WO2008074845A2 - Verfahren zur herstellung eines produktes mit polymermatrix, daraus bestehende implantate sowie deren verwendung - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of a polymer matrix product, products available thereafter and their use.
  • rhBMP-2 encapsulate rhBMP-2 in an amount of 170 ⁇ g / g poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) in the PLGA under drastic conditions (dichloromethane, 6M urea) but almost complete release of the encapsulated rhBMP-2 already within about 10 days.
  • PLGA poly (lactide-co-glycolide)
  • Poly (D, L-lactide) is an amorphous polyester of the D- and L-lactic acid with a glass transition temperature of about 57 0 C. Due to the lack of Kristallimtat PDLLA has a lower strength and a lower modulus of elasticity than crystalline poly (L Lactide) (PLLA). Particular advantages of the Gewebersmate ⁇ als Polylactid are the strength over several weeks, the degradability and the formation of the physiological monomer lactic acid as a final degradation product. PLLA degradation in vitro and in vivo occurs in five phases: Phase 1: hydration;
  • Phase 2 Depolymerization without loss of mass (10-20 weeks, new bone trabeculae);
  • Phase 3 loss of mass
  • Phase 4 Absorption (2-5 years, uptake of fragments by phagocytes);
  • Phase 5 Elimination (lactate is converted to pyruvate and metabolised).
  • Bone growth factor of the BMP class in particular BMP-2, can be produced.
  • the invention therefore relates to a process for the preparation of a polymer matrix product comprising the steps of: a) mixing a powdery biodegradable polymer with an aqueous solution of a growth factor, cytostatic agent, antibiotic or mixtures thereof to a slurry in an amount such that the aqueous Solution almost completely from the is absorbed by powdery polymer; b) drying the sludge obtained in step a); c) introducing the product from step b) into a shaping device; and d) shaping the product introduced into the molding apparatus into an application form for promoting cell growth.
  • the inventors have found as one of the essential elements of the invention that a slurry is formed, i. there is no supernatant next to the powder.
  • the primary "drying" of the sludge is understood to be more than a spontaneous dryness due to the hygroscopicity of the polymer powder such as PDLLA powder.
  • Hygroscopy causes the aqueous solution to react with the e.g. BMP is absorbed into the polymer particles and presumably combines with the polymer particles in a very fine and adsorptive manner.
  • a drying process e.g. Air drying or freezing followed by lyophilization.
  • a polyvalent sugar such as sucrose may be present in the aqueous solution.
  • biodegradable polymer having a particle size of up to 500 ⁇ m.
  • This biodegradable polymer is preferably polylactic acid, polyglycolic acid or their copolymers.
  • the powdery biodegradable polymer may additionally contain a pH stabilizer such as CaCO 3, NaHCO 3, etc.
  • a pH stabilizer such as CaCO 3, NaHCO 3, etc.
  • 1.5 to 2.5 milliliters of the aqueous solution of bone growth factor is used per gram of the polymer.
  • This aqueous solution of BMP bone growth factor Class should have a concentration of growth factor that allows from 0.5 mg to 10 mg bone growth factor per gram of biodegradable polymers in the product.
  • Particularly high loading of the bone growth factor polymer can be achieved with an aqueous solution of the bone growth factor of the BMP class at a pH of 4 to 5, or at a pH of 9.5 to 10.5.
  • the resulting product can be lyophilized for better further processing.
  • the lyophilisate can be introduced into an extruder as a shaping device and extruded by means of the extruder at a temperature above the glass transition temperature of the biodegradable polymer and below the denaturation temperature of the bone growth factor to a granulate. In this way, a granule is obtained which has an already well homogeneous distribution of the growth factor in the polymer.
  • Shaping apparatus is introduced, is subjected in the autoclave above the glass transition temperature of the biodegradable polymer and below the decomposition temperature of the bone growth factor of a pressure fumigation with supercritical carbon dioxide, then the autoclave is relieved of pressure and the resulting foam-like product is removed from the autoclave.
  • the foam-like product thus obtained which can also be shaped further into the desired application form, is distinguished characterized by a long-lasting release while maintaining the biological activity, which is not known in the prior art.
  • the desired application form includes, as above, a surgical fastener such as a suture, pin, nail, screw or rivet, a plate or membrane, or the use as a coating agent for metallic or ceramic implants onto which the foam-like product may be melted.
  • a surgical fastener such as a suture, pin, nail, screw or rivet, a plate or membrane, or the use as a coating agent for metallic or ceramic implants onto which the foam-like product may be melted.
  • the invention therefore also relates to a product having a polymer matrix obtained by the method according to the invention and to application forms produced therefrom, such as a surgical fastener such as thread, pin, nail, screw or rivet, a plate or membrane, and the use for coating on implants and the like coated implants.
  • the preparation of the PDLLA-CaCO 3 -BMP-2 composite can be carried out as follows: 1 g PDLLA-CaCO 3 granules are dissolved in 1.6 ml BMP-2 solution (125 ⁇ g / ml in unbuffered 15 mM sucrose, the BMP-2 concentration up to 2 mg / ml in unbuffered 15 mM sucrose or in 15 mM sucrose buffered at pH 4.5 or pH 10.0, respectively, and in a Potter homogenizer with Teflon pistist manually with rotary movements homogenized. During the homogenization process, the material became dry again, so that again a powder was present at the end of the homogenization.
  • This powder was further processed either directly or after lyophilization into foamed tablets in a gassing process.
  • the PDLLA-CaCO is subjected in an autoclave at a temperature of about 35-55 0 C 3 BMP-2 powder mixture in a Teflon mold (10 x 5 x 2 mm openings) to pressure gassing with supercritical CO 2 (100 bar).
