WO2008047656A1 - Procédé de fabrication d'un acide l-amino - Google Patents

Procédé de fabrication d'un acide l-amino Download PDF

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WO2008047656A1
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Hiroyuki Kanamaru
Makoto Ueda
Hirokazu Nanba
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Kaneka Corporation
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an L amino acid useful as an intermediate for pharmaceuticals and the like. More specifically, in a reaction in which amino acid dehydrogenase and an enzyme capable of coenzyme regeneration are allowed to act on the corresponding keto acid to convert to L amino acid, the coenzyme is divided into two or more times and added.
  • the present invention relates to a method for producing an L amino acid.
  • L-amino acids are useful compounds as synthetic intermediates for pharmaceuticals and the like.
  • various methods such as extraction methods, chemical synthesis methods, fermentation methods, and enzymatic synthesis methods are known.
  • the extraction method requires large-scale purification equipment from protein hydrolysates. Since amino acids produced by chemical synthesis are usually racemic, an expensive resolving agent, asymmetric catalyst, etc. are required to produce optically active substances. Fermentation methods require large-scale purification equipment, as with extraction methods with low product concentrations, and are not suitable for the synthesis of unnatural amino acids.
  • the enzymatic synthesis method can avoid these problems by using an inexpensive biocatalyst, and can provide an efficient production method at a lower cost.
  • Non-patent Document 1 a method of producing L amino acid by reacting the corresponding keto acid with an amino acid dehydrogenase and an enzyme having a coenzyme regeneration ability (Non-patent Document 1) is known.
  • Non-patent Document 1 a method of producing L amino acid by reacting the corresponding keto acid with an amino acid dehydrogenase and an enzyme having a coenzyme regeneration ability
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-23896
  • Patent Document 2 International Publication No. WO95 / 093081 Pamphlet
  • Non-patent document 1 Ramesh Pat Patel, ⁇ Enzymatic synthesis of chiral intermediates for Om apatrilat, an antihypertensive drug '', Ny Biomolecular Engineering, 2001, No. 17, p. 167
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing an L amino acid in the above reductive amination reaction regardless of the purity of the substrate.
  • the present invention has the following features.
  • R is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent, V having a substituent, may be! /, An aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms, or a substituent. ! /, May! / Represents an aryl group having 6 to 20 carbon atoms), and an enzyme having amino acid dehydrogenase and coenzyme regeneration ability is allowed to act on the keto acid represented by And general formula (2):
  • one feature of the present invention is a method for producing the above L amino acid, wherein the purity of keto acid is 95% or less.
  • One feature of the present invention is the method for producing the above L-amino acid, wherein the amount of coenzyme added at the start of the reaction is 3/4 or less of the total amount added through the reaction. .
  • one feature of the present invention is the method for producing the above L amino acid, wherein the amount of coenzyme added at one time is less than or equal to half of the total amount of added calories throughout the reaction.
  • One feature of the present invention is a method for producing the above L amino acid, in which a coenzyme is continuously added.
  • the present invention has the above-described configuration, and can efficiently produce an L amino acid regardless of the purity of the substrate keto acid.
  • R is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent, may have a substituent, or may be! /
  • a substituent having a substituent! / Represents an aryl group having 6 to 20 carbon atoms).
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent in R is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, an isopropyl group, an isobutyl group, a 1 methylpropyl group, and a strong rubamoylmethyl group.
  • 2-force rubermoylethyl group hydroxymethyl group, 1-hydroxyxetyl group, mercaptomethyl group, 2-methylthioethyl group, (1 mercapto 1-methyl) ethyl group, 4 aminobutyl group, 3-guanidinopropyl group, 4 (5) -Imidazolemethyl group, ethyl group, npropyl group, nbutyl group, tbutyl group, 2,2-dimethylpropyl group, chloromethyl group, methoxymethyl group, 2hydroxyethyl group, 3aminopropyl group 2 cyanoethyl group, 3 cyanopropyl group, 4 (benzoylamino) butyl group, or 2-methoxycarbonylethyl group It is below.
