WO2008065796A1

WO2008065796A1 - Inhibiteur de l'α -glucosidase

Info

Publication number: WO2008065796A1
Application number: PCT/JP2007/067919
Authority: WO
Inventors: Sei Ozaki; Hiromi Oe; Shinichi Kitamura
Original assignee: Fuji-Sangyo Co., Ltd.; Osaka Prefecture University
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2008-06-05
Also published as: JP2008137925A; JP4125768B2

Description

明細書

a 一ダルコシダーゼ阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は、新規な α ダルコシダーゼ阻害剤に関する。

背景技術

[0002] a ダルコシダーゼは、 α—グルカン、短鎖オリゴ糖などの非還元末端側からグノレコースを解離するェキソ型加水分解酵素である。この酵素は、植物におけるデンプン代謝や動物の消化作用並びにグリコーゲン代謝に関与し、糖質代謝系において重要な役割を果たしている。中でも、ヒト小腸における糖吸収を制御することから、その阻害剤については多くの研究がなされており、高血糖症状を原因とする糖尿病、高脂血症、肥満などの予防や治療にお!/、て有効とされる。

[0003] 事実、 α ダルコシダーゼ阻害剤は糖吸収阻害の他に、耐糖能異常者 (IGT)への長期投与によってインスリン感受性の改善や 2型糖尿病の発症が有意に抑制されるだけでなぐ心血管疾患の発生も有意に抑制されることが示され、更には、高血圧発症においても有意に抑制されることがわかってくるなど、優れた有効性が明らかにされてきている（非特許文献 1、 2)。

[0004] a ダルコシダーゼ阻害剤は、 1966年に Streptomyces sp.の代謝産物として分離されたノジリマイシンの構造が明らかにされて以来 (非特許文献 3)、多数の類縁化合物が単離され、またそれらをモチーフとした化合物の合成研究がなされてきた（非特許文献 4)。これらの化合物は、単糖のビラノース内の酸素原子が窒素に置換されたァザ糖に属する擬似糖質の一種である点を共通の特徴としている。これらの他に、硫黄、リン、炭素原子などで置換された化合物がチォ糖、フォスファ糖、力ルバ糖として知られており、既に医薬品となっているァカルボース、ボグリボース、ミグリトールなどもこれらの化合物群に属する。

[0005] 中でも、最も研究されているのはァザ糖類であり、前記のミグリトールはノジリマイシンより生まれた薬剤である。ノジリマイシンは、優れた α 及び /3—ダルコシダーゼ阻害成分ではあったが、不安定であることから、まず C 1位の水酸基を還元したデォキシノジリマイシンが合成された。その結果、更に安定性及び阻害活性を増したが、 i n vivoにおいて活性が低下するという欠点があり、更なる誘導体の合成、検討が成され、ミグリトールが誕生した。最も阻害活性の強いボグリボースについても同様で、ァカルボースの発見に端を発し、構造活性相関の研究が進められ、ノリダミン、ノリエナミン、バリオールァミンなど力ルバ糖アミン類をリード化合物とした化学修飾により合成に至っている。

[0006] 一方、ダルコシダーゼ酵素の活性部位につ!/、ては、コンズリトール Bエポキシド（CB E)の特異的結合反応を利用した研究が行われており、 Asp—カルボキシル基の関与が明ら力、となってきている（非特許文献 5)。また、デォキシノジリマイシン、その異性体であるィソファゴミンの選択的阻害活性力、らもイミノ基と酵素活性部位とのイオン対形成により作用してレ、ると考えられて!/、る。

[0007] これらの擬似糖質と異なる阻害成分としては、アタリドンアルカロイド（非特許文献 6 )、クマリン配糖体 (非特許文献 7)、フラボノイド類 (非特許文献 8、 9)、タンニン類 (非特許文献 10、 11)など多くの植物由来成分が知られている力これらの化合物群は阻害レベルが非常に弱!/、ことから、実用化には至って!/、な!/、。

[0008] このような状況下、近年特に有効性の高!/、ものとしてコタラヒムブッ（Salacia reticula ta WIGHT)が注目されて!/、る。コタラヒムブッは、デチンムル科（Hippocrateaceae)サラキア属（Salacia)のツル性植物であり、スリランカでは伝承医学ァーュルヴエーダにおいて、リューマチ、皮膚病に加え糖尿病に有効な薬用植物として昔から利用されてきたと言われている（非特許文献 12)。利用部位は、主に根や幹部とされており、太い幹などになるとくり抜いてコップを作り、食事の際お湯やお水を入れて使うと糖尿病予防にレ、レ、と伝えられてレ、るほどである。

