WO2008098485A1 - Sels de dérivé de 4-aniline quinazoline - Google Patents

Sels de dérivé de 4-aniline quinazoline Download PDF

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WO2008098485A1
WO2008098485A1 PCT/CN2008/000318 CN2008000318W WO2008098485A1 WO 2008098485 A1 WO2008098485 A1 WO 2008098485A1 CN 2008000318 W CN2008000318 W CN 2008000318W WO 2008098485 A1 WO2008098485 A1 WO 2008098485A1
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salt
acid
cancer
tumor
chloro
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PCT/CN2008/000318
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Inventor
Jianhui Guo
Yong Jiang
Original Assignee
Shanghai Allist Pharmaceuticals, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
    • C07D239/94—Nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a salt of a 4-aniline quinazoline derivative. Specifically, the present invention relates to a salt form of N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl acrylamide, and preparation thereof A method, a pharmaceutical composition comprising the salt forming form, and the use of the salt forming form for preventing and/or treating a tumor. Background technique
  • Cancer is thought to be a disease mediated by intracellular signaling systems or signaling mechanisms.
  • the cells receive many instructions from outside the cell to direct the cell to proliferate.
  • the purpose of the signaling system is to accept these or other signals on the cell surface, introduce it into the cell, and then pass these signals to the nucleus, cytoskeleton, and affect the transcription of the gene. And protein synthesis.
  • the most common cause of cancer is a series of defects, which can be defects in certain proteins (when they are mutated), or defects in the regulation of the amount of protein in the cell, resulting in overproduction or underproduction of the protein.
  • defects usually, there is a significant damage in the cells that causes a constitutive state, thereby causing the nucleus to receive a proliferative signal, and in fact these signals do not exist. This can happen through a variety of mechanisms.
  • cells will start to produce true growth factors for their own receptors, so-called autocrine loop mechanisms.
  • Epidermal growth factor receptor has been identified as a critical driver of cell growth and reproduction. In common tumors, such as non-small cell lung cancer, epidermal growth factor receptors are abundantly expressed, far beyond the normal range.
  • the epidermal growth factor receptor family consists of EGFR (Erb-Bl), Erb-B2 (HER-2/neu), Erb-B3 and Erb-B4.
  • Epidermal growth factor receptors are involved in disease progression in most cancers, particularly colon and breast cancer. Overexpression and mutation of this receptor have been clearly identified as major risk factors for breast cancer with poor prognosis.
  • EGFR belongs to the family of protein tyrosine kinases (PTKs), a class of enzymes that catalyze the transfer of a phosphate group from hydrazine to a tyrosine residue located on a protein substrate.
  • PTKs protein tyrosine kinases
  • Protein tyrosine kinases play a role in normal cell growth. Overexpression of EGFR causes the receptor to be activated in the absence of ligand, phosphorylating certain proteins, and producing a signal for cell division. Therefore, EGFR, through the action of its own tyrosine kinase, leads to excessive amplification of weak signals, causing excessive proliferation of cells.
  • European Patent Application EP 520 722 A1 discloses certain 4-anilino-naphthyridines having ⁇ inhibitor activity.
  • European Patent Application EP 566 226 A1 discloses 4-anilinoquinazoline having a plurality of substituents at positions 5-8 having PTK inhibitor activity. It is known from European Patent Application EP 635 498 A1 that certain 4-anilino-naphthyridines which contain a plurality of substituents at position 6 and which must have a halogen substitution at position 7 also have PTK inhibitor activity.
  • WO 96/30347 (Chinese Patent No. CN96102992) relates to some 4-(substituted anilino)quinazoline derivatives, prodrugs thereof and pharmaceutically acceptable salts thereof for use in the treatment of hyperproliferative diseases.
  • W097/38983 (Chinese Patent CN97194458) provides a compound which is an irreversible inhibitor of tyrosine kinase.
  • W299/35146 (Chinese Patent CN99803887) discloses a bicyclic heteroaromatic compound as a protein tyrosine kinase inhibitor.
  • WO00/06555 Choinese Patent CN99808949 also relates to derivatives of certain substituted quinazolines having PTK inhibitor activity.
  • PCT/CN2006/002786 describes a new class of 4-aniline quinazoline derivatives and their use as PTK inhibitors.
  • the compound prepared in Example 8 is N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl ⁇ -acrylamide, and the experiment proves It has a good inhibitory effect on human epidermoid squamous cell carcinoma A431 and human breast cancer cell BT-474, and has a significant anti-tumor effect on human epidermoid squamous cell carcinoma A431 transplanted into mice.
  • In vitro experiments demonstrated that the compound has superior inhibitory activity against Erb-B2 kinase.
  • the documents are incorporated herein by reference in their entirety. Summary of the invention
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a novel N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl acrylamide (the following formula Structure I) a salt-forming form, a process for its preparation, a pharmaceutical composition comprising the salt-forming form, and the use of the salt-forming form for the prevention and/or treatment of a tumor.
  • This salt-forming form has excellent tumor suppressing activity, has good bioavailability in animals, and is low in toxicity, and is suitable for preparation of an antitumor preparation.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” means a pharmaceutically acceptable acid addition salt and a base addition salt.
  • the acid addition salt is a salt of a compound of formula (I) with a suitable inorganic or organic acid, including, for example, hydrobromide, hydrochloride, sulfate, hydrogen sulfate, carbonate, bicarbonate, Sulfite, phosphate, hydrogen phosphate, acetate, oxalate, malonate, valerate, oleate, palmitate, stearate, laurate, borate, pair Tosylate, methanesulfonate, tartrate, benzoate, lactate, benzoate, citrate, maleate, fumarate, malate, pamoate Salts, salicylates, vanillates, mandelates, succinates, gluconates, lactobions and lauryl sulf
  • the base addition salt is a salt of a compound of formula (I) with a suitable inorganic or organic base, including, for example, a salt formed with an alkali metal, an alkaline earth metal, a quaternary ammonium cation, such as a sodium salt, a lithium salt, a potassium salt, a calcium salt, a magnesium salt, a tetramethyl quaternary ammonium salt, a tetraethyl quaternary ammonium salt, etc.; an amine salt, including a salt formed with ammonia (NH 3 ), a primary amine, a secondary amine or a tertiary amine, such as: methylamine salt, Diammonium salt, triterpene salt, triethylamine salt, ethylamine salt, etc., especially triethylamine salt.
  • a salt formed with an alkali metal, an alkaline earth metal, a quaternary ammonium cation such as a
  • the salt is an acid addition salt, and includes a mineral acid salt and an organic acid salt
  • the inorganic acid salt may be selected from the group consisting of a hydrobromide salt, a hydrochloride salt, a sulfate salt, a sulfite, a phosphate or a borate
  • the organic acid salt may be selected from the group consisting of acetate, oxalate, malonate, valerate, p-toluenesulfonate, methanesulfonate, tartrate , benzoate, lactate, toluene citrate, citrate, maleate, rich Caprate, malate, pamoate, salicylate, vanillate, mandelate or succinate
  • more preferred acid addition salts are hydrochloride, sulfate, phosphate, carbon Acid salt, p-toluenesulfonate, methanesulfonate, benzoate,
  • the salt is a hydrochloride or p-toluenesulfonate.
  • a process for the preparation of a pharmaceutically acceptable salt of the present invention which is prepared by treating N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro) with a suitable acid or base. -benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl ⁇ -acrylamide to give the salt, comprising the steps of:
  • the organic solvent may be selected, for example, from decyl alcohol, ethanol, ethyl acetate, tetrahydrofuran, triethylamine, diethyl ether or 1,4-dioxane or a mixed solvent thereof;
  • the acid includes a mineral acid such as hydrobromine Acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, carbonic acid, sulfurous acid, phosphoric acid, boric acid, organic acids such as acetic acid, oxalic acid, malonic acid, valeric acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid, lauric acid, p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid Acid, tartaric acid, benzoic acid, lactic acid, hydrazine formic acid, citric acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, pamoic acid, salicylic acid, vanillic acid, mandelic acid, succinic acid, gluconic acid, lac
  • the above preparation can be carried out under cooling, normal temperature or heating, and it is noted that the selection of the reaction temperature has a certain influence on different salt-forming reactions, which is also within the knowledge of those skilled in the art.
  • the salt formation reaction temperature of the present invention is -10 ° C ⁇ the boiling point of the solvent used, preferably 0 ° C ⁇ 4 (TC, the optimum reaction of the specific salt formation reaction can be easily determined by those skilled in the art by conventional techniques in the art. Temperature.
  • the method comprises:
  • the method comprises:
  • N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]] can also be prepared by other methods known in the art for the acid addition of amines.
  • a pharmaceutical composition comprising a salt of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition can be administered to a mammal (e.g., a human) and can be administered orally, rectally, parenterally (intravenously, intramuscularly or subcutaneously), topically, or the like.
  • a pharmaceutical composition is used, a therapeutically or prophylactically effective amount of a salt of the invention is administered to a mammal (e.g., a human) in need of treatment or prevention.
