WO2008068359A2 - Método para producir anticuerpos mediante inmunización con haptenos unidos a partículas de óxidos metálicos - Google Patents

Método para producir anticuerpos mediante inmunización con haptenos unidos a partículas de óxidos metálicos Download PDF

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WO2008068359A2
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Eva María BRUN SÁNCHEZ
Marta GARCES GARCÍA
Ángel MAQUIEIRA CÁTALA
Rosa Puchades Pla
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Universidad Politechnica De Valencia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Definitions

  • the present invention belongs to the field of antibody production, specifically it refers to a method for producing antibodies against low molecular weight molecules, which are not very immunogenic in themselves, as well as a polyclonal serum against said molecules or monoclonal antibodies obtainable by Said method
  • Immunoassays are methodologies widely used in the clinical, biotechnological, food and environmental fields, for the specific detection of a substance.
  • the wide diffusion of these techniques is based, fundamentally, on the specificity of the antibodies and the possibility of developing them against any substance, aggregate, virus, cell, etc.
  • Immunization methods are well established and, in general, it is relatively easy to obtain specific antibodies against immunogenic substances (eg proteins) which are, in general, those with high molecular mass.
  • immunogenic substances eg proteins
  • substances neutral molecules, ions, etc.
  • molecular mass less than 5000 D such as amino acids, pesticides, peptides, etc.
  • carrier molecules or carriers such as amino acids, pesticides, peptides, etc.
  • the traditional immunization procedure consists of covalently binding these small molecules (haptens) to proteins such as bovine serum albumin, mollusk hemocyanin Megathura crenulata, thyroglobulin, etc.
  • the immunogens used are not easy to characterize since, when using Carrier proteins of high molecular weight, the ratio ca / r / er / hapten cannot be determined exactly;
  • the effectiveness of immunization is variable, obtaining heterogeneous results that are difficult to reproduce and systematize. This is mainly due to the variability of the immunogens and the difficulty of limiting the immune response of the host animal.
  • the sera obtained by this route contain antibodies against the carrier protein, which broadens the response spectrum of the sera, increasing nonspecific interference. All this becomes more acute as the molecular size decreases. Consequently, this methodology must be improved, so that immunogens are available for haptens, perfectly characterized, with a homogeneous response, without interference of the carrier molecule, prepared and purified in a simple and reproducible way. For this, it would be necessary, that is, a method should be available in which the carrier was as inert as possible, although capable of activating the immune response. On the other hand, the method of anchoring the hapten to the carriage should be quantitative and reproducible, allowing the hapten / carriage molar ratio to be easily established.
  • the authors of the present invention have developed a new method for producing highly specific antibodies against low molecular weight substances, such as drugs, pesticides, vitamins, peptides, etc., without the need to use a protein or similar substance as a carrier agent, and No need for adjuvants.
  • the method also allows controlling each of the stages of preparation of the immunogens, which ensures the reproducibility of the procedure.
  • the hapten is bound to metal oxide particles of stoichiometry E x O and , being E a chemical element whose oxides are solid and with a particle size on the scale of nm to ⁇ m - preferably-, being x and the stoichiometric coefficients of each element.
  • E a chemical element whose oxides are solid and with a particle size on the scale of nm to ⁇ m - preferably-, being x and the stoichiometric coefficients of each element.
  • Previously these particles have been silanized by providing them with an amino, epoxide, thiol or isocyanate functional group.
  • An antecedent of the present invention is the method for the production of antibodies by immunization with colloidal gold particles, bound to haptens (amino acids) by ionic interactions and Van der Waals forces described in EP0232717.
  • This patent uses a different route in terms of the carriage used (gold) and immobilization mode (electrostatic) of the haptens.
  • Aluminum oxide is known as an adjuvant in the preparation of vaccines for humans.
  • this substance is used as an adjuvant to increase the antigenicity of a tumor antigen and a bee toxin.
  • this oxide has been covalently bound to polymeric proteins or peptides in order to produce vaccines in which the antigens maintain their original conformation, as Frey ei a / 3 has described, for example.
  • GB-A-981242 discloses a method to increase the antigenicity of vaccines containing antigenic material or of microbial origin, by the addition of rare earth salts such as lanthanum or cerium.
  • Figure 1 represents the maximum absorbance means ( ⁇ 490 nm) of the sera obtained after the immunization of mice with atrazine, biotin and sulfasalazine haptens linked to KLH, aluminum oxide and europium particles, or particles aprotinin-bound, with and without Freund's adjuvant.
  • Figure 2 Represents competition curves for atrazine using sera obtained by immunization with AT-particles without adjuvant, AT-particles with adjuvant and KLH-AT with adjuvant.
  • the first object of the present application is a method for producing specific antibodies against a substance of low molecular weight (hapten) comprising: a) derivatization of particles of a metal oxide; b) conjugation of hapten to metal oxide particles derivatized in a); c) immunization of an animal with the metal oxide / hapten conjugate.
  • the first step of derivatization of the metal oxide particles seeks to functionalize the particles with reactive groups such as, for example, amino, epoxide, thiol or isocyanate groups, whose task is to facilitate the subsequent conjugation between the particles of the metal oxide and the hapten against which It aims to produce specific antibodies.
  • reactive groups such as, for example, amino, epoxide, thiol or isocyanate groups
  • derivatization is preferably a silanization.
