CN1532206A - 胸腺素α1的活性片段及其聚乙二醇化衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及其在治疗或预防免疫缺陷、免疫功能低下有关疾病的药物中用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预防中的应用。
Description
发明领域
本发明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物及其在治疗或预防与免疫缺陷、免疫功能低下有关疾病的药物中的用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS(严重急性呼吸综合征)等相关疾病的治疗或预防中的应用。
背景技术
胸腺素α1(Tα1)是胸腺分泌的一种重要的多肽，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，能促进T细胞的成熟和分化，并促使成熟的T细胞分泌多种淋巴因子(如白介素-2和γ-干扰素等)，还能促进白介素-2受体的生成。Tα1由28个氨基酸残基组成，分子量为3108，等电点为4.2，N-端含有乙酰化结构，其氨基酸序列如下：
1 10
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-
20 28
Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
Tα1具有明确的化学结构和显著增强免疫功能的作用，其临床应用研究始于二十世纪八十年代，但关于其构效关系研究的报道不多。Abiko等(Chem Pharm Bull，1980，28：3542-8)用E-玫瑰花结形成试验证实Tα1的C-端部分片段具有一定的活性：Tα1(100％)，14-28(9.83％)，19-28(1.04％)。Felix等(Int J Pept Protein Res，1985，26：130-48)用免疫抑制小鼠试验证实N-端片段1-4，4-10，1-10及1-14基本无活性；C-端片段15-28和18-28与Tα1活性相当，21-28(75％)，23-28(50％)和25-28(50％)具有部分活性。Ho等(Thymus，1987，9：77-84)报道C-端片段13-19与Tα1具有相同的促T细胞增殖活性，20-25和20-28具有部分活性。Ciaredelli等(Biochemistry，1982，21：4233-4237)用硫唑呤抑制E-玫瑰花结形成试验发现C-端17-28区域部分片段有较好的活性，其中20-25和20-27活性与Tα1相当，17-24活性略高于Tα1。Abiko等(Biotechnol Ther，1992，3：159-68)以Phe和Phe(4-F)替代Tα1序列中21位的Glu合成了[Phe21]-desAc-Tα1和[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1，E-玫瑰花结形成试验显示[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1比[Phe21]-desAc-Tα1活性高，[Phe21]-desAc-Tα1与desAc-Tα1活性相当。
Grottesi等(Peptides，1998，19：1731-8)通过圆二色谱和二维核磁对Tα1在溶液中的构象进行了研究。结果表明，Tα1在水溶液中并不形成优势的二级构象，但在疏水环境中能形成一定的二级结构。在40％的三氟乙醇水溶液中，Val5和Glu8之间形成β-转角，Lys17和Glu24之间形成α-螺旋。鉴于Tα1受体结构还未被发现，Grottesi等认为Tα1与淋巴细胞的作用可能是：Tα1首先通过极性氨基酸残基与细胞膜形成静电作用，然后诱导Tα1的Lys17至Glu24之间序列形成α螺旋结构并嵌入细胞膜，进而与IL-2受体跨膜区发生静电作用。这一作用模型有助于解释Tα1与IL-2的协同作用。
病毒性乙型和丙型肝炎，可以导致肝癌和肝硬化，WHO估计目前全球有3.5亿乙型肝炎病毒携带者和1.7亿丙型肝炎病毒携带者。乙型肝炎在亚洲尤为流行，我国是肝炎大国。Tα1用于免疫缺陷或免疫受抑制的疾病的临床治疗研究始于20世纪80年代，目前已经取得了较好的效果。临床试验的总结分析证明，Tα1单独或与干扰素联合使用治疗慢性乙型肝炎是有效的。1996年，美国赛生制药公司生产的化学合成胸腺素α1(商品名为日达仙)首先在中国上市，它单独或与干扰素联合使用治疗慢性乙型肝炎。至2002年12月，日达仙已在30多个国家获准销售。在治疗丙型肝炎方面，日达仙与干扰素一起使用是目前最为有效的方法之一。对于许多其它疾病，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤和艾滋病，Tα1都有一定的疗效。另外，Tα1也可作为疫苗辅助药加强流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。
目前临床使用的Tα1为化学合成品，价格昂贵、用药剂量大、周期长。寻找生物活性肽的活性中心是构效关系研究的重要目的之一，因此进行Tα1的构效关系研究，寻找结构简单并有较好活性的Tα1活性片段仍有意义。
发明内容
本发明人经研究现已发现式I化合物或其衍生物具有优良的预防或治疗免疫缺陷、免疫功能低下有关疾病的活性，并且它们与聚乙二醇形成的衍生物在保持固有活性的同时，延长了式(I)化合物的体内半衰期，从而降低了式(I)化合物的用量并延长了式(I)化合物的体内作用时间。
本发明第一方面涉及式(I)化合物或其立体异构体：
X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2 (I)
X1为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y1为L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X2为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X3为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y为L-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，如His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Z1为L-或D-型的中性或亲脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Z2为L-或D-型的中性或亲脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中R为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y2为L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等。
