WO2008135077A1 - Beschichtete oberfläche für die zellkultur - Google Patents

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WO2008135077A1
WO2008135077A1 PCT/EP2007/054198 EP2007054198W WO2008135077A1 WO 2008135077 A1 WO2008135077 A1 WO 2008135077A1 EP 2007054198 W EP2007054198 W EP 2007054198W WO 2008135077 A1 WO2008135077 A1 WO 2008135077A1
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keratin layer
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Stephan Reichl
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Technische Universität Braunschweig
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a coated surface of a natural or synthetic substrate, the methods of making the coated surface, and the use of the coated surface to promote cell growth in vitro or in vivo.
  • the carrier substrate may be a natural or synthetic polymer, for example a plastic such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polybutylene, polyacrylate, polycarbonate and copolymers thereof or a mineral carrier substrate, for example ceramic or glass.
  • the surface When using the invention coated surface for in vitro cultivation of animal cells, the surface is used as part of the culture vessel; for use in vivo, the surface coated according to the invention is used for the production of medical products for promoting wound healing, for example in the form of wound dressings.
  • Surfaces or molds coated according to the invention from the material of the coating according to the invention can also be used for the production of implants can be used which have cultured on the surface cells, for example, used as a substitute for tissue or tissue layers, such as the cornea.
  • DE 698 08 291 T2 discloses a wound dressing having a surface comprising a biodegradable cell anchoring layer consisting of heparin, inositol phosphate, fucoidin, syndecan, betaglycan, perlecan, dextran sulfate, pentosan, mesoglycan, polyvinyl sulfate or polylysine.
  • AT 412 781 B describes plastic molded bodies filled with biological fiber material, e.g. with starch, corn or rice flour, gluten, collagen, keratin, lignin, pectin and hemicelluloses.
  • biological fiber material e.g. with starch, corn or rice flour, gluten, collagen, keratin, lignin, pectin and hemicelluloses.
  • the processing is done by injection molding.
  • thermoplastics for the production of vessels for cell culture to which a thermostable polypeptide is admixed, for example pronectin.
  • Parmar et al. (American Journal of Ophthalmology 299 et seq. (2006)) describe the in vitro cultivation of human amniotic epithelial cells on the concave side of a collagen form for the preparation of a graft as a replacement of the cornea.
  • Talbot (Molecular Vision, 65-75 (2006)) describes the production of corneal epithelium by cultivating rabbit limbic epithelial cells on a fibrin gel matrix.
  • Yamauchi et al. J. of Biomedical Mat. Res. 31, 439-444 (1996) discloses coating cell culture vessels with a keratin solution obtained by degreasing sheep's wool, incubating in concentrated urea solution with SDS and 2-mercaptoethanol at neutral pH for 12 h At 50 ° C., followed by dialysis against 0.08% by weight of 2-mercaptoethanol in water, 10 ml of the reduced keratin solution were mixed with 0.08 ml of 50% glycerol, coated to 40 cm and dried. Yamauchi et al., J.
  • Biomater, Polymer., Edn, 9: 259-270 (1998)) describe culturing L929 fibroblasts in polystyrene plates coated with a sheep wool keratin solution in 7M urea, 2-mercaptoethanol, and optionally SDS were. Cell growth was only detected in the absence of SDS. The keratin oil had no glycerin. Cell culture data is only for the first 48 hours after sowing.
  • Tanabe et al. (Mat. Sc. And Engineering C 24 (2004) 441-446) describe a coating prepared from reduced keratin solution and optionally 10-30% chitosan for cell culture.
  • the present invention Compared with the known prior art, it is an object of the present invention to provide a coating for substrate surfaces, which causes an improved cell growth and / or allows a better optical control of cells that are cultivated on the coating.
  • the seeding efficiency and / or the multiplication rate of the cells and / or the saturation density to be achieved are to be increased.
  • the aim is to improve the tissue regeneration.
  • the invention achieves the aforementioned objects by providing a coated surface of a carrier substrate and a method for producing a coated carrier substrate, wherein the coating of the carrier substrate comprises keratin, preferably consisting essentially of keratin.
  • the advantageous properties of the keratin coating according to the invention are particularly evident when used for the in vitro or in vivo cultivation of epithelial or endothelial cells.
  • the keratin coating is prepared by applying or coating keratin, preferably in the form of nanoparticles from an aqueous keratin solution or keratin suspension, the solution or suspension containing no reducing compounds, preferably dialyzed against water which has no additives. It is preferred that the keratin used to prepare the solution is ⁇ -keratin. Particularly preferably, the keratin solution is made of hair, for example human hair. To produce the coating, keratin is brought into solution or into nanoparticulate suspension by mixing with an aqueous composition, the aqueous composition preferably containing only thiourea, urea and mercaptoethanol. In this aqueous composition mercaptoethanol can be replaced by another reducing compound.
  • an optically transparent keratin layer By applying keratin from the aqueous keratin solution or suspension to the substrate surface, an optically transparent keratin layer can be produced, so that an optically transparent culture vessel for the cell culture can be produced with optically transparent carrier substrate, for example glass or polystyrene, due to the keratin coating allows significantly more effective cell culture.
  • optically transparent carrier substrate for example glass or polystyrene
  • keratin layers produced from the keratin solution are preferred which have a monomodal size distribution whose main value is in the range from 20 to 5000 nm, preferably 100 to 1000 nm, more preferably 100 to 200 nm.
  • the keratin coating according to the invention When comparing the keratin coating according to the invention with other peptide coatings in vessels for cell culture, it has been found that at least for some cell types of immortalized cell lines and of primary cells a higher seeding efficiency and / or a better growth was obtained. At present, it is believed that the significantly improved culturing results are due to the particular structure of the keratin coating, which has a nanoparticulate structure.
  • the keratin coating of a carrier substrate according to the invention allows colonization with animal cells, for example human amniotic epithelial cells or cornea cells, whereby the keratin coating was detachable from the carrier substrate after colonization and can be used as an implant is.
  • animal cells for example human amniotic epithelial cells or cornea cells
  • Such an implant or graft populated with animal, in particular human, cells then has no carrier substrate other than the keratin, which provides the stability of the implant.
  • a keratin film occurs in place of the keratin coating on a carrier substrate.
  • the keratin film without an additional carrier substrate can be prepared by forming the keratin film on a substrate and then separating the keratin film from the substrate, for example by peeling off a dried keratin film.
  • Such a keratin film of this embodiment like the keratin coating, can be produced from an aqueous solution or suspension of keratin and has the properties according to the invention of promoting cell growth and / or high seeding efficiency.
  • Such a keratin film is particularly suitable for use in the manufacture of implants, which may also have one or two-sided adherent animal cells which have been applied by in vitro cultivation on the surface of the keratin film.
  • a keratin film according to the invention is preferably produced on a carrier substrate which determines the mechanical stability of the composite material.
  • Suitable carrier substrates are, in particular, water-insoluble polymers, e.g. from the group comprising polymer films, in particular polyethylene terephthalate (PET).
  • the keratin film contain cell growth promoting compounds, for example PDGF (platelet growth factor), rhPDGF-BB (becaplermin), EGF (epidermal growth factor), PDECGF (platelet endothelial cell growth factor), aFGF (acidic fibroblast growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), TGF ⁇ (transformation growth factor ⁇ ), TGF ⁇ (transformation growth factor ⁇ ), KGF (Keratinocyte growth factor) IGF1 / IGF2 (insulin-like growth factors), TNF (Tumor Necrosis Factor) and / or additives that improve the adhesion of tissue, for example laminin, fibronectin and / or antibiotic agents, eg antibiotics, iodine and / or wound healing promoting agents, eg dexpanthenol.
  • cell growth promoting compounds for example PDGF (platelet growth factor), rhPDGF-BB (becaplermin), EGF (epidermal growth
  • the coating according to the invention of keratin on a carrier substrate, or the keratin film without adhesive carrier substrate is preferably produced by producing a keratin film on a carrier substrate from an aqueous solution or suspension of keratin, optionally with subsequent separation of the keratin film. Keratin is applied by wetting a substrate surface with the aqueous keratin solution or suspension.
  • the obtained coating of keratin on the surface of the carrier substrate contacted by the keratin solution is well suited for the cultivation of animal cells because of the high cell growth and the high seeding efficiency.
  • the optical transparency of the applied keratin layer does not decrease significantly with increasing layer thickness.
  • Thin keratin films can have a higher transparency and also retain the advantageous properties for cell cultivation and wound healing of larger layer thicknesses.