  • Said silanization is preferably carried out by the reaction of the metal oxide particles with silanes selected from (3- aminopropyl) triethoxysilane, (3-aminopropyl) t ⁇ methoxysilane, 3 [2- (2-aminoethylamino) ethylaminojpropyltrimethoxysilane, 3- (2- aminoethylamino) -propyldimethoxymethylsilane, [3- (2-aminoethylamine) propyl] trimethoxysilane, 3-aminopropyldimethylmethoxysilane, 3- aminopropyl (diethoxy) methylsilane, ⁇ / - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenedyloxyethoxymethyl (3- , (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane or (3- isocyan
  • Derivatized particles may be of any metal oxide, although rare earth oxide particles such as samarium oxide or terbium oxide are preferred, although aluminum oxide particles and europium oxide particles are even more preferred.
  • the particles should preferably have a size in the order of nm to ⁇ m.
  • the method of the invention allows to obtain antibodies against haptens of low molecular weight that is neutral molecules, ions, amino acid, peptides, pesticides, antibiotics etc. whose molecular weights are below 5000 Da.
  • the hapten is atrazine, biotin or sulfasalazine.
  • the method of the invention allows obtaining both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • the Ia is first carried out immunization of mice or rabbits according to conventional immunization protocols 2 .
  • Polyclonal sera are obtained by bleeding the animal and subsequent separation of the serum by centrifugation.
  • the monoclonal antibodies are obtained by isolating B cell clones from the spleen of mice immunized with the metal oxide / hapten.
  • an object of the invention is also a polyclonal serum obtainable according to the described method, just as it is a monoclonal antibody obtainable by said method.
  • hapten Oxide particles bound to a low molecular mass protein (aprotinin), in turn conjugated to hapten - Aprotinin bound to hapten
  • Example 1 particle derivatization of metal oxide
  • the reaction mixture was then cooled in a 0 0 C bath.
  • the suspension was centrifuged at 1500xg at 4 0 C for 10 minutes, discarding the supernatant.
  • the particles were subsequently washed by resuspension in 25 mL of deionized water, vortexing and centrifugation at 9500xg for 15 minutes, removing the supernatant. After seven washes, the particles were dried in an oven at 140 0 C and pulverized in a mortar. Yield: 4.75g,
  • 3.5 g of activated nanoparticles were weighed and mixed with 5 mL of a silanizing agent such as (3-aminopropyl) trimethoxysilane, (3- aminopropyl) triethoxysilane, 3 [2- (2-amyloxyethylamino) ethylamino] propyltrimethoxysilane or other similar, dissolved in 40 mL of anhydrous toluene.
  • the reaction mixture was refluxed under an argon atmosphere for 24 hours at 135 0 C. Once cold, the suspension was centrifuged at 200xg for 5 minutes, and the supernatant was discarded.
  • the particles were washed 5 times by resuspension in toluene (40 mL), centrifugation at 5000xg for 5 minutes and solvent removal. The particles were then washed three times with 40 mL of acetone, following the procedure described, centrifuging at 5000xg for 20 minutes. They were dried at room temperature, using vacuum, until constant weight. Subsequently, the particles were pulverized in a mortar and stored in a topaz jar in a desiccator. Yield: 3.38 g, 97%, amination percentage: 2%.
  • the particles of europium oxide were silanized, although in this case the previous step of surface activation described in example 1.1 was not necessary.
  • the amount of free amino groups resulting from the silanization of the particles was determined by elementary analysis.
  • the efficiency of silanization can be varied depending on the reaction time and the stoichiometric oxide / silane ratio used; in this way, it is possible to obtain nanoparticles with more or less number of free amino groups, as appropriate to anchor more or less hapten.
  • derivatization is achieved as amino, epoxide, thiol or isocyanate, by reaction with silanes such as ⁇ / - [3-
  • Example 2 Preparation of immunogens
  • the derivatized nanoparticles were conjugated to different haptens such as atrazine, biotin and antibiotics to produce antibodies.
  • haptens must contain functional groups (eg -COOH) covalently linkable to the particles, either directly or using cross-linkers or other synthesis reactions well known to specialists 4 .
  • Aprotinin-hapten conjugates were also linked to compare their immunogenicity with that of the hapten particles, in the absence of protein.
  • KLH-hapten and aprotinin-hapten conjugates were used as control immunogens. The following examples indicate the procedure used to perform the conjugations.
  • Example 2.1 Conjugation of aluminum oxide particles v europium to sulfasalazine v atrazine and biotin haptens
  • Example 2.2 Conjugation of KLH to sulfasalazine and atrazine and biotin haptens
  • Example 2.3 Conjugation of aprotinin to sulfasazine or an atrazine or biotin hapten
  • Sulfasalazine and atrazine and biotin haptens were also covalently bound to aprotinin following the method described by Erlanger 6 .
  • the hapten / protein molar ratio was determined by Maldi-TOF-MS, giving a value of 5: 1 in all cases.
  • Example 2.4 Conjugation of amine aluminum or europium oxide particles to aprotinin-hapten conjugates.
  • aprotinin-hapten conjugates obtained in Example 2.3, 5 mg of a carbodiimide, such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide or 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide, were added. After homogenization, 50 mg of amine aluminum or europium oxide particles were added. The mixture was allowed to react for 3 hours by vortexing. It was subsequently centrifuged at 9000 rpm and the supernatant removed. The solid was then washed repeatedly (six times) by resuspension in 1 mL of deionized water, centrifugation and removal of the supernatant. Finally, the particles were suspended in 1 mL of PBS (10 mM phosphate buffer, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4) and stored at -2O 0 C.