  • the aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms which may have a substituent is not particularly limited, and examples thereof include benzyl group, indolylmethyl group, 4-hydroxybenzyl group, 2 fluorobenzyl group, 3 —Fluorobenzyl group, 4 fluorobenzyl group, 3,4-methylenedibenzyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the aryl group having a substituent may include a phenyl group or a 4-hydroxyphenyl group.
  • Examples of the substituent include an amino group, a hydroxyl group, a nitro group, a cyan group, a carboxy group, an alk quinol group, an aralkyl group, a aranol group, an alkanol group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, or a halogen atom Etc.
  • the keto acid may contain impurities such as by-products when the keto acid is produced, and decomposition products of the keto acid.
  • impurities include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid; formic acid Organic acids such as acetic acid; metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium, iron, lithium, mangan, zinc, copper and their salts; methanol, ethanol, ethyl acetate, acetone, toluene, chloroform, n
  • Organic solvents such as hexane can be mentioned.
  • the productivity of the reaction may be reduced (see Reference Example 1 and Comparative Example 1). reference).
  • Examples of a decrease in reaction productivity include a decrease in the yield of L-amino acid produced and an increase in reaction time.
  • the purity of the keto acid described here indicates the ratio of the weight of the keto acid contained in the keto acid product to the dry weight of the keto acid product.
  • An amino acid dehydrogenase is an enzyme having an activity to reductively aminate keto acid or cyclic imine.
  • phenylalanine dehydrogenase, leucine dehydrogenase, pyrroline 2-power rubonate reductase, etc. The power to raise S.
  • coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert this oxidized coenzyme into a reduced form (hereinafter referred to as coenzyme regeneration ability) and a compound serving as a substrate for the enzyme having the coenzyme regeneration ability coexist with an amino acid dehydrogenase.
  • coenzyme regeneration ability an enzyme having the ability to convert this oxidized coenzyme into a reduced form
  • a compound serving as a substrate for the enzyme having the coenzyme regeneration ability coexist with an amino acid dehydrogenase.
  • Examples of the enzyme having coenzyme regeneration ability include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose 6-phosphate dehydrogenase. Or glucose dehydrogenase.
  • formate dehydrogenase is used.
  • amino acid dehydrogenase and the enzyme having the ability to regenerate coenzyme used in the present invention those derived from animals, plants, and microorganisms can be used.
  • microorganisms capable of producing amino acid dehydrogenase include, for example, the following known microorganisms capable of producing the enzyme, genus Brevibacterium, Rhodococcus, Sporosanoresina (Siporosarcina), Thermoactinomy
  • Examples include microorganisms belonging to the genus (Halomonas), the genus Clostridium, the genus Bacillus, the genus NeurosiDora, the genus Escherichia, or the genus Aerobacte.
  • an enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus is used. More preferably, an enzyme derived from Bacillus badius IAM11059 or Bacillus sphaericus NBRC3341 is used.
  • Easfc bafc IAM11059 is a microorganism that produces phenylalanine dehydrogenase, and is known in EP256514 and Bisci. Biotechnol. Biochem., 1995, 59, 10, 1994. is there.
  • the Bacillus siohaericus NBRC3341 strain is a microorganism that produces leucine dehydrogenase, and has the same number of amino acid residues as the known leucine dehydrogenase of Bacillus subtilis. 100% —matches in the array. In the gene sequence, 14 bases are different in 1095 bases.
  • microorganisms having the ability to produce formate dehydrogenase include the following known ones: Candida, Pecka, Pichia, Lioomvces, Pseudom onas, Moraxella, noisy, and other microorganisms that are capable of producing enzymes. Examples include microorganisms belonging to the genus Hviphomicrobium, the genus Paracoccus, the genus Thiobacillus, and the genus ⁇ ⁇ cvlobacter.
  • an enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Thiobacillus or the genus Ancylobacter is used. More preferred is an enzyme derived from Thiobacillus s KNK65MA strain (FERM BP-7671) or Ancvlobacter aauaticus KNK607M strain (FERM BP-7335).
  • a transformed microorganism In order to obtain a highly active bacterium that efficiently and highly produces each of the above enzymes, it is effective to produce a transformed microorganism as is well known.