  • the surface of the carrier substrate to be coated can be coated with keratin by contacting with the aqueous keratin solution under conditions under which keratin separates from the aqueous solution or suspension. Such conditions are e.g. the presence of atmospheric oxygen in contact with the aqueous keratin solution or suspension, wherein the keratin solution has no reducing components.
  • the deposited keratin may be removed from the carrier substrate after solidifying the deposited keratin.
  • the solidification of the keratin solution is achieved by drying off the solution water.
  • Preferred layer thicknesses of the keratinous film according to the invention on a carrier substrate are in the range of 0.1 to 1 ⁇ m, preferably 0.2 to 0.6 ⁇ m, for keratin films in the range of 1 to 100 ⁇ m, preferably 1 to 50 ⁇ m, more preferably 2 to 20 microns.
  • ⁇ -keratin of natural origin is used, preferably of human origin Hair.
  • the ⁇ -keratin is brought into solution, for example, by urea and mercaptoethanol, preferably in combination with thiourea in water. Undissolved constituents can be removed by centrifugation at 10,000 x g, optionally by alternative or additional filtration.
  • Urea, mercaptoethanol and / or thiourea are substantially separated from the keratin-containing fraction by extensive dialysis against distilled water.
  • the dialysate has a size distribution Z M ittei so% of 109 nm, with Di 0 ⁇ 84 nm and D 90 > 140 nm found in some examples.
  • This keratin solution which in the present case is also referred to as a suspension of nanoparticles of keratin, is contacted with the surface of a carrier substrate to be coated, excess is removed and the wetted surface is allowed to dry.
  • This method of contacting and drying can be repeated to produce a thicker keratin layer.
  • the thickness of the keratin infiltrant obtained increases with both the keratin concentration the solution used as well as with the increase in the volume of the keratin solution from which solution water is removed on the carrier substrate.
  • the resulting keratin film is transparent to visible light. Electron microscopy reveals nanostructures, which in the present case are also called nanoparticles.
  • the deposited keratin film contains substantially no free thiol groups and it is believed that they are already substantially completely oxidized in the dialysate, i. after removal of the keratin added reducing compounds.
  • the cells cultured on a keratin-coated support substrate were suitable for in vitro experiments for permeation of drugs through a cell layer, e.g. If the carrier substrate is a polycarbonate filter with pores in the range of 0.4 to 3 microns, so even diffusion permeable.
  • the cells were cultured unilaterally on the keratin-coated polycarbonate filter.
  • the keratin film is crosslinked, for example by contacting the keratin nanoparticle deposited from the keratin suspension on a carrier substrate with a crosslinking agent, for example reagent which has at least two keratin-reactive functional groups.
  • a crosslinking agent for example reagent which has at least two keratin-reactive functional groups.
  • Suitable crosslinking reagents have, for example, at least two carbonyl groups and / or imide groups. It has been found that glutaraldehyde and carbodiimides, for example 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide or succinimides, for example N-hydroxysuccinimide, are suitable.
  • unreacted crosslinking reagent is removed or, preferably, removed by increasing the temperature to up to 200 ° C. or converted into products harmless to the cell culture.
  • the crosslinking leads to an increase in the mechanical stability of the keratin film, whether as a coating of a carrier substrate, or after detachment from the carrier substrate, of the single-layered keratin film.
  • an increase in the mechanical stability of the keratin film by increasing the temperature, for example during or after removal of the solution water, up to 200 ° C., preferably 80-180 ° C., more preferably 100 to 130 0 C for a time of 1 to 30 min, preferably 2 to 15 min carried out.
  • FIG. 1 shows the measurement result of the photon correlation spectroscopy of the keratin solution according to Comparative Example 2 (Y axis shows intensity in%)
  • FIG. 2 shows the measurement result of the photon correlation spectroscopy of the keratin solution according to Example 1 (Y axis shows intensity in%)
  • FIG. 4 shows scanning electron micrographs of keratin layers according to comparative experiment 2, namely at A) with 90 ⁇ m edge length, B) 18 ⁇ m edge length, C) after scribe, 90 ⁇ m edge length and D), as cutout from C), with 30 ⁇ m edge length,
  • FIG. 5 shows a scanning electron micrograph of a keratin film according to the invention
  • FIG. 6 shows a scanning electron micrograph of a keratin film according to the invention after partial detachment from the carrier substrate
  • FIG. 7 shows a scanning electron micrograph of a section of FIG. 6,
  • FIG. 8 shows a detail of FIG. 7 and FIG.
  • aqueous keratin solution 20 g of human hair was washed with a 0.5% SDS solution, dried and degreased overnight by incubation with n-hexane. After removal of the hexane, 400 mL of a 25 mM Tris solution (pH 8.5) of 2 M thiourea, 5 M urea and 5% mercaptoethanol in water are added. After sealing the vessel with parafilm was stirred at 50 0 C for 72 h. Undissolved constituents were removed by centrifugation on a laboratory centrifuge at about 10,000 ⁇ g (10 min, 5,000 rpm); the supernatant was additionally filtered through a filter with a pore size of 2.5 ⁇ m.
  • the keratin solution is pipetted into wells of a microtiter plate (polystyrene), in which a 5 wt .-% TCA solution was placed in water. This leads to a white precipitation of the protein. The precipitation is allowed to settle, then the supernatant is removed and the plate is dried. It remains a white, optically opaque film back. To remove TCA, the dried film was washed several times with distilled water. In comparative experiments with uncoated microtiter plates, no significant or only slight improvement in growth rate or seeding efficiency was found in the animal cell culture, while the microtiter plates coated according to the invention (according to Example 1) gave improved growth rate and seeding efficiency values for a large number of cell lines. The measured values are listed in Table 1 of Example 2 below.
  • a reduced keratin coated cell culture plate was prepared according to Yamauchi et al. J. Biomater, Polym. Ed 9: 259-270 (1998)) without using SDS in the keratin solution.
  • Electron micrographs are shown in Figure 4, A) - D), in which irregularities of this keratin coating are noticeable, while the keratin film according to the invention, of which electron micrographs are shown in Figures 5-9, is significantly more homogeneous with a planar surface.
  • Example 1 Production of a Plastic Surface with Keratin Coating
  • keratin is deposited from an aqueous solution.
  • the aqueous keratin solution was degreased by washing 20 g of human hair with a 0.5% SDS solution, drying, and incubating with n-hexane overnight. After removal of the hexane, 400 mL of a 25 mM Tris solution (pH 8.5) of 2 M thiourea, 5 M urea and 5% mercaptoethanol in water are added. After sealing the vessel with parafilm was stirred at 50 0 C for 72 h.
  • the filtrate was dialyzed against distilled water, for example by means of a Spektrapore 1 membrane (exclusion limit 6-8000 Da), usually per 100 mL of filtrate against 5 L of water over 72 h with 6-fold replacement of the water.
  • the dialysate was in a Centrifuge centrifuged at 15,000 rpm for 10 min to remove aggregates.
  • the centrifugate can be used directly for the preparation of coated carrier substrates or for the production of keratin films.
  • the measurement result of the photon correlation spectroscopy for the particle size distribution is shown in FIG. 2 and has a narrow monomodal size distribution with a Z-average (Z-mean) of 120 nm and a polydispersity index of 0.07.
  • the Bradford protein concentration of the keratin solution according to the invention was about twice as high as that of Comparative Example 2 according to Yamauchi.
  • microtiter plates for cell culture of polystyrene or polycarbonate were used and contacted with such a volume that the surface was wetted throughout.
  • 400 ⁇ L of coating solution was pipetted per well. Immediately after pipetting, d. H. After about 5 to 10 seconds, the solution was completely removed and the surface allowed to air dry under sterile conditions. This contacting with subsequent drying was repeated 2 to 5 times. The plates are stable after drying and can be stored at room temperature.
  • Sterilization of the coated surfaces may be accomplished by irradiation or wetting in 70% ethanol / water for 2 hours followed by drying.
  • FIGS. 3 A) and B Optical microscopic views of a keratin coating produced in this way are shown in FIGS. 3 A) and B), the magnification being given by the dimensions of the burnt-in dimensional bar.
  • FIGS. 3 A) and B which show keratin coatings according to the comparative example, the significantly increased homogeneity and optical transparency of the keratin film according to the invention becomes clear.
  • FIG. 5 shows a scanning electron micrograph of a keratin film according to the invention in wells of a microtitre plate (polystyrene) with an edge length of the recording of approximately 18 ⁇ m.