  • PBS 10 mM phosphate buffer, 137 m
  • Example 3 Immunization Immunogens prepared according to Example 2 were resuspended in PBS.
  • the particle suspensions were dispersed by sonication in an ultrasonic bath prior to immunization.
  • Each antigen was inoculated into two groups (with and without Freund's adjuvant) of female BALB / c mice (H-2 d ).
  • the doses contained 100 ⁇ g of antigen in 200 ⁇ L of PBS.
  • the dose of the adjuvant groups contained the same amount of antigen in 100 ⁇ L of PBS, plus
  • Immunizations were carried out by intraperitoneal injection of the antigen in four doses, at intervals of two weeks. Bleeds were performed two days after each immunization. Finally, the animals were sacrificed two days after the last dose; The blood was extracted by cardiac puncture, separating the serum by centrifugation.
  • the sera obtained were characterized by titration and competition tests.
  • the avidity of the sera against upholstery antigens was determined by indirect non-competitive ELISA, measuring the binding of each serum (serial dilutions from 1/500 to 1/32000) to each conjugate at different concentrations (from 1 to 0.001 mg / L).
  • polystyrene ELISA plates were coated with solutions of OVA-hapten conjugates in carbonate buffer (50 mM carbonate bicarbonate, pH 9.6), 100 ⁇ L / well. Plates, sealed, incubated at 4 0 C for 16 hours. The next day, they were washed 6 times with PBS-T buffer (PBS containing 0.05% Tween 20).
  • the enzymatic reaction was stopped by adding H 2 SO 4 (50 ⁇ L / well), and the absorbance read at two wavelengths, 490 and 650 nm, in a plate reader.
  • concentrations of the upholstery conjugates and the dilution of the sera used in the competition tests were chosen to produce approximate absorbance values of 1.0 unit in the absence of analyte.
  • Tables 1 and 2 show the results of the titration of the sera obtained after immunization with aprotinin-AT, KLH-AT, particles-AT and particles-aprotinin-AT.
  • Tables 1 and 2 show the maximum absorbance ( ⁇ 490 nm) of each serum diluted 1/1000, using OVA-AT upholstery conjugate at a concentration of 1 ⁇ g / mL. These values (to which the absorption of the target has been subtracted) reveal a high recognition of the upholstery antigen by the majority of the sera obtained.
  • the highest titles were obtained using as a carrier a protein, either KLH or aprotinin.
  • Table 3 shows, comparatively, the titration results obtained with and without adjuvant, for the immunogens particles-AT and particles-aprotinin-AT. In both cases the results are similar, with considerable dispersion observed among the immunized animals.
  • Figure 1 shows the maximum absorbance means ( ⁇ 490 nm) of the sera obtained with particles of aluminum oxide and europium, with and without adjuvant (diluted 1/1000) using as OVA-hapten upholstery conjugates for the different systems, at a concentration of 1 ⁇ g / mL.
  • the titration values show recognition of the upholstered antigen by the sera obtained, which demonstrates the production of antibodies with all the conjugates used. Only in the case of europium particles bound to the atrazine hapten did a final mean titer of less than 0.5 absorbance units be obtained; however, the use of Freund's adjuvant makes it possible to use these particles as a immunization carrier.
  • the method of the present invention has several advantages over obtaining immunogens with proteins.
  • metal oxide particles are very cheap.
  • they are chemically very stable, they stored in normal conditions without requiring refrigeration etc. and they can be derivatized with different functional groups in a reproducible manner, which makes it possible to obtain hapten particles with a controlled hapten / ca / r / er molar ratio and easy to determine by elementary analysis.
  • These conjugations can be carried out using high proportions of organic solvents, which is a great advantage with highly apolar haptens.
  • the purification of these conjugates is quick and simple, avoiding dialysis, molecular exclusion or other similar methodologies.
  • the immunization with this type of conjugates avoids the use of proteins and, consequently, the production of antibodies against them, improving the specificity of the serum.
  • Another advantage of the aluminum oxide particles is that it is not necessary to additionally administer an adjuvant together with the immunogen, since they act as such.
  • the particles-hapten conjugates developed have allowed to produce specific antibodies against substances of low molecular weight without the use of proteins as a carrier, or of adjuvants in the immunization in the case of aluminum oxide.
  • the sera thus obtained have provided immunoassays of sensitivity comparable to those achieved by traditional immunization, which demonstrates the potential of this methodology.

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Abstract

La presente invención pertenece al campo de Ia producción de anticuerpos, concretamente se refiere a un método para producir anticuerpos frente a moléculas de bajo peso molecular, poco inmunogénicas por si mismas, así como a un suero policlonal frente dichas moléculas o a anticuerpos monoclonales obtenibles por dicho método.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR ANTICUERPOS MEDIANTE INMUNIZACIÓN CON HAPTENOS UNIDOS A PARTÍCULAS DE ÓXIDOS METÁLICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de Ia producción de anticuerpos, concretamente se refiere a un método para producir anticuerpos frente a moléculas de bajo peso molecular, poco ¡nmunogénicas por si mismas, así como a un suero policlonal frente dichas moléculas o a anticuerpos monoclonales obtenibles por dicho método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los inmunoensayos son metodologías ampliamente utilizadas en el ámbito clínico, biotecnológico, alimentario y medioambiental, para Ia detección específica de una sustancia. La gran difusión de estas técnicas se basa, fundamentalmente, en Ia especificidad de los anticuerpos y Ia posibilidad de desarrollarlos frente a cualquier sustancia, agregado, virus, célula, etc.