  • a method for preparing a transformed microorganism for example, after cloning a leucine dehydrogenase gene from a strain exhibiting leucine dehydrogenase activity, a recombinant plasmid with an appropriate vector is prepared, and this is used.
  • a plasmid, phage or derivative thereof derived from a microorganism capable of autonomous replication in a host can be used.
  • bacteriological properties are well known to those skilled in the art and provided for transformation! /
  • Escherichia coll is selected and used as a vector in the microorganism. It is preferable to use a vector that can replicate autonomously.
  • Examples of such vectors include pUC18 (Takara Bio Inc.), pUC19 (Takara Bio Inc.), pBR322 (Takara Bio Inc.), pACYC184, which are readily available to those skilled in the art or are commercially available. (Tatsubon Gene Co., Ltd.), pSTV28 (Takara Bio Inc.), pSTV29 (Takara Bio Inc.), pSClOl (Funakoshi Co., Ltd.), pT7Blue (Takara Bio Inc.), or International Publication No.
  • WO94 / 03613 pamphlet It is possible to list pUCNTs or their derivatives that can be manufactured by those skilled in the art based on the description in this specification. [0041] These derivatives are genes related to promoters, terminators, enhancers, SD-directed 1], replication initiation sites (ori), and other regulatory functions for the purpose of increasing enzyme production and stabilizing plasmids. It also refers to a modified version of the drug, drug resistance, and a modified restriction enzyme site at the cloning site.
  • Escherichia coli HB101 containing a formate dehydrogenase gene derived from Thiobacil lus sp. KNK65MA strain (FERM BP-7671) was used.
  • pFTOOl (FERM BP-7672) or Escherichia coli HB101 (pFT002) (FERM BP-7673) (see International Publication No. WO03 / 031626 pamphlet).
  • the recombinant DNA technology used in the present invention is well known in the art, and includes, for example, Molecular Cloning 2 ⁇ Edition (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989), urrent Protocols in Molecular Biology (reene Publishing Associates and Wiley-Interscience).
  • the enzyme By culturing the above transformant and the like, the enzyme can be produced in large quantities.
  • Microorganisms may be cultured using a normal medium.
  • the medium used for the culture may be a normal medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts. Addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids to these often gives favorable results.
  • a carbon source carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols and the like are appropriately used.
  • nitrogen source ammonium salt, aqueous ammonia, ammonia gas, urea, yeast extract, peptone, corn steep liquor, etc. are used.
  • inorganic salts include phosphate, magnesium, potassium, sodium, calcium, iron, sulfate, and chlorine.
  • the culture is particularly preferably performed at a temperature ranging from 25 ° C to 40 ° C and from 25 ° C to 37 ° C.
  • the pH can be cultured from 4 to 8, but 5 to 7.5 is preferable.
  • either a batch or continuous culture method may be used.
  • keto acid the above-mentioned amino acid dehydrogenase, an enzyme capable of coenzyme regeneration, and a compound serving as a substrate thereof are simultaneously present, and the reaction is carried out in an aqueous medium.
  • amino acid dehydrogenase and the enzyme having a coenzyme regeneration ability used in the present invention may be those produced by culturing microorganisms having respective activities, Alternatively, a product obtained by breeding and cultivating a transformant introduced with each enzyme gene may be used, or a product obtained by breeding, cultivating and cultivating a transformant introduced with a plurality of enzyme genes. May be used.
  • the produced amino acid dehydrogenase and the enzyme having a coenzyme regeneration ability can be used not only as the enzyme itself, but also as a microorganism or a processed product thereof.
  • the processed microorganism product is, for example, a crude extract, a cultured cell freeze-dried organism, an acetone-dried organism, or a crushed product of these cells, and has the desired enzyme activity! / Means something.
  • Immobilized enzymes obtained by immobilizing the enzyme itself or the cells in a known manner. Immobilization can be performed by a cross-linking method, a covalent bonding method, a physical adsorption method, an entrapment method and the like, which are well known to those skilled in the art.
  • the addition of a coenzyme such as NAD to the reductive amination reaction can be expected to improve the efficiency of the reaction.