  • the glass transition temperature of the PDLLA is at a pressure of 100 bar at ⁇ -50 0 C, ie at 100 0 C above the glass transition temperature, the polylactide thermoplastic / liquid and dissolves the BMP-2.
  • the PDLLA-CaCO 3 - BMP-2 powder mixture is held for about 2 hours under these conditions (hold time).
  • the temperature is lowered to room temperature and the pressure to ambient pressure (decompression). Under these conditions, a certain "porosity" which can be increased by faster decompression is obtained. Under these conditions, the BMP-2 must withstand a pressure of 100 bar and a temperature of 55 ° C. in order to remain biologically active.
  • I-labeled rhBMP-2 was used by the inventors to describe the individual steps of the preparation and the properties of foamed BMP-2-loaded
  • Bone growth factor rhBMP-2 can be incorporated in amounts up to 3.4 mg / g polylactide and that this rhBMP-2 is released at a rate constant of 1.6 ⁇ 10 -3 [d] ie with a half-life of ⁇ 400 days.
  • the released rhBMP-2 is active both in vitro and in vivo. activity measurements
  • rhBMP-2 Recombinant human "bone morphogenetic protein" was prepared in E. coli according to methods previously described with a purity of> 95% by the inventors.
  • the biological activity of the rhBMP-2 thus obtained can be determined by means of a cell culture (MC3T3-E1 cell).
  • Radioactive labeling of rhBMP-2 was performed by the chloramine-T method ( 125 I-rhBMP-2) as described for the protein ubiquitin in the prior art. The biological activity of 125 I-rhBMP-2 is fully retained in this method.
  • PDLLA poly (D, L-lactide) resomer 207 and resomer 208 (with a slightly different degree of polymerization) was purchased and dissolved in chloroform A pH stabilizer such as CaCC> 3 can be added for pH stabilization during hydrolysis in the organism
  • the PDLLA / CaCC> 3 mixture can be precipitated with an organic solvent such as ethanol, then dried, ground to a fine powder and sieved (particle size ⁇ 200 ⁇ m) and mixed with a growth factor such as rhBMP-2 in an aqueous solution.
  • Composite material can then be treated with supercritical CO 2 after
  • foamed 125 l-rhBMP-2-containing tablets were suspended in 1.5 ml PBS buffer (phosphate buffered saline: 137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) small reagent tube and incubated with multiple changes with 1.5 ml of PBS for continuous mixing on a rotating wheel at room temperature for 107 days.
  • PBS buffer phosphate buffered saline: 137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4
  • the biological activity of the soluble rhBMP-2 was measured by recording the dose-response curve (induction of alkaline phosphatase) with MC3T3-E1 cells.
  • the biological activity is called
  • tissue samples were carefully freed from the soft tissue jacket immediately after collection and introduced for primary fixation in phosphate buffered formaldehyde solution (4.5%).
  • phosphate buffered formaldehyde solution 4.5%).
  • the tissue samples were dehydrated after primary fixation in an ascending alcohol series.
  • the samples were then embedded in Technovit 7200 VLC.
  • 2 thin sections of 20 ⁇ m thickness were prepared from each sample. A 1% thionin solution was used for surface staining of the finished ground sections.
  • Histomorphometric evaluation was performed by a semi-automatic image analysis program coupled to a transmitted light microscope (Eclipse 800, Nikon Corp., Tokyo, Japan) (Lucia 32g / 4.51, Laboratory Imaging Ltd., Prague, Czech Republic) at 4 times original magnification.
  • standardized measuring frames were positioned centrically over the defect area with the PDLLA tablets contained therein and the
  • n 20.
  • the calcite-containing tablets had a weight of 35 mg.
  • the absolute levels of released 125 I-rh-BMP-2 (initial loading 1.0 + 0.145 mg / g) were calculated for various periods of time. In 107 days, a total of 230 ⁇ g 125 I-rh-BMP-2 / g PDLLA was released (ie, 23% of the total). In the burst phase, it was 93 ⁇ g / g within one day. Thus, as shown in Table 3 below, a three-month constant and very effective stimulation of bone growth is possible.
  • the tablets obtained according to the invention (10 ⁇ 5 ⁇ 2 mm) had a weight of 40-60 mg / tablet and contained 20-80 ⁇ g BMP-2 / tablet.
  • the structure of the foamed PDLLA is sponge matrix-like and the biological activity of the bone growth factor is maintained almost unchanged.
  • the polylactide composite of the present invention is a material containing a polylactide matrix (mechanically stable implant or spacer, bone substitute material), CaCC> 3 for buffering the lactic acid produced in the hydrolysis, and BMP-2 for osteoinduction , which is excellent for increasing bone growth.
  • a polylactide matrix mechanically stable implant or spacer, bone substitute material
  • CaCC> 3 for buffering the lactic acid produced in the hydrolysis
  • BMP-2 for osteoinduction
  • the matrix of the invention with bone growth factor can be advantageously used in the following forms: • pins, nails, screws • plates, membranes
  • BMP-2 for example, withstands temperatures without denaturation up to 100 ° C.
  • the shaped bodies produced in this way can thus be fused with the latter by means of a sonic welding method when implanted in the tissue.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit Polymermatrix beinhaltend Wachstumsfaktore, Cytostatika oder Antibiotika, danach erhältliche Produkte sowie deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit Polymermatrix , daraus bestehende Implantate sowie deren Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit Polymermatrix, danach erhältliche Produkte sowie deren Verwendung.