La obtención de anticuerpos -en cualquiera de sus modalidades- requiere inmunógenos o, en el caso de técnicas recombinantes, sustancias que permitan efectuar Ia selección adecuada de entre los péptidos expresados.
Los métodos de inmunización están bien establecidos y, en general, es relativamente fácil obtener anticuerpos específicos contra sustancias inmunogénicas (p.e. proteínas) que son, en general, las que poseen elevada masa molecular. Sin embargo, las sustancias (moléculas neutras, iones, etc.) de masa molecular inferior a 5000 D, tales como aminoácidos, plaguicidas, péptidos, etc., no son inmunogénicas por sí mismas y deben unirse a moléculas portadoras o "carriers" para inducir respuesta inmune, es decir, producir anticuerpos contra ellas. La bibliografía especializada recoge ampliamente estos aspectos1'2.
El procedimiento tradicional de inmunización consiste en unir covalentemente estas moléculas de pequeño tamaño (haptenos) a proteínas como albúmina de suero bovino, hemocianina del molusco Megathura crenulata, tiroglobulina, etc. Los inmunógenos empleados no son fáciles de caracterizar dado que, al utilizar proteínas carríer de elevado peso molecular, Ia relación ca/r/er/hapteno no puede determinarse exactamente; además, Ia efectividad de Ia inmunización es variable, obteniéndose resultados heterogéneos que son difíciles de reproducir y sistematizar. Ello se debe, principalmente, a Ia variabilidad de los inmunógenos y a Ia dificultad de acotar Ia respuesta inmunitaria del animal huésped. Además, los sueros obtenidos por esta vía contienen anticuerpos contra Ia proteína portadora, Io que amplía el espectro de respuesta de los sueros, aumentando las interferencias inespecíficas. Todo ello se agudiza a medida que disminuye el tamaño molecular. En consecuencia, esta metodología debe mejorarse, de modo que se disponga de inmunógenos para haptenos, perfectamente caracterizados, con una respuesta homogénea, sin interferencia de Ia molécula carríer, preparados y purificados de un modo sencillo y reproducible. Para ello, sería necesario, es decir, se debería disponer de un método en el que el carrier fuera Io más inerte posible, aunque capaz de activar Ia respuesta inmunitaria. Por otro lado, el método de anclaje del hapteno al carríer debería ser cuantitativo y reproducible, permitiendo establecer fácilmente Ia relación molar hapteno/ carríer.
Los autores de Ia presente invención han desarrollado un nuevo método para producir anticuerpos altamente específicos contra sustancias de bajo peso molecular, como fármacos, plaguicidas, vitaminas, péptidos, etc., sin Ia necesidad de usar una proteína o sustancia similar como agente portador, y sin necesidad de adyuvantes. El método permite, además, controlar cada una de las etapas de preparación de los inmunógenos, Io que asegura Ia reproducibilidad del procedimiento.
Siguiendo el método de este invento, el hapteno es unido a partículas de óxidos metálicos de estequiometría ExOy, siendo E un elemento químico cuyos óxidos son sólidos y con un tamaño de partícula en Ia escala de nm a μm - preferentemente-, siendo x e y los coeficientes estequiométricos de cada elemento. Previamente estas partículas han sido silanizadas dotándolas de un grupo funcional amino, epóxido, tiol o isocianato.
Un antecedente de Ia presente invención es el método para Ia producción de anticuerpos por inmunización con partículas de oro coloidales, unidas a haptenos (aminoácidos) por interacciones iónicas y fuerzas de Van der Waals descrito en EP0232717. Esta patente utiliza una vía diferente en cuanto al carríer utilizado (oro) y modo de inmovilización (electrostática) de los haptenos.
El óxido de aluminio, por su parte, es conocido como adyuvante en Ia preparación de vacunas para humanos. En las patentes DE-A- 1945251 y DE-A-
1492010 se utiliza esta sustancia como adyuvante para incrementar Ia antigenicidad de un antígeno tumoral y una toxina de abeja. Por otra parte, este óxido se ha unido covalentemente a proteínas o péptidos poliméricos con el fin de producir vacunas en las que los antígenos mantienen su conformación original, como ha descrito Frey eí a/3, por ejemplo.
Por otro lado, las tierras raras también se han utilizado en Ia preparación de adyuvantes de inmunización. La patente GB-A-981242 revela un método para incrementar Ia antigenicidad de vacunas que contienen material antigénico o de origen microbiano, mediante Ia adición de sales de tierras raras como lantano o cerio.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : representa las medias de absorbancia máxima (λ 490 nm) de los sueros obtenidos tras Ia inmunización de ratones con haptenos de atrazina, biotina y sulfasalazina unidos a KLH, partículas de óxido de aluminio y europio, o partículas unidas a aprotinina, con y sin adyuvante de Freund. Figura 2: representa las curvas de competición para atrazina usando sueros obtenidos por inmunización con partículas-AT sin adyuvante, partículas-AT con adyuvante y KLH-AT con adyuvante.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El primer objeto de Ia presente solicitud es un método para producir anticuerpos específicos contra una sustancia de bajo peso molecular (hapteno) que comprende: a) derivatización de partículas de un óxido metálico; b) conjugación del hapteno a las partículas de óxido metálico derivatizadas en a); c) inmunización de un animal con el conjugado óxido metálico/hapteno. El primer paso de derivatización de las partículas del óxido metálico persigue funcionalizar las partículas con grupos reactivos como por ejemplo grupos amino, epóxido, tiol o isocianato, cuya tarea es facilitar Ia conjugación posterior entre las partículas del óxido metálico y el hapteno frente al cual se pretende producir los anticuerpos específicos. Dependiendo de los grupos reactivos presentes en el hapteno se hará más adecuado funcionallzar las partículas con uno u otro grupo químico.