[0009] その有効性については、 1984年にコロンボ大学の E.H.Karunanayake等によって糖負荷試験による血糖上昇抑制作用が確認されて以来 (非特許文献 13)、多くの研究が成されてきており、他にも抗肥満、肝保護などといった作用について明らかにされてきている（非特許文献 14、 15、 16、 17、 18)。また、変異原性や急性毒性試験など（非特許文献 19、 20、 21)、安全性についても検討がなされており、コタラヒムブッが優れた有効性と高!/、安全性を併せ持つ植物であるとレ、う科学的裏付けが得られてきている。

[0010] このコタラヒムブッの α—ダルコシダーゼ阻害活性に関しては、有効成分として分子内に硫酸基を有するチォ糖類のサラシノール (特許文献 1、非特許文献 22)ゃコタラノーノレ (非特許文献 23)及びレティキユラノール (特許文献 2)が既に明らカ、にされている。また、医薬品として上市されているァカルボースを凌ぐ非常に強い阻害活性を有していることから、この成分をリード化合物として、異性体合成などが盛んに行われている（非特許文献 24、 25)。

[0011] しかしながら、一方では現在明らかとなっている前記 3成分の含有量や活性比較から考えると、これら 3成分からではコタラヒムブッのもつ阻害活性を充分に説明することが出来ないとの報告例もあり（非特許文献 26)、更なる有効成分の存在が示唆された。

[0012] 特許文献 1:特開平 11 29472号公報

特許文献 2：特開 2004— 323420号公報

非特許文献 l:Chiasson Jし. et al.， JAMA,.290， p486- 494， 2003、

非特許文献 2:Yuichi Shinoda et al.， Metabolism., 55， p935— 939， 2006

非特許文献 3:Inoue S et al.， J. Antibiot., 19， p288— 292， 1966

非特許文献 4:Naoki Asano, Glycobiology. , 13(10)， p 93— 104， 2003

非特許文献 5:Monique M.P. Hermans et al.， J. Biol. Chem., 266(21)， pl3507— 135

12， 1991

非特許文献 6: Jean Duplex Wansi et al.， Chem. Pharm. Bull., 54(3)， p292— 296， 20 06

非特許文献 7: Sung Ok Lee et al.， Arch.Pharm.Res·， 27 (12)， pl207— 1210， 2004 非特許文献 8:Jun awabata et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(2)， p445— 447 ， 2003.

非特許文献 9:Kiran Iqbal et al.， Chem. Pharm. Bull., 52 (7)， p785— 789， 2004 非特許文献 10:Miou Toda et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(2)， p294— 298，

2000、

非特許文献 ll:Miou Toda et al.， Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(3)， p542— 547， 2001

非特許文献 12 : Attygalle， Sinhalese Materia Medica., p43, 1917

非特許文献 13 : E.H.Karunanayake et al.， J Ethonopharmacol., 11， p223— 231， 1984 非特許文献 14 : Osami jimoto et al.，日本栄養'食糧学会誌， 53(5), pl99— 205， 20

00

非特許文献 15 : Masayuki Yoshikawa et al.， J Nutr., 132， pl819— 1824， 2002 非特許文献 16 : Masayuki Yoshikawa et al.， Biol.Pharm.Bull.,25, p72— 76， 2002 非特許文献 17 : Masayuki Yoshikawa et al.，薬学雑誌， 123(10)， p871— 880， 2003、非特許文献 18 : Hidehiko Beppu et al.，日本食品新素材研究会誌， 8(2)， pl05— 117， 2005

非特許文献 19 : Hiroshi Shimoda et al.，食衛誌， 40(3)， pl98— 205， 1999

非特許文献 20 : Hiroshi Shimoda et al.，食衛誌， 42(2)， pl44— 147， 2001

非特許文献 21 : Hiroshi Shimoda et al.，医学と薬学， 46(4)， p527— 540， 2001 非特許文献 22： Masayuki Yoshikawa et al.， Tetrahedron Letters., 38(48)， p8367— 8

370， 1997

非特許文献 23 : Masayuki Yoshikawa et al.， Chem.Pharm.Bull·， 46(8)， pl339— 1340， 1998

非特許文献 24 : Ahmad Ghavami et al.， J. Org. Chem. , 66， p2312— 2317， 2001 非特許文献 25 : Monica G.Szczepina et al.， J. Am. Chem. Soc, 126( 39 )， pl2458—