Die Einbringung biologisch aktiver Proteine wie z.B. Wachstumsfaktoren in künstliche implantierbare Polymere mit nachfolgender Freisetzung im Gewebe unter Erhalt der biologischen Aktivität ist ein noch ungelöstes Problem in der Biomaterial- und Implantatforschung. Ein sehr vielversprechendes Polymer, das sich zur Losung der Probleme anbietet, ist das biologisch abbaubare Polylaktid. So ist schon früh versucht worden Wachstumsfaktoren u.a. BMP-2 in Polylaktide einzubringen. So konnten beispielsweise Weber et al. [ (2002) Slow and continuous application of human recombinant bone morphogenetic protein via biodegradable poly (lactide-co- glycolide) foamspheres. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. , 31, 60-65] rhBMP-2 in einer Menge von 170 μg/g Poly (Laktid- co-Glycolid) (PLGA) in das PLGA unter drastischen Bedingungen (Dichlormethan, 6M. Harnstoff) einkapseln, jedoch erfolgte die fast vollständige Freisetzung des eingekapselten rhBMP-2 bereits innerhalb von ca. 10 Tagen.
Poly (D, L-Lactid) ist ein amorpher Polyester der D- und L- Milchsaure mit einer Glastemperatur von ca. 57 0C. Auf Grund des Fehlens der Kristallimtat besitzt PDLLA eine niedrigere Festigkeit und einen niedrigeren Elastizitätsmodul als kristallines Poly (L-Lactid) (PLLA) . Besondere Vorzuge des Gewebeersatzmateπals Polylactid sind die Festigkeit über mehrere Wochen, die Abbaubarkeit und die Entstehung des physiologischen Monomers Milchsäure als endgültigem Abbauprodukt. Der PLLA-Abbau in vitro und in vivo erfolgt in fünf Phasen: Phase 1: Hydratation;
Phase 2: Depolymerisation ohne Masseverlust (10-20 Wochen, neue Knochenbälkchen) ;
Phase 3: Masseverlust; Phase 4: Absorption (2-5 Jahre, Aufnahme von Fragmenten durch Phagozyten) ;
Phase 5: Elimination (Lactat wird in Pyruvat umgewandelt und verstoffwechselt) .
Im Stand der Technik ist zur Aufschäumung von Polylactiden aus der Sheridan, M. H., Shea, L. D., Peters, M. C, & Mooney, D. J. (2000) J. Control Release, 64, 91-102 bekannt, dass trockene Pulver von Polylactid-co-Glycolid und lyophilisiertem Blutgefäßwachstumsfaktor VEGF gemischt und aufgeschäumt (59 bar) werden, wobei der Schaum fragmentiert. In anderen Versuchen wurde eine offenporige Struktur durch Schäumung mit NaCl hergestellt. Die Freisetzungsraten schwankten zwischen 2 und 70 Tagen.
Seitens der Erfinder wurde nun gefunden, dass stabile Produkte, insbesondere Schäume mit eingebundenem Knochenwachstumsfaktor, aus einer Mischung aus einem Polylactid mit einer Lösung mindestens eines
Knochenwachstumsfaktors der BMP-Klasse, insbesondere BMP-2, hergestellt werden können.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit Polymermatrix, das die folgenden Schritte umfasst : a) Mischen eines pulverförmigen biologisch abbaubaren Polymers mit einer wässrigen Lösung eines Wachstumsfaktors, Cytostatikum, Antibiotikum oder Mischungen davon zu einer Schlämme in einer Menge, dass die wässrige Lösung nahezu vollständig von dem pulverförmigen Polymer aufgesaugt wird; b) Trocknen der in Schritt a) erhaltenen Schlämme; c) Einbringen des Produktes aus Schritt b) in eine Formgebungsvorrichtung; und d) Formen des in die Formgebungsvorrichtung eingebrachten Produktes in eine Applikationsform zur Förderung des Zellwachstums..
Die Erfinder haben dabei als eines der wesentlichen Elemente der Erfindung festgestellt , dass eine Schlämme gebildet wird, d.h. es ist kein Flüssigkeitsüberstand neben dem Pulver vorhanden. Das primäre "Trocknen" der Schlämme wird dabei mehr als ein spontanes Trockenwerden auf Grund der Hygrosokopie des Polymer-Pulvers wie PDLLA-Pulvers verstanden. Die Hygroskopie bewirkt, daß die wässrige Lösung mit dem z.B. BMP in die Polymer-Partikel aufgesaugt wird und sich vermutlich mit den Polymer-Partikeln feinst und adsorptiv verbindet . In der Regel wird dabei auf ein Gramm Polymer 1,0 bis 3,5 ml der wässrigen Lösung eingesetzt, und das pulverförmige Polymer saugt die wässrige Lösung nahezu vollständig auf, so dass ein etwas feuchtes Pulver verbleibt. Sekundär wird ein Trocknungsprozeß z.B. Lufttrocknung oder Einfrieren mit nachfolgender Lyophilisierung eingesetzt.
Um den Wachstumsfaktors, Cytostatikum, Antibiotikum oder Mischungen davon beim dem Trocknen in der biologischen Aktivität zu erhalten und zu schützen, kann in der wässrigen Lösung ein mehrwertiger Zucker wie Sucrose vorhanden sein.