En el contexto de Ia presente invención Ia derivatlzación es preferiblemente una silanización. Dicha silanización se realiza preferiblemente mediante Ia reacción de las partículas del óxido metálico con silanos seleccionado entre (3- aminopropil)trietoxisilano, (3-aminoprop¡l)tπmetoxisilano, 3[2-(2-aminoetilamino) etilaminojpropiltrimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino)-propildimetoximetilsilano, [3- (2-aminoetilam¡no)propil]trimetoxisilano, 3-aminopropildimetilmetoxisilano, 3- aminopropil(dietoxi)metilsilano, Λ/-[3-(trimetoxisilil)propil]etilendiamlna, (3- glicidoxipropil)trimetoxisilano, (3-mercaptopropil)tr¡metoxisilano o (3- isocianatopropil)trietoxisilano. Dependiendo del silano usado se funcionalizará las partículas con grupos aminos, epóxido, tiol o isocianato los cuales serán más o menos adecuados para su posterior conjugación con el hapteno dependiendo de los grupos funcionales que este presente.
Las partículas derivatizadas pueden ser de cualquier óxido metálico, aunque son preferidas las partículas de óxidos de tierras raras como el óxido de samario o el óxido de terbío, aunque son aún más preferidas las partículas de óxido de aluminio y Ia partículas de óxido de europio. Las partículas deben tener preferentemente un tamaño en el orden de nm a μm.
El método de Ia invención permite obtener anticuerpos frente a haptenos de bajo peso molecular esto es moléculas neutras, iones, aminoácido, péptidos, plaguicidas, antibióticos etc. cuyos pesos moleculares estén por debajo de 5000 Da. En una realización particular de Ia invención el hapteno es Ia atrazina, Ia biotina o Ia sulfasalazina.
El método de Ia invención permite Ia obtención tanto de anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales. Para ello, primero se lleva a cabo Ia inmunización de ratones o conejos de acuerdo con protocolos de inmunización convencionales2. Los sueros policlonales se obtienen mediante el sangrado del animal y posterior separación del suero por centrifugación. Los anticuerpos monoclonales, se obtiene, sin embargo mediante el aislamiento de clones de células B del bazo de ratones inmunizados con el óxido metálico/hapteno.
Es por tanto también un objeto de Ia invención un suero policlonal obtenible de acuerdo el método descrito, así como Io es un anticuerpo monoclonal obtenible por dicho método.
A continuación se presentan unos ejemplos para ilustrar Ia invención.
EJEMPLOS
Para demostrar Ia validez del método se presentan resultados experimentales concretos, obtenidos utilizando como inmunógenos óxido de aluminio y óxidos de europio. Para ello se prepararon los siguientes conjugados de inmunización:
- Partículas de óxidos unidas a haptenos
- Partículas de óxidos unidas a una proteína de baja masa molecular (aprotinina), conjugada a su vez al hapteno - Aprotinina unida al hapteno
- KLH unida al hapteno.
Estos conjugados fueron inoculados en ratones (vía intraperitoneal) y conejos (vía intramuscular), siguiendo protocolos de inmunización convencionales2. De acuerdo con este método, se obtienen anticuerpos policlonales in vivo en ratones y en conejos, y anticuerpos monoclonales aislando clones de células B del bazo de ratones previamente inmunizados.
A continuación se describen las etapas de preparación de inmunógenos y los resultados obtenidos.
Ejemplo 1 : derivatización de partículas del óxido metálico
1.1 ,- Activación de Ia superficie de las partículas Se suspendieron 5 g de nanopartículas de óxido de aluminio en 50 mL de una disolución de un ácido fuerte al 5% (v/v), y se calentaron a 90 0C con agitación durante 90 minutos.
A continuación se enfrió Ia mezcla de reacción en un baño a 0 0C. La suspensión fue centrifugada a 1500xg a 4 0C durante 10 minutos, desechando el sobrenadante. Posteriormente se lavaron las partículas por resuspensión en 25 mL de agua desionizada, agitación en vórtex y centrifugación a 9500xg durante 15 minutos, eliminando el sobrenadante. Tras siete lavados, las partículas fueron secadas en estufa a 140 0C y pulverizadas en un mortero. Rendimiento: 4,75 g,
95%.
1 .2.- Derivatización: Aminación de las partículas activadas.
Se pesaron 3,5 g de nanopartículas activadas y se mezclaron con 5 mL de un agente silanizante como por ejemplo (3-aminopropil)trimetoxisilano, (3- aminopropil)trietoxisilano, 3[2-(2-amiπoetilamino)etilamino]propiltrimetoxisilano u otro similar, disuelto en 40 mL de tolueno anhidro. La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo bajo atmósfera de argón durante 24 h a 135 0C. Una vez frío, Ia suspensión se centrifugó a 200xg durante 5 minutos, y se desechó el sobrenadante. Las partículas se lavaron 5 veces por resuspensión en tolueno (40 mL), centrifugación a 5000xg durante 5 minutos y eliminación del disolvente. A continuación las partículas se lavaron tres veces con 40 mL de acetona, siguiendo el procedimiento descrito, centrifugando a 5000xg durante 20 minutos. Se secaron a temperatura ambiente, utilizando vacío, hasta peso constante. Posteriormente, las partículas fueron pulverizadas en un mortero y guardadas en frasco topacio en un desecador. Rendimiento: 3,38 g, 97 %, porcentaje de aminación: 2%.