12469， 2004

非特許文献 26 : Masayuki Yoshikawa et al.，薬学雑誌， 121(5)， p371— 378， 2001 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本願発明者らは、上記背景技術に基づき、さらに研究を重ねた結果、コタラヒムブッから新たな α—ダルコシダーゼ阻害活性物質を見出し、本発明を完成させるに至つた。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明の化合物はこれまでに知られていな力、つた化学式 (化 1)で示される新規の化合物であって、 α —ダルコシダーゼ阻害活性を有する。

発明の効果

[0015] 本発明によると、これまでに知られた α —ダルコシダーゼ阻害剤よりも強い作用を有する α —ダルコシダーゼ阻害剤が提供され、抗糖尿病薬や抗高脂血症薬など抗高血糖を原因とする各症状への臨床適用やいわゆる効能表示が認められた特定保健用食品などへの応用が期待される。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]コタラヒムブッ水抽出物の HP— 20分画物をァミノカラムで分画した 70%ァセト二トリル溶出物の HPLCチャートである。

[図 2]コタラヒムブッ抽出物の最終分画物の¹ H— NMRスペクトルである。

[図 3]コタラヒムブッ抽出物の最終分画物の¹³ C— NMRスペクトルである。

[図 4]コタラヒムブッ抽出物の最終分画物の FAB— MSスペクトルである。

[図 5]コタラヒムブッ抽出物の最終分画物の推定平面構造図である。

[図 6]糖負荷試験 (スクロース）による有効性評価を示すグラフである。

[図 7]糖負荷試験 (マルトース）による有効性評価を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明に係る新規化合物は次の化学式 (化 1)の構造を有するもので、デチンムル科サラキア属植物の根及び地上部に多く含まれている。この化合物は、非常に優れた α—ダルコシダーゼ阻害活性を有する。この化合物は、主として、デチンムル科サラキア属植物の根部及び地上部の溶媒抽出物から得られ、サラキア属植物として、例えば、サラキア ·レティキュラータ（Salacia reticulata :コタラヒムブッ）、サラキア 'プリノイデス（Salacia prinoides)、サラキア 'ォブロンガ（Salacia oblonga)、サラキア'キネンシス（Salacia chinensis)が例示される。もっとも、本発明の化合物はこれら以外の部位や当該植物以外の植物から抽出してもよいのは言うまでもない。

[化 1]

[0018] その精製方法は特に限定されるものではなぐ例えば種々の公知の方法を組み合わせることによって得られる。例えば、サラキア属植物の根や地上部の切断物等に対して抽出溶媒を加えて抽出し、その後濾液を取り、濃縮後、溶媒やカラムを用いた分画操作により精製を加えることによって得られる。

[0019] さらに具体的な一例を挙げると、サラキア属植物の根及び/又は地上部に対して、重量比で約 2〜20倍量の抽出溶媒を加える。抽出溶媒としては、水、あるいはアルコール類、あるいは水とアルコール類又はアセトンなどの親水溶媒との混合溶媒から選択してもよいが、特に水が好ましい。また、超臨界抽出法を用いることもできる。

[0020] 抽出時間は適宜定められる力好ましくは一晩以上還流する。その後、遠心分離やろ過処理により残渣を除去する。得られた濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥する。以上の操作により、出発原料となるコタラヒムブッエキス末が得られる。尚、前記残渣に再度溶媒を添加し、同一の抽出操作を繰り返しても良い。

[0021] このコタラヒムブッエキス末を用いて水溶液を調整し、当量のエタノールを添加してエタノール沈殿処理を行う。沈殿溶媒としては、他にメタノール、イソプロパノール、ァセトニトリルなどを使用しても良い。その後、遠心分離やろ過処理により沈殿を除去する。そして、減圧濃縮により有機溶媒を除去したものを用いてカラムクロマトグラフィーなどの分離操作を行うことにより、本発明の新規 α —ダルコシダーゼ阻害物質を得ること力 Sでさる。

[0022] こうして得られた α —ダルコシダーゼ阻害剤は単一成分としてそのまま用いることもできる力各種の食品やお茶などの飲料に添加剤として用いたり、食後の血糖の上昇を抑えたり、糖の吸収を抑えたりするなどと言った効能効果が標榜できる特定保健用食品として提供される。また、適当な賦形剤や保存料、香料などと共に錠剤、カブセル剤、軟カプセル剤、散剤、顆粒剤等の内服剤や注射剤といった形状に製剤化してもよい。また、医薬品としての用途のみならず、いわゆる医薬品の形態に類似した健康食品としても禾 IJ用すること力できる。