  • a microtitre plate polystyrene
  • FIG. 6 shows a section of a coated surface in which the applied keratin coating was detached in sections by scribing with a needle.
  • the Edge length of the electron micrograph of Figure 6 is about 180 microns.
  • FIG. 7 shows a section of the receptacle of FIG. 6, approximately in the center, with an edge length of the receptacle of approximately 45 ⁇ m.
  • FIG. 8 A further detail enlargement of FIG. 7, approximately in the upper third center, is shown in FIG. 8, wherein the edge length of the receptacle is approximately 18 ⁇ m; a further fragmentary enlargement of Figure 8, approximately the middle of the recording is shown in Figure 9 (edge length of the recording 4.5 microns).
  • the keratin layer produced according to the invention contains nanoparticles or substructures having diameters of about 0.3 to 0.4 ⁇ m.
  • the aqueous keratin solution with intermediate drying layer thicknesses of keratin of about 1.5 to 4 microns were produced.
  • Example 2 Culturing of Animal Cells on Plastic Surfaces with Keratin Coating
  • Culture vessels for cell culture made of polystyrene with keratin coating prepared according to Example 1 were each seeded approximately 30,000 cells after trypsinization in fresh cell culture medium.
  • the cells of three wells were detached at the same time by trypsinizing and counted in the Coulter counter. From the obtained values a growth curve could be created (logarithm of the cell number over growth time). From the growth curve, the lag phase, the population doubling time (PDT) and the achieved saturation density were determined graphically with sigmoid adaptation.
  • PDT population doubling time
  • the wells were seeded with 100,000 cells per well in cell culture medium. After culturing for 14 h, the medium is aspirated, the well rinsed and the attached cells are detached by trypsinization and counted. The Sowing efficiency is calculated as the quotient of the number of cells attached to the number of originally inserted cells.
  • Table 1 Comparison of seed efficiency on uncoated polystyrene microtiter plate with keratin-coated according to the invention and keratin-coated by TCA precipitation
  • Caco-2 Caco-2 cell line (Co ion carcinoma, human), immortalized HaCaT HaCaT cell line (epidermis, human), immortalized Sirc SIRC cell line (corneal epithelium, rabbit), immortalized Cepi cepi cell line (corneal epithelium, human), immortalized
  • Cepi serum reduced
  • HCK HCK cell line corneal fibroblasts, human
  • Hufib HUFIB corneal fibroblasts, human
  • SZ 95 (sebocytes, human), immortalized
  • HCE-T HCE-T (corneal epithelium, human), immortalized
  • PHK PHK keratinocytes, human
  • the method produced structure of the keratin film is, in particular on the solubilization of hair in the presence of thiourea and the absence of 2-mercaptoethanol during dialysis, while according to Comparative Experiment 2, the solubilization without thiourea was carried out and the dialysis against water containing 2-mercaptoethanol.
  • Example 3 Cultivation of cells on keratin-coated surfaces for use in measuring the permeation of drugs through cell layers
  • keratin-coated polycarbonate filters For the in vitro measurement of permeation of drugs by cultured cells, cells were grown on keratin-coated polycarbonate filters according to the present invention, the polycarbonate filters themselves being diffusion permeable due to pores having sizes in the range of 0.4-3 ⁇ m. According to Example 2, a keratin coating was produced on the polycarbonate filter, on which in turn cells were cultured under cell culture conditions one or more layers.
  • the cells grown on the keratin layer of the polycarbonate support could be used to measure the diffusion of drugs through the cell layers.
  • a drug Na-fluorescein was used, which was abandoned on one side of the cultured cells.
  • the permeation through the cell layers was determined by fluorescence spectroscopy.
  • a mixture with 60% by weight of polyvinylpyrrolidone, 35% by weight of polyethylene glycol 400 and 5% by weight of sodium carboxymethylcellulose according to Example 1 was provided with a keratin layer as an example for an elastic carrier substrate.
  • glycerin was optionally applied in aqueous solution and the water removed by drying, alternatively polyethylene glycol and / or polypropylene glycol.
  • the carrier substrate had the adherent keratin layer and could be used to cover wounds.
  • a keratin film for use in the preparation of pharmaceutical compositions was prepared by depositing a keratin film according to Example 1 on a carrier substrate.
  • the carrier substrate used was preferably a polymer which had only a slight adhesion to the keratin film deposited thereon, for example siliconized PET.
  • the keratin layer could be provided with a plasticizer after deposition, or the plasticizer could already be added to the aqueous keratin solution.
  • Glycerol, polyethylene glycol, polypropylene glycol and mixtures of these are particularly suitable as plasticizers.
  • the keratin film was obtained by mechanical removal from the carrier substrate.
  • Such a keratin film could be used as a wound dressing, or for the production of an implant.
  • crosslinking of the keratin particles was achieved by applying a 4% by weight glutaraldehyde solution, incubating at room temperature for 12 h, then removing the glutaraldehyde and washing with water.
  • the resulting keratin film may be dried at room temperature or used hydrated.
  • Example 6 Preparation of an Animal Cell Implant on a Keratin Fluff
  • Talbot et al. Molecular Vision 65-75 (2006) isolated rabbit corneal cells or according to Parmar et al. (American J. of Ophthalmology, pp. 299-300 (Feb.

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Abstract

Die Erfindung stellt eine Keratinbeschichtung eines Trägersubstrats und ein Verfahren zu deren Herstellung bereit. Diese Keratinbeschichtung ist insbesondere für die in vitro oderin vivo Kultivierung von Epithel- oder Endothelzellen geeignet und wegen ihrer optischen Durchlässigkeit für die Mikroskopie. Die Keratinbeschichtung wird durch Aufbringen oder Beschichten von Keratin in Form von Nanopartikeln aus einer wässrigen Keratinlösung oder Keratinsuspension hergestellt, wobei die Lösung oder Suspension keine reduzierenden Verbindungen enthält. Dabei wird die Keratinlösung bevorzugt aus Haaren hergestellt, beispielsweise menschlichen Haaren. Zur Herstellung der Beschichtung wird Keratin durch Mischen mit einer wässrigen Zusammensetzung in Lösung bzw. in nanopartikuläre Suspension gebracht, die Thioharnstoff, Harnstoff und Mercaptoethanol enthält.

Description

Beschichtete Oberfläche für die Zellkultur
Die vorliegende Erfindung betrifft eine beschichtete Oberfläche eines natürlichen oder synthetischen Substrats, das Verfahren zur Herstellung der beschichteten Oberfläche und die Verwendung der beschichteten Oberfläche zur Förderung des Zellwachstums in vitro oder in vivo. Das Trägersubstrat kann ein natürliches oder synthetisches Polymer sein, beispielsweise ein Kunststoff wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polybutylen, Polyacrylat, Polycarbonat und Copolymere dieser oder ein mineralisches Trägersubstrat, beispielsweise Keramik oder Glas.
Bei Verwendung der erfindungsgemäß beschichteten Oberfläche zur in vitro Kultivierung tierischer Zellen wird die Oberfläche als Teil des Kultivierungsgefäßes eingesetzt; für die Verwendung in vivo wird die erfindungsgemäß beschichtete Oberfläche zur Herstellung medizinischer Produkte zur Förderung der Wundheilung eingesetzt, beispielsweise in Form von Wundauflagen. Erfindungsgemäß beschichtete Oberflächen oder Formen aus dem Material der erfindungsgemäßen Beschichtung können auch zur Herstellung von Implantaten verwendet werden, die auf der Oberfläche kultivierte Zellen aufweisen, die z.B. als Ersatz für Gewebe oder Gewebsschichten, beispielsweise die Cornea verwendet werden.
Stand der Technik
Die DE 698 08 291 T2 offenbart einen Wundverband mit einer Oberfläche, die eine biologisch abbaubare Zellverankerungsschicht aufweist, die aus Heparin, Inositolphosphat, Fucoidin, Syndecan, Betaglycan, Perlecan, Dextransulfat, Pentosan, Mesoglycan, Polyvinylsulfat oder Polylysin besteht.
Die AT 412 781 B beschreibt Formkörper aus Kunststoff, der mit biologischem Fasermaterial gefüllt ist, z.B. mit Stärke, Mais- oder Reismehl, Gluten, Kollagen, Keratin, Lignin, Pektin und Hemicellulosen. Die Verarbeitung erfolgt durch Spritzgießen.
Die WO 95/01998 beschreibt Thermoplasten zur Herstellung von Gefäßen für die Zellkultur, denen ein thermostabiles Polypeptid zugemischt ist, beispielsweise Pronektin.