Das Fehlen des Überstandes oder einer flüssigen Phase in der Schlämme bewirkt, daß nur sehr geringe Mengen nicht im PDLLA Pulver aufgenommenen BMPs zwischen den PDLLA-Partikeln beim Trocknungsprozeß verbleiben. Je mehr flüssige Phase, d.h. partikelfreie Phase, vorhanden ist, desto mehr „Eisbrocken" fallen beim Einfrieren vor der Lyophilisierung an. Wenn diese Eisbrocken trockenen, so fällt extrapartikuläres BMP-2 Pulver an. Nach Vermutung der Erfinder ist es dieses extrapartikuläre BMP, welches später nicht so aufgeschäumt wird, außen auf den Tabletten verbleibt und die "Burst-Phase" bedingt, die seitens der Erfinder nicht angestrebt wird.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es nun möglich, ein resorbierbares osteoinduktives Polymermaterial zur verbesserten bzw. beschleunigten Knochenheilung und - neubildung durch Freisetzung des Wachstumsfaktors bei zeitgleicher Degradation eines individuellen präoperativ gefertigten Implantats herzustellen. Dies kann insbesondere durch eine homogene Verteilung des Wachstumsfaktors, insbesondere BMP-2, bei einer hohen Beladungsmöglichkeit mit langdauernder Freisetzung unter Erhalt der biologischen Aktivität erreicht werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren setzt man vorzugsweise ein pulverförmiges biologisch abbaubares Polymer mit einer Teilchengröße bis 500 μm ein. Dieses biologisch abbaubar Polymer ist bevorzugt Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder deren Copolymere.
Um das physiologische Milieu bei dem Abbau des Polymers im Körper zu stabilisieren, kann das pulverförmige biologisch abbaubare Polymer zusätzlich ein pH-Stabilisierungsmittel wie CaCO3, NaHCO3 etc. enthalten. Ein Nachteil des Polysäure wie Polylactids ist jedoch die pH-Absenkung um mehrere pH- Einheiten während der Hydrolyse, weshalb dem Polymer auch vorzugsweise Puffersubstanzen (z.B. CaCO3 oder 80% Na2HPO4/20% NaH2PO4) zugesetzt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform werden auf ein Gramm des Polymers 1,5 bis 2,5 Milliliter der wässrigen Lösung des Knochenwachstumsfaktors eingesetzt .
Diese wässrige Lösung des Knochenwachstumsfaktors der BMP- Klasse, insbesondere BMP-2, sollte eine Konzentration an Wachstumsfaktor besitzen, die von 0,5 mg bis 10mg Knochenwachstumsfaktor pro Gramm an biologisch abbaubaren Polymeren im Produkt ermöglicht. Eine besonders hohe Beladung des Polymers mit Knochenwachstumsfaktor kann mit einer wässrigen Lösung des Knochenwachstumsfaktors der BMP-Klasse bei einem pH-Wert von 4 bis 5, oder mit einem pH-Wert von 9,5 bis 10,5 erzielt werden.
Wenn die Mischung aus dem Polymer und der wässrigen Lösung des Knochenwachstumsfaktors nicht ausreichend rieselfähig ist, kann zur besseren Weiterverarbeitung das erhaltene Produkt, die Schlämme, lyophilisiert werden.
In einem nächsten Verfahrenschritt kann das Lyophilisat in einen Extruder als Formgebungsvorrichtung eingebracht und mittels des Extruders bei einer Temperatur oberhalb der Glasübergangstemperatur des biologisch abbaubaren Polymers und unterhalb der Denaturierungstemperatur des Knochenwachstumsfaktors zu einem Granulat extrudiert werden. Auf diese Weise wird ein Granulat erhalten, das eine bereits gut homogene Verteilung des Wachstumsfaktor im Polymer besitzt .
Eine noch homogenere Verteilung kann erreicht werden, wenn das das Lyophilisat in einen Autoklaven als
Formgebungsvorrichtung eingebracht wird, in dem Autoklaven oberhalb der Glasübergangstemperatur des biologisch abbaubaren Polymers und unterhalb der Zersetzungstemperatur des Knochenwachstumsfaktors einer Druckbegasung mit überkritischem Kohlendioxid unterworfen wird, anschließend der Autoklav druckentlastet wird und das erhaltene schaumförmige Produkt aus dem Autoklaven entnommen wird.
Das so erhaltene schaumförmige Produkt, das auch weiter in die gewünschte Applikationsform geformt werden kann, zeichnet sich durch eine lang andauernde Freisetzung unter Erhalt der biologischen Aktivität aus, die im Stand der Technik nicht bekannt ist.
Die die gewünschte Applikationsform umfasst wie oben ein chirurgisches Befestigungsmittel wie Faden, Stift, Nagel, Schraube oder Niete, eine Platte oder Membran, oder die Verwendung als Beschichtungsmittel für metallische oder keramische Implantate, auf die die das schaumförmige Produkt aufgeschmolzen wedren kann.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Produkt mit einer Polymermatrix, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie daraus hergestellte Applikationsformen wie ein chirurgisches Befestigungsmittel wie Faden, Stift, Nagel, Schraube oder Niete, eine Platte oder Membran, sowie die Verwendung zur Beschichtung auf Implantaten und die so beschichteten Implantate.
Herstellungsbeispiel
Erfindungsgemäß wird als ein Ausführungsbeispiel das Polylactid-Calcium Carbonat-Komposit (pH-Stabilisierung) aus 2 g PoIy (D, L-Lactid) (200-500 μm PDLLA, Resomer R 207 oder R 208, Boehringer Ingelheim) in 100 ml Chloroform gelöst, mit CaCO3 (Merck, p.a.) im Verhältnis (w:w = 80:20) nach Vorschrift dispergiert, in 300 ml Ethanol ausgefällt, getrocknet und zu einem Pulver mit einer Korngröße von 200- 400 μm mechanisch zermahlen (= PDLLA-CaCO3 Granulat) .