  • concentration of the coenzyme such as NAD is preferably (more than 0.001 equivalents and less than 2 equivalents, more preferably less than (equivalent to more than 0.0001 equivalents, less than 0.1 equivalents, more preferably less than the substrate).
  • the upper limit of the amount of coenzyme added is not particularly limited, but is usually 2 equivalents or less, preferably 0.1 equivalents or less, more preferably 0, from the economical viewpoint. .01 equivalent or less.
  • the amount of coenzyme added at the start of the reaction is preferably 3/4 or less of the total amount added through the reaction, more preferably 3 minutes. It is 2 or less, more preferably 1/2 or less, particularly preferably 1/3 or less, and 1/4 or less.
  • the amount added once is not more than two-thirds of the total amount added through the reaction, more preferably not more than one-half, Preferably it is 1/3 or less, particularly preferably 1/4 or less.
  • the number of coenzyme additions is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, and further preferably 4 times or more.
  • the coenzyme can be added continuously during the reaction.
  • the productivity improvement effect of the reaction by dividing the coenzyme as described above is effective when the substrate purity is 95% or less, more effective when it is 90% or less, and 85% or less. This is especially useful for cases.
  • the concentration of the keto acid which is a substrate for the above reductive amination reaction is 0.1% ( W / v) or more, 90% (w / v) or less, preferably 1% (w / v) or more, 60
  • the reaction is performed in a dissolved or suspended state at a concentration of% (w / v) or less, and the reaction temperature is adjusted to an appropriate temperature of 10 ° C or higher and 80 ° C or lower, preferably 20 ° C or higher and 60 ° C or lower. What is necessary is just to stand still for a while or to stir, keeping.
  • the pH of the above reaction is preferably 4 or more and 12 or less, more preferably pH 6 or more and 11 or less.
  • the pH can be adjusted by adding an acid or a base.
  • the substrate for this reaction may be added all at once, dividedly or continuously.
  • the reductive amination reaction can be performed in a batch method or a continuous method.
  • the reductive amination reaction of the present invention can also be performed using an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
  • the aqueous medium include water, a buffer solution, an aqueous medium containing a water-soluble organic solvent such as ethanol, or an organic solvent that is difficult to dissolve in water, for example, ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n
  • An aqueous medium containing an organic solvent such as hexane A suitable solvent such as a two-phase system can be used.
  • antioxidants, surfactants, metals, etc. can be added as necessary.
  • Isolation of the L amino acid produced by the reductive amination reaction as described above may be performed by a conventional separation method, for example, a separation method such as extraction, concentration, crystallization, column chromatography, or a combination thereof. Power to refine, S can.
  • Transformants having leucine dehydrogenase activity and formate dehydrogenase activity bred by the method shown in Reference Example 4 described later were sterilized with medium A (tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0 5%, ampicillin 0.01%, dissolved in deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin is added after sterilization) and shaken at 33 ° C for 48 hours for aerobic Cultured.
  • medium A tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0 5%, ampicillin 0.01%, dissolved in deionized water, pH 7.0 before sterilization, but ampicillin is added after sterilization
  • the cells were collected by centrifugation and suspended in deionized water to obtain a cell concentrate.
  • trimethinolevinolevic acid having a purity of 83. 2%
  • the above cell concentrate and 1.4 molar equivalents of ammonium formate of trimethylpyruvic acid were added, and 5M aqueous ammonia was further added.
  • deionized water was added to prepare a reaction solution to 2 ml.
  • NAD was added to this reaction liquid so that it might become 0.0009 molar equivalent of trimethylpyruvic acid, and it stirred at 30 degreeC, and reacted for 21.5 hours.
  • a cell concentrate of a transformant having the same amount of leucine dehydrogenase activity and formate dehydrogenase activity as in Comparative Example 1 was added to 96.2 mg of 83.2% pure trimethylpyruvic acid used in Comparative Example 1.
  • NAD was added to this reaction solution so as to have a molar equivalent of 0.0003 mol of trimethylpyruvic acid, and the mixture was stirred at 30 ° C.
  • NAD was added in an amount of 0.0003 mole equivalent of the substrate at 3 hours and 6 hours from the start of the reaction, and the reaction was continued up to 21.5 hours.