De manera similar, las partículas de óxido de europio fueron silanizadas, aunque en este caso no fue necesario el paso previo de activación de su superficie descrito en el ejemplo 1.1.
La cantidad de grupos amino libres resultantes de Ia silanización de las partículas fue determinada mediante análisis elemental. La eficiencia de Ia silanización puede variarse en función del tiempo de reacción y de Ia relación estequiométrica óxido/silano que se utilice; de este modo, es posible obtener nanopartículas con mayor o menor número de grupos amino libres, según convenga anclar más o menos hapteno.
Del mismo modo se consigue Ia derivatización como amino, epóxido, tiol o isocianato, por reacción con silanos tales como Λ/-[3-
(trimetoxisilil)propil]etilendiam¡na, (3-glicidoxipropil)trimetoxisilano, (3- mercaptoprop¡l)trimetoxisilano y (3-isocianatopropil)tr¡etoxisilano.
Ejemplo 2: preparación de inmunóqenos Las nanopartículas derivatizadas fueron conjugadas a distintos haptenos como atrazina, biotina y antibióticos para producir anticuerpos. Estos haptenos deben contener grupos funcionales (p.e. -COOH) enlazables covalentemente a las partículas, bien directamente o utilizando cross-linkers u otras reacciones de síntesis bien conocidas por los especialistas4. También fueron unidas a conjugados aprotinina-hapteno para comparar su ¡nmunogenicidad con Ia de las partículas-hapteno, en ausencia de proteína. Como inmunógenos control se utilizaron conjugados de KLH-hapteno y aprotinina-hapteno. En los siguientes ejemplos se indica el procedimiento utilizado para realizar las conjugaciones.
Ejemplo 2.1 : Conjugación de partículas de óxido de aluminio v europio a sulfasalazina v haptenos de atrazina y biotina
A una disolución de sulfasalazina (S), un hapteno de atrazina (AT) o de biotina (B) (71 ,4 μmoles) en dimetilformamida (DMF) anhidra (70 μL) se adicionó sucesivamente una disolución de diciclohexílcarbodümida (75 μmoles, 15 mg) en 50 μL de DMF anhidra y de N-hidroxisuccinimida (75 μmoles, 8,6 mg) en 50 μL de DMF anhidra. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 5 horas a temperatura ambiente y protegida de Ia luz. Se centrifugó para eliminar Ia diciclohexilurea formada, y el sobrenadante fue adicionado a 50 mg de partículas de óxido de aluminio o europio silanizadas, suspendidas en 1 mL de tampón carbonato. La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2,5 horas protegida de la luz, y toda Ia noche a 4 0C, agitando con un vórtex. A continuación se centrifugó Ia suspensión, eliminando el sobrenadante. Las partículas fueron lavadas seis veces por resuspensión en 1 mL de agua, agitación en vórtex y centrifugación. El conjugado se secó a vacío a temperatura ambiente. La presencia del hapteno anclado en las partículas se comprobó mediante análisis elemental de las mismas.
Ejemplo 2.2: Conjugación de KLH a sulfasalazina y haptenos de atrazina y biotina
Los mismos haptenos de atrazina y biotina, y Ia sulfasalazina fueron unidos covalentemente a KLH (hemocianina de Megathura crenulata) utilizando diciclohexilcarbodiimida, según el método descrito por Langone5. La concentración de proteína de las fracciones obtenidas se determinó mediante el método de Bradford. La relación de mareaje hapteno/KLH resulta difícil de determinar mediante Maldi-TOF-MS, debido al elevado peso molecular de esta proteína. Por otro lado, tampoco es posible determinarla espectrofotométricamente debido a que Ia proteína presenta una banda de absorción a 260 nm, que coincide con bandas de absorción máxima de los haptenos. Como se ha señalado previamente, este es un ejemplo de los inconvenientes que presenta el método clásico de preparación de inmunógenos macromolécula-hapteno
Ejemplo 2.3: Conjugación de aprotinina a sulfasazina o a un hapteno de atrazina o biotina
La sulfasalazina y los haptenos de atrazina y biotina también fueron unidos covalentemente a aprotinina siguiendo el método descrito por Erlanger6. La relación molar hapteno/proteína fue determinada mediante Maldi-TOF-MS, dando un valor de 5:1 en todos los casos.
Ejemplo 2.4: Conjugación de partículas de óxido de aluminio o europio aminadas a conjugados aprotinina-hapteno.
A los conjugados aprotinina-hapteno, obtenido en el ejemplo 2.3, se adicionaron 5 mg de una carbodiimida, como por ejemplo 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida o 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Tras homogeneizar, fueron adicionados 50 mg de partículas de óxido de aluminio o europio aminadas. La mezcla se dejó reaccionar durante 3 horas por agitación en vórtex. Posteriormente fue centrifugada a 9000 rpm y el sobrenadante eliminado. A continuación, el sólido fue lavado reiteradamente (seis veces) por resuspensión en 1 mL de agua desionizada, centrifugación y eliminación del sobrenadante. Finalmente, las partículas fueron suspendidas en 1 mL de PBS (tampón fosfato 10 mM, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH 7,4) y almacenadas a -2O0C.
Ejemplo 3: inmunización Los inmunógenos preparados según el ejemplo 2 se resuspendieron en PBS.