  • a therapeutically or prophylactically effective amount refers to an amount of active compound sufficient to cause a biological or medical response sought by a veterinarian or clinician in a mammal, such as a human. Ordinary physicians, veterinarians, and clinicians can readily determine the effective amount of a salt of the invention required to treat or prevent a given condition.
  • the daily dose is usually 1 to 10,000 mg, preferably 20 to 500 mg.
  • the specific dose should also take into account the route of administration, the age, sex, weight and health of the patient, as well as the specific condition being treated, which are within the skill of the skilled physician.
  • the term "mammal” as used herein includes, but is not limited to, cats, dogs, rabbits, goats, sheep, rats, mice, humans, and the like, with humans being particularly preferred.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as a solid dosage form for oral administration, including capsules, tablets, pills, powders, granules, and granules.
  • the salts provided herein may be admixed with at least one conventional inert excipient (or carrier) including, but not limited to: (a) a filler or solubilizing agent, For example, starch, lactose, sucrose, glucose, mannitol, and silicic acid; (b) binders such as, for example, hydroxymethylcellulose, alginate, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose, and acacia; (c) moisturizing (d) a disintegrant, for example, agar, calcium carbonate, potato starch or tapioca starch, alginic acid, certain complex silicates, polyvinylpolypyrrolidone and sodium carbonate; (e) a slow solvent , for example, paraffin wax; absorption accelerators, for example
  • Solid dosage forms such as tablets, dragees, capsules, pills and granules may be prepared with coatings and shells such as enteric coatings and other materials known in the art. They may contain opacifying agents, and the release of the active compound in such compositions may be released in a portion of the digestive tract in a delayed manner. If necessary, the active compound may also form a microcapsule form with one or more of the above-mentioned excipients.
  • liquid dosage forms for oral administration, including pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups or elixirs, and the like.
  • liquid dosage forms may contain inert diluents conventionally employed in the art, such as water or other solvents, solubilizers and emulsifiers, for example, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, acetic acid Ethyl ester, propylene glycol, 1,3-butanediol, dimethylformamide and oils, especially cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, or a mixture of these substances.
  • the compositions may contain adjuvants such as wetting agents, emulsifying and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, and flavoring agents.
  • the suspension may contain a suspending agent, for example, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan ester, microcrystalline fiber. , aluminum methoxide and agar or a mixture of these substances.
  • a suspending agent for example, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan ester, microcrystalline fiber. , aluminum methoxide and agar or a mixture of these substances.
  • the pharmaceutical composition may be formulated for parenteral injection, including physiologically acceptable sterile aqueous or nonaqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and for reconstitution into sterile injectable solutions or A sterile powder of the dispersion.
  • Aqueous and nonaqueous vehicles, diluents, solvents or excipients can be employed in the preparation of such sterile aqueous or nonaqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions.
  • Suitable aqueous and nonaqueous vehicles, diluents, solvents or vehicles include water, ethanol, polyols and suitable mixtures thereof.
  • compositions may be formulated for topical administration, including ointments, powders, patches, propellants, and inhalants.
  • the salts provided herein can be combined under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and any preservatives, buffers, or propellants which may be required if necessary.
  • the salts of the present invention are useful in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a disease mediated by a protein tyrosine kinase, including tumors, particularly malignant tumors such as breast cancer, non-small cell lung cancer, ovary Cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, epidermoid squamous cell carcinoma, etc.
  • the invention relates to a method of treating and/or preventing a tumor in a mammal comprising administering a therapeutically or prophylactically effective amount of a salt of the invention to a mammal in need of such treatment or prevention.
  • the salts of the present invention may be administered alone or in combination with other pharmaceutically acceptable therapeutic agents, particularly in combination with other anti-tumor drugs.
  • the therapeutic agent includes, but is not limited to, a drug antitumor drug acting on the chemical structure of DNA such as cisplatin, an antitumor drug affecting nucleic acid synthesis such as methotrexate (MTX), 5-fluorouracil (5FU), etc., affecting nucleic acid transcription
  • MTX methotrexate
  • 5FU 5-fluorouracil
  • Antitumor drugs such as doxorubicin, epirubicin, aclarithromycin, phosfomycin, etc., antitumor drugs acting on tubulin synthesis such as paclitaxel, vinorelbine, etc., aromatase inhibitors such as ammonia Mitt, lantron, letrozole, ruined, etc., cell signaling pathway inhibitors such as Imatinib, Gefitinib, Erlotin
  • the ingredients to be combined may be administered simultaneously or sequentially, in the form of a single preparation or in the form of different preparations.
  • the combination includes not only a combination of a compound of the present invention and one other active agent, but also a combination of the compound of the present invention and two or more other active agents.
  • the main advantages of the invention include:
  • Step A Preparation of 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-6-nitroquinazoline 1) Add in a 100 ml flask equipped with a reflux condenser 6-nitroquinazolinone
  • the above solid product was placed in a 250 ml flask equipped with a reflux condenser, and 4.7 g (87 mmol) of reduced iron powder; 10 ml of water acetic acid and 50 ml of absolute ethanol were added. The mixture was heated to reflux, taken-up after 5 h, cooled to room temperature, and extracted with a large amount of water-ethyl acetate mixture. The organic phase was combined, washed twice with sodium hydrogen carbonate solution, dried, concentrated, and purified by column chromatography to give a light brown solid. The product was identified as 4-(3-fluorobenzyloxy)-3-chloroaniline. The total yield is 75%.
  • ⁇ - ⁇ 400 ⁇ , CDC1 3 ): ⁇ 11.30(1H, br), 9.54-9.48(1 ⁇ , m), 8.45-8.41(lH, m), 8.31-8.25(1H, m), 7.98-7.89(lH , m), 7.50-7.47(lH, m), 7.35-7.26 (1H, m), 7.05-6.96(1H, m), 6.90-6.80(2H, m), 7.74-7.60(2H, m), 4.84 (2H, s).
  • Step B Preparation of 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-6-aminoquinazoline in a flask equipped with a reflux condenser in accordance with step A 4-[3-Chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-6-nitroquinazoline 1.60g prepared by the method
  • Example 2 According to the method shown in Example 2, a 2 mol/L sulfuric acid/1,4-dioxane solution was used instead of the 4 mol/L HCl/1,4-dioxane solution used to obtain N- ⁇ 4- [3-Chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl ⁇ -acrylamide sulfate.
  • Example 2 According to the method shown in Example 2, a 2 mol/L phosphoric acid/1,4-dioxane solution was used instead of the 4 mol/L HCl/1,4-dioxane solution used to obtain N- ⁇ 4- [3-chloro-4-(3- Fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-ylacrylamide phosphate.
  • Example 2 According to the method shown in Example 2, a 2 mol/L carbonic acid/1,4-dioxane solution was used instead of the 4 mol/L HCl/1,4-dioxane solution used to obtain N_ ⁇ 4-[ 3-Chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl ⁇ -acrylamide carbonate.
  • N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl acrylamide prepared according to the method described in Example 1 3 g ( 6.68 mmol)
  • N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl-)acrylamide p-toluenesulfonate can also be passed Prepared by the following method: 3 g ( 6.68 mmol) of N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl acrylamide was dissolved in 30 mL of tetrahydrofuran.
  • methanesulfonic acid (6 eq, 4.25 g) was used instead of p-toluenesulfonic acid to obtain N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamine. - quinazoline-6-ylacrylamide methanesulfonate.
  • Example 9 N- ⁇ 4-[3-Chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-yl ⁇ -acrylamide salicylate
  • salicylic acid (6 eq, 5.39 g) was used instead of p-toluenesulfonic acid to obtain N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenyl.
  • Amino]-quinazolin-6-ylacrylamide salicylate According to the method shown in Example 6, salicylic acid (6 eq, 5.39 g) was used instead of p-toluenesulfonic acid to obtain N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenyl. Amino]-quinazolin-6-ylacrylamide salicylate.
  • N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazolin-6-ylacrylamide l.Og prepared according to the method described in Example 1) 2.23mmol) dissolved in 20mL of methanol, stirred in a water bath, slowly added oxalic acid solution (2mg) of oxalic acid (990mg), precipitated as a yellow solid, stop stirring after 45min, filter, wash, dry to obtain 530mg of yellow-green solid (0.98 mmol) N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylaminobuquinazoline-6-yl acrylamide oxalate, yield 44%. MS: 449. Mp: 253-256 ° (:.
  • acetic acid (660 mg) was used instead of oxalic acid to obtain N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazoline-6. -yl ⁇ -acetate of acrylamide.
  • valeric acid (1.12 g) was used instead of oxalic acid to obtain
  • tartaric acid (1.65 g) was used instead of oxalic acid to obtain N- ⁇ 4-[3-chloro-4-(3-fluoro-benzyloxy)phenylamino]-quinazoline- 6-Acrylamide tartrate.
  • solubility determination method that is, at room temperature, an appropriate amount of the test compound is weighed and placed in a 15 mL aqueous solution, and then thoroughly stirred to dissolve, allowed to stand at room temperature for 3 hours, and pipetted 10 mL of the upper clear saturated solution with a pipette until it is called In a heavy weighing bottle, the solvent is heated and evaporated, dried, and weighed to obtain the mass of the residue, which is the mass of the solute in the solution.