  • a cell concentrate of a transformant having the same amount of leucine dehydrogenase activity and formate dehydrogenase activity as in Comparative Example 1 was added to 88.2 mg of 98.5% trimethylpyruvic acid, and 1. 4 molar equivalents of ammonium formate were added, and 5M aqueous ammonia was added to adjust the pH to 8.0, and then deionized water was added to prepare a reaction solution to 2 ml. [0075] NAD was added to the reaction solution so as to have a substrate equivalent of 0 ⁇ 0009 monorequivalent, stirred at 30 ° C, and allowed to react for up to 22 hours.
  • DNA primers (Primer-1: SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and Primer 2: SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) PCR was performed.
  • PCR is performed by using PyrobestDNA polymerase (Takara Bio Inc.) 1.2 5U (0.25 1), l OX Pyrobest Bufferll (Takara Bio Inc.) 5 1, 2.5 mM each dN TP solution 4 Add 20 H primer aqueous solution 2 H 1 each, and then add sterilized water to prepare a reaction solution prepared to a total volume of 50, heat denaturation (96 ° C, 30 seconds), filing (50 (° C, 30 seconds) and extension reaction (72 ° C, 90 seconds) were repeated 25 cycles and then cooled to 4 ° C.
  • DNA fragment obtained by PCR was cleaved with restriction enzymes Ndel and EcoRI, and vector plasmid pUCNT cleaved with the same enzymes (manufactured by a person skilled in the art based on the description in the specification of International Publication No. WO94 / 03613) ) And T4 DNA ligase to obtain a plasmid designed to express a large amount of formate dehydrogenase.
  • a transformant having formate dehydrogenase activity was bred by mixing the resulting plasmid with Escherichia coli HB101 combinatorial senore and performing transformation.
  • the obtained transformant was inoculated into 6 ml of medium A sterilized in a test tube, and then aerobically cultured by shaking at 37 ° C for 24 hours.
  • Plasmid extraction was performed using Kit (manufactured by QIAGEN), and a plasmid designed to express a large amount of formate dehydrogenase was recovered.
  • a DNA fragment obtained by PCR was cleaved with restriction enzymes EcoRI and Sacl, and a person skilled in the art based on the description in the specification of vector plasmid pUCT (pUCNT (International Publication No. A plasmid vector designed to express a large amount of oral isine dehydrogenase by ligating it with T4 DNA ligase. .
  • a transformant having leucine dehydrogenase activity was bred by mixing and transforming the obtained plasmid with a combination senor of Escherichia coli HB101.
  • the obtained transformant was inoculated into 6 ml of medium A sterilized in a test tube, and then aerobically cultured by shaking at 37 ° C for 24 hours.
  • the cells are collected from the obtained culture broth by centrifugation, and QIAprep Spin Miniprep
  • Plasmid extraction was performed using Kit (manufactured by QIAGEN), and a plasmid designed to express a large amount of leucine dehydrogenase was recovered.
  • the plasmid designed to express a large amount of the leucine dehydrogenase obtained in Reference Example 3 was cleaved with restriction enzymes EcoRI and Pstl, and a DNA fragment containing the leucine dehydrogenase gene was removed from TaKaRaRECOCHIP (Takara Bio Inc. ).