[0023] すなわち、本発明の医薬組成物は、化学式 (化 1)で示された α —ダルコシダーゼ阻害剤 (化合物）と薬理学的に許容される担体とからなる。ここで、薬理学的に許容される担体とは、製剤化に必要とされる賦形剤や結合剤、崩壊剤、滑沢剤、 ρΗ調整剤、溶剤などを意味する。賦形剤としては乳糖、ショ糖、でんぷん、結合セルロース、マンニット、タルク等が、結合剤としてはシロップ、アラビアゴム、デキストリン等力崩壊剤としてはポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D—マンニトール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等力 S、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、 pH調整剤としては塩酸、クェン酸、リン酸、リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム等力溶剤としては水やエタノール等が例示される。医薬組成物の形態も限定されるものではない。医薬組成物の形態としては、上記のごとく錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、顆粒剤等の内服剤や注射剤が例示される。また、本発明の医薬組成物は、化学式 (化 1)で示された α —ダルコシダーゼ阻害剤 (化合物）のみを有効成分とする医薬組成物だけでなぐそれ以外の有効成分を含む医薬組成物を包含する。

[0024] また、本発明の食品組成物は、化学式 (化 1)で示された α —ダルコシダーゼ阻害剤（化合物）と栄養学的に許容される担体とからなる。ここで食品組成物とは、ガムやキャンディー、ゼリー等の菓子類、うどんやそば等の麵類、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、味噌やしようゆ、ソース等の調味料、スープ類、ジュース、コーヒー、お茶、栄養補給用の飲料等の各種飲料をはじめとする一般食品、錠剤やカプセル等医薬品に類似させた形態を有する!/、わゆる健康食品（その効果を標榜することが公に認められた特定保健用食品を含む）などを意味する。栄養学的に許容される担体とは、これらの食品の調製に必要な食品調製用原料を言い、食紅などの色素、ビタミン Eゃビタミン Cなどの抗酸化剤、ビタミン Aやビタミン B1などの各種ビタミン、防腐剤、保存剤等必要に応じて添加される各種添加剤をも含む意味で用いられる。ただし、本発明にお!/、ては化学式 (化 1)で示された α—グノレコシダーゼ阻害剤（化合物）を含むように調整された天然物由来の抽出物、つまり公知であるコタラヒムブッ抽出物を含む食品組成物は除かれる。もっとも、前記抽出物を含む食品組成物に、その効果を増大させるために本発明の α —ダルコシダーゼを配合することを本発明から排除するものでない。

[0025] これらの食品組成物や医薬品組成物において、 α —ダルコシダーゼ阻害活性が有効に発揮されるためには、全重量に対して、本発明成分を少なくとも 0. 0001 %、より好ましくは 0. 005-0. 1 %程度が必要とされる。もっとも、この量は投与対象となる患者や動物の症状、年齢、摂取形態等によって適宜設定されうる。

[0026] 以下、実施例に基づいて本発明についてさらに詳細に説明する力本発明は以下の実施例に限定されな!/、のは言うまでもなレ、。

実施例 1

[0027] 〔コタラヒムブッ抽出物の粗分画〕

コタラヒムブッ（Salacia reticulata)の乾燥した幹約 1 · 1kgに 10倍量の水を加えて、一晩（14〜； 15時間）熱水抽出を行った。得られた抽出液中の不溶物は、遠心分離 (8，000rpm/30min)及びろ過処理により除去した。これらの操作により、コタラヒムブッ熱水エキス末 100gを得た。これに水を添加し、 500mlの水溶液を調製した。その後、攪拌しながら当量のエタノールを添加し、生じた沈殿物は遠心分離 (8，000rpm/ 30min)により除去を行った。得られた上清は、減圧濃縮によりエタノール除去を行つた（収量 69. 0g)。これを用いて再度 500mlの水溶液を調製した後、 HP— 20カラム処理 (使用担体：三菱化学社製合成吸着剤 HP— 20を lkg充填、カラム： 8 X 35cm) を行った。溶出は、水（5U、 20容量％、 40容量％、 60容量％、 80容量％のメタノール水溶液 (各 2. 5Uを用いて、ステップワイズ溶出を行い、水溶出画分（「HP— 20 W」画分；収量 34. lg)、 20容量％メタノール画分（「： HP— 20— 20」画分；収量 5. 8 9g)、 40容量％メタノール画分（「： HP— 20— 40」画分；収量 9. 48g)、 60容量％メタノール画分（「HP— 20— 60」画分；収量 4. 85g)、 80容量％メタノール画分（「： HP— 20— 60」画分；収量 0. 67g)を得た（全回収率 86. 0%)。得られた各分画物について、 α—ダルコシダーゼ阻害活性試験を実施した。阻害活性試験は、以下の操作方法に従い実施した。その結果を表 1に示す。