Parmar et al. (American Journal of Ophthalmology 299 ff (2006)) beschreiben die in vitro Kultivierung von menschlichen amniotischen Epithelzellen auf der konkaven Seite einer Collagenform zur Herstellung eines Transplantats als Ersatz der Cornea.
Talbot (Molecular Vision, 65-75 (2006)) beschreibt die Herstellung von Cornea-Epithel durch Kultivierung von limbischen Epithelzellen des Kaninchen auf einer Fibringel-Matrix.
Für die Zellkultur sind Gefäße aus Polymeren bekannt, die eine Beschichtung aus Laminin, Fibronectin, Kollagen oder Polylysin aufweisen. So beschreiben Yamauchi et al. (J. of Biomedical Mat. Res. 31, 439-444 (1996) die Beschichtung von Gefäßen für die Zellkultivierung mit einer Keratinlösung, die durch Entfetten von Schafwolle, Inkubieren in konzentrierter Harnstoffiösung mit SDS und 2-Mercaptoethanol bei neutralem pH für 12 h bei 50 0C und anschließender Dialyse gegen 0,08 Gew.-% 2-Mercaptoethanol in Wasser hergestellt wurde. Zur Beschichtung wurden 10 mL der Lösung reduzierten Keratins mit 0,08 mL 50 % Glyzerin versetzt, auf 40 cm aufgetragen und getrocknet. Yamauchi et al (J. Biomater. Sei. Polymer Edn, 9: 259-270 (1998)) beschreiben die Kultivierung von L929 Fibroblasten in Polystyrolplatten, die mit einer Keratinlösung aus Schafwolle in 7 M Harnstoff, 2-Mercaptoethanol und optional SDS beschichtet worden waren. Nur in Abwesenheit von SDS wurde Zellwachstum festgestellt. Der Keratinfϊlm wies kein Glycerin auf. Die Daten zur Zellkultivierung betreffen nur die ersten 48 h nach Aussaat.
Tanabe et al. (Mat. Sc. and Engineering C 24 (2004) 441-446) beschreiben eine Beschichtung, die aus reduzierter Keratinlösung und wahlweise 10-30 % Chitosan hergestellt wird, zur Zellkultur.
Aufgabe der Erfindung
Gegenüber dem bekannten Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Beschichtung für Substratoberflächen bereitzustellen, die ein verbessertes Zellwachstum bewirkt und/oder eine bessere optische Kontrolle von Zellen, die auf der Beschichtung kultiviert sind, erlaubt. Bei der Verwendung zur in vitro Kultivierung tierischer Zellen ist dabei die Aussaat-Effizienz und/oder die Vermehrungsrate der Zellen und/oder die zu erreichende Sättigungsdichte zu erhöhen. Bei der Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Produkte, beispielsweise von Wundauflagen oder bei der Verwendung zur Herstellung von Implantaten, wird die Verbesserung der Gewebsregenerierung angestrebt.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die vorgenannten Aufgaben durch Bereitstellung einer beschichteten Oberfläche eines Trägersubstrats und eines Verfahrens zur Herstellung eines beschichteten Trägersubstrats, wobei die Beschichtung des Trägersubstrats Keratin aufweist, vorzugsweise im wesentlichen aus Keratin besteht. Die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Keratinbeschichtung zeigen sich insbesondere bei der Verwendung für die in vitro oder in vivo Kultivierung von Epithel- oder Endothelzellen.
Die Keratinbeschichtung wird durch Aufbringen oder Beschichten von Keratin, vorzugsweise in Form von Nanopartikeln aus einer wässrigen Keratinlösung oder Keratinsuspension hergestellt, wobei die Lösung oder Suspension keine reduzierenden Verbindungen enthält, vorzugsweise gegen Wasser dialysiert wurde, das keine Zusätze aufweist. Dabei ist es bevorzugt, dass das zur Herstellung der Lösung eingesetzte Keratin α- Keratin ist. Besonders bevorzugt wird die Keratinlösung aus Haaren hergestellt, beispielsweise menschlichen Haaren. Zur Herstellung der Beschichtung wird Keratin durch Mischen mit einer wässrigen Zusammensetzung in Lösung bzw. in nanopartikuläre Suspension gebracht, wobei die wässrige Zusammensetzung vorzugsweise nur Thioharnstoff, Harnstoff und Mercaptoethanol enthält. In dieser wässrigen Zusammensetzung kann Mercaptoethanol durch eine andere reduzierende Verbindung ersetzt werden.
Durch Aufbringen von Keratin aus der wässrigen Keratinlösung oder -Suspension auf die Substratoberfläche kann eine optisch transparente Keratinschicht erzeugt werden, so dass bei optisch transparentem Trägersubstrat, beispielsweise Glas oder Polystyrol, ein optisch transparentes Kultivierungsgefäß für die Zellkultur hergestellt werden kann, das auf Grund der Keratinbeschichtung eine signifikant effektivere Zellkultivierung erlaubt.
Die Analyse der Größenverteilung der erfindungsgemäß für die Herstellung der Keratinbeschichtung eingesetzten Lösung oder nanopartikulären Suspension von Keratin, auch als wässrige Zusammensetzung von Keratin oder solubilisiertes Keratin bezeichnet, zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Lösen bzw. Solubilisieren eine sehr enge, monomodale Größenverteilung um etwa 50 - 250 nm erzeugt. In der Photonenkorrelationsspektroskopie mittels dynamischer Laserlichtstreuung kann ein Polydispersitätsindex analysiert werden, der signifikant kleiner als der für Keratinlösungen nach dem Stand der Technik ist. Entsprechend sind aus der Keratinlösung erzeugte Keratinschichten bevorzugt, die eine monomodale Größenverteilung aufweisen, deren Hauptwert im Bereich von 20 bis 5000 nm, vorzugsweise 100 bis 1000 nm, bevorzugter 100 bis 200 nm liegt.
Beim Vergleich der erfindungsgemäßen Keratinbeschichtung mit anderen Peptidbeschichtungen in Gefäßen für die Zellkultur hat sich gezeigt, dass zumindest für einige Zelltypen immortalisierter Zelllinien und von Primärzellen eine höhere Aussaateffizienz und/oder ein besseres Wachstum erhalten wurde. Gegenwärtig wird angenommen, dass die signifikant verbesserten Kultivierungsergebnisse auf der besonderen Struktur der Keratinbeschichtung beruht, die eine nanopartikuläre Struktur aufweist. Bei der Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Produkte, beispielsweise eines Cornea-Implantats, ermöglicht die erfindungsgemäße Keratinbeschichtung eines Trägersubstrats die Besiedlung mit tierischen Zellen, beispielsweise menschlichen amniotischen Epithelzellen oder Cornea-Zellen, wobei die Keratinbeschichtung nach der Besiedlung von dem Trägersubstrat ablösbar war und als Implantat verwendbar ist. Ein solches mit tierischen, insbesondere menschlichen Zellen besiedeltes Implantat oder Transplantat weist dann kein Trägersubstrat außer dem Keratin auf, das die Stabilität des Implantats bereitstellt.
Bei der Verwendung der Keratinbeschichtung zur Herstellung pharmazeutischer Produkte für medizinische Zwecke, z.B. als Transplantat oder Implantat, ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass an die Stelle der Keratinbeschichtung auf einem Trägersubstrat ein Keratinfilm tritt. Der Keratinfilm ohne zusätzliches Trägersubstrat kann durch Erzeugen des Keratinfilms auf einem Substrat und anschließende Trennung des Keratinfϊlms von dem Substrat, beispielsweise durch Ablösen eines getrockneten Keratinfilms hergestellt werden. Ein solcher Keratinfilm dieser Ausführungsform ist wie die Keratinbeschichtung aus einer wässrigen Lösung oder Suspension von Keratin herstellbar und weist die erfindungsgemäßen Eigenschaften der Förderung des Zellwachstums und/oder hohen Aussaateffizienz auf. Ein solcher Keratinfilm ist insbesondere zur Verwendung bei der Herstellung von Implantaten geeignet, die auch ein- oder zweiseitig anhaftende tierische Zellen aufweisen können, die durch in vitro Kultivierung auf die Oberfläche des Keratinfilms aufgebracht wurden.
Zur Verwendung bei der Herstellung von Wundauflagen wird ein erfindungsgemäßer Keratinfilm vorzugsweise auf einem Trägersubstrat erzeugt, das die mechanische Stabilität des Materialverbunds bestimmt. Als Trägersubstrat kommen insbesondere wasserunlösliche Polymere in Betracht, z.B. aus der Gruppe, die Polymerfolien umfaßt, insbesondere aus Polyethylenterephthalat (PET).