Description

明 細 書
L一アミノ酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、医薬品等の中間体として有用な、 L アミノ酸の製造法に関する。より詳 細には、対応するケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を 作用させて L アミノ酸に変換する反応において、補酵素を 2回以上に分割して添カロ することを特徴とする L アミノ酸の製造方法に関する。
背景技術
[0002] L アミノ酸は医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。 L アミノ酸の製 造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成法など種々の方法が知 られている。抽出法では蛋白質加水分解物からの大規模な精製設備が必要となる。 化学合成法で製造されるアミノ酸は通常ラセミ体であるため、光学活性体を製造する には、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。発酵法では生成物濃度が低ぐ抽 出法同様大規模な精製設備を必要とし、また、非天然型のアミノ酸の合成には適し ていない。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を 回避して、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。 L アミノ酸の酵素 的合成法としては、例えば対応するケト酸にアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生 能を有する酵素を作用させて L アミノ酸を製造する方法 (非特許文献 1)が知られて いる。しかし、上記の方法では、高価な市販酵素や微生物から精製された酵素を使 用する必要があり、工業的に使用するには課題を抱えていた。
[0003] このような課題を解決するための手段として、これらの酵素をコードする DNAを遺 伝子組換え手法を用いてクローン化して形質転換体を育種し、該形質転換体を培養 することにより、各酵素を高生産する試みがなされている。例えば、補酵素依存性アミ ノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体 を育種、培養し、ケト酸に作用させて L—アミノ酸を製造する方法が知られている（特 許文献 1、 2)。しかし上記特許文献 1に記載されている反応により生成する Lーァミノ 酸の濃度は約 10mMと工業的に製造を行なうには低い濃度である。また、特許文献 2に記載されている方法では、ケト酸を分割、あるいは連続的に添加することにより反 応液中のケト酸の濃度を一定値以下に保つ必要がある。
特許文献 1 :特開平 10— 23896号公報
特許文献 2 :国際公開第 WO95/093081号パンフレット
非特許文献 1 :ラメシュ · Ν ·パテル (Ramesh Ν· Patel)、「抗高血圧薬ォマパトリラットの 光字活性中間体の酵素的合成」 (Enzymatic synthesis of chiral intermediates for Om apatrilat, an antihypertensive drug)、ノ ィ才モレキュフー 'ュンンニノリング (Biomolec ular Engineering), 2001年、 17号、 167頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明者らは還元アミノ化反応において、純度の低いケト酸を基質として使用する と、反応の生産性が低下する場合があることを見出した。
[0005] 本発明の目的は、上記還元アミノ化反応において基質の純度にかかわらず効率的 な L アミノ酸の製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、対応するケト酸にアミノ酸脱水 素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させることにより L アミノ酸に変換 する反応（還元アミノ化反応）を行う際に、反応液中に補酵素を 2回以上に分けて添 加することにより、低純度のケト酸を基質として使用した場合に生じる L アミノ酸の 収率低下等による生産性の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至 つた。
[0007] すなわち本発明は、以下の特徴を有する。
本発明の一つの特徴は、一般式（1)：
[0008] [化 3]
Figure imgf000003_0001
R CO2H ( 1 ) (式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ!/、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して!/、てもよ!/、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素 再生能を有する酵素を作用させて、一般式 (2)：
[0009] [化 4]
NH2
R 、 CO2H (つ)
(式中、 Rは前記と同じ）で表される L アミノ酸に変換する反応において、補酵素を 2 回以上に分割して反応に添加することを特徴とする L アミノ酸の製造方法である。
[0010] また、本発明の一つの特徴は、ケト酸の純度が 95%以下である上記 L アミノ酸の 製造方法である。
[0011] また、本発明の一つの特徴は、反応開始時における補酵素の添加量が、反応を通 じての総添加量の 4分の 3以下である上記 L—アミノ酸の製造方法である。
[0012] また、本発明の一つの特徴は、 1回の補酵素の添加量が、反応を通じての総添カロ 量の 2分の 1以下である上記 L アミノ酸の製造方法である。
[0013] また、本発明の一つの特徴は、補酵素を連続的に添加する上記 L アミノ酸の製 造方法である。
発明の効果
[0014] 本発明は上述の構成からなり、基質であるケト酸の純度にかかわらず L アミノ酸を 効率良く製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形 態および実施例によって限定されるものではなレ、。
[0016] 1.還元アミノ化反応に基質として使用するケト酸の種類
本発明の還元アミノ化反応の基質としては、以下の一般式（1)： [0017] [化 5]
Figure imgf000005_0001