Dann kann die Herstellung des PDLLA-CaCO3-BMP-2 Komposits wie folgt erfolgen: 1 g PDLLA-CaCO3 Granulat wird in 1.6 ml BMP-2 Lösung (125 μg/ml in ungepufferter 15 mM Sucrose, wobei die BMP-2 Konzentration bis 2 mg/ml in ungepufferter 15 mM Sucrose oder in bei pH 4.5 bzw. pH 10.0 gepufferter 15 mM Sucrose betragen kann, aufgenommen und in einem Potter- Homogenisator mit Teflonpistil manuell mit Drehbewegungen homogenisiert. Während des Homogenisierungsvorganges wurde das Material wieder trocken, so dass am Ende der Homogenisierung wiederum ein Pulver vorlag. Dieses Pulver wurde entweder direkt oder nach Lyophilisierung zu aufgeschäumten Tabletten in einem Begasungsverfahren weiterverarbeitet. Dabei wird das PDLLA-CaCO3-BMP-2 Pulvergemisch in einer Teflonhohlform (10 x 5 x 2 mm Öffnungen) einer Druckbegasung mit überkritischem CO2 (100 bar) in einem Autoklaven bei einer Temperatur von ca. 35-55 0C unterworfen. Die Glasübergangstemperatur des PDLLA liegt bei einem Druck von 100 bar bei < -50 0C , d.h. bei 100 0C oberhalb der Glasübergangstemperatur ist das Polylactid thermoplastisch/flüssig und löst das BMP-2. Das PDLLA-CaCO3- BMP-2 Pulvergemisch wird ca. 2 Stunden bei diesen Bedingungen gehalten (Haltezeit) . Innerhalb von 20 Minuten werden dann die Temperatur auf Zimmertemperatur und der Druck auf Umgebungsdruck gesenkt (Dekompression) . Unter diesen Bedingungen wird eine bestimmte "Porosität", die durch schnellere Dekompression erhöht werden kann, erhalten. Das BMP-2 muss also unter diesen Bedingungen einen Druck von 100 bar und eine Temperatur von 55 0C aushalten, um biologisch aktiv zu bleiben.
Seitens der Erfinder wurde erstmals 125I-markiertes rhBMP-2 eingesetzt, um die einzelnen Schritte der Herstellung und die Eigenschaften aufgeschäumter BMP-2-beladener
Polylaktid-Tabletten exakt verfolgen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass beispielsweise der
Knochenwachstumsfaktor rhBMP-2 in Mengen bis zu 3.4 mg/g Polylaktid inkorporiert werden kann und daß dieses rhBMP-2 mit einer Geschwindigkeitskonstante von 1.6 x 10~3 [d] d.h. mit einer Halbwertszeit von ~ 400 Tagen freigesetzt wird. Dabei ist das freigesetzte rhBMP-2 sowohl in vitro als auch in vivo aktiv. Aktivitätsmessungen
Rekombinantes humanes "bone morphogenetic protein" (rhBMP- 2) wurde in E. coli nach bisher beschriebenen Methoden mit einem Reinheitsgrad von > 95% von den Erfindern hergestellt. Die biologische Aktivität des so erhaltenen rhBMP-2 kann mit Hilfe einer Zellkultur (MC3T3-E1 Zellern) bestimmt werden.
Die radioaktive Markierung von rhBMP-2 erfolgte nach der Chloramin-T Methode (125I-rhBMP-2 ) , wie für das Protein Ubiquitin im Stand der Technik beschrieben wurde. Die biologische Aktivität des 125I-rhBMP-2 bleibt bei dieser Methode voll erhalten.
Die Beladung des biologisch abbaubaren Polymers konnte wie oben erwähnt anhand von PDLLA gezeigt werden. PDLLA (PoIy (D, L-Laktid) Resomer 207 und Resomer 208 (mit einem geringfügig unterschiedlichen Polymerisationsgrad) wurde käuflich erworben und in Chloroform aufgelöst. Ein pH- Stabilisierungsmittel wie CaCC>3 kann zur pH-Stabilisierung während der Hydrolyse im Organismus zugesetzt werden. Das PDLLA/CaCC>3-Gemisch kann mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol gefällt, dann getrocknet, zu einem feinen Pulver gemahlen und gesiebt (Korngröße ~ 200 μm) werden sowie mit einem Wachstumsfaktor wie rhBMP-2 in einer wässrigen Lösung gemischt werden. Das so erhaltene
Kompositmaterial kann dann mit überkritischem CO2 nach der
Methode von Tschakaloff et al. in rechteckigen Tabletten
(10 x 5 x 2 mm, ~35 mg/Tablette) in einem Autoklaven aufgeschäumt werden.
Für Tierversuche wurden runde Tabletten mit Durchmesser von 5 mm und einer Höhe von 2 mm verwendet (~20 mg/Tablette) . Die jeweilige Beladung und die Beladungsausbeute wurden mit Hilfe des 125I-rhBMP-2 (siehe oben) bestimmt. Die Dichte der aufgeschäumten Tabletten betrug etwa 0.5 g/cm3.
Freisetzung von rhBMP-2
Zur Messung der Freisetzungskinetiken wurden aufgeschäumte 125I-rhBMP-2 haltige Tabletten in 1.5 ml PBS Puffer (Phosphate Buffered Saline: 137 mM NaCl, 8.1 πiM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.4) in kleinen Reagensröhrchen aufgenommen und unter multiplen Wechseln mit 1.5 ml PBS zur ständigen Durchmischung auf einem rotierenden Rad bei Zimmertemperatur für 107 Tage inkubiert. Zu bestimmten Zeiten (Pufferwechsel) wurden die Tabletten aus den Reagensröhrchen herausgenommen, zweimal in frischem PBS (1.5 ml) gewaschen, in neue Eppendorfgefäße mit frischem PBS-Puffer überführt und dann im Gammazähler (Wizard TM3, Wallac, Finnland) gemessen. Die berechneten Halbwertszeiten wurden entsprechend dem spontanen Zerfall des 125I (t1/2= 60 d) korrigiert.