[0028] 〔 a ダルコシダーゼ阻害活性測定（In vitro)〕

(粗酵素溶液の調製）

試薬として、試薬 1 :ラット小腸アセトンパウダー（SIGMA社製）、試薬 2 : l OOmMリン酸カリウム緩衝液（5mMEDTA、 pH7.0)、試薬 3： l OOmMリン酸カリウム緩衝液（0. 1 % Triton, pH7.0)、試薬 4 : 10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0)を用いる。

[0029] まず、試薬 1の 5gに試薬 2の 50mlを加え、氷冷しながらホモジナイズ（1分 X 3回）を行った。得られた溶液を遠心分離（15, 000 X g/60minあるいは 21 , 000 X g/6 Omin)し上清を除去した。その後、沈殿に試薬 3の 50mLを加え、攪拌可溶化させ、 4 °C下に 60分間放置した。これを更に遠心分離（15, 000 X g/90minあるいは 1 10, 000 X g/90min)し、上清を得た。得られた上清について、試薬 4を用いて 24時間透析を行った。透析後に得られた内液を粗酵素溶液として試験に用いた。

[0030] ( a グノレコシダーゼ阻害活性試験）

試験用試薬として、試薬 1：粗酵素溶液、試薬 2 : DMSO、試薬 3 : l OOmMスクロース水溶液（25mMマルトース水溶液）、試薬 4： 2MTris_HCl緩衝液（pH7.0)、試薬 5 ：グルコース CIIテストヮコ一発色液（和光純薬製）を準備した。試験サンプル溶液は、被験物質（l Omg)を DMSO ( 10mUにて溶解させたものを（サンプルの阻害活性の強さに応じて適宜希釈する）用いた。また、 1検体あたり n = 3で測定を行い、検体毎にそれぞれブランクをおいた。次いで、以下の操作により阻害活性を測定した。

[0031] 96穴プレートにサンプル溶液 10 L及び試薬 1の 25 μ Lを加えて恒温槽で 5分間プレインキュペートした。この時、ブランクには試薬 1を添加する前に、反応が進行しないよう試薬 4の 50 Lをカロえておく。その後、試薬 3の 20 Lを加えて反応を開始する。 [0032] 反応開始 30分後、ブランク以外の反応液に試薬 4の 50 μ Lを添加し反応停止させた。それから、各反応液に試薬 5の 1 50 Lを加えて 10分間発色させた後、マイクロプレートリーダーを用いて 492nmにおける吸光度を測定した。得られた測定結果より、下記の式 1にて阻害率を算出した。

阻害率（％) = { (GlcO - Glcx)/GlcO } X 100 · · · ·式 1

ただし、 GlcO :コントロール（サンプルと同量の DMS O)吸光度の平均値（n = 3)より相当するブランクの吸光度の平均値 (n = 3)を差し引いたもの

Glcx：サンプルの吸光度の平均値 (n = 3)より相当するブランクの吸光度の平均値 (n = 3)を差し引いたもの

[0033] [表 1]

HP-20処理後の収量、及び α—ダルコシダーゼ阻害活性（ IC₅₀ )

[0034] 表 1から理解されるように、エキス内の阻害活性成分は、殆んどが水溶出画分に回収されており、メタノール濃度を高めるに従って阻害活性は低下していった。 60容量 %以上の濃度では阻害活性が認められなくなった。そこで、顕著な活性が認められた HP— 20W画分について更に分離を進めることとした。

[0035] 〔コタラヒムブッ粗分画物の分画'精製〕

分画物を 200mLの水溶液とした後、当量のエタノールを添加攪拌し不溶部分を遠心除去した（7 , 500rpm/30min)。得られた上清は、減圧濃縮によりエタノールを除去した。これを 40mLの水溶液とし、ァミノカラム (使用担体：富士シリシァ化学社製 N H- DM 1020SGを 950g充填したカラム： 8 X 49cm)にアプライした。

[0036] 溶出は、 80容量％ (6L)、 70容量％ (9L)、 60容量％、 40容量％、 20 %容量ァセトニトリル水溶液（各 6L)、水（12Uを用いて、ステップワイズ溶出を行い、 80容量％ァセトニトリル溶出画分（「80%CN」画分；収量 4. 43g)、 70%ァセトニトリル溶出画分（「70%CN」画分；収量 12. 10g)、 60%ァセトニトリル溶出画分（「60%CN」画分；収量 2· 78g)、 40%ァセトニトリル溶出画分（「40%CN」画分；収量 6· 75g)、 20% ァセトニトリル溶出画分（「20%CN」画分;収量 1. 90g)、水溶出画分（「W」画分; 4. 20g)を得た (全回収率 94. 3%)。得られた各分画物について、上記方法にて α— ダルコシダーゼ阻害活性試験を実施した。その結果を表 2に示した。