本发明再一方面涉及式(II)化合物，其为式(I)化合物任意位点的氨基经PEG共价修饰的化合物，所述氨基包括N-端氨基或赖氨酸侧链氨基，
[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2
(II)
PEG表示：RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定义。
本发明还涉及式(III)化合物，其为式(I)化合物任意位点的羧基经PEG共价修饰的化合物，所述羧基包括C-端羧基，天冬氨酸或谷氨酸侧链的羧基，
X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z
(III)
其中，X＝O或NH，z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定义。
本发明还涉及式(IV)化合物，其为式(I)化合物的N-端引入半胱氨酸后经PEG-M修饰的化合物：
PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2
(IV)
Cys为半胱氨酸，它通过其侧链硫醚原子与M基团共价相连，Cys还以其羧基与式(I)化合物的N-端氨基形成酰胺键相连，X1，X2，X3，Y，Y1，Y2，Z1和Z2如式I中定义。
本发明所涉及药物组合物，其包括至少一种式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物及药用载体或赋形剂。
本发明还涉及至少一种式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物在制备用于预防或治疗免疫缺陷或免疫低下有关疾病的药物中用途，包括在乙肝，丙肝，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预防中的应用。
本发明还涉及制备式I化合物的方法，其包括，用已知固相或液相合成法合成。
本发明还涉及式II或式III化合物的制备方法，其包括将在PEG上引入羧基或氨基后与式(I)化合物的中的氨基或羧基的缩合反应形成。
根据本发明，在本发明中使用的缩写词具有下面的含义：
Tα1-胸腺素α1，
PEG-聚乙二醇，
PEG-MAL-马来酰亚胺基聚乙二醇，
PEG-VS-乙烯砜基聚乙二醇，
PEG-IODO-碘代乙酰胺基聚乙二醇，
Ala-丙氨酸，
Arg-精氨酸，
Asn-天冬酰胺，
Asp-天冬氨酸，
Cys-半胱氨酸，
Glu-谷氨酸，
Gly-甘氨酸，
His-组氨酸，
Ile-异亮氨酸，
Leu-亮氨酸，
Lys-赖氨酸，
Mob-β-胡椒基丙氨酸，
Nal-萘丙氨酸，
Phe-苯丙氨酸，
Phg-苯基甘氨酸，
Pya-β-吡啶基丙氨酸，
Pro-脯氨酸，
Ser-丝氨酸，
Thr-苏氨酸，
Trp-色氨酸，
Tyr-酪氨酸，
Val-缬氨酸，
GABA-γ-氨基丁酸，
Ac-乙酰基，
Boc-叔丁氧羰基，
Fmoc-芴甲氧羰基，
DMF-二甲基甲酰胺，
DCC-二环己基碳二亚胺，
HOBT-1-羟基苯并三唑，
HBTU-2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，
NMM-N-甲基吗啡啉，
TFA-三氟乙酸，
Ts-Cl-对甲苯磺酰氯
RP-HPLC-反相高效液相色谱。
本发明中，所有氨基酸构型除注明为D-型外，均为L-型。
根据本发明，式I化合物优选X1为Lys；Y1为Glu；X2为Lys；X3为Lys；Y为L-或D-型Phe(X)，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1为Val；Z2为Val；Y2为Glu。
根据本发明，式II化合物优选z＝1；X1为Lys；Y1为Glu；X2为Lys；X3为Lys；Y为Glu、L-或D-型Phe(R)，R为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Bt、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1为Val；Z2为Val；Y2为Glu。
本发明所用的PEG-OH结构为：RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，R＝H或CH3，n＝5-1000。平均分子量由几百到几万的PEG-OH可作为商品化试剂购买到，PEG-NH2可以购买或通过以下反应得到先将其转化为PEG-NH2，再与琥珀酸酐反应得到PEG-NHCOCH2CH2COOH，然后将此化合物可作为羧基组分，可在固相上将其偶联到多肽的N-端，最后经三氟乙酸裂解和反相高效液相色谱纯化得产物。
在PEG的一端先引入氨基、羧基或制备PEG化修饰的氨基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH2-PEG)-OH、Fmoc-Glu(CO-NH-PEG)-OH Fmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶联到肽序列中去，可实现对多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys侧链氨基、Asp或Glu侧链羧基的修饰。
将PEG-NH2分别与马来酸酐、乙烯基氯化亚砜、碘代乙酸酐反应得PEG-MAL、PEG-VS和PEG-IODO。PEG-MAL通过以下反应得到：
Tα1(17-24)的活性片段可用固相或液相多肽合成法合成，在合成过程中很容易在N-端或C-端引入一个Cys。将含Cys的肽链溶于水中，用碳酸氢钠调pH7-8，加入3倍当量的PEG-MAL或PEG-MAL或PEG-VS和PEG-IODO室温搅拌反应，用反相高效液相色谱纯化得PEG修饰的Tα1的活性片段。PEG-MAL修饰Cys-Tα1(17-24)的反应如下：
本发明涉及的Wang树脂、DCC、HOBT、HBTU、NMM、TFA和普通Fmoc-氨基酸通过购买获得，下列非天然氨基酸由发明人合成并拆分：