  • the solubility of the compound of the formula (I) and its salt in water is calculated by the same method. The solubility of the compound in sterol was measured and the results are as follows:
  • Oral administration 24 healthy SD rats, male, weighing 200-250 g, were randomly divided into three groups.
  • the compound obtained in the above Example 1 21.68 mg/kg), its hydrochloride ( 23.42 mg/kg) or its p-toluenesulfonate (30 mg/kg) were administered by gavage, respectively, 0.5, 1.0, 1.5 after administration.
  • Blood samples were taken at 2.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 12, and 24 hours. Plasma was prepared and the concentration of the drug in the plasma was determined by liquid chromatography/tandem mass spectrometry to obtain a drug concentration-time curve.
  • Intravenous (iv) 8 healthy SD rats, male, weighing 200-250 g, intravenously administered a compound of formula (I) to a sulfonate, 5 min, 15 min, 0.5, 1.5, 2.0, 3.0 after dosing Blood samples were taken at 4.0, 5.0 and 7.0 hours, plasma was separated and prepared, and the concentration of the drug in the plasma was determined by liquid chromatography/tandem shield method to obtain a drug concentration-time curve.
  • the main pharmacokinetic parameters are shown in the following table:
  • Example 1 Detection of EGFR tyrosine kinase inhibitory activity
  • the EGFR tyrosine kinase reaction substrate Poly(Glu, Tyr) 4: 1 was coated with the enzyme plate; the plate was washed three times with T-PBS, and dried in an oven at 37 ° C; each well was sequentially diluted with reaction buffer. ATP solution, gradient concentration of the test compound, and test tyrosine kinase initiation reaction, 37. C-shake reaction for 1 hour, T-PBS (phosphate buffer pH 7.4 containing 0.05% Tween) was washed three times; antibody PY99 was added at 37. C was reacted for 1 h, washed three times with T-PBS; horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was added at 37.
  • T-PBS phosphate buffer pH 7.4 containing 0.05% Tween
  • VERSAmax (MDC, USA) measured the OD at 492 nm.
  • the inhibition rate of the sample is obtained by the following formula:
  • the p-toluenesulfonate or hydrochloride salt of the compound of the formula (I) obtained in the above examples was formulated into five concentration gradients, and the tetrazolium salt of the living cells was referenced.
  • Inhibition rate (%) (solvent control OD value - test compound OD value) / solvent control OD value X 100%, IC 50 value was calculated by Logit method.
  • the IC 50 of the terpene sulfonate of the compound of formula (I) against human epidermoid squamous carcinoma cell line A431 and human breast cancer cell line BT-474 was 0.73 ⁇ ⁇ and 0.42 ⁇ ⁇ respectively; the salt of the compound of formula (I)
  • the IC 50 of the acid salt to human epidermoid squamous cell carcinoma A431 and human breast cancer cell BT-474 was 0.84 ⁇ ⁇ and 0.46 ⁇ ⁇ , respectively.
  • the tumor-preventing effect of human epidermoid squamous cell carcinoma A431 transplanted into BALB/cA rats was well-growth A431 solid tumors, and cut into uniform small pieces of 2-3 mm under sterile conditions, using trocars on each BALB /cA rats were inoculated subcutaneously on the right iliac crest, randomized from the 7th day after inoculation, and started continuous oral gavage for 13 days, and the long diameter (a) and short diameter (b) of the tumor block were measured every 4 days with vernier calipers.
  • the tumor mass was dissected and weighed, and the tumor inhibition rate was calculated. The results are shown in the following table, indicating that the compound of formula (I) has a significant antitumor effect on the terephthalic acid salt.
  • the negative control group was 0.5% CMC-Na (carboxymethylcellulose sodium) 0.2 mL/head. 2 times a week
  • the tumor has a long diameter (a) and a short diameter (b), and is also called the weight of the nude mouse.
  • the anti-tumor activity evaluation index is the relative tumor growth rate T/C (%), and the calculation formula is as follows:
  • T/C ( % ) ( TRTV / CRTV ) X 100
  • Vo refers to the tumor volume before administration
  • V 21 refers to tumor volume after 3 weeks of continuous administration.
  • Example 2 Long-term toxicity test

Description

4 -苯胺喹唑啉衍生物的盐 技术领域
本发明涉及 4-苯胺喹唑啉衍生物的盐。 具体的说， 本发明涉及 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺的成盐 形式、其制备方法、 包含该成盐形式的药物组合物及该成盐形式在预 防和 /或治疗肿瘤中的应用。 背景技术
癌症被认为是由细胞内信号传导系统或信号传导机制介导的疾 病。 细胞接受许多来自细胞外的指令， 指导细胞是否增殖， 信号传导 系统的目的是接受细胞表面的这些或其它信号， 将其导入细胞内， 然 后将这些信号传递到细胞核、 细胞骨架， 影响基因的转录和蛋白质的 合成。
癌症的最常见病因是一系列的缺损，所述缺损可以是某些蛋白质 的缺损（当其突变时）， 或者是对细胞内蛋白质的量的调节的缺损， 从 而使蛋白过度产生或产生不足。 通常， 在细胞内存在重要损伤， 该损 伤导致组成型状态， 由此使细胞核收到增殖信号， 而事实上这些信号 并不存在。这可以通过多种机制发生。有时细胞会在不应该的情况下 开始生产其自身受体的真正的生长因子， 所谓的自分泌环机制。
细胞表面存在大量的受体，生长因子与这些受体的相互作用是细 胞生长正常调节的必需事件。 然而， 在某些条件下， 由于这些受体或 者突变或者过量表达， 这些受体可变为异常， 其结果是细胞繁殖不受 控制， 最终导致肿瘤的生长。