[表 2] ァミノカラム処理分画物の α—ダルコシダーゼ阻害活性（ IC₅₀ )

[0038] 試験結果より、 70%CN画分以外の溶出部分では殆んど阻害活性が認められず、主要な阻害活性成分は 70%CN画分に存在していることが明らかとなった。尚、前処理時に生じた沈殿にっレ、て、阻害活性試験を実施したところ活性は認められなかつた。

[0039] 次に、この分画物を用いて HPLC分取を行った。分取条件は、使用カラム： YMC p ack polyamine— 11 (20 250111111)、移動相：65容量％ァセトニトリル、流速： 4. 5mL /min、カラム温度：30°C、検出器: RIで行った。分離用サンプルは、移動相溶媒に溶解したものを用いた。しかし、この時大量の白色沈殿が生じたため、これを遠心除去した後得られる上清部分を使用した（白色沈殿にっレ、て、阻害活性試験を実施したところ活性は認められな力、つた）。このときに得られた HPLC溶出液から、それぞれ Frl (7— 15min/収量 433. Omg)、 Fr2 (25— 35min/収量 1744. 0mg)、 Fr3 ( 35— 40min/収量 526. 7mg)、 Fr4 (40— 50min/収量 256. 7mg)、 Fr5 (53— 57min/収量 33. 6mg)と 5つの分画物を得た。このときの HPLCチャートを図 1に示す。更に、カラム吸着成分の回収のために 20容量％ァセトニトリル水溶液にて洗浄を行った（全回収率 88. 2%)。得られた分画物について、上記方法にて《—ダルコシダーゼ阻害活性試験を実施した。その結果を表 3に示した。

[表 3]

HPLC分画物の α—ダルコシダーゼ阻害活性（ IC₅₀ )

[0041] 表 3から理解されるように、 Frl及び Fr3〜5について阻害活性が認められ、 Fr²及び 20%ァセトニトリル回収部においては、全く阻害活性が認められなかった。 Fr3〜 5においても比較的強い阻害活性が認められた力特に Frlが強い阻害活性を示しすこことから、これを更に分離していくこととした。なお、移動相として 50〜70容量％ァセトニトリル水溶液を用いることによつても Frlを分離することができる。この場合保持時間が変動するが 10〜25min以内のピークを回収することで他の活性成分画分（F r3〜5)と分離できる。

[0042] YMC pack polyamine— IIカラムでは、図 1に示したスペクトルの通り、ピークがブロードになることから更に分離していくことは非常に困難であると考え、次に使用カラムを ODSに変更し、さらに分画を進めた。

[0043] 分取条件は、使用カラム： DAISOPAK SP-120-5 - ODS_BP (20 X 250mm)、移動相：水、流速： 5. OmL/min,カラム温度： 30°C、検出器： RIで実施した。得られたスぺクトルより、 ODSFrl (10— 10· 7min/収量 230· 4mg)、 ODSFr2 (10· 7— 11 • 2min/5. 8mg)、 ODSFr3 (11. 2— 13min/70. 8mg)と 3つの分画物を得た。これらの分画物につ!/、て阻害活性試験を実施した。その結果を表 4に示す。

[0044] [表 4] HPLC分画物の ccーグルコシダーゼ阻害活性（ ICso )

[0045] 〔分画 ·精製物の構造決定〕

ODSFr2画分についてさらに数回同様の分取操作を繰り返してほぼ単一の物質を得た。この物質の構造を明らかとするために各種 NMR分析 ^H、 ¹³C、 'H- 'HCOS Y、 ^1^ (3じ及び^1^[8じ）並びに？八：6— ^[3分析を実施し、得られた各種スペクトルデータを用いて構造解析を行った。 NMR分析（1D—及び 2D—）は、分析装置: JN M AL— 400 (日本電子製、 400MHz)、溶媒： D O (内部標準試薬としてアセトン

2

を使用）、分析温度： 25°Cにて行った。 FAB— MS分析は、分析装置： 7000QQ型（日本電子製）、イオン化法：高速原子衝撃法 (FAB)、加速電圧： 6kV、マトリックス：グリセリン、測定質量範囲：〜 m/zl000にて実施した。図 2に¹ H— NMRスペクトル（ inD O/400MHz)を、図 3に¹³ C— NMRスぺクトノレ（inD O/400MHz)を、図 4