で表される（式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換 基を有してレ、てもよ!/、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して!/、てもよ い炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるケト酸を挙げること力 Sできる。
[0018] 上記 Rにおける置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基としては、特 に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、 1 メチルプロピル 基、力ルバモイルメチル基、 2—力ルバモイルェチル基、ヒドロキシメチル基、 1ーヒド ロキシェチル基、メルカプトメチル基、 2—メチルチオェチル基、 （1 メルカプト 1 ーメチル）ェチル基、 4 アミノブチル基、 3—グァニジノプロピル基、 4 (5)—イミダゾ ールメチル基、ェチル基、 n プロピル基、 n ブチル基、 t ブチル基、 2, 2—ジメ チルプロピル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、 2 ヒドロキシェチル基、 3 アミ ノプロピル基、 2 シァノエチル基、 3 シァノプロピル基、 4 （ベンゾィルァミノ）ブ チル基、又は、 2—メトキシカルボニルェチル基などが挙げられる。
[0019] 置換基を有していてもよい炭素数 7〜20のァラルキル基としては、特に限定されず 、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、 4ーヒドロキシベンジル基、 2 フルォロ ベンジル基、 3—フルォロベンジル基、 4 フルォロベンジル基、又は、 3, 4—メチレ ンジォキシベンジル基等が挙げられる。
[0020] 置換基を有してレ、てもよ!/、炭素数 6〜20のァリール基としては、フエニル基、または 4ーヒドロキシフエニル基などが挙げられる。
[0021] 置換基としては、アミノ基、ヒドロキシノレ基、ニトロ基、シァノ基、カルボキシノレ基、ァ ルキノレ基、ァラルキル基、ァリーノレ基、アルカノィル基、アルケニル基、アルキニル基 、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
[0022] また、上記ケト酸には、該ケト酸を製造する際の副産物、該ケト酸の分解物等の不 純物が混入している場合がある。不純物としては例えば、塩酸、硫酸等の鉱酸;ギ酸 、酢酸等の有機酸；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、リチウム、マン ガン、亜鉛、銅等の金属及びそれらの塩;メタノール、エタノール、酢酸ェチル、ァセ トン、トルエン、クロ口ホルム、 n へキサン等の有機溶媒等を挙げることができる。
[0023] また、分解物としては例えば、当該ケト酸が脱炭酸することにより生成する一般式（3 )：
[0024] [化 6]
R— O H / ' j )
(式中、 Rは前記と同じ）で表されるカルボン酸化合物等を挙げる事ができる。
[0025] このような不純物の混入により純度が低下したケト酸を、後述する還元アミノ化反応 の基質として使用すると、反応の生産性が低下する場合がある（参考例 1、及び比較 例 1を参照）。反応の生産性が低下する例としては、生成する L アミノ酸の収率が低 下する、反応時間が増加する事等が挙げられる。
[0026] ここで述べるケト酸の純度とは、該ケト酸製品の乾燥重量に対する該ケト酸製品中 に含まれるケト酸の重量の割合を示す。
[0027] 2.還元アミノ化反応に使用する酵素
次に還元アミノ化反応に使用する酵素について説明する。アミノ酸脱水素酵素とは 、ケト酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフエ 二ルァラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン 2—力ルボン酸レダクタ一 ゼ等を挙げること力 Sできる。
[0028] これらアミノ酸脱水素酵素による反応は、 NADHのような還元型の補酵素を必要と し、当該反応の進行に伴い、補酵素 NADHは酸化型に変換される。この酸化型の 補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、及び 当該補酵素再生能を有する酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存 させて反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
[0029] 補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース 6—リン酸脱水素酵素 、又はグルコース脱水素酵素等を挙げることができる。好適には、ギ酸脱水素酵素が 使用される。
[0030] 本発明で用いるアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素としては、動 物、植物、微生物由来のものが使用できる力 工業的な利用には微生物由来のもの が好ましい。
[0031] アミノ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当 該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバタテリゥム (Brevibacterium)属、 ロドコッカス (Rhodococcus)属、スポロサノレシナ（Siporosarcina)属、サーモアクチノマイ
(Halomonas)属、クロストリジゥム（Clostridium)属、バチルス（Bacillus)属、ニューロス ボラ（NeurosiDora)属、ェシェリヒア（Escherichia)属、又は、ァェロノ クタ一（Aerobacte £)属に属する微生物等が挙げられる。
[0032] 好ましくはバチルス (MlM)属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに 好ましくは、バチルス パディウス（Bacillus badius) IAM11059、又は、バチルス ス ファエリカス (Bacillus sphaericus) NBRC3341由来の酵素が挙げられる。