表皮生长因子受体 (EGFR)被确定为在细胞生长和繁殖过程中至 关重要的驱动因素。 在常见的肿瘤， 如非小细胞肺癌中， 表皮生长因 子受体大量表达， 远远超出正常范围。 表皮生长因子受体家族由 EGFR(Erb-Bl)、 Erb-B2(HER-2/neu)、 Erb-B3和 Erb-B4 组成。 表皮生 长因子受体与大部分癌症的疾病进程有关， 特别是结肠癌和乳腺癌。 该受体的过度表达和突变已被明确证实是预后不好的乳腺癌的主要 危险因素。此外， 已证实该受体家族的所有四个成员均可与该家族的 其它成员聚合为异源二聚体， 形成信号传导复合物， 如果该家族中有 一个以上的成员在恶性肿瘤中过度表达，便可导致协同的信号传导作 用。
EGFR属于蛋白酪氨酸激酶 (PTK)家族， 蛋白酪氨酸激酶是一类 将磷酸基团从 ΑΤΡ 催化转移到位于蛋白质底物的酪氨酸残基上的 酶。 蛋白酪氨酸激酶在正常细胞生长中起作用。 EGFR的过度表达， 导致该受体在缺乏配体的条件下被激活， 使某些蛋白发生磷酸化， 产 生了细胞分裂的信号。 因此， EGFR通过自身酪氨酸激酶的作用， 导 致了弱信号的过度放大， 引起了细胞的过量增殖。
由于异常的受体酪氨酸激酶在癌发病机理中所起作用的重要性， 因此最近的许多研究都涉及作为潜在抗癌治疗药物的特异的 PTK 抑 制剂的研制。 欧洲专利申请 EP520722 A1 公开了某些 4-苯胺基间二 氮杂萘具有 ρτκ抑制剂活性。 欧洲专利申请 EP566226 A1公开了在 位置 5-8含有许多取代基的 4-苯胺基间二氮杂萘具有 PTK抑制剂活 性。 从欧洲专利申请 EP635498 A1 得知， 在位置 6含有许多取代基、 在位置 7 必须有一个鹵素取代的某些 4-苯胺基间二氮杂萘也具有 PTK抑制剂活性。
WO 96/30347(中国专利 CN96102992)涉及一些 4- (取代苯胺基） 喹唑啉衍生物、其前药和其药学上可接受的盐， 用于治疗过度增生疾 病。
W097/38983(中国专利 CN97194458)提供了作为酪氨酸激酶不 可逆抑制剂的化合物。
W099/35146(中国专利 CN99803887)公开了作为蛋白酪氨酸激 酶抑制剂的二环杂芳族化合物。
WO00/06555(中国专利 CN99808949)也涉及某些取代的喹唑啉 的衍生物具有 PTK抑制剂活性。
' WO2006/071017提及了某些能抑制癌细胞生长的喹唑啉衍生物。
本申请的申请人于 2006年 10月 20日提交的申请
PCT/CN2006/002786描述了一类新型的 4-苯胺喹唑啉衍生物， 以及 其作为 PTK 抑制剂的应用。其中，实施例 8制备的化合物为 N- {4-[3- 氯 _4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺， 实验证明其对 人表皮样鳞癌细胞 A431、人乳腺癌细胞 BT-474有较好的抑制生长的 作用， 对移植于棵鼠的人表皮样鳞癌 A431的抑瘤作用明显。 体外实 验证明该化合物对 Erb-B2激酶有优越的抑制活性。 所述文献通过引 用以全文并入本文。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供新颖的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄 氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 （如下式结构 I ) 成盐形式、 其制备方法， 包含该成盐形式的药物组合物及该成盐形式在预防和 / 或治疗肿瘤中的应用。 该成盐形式具有优异肿瘤抑制活性， 且在动物 体内的生物利用度良好、 毒性低， 适于制备抗肿瘤用的制剂。
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本发明的第一方面， 提供了一种式 (I)化合物在药学上可接受的 盐。 在本发明中， 所述 "药学上可接受的盐" 是指在药学上无毒的酸 加成盐和碱加成盐。所述酸加成盐为式 (I)化合物与合适的无机酸或者 有机酸形成的盐， 包括例如氢溴酸盐、 盐酸盐、 硫酸盐、 硫酸氢盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 亚硫酸盐、磷酸盐、 磷酸氢盐、 乙酸盐、 草酸盐、 丙二酸盐、 戊酸盐、 油酸盐、 棕榈酸盐、 硬脂酸盐、 月桂酸盐、 硼酸 盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 酒石酸盐、 苯甲酸盐、 乳酸盐、 曱苯 甲酸盐、 柠檬酸盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 苹果酸盐、 双羟萘酸盐、 水杨酸盐、 香草酸盐、 扁桃酸盐、 琥珀酸盐、 葡萄糖酸盐、 乳糖酸盐 和月桂基磺酸盐等。所述碱加成盐为式 (I)化合物与合适的无机碱或者 有机碱形成的盐， 包括例如与碱金属、 碱土金属、 季铵阳离子形成的 盐， 如钠盐、 锂盐、 钾盐、 钙盐、 镁盐、 四甲基季铵盐、 四乙基季铵 盐等； 胺盐， 包括与氨（NH3 ) 、 伯胺、 仲胺或叔胺形成的盐， 如： 甲胺盐、 二曱胺盐、 三曱胺盐、 三乙胺盐、 乙胺盐等， 特别是三乙胺 盐。
在本发明提供的进一步优选的方案中， 所述盐是酸加成盐， 包括 无机酸盐和有机酸盐，其中所述无机酸盐可以选自氢溴酸盐、盐酸盐、 硫酸盐、 亚硫酸盐、 磷酸盐或者硼酸盐； 其中所述有机酸盐可以选自 乙酸盐、 草酸盐、 丙二酸盐、 戊酸盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 酒 石酸盐、 苯甲酸盐、 乳酸盐、 甲苯曱酸盐、 拧檬酸盐、 马来酸盐、 富 马酸盐、 苹果酸盐、 双羟萘酸盐、 水杨酸盐、 香草酸盐、 扁桃酸盐或 者琥珀酸盐； 更优选的酸加成盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 苯甲酸盐、 水杨酸盐、 草酸盐、 乙酸盐、 戊酸盐、 丙二酸盐或者酒石酸盐， 特别是盐酸盐、 硫酸盐、 对甲苯磺 酸盐、 甲磺酸盐、 草酸盐或者酒石酸盐。
在本发明提供的最优选方案中，所述盐为盐酸盐或者对甲苯磺酸 盐。
本发明的第二方面，提供了一种制备本发明所述药学上可接受的 盐的制备方法， 通过采用合适的酸或者碱处理 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄 氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺得到所述的盐， 包括步骤：
(a) 将 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基卜喹唑啉 -6-基}-丙烯酰 胺溶于合适的有机溶剂中，在搅拌条件下滴加含相应酸或相应碱的溶 剂；
(b) 直接过滤或经浓缩后过滤得到固体， 水洗， 干燥后得到所述的 盐。
其中所述的有机溶剂可以例如选自曱醇、 乙醇、 乙酸乙酯、四氢呋喃、 三乙胺、 乙醚或者 1,4-二氧六环或者其混合溶剂； 所述的酸包括无机 酸如氢溴酸、 盐酸、 硫酸、 碳酸、 亚硫酸、 磷酸、 硼酸， 有机酸如乙 酸、 草酸、 丙二酸、 戊酸、 油酸、 棕榈酸、 硬脂酸、 月桂酸、 对曱苯 磺酸、 甲磺酸、 酒石酸、 苯甲酸、 乳酸、 曱笨甲酸、 柠檬酸、 马来酸、 富马酸、 苹果酸、 双羟萘酸、 水杨酸、 香草酸、 扁桃酸、 琥珀酸、 葡 萄糖酸、 乳糖酸和月桂基磺酸等； 所述的碱包括无机碱和有机碱， 如 碱金属的、 碱土金属的或季铵的氢氧化物或碳酸盐， 氨水， 曱胺， 二 曱胺， 三曱胺， 三乙胺， 乙二胺等。
通常， 上述制备过程可以在冷却、 常温或者加热条件下进行， 值 得注意的是反应温度的选择对不同的成盐反应有一定影响，这也是在 本领域技术人员知识范畴内的。 本发明成盐反应温度为 - 10 °C ~所用 溶剂的沸点， 优选 0 °C ~ 4(TC， 本领域技术人员通过本领域常规的技 术手段就能容易地确定具体成盐反应的最优反应温度。
以制备本发明优选的盐酸盐为一具体例子， 该方法包括：
(a) 将 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺 溶于乙酸乙酯 /三乙胺或者四氢呋喃 /三乙胺中， 緩慢滴加 HCl/1 ,4-二 氧六环溶液， 有固体析出； (b) 停止搅拌， 过滤， 水洗， 干燥后得到 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基) 苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺盐酸盐。
以制备本发明优选的对甲苯磺酸盐为另一具体例子， 该方法包 括：
(a) 将 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 溶于甲醇 /四氢呋喃混合溶剂中， 緩慢滴加对甲苯磺酸的甲醇 /四氢呋 喃混合溶液， 有固体析出；
(b) 停止搅拌， 过滤， 水洗， 干燥后得到 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基) 苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺对甲苯磺酸盐。
此外，还可以通过本领域已知的其他用于制备胺的酸加成益的方 法制备 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 酸加成盐。 '
本发明的第三方面， 提供了一种药物组合物， 它含有本发明所述 的盐和药学上可接受的载体。
所述药物组合物可给药于哺乳动物 （如人） ， 可以口服、 直肠、 肠胃外（静脉内、 肌肉内或皮下）、 局部等方式给药。 使用药物组合物 时，将治疗或预防有效量的本发明所述盐施用于需要治疗或预防的哺 乳动物（如人）。术语 "治疗或预防有效量"指的是足以在哺乳动物（如 人）体内引起兽医或临床医师所探求的生物或医学反应的活性化合物 的量。普通的医师、兽医和临床医师可容易地确定治疗或预防指定疾 病所需的本发明盐的有效量。一般，为每天 0.01 ~ 20mg/kg患者体重， 优选每天 0.1 ~ 10mg/kg患者体重。更具体而言，对于 60kg体重的人， 日给药剂量通常为 1 ~ l OOOmg, 优选 20 ~ 500mg。 当然， 具体剂量还 应考虑给药途径， 患者的年龄、 性别、 体重和健康状况， 以及被治疗 的特定状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。在本文中使 用的术语 "哺乳动物" 包括但不限于猫、 狗、 兔、 山羊、 绵羊、 大鼠、 小鼠和人等， 特别优选人。
所述药物组合物可以配制为用于口服给药的固体剂型，包括胶嚢 剂、 片剂、 丸剂、 散剂、 颗粒剂和糖丸等。 在这些固体剂型中， 本发 明提供的盐可以与至少一种常规惰性赋形剂（或载体)混合， 所述惰性 赋形剂（或载体）包括但不限于： （a) 填料或增溶剂， 例如， 淀粉、 乳 糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸； （b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维 素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基吡咯烷酮、 蔗糖和阿拉伯胶； （c) 保湿 剂， 例如， 甘油； （d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或 木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸盐、 聚乙烯基聚吡咯烷酮和碳酸钠； (e)緩溶剂， 例如石蜡； 吸收加速剂， 例如， 季胺化合物； （g) 润 湿剂， 例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯； （h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠， 或其混合物。 胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也可包 含緩冲剂。