2 2

に FAB— MSスペクトルを示した。

[0046] 以上の結果を基に、解析を行った結果、 ODSFr2から得られた成分は図 5に示すようなスルフォキシドを有するシクリトールであることが示唆された。し力、し、得られたスぺクトルデータからでは、スルフォキシドの存在を確認することが出来ないことから、更に HR— MS分析により、元素組成を明らかにすることとした。分析装置: JMS—T1 00LC (日本電子製）、イオン化法： APCI、測定質量範囲：〜 m/z 1000の分析条件にて実施した。この分析から、表 5に示す結果が得られた。

[0047] [表 5] 本発明成分の APCI— MS分析結果

以上のことより、図 5に示した構造との整合性が得られたことから、 ODSFr2で得られた成分は、次の化学式 (化 1)に示すようにスルフォキシドを有する 13員環シクリトール構造であることが明らかとなった。

[0049] [化 1]

[0050] さらに IR分析を実施し、官能基の確認を行った。分析装置: JASCO FT/IR-460 plu s infrared spectrometer,分析法： KBr法の分析条件にて実施した。測定の結果、スルフォキシドを示す 1071CHT¹の吸収バンドが検出された。これにより、スルフォキシドが分子内に含まれることが確認された。

実施例 2

[0051] 〔糖負荷試験 (スクロース負荷試験）による活性評価〕

飼育環境は、明喑周期（7 : 00— 19 : 00照明 ONの 12時間周期）、温度 23〜25°C

、湿度 60〜70%条件下で、 5週齢の Wistarラット（雄性）を用い、試験前に 1週間予備飼育を行った。予備飼育期間中、飼料、及び飲料水はともに自由摂取とした。

[0052] 群分けは、体重及び血糖値を基準に各群 6匹、計 4群に分けた。投与群はそれぞれ対照群 (精製水）及び α —ダルコシダーゼ阻害剤投与群（0. 15、 0. 30及び 0. 4

5mg/kg)とした。

[0053] 糖負荷試験は、各群にスクロース（2. 5g/kg)を経口投与し、糖負荷前（0分後）、

60及び 120分後に尾静脈より採血を行った。尚、 α —ダルコシダーゼ阻害剤はスクロース溶液に溶解し、同時投与を行った。グルコース CIIテストヮコー（和光純薬製）を用いて、得られた血清中の血糖値の測定を行った。対照群の血糖を対照にして、 Du nnett多重比較検定によって有効性評価を実施した。その結果を表 6及び図 6に示す。表 6の数値は平均値土標準偏差である。表 6及び図 6には、対照群に対し、 pく 0. 0 5で有意差があった場合には「*」が、 pく 0. 01で有意差があった場合には「* *」が示されている。

[0054] その結果、 0. 15mg/kgの阻害剤投与群では対照群と比較して糖負荷 60分後の血糖値で差は認められなかった力 0. 30及び 0. 45mg/kgの投与群は危険率 5 %及び 1 %で有意な低値を示しており、糖吸収抑制作用が確認された。

[0055] [表 6]

糖負荷試験 (スクロース)結果

血糖値 (mgZdL) :平均値土榡準偏差

*: p<0.05； **: p<0.01 vs 対照群実施例 3

[0056] 〔糖負荷試験 (マルトース負荷試験）による有効性評価〕

試験方法は、実施例 2と同条件にて実施した。投与群はそれぞれ対照群 (精製水）及び α —ダルコシダーゼ投与群（0· 30、 0. 60及び 0. 90mg/kg)とした。

[0057] 糖負荷試験は、各群にマルトース（2. 5g/kg)で経口投与し、糖負荷前（0分後）、

60及び 120分後に尾静脈より採血を行い、得られた血清を用いて血糖値の測定を行った。尚、 α—ダルコシダーゼ阻害剤は、マルトース溶液に溶解し、同時投与を行つた。グルコース CIIテストヮコー（和光純薬製）を用いて、得られた血清中の血糖値の測定を行った。対照群の血糖を対照にして、 Dunnett多重比較検定によって有効性評価を実施した。その結果を表 7及び図 7に示す。表の数値は平均値土標準偏差である。表 7及び図 7には、対照群に対し、 pく 0. 1で有意差があった場合には「a」が、 p〈0. 05で有意差があった場合には「*」が、 pく 0. 01で有意差があった場合には「 * *」が示されている。