[0033] バチルス バディウス（Easfc bafc) IAM11059はフエ二ルァラニン脱水素酵素 を生産する微生物であり、 EP256514号、及び Bisci. Biotechnol. Biochem. 、 1 995年、 59巻、 10号、 1994頁で公知である。
[0034] また、バチルス スファエリカス（Bacillus siohaericus) NBRC3341株は、ロイシン脱 水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス サチルス (Bacillus subtilis)の ロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で 100%—致する。 遺伝子配列では 1095塩基中、 14塩基が異なっている。
[0035] バチルス サチルス（Bacillus subtilis)の遺伝子配列は、 Nature、 1997年、 390巻 、 249頁および NCBIデータベースのァクセッションナンバー CAB14339で公知で ある。また、ピロリンー2—力ルボン酸レダクターゼがニューロスポラ（NeurosiDora)属、 ェシエリヒア (Escherichia)属、ァエロパクター (Aerobacter)属で知られて!/ヽることは、 Methods Enzymol. 、 1962年、 5巻、 882頁で述べられている。
[0036] ギ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該 酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ（Candida)属、クロイツケラ ( eckera)属、ピキア (Pichia)属、リポマイセス (Lioomvces)属、シユードモナス (Pseudom onas)属、モラキセラ（Moraxella)属、ノヽィホマイクロビゥム（Hviphomicrobium)属、パラ コッカス（Paracoccus)属、チオノ ンラス (Thiobacillus)属、又は、アンシロバクタ一（^π cvlobacter)属に属する微生物等が挙げられる。
[0037] 好ましくはチォバシラス（Thiobacillus)属、又は、アンシロバクタ一（Ancylobacter)属 に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチォバシラス エスピー（ Thiobacillus s ) KNK65MA株（FERM BP— 7671)、又は、アンシロバクタ一 ァ クァティカス (Ancvlobacter aauaticus) KNK607M株 (FERM BP - 7335)由来の 酵素が挙げられる。
[0038] 上記の各酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質 転換微生物を作成することが有効である。形質転換微生物の作成方法としては、例 えばロイシン脱水素酵素活性を示す菌株からロイシン脱水素酵素遺伝子をクロー二 ングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成し、これを用いて、特に限定 されな!/、が、ェシエリヒア コリ (Escherichia coll)等の宿主微生物を形質転換すること により形質転換体を得る方法が挙げられる。
[0039] ベクターとしては宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたは その誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物として、例えば、菌学的性質が当業 者に周知であって、形質転換用に提供されて!/、るェシエリヒア コリ (Escherichia coll) を選択し、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いることが好 ましい。
[0040] このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは市販され ている pUC18 (タカラバイオ株式会社）、 pUC19 (タカラバイオ株式会社）、 pBR322 (タカラバイオ株式会社）、 pACYC184 (株式会社二ツボンジーン）、 pSTV28 (タカ ラバイオ株式会社）、 pSTV29 (タカラバイオ株式会社）、 pSClO l (フナコシ株式会 社）、 pT7Blue (タカラバイオ株式会社）、又は国際公開第 WO94/03613号パンフ レットの明細書の記載に基づいて当業者が製造しうる pUCNT、若しくはそれらの誘 導体を挙げること力 Sできる。 [0041] それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモー ター、ターミネータ一、ェンハンサー、 SD配歹 1]、複製開始部位 (ori)、その他の調節 などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素 サイトを改質したものなどを指す。
[0042] このようにして得られた形質転換体の一例として、チォバシラス エスピー（Thiobacil lus sp.) KNK65MA株（FERM BP— 7671)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含 有するェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTOOl) (FERM BP- 7672) 、又はェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB101 (pFT002) (FERM BP— 7673) (国際公開第 WO03/031626号パンフレット参照）等を挙げることができる。
[0043] なお、本発明で用いた組換え DNA技術は当該分野において周知であり、例えば、 Molecular Cloning 2ηα Edition (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 し urren t Protocols in Molecular Biology ( reene Publishing Associates and Wiley-Interscie nce)に記載されている。
[0044] 上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、 L
アミノ酸の製造に利用することができる。微生物の