Bei der Herstellung von Wundauflagen ist es bevorzugt, dass der Keratinfilm zellwachstumsfördernde Verbindungen enthält, beispielsweise PDGF (Plättchenwachstumsfaktor), rhPDGF-BB (Becaplermin), EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), PDECGF (Plättchen-Endothelzellen- Wachstumsfaktor), aFGF (saurer Fibroblastenwachstumsfaktor), bFGF (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor), TGFß (Transformationswachstumsfaktor ß), TGFα (Transformationswachstumsfaktor α), KGF (Keratinozytenwachstumsfaktor) IGF1/IGF2 (insulinähnliche Wachstumsfaktoren), TNF (Tumornekrosefaktor) und/oder Additive, die das Anhaften von Gewebe verbessern, beispielsweise Laminin, Fibronektin und/oder antibiotische Wirkstoffe, z.B. Antibiotika, Jod und/oder wundheilungsfördernde Stoffe, z.B. Dexpanthenol.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Beschichtung aus Keratin auf einem Trägersubstrat, bzw. der Keratinfilm ohne anhaftendes Trägersubstrat, wird vorzugsweise durch Erzeugung eines Keratinfilms auf einem Trägersubstrat aus einer wässrigen Lösung oder Suspension von Keratin hergestellt, ggf. mit anschließender Abtrennung des Keratinfilms. Das Aufbringen des Keratins erfolgt durch Benetzen einer Substratoberfläche mit der wässrigen Keratinlösung oder -Suspension. Die erhaltene Beschichtung aus Keratin auf der von der Keratinlösung kontaktierten Oberfläche des Trägersubstrats ist wegen des hohen Zellwachstums und der hohen Aussaateffizienz gut zur Kultivierung tierischer Zellen geeignet. Überraschenderweise nimmt die optische Transparenz der aufgebrachten Keratinschicht nicht signifikant mit zunehmender Schichtdicke ab. Dünne Keratinfilme können eine höhere Transparenz aufweisen und auch die vorteilhaften Eigenschaften für die Zellkultivierung und Wundheilung größerer Schichtdicken beibehalten.
Abhängig von dem Trägersubstrat haftet aufgebrachtes Keratin auf dessen Oberfläche an, so dass beispielsweise für Kunststoffe oder Glas, die zur Herstellung von Gefäßen für Zellkultivierung eingesetzt werden, ohne weitere Zusätze eine ausreichend stabile Anhaftung des Keratinfilms erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die zu beschichtende Oberfläche des Trägersubstrats durch Kontaktieren mit der wässrigen Keratinlösung unter Bedingungen mit Keratin beschichtet werden, unter denen sich Keratin aus der wässrigen Lösung bzw. Suspension abscheidet. Derartige Bedingungen sind z.B. das Vorhandensein von Luftsauerstoff in Kontakt mit der wässrigen Keratinlösung oder - Suspension, wobei die Keratinlösung keine reduzierenden Bestandteile aufweist.
In Abhängigkeit von der Konzentration an Keratin in der wässrigen Lösung lässt sich durch Kontaktieren des Trägersubstrats mit wässriger Keratinlösung oder -Suspension für eine Zeitdauer im Bereich von 5 s bis 10 min einfach oder, mit zwischenzeitlichem Trocknen, mehrfaches Kontaktieren eine erfindungsgemäße Keratinbeschichtung auf der Oberfläche des Trägersubstrats herstellen. Dabei hat sich gezeigt, dass es für die optische Durchlässigkeit vorteilhaft ist, eine möglichst dünnschichtige Keratinbeschichtung herzustellen, während es für die Ausführungsform, in der ein Keratinfilm erzeugt und verwendet wird, für die mechanische Stabilität vorteilhaft ist, eine größere Schichtdicke zu erzeugen, durch einfaches, vorzugsweise mehrfaches Auftragen der wässrigen Keratinlösung oder -Suspension auf eine Oberfläche. In der Ausführungsform der Erfindung als Keratinfilm ohne anhaftendes Trägersubstrat kann das abgeschiedene Keratin nach Verfestigen des abgeschiedenen Keratins von dem Trägersubstrat entfernt werden. Das Verfestigen des Keratinfϊlms wird durch die Abtrocknung des Lösungswassers erreicht.
Bevorzugte Schichtdicken des erfindungsgemäßen Keratinfϊlms auf einem Trägersubstrat liegen im Bereich von und 0,1 bis 1 μm, vorzugsweise 0,2 bis 0,6 μm, für Keratinfilme im Bereich von 1 bis 100 μm, vorzugsweise 1 bis 50 μm, bevorzugter 2 bis 20 μm.
Zur Herstellung der Keratinlösung, die neben gelöstem Keratin suspendierte Nanopartikel aus Keratin enthält und für die Zwecke der Erfindung gleichbedeutend auch als Keratinsuspension bezeichnet wird, aus der die erfindungsgemäße Keratinbeschichtung und der Keratinfilm herstellbar sind, wird vorzugsweise α-Keratin natürlicher Herkunft verwendet, vorzugsweise aus menschlichem Haar. Das α-Keratin wird beispielsweise durch Harnstoff und Mercaptoethanol, vorzugsweise in Kombination mit Thioharnstoff in Wasser in Lösung gebracht. Ungelöste Bestandteile können durch Zentrifugation bei 10.000 x g, optional durch alternative oder zusätzliche Filtration entfernt werden.
Harnstoff, Mercaptoethanol und/oder Thioharnstoff werden durch extensive Dialyse gegen destilliertes Wasser im Wesentlichen von der keratinhaltigen Fraktion abgetrennt. Das Dialysat weist eine Größenverteilung ZMittei so % von 109 nm auf, wobei Di0 < 84 nm und D90 > 140 nm in einigen Beispielen gefunden wurden.
Diese Keratinlösung, die vorliegend auch als Suspension von Nanopartikeln aus Keratin bezeichnet wird, wird mit der zu beschichtenden Oberfläche eines Trägersubstrats kontaktiert, Überschuss wird entfernt und die benetzte Oberfläche trocknen gelassen. Dieses Verfahren des Kontaktierens und Trocknens kann wiederholt werden, um eine dickere Keratinschicht zu erzeugen. Die Dicke des erhaltenen Keratinfϊlms steigt sowohl mit der Keratinkonzentration der verwendeten Lösung als auch mit der Zunahme des Volumens der Keratinlösung, aus dem auf dem Trägersubstrat Lösungswasser entfernt wird, an.
Der erhaltene Keratinfilm ist für sichtbares Licht durchlässig. In der Elektronenmikroskopie sind Nanostrukturen sichtbar, die vorliegend auch als Nanopartikel bezeichnet werden. Der abgeschiedene Keratinfilm enthält im Wesentlichen keine freien Thiolgruppen und es wird angenommen, dass diese bereits im Dialysat im Wesentlichen vollständig oxidiert sind, d.h. nach Entfernen der dem Keratin zugesetzten reduzierenden Verbindungen.
Bei der Kultivierung von Zellen in vitro in Zellkulturgefäßen, deren Oberflächen erfindungsgemäß mit einem Keratinfilm beschichtet waren, wurden neben einer höheren Aussaateffizienz eine schnellere Verdoppelungsrate und eine signifikant höhere Sättigungsdichte für eine Vielzahl von Zelltypen gefunden.
Die auf einem keratinbeschichteten Trägersubstrat kultivierten Zellen eigneten sich für in vitro Versuche zur Permeation von Wirkstoffen durch eine Zellschicht, z.B. wenn das Trägersubstrat ein Polycarbonatfilter mit Poren im Bereich von 0,4 bis 3 μm ist, also selbst diffusionsdurchlässig ist. Die Zellen wurden einseitig auf dem Keratin beschichteten Polycarbonatfilter kultiviert.
In weiter bevorzugter Ausführungsform ist der Keratinfilm vernetzt, beispielsweise durch Kontaktieren der aus der Keratinsuspension auf ein Trägersubstrat abgeschiedenen Keratinnanopartikel mit einem Vernetzungsmittel, beispielsweise Reagenz, das mindestens zwei mit Keratin reaktive funktionale Gruppen aufweist. Geeignete Vernetzungsreagenzien weisen z.B. mindestens zwei Carbonylgruppen und/oder Imidgruppen auf. Es hat sich gezeigt, dass Glutaraldehyd und Carbodiimide, z.B. l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid oder Succinimide, z.B. N-Hydroxysuccinimid geeignet sind. Im Anschluß an die Kontaktierung wird nicht umgesetztes Vernetzungsreagenz entfernt oder, vorzugsweise, durch Temperaturerhöhung auf bis zu 200 0C entfernt bzw. zu für die Zellkultur unschädlichen Produkten umgesetzt.