[0058] その結果、 0. 30mg/kg投与群は対照群と比較して 60分後血糖値が低下傾向（p く 0. 1)を示すに止まったが、 0. 60及び 0. 90mg/kg投与群においては危険率 1 % で有意な低値を示しており糖吸収抑制作用が確認された。このように、ラットに対しても有効な抗糖尿病作用を示すことが明らかとなった。

[0059] [表 7]

糖負荷試験 (マルトース)結果

血糖値 (mgZdL) :平均値土棵準偏差

a : p<0.1 ; * : p<0.01 ； **: p<0.01 vs 対照群

[0060] 〔分画'精製物の活性比較〕

上記構造決定された α —ダルコシダーゼ阻害剤について、コタラヒムブッから得られた既報成分 (非特許文献 26から引用）及び医薬品として販売が認められているボダリボースとその活性を比較した。その結果を表 8に示す。この表から分かるように、上市されているボグリボースとほぼ同程度の活性強度を示し、同じ植物から得られた既報成分と比較して、マルターゼ阻害で約 7；!〜 103倍、スクラーゼ阻害では約 19〜 34倍もの阻害活性強度を示した。また、糖負荷試験による評価においても既報成分以上の低用量にて、糖吸収阻害作用を示した。このように、本発明による α —ダルコシダーゼ阻害剤は、既報成分をはるかに凌ぐ阻害活性を示す成分であることが明ら力、となり、コタラヒムブッ抽出物における主たる活性成分であると考えられる。

[0061] [表 8] 本発明成分との α-ダルコシダーゼ阻害活性比較（ IC₅₀ )

1) 薬学雑誌 121(5), ρ371— 378( 2001 )より引用。

2) ベイスン OD錠 0.2 (武田薬品工業株式会社製）を用い、弊社にて試験実施。

括弧内のモル濃度は、分子量を基に算出。

[0062] 以上のように、化学式 (化 1 )で示される化合物は優れた α —ダルコシダーゼ阻害活性を有していることが確認された。この化合物の α —ダルコシダーゼ阻害活性は、これまで報告がなされているコタラヒムブッ中に存在しているサラシノールゃコタラノールに比べるとかなり高い比活性を有し、コタラヒムブッ抽出物中における本発明に係る化合物の寄与率は高レ、ものと考えられる。

実施例 4

[0063] 次に、この成分を使った処方例を示す。

〔製造例 1 :錠剤〕

本発明の α —ダルコシダーゼ阻害剤 0. 07g

マルトシルサイクロデキストリン 600g

ショ糖脂肪酸エステル 50g

炭酸カルシウム 15g

還元麦芽糖水あめ 75g

無水乳酸 1 10g

結晶セルロース 100g

ミルクカルシウム 50g

上記処方に従って、常法に従!/、錠剤 5000錠を製造した。

〔製造例 2 :キャンディー〕

本発明の α —ダルコシダーゼ阻害剤 1. 0g

砂糖 120g

水あめ 100g i 4g

香料 0. 4g

上記処方に従って、常法に従いキャンディー 50個を製造した。

[0065] 〔製造例 3 :清涼飲料（500mU〕

クェン酸 0. 2g

果糖ブドウ糖液糖 25g

香料適量

本発明の α —ダルコシダーゼ阻害剤 0. 5mg

水適量

上記処方に従って、常法に従!/、清涼飲料水 500mLを製造した。

[0066] 〔製造例⁴ :ソフトカプセル〕

(内容物）

サフラワー油 88 · 0質量％

乳化剤 1 1. 8質量％

本発明の α —ダルコシダーゼ阻害剤 0. 2質量⁰ /₀

上記処方による内容物とゼラチンを主成分とする剤皮を用い、常法に従ってソフトカプセルを製造した。

産業上の利用可能性

[0067] 本発明の化合物は、新規でかつ活性の高い α —ダルコシダーゼ阻害作用を有し、これにより、抗糖尿病患者や糖尿病予備群の人に対してより有効な抗糖尿病薬ゃ特定保健用食品などが提供される。

Claims

請求の範囲次の化学式 (化 1)で示される化合物。

[化 1]

[3] 請求項 2に記載の α —ダルコシダーゼ阻害剤と薬理学的に許容される担体とからなる医薬組成物。

[4] 請求項 2に記載の α —ダルコシダーゼ阻害剤と栄養学的に許容される担体とからなる食品組成物（ただし、請求項 2に記載の α—ダルコシダーゼ阻害剤を含むように調整された天然物由来の抽出物を含有する食品組成物は除く）。

[5] 次の化学式 (化 1 )で示される化合物の α —ダルコシダーゼ阻害剤若しくは抗糖尿病薬としての使用。

[化 1]