固体剂型如片剂、 糖丸、 胶嚢剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳 材制备， 如肠衣和其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并 且，这种组合物中活性化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某 一部分中释放。 必要时， 活性化合物也可与上迷赋形剂中的一种或多 种形成微胶嚢形式。
所述药物组合物也可以配制为用于口服给药的液体剂型，包括药 学上可接受的乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆或酊剂等。 除了本发明提供 的盐作为活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀 释剂， 如水或其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳 酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1 ,3 -丁二醇、 二甲基曱酰胺以及油， 特 别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油， 或这些 物质的混合物等。 除了这些惰性稀释剂外， 组合物也可包含助剂， 如 润湿剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、 矫味剂和香料。
当本发明盐以悬浮液存在时， 除了本发明提供的盐外， 悬浮液可 包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十八烷醇、 聚氧乙烯山梨醇和脱水山 梨醇酯、 微晶纤维素、 甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
所述药物组合物可以配制为用于肠胃外注射的剂型，包括生理上 可接受的无菌含水或非水溶液、 分散液、 悬浮液或乳液， 和用于重新 溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。含水和非水载体、稀 释剂、 溶剂或赋形剂可用于制备所述无菌含水或非水溶液、 分散液、 悬浮液或乳液。 适宜的含水和非水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括 水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混合物。
所迷药物组合物可以配制为用于局部给药的剂型， 包括软膏剂、 散剂、 贴剂、 喷射剂和吸入剂。 本发明提供的盐可在无菌条件下与生 理上可接受的载体及任何防腐剂、緩冲剂， 或必要时可能需要的推进 剂一起混合。 另一方面，本发明所迷的盐可用于制备由蛋白酪氨酸激酶介导的 疾病的治疗或者预防药物， 所述疾病包括肿瘤， 特别是恶性肿瘤， 例 如乳腺癌、 非小细胞肺癌、 卵巢癌、 胃癌、 结肠癌、 胰腺癌、 表皮样 鳞癌等。
再一方面， 本发明还涉及治疗和 /或预防哺乳动物肿瘤的方法， 包括将治疗或预防有效量的本发明所述的盐给予需要此治疗或预防 的哺乳动物。
本发明所述的盐可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗 剂联合给药， 特别是与其他抗肿瘤药物组合。 所述治疗剂包括但不限 于： 作用于 DNA化学结构的药物抗肿瘤药如顺铂， 影响核酸合成的 抗肿瘤药物如甲氨蝶呤 (MTX)、 5-氟尿嘧啶 (5FU)等， 影响核酸转录 的抗肿瘤药物如阿霉素、 表阿霉素、 阿克拉霉素、 光辉霉素等， 作用 于微管蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、 长春瑞滨等， 芳香化酶抑制 剂如氨鲁米特、 兰特隆、 来曲唑、 瑞宁德等， 细胞信号通路抑制剂如 伊马替尼 ( Imatinib ) 、 吉非替尼 ( Gefitinib ) 、 埃罗替尼 ( Erlotinib ) 等。待组合的各成分可同时或顺序地给予， 以单一制剂形式或以不同 制剂的形式给予。所述组合不仅包括本发明的化合物和一种其它活性 剂的组合，而且包括本发明的化合物和两种或更多种其它活性剂的组 合。 本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供的盐经实验证明在动物体内具有优异的生物利用 度；
(b)本发明提供的盐经实验证明具有优异的抗肿瘤活性；
(c)本发明提供的盐经实验证明在动物体内毒性低， 给药安全性 高。 下面结合具体实施方式， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施 未注明具体奈件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制 厂商所 建议的条件。所采用的原料为可商业上购得的或者可以很容易地由本 领域技术人员根据已知文献方法制得的。 对于所涉及的缩写， THF 指四氢呋喃， EA 指乙酸乙酯， DMSO是指二甲基亚砜， PVPP指聚乙浠 基聚吡咯烷酮， PVP指聚乙烯基吡咯烷酮， ig指灌胃， 指静脉注射。 除非另有说明， 否则份数和百分比为重量份数和重量百分比。 具体实施方式
实施例 1: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯 酰胺
步骤 A: 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)笨基胺基] -6-硝基喹唑啉的制备 1 ) 在一装有回流冷凝装置的 100ml烧瓶中加入 6-硝基喹唑酮
2.85g(15mmol), 三氯氧磷 25ml, 105°C回流反应 3h， 取出小心倾入 150ml冰水体系中， 慢慢析出鳞片状固体， 过滤干燥， 经鉴别该化合 物为 4-氯 -6-硝基-喹唑啉。 收率 78%。
!Η-ΝΜ (400ΜΗζ, CDC13): δ 9.22(2H, s), 8.74(1Η, dd, J=2.57Hz,
9.16Hz), 8.27(1H, d, J=9.16Hz)。 2)在一装有回流冷凝装置的 250ml的烧瓶内加入 2-氯 -4-硝基苯 酚 4.65g(26.6mmol), 间氟苄溴 3.3 lml(27.0mmol， leq), 碳酸钾 9.4g(54mmol, 2eq), 二甲基甲酰胺 50ml, 加热回流。 反应 4h后， 取出趁热滤去固体， 滤液冷至室温。 向体系中加入 300ml乙酸乙酯稀 释， 用水洗涤 3次， 有机相干燥， 浓缩， 柱层析纯化得固体产物。 将 上述固体产物置于一个装有回流冷凝装置的 250ml烧瓶内，加入还原 铁粉 4.7g(87mmol), ；水醋酸 10ml, 无水乙醇 50ml。 加热回流， 5h后 取出， 冷却至室温， 用大量水 -乙酸乙酯混和溶剂萃取， 合并有机相， 用碳酸氢钠溶液洗涤两次， 干燥， 浓缩， 柱层析纯化样品， 得到浅棕 色固体， 经鉴别该产物为 4-(3-氟苄氧基) -3-氯苯胺。 总收率 75%。
1H-NMR(400MHz, CDC13): δ 7.38-7.29(1Η, m), 7.23-7.16(2Η, m), 7.04-6.96(1Η, m)， 6.79-6.74(2Η, m), 6.50(1Η, dd, J=2.75Hz, 8.61Hz), 5.03(2H, s)， 3.50(2H, br；)。
3 )将 4-氯 -6-硝基-喹唑啉 1.20g ( 5.7mmoI)和 4-(3-氟苄氧基) -3- 氯苯胺 1.37g ( 5.6mmol ) 溶于 80mL异丙醇中， 回流反应 3h, 当体 系中析出大量黄色固体， 过滤， 固体用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至 pH=8。 真空干燥， 得到黄色固体 1.62g (3.75mmol) 。 经鉴别该化合 物为 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基卜6-硝基喹唑啉， 收率 67%。 Ή-ΝΜ (400ΜΗζ, CDC13): δ 11.30(1H, br), 9.54-9.48(1Η, m), 8.45-8.41(lH, m)， 8.31-8.25(1H, m)， 7.98-7.89(lH, m), 7.50-7.47(lH, m), 7.35-7.26 (1H, m)， 7.05-6.96(1H, m), 6.90-6.80(2H, m), 7.74-7.60(2H, m), 4.84(2H, s)。 步骤 B: 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -6-胺基喹唑啉的制备 在一个装有回流冷凝装置的烧瓶中加入按照步骤 A的方法制备 的 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -6-硝基喹唑啉 1.60g
( 3.77mmol ) ， 还原铁粉 1.05g ( 18.85mmol, 5eq ) ， 水醋酸 2mL, 曱醇 40mL , 85 °C油浴下回流反应 2.5h后， 过滤除去铁粉， 滤液用乙 酸乙酯稀释， 碳酸氢钠溶液洗涤， 水洗， 有机相干燥、 浓缩， 得到黄 色固体 900mg (2.28mmol) 。 经鉴别该化合物为 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄 氧基)苯基胺基] -6-胺基喹唑啉， 收率 61 %。
1H-NMR(400MHz, DMSO): δ 9.32(1H, s)， 8.31(1H, s), 8.04(1H, d, J=2.64Hz)， 7.73(1H, dd, J=2.64Hz, 8.80Hz), 7.54-7.43(2H, m), 7.36-7.28(3H, m), 7.26-7.14(3H, m), 5.57(2H, br), 5.27(2H, s)。 步骤 C: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙 烯酰胺的制备