Die Vernetzung führt zu einer Erhöhung der mechanischen Stabilität des Keratinfilms, ob als Beschichtung eines Trägersubstrats, oder nach dem Ablösen vom Trägersubstrat, des einschichtigen Keratinfilms. Alternativ oder zusätzlich zur Kontaktierung des aus der Suspension abgeschiedenen Keratinfilms mit Vernetzungsreagenz kann eine Erhöhung der mechanischen Stabilität des Keratinfilms durch Temperaturerhöhung, z.B. während oder nach Entfernung des Lösungswassers, auf bis zu 200 0C, vorzugsweise auf 80 bis 180 0C, bevorzugter auf 100 bis 130 0C für eine Zeit von 1 bis 30 min, vorzugsweise 2 bis 15 min erfolgen.
Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen
- Figur 1 das Meßergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie der Keratinlösung nach Vergleichsbeispiel 2 zeigt (Y-Achse zeigt Intensität in %),
- Figur 2 das Meßergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie der Keratinlösung nach Beispiel 1 zeigt (Y-Achse zeigt Intensität in %),
- Figur 3 lichtmikroskopische Aufnahmen einer A) erfindungsgemäßen Keratinschicht, Vergrößerung für Balken = 100 μm, B) erfindungsgemäßen Keratinschicht, Balken = 200 μm und eine Keratinschicht nach Vergleichsversuch 2 bei C) Vergrößerung für Balken = 100 μm, D) Vergrößerung für Balken = 200 μm, E) Vergrößerung für Balken = 500 μm zeigt,
- Figur 4 rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Keratinschichten nach Vergleichsversuch 2 zeigt, nämlich bei A) mit 90 μm Kantenlänge, B) 18 μm Kantenlänge, C) nach Anritzen, 90 μm Kantenlänge und D), als Ausschnitt von C), mit 30 μm Kantenlänge,
- Figur 5 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinfilms zeigt,
- Figur 6 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinfilms nach bereichsweiser Ablösung vom Trägersubstrat zeigt,
- Figur 7 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Ausschnitts von Figur 6 zeigt,
- Figur 8 einen Ausschnitt von Figur 7 zeigt und
- Figur 9 einen Ausschnitt von Figur 8 zeigt. Vergleichsbeispiel 1 : Herstellung einer Kunststoffoberfläche mit Keratinbeschichtung durch Ausfällung mit Trichloressigsäure (TCA)
Für eine wässrige Keratinlösung wurden 20 g menschlicher Haare mit einer 0,5 % SDS- Lösung gewaschen, getrocknet und durch Inkubation mit n-Hexan über Nacht entfettet. Nach Entfernen des Hexans werden 400 mL einer 25 mM Tris-Lösung (ph 8,5) 2 M Thioharnstoff, 5 M Harnstoff und 5 % Mercaptoethanol in Wasser zugegeben. Nach Verschließen des Gefäßes mit Parafilm wurde für 72 h bei 50 0C gerührt. Ungelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugieren auf einer Laborzentrifuge bei ca. 10.000 x g (10 min, 5.000 upm) entfernt; der Überstand wurde zusätzlich durch einen Filter mit einer Porengröße von 2,5 μm filtriert.
Die Keratinlösung wird in Näpfe einer Mikrotiterplatte (Polystyrol) pipettiert, in denen eine 5 Gew.-% TCA Lösung in Wasser vorgelegt war. Dabei kommt es zu einer weißen Ausfällung des Proteins. Der Ausfällung wird Zeit zum Absetzen gegeben, dann wird der Überstand abgenommen und die Platte getrocknet. Es bleibt ein weißer, optisch undurchlässiger Film zurück. Zur Entfernung von TCA wurde der getrocknete Film mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen. Bei Vergleichsversuchen mit unbeschichteten Mikrotiterplatten zeigte sich in der tierischen Zellkultur keine signifikante oder eine nur geringe Verbesserung der Wachstumsrate oder der Aussaateffizienz, während die erfindungsgemäß beschichteten Mikrotiterplatten (gemäß Beispiel 1) für eine Vielzahl von Zelllinien verbesserte Werte für die Wachstumsrate und Aussaateffizienz ergaben. Die gemessenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle 1 von Beispiel 2 aufgeführt.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung einer Kunststoffoberfläche mit Keratinbeschichtung aus Keratinlösung in Gegenwart reduzierender Verbindungen
Eine mit reduziertem Keratin beschichtete Platte für die Zellkultur wurde entsprechend Yamauchi et al. (J. Biomater. Sei. Polym. Ed 9: 259-270 (1998)) ohne Verwendung von SDS in der Keratinlösung hergestellt.
Im einzelnen wurde menschliches Haar (20 g) in 360 mL 7 M Harnstoff mit 32 mL 2- Mercaptoethanol in einer geschlossenen Glasflasche bei 50 0C für 24 h geschüttelt und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde dreimal gegen 12 L destilliertes Wasser mit 0,2 Gew.-% 2-Mercaptoethanol über Nacht dialysiert. Es wurde eine trübe Lösung von ca. 480 mL erhalten. Die Analyse der Partikelgrößenverteilung mit Photonenkorrelationsspektroskopie ist in Figur 1 gezeigt und ergab eine multimodale Größenverteilung mit einem Z-Average-Wert um eine Partikelgröße von ca. 125 nm und auf Grund einer stark multimodalen Verteilung einen Polydispersitätsindex von 0,41. Die Verteilungskurve zeigt drei Spitzenwerte bei ca. 115 nm, 700 nm und 4770 nm.
Der Auftrag dieser Keratinlösung nach Yamauchi erfolgte entsprechend Beispiel 1.
Lichtmikroskopische Aufnahmen sind in Figur 3 neben Aufnahmen der erfindungsgemäß beschichteten Platten gezeigt. Die Aufnahmen von Figur 3, die als C), D) und E) die gemäß diesem Vergleich beschichteten Polystyroloberflächen zeigen, sind deutlich mit Unregelmäßigkeiten versehen, die für mikroskopische Zwecke einen inhomogenen Hintergrund geben. Die erfindungsgemäßen Keratinfilme sind als Figur 3, A) und B) gezeigt und sind bei gleichen Mikroskopiebedingungen deutlich homogener.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen sind in Figur 4, A) - D) gezeigt, in denen Unebenheiten dieser Keratinbeschichtung auffallen, während der erfindungsgemäße Keratinfilm, von dem elektronenmikroskopische Aufnahmen in Figuren 5 - 9 gezeigt sind, deutlich homogener mit ebener Oberfläche ist.
Beispiel 1 : Herstellung einer Kunststoff Oberfläche mit Keratinbeschichtung Für die Herstellung einer Keratinbeschichtung auf einem Trägersubstrat, bzw. eines Keratinfilms, der von einem Trägersubstrat ablösbar ist, wird Keratin aus einer wässrigen Lösung abgeschieden. Die wässrige Keratinlösung wurde durch Waschen von 20 g menschlicher Haare mit einer 0,5 % SDS-Lösung, Trocknen und durch Inkubation mit n- Hexan über Nacht entfettet. Nach Entfernen des Hexans werden 400 mL einer 25 mM Tris- Lösung (pH 8,5) 2 M Thioharnstoff, 5 M Harnstoff und 5 % Mercaptoethanol in Wasser zugegeben. Nach Verschließen des Gefäßes mit Parafilm wurde für 72 h bei 50 0C gerührt. Ungelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugieren auf einer Laborzentrifuge bei ca. 10.000 x g (10 min, 5.000 upm) entfernt; der Überstand wurde zusätzlich durch einen Filter mit einer Porengröße von 2,5 μm filtriert. Das Filtrat konnte ohne wesentliche Veränderungen der Eigenschaften bei 4 0C aufbewahrt oder in Aliquots eingefroren werden.
Das Filtrat wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, z.B. mittels einer Spektrapore 1 Membran (Ausschlußgrenze 6 - 8.000 Da), üblicherweise je 100 mL Filtrat gegen 5 L Wasser über 72 h mit 6-fachem Auswechseln des Wassers. Das Dialysat wurde in einer Ultrazentrifuge bei 15.000 Upm für 10 min zentrifugiert, um Aggregate zu entfernen. Das Zentrifugat kann unmittelbar zur Herstellung beschichteter Trägersubstrate oder zur Herstellung von Keratinfilmen verwendet werden.