Las suspensiones de partículas fueron dispersadas por sonicación en un baño de ultrasonidos previamente a Ia inmunización. Cada antígeno fue inoculado a dos grupos (con y sin adyuvante de Freund) de ratones hembra BALB/c (H-2d). Las dosis contenían 100 μg de antígeno en 200 μL de PBS. La dosis de los grupos con adyuvante contenían Ia misma cantidad de antígeno en 100 μL de PBS, más
100 μL de adyuvante de Freund. Un grupo control fue inmunizado con 5 μmoles de hapteno mezclado con 100 μL de adyuvante de Freund. Todos los ensayos se efectuaron en grupos de seis ratones por ensayo.
Las inmunizaciones se llevaron a cabo por inyección intraperitoneal del antígeno en cuatro dosis, a intervalos de dos semanas. Se realizaron sangrías dos días después de cada inmunización. Finalmente, los animales fueron sacrificados dos días después de Ia última dosis; Ia sangre fue extraída por punción cardiaca, separando el suero por centrifugación.
Los sueros obtenidos se caracterizaron mediante ensayos de titulación y competición. En primer lugar, Ia avidez de los sueros contra antígenos de tapizado se determinó mediante ELISA indirecto no competitivo, midiendo Ia unión de cada suero (diluciones seriadas desde 1/500 a 1/32000) a cada conjugado a diferentes concentraciones (desde 1 hasta 0,001 mg/L). Para ello, se tapizaron placas ELISA de poliestireno con disoluciones de conjugados OVA- hapteno en tampón carbonato (50 mM carbonato-bicarbonato, pH 9,6), 100 μL/pocillo. Las placas, selladas, se incubaron a 4 0C durante 16 horas. Al día siguiente, se lavaron 6 veces con tampón PBS-T (PBS conteniendo 0,05% de Tween 20). A continuación fueron adicionadas a cada placa distintas concentraciones de suero disuelto en PBS (100 μL/pocillo), e incubadas a temperatura ambiente durante una hora. Tras el lavado de las placas, como se ha indicado previamente, éstas fueron incubadas durante una hora con inmunoglobuiinas anti-ratón -dilución 1 :2000 en PBS (100 μL/pocillo)- marcadas con peroxidasa. Una vez lavadas, fueron reveladas por adición de 100 μL/pocillo de una disolución de sustrato (2 mg/mL de o-fenilendiamina -OPD- y 0,012% H2O2 en citrato sódico 25 mM y fosfato sódico 62 mM, pH 5,5). Pasados 10 minutos, Ia reacción enzimática fue parada por adición de H2SO4 (50 μL/pocillo), y Ia absorbancia leída a dos longitudes de onda, 490 y 650 nm, en un lector de placas. Las concentraciones de los conjugados de tapizado y Ia dilución de los sueros utilizados en los ensayos de competición fueron elegidas para producir valores de absorbancia aproximados de 1 ,0 unidad en ausencia de analito.
Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados de Ia titulación de los sueros obtenidos tras inmunización con aprotinina-AT, KLH-AT, partículas-AT y partículas- aprotinina-AT.
Tabla 1. Titulación indirecta de sueros de ratones inmunizados sin adyuvante
Figure imgf000011_0001
a Dilución sueros 1/1000 b conjugado de tapizado OVA-AT, concentración 1 μg/mL. Los números entre paréntesis corresponden a diferentes animales inoculados con el mismo antígeno
Tabla 2. Titulación indirecta de los sueros obtenidos de ratones inmunizados con adyuvante.
Figure imgf000012_0001
a Dilución sueros 1/1000 b conjugado de tapizado OVA-AT, concentración 1 μg/mL.
*Los números entre paréntesis corresponden a diferentes animales inoculados con el mismo antígeno.
En las tablas 1 y 2 se muestra Ia absorbancia (λ 490 nm) máxima de cada suero diluido 1/1000, usando como conjugado de tapizado OVA-AT a una concentración de 1 μg/mL. Estos valores (a los que se ha restado Ia absorción del blanco) revelan un alto reconocimiento del antígeno de tapizado por Ia mayoría de los sueros obtenidos. Los títulos más altos fueron obtenidos utilizando como carrier una proteína, bien KLH o aprotinina. En Ia Tabla 3 se muestran, comparativamente, los resultados de titulación obtenidos con y sin adyuvante, para los inmunógenos partículas-AT y partículas-aprotinina-AT. En ambos casos los resultados son similares, observándose bastante dispersión entre los animales inmunizados.
Tabla 3. Comparación de los resultados de los ensayos de titulación indirecta de los sueros obtenidos con ratones inmunizados con y sin adyuvante.
Figure imgf000013_0001
a Dilución sueros 1/1000 b conjugado de tapizado OVA-AT, concentración 1 μg/mL.
Los números entre paréntesis corresponden a diferentes animales inoculados con el mismo antígeno.
Como puede apreciarse, el uso de adyuvante de Freund no mejora sensiblemente los resultados, siendo incluso mejores sin adyuvante en el caso de partículas-aprotinina-AT. Hay que destacar los buenos resultados obtenidos en titulación usando como inmunógeno partículas-hapteno sin adyuvante, Io que demuestra claramente Ia validez del método objeto de Ia invención.