在冰浴下加按照步骤 B的方法制备的 4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯 基胺基 ]-6-胺基喹唑啉 1.2g ( 3.04mmol ) , 三乙胺 0.6mL ( 4.58mmol, 1.5eq) , 丙烯酰氯 0.28mL ( 3.33mmol, l.leq ) ， THF 40mL, 逐渐 升至室温反应， 3h后， 停止反应， 过滤， 固体水洗至中性， 干燥， 得到黄色固体 1.0g(2.23mmol)。经鉴别该化合物为： N-{4-[3-氯 -4-(3- 氟-苄氧基）苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺， 收率 67%。 MS: 449。 mp: 222-225。C。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 8.75(1H, s), 8.60-8.52(2H, m), 7.81(1H, d, J-2.44Hz), 7.69(2H, s)， 7.54(1H, dd, J=2.56Hz, 8.92Hz), 7.30-7.22(2H, m), 7.18-7.08(2H, m), 6.96-6.86(2H, m), 6.37(2H, d， J=5.86Hz), 5.67(1H, t， J=5.86Hz), 5.06(2H, s)。 实施例 2: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯 酰胺盐酸盐 将按照实施例 1所述方法制备的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）笨基 胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺 l .Og ( 2.23mmol )溶于 20mL乙酸乙酯 /三乙胺混合溶剂 （ EA/Et3N=40/l ) 中， 于水水浴下搅拌， 緩慢滴加 4mol/L的 HCl/1 ,4-二氧六环溶液 （ 2mL ) 。 有黄色固体析出， 45min 后停止搅拌， 过滤， 水洗， 干燥得黄绿色固体 530mg ( 1.09mmol ) 。 经鉴別该化合物为 N-{4- [3-氯- 4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6- 基} -丙烯酰胺盐酸盐， 收率 49%。 MS: 449。 mp: 249-252 °C。
]Η-ΝΜΚ(400ΜΗζ, CDCl3+DMSO): δ 8.91( 1 Η, s), 8.76-8.69(2Η, m)， 8.01(1 Η, d), 7.83(2Η, s), 7.68(1Η, dd)， 7.46-7.33(2Η, m)， 7.34-7.29(2Η, m), 7.23-7.18(2Η, m), 6.51(2Η , d), 6.28(1Η, t), 5.61(2Η, s)。
题述的 Ν-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯 酰胺盐酸盐也可通过以下方法制备： 将 Ν-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基） 苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺 l .Og ( 2.23mmol )溶于 20mL四氢 呋喃 /三乙胺混合溶剂 （ THF/Et3N=40/l ) 中， 于冰水浴下搅拌， 緩慢 滴加 4N浓 HCl/1 ,4-二氧六环溶液 2mL， 有黄色固体析出， 45min后 停止搅拌，过滤，水洗，干燥得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] - 喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺盐酸盐 370mg ( 0.76mmol ) , 收率 34%。 实施例 3 : Ν-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基卜丙烯 酰胺硫酸盐
按照实施例 2所示的方法， 采用 2mol/L的硫酸 /1 ,4-二氧六环溶 液代替所用的 4mol/L的 HCl/1,4-二氧六环溶液，获得 N-{4-[3-氯 -4-(3- 氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺硫酸盐。
,H-NMR(400MHz, CDCl3+DMSO): δ 8.99( 1 H, s), 8.82-8.76(2H, m), 8.10(1H, d), 7.90(2H, s), 7.74(1 H, dd) , 7.53-7.40(2H, m), 7.42-7.37(2H, m)， 7.31 -7.26(2H, m)， 6.60(2H, d), 6.35(1H, t), 5.70(2H, s)。 实施例 4: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯 酰胺磷酸盐
按照实施例 2所示的方法， 采用 2mol/L的磷酸 /1 ,4-二氧六环溶 液代替所用的 4mol/L的 HCl/1 ,4-二氧六环溶液，获得 N-{4-[3-氯 -4-(3- 氟-苄氧基)苯基胺基 ]-喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺磷酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 8.95(1 H, s), 8.78-8.72(2H， m)， 8.07(1H, d), 7.86(2H， s) , 7.70(1H, dd), 7.50-7.36(2H, m), 7.38-7.33(2H, m), 7.27-7.22(2H, m), 6.56(2H, d), 6.30(1H, t), 5.64(2H, s)。 实施例 5: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯 酰胺碳酸盐
按照实施例 2所示的方法， 采用 2mol/L的碳酸 /1 ,4-二氧六环溶 液代替所用的 4mol/L的 HCl/1 ,4-二氧六环溶液，获得 N_{4-[3-氯 -4-(3- 氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺碳酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 8.97(1H, s)， 8.90-8.74(2H, m)， 8.09(1 H, d), 7.87(2H, s), 7.72(1H, dd), 7.52-7.38(2H, m), 7.40-7.35(2H, m)， 7.29-7.24(2H, m), 6.58(2H, d) , 6.32(1H, t)， 5.66(2H, s)。 实施例 6: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯 酰胺对甲笨磺酸盐
将按照实施例 1所述方法制备的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基 胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 3g ( 6.68mmol ) 溶于 50mL四氢呋喃 / 曱醇的混合溶剂 （THF/CH3OH=l/l ) 中， 向体系中緩慢滴加对曱苯 磺酸 （6eq， 7.62g ) 的四氢呋喃 /甲醇混合溶液 （ THF/CH3OH=l/l ) 24mL, 在滴加过程中， 体系緩慢析出大量黄色固体， 过滤， 固体水 洗。 真空干燥得黄绿色固体 2.93g ( 4.72mmol ) 。 经鉴别该化合物为 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基- }丙烯酰胺对甲笨 磺酸盐， 收率 70 %。
元素分析 ( C31H26C1FN405S ) ：
理论值： C: 59.95% , H: 4.22% , N: 9.02%, S: 5.16% 实测值： C: 60.01% , H: 4.22% , N: 8.99%, S: 5.13%
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 10.78(1H, s)9.07(lH, s)，
8.89(1H, s)， 8.06-8.04(lH, d), 7.88-7.84(2H, t), 7.59-7.57(l H, d)， 7.50-7.44(3H, dd), 7.35-7.30(3H, m), 7.21-7.16(1H, t)， 7.10-7.08(2H, d), 6.54-6.48( l H, dd), 6.38-6.34(l H , d), 5.90-5.87(2H , d), 2.26(3H, S)。
题述的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基-)丙烯 酰胺对曱苯磺酸盐也可以通过以下方法制备： 将 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟- 苄氧基)笨基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 3g ( 6.68mmol )溶于 30mL 四氢呋喃 /甲醇的混合溶剂 （ THF/CH3OH=2/l ) 中， 向体系中緩慢滴 加对曱苯磺酸（ 1 eq , 〗 .27g)的四氢呋喃 /曱醇的混合溶液
( THF/CH3OH=l/l ) 24mL, 滴加完毕后， 体系緩慢析出大量黄色固 体， 过滤， 固体水洗。 真空干燥得题述的盐 2.6g ( 4.19mmol ) , 收 率 63 %。 实施例 7: Ν-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯 酰胺甲磺酸盐
按照实施例 6所示的方法， 采用甲磺酸（6eq， 4.25g )代替对甲 苯磺酸， 获得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙 烯酰胺甲磺酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDC13+DMS0): δ 9.05( 1Η, s), 8.95-8.79(2H , m)， 8.15(1H, d), 7.93(2H, s)， 7.77(1H, dd), 7.57-7.43(2H, m), 7.45_7.40(2H, m), 7.34-7.29(2H, m), 6.63(2H , d), 6.37(1H, t)， 5.71(2H , s), 2.87(3H, s)。 实施例 8: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯 酰胺苯甲酸盐
按照实施例 6所示的方法， 采用苯曱酸（6eq， 4.76g )代替对曱 苯磺酸， 获得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基卜丙 烯酰胺苯曱酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDC13+DMS0): δ 10.70(1 H, s), 8.98(1 Η， s)， 8.80(1Η, s) , 7.08-7.00(1Η, d), 7.81-7.76(2Η, t) , 7.51-7.49(1Η, d), 7.42-7.36(3Η, dd), 7.27-7.22(3Η, m) , 7.14-7.08(1Η, t), 7.02-7.00(2Η, d), 6.48-6.40(1 Η, dd,) , 6.30-6.26(1 Η, d), 5.82-5.80(2Η, d), 2.40(3Η , s)。 实施例 9: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯 酰胺水杨酸盐 按照实施例 6所示的方法， 采用水杨酸（6eq, 5.39g )代替对曱 苯磺酸， 获得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙 烯酰胺水杨酸盐。