Biologische Aktivitätsmessungen
Die biologische Aktivität des löslichen rhBMP-2 wurde durch Aufnahme der Dosiswirkungskurve (Induktion der alkalischen Phosphatase) mit MC3T3-E1 Zellen gemessen.
Die biologische Aktivität wird als
Halbaktivierungskonstante (K05) angegeben, wobei die Normwerte für die Konstante bei 3-20 nM sowohl für vom Erfinder hergestelltes als auch für das kommerziell erhältliche rhBMP-2 (InductOs, Wyeth) liegen.
Tierversuche rhBMP-2 haltige (0.8 - 3.4 mg/g PDLLA, Resomer 207) Tabletten (5 mm Durchmesser x 2 mm Höhe) wurden in einem kritischen Defektheilungsmodell (Schafsrippe ) in 5 mm Durchmesser Bohrungen unter Einhaltung der Tierschutzbestimmungen eingesetzt.. Präparateherstellung
Die Gewebeproben wurden unmittelbar nach der Entnahme vorsichtig vom Weichteilmantel befreit und zur Primärfixierung in phosphatgepufferte Formaldehydlösung (4,5%) eingebracht. Entsprechend einer modifizierten histologischen Technik zur Herstellung unentkalkter Dünnschliffpräparate nach Prof. Donath wurden die Gewebeproben nach Primärfixierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Zum Erhalt der PDLLA-Anteile wurden die Proben anschließend in Technovit 7200 VLC eingebettet. Nach Lichtpolymerisation des Einbettungsmaterials wurden von jeder Probe 2 Dünnschliffe mit einer Dicke von 20 μm hergestellt. Zur Oberflächenfärbung der fertig bearbeiteten Schliffpräparate wurde eine l%ige Thioninlösung verwendet.
Histomorphometrie
Die histomorphometrische Auswertung erfolgte mittels eines semiautomatischen, an ein Durchlichtmikroskop (Eclipse 800, Nikon Corp., Tokyo, Japan) gekoppelten Bildanalyseprogramms (Lucia 32g/4.51, Laboratory Imaging Ltd., Prag, Tschechische Republik) bei einer 4-fachen Originalvergrößerung. Hierzu wurden standardisierte Messrahmen zentrisch über den Defektbereich mit den darin enthaltenen PDLLA Tabletten positioniert und die
Flächenanteile für neugebildetes Knochengewebe
(mineralisiert und unmineralisiert) und Leerraum erhoben sowie aus diesen Werten der Anteil an verbliebenem PDLLA berechnet .
Aufbau einer Isotopenmethode zur Messung der Beladung Um die Einbringung von rhBMP-2 in PDLLA oder auch PLGA Tabletten möglichst eindeutig, fehlerfrei und mit höchster Empfindlichkeit quantifizieren zu können, wurde die Isotopenmethode der Radioiodierung von rhBMP-2 zum 125I- rhBMP-2 gewählt. Wie oben beschrieben, wurde das PDLLA-Pulver mit rhBMP-2 gemischt und dann in der Hochdruckbegasungsanlage aufgeschäumt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Tabelle 1 -Beladung von PDLLA-Tabletten mit 125I-rhBMP-2 1 )
Figure imgf000012_0001
1> Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung, n in Klammern (siehe auch: Lange, M., Sänger, T., Chatzinikolaidou , M., Laub, M., Jennissen, H. P. (2008) "rhBMP-2 composite of foamed PoIy- (D,L-) lactide as drug delivery system for bone tissue engineering" Abstract Commun. 8th World Congress on Biomaterials , May 28-June 1, 2008, Amsterdam, NL) .
Wie aus der Tabelle 1 hervorgeht, konnten Beladungen von 0.34-1.0 mg 125I-rhBMP-2 pro g Tablette in guten Ausbeuten erhalten werden. Die Versuche zeigen, daß hier eine effektive Methode zur Beladung der Tabletten entwickelt wurde .
Freisetzungsversuche Die wie in der Tabelle 1 hergestellten Tabletten konnten auf Grund der radioaktiven Markierung des rhBMP-2 sogleich für die Freisetzungsversuche verwendet werden. Wie der Erfinder feststellte, führt die Inkubation von 125I-rhBMP-2/PDLLA Tabletten in PBS-Puffer pH 7.4 zu einer langsamen Freisetzung des 125I-rhBMP-2 über einen Zeitraum von 107 Tagen. Die nichtlineare Anpassung an eine zweiphasige Exponentialfunktion führte zu einer guten Anpassung, so daß die Geschwindigkeitskonstanten und die Halbwertszeiten leicht ermittelt werden konnten. Für den Zeitverlauf ergab sich eine Freisetzung in zwei Phasen, einer initialen sog. Burst-Phase innerhalb der ersten 1-3 Tage mit einer Halbwertszeit von tM ~ 0.3-0.5 d und einer zweiten langsamen, prolongierten, monoexponentiellen Hauptphase für den Rest der Beobachtungszeit mit einer Halbwertszeit von XM. ~ 400-469 d. Aus den langen Halbwertszeiten der zweiten und damit Hauptphase bietet sich der Schluß an, daß es keine Poren für die Freisetzung des 125I-rhBMP-2 im aufgeschäumten PDLLA gibt, sondern, daß die Freisetzung erst mit der Hydrolyse bzw. Dekomposition des PDLLA beginnt. Somit ist auch eine Bindung des 125I-rhBMP-2 an der Oberfläche der Tablette in größeren Mengen, außer im Falle der Burst-Phase, unwahrscheinlich. Eine Zusammenfassung der kinetischen und statistischen Daten befindet sich in der nachfolgenden Tabelle. Die Geschwindigkeitskonstanten für die Freisetzung des 125I-rh- BMP-2 der drei unterschiedlich beladenen PDLLA-Tabletten liegen zwischen kb-i = 1.5-1.7 x 10"3 [d"1] oder (kb-i - 2.0
Figure imgf000013_0001
Tabelle 2
Figure imgf000013_0002
'Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler, n = 20. Die Halbwertszeiten wurden entsprechend dem spontanen Zerfall von 125I (ti/2= 60 d) korrigiert. Die calcithaltigen Tabletten hatten ein Gewicht von 35 mg.
-' Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung, n in Klammern (siehe auch: Lange, M., Sänger, T.,
Chatzinikolaidou, M., Laub, M., Jennissen, H. P. (2008) "rhBMP-2 composite of foamed PoIy- (D, L-) lactide as drug delivery System for bone tissue engineering" Abstract Commun. 8th World Congress on Biomaterials, May 28-June 1, 2008, Amsterdam, NL) .
Wie in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt, wurden die absoluten Mengen an freigesetztem 125I-rh-BMP-2 (initiale Beladung 1.0 + 0.145 mg/g) für verschiedene Zeiträume berechnet. In 107 Tagen wurde insgesamt 230 μg 125I-rh-BMP- 2/g PDLLA d.h. (23% der Gesamtmenge) freigesetzt. In der Burst-Phase waren es innerhalb eines Tages 93 μg/g. Wie in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt, ist somit eine dreimonatige konstante und sehr effektive Stimulierung des Knochenwachstums möglich.
Tabelle 3
Freigesetzte absolute Mengen an 125I-rhBMP-2 aus 10 mit 1.0 mg/g beladenen Tabletten über einen Zeitraum von 107
Figure imgf000014_0001
3 ) Die f reige set zten Mengen an 125 I -rhBMP-2 wurden an Hand der Daten in und Tab . 2 berechnet . Interessanterweise wurde über einen sehr langen Zeitraum von 93 Tagen eine konstante Freisetzungsgeschwindigkeit von 0.8-1.2 μg/Tag x g erhalten. Berechnet man nun für eine durchschnittliche Freisetzungsrate von 1.0 μg/Tag x g die Konzenteration des freigesetzten rhBMP-2 aus einer 20 mg Tablette (= 20 ng/Tag) in einem Knochendefekt (0 = 5mm x 2 mm Tiefe) des Volumens von ~40 μl, so erhält man den Wert ~20 nM, was eine fast maximale Stimulierung der MC3T3-T3 Zellen in vitro bedeutet.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Tabletten (10 x 5 x 2 mm) besaßen ein Gewicht von 40-60 mg/Tablette und enthielten 20- 80 μg BMP-2/Tablette. Die Struktur des aufgeschäumten PDLLA ist schwammmatrixartig, und die biologische Aktivität des Knochenwachstumsfaktors wird nahezu unverändert beibehalten.
Nachweis der biologischen Aktivität von rhBMP-2/PDLLA- Tabletten im Tierversuch.
Wie oben erwähnt, wurden seitens der Erfinder Tierversuche in der Schafsrippe durchgeführt. In den Rippen wurden
Lochdefekte (0 = 5 mm x 2 mm Tiefe) gesetzt in die paßgenau mit BMP-2 beladene PDLLA-Tabletten gleicher Größe
(20 mg) eingefügt wurden. Nach 8 Wochen Liegezeit wurden die Schafe getötet und die Rippen entfernt. Die histomorphometrische Auswertung der mit Thioninlösung angefärbten Dünnschliffpräparate erfolgte mittels eines semiautomatischen, an ein Durchlichtmikroskop (Eclipse
800, Nikon) gekoppelten Bildanalyseprogramms (Lucia
32g/4.51, Laboratory Imaging Ltd.) bei einer 4-fachen Originalvergrößerung. Es wurden die Flächenanteile für neugebildetes Knochengewebe (mineralisiert und unmineralisiert ) und der Leerraum bestimmt. Als deutlichen
Unterschied erkennt man auf den Leerpräparaten (ohne rhBMP-2) nur spärliche punktuelle Areale mit Knocheneubildung, und diese liegen vorzugsweise in der Peripherie der Präparate am Übergang zum ortsständigen Knochen der Defekte oder unmittelbar subperiostal. Im Gegensatz dazu stellt sich die Knochenneubildung in den rh-BMP2 Präparaten deutlich umfangreicher dar. Die multiplen Areale mit Knochenneubildung sind zudem diffus über den gesamten Querschnitt der PDLLA-Tablette verteilt und nicht nur peripher gruppiert. Einhergehend mit einer signifikant stärker ausgeprägten Knochenneubildung findet sich auch ein erhöhter Abbau des PDLLA-Materials mit deutlich zahlreicheren Resorptionsstellen.