Das Meßergebnis der Photonenkorrelationsspektroskopie zur Partikelgrößenverteilung ist in Figur 2 gezeigt und weist eine enge monomodale Größenverteilung mit einem Z-Average (Z- Mittelwert) von 120 nm und einem Polydispersitätsindex von 0,07 auf.
Die nach Bradford gemessene Proteinkonzentration der erfindungsgemäßen Keratinlösung war etwa doppelt so hoch, wie die von Vergleichsbeispiel 2 nach Yamauchi.
Als Beispiel für ein Trägersubstrat wurden Mikrotiterplatten zur Zellkultur aus Polystyrol oder Polycarbonat verwendet und mit einem solchem Volumen kontaktiert, dass die Oberfläche durchgängig benetzt war. Für 24 -Napf-Platten zur Zellkultur wurden pro Napf 400 μL Beschichtungslösung einpipettiert. Unmittelbar nach dem Einpipettieren, d. h. nach ca. 5 bis 10 s wurde die Lösung komplett abgenommen und die Oberfläche wurde unter sterilen Bedingungen an der Luft trocknen gelassen. Diese Kontaktierung mit anschließender Trocknung wurde 2 - 5 mal wiederholt. Die Platten sind nach dem Trocknen stabil und können bei Raumtemperatur gelagert werden.
Eine Sterilisation der beschichteten Oberflächen kann durch Bestrahlung oder Benetzen in 70 % Ethano l/Wasser für 2 h und anschließendes Trocknen erfolgen.
Lichtmikroskopische Aufsichten auf eine derart hergestellte Keratinbeschichtung sind in Figuren 3 A) und B) gezeigt, wobei sich die Vergrößerung aus den angegebenen Maßen des eingebrannten Dimensionsbalkens ergibt. Im Vergleich mit den Figuren C) - E), die Keratinbeschichtungen gemäß Vergleichsbeispiel zeigen, wird die signifikant erhöhte Homogenität und optische Durchlässigkeit des erfindungsgemäßen Keratinfilms deutlich. Figur 5 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Keratinfilms in Näpfen einer Mikro titerplatte (Polystyrol) mit einer Kantenlänge der Aufnahme von ca. 18 μm.
In Figur 6 ist ein Abschnitt einer beschichteten Oberfläche gezeigt, in der die aufgetragenen Keratinbeschichtung durch Ritzen mit einer Nadel abschnittsweise gelöst wurde. Die Kantenlänge der elektronenmikroskopischen Aufnahme von Figur 6 beträgt ca. 180 μm. Figur 7 zeigt einen Ausschnitt der Aufnahme von Figur 6, etwa mittig, mit einer Kantenlänge der Aufnahme von ca. 45 μm.
Eine weitere Ausschnittsvergrößerung von Figur 7, etwa im oberen Drittel Mitte, ist in Figur 8 gezeigt, wobei die Kantenlänge der Aufnahme ca. 18 μm beträgt; eine weitere ausschnittsweise Vergrößerung von Figur 8, etwa Mitte der Aufnahme, ist in Figur 9 gezeigt (Kantenlänge der Aufnahme 4,5 μm).
Die Abbildungen zeigen, dass die erfindungsgemäß erzeugte Keratinschicht Nanopartikel oder Substrukturen enthält, die Durchmesser von ca. 0,3 bis 0,4 μm haben. Bei 4- bis 5- fachem Auftragen der wässrigen Keratinlösung mit zwischenzeitlicher Trocknung wurden Schichtdicken des Keratins von ca. 1,5 bis 4 μm erzeugt.
Strukturelle Unterschiede zu Keratinbeschichtungen aus reduziertem Keratin gemäß Yamauchi et al, die in Vergleichsbeispiel 2 hergestellt wurden, sind neben der monomodalen Partikelgrößenverteilung auch die verbesserte optische Transparenz und die deutlich geringere Anzahl von störenden Unregelmäßigkeiten, die sich aus dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren des Keratinfϊlms ergeben.
Beispiel 2: Kultivierung tierischer Zellen auf Kunststoffoberflächen mit Keratinbeschichtung Gemäß Beispiel 1 hergestellte Kulturgefäße zur Zellkultur aus Polystyrol mit Keratinbeschichtung wurden jeweils ca. 30.000 Zellen nach Trypsinieren in frischem Zellkulturmedium ausgesät. Für Zählungen wurden die Zellen von jeweils drei Näpfen zu jeweils gleichen Zeitpunkten durch Trypsinieren abgelöst und im Coulter-Counter gezählt. Aus den erhalten Werten konnte eine Wachstumskurve erstellt werden (Logarithmus der Zellzahl über Wachstumszeit). Aus der Wachstumskurve wurde mit sigmoider Anpassung die Lagphase, die Populations- Verdoppelungszeit (PDT), sowie die erreichte Sättigungsdichte graphisch ermittelt.
Zur Bestimmung der Aussaateffizienz wurden die Näpfe mit jeweils 100.000 Zellen pro Napf in Zellkulturmedium eingesät. Nach Kultivierung über 14 h wird das Medium abgesaugt, der Napf gespült und die angehefteten Zellen durch Trypsinieren abgelöst und gezählt. Die Aussaateffizienz ergibt sich als Quotient der Zahl angehefteter Zellen zu der Zahl ursprünglich eingesetzter Zellen.
Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt, wobei Tabelle 1 die Aussaateffizienz in Prozent angibt und Tabelle 2 das Proliferationsverhalten. Zum Vergleich sind jeweils unbeschichtete identische Kulturgefäße aus Polystyrol eingesetzt worden („Polystyrol").
Tabelle 1: Vergleich Aussaateffizienz auf unbeschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatte mit erfindungsgemäß keratinbeschichteten und durch TCA-Fällung keratinbeschichteten
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Tabelle 2: Proliferation von Zellen auf keratinbeschichteten Oberflächen gegenüber unbeschichteten Oberflächen
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* Keratin Klar = erfindungsgemäße Keratinbeschichtung auf Polystyrol
** TCA-gefällt = Keratinbeschichtung nach Vergleichsbeispiel 1 auf Polystyrol
Caco-2 Caco-2 Zelllinie (Co Ion-Karzinom, human), immortalisiert HaCaT HaCaT Zelllinie (Epidermis, human), immortalisiert Sirc SIRC Zelllinie (Corneaepithel, Kaninchen), immortalisiert Cepi Cepi Zelllinie (Corneaepithel, human), immortalisiert
Cepi (serum reduced) wie oben, mit geringerem Serumgehalt kultiviert Henc HENC Zelllinie (Corneaendothel, human), immortalisiert
HCK HCK Zelllinie (corneale Fibroblasten, human), immortalisiert
Hufib HUFIB (corneale Fibroblasten, human), Primärkulturen
SZ 95 SZ 95 (Sebozyten, human), immortalisiert
HCE-T HCE-T (Corneaepithel, human), immortalisiert
PHK PHK (Keratinocyten, human), Primärkultur
Sowohl aus den Werten für die Aussaateffizienz als auch aus den Werten für das Proliferationsverhalten, d.h. die Verkürzung der Lagphase und die Verkürzung der Populations- Verdoppelungszeit, und der deutlichen Zunahme der Sättigungsdichte der getesteten Zellen wird deutlich, dass die Kultivierung durch die erfindungsgemäße Keratinbeschichtung gegenüber unbeschichteten Mikrotiterplatten und gegenüber durch TCA- Fällung keratinbeschichteten Platten signifikant verbessert ist.
Im Unterschied zu den erfindungsgemäßen Keratinbeschichtungen zeigte die Kultivierung von Epithel- und Endothelzellen auf keratinbeschichteten Platten, die gemäß Vergleichsbeispiel 2 aus Keratin hergestellt wurden, signifikant schlechtere Werte für das Proliferationsverhalten, die Verkürzung der Populations- Verdoppelungszeit und die Sättigungsdichte. Die Werte zur Aussaateffizienz und Proliferation wurden mit der Zelllinie HCE-T bestimmt:
Tabelle 3: Vergleich der Eigenschaften von Keratinfilmen zur Zellkultur
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Es wird vermutet, dass ein Grund für die homogenere Oberfläche und das bessere Proliferationsverhalten kultivierter tierischer Zellen in der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Struktur des Keratinfilms liegt, insbesondere an der Solubilisierung von Haar in Gegenwart von Thioharnstoff und am Fehlen von 2-Mercaptoethanol während der Dialyse, während gemäß Vergleichsversuch 2 die Solubilisierung ohne Thioharnstoff erfolgte und die Dialyse gegen Wasser mit einem Gehalt an 2-Mercaptoethanol.