元素分析 ( C31H24C1FN405 ) ：
理论值： C: 64.43%, H: 4.12%, N: 9.54%
实测值： C: 64.48%, H: 4.12%, N: 9.52%
1H-NMR(400MHz, CDC13+DMS0): δ 10.70(1H, s)， 8.98(1H, s), 8.80(1 H, s), 7.08-7.00(lH, d), 7.81 -7.76(2H, t), 7.51-7.49(1H, d), 7.42-7.36(3H, dd)， 7.27-7.22(3H, m), 7. 14-7.08(1 H, t) , 7.02-7.00(2H, d), 6.48-6.40(lH, dd，）， 6.30-6.26(lH, d), 5.82-5.80(2H, d), 2.40(3H, s)。 实施例 10: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙 烯酰胺草酸盐
将按照实施例 1所述方法制备的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯基 胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺 l .Og ( 2.23mmol ) 溶于 20mL甲醇中， 于水水浴下搅拌， 緩慢滴加草酸 （ 990mg ) 的曱醇溶液 （2mL ) , 有 黄色固体析出， 45min后停止搅拌， 过滤， 水洗， 干燥得黄绿色固体 530mg ( 0.98mmol ) N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯基胺基卜喹唑啉 -6- 基卜丙烯酰胺草酸盐， 收率 44%。 MS: 449。 mp: 253-256 ° (：。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 9.1 1(1H, s), 8.76-8.64(2Η, m), 8.01(1 Η, d, J=2.44Hz), 7.90(2H, s), 7.71(1H, dd， J=2.56Hz, 8.92Hz), 7.52-7.41(2H, m), 7.33-7.26(2H, m) , 7.12-7.05(2H, m), 6.54(2H, d) , 6.12(1 H, t) , 5.56(2H , s), 2.98(6H, s)。 实施例 1 1 : N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基卜喹唑啉 -6-基} -丙 烯酰胺乙酸盐
按照实施例 10所示的方法， 采用乙酸（ 660mg ) 代替草酸， 获 得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺的乙 酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+D SO): δ 8.97(1H, s), 8.90-8.74(2H, m), 8.09(1H, d, J=2.44Hz), 7.87(2H , s), 7.72(1 H, dd), 7.52-7.38(2H, m), 7.40-7.35(2H, m), 7.29-7.24(2H, m), 6.58(2H, d), 6.32(1H, t), 5.66(2H, s), 2.10(3H, s)。 实施例 12: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）笨基胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙 烯酰胺戊酸盐
按照实施例 10所示的方法， 采用戊酸（ 1.12g )代替草酸， 获得
N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基 ]-喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺的戊酸 盐。
1H-NMR(400MHz, CDCl3+DMSO): δ 8.97(1H， s), 8.90-8.74(2H, m), 8.09(1 H, d， J=2.44Hz), 7.87(2H , s), 7.72(1 H, dd), 7.52-7.38(2H , m), 7.40-7.35(2H, m), 7.29-7.24(2H, m) , 6.58(2H, d), 6.32(1 H, t), 5.66(2H, s)， 2.28(3H, t), 1.60(2H, m), 1.38(2H, m), 1.00(3H, t)。 实施例 13: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙 烯酰胺丙二酸盐
按照实施例 10所示的方法， 采用丙二酸（ 1.14g )代替草酸， 获 得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基}-丙烯酰胺的丙 二酸盐。
1H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 8.97(1H, s)， 8.90-8.74(2H, m)， 8.09(1H , d, J=2.44Hz), 7.87(2H, s), 7.72(1H, dd), 7.52-7.38(2H, m)， 7.40-7.35(2H, m), 7.29-7.24(2H, m), 6.58(2H, d), 6.32(1H, t)， 5.66(2H, s), 3.27(2H, s)。 实施例 14: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）笨基胺基卜喹唑啉 -6-基} -丙 烤醜胺酒石酸益
按照实施例 10所示的方法， 采用酒石酸（ 1.65g )代替草酸， 获 得 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)笨基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺的酒 石酸盐。
元素分析 （ C28H24C1FN403 ) ：
理论值： C: 56.15%, H: 4.04% , N: 9.35%
实测值： C: 56.19% , H: 4.04%, N: 9.33%
'H-NMR(400MHz, CDCI3+DMSO): δ 8.97(1 H, s), 8.90-8.74(2H, m)， 8.09(1 H, d, J=2.44Hz), 7.87(2H , s), 7.72(1H, dd), 7.52-7.38(2H, m), 7.40-7.35(2H, m), 7.29-7.24(2H, m) , 6.58(2H, d), 6.32( 1 H, t), 5.66(2H , s)， 4.55(2H, s)。 实施例 15: N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）苯基胺基] -喹唑啉 -6-基卜丙 烯酰胺三乙胺盐
将按照实施例 1所述方法制备的 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基）笨基 胺基] -喹唑啉 -6-基} -丙烯酰胺 1.0g( 2.23mmol )悬浮于 20mL曱醇中， 于 35 °C下搅拌， 缓慢滴加三乙胺 2.3mL， 悬浮液慢慢澄清。 min后 停止搅拌， 浓缩， 水洗， 干燥得黄绿色固体 530mg ( 0.96mmol ) , 经鉴别为 Ν-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基卜喹唑啉 -6-基 丙烯酰 胺三乙胺盐。 收率 43%。 MS: 449。
1H-NMR(400MHz, CDC13+DMS0): δ 10.59(1H, s), 10.07(1Η, s), 8.80(1Η, s), 8.58(1Η, s) , 7.95-7.89(2Η, m)， 7.79-7.75(1Η, d), 7.67-7.63(1Η, dd), 7.49-7.42(2Η, s)， 7.33-7.23(3Η, m), 7.19-7.13(1Η, m)， 7.12-7.07(2Η, dm), 6.58-6.42(1 Η, m)， 6.38-6.35(1Η, d), 5.84(1Η, t, ), 5.21(2Η, s) , 1.20- 1.10(9Η, m)。 实施例 16 溶解度实验
按照常规溶解度测定方法， 即在室温条件下， 称取适量待测化合 物并将其至于 15mL水溶液中， 然后充分搅拌使溶， 室温下放置 3h, 用移液管吸取 10mL上部澄清饱和溶液至于已称重的称量瓶中，加热 挥干溶剂， 干燥， 称重得到残留物质量即为溶液中溶质的质量， 再经 计算得到式（ I )化合物及其盐在水中的溶解度， 同法测得待测化合物 在曱醇中的溶解度， 结果如下所示：
化合物 水中溶解度 (/mL) 曱醇中溶解度 (/mL) 式 (： I )化合物 <10ng <lmg
盐酸盐 >^g >5mg
硫酸盐 >5mg
对甲苯磺酸盐 >7μ >7mg
甲磺酸盐 >5μ§ >5mg
草酸盐 >5μ8 >5mg
酒石酸盐 >7μ§ >7mg
三乙胺盐 〉5 g >5mg 实施例 17 SD大鼠 （Sprague Dawley大鼠） 药物吸收实验
灌胃给药（ig): 健康 SD大鼠 24只， 雄性， 体重 200 ~ 250g， 随机分 成三组。 分别灌胃给予上述实施例 1所得的化合物 （21.68 mg/kg ) 、 其盐酸盐 （ 23.42 mg/kg ) 或其对甲苯磺酸盐 （30mg/kg ) , 于给药后 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0、 5.0、 7.0、 9.0、 12和 24 小时采集血样， 分 离制备血浆， 采用液相色语 /串联质谱法测定血浆中药物的浓度， 得到药 物浓度 -时间曲线。
其主要的药物动力学参数如下表所示：
Figure imgf000017_0002
静脉注射 (iv): 健康 SD大鼠 8只， 雄性， 体重 200 ~ 250g, 静脉给 予式（ I )化合物的对甲笨磺酸盐， 于给药后 5min、 15min、 0.5、 1.5、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0和 7.0小时采集血样， 分离制备血浆， 采用液相色谱 /串联盾谱法测定血浆中药物的浓度， 得到药物浓度 -时间曲线。 其主要的 药物动力学参数如下表所示：
Figure imgf000017_0001
经剂量校正后， 按 AUQ 计算， 实施例 1所得的式（ I )化合物灌 胃给药的绝对生物利用度为 0.95 % ,化合物的盐酸盐灌胃给药的绝对 生物利用度为 9.30% ,化合物的对曱苯磺酸盐灌胃给药的绝对生物利 用度为 1 1.07 %。 实施例 1 8 EGFR酪氨酸激酶抑制活性检测