Phe(4-F)，Phe(3-F)，Phe(2-F)，Phe(4-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(2-Cl)，Phe(4-Br)，Phe(3-NO2，Phe(2，5-Cl2，Phe(4-F，3-Cl)，Mob，D-Phe，D-Phe(4-F)，D-Phe(3-F)，D-Phe(2-F)，D-Phe(3-Cl)，D-Phe(2-Cl)，D-Phe(4-Br)，D-Phe(3-NO2)，D-Phe(2，5-Cl2)，D-Phe(4-F，3-Cl)，D-Mob。
本发明合成的系列八肽衍生物是基于Tα1(17-24)的新结构的Tα1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，通过初步活性评价观察到部分化合物具有较好的体外促小鼠淋巴细胞增殖的生物活性。含它们的药物组合物可用于免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病的治疗或预防。Tα1活性八肽衍生物可与一种或多种赋形剂结合制成适用于人的剂型，如用甘露醇作赋形剂制成注射剂，经皮下给药治疗免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预防中的应用。
根据本发明，式I化合物优选下面的化合物
[Phe21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)
[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)。
根据本发明，式II化合物优选下面的化合物
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)
X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
根据本发明，与免疫缺陷或免疫功能低下有关的疾病举例有：乙型肝炎，丙型肝炎，非小细胞肺癌，黑色素瘤或艾滋病，冠状病毒引起的SARS。
根据本发明，本发明中所用术语“Tα1(17-24)序列是指Tα1的17位-24位的氨基酸序列。
具体实施方式
实施例
下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例所用固相合成载体Wang树脂为ACT产品，DCC、HOBT、HBTU、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品，TFA为ACROS产品，平均分子量为2000的mPEG-OH为Sigma产品。
实施例1 Phe(4-F)21Tα1(17-24)的合成
将0.285g H-Phe(4-F)-OH.HCl(1.3mmol)溶于10mL甲醇、10mL丙酮和10mL水中，加入0.218g NaHCO3(2.6mmol)，搅拌使固体溶解后再加入等0.438g Fmoc-OSu(1.3mmol)，室温搅拌反应。TLC监测反应完成后，旋转蒸发除去有机溶剂，用6N盐酸调pH2-3，乙酸乙酯提取水相3次，合并有机相，无水MgSO4干燥。滤除干燥剂，将滤液旋转蒸发除去溶剂得白色固体。再以乙酸乙酯-石油醚重结晶得0.320g Fmoc-Phe(4-F)-OH，收率61.5％。
以100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据Tα1(17-24)的氨基酸序列，在21位以Fmoc-Phe(4-F)-OH代替Fmoc-Glu(OtBu)-OH，按标准的Fmoc固相多肽合成方法操作合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe(4-F)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang树脂。
将5ml裂解液(4.5ml TFA，0.5ml间甲酚)冷却至0℃，加入上述合成的肽树脂反应90分钟。滤除树脂并用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，旋转蒸发除去TFA，加入无水乙醚沉淀出固体。滤集固体，溶于水，冰冻干燥后得粗品肽27.0mg，HPLC纯化得纯品9.3mg。FAB-MS：1024.8(理论值1024.2)。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
实施2 mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)的合成
称取mPEG2000-OH 20g(10mmol)置于250ml反应瓶中，加入50mlCH2Cl2，固体溶解后再加入7.5ml Et3N(50mmmol)和9.5g Ts-Cl(50mmol)，室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加100ml无水乙醚沉淀出固体，得18.9g mPEG2000-OTs，收率94％
将12g mPEG2000-OTs(6mmol)溶于30ml DMF，加入3.36g(18mmol)邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，加入4.0ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2，滤去不溶物，再将滤液旋转蒸发除去溶剂，用无水乙醚沉淀出固体，再以无水乙醇-乙醚重结晶，得10.9g mPEG2000-NH2，收率90％。
将6.3g mPEG2000-NH2溶于20ml DMF中，加入0.45g琥珀酸酐，40℃反应0.5小时，减压蒸去溶剂，加无水乙醚沉淀出固体，得4.7gmPEG2000-NHCOCH2CH2COOH，收率74％。
以100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据Tα1(17-24)的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang树脂，加入mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH(0.1mmol)，HBTU(0.1mmol)，NMM(0.15mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml TFA为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体60mg。HPLC纯化得目标产物。
mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)经MALDI-TOF-MS分析，在3127附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
实施3 Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)的合成
将1.0g mPEG2000-NH2溶于10ml二氧六环，加入马来酸酐0.4g，80℃搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，滤集固体，干燥后得0.95g。将所得固体溶于15ml乙酸酐，加入1.0g乙酸钠，100℃搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用二氯甲烷溶解，滤去不溶物，向滤液中加入适量活性炭，放置30min，滤除活性炭，将滤液浓缩至干，加入无水乙醚，沉淀出固体，滤集、干燥后得浅黄色固体0.55g mPEG2000-MAL，收率55％。
以100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据Tα1(17-24)的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang树脂。以EDT-间甲酚-TFA作裂解液，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出白色固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色干粉37mg。RP-HPLC纯化，FAB-MS分析，M+1峰：1092(理论值：1091)。
将经RP-HPLC纯化后的Cys-Tα1(17-24)溶于水中，以碳酸氢钠调pH至7-8，加入3倍当量的mPEG2000-MAL，室温反应，用RP-HPLC监测反应进程和分离产物。
Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)经MALDI-TOF-MS分析，在3096附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：Glu，3.36(3)；Val，1.50(2)；Lys，3.14(3)。
实施例4 3H-TdR掺入法检测对小鼠脾淋巴细胞的增殖反应
断头放血处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，放入RPMI1640液中。将脾脏放在100目不锈钢网上或尼龙网中用针芯或三角玻棒研磨，制成脾细胞悬液。用培养液离心洗涤脾细胞一次后，加入Tris-NH4Cl缓冲液(0.16M NH4Cl和0.17M Tris按9∶1混合，pH7.2)作用3-5分钟，溶解RBC，再用培养液离心洗涤两次。用苔盼蓝染色，活细胞数需在95％以上。用20％小牛血清1640液将细胞稀释成5-10×106个/mL浓度备用。将脾细胞加入无菌96孔培养板中，5-10×105个/100μL/孔，再加入Con A 50μL/孔(终浓度0.5μg/mL)，37℃孵温6小时。加入不同浓度待测样品50μL/孔，置5％CO2培养箱中，培养66小时。终止培养前16小时，每孔加入3H-TdR20μL，使其终浓度为1μci(37KBq)/mL。用TOMTEC公司Harvester96型96孔板细胞收集仪收集细胞样本于型玻璃纤维滤纸片上，置80℃烘箱内干燥30分钟或自然干燥。将干燥的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶中，用PerkinElmer公司的MicoBeta Trilux 1450型微量液闪仪检测cpm值。液闪仪每分钟记录的脉冲数(cpm)表示试验结果。
| 样品名称 | 样品剂量(μg/ml) | Cpm(x±s) | |
| ConA(-) | ConA(+) | ||
| ConA | 5 | 337.3±24.4 | 3262.3±549.0 |
| Tα1 | 1050100 | 770.0±187.5*734.0±97.9**772.3±75.1*** | 13188.7±4225.0*14352.7±2463.9**15388.3±3051.6** |
| Tα1(17-24) | 1050100 | 1011.7±104.1***835.0±55.5***674.7±29.1*** | 10901.0±3322.8*14117.3±3813.8**11263.7±1016.4*** |
| [Phe21]Tα1(17-24) | 1050100 | 825.7±171.7**717.3±75.7**596.7±58.3** | 12514.3±1863.6***11510.0±836.5***10538.5±2075.6** |
| [Phe(4-F)21]Tα1(17-24) | 1050100 | 567.3±72.2**642.7±25.5***449.3±19.7** | 13164.3±1495.2***13063.3±1327.3***11938.3±662.0*** |
| [Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24) | 1050100 | 470.0±102.6303.3±56.6402.7±49.4 | 7078.5±5356.22402.7±722.82384.7±536.2 |
| MPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24) | 1050100 | 530.7±51.9**544.7±56.4**690.7±115.0** | 1499.8±1786.8***13048.7±693.0***11265.7±3280.4* |
注：n＝3，*，**，***表示与CON比较P＜0.05，＜0.01，＜0.001
实施例5 Tα1活性片段的体外抗SARS病毒实验
生长成片的96孔塑胶板培养的Vero E6细胞，倾出培养液后，加入100TCID50的SARS病毒，吸附2小时，倾出病毒，加入待测样品，终浓度为100μg/ml，继续培养7天，每天在显微镜下观察Vero E6细胞病变程度，结果如下：
| 组别 | 样品浓度(μg/ml) | 100TCID50的结果 |
| 病毒对照(未加样品) | 0 | 4+/4 |
| Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24) | 100 | 4-/4 |
注：4-/4表示4个孔都无病毒繁殖，即阴性；4+/4表示4个孔均为阳性。
结论：Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)在100μg/ml时有体外抗SARS病毒活性。
Claims (10)
1.具有式(I)结构的八肽衍生物或其立体异构体：
X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2 (I)
X1为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y1为L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X2为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X3为L-或D-型的天然或非天然碱性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y为L-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，如His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Z1为L-或D-型的中性或亲脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Z2为L-或D-型的中性或亲脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中R为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，取代基选自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
Y2为L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等。
2.根据权利要求1的化合物：X1为Lys；Y1为Glu；X2为Lys；X3为Lys；Y为L-或D-型Phe(X)，其中X为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1为Val；Z2为Val；Y2为Glu。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中所述化合物下列八肽衍生物：
[Phe21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)
[Phe(3-NO2)21]-Tα1(1 7-24)
[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)
[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)
[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)
4.式(I)结构中任意位点的氨基经PEG共价修饰的化合物(II)，其中所述氨基包括N-端氨基和赖氨酸侧链氨基：
[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2
(II)
PEG表示：RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定义同权利要求1。
5.根据权利要求4的化合物，z＝1；X1为Lys；Y1为Glu；X2为Lys；X3为Lys；Y为Glu、L-或D-型Phe(R)，R为氢、卤素、硝基、羧基或C1-C4烷基单取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1为Val；Z2为Val；Y2为Glu。
6.下列化合物选自权利要求5的化合物：
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)
PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)
X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
7.式(I)结构中任意位点的羧基经PEG共价修饰的化合物(III)，其中所述羧基包括C-端羧基、天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基：
X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z
(III)
X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定义同权利要求1；X＝O或NH，z＝1-4。
8.式(I)结构化合物的N-端引入半胱氨酸后经PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修饰的化合物(IV)：
PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2
(IV)
或
或
Cys为半胱氨酸，通过侧链硫醚原子与M基团共价相连；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定义同权利要求1。
9.式(I)结构化合物的C-端引入半胱氨酸后经PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修饰的化合物(V)：
X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-Cys-M-PEG
(V)
X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定义同权利要求1；M的定义同权利要求8。
10.权利要求1-9中任一化合物作为药物或药物组合物的组分在免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病的治疗或预防中的应用，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预防中的应用。
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