                  10                  15
His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro
             20                  25                  30
<210>2
<211>29
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<300>
<301>Rivier，J.et al.
<302>Characterization of a growth hormone-releasing factor from a
     human pancreatic islet tumor
<303>Nature
<305>300
<306>276-278
<307>1982-01-01
<400>2
Tyr Ala Asp Ala Ile phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
  1               5                  10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg
             20                  25
2

Claims (12)

1、一种制备非靶位点胺基被选择性地保护的肽的方法，其包括分别以ivDde或Mtt、以及Boc封闭靶位点支链胺基与非靶位点支链胺基，以及以Fmoc或Nsc保护Nα-胺基，从而合成所述肽。
2、如权利要求1所述的方法，其进一步包括以至少一个选自Fmoc、Nsc、Dde以及ivDde的最终胺基保护基取代包括Nα-胺基的非靶位点胺基的胺基保护基。
3、如权利要求1所述的方法，其进一步包括以Boc取代包括Nα-胺基的非靶位点胺基的胺基保护基。
4、如权利要求1至3任一项所述的方法，其中肽的合成是通过固相合成实施。
5、如权利要求1至3任一项所述的方法，其中肽序列被分为至少两个片段，各片段经单独合成然后经缩合生成肽。
6、根据权利要求1至5任一项所述的方法制备的非靶位点胺基被选择性地保护的肽。
7、如权利要求6所述的肽，其中所述肽为降钙素或GRF(1-29)。
8、一种制备其中PEG特异性地结合到靶位点胺上的特异性地结合的PEG-肽的方法，其包括(1)将如权利要求6所述的肽与经活化的PEG反应的步骤，以及(2)在酸-碱解封闭条件下除去步骤(1)中所得到的化合物的胺基保护基的步骤。
9、如权利要求8所述的方法，其进一步包括将步骤(2)的产品纯化的步骤。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述纯化步骤包括通过离子交换色谱分离产品、脱盐、然后干燥。
11、如权利要求8至10任一项所述的方法，其中所述经活化的PEG为分子量范围在1,000至40,000内的直链或支链羟基或甲氧基型烷基化或酰化PEG。
12、如权利要求11所述的方法，其中所述经活化的PEG为选自以下组中的至少之一：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺氨基甲酸酯以及单甲氧基聚乙二醇tresylate。
CNB038258285A 2003-01-18 2003-01-18 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法 Expired - Fee Related CN100357313C (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2003/000118 WO2004065412A1 (en) 2003-01-18 2003-01-18 Peptides having protected amines of untargeted sites, methods for production thereof and of specifically conjugated peg peptides using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1745091A true CN1745091A (zh) 2006-03-08
CN100357313C CN100357313C (zh) 2007-12-26

Family

ID=32768419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB038258285A Expired - Fee Related CN100357313C (zh) 2003-01-18 2003-01-18 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7662915B2 (zh)
EP (1) EP1585758A4 (zh)
JP (1) JP4339797B2 (zh)
CN (1) CN100357313C (zh)
AU (1) AU2003206158A1 (zh)
WO (1) WO2004065412A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008151512A1 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives
CN106928341A (zh) * 2011-03-30 2017-07-07 上海仁会生物制药股份有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
CN113583230A (zh) * 2021-06-30 2021-11-02 苏州欣影生物医药技术有限公司 一种peg双胺选择性反应制备异双官能团的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006105794A1 (en) 2005-04-06 2006-10-12 M 2 Medical A/S An actuator
US11382711B2 (en) 2008-08-13 2022-07-12 Invuity, Inc. Cyclo olefin polymer and copolymer medical devices
WO2024079043A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Bachem Holding Ag Method of manufacturing a peptide with a lysine derivative

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2541271B1 (fr) * 1983-02-21 1986-05-23 Sanofi Sa Nouvelle synthese du hpgrf en phase liquide
AU7113594A (en) * 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US6310180B1 (en) * 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
JP3808938B2 (ja) * 1996-07-16 2006-08-16 久光製薬株式会社 核酸運搬体
ZA977451B (en) * 1997-06-30 1999-05-19 Mandiro Trading Ltd Multiplayer interactive video gaming device
EP0922446A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
WO1999045026A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008151512A1 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives
CN106928341A (zh) * 2011-03-30 2017-07-07 上海仁会生物制药股份有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
CN106928341B (zh) * 2011-03-30 2021-06-01 上海仁会生物制药股份有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
CN113583230A (zh) * 2021-06-30 2021-11-02 苏州欣影生物医药技术有限公司 一种peg双胺选择性反应制备异双官能团的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004065412A8 (en) 2005-07-28
EP1585758A1 (en) 2005-10-19
EP1585758A4 (en) 2006-06-07
US20060063914A1 (en) 2006-03-23
WO2004065412A1 (en) 2004-08-05
JP2006524184A (ja) 2006-10-26
US7662915B2 (en) 2010-02-16
AU2003206158A1 (en) 2004-08-13
JP4339797B2 (ja) 2009-10-07
CN100357313C (zh) 2007-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1149967C (zh) 聚乙二醇-grf偶联物的位点特异性制备
CN1267449C (zh) 用于肽合成的方法和组合物
CN1132845C (zh) 获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素前体的改进的方法
CN1163504C (zh) 制备与树脂结合的环状肽的方法
CN101068833A (zh) 产生羧基端酰胺化肽的方法
CN1041950A (zh) 新型肽酶抑制剂
CN1454214A (zh) 具有增高功效的修饰生物肽
CN1303299A (zh) 关于肽合成的方法以及组合物
CN1849141A (zh) 用于聚(乙二醇)修饰的肽的间隔臂部分
CN1050198A (zh) 新的肽酶和异构酶抑制剂
CN1802385A (zh) 具有CXCR4拮抗活性的模板固定的β－发夹肽模拟物
CN1186355C (zh) 血管活性肠肽类似物的合成
CN1055480C (zh) 爪蟾抗菌肽的取代类似物
CN1865283A (zh) 固相多肽合成鲑鱼降钙素的制备方法
CN1929860A (zh) HIV gp41衍生肽的位点特异性化学修饰
CN1099040A (zh) 线性粘合抑制剂
CN1745091A (zh) 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法
CN1054857C (zh) 具有胃肠道运动刺激活性的胃动素样多肽
CN1061606A (zh) 具有生长激素释放活性的多肽化合物
CN1777439A (zh) 生长抑素的载体
CN1111909A (zh) 新多肽及编码该多肽的dna
CN1612891A (zh) 修饰肽的制造方法
CN1051914A (zh) 肽类
CN1968961A (zh) 制备肽的方法
CN1282337A (zh) 具有整联蛋白抑制剂特性的环肽衍生物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20071226

Termination date: 20120118