将 EGFR酪氨酸激酶反应底物 Poly(Glu，Tyr) 4: 1 包被酶标板； T-PBS洗板三次， 于 37°C烘箱中干燥； 每孔依次加入用反应緩冲液 稀释的 ATP溶液、 梯度浓度的待测化合物、 以及受试酪氨酸激酶启 动反应， 置 37。C摇床反应 1小时， T-PBS (含 0.05%吐温的 pH7.4 的磷酸盐緩沖液）洗板三次； 加入抗体 PY99于 37。C反应 lh, T-PBS 洗板三次；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的 IgG于 37。C反应 l h, T-PBS洗板三次； 加入 OPD (邻苯二胺）显色液， 室温避光反应 1 - 10 min; 加入 2 M H2S04中止反应， 用可调波长式微孔板酶标仪
VERSAmax (美国 MDC公司）测在 492nm波长下的 OD值。 样品的 抑制率通过下列公式求得：
样品的抑制率％- [ 1 - (待测化合物 OD值 -无酶对照孔 OD值） I (阴性对照 OD值 -无酶对照孔 OD值） ] χ 100%
结果表明： 式（I )化合物的盐酸盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 草酸盐或酒石酸盐对 EGFR酪氨酸激酶具有优异的抑制活性。 实施例 19 对肿瘤细胞抹的增殖抑制试验
将上述实施例所得的式（ I )化合物的对甲苯磺酸盐或盐酸盐配 制成 5个浓度梯度， 参照活细胞的四氮唑盐
( 3-(4,5-dimethylthiahiazolo-2-yl)-3,5-di-phenyl tetrazolium bromide , MTT ) 法检测： 分别将处于对数生长期的人表皮样鳞癌细胞 A43 1、 人乳腺癌细胞 BT-474 ( 1 X 105 )接种于 96孔培养板， 培养 24h后， 加入不同浓度的待测化合物， 每个浓度设三复孔； 并设 DMSO溶剂 对照孔及无细胞调零孔。用药物处理细胞 72小时后，加入 20 μL TT ( Sigma , St Louis , MO , USA )溶液； 继续培养 4小时后， 加入 50 三联液（ 10%SDS-5%异丁醇 -0.01 mol/L HC1 ) , 于培养箱中过夜。 然后用酶标仪在 570nm波长下测定 OD值。 以下列公式计算药物对 细胞生长的抑制率：
抑制率 （％ ) = (溶剂对照 OD值 -待测化合物 OD值） /溶剂对 照 OD值 X 100%, IC50值采用 Logit法计算。
结果： 式（ I )化合物的对曱苯磺酸盐对人表皮样鳞癌细胞 A431、 人乳腺癌细胞 BT-474的 IC50分别为 0.73 μ Μ、 0.42 μ Μ; 式（ I )化合 物的盐酸盐对人表皮样鳞癌细胞 A431、人乳腺癌细胞 BT-474的 IC50 分别为 0.84 μ Μ、 0.46 μ Μ。 实施例 20
对移植于 BALB/cA棵鼠的人体表皮样鳞癌 A431的抑瘤作用 取生长良好的 A431实体瘤， 无菌条件下切割成 2-3mm大小的 均匀小块， 用套管针于每只 BALB/cA棵鼠右腋皮下接种一块， 接种 后 7 日起随机分组， 开始连续经口灌胃给药 13天， 并用游标卡尺每 4天测瘤块的长径 （a ) 、 短径 （b ) ， 根据公式 V=ab2/2计算肿瘤体 积 （mm3 ) , 接种后 23天脱颈处死动物， 解剖取瘤块， 称瘤重， 计 算抑瘤率。 结果如下表所示， 表明式（ I )化合物的对曱苯磺酸盐具有明显的 抑瘤作用。
Figure imgf000019_0001
对移植于 BALB/cA裸鼠的人卵巢癌 SKOV-3的抑瘤作用 取生长旺盛期的 SKOV-3瘤组织剪切成 1.5 mm3左右均匀小块， 在无菌条件下， 用套针管接种于 BALB/cA棵鼠右侧腋窝皮下。 棵鼠 移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径， 待肿瘤生长至 80-100 mm3后将 动物随机分组。 受试物实验组经口灌胃每日一次， 连续用药 3周。 阳 性对照药 MMC (丝裂霉素）的剂量为 5mg/kg于第 1天静脉给药 1次。 阴性对照组为 0.5%CMC-Na (羧甲基纤维素钠） 0.2mL/只。每周 2次测 量肿瘤长径 （a ) 、 短径 （b ) , 同时称裸鼠体重。 根据公式¥=^2/2 计算肿瘤体积（ mm3 )。根椐测量的结果计算出相对肿瘤体积（ relative tumor volume , RTV ) (计算公式为： RTV = Vt/V0， 其中 V。为分笼 给药时（即 do)测量所得肿瘤体积， ¼为每一次测量时的肿瘤体积） 。 抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C ( % ) , 计算公式如下：
T/C ( % ) = ( TRTV / CRTV ) X 100
TRTV: 治疗组 RTV ； CRTV: 阴性对照组 RTV。
疗效评价标准： T/C(%) 〉 60%为无效， T/C(%) < 60为有效。 结果如下表所示， 表明式（ I )化合物的对曱苯磺酸盐具有明显的 抑瘤作用。
动物数 肿瘤体积 （mm3) T/C 組別 剂量、 給药方式 RTV
开始 最后 Vo v21 (%)
0.5%CMC-Na 0.2mL/只 ig 12 12 85土 35 638+ 339 9.6+ 5.4
MMC 5mg/kg iv 6 6 83士 13 258士 77 3.1士 0.5 32.0 对甲苯磺酸盐 200mg/kg ig 6 6 86土 13 303土 72 3.5士 0.8 36.9 对曱苯磺酸盐 100mg/kg ig 6 6 87士 41 345土 88 4.3土 1.3 45.0 对甲笨磧酸盐 50mg/kg ig 6 6 79土 28 421土 89 5. 1 ± 1.7 53.0
Vo指给药前肿瘤体积； V21指连续用药 3周后肿瘤体积 实施例 2】 长期给药毒性试验
健康 SD大鼠 130只， 雄性， 体重 200 ~ 250g, 随机分成 26组。 连 续灌胃给予式（ I )化合物的盐酸盐、 对曱苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 草酸 盐、 酒石酸盐 4周， 设 20、 50、 100、 500 、 800mg/(kg ·天） 5个剂 量组和 1个溶剂对照组。 给药 4周结果显示： 20、 50、 100、 500 、 800mg/(kg ·天)组大鼠体征、 外观、 行为、 活动、 粪便形状未见异常， 进食量正常， 体重和体重增长与对照组基本相似， 无统计学差异。 血 液学、 血液生化学、 心电图、 体温和尿液检查结果显示， 各项检查指 标与对照组相似， 均在正常值范围内波动。 表明式（ I )化合物的成盐 形式毒性低、 给药安全性高。 实施例 22 药物组合物
由以下组分制备 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基 丙烯酰胺盐酸盐的胶嚢： 式（ I )化合物的盐酸盐
淀粉
乳糖
PVPP
PVP
滑石粉
十二烷基^ L酸钠 按常规方法， 将式（ I )化合物的盐酸盐、 淀粉混合过筛， 再与上述其 他组分混合均勾， 装入普通明胶胶嚢。 实施例 23 药物组合物
由以下組分制备 N-{4-[3-氯 -4-(3-氟-苄氧基)苯基胺基] -喹唑啉 -6-基}-丙烯酰胺对甲 ^^黄酸盐的片剂： 式（ I )化合物的对甲苯磅酸盐 20g
淀粉 20g
乳糖 40g
PVPP 3g
PVP 3g
滑石粉 1.6g
十二烷基硫酸钠 5g 按常规方法， 将式（ I )化合物的对甲笨磅酸盐、 淀粉混合过筛， 再与 上述其他组分混合均勾， 直接压片。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一 篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲 授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价 形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种式 (I)所示化合物在药学上可接受的盐,
Figure imgf000023_0001
2. 如权利要求 1所述的盐， 其中所述盐为式 (I)化合物与无机酸 或有机酸形成的酸加成盐或者与无机碱或有机碱形成的碱加成盐。
3. 如权利要求 2所述的盐， 其中所述盐为酸加成盐。
4. 如权利要求 3所述的盐， 其中所述酸加成盐为氢溴酸盐、 盐 酸盐、 硫酸盐、 硫酸氢盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 亚硫酸盐、 磷酸盐、 磷酸氢盐、 硼酸盐、 乙酸盐、 草酸盐、 丙二酸盐、 戊酸盐、 苯甲酸盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 酒石酸盐、 乳酸盐、 苯曱酸盐、 甲苯甲酸 盐、 柠檬酸盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 苹果酸盐、 双羟萘酸盐、 水杨 酸盐、 香草酸盐、 扁桃酸盐或者琥珀酸盐。
5. 如权利要求 4所迷的盐， 其中所述酸加成盐为盐酸盐、 硫酸 盐、 磷酸盐、 碳酸盐、 对甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 苯甲酸盐、 水杨酸 盐、 草酸盐、 乙酸盐、 戊酸盐、 丙二酸盐或者酒石酸盐。
6. 如权利要求 5所述的盐， 其中所迷酸加成盐为盐酸盐或者对 甲苯磺酸盐。
7. 如权利要求 2所述的盐， 其中所述盐为碱加成盐。
8. 如权利要求 7所述的盐， 其中所述碱加成盐为碱金属盐、 碱 土金属盐、 季铵阳离子盐或者胺盐。
9. 如权利要求 8所述的盐， 其中所述碱加成盐为钠盐、 钾盐、 钙盐、 镁盐、 四甲基季铵盐、 四乙基季铵盐、 曱胺盐、 二曱胺盐、 三 甲胺盐、 三乙胺盐、 乙胺盐。
10. 如权利要求 9所述的盐， 其中所述盐为三乙胺盐。
1 1. 用于治疗或预防哺乳动物肿瘤的权利要求 1 - 10 任一所述 盐。
12. 一种制备权利要求 1 ~ 10任一所述盐的方法， 包括步骤： (a) 将式 (I)化合物溶于有机溶剂中， 在搅拌条件下滴加含酸或 碱的溶剂；
直接过滤或经浓缩后过滤得到固体， 水洗， 干燥后得到所
Figure imgf000024_0001
13. 如权利要求 12 所述的方法， 其中所述的有机溶剂为甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 四氢呋喃、 三乙胺、 乙醚、 1 ,4-二氧六环或者其混 合溶剂。
14. 一种包含权利要求 1― 10任一所述的盐和药学上可接受的载 体的药物组合物。
15. 如权利要求 14的药物组合物， 其还包含另外的抗肿瘤药物。
16. 如权利要求 1 - 10 任一所述的盐在制备抗肿瘤药物中的用 途。
17. 如权利要求 16 所迷的用途， 其中所述肿瘤选自乳腺癌、 非 小细胞肺癌、 卵巢癌、 胃癌、 结肠癌、 胰腺癌和表皮样鳞癌。
18. 一种治疗或预防哺乳动物肿瘤的方法， 包括将治疗或预防有 效量的权利要求 1 -10任一所述的盐给予需要的哺乳动物。
19. 如权利要求 18 所述的方法， 其中所述肿瘤选自乳腺癌、 非 小细胞肺癌、 卵巢癌、 胃癌、 结肠癌、 胰腺癌和表皮样鳞癌。
20. 如权利要求 19 所述的方法， 其中进一步包括将另外的抗肿 瘤药物与权利要求 1 - 10任一所迷的盐同时或顺序地给予需要的哺乳 动物。
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