En Ia figura 1 se muestran las medias de absorbancia máxima (λ 490 nm) de los sueros obtenidos con partículas de óxido de aluminio y de europio, con y sin adyuvante (diluidos 1/1000) usando como conjugados de tapizado OVA-hapteno para los distintos sistemas, a una concentración de 1 μg/mL. Los valores de titulación muestran reconocimiento del antígeno de tapizado por los sueros obtenidos, Io que demuestra Ia producción de anticuerpos con todos los conjugados utilizados. Únicamente en el caso de partículas de europio unidas al hapteno de atrazina se obtuvo un título medio final inferior a 0,5 unidades de absorbancia; no obstante, el uso de adyuvante de Freund hace posible el uso de estas partículas como carríerde inmunización.
Como ocurre con el sistema atrazina, los títulos más altos para biotina y sulfasalazina fueron obtenidos utilizando como carrier KLH, aunque hay que destacar los elevados títulos obtenidos para el sistema biotina con Ia nueva metodología desarrollada.
Los sueros que mostraron reconocimiento específico fueron usados para llevar a cabo ensayos de competición en formato indirecto. Estos ensayos se realizaron siguiendo el protocolo de titulación, por incubación de 50 μL de Ia dilución apropiada de cada suero en PBS con 50 μL de una disolución del analito en el mismo tampón. La figura 2 muestra Ia curva de competición obtenida para el sistema atrazina usando como antígenos: - Conjugado partículas-AT sin adyuvante
- Conjugado partículas-AT con adyuvante
- Conjugado KLH-AT con adyuvante
Las curvas de competición obtenidas con los diferentes inmunógenos en las mismas condiciones, muestran que Ia inmunización con partículas-hapteno sin adyuvante proporciona un valor de IC50 comparable al obtenido por inmunización tradicional (proteína-hapteno/adyuvante). No obstante, hay que considerar que Ia sensibilidad alcanzada con estos sueros podría mejorarse mediante heterología de tapizado en el ¡nmunoensayo, ya que en estos ensayos iniciales se ha empleado el mismo hapteno en Ia inmunización y en el conjugado de tapizado.
Discusión
El método de Ia presente invención presenta varias ventajas frente a Ia obtención de inmunógenos con proteínas. En primer lugar, las partículas de óxidos metálicos son muy baratas. Además, son químicamente muy estables, se almacenan en condiciones normales sin requerir refrigeración etc. y pueden derivatizarse con distintos grupos funcionales de una forma reproducible, Io que permite obtener conjugados partículas-hapteno con relación molar hapteno/ca/r/er controlada y fácil de determinar mediante análisis elemental. Estas conjugaciones pueden llevarse a cabo usando proporciones elevadas de disolventes orgánicos, Io que supone una gran ventaja con haptenos altamente apolares. Además, Ia purificación de estos conjugados es rápida y sencilla, evitando diálisis, exclusión molecular u otras metodologías similares. Por otro lado, Ia inmunización con este tipo de conjugados evita el uso de proteínas y, en consecuencia, Ia producción de anticuerpos frente a las mismas, mejorando Ia especificidad del suero. Otra ventaja de las partículas de óxidos de aluminio se debe a que no es necesario administrar adicionalmente un adyuvante junto al inmunógeno, ya que actúan por sí mismas como tal. Los conjugados partículas-hapteno desarrollados han permitido producir anticuerpos específicos contra sustancias de bajo peso molecular sin el uso de proteínas como carríer, ni de adyuvantes en Ia inmunización en el caso de óxido de aluminio. Los sueros así obtenidos han proporcionado inmunoensayos de sensibilidad comparable a los conseguidos por inmunización tradicional, Io que demuestra el potencial de esta metodología.
BIBLIOGRAFÍA
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6. Erlanger, B. F. The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: a survey. Methods Enzymol. (1980) 70, 85.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para producir anticuerpos específicos contra una sustancia de bajo peso molecular (hapteno) que comprende: a) derivatización de partículas de un óxido metálico; b) conjugación del hapteno a las partículas de óxido metálico derivatizadas en a); c) inmunización de un animal con el conjugado óxido metálico/hapteno.
2. Método de acuerdo con al reivindicación 1 donde Ia derivatización comprende Ia silanización del óxido metálico.
3. Método de acuerdo con Ia reivindicación 2 donde Ia silanización se lleva acabo con (3-aminopropil)trietoxisilano, (3-minopropil)trimetoxisilano, 3[2-(2- aminoetilamino)etilamino]propiltrimetoxísilano, 3-(2-aminoetilamino)- propildimetoximetilsilano, [3-(2-aminoetilamino)propil]trimetoxisilano, 3- aminopropildimetilmetoxisilano, 3-aminoprop¡l(dietoxi)metilsilano, Λ/-[3- (trimetoxisil¡l)propil]etilendiamina, (3-glicidoxípropil)trimetoxisilano, (3- mercaptopropil)tr¡metoxisilano o (3-isocianatopropil)trietoxisilano.
4. Método de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde el óxido metálico es el óxido de aluminio o un oxido de una tierra rara.
5. Método de acuerdo con Ia reivindicación 4 donde el oxido metálico es el óxido de aluminio, oxido de europio, oxido de samario u oxido de terbio.
6. Método de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde el hapteno es un aminoácido, un péptido, un plaguicida o un antibiótico.
7. Método de acuerdo con Ia reivindicación 6 donde el hapteno es Ia atrazína, Ia biotina o Ia sulfasalazina.
8. Método de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde el anticuerpo es policlonal o monoclonal.
9. Suero policlonal obtenible de acuerdo con el método de Ia reivindicación 1.
10. Anticuerpo monoclonal obtenible de acuerdo con el método de Ia reivindicación 1.
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