Eine quantitative Auswertung der Tierversuche ist in Tab. 4 zusammengefaßt. Es wurden zwei Arten von Kontrollen durchgeführt: Kontrolle 1 in einer Rippe, wo nur Implantate ohne rhBMP-2 eingesetzt waren und Kontrolle 2, bei denen BMP-2 haltige Implantate in der gleichen Rippe vorhanden waren. Wie Tab. 4 zu entnehmen ist, liegen die Kontrollen 2 immer über den Kontrollen 1, was bedeutet, daß das rhBMP-2 in Nachbarschaft zu den Kontrollen 2 bereits zu einer deutlichen Erhöhung des Knochenwachstums in den Präparaten führt. Die Kontrollen 2 wurden daher von den Erfindern nicht als echte Kontrollen anerkannt. Vergleicht man nun die rhBMP-2 haltigen Tabletten (0.8-3.4 mg/g) mit der Kontrolle 1, so findet man eine signifikante Erhöhung des prozentualen Anteils des neugebildeten Knochens (p < 0.05, im ungepaarten, zweiseitigen t-Test) . Bei einem Gehalt von 3.4 mg/g war der Anteil neugebildeten Knochens sogar signifikant größer als die Kontrolle 2. Die Inkorporation von rhBMP-2 in aufgeschäumte PDLLA Tabletten führt daher zu einer starken Stimulierung des Knochenwachstums und zu einem Ersatz des PDLLA durch Knochen im Rippenmodell des Schafes nach 8 Wochen. Tabe lle 4
De novo Knochenbildung (Morphometrie) in einem "Critical
Size Defect" in Schafsrippen 8 Wochen nach Implantation
Figure imgf000017_0001
3)Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen n = 3. Signifikanz ist gegeben bei P < 0.05. Es handelt sich um Tabletten mit einem Durchmesser von 5 mm und 2 mm Dicke. Das Gewicht betrug 20 mg (siehe auch Lange, M., Spassova, E., Laub, M., Schopper, C; Sänger, T., Stoev, V., Ewers, R., Jennissen, H. P. (2008) "Critical Size Rib Defects in Sheep as a New Model for Testing rhBMP-2 Osteoinductivity of rhBMP-2/PDLLA" Abstract Commun . 8th World Congress on Biomaterials, May 28-June 1, 2008, Amsterdam, NL) .
Aufgrund der Messergebnisse wird bestätigt, dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Polylactidkomposit um ein Material, das eine Polylactidmatrix (mechanisch stabiles Implantat oder Platzhalter, Knochenersatzmaterial), CaCC>3 zur Abpufferung der bei der Hydrolyse entstehenden Milchsäure und BMP-2 zur Osteoinduktion enthält, handelt, das hervorragend zur SWteigerung des Knochenwachstums eingesetzt werden kann.
Die erfindungsgemäße Matrix mit Knochenwachstumsfaktor kann dabei in folgenden Formen vorteilhaft verwendet werden: •Stifte, Nägel, Schrauben •Platten, Membranen
•Beschichtung auf Metallimplantaten, die auch mittels lokaler thermischer Behandlung am
Applikationsort im Patienten in ihrer Wirksamkeit gesteigert werden können. In allen Fällen mit oder ohne lokale thermische Behandlung am Applikationsort übersteht beispielhaft BMP-2 Temperaturen ohne Denaturierung bis 100 0C.
Die so hergestellten Formkörper können somit mit Hilfe eines Sonic-Welding-Verfahrens bei Implantation in das Gewebe mit diesem verschmolzen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit Polymermatrix, das die folgenden Schritte umfasst: a. Mischen eines pulverförmigen biologisch abbaubaren Polymers mit einer wässrigen Lösung eines Wachstumsfaktors, Cytostatikum, Antibiotikum oder Mischungen davon zu einer Schlämme in einer Menge, dass die wässrige Lösung nahezu vollständig von dem pulverförmigen Polymer aufgesaugt wird; b. Trocknen der in Schritt a) erhaltenen Schlämme; c.Einbringen des Produktes aus Schritt b) in eine Formgebungsvorrichtung; und d. Formen des in die Formgebungsvorrichtung eingebrachten Produktes in eine Applikationsform zur Förderung des Zellwachstums .
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man ein pulverförmiges biologisch abbaubares Polymer mit einer Teilchengröße bis 500 μm verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man als biologisch abbaubares Polymer Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder deren Copolymere einsetzt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das pulverförmige biologisch abbaubare Polymer zusätzlich ein pH-Stabilisierungsmittel enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem auf ein Gramm des Polymers 1 bis 3,5, vorzugsweise 1,5 bis 2,5 Milliliter der wässrigen Lösung eingesetzt werden .
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man eine wässrige Lösung eines Knochenwachstumsfaktors der BMP-Klasse, insbesondere BMP-2, in einer Konzentration in der wässrigen Lösung einsetzt, die 0,5 mg bis 10 mg Knochenwachstumsfaktor pro Gramm an biologisch abbaubarem Polymer im Produkt entspricht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man eine wässrige Lösung des Knochenwachstumsfaktors der BMP-Klasse mit einem pH-Wert von 4 bis 5, oder mit einem pH-Wert von 9,5 bis 10,5 verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die in Schritt a) erhaltene Schlämme lyophilisiert wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die getrocknete Schlämme in einen Extruder als Formgebungsvorrichtung eingebracht und mittels des Extruders bei einer Temperatur oberhalb der
Glasübergangstemperatur des biologisch abbaubaren Polymers und unterhalb der Denaturierungstemperatur des Knochenwachstumsfaktors zu einem Formkörper extrudiert wird .
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die getrocknete Schlämme in einen Autoklaven als Formgebungsvorrichtung eingebracht wird, in dem Autoklaven oberhalb der Glasübergangstemperatur des biologisch abbaubaren Polymers und unterhalb der
Zersetzungstemperatur des Knochenwachstumsfaktors einer Druckbegasung mit überkritischem Kohlendioxid unterworfen wird, anschließend der Autoklav druckentlastet wird und das erhaltene schaumförmige Produkt aus dem Autoklaven entnommen wird.
11. Formkörper, erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 9.
12. Schaumförmiges Produkt, erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 10.
13. Verwendung des Produktes nach Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung a. eines chirurgischen Befestigungsmittels wie Faden, Stift, Nagel, Schraube oder Niete, b. einer Platte oder Membran, oder c. zur Beschichtung von Implantaten.
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