Beispiel 3: Kultivierung von Zellen auf keratinbeschichteten Oberflächen zur Verwendung für die Messung der Permeation von Arzneistoffen durch Zellschichten
Für die in vitro Messung der Permeation von Arzneistoffen durch kultivierte Zellen wurden Zellen auf erfindungsgemäß mit Keratin beschichteten Polycarbonatfiltern aufwachsen gelassen, wobei die Polycarbonatfilter selbst aufgrund von Poren mit Größen im Bereich von 0,4 - 3 μm diffusionsdurchlässig sind. Entsprechend Beispiel 2 wurde auf dem Polycarbonatfilter eine Keratinbeschichtung erzeugt, auf der wiederum Zellen unter Zellkulturbedingungen ein- oder mehrschichtig kultiviert wurden.
Die auf der Keratinschicht des Polycarbonatfϊlters aufgewachsenen Zellen konnten zur Messung der Diffusion von Arzneistoffen durch die Zellschichten verwendet werden. Als Beispiel für einen Arzneistoff wurde Na-Fluorescein eingesetzt, das einseitig auf die kultivierten Zellen aufgegeben wurde. Die Permeation durch die Zellschichten wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmt.
Im Vergleich mit einem bis auf die fehlende Keratinbeschichtung identischen Versuch hat sich gezeigt, dass die Keratinschicht auf dem Polycarbonatfilter keinen oder einen konstanten Einfluss auf die Permeationsraten des Arzneistoffs hat, so dass dieser Einfluss der Keratinbeschichtung durch Vergleich mit einem Vergleichsversuch mit kultivierten Zellen auf unbeschichtetem Polymerfilter ermittelt und herausgerechnet werden kann.
Beispiel 4: Herstellung einer Wundauflage
Zur Herstellung einer Wundauflage mit Keratinbeschichtung gemäß der Erfindung wurde als Beispiel für ein elastisches Trägersubstrat eine Mischung mit 60 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon, 35 Gew.-% Polyethylenglycol 400 und 5 Gew.-% Natrium- Carboxymethylcellulose entsprechend Beispiel 1 mit einer Keratinschicht versehen.
Als Weichmacher wurde optional Glycerin in wässriger Lösung aufgetragen und das Wasser durch Trocknen entfernt, alternativ Polyethylenglycol und/oder Polypropylenglycol. Das Trägersubstrat wies die anhaftende Keratinschicht auf und konnte zur Abdeckung von Wunden eingesetzt werden.
Beispiel 5: Herstellung eines Keratinfilms
Ein Keratinfilm zur Verwendung bei der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, beispielsweise zur Herstellung von Wundauflagen oder zur Herstellung von Implantaten oder Transplantaten wurde durch Abscheiden eines Keratinfilms nach Beispiel 1 auf einem Trägersubstrat hergestellt. Dabei wurde als Trägersubstrat vorzugsweise ein Polymer eingesetzt, das nur eine geringe Haftung zu dem darauf abgeschiedenen Keratinfilm aufwies, beispielsweise silikonisiertes PET.
Zur Erhöhung der Elastizität der Keratinschicht konnte die Keratinschicht nach der Abscheidung mit einem Weichmacher versehen werden, oder der Weichmacher konnte bereits der wässrigen Keratinlösung zugesetzt sein. Als Weichmacher eignen sich insbesondere Glycerin, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Mischungen dieser.
Im Anschluss an die Trocknung der Keratinbeschichtung auf dem Trägersubstrat, vorzugsweise nach Zugabe von Weichmachern, wurde der Keratinfilm durch mechanisches Entfernen von dem Trägersubstrat erhalten.
Ein solcher Keratinfilm konnte als Wundauflage eingesetzt werden, oder zur Herstellung eines Implantats.
Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität wurde im Anschluß an die Abscheidung des Keratinfilms eine Vernetzung der Keratinpartikel durch Aufbringen einer 4 Gew.-% Glutaraldehydlösung, Inkubieren bei Raumtemperatur für 12 h, anschließendes Entfernen des Glutaraldehyds und Waschen mit Wasser erreicht. Der entstandene Keratinfilm kann bei Raumtemperatur getrocknet oder hydratisiert verwendet werden.
Ähnliche Erhöhungen der Stabilität des Keratinfilms ließen sich in Abwesenheit eines zugesetzten Vernetzungsreagenzes durch Trocknung bei Temperaturen 80 bis 120 0C für 20 - 40 min erzielen. Die Trocknung bei diesen Temperaturen konnte auch mit der Kontaktierung mit Vernetzungsreagenz kombiniert werden. Beispiel 6: Herstellung eines Implantats mit tierischen Zellen auf einem Keratinfflm Als ein Beispiel für ein Implantat mit einem erfindungsgemäßen Keratinfilm wurden nach dem Verfahren von Talbot et al. (Molecular Vision 65-75 (2006)) isolierte Cornea-Zellen des Kaninchens oder nach Parmar et al. (American J. of Ophthalmology, S. 299 - 300 (Feb. 2006)) isolierte menschliche amniotische Epithelzellen einseitig auf einem Abschnitt eines nach Beispiel 5 hergestellten Keratinfilms unter Zellkulturbedingungen bis zur Konfluenz angezogen. Eine derartige Schicht aus Cornea-Zellen auf einem Keratinfilm stand dann zur Verwendung als Transplantat zum Ersatz der Cornea bereit.

Claims

Ansprüche
1. Keratinschicht für die Kultivierung von tierischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht durch Solubilisieren von Haar in wässriger Zusammensetzung von Thioharnstoff, Harnstoff und 2-Mercaptoethanol bei pH 8-9, Abtrennung von Thioharnstoff, Harnstoff und 2-Mercaptoethanol von der wässrigen Zusammensetzung von solubilisiertem Keratin, Kontaktieren eines Trägersubstrats mit der wässrigen Zusammensetzung und anschließendes Trocknen erhältlich ist.
2. Keratinschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Keratin Partikel in im wesentlichen monomodaler Größenverteilung in einem Bereich von 20 bis 5000 nm aufweist.
3. Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Keratin α-Keratin ist.
4. Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht ohne Trägersubstrat vorliegt.
5. Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht einen Gehalt an PDGF (Plättchenwachstumsfaktor), rhPDGF- BB (Becaplermin), EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), PDECGF (Plättchen- Endothelzellen- Wachstumsfaktor), aFGF (saurer Fibroblastenwachstumsfaktor), bFGF (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor), TGFß (Transformationswachstumsfaktor ß), TGFα (Transformationswachstumsfaktor α), KGF
(Keratinozytenwachstumsfaktor) IGF1/IGF2 (insulinähnliche Wachstumsfaktoren), TNF (Tumornekrosefaktor) und/oder Laminin, Fibronektin und/oder antibiotische Wirkstoffe und/oder wundheilungsfördernde Stoffe aufweist.
6. Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht durch ein Reagenz, das mindestens zwei mit Keratin reaktive funktionelle Gruppen aufweist, vernetzt ist.
7. Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht durch Trocknung bei einer Temperatur von 80 bis 200 0C vernetzt ist.
8. Verfahren zur Herstellung einer Keratinschicht nach einem der voranstehenden Ansprüche durch Solubilisieren entfetteter Haare in 2 M Thioharnstoff, 5 M Harnstoff, 5 Gew.-% 2-Mercaptoethanol bei 50 0C und pH 8 bis 9, anschließendes Dialysieren gegen Wasser, das keine reduzierenden Verbindungen enthält, Kontaktieren der dialysierten wässrigen Zusammensetzung von Keratin mit der Oberfläche eines Trägersubstrats und Trocknen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeschiedene Keratinschicht mit einem Reagenz, das mindestens zwei mit Keratin reaktive funktionelle Gruppen aufweist, kontaktiert wird und/oder bei einer Temperatur von 80 bis 200 0C getrocknet wird.
10. Verwendung einer Keratinschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur in vitro Kultivierung von Zellen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen tierische oder menschliche Epithel- oder Endothelzellen sind.
12. Verwendung einer Keratinschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung medizinischer Produkte zur Verwendung als Wundaufiage.
13. Verwendung einer Keratinschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Implantats.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinschicht zumindest abschnittsweise durch die in vitro Kultivierung mit Zellen besiedelt ist.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Keratinfilm einen Weichmacher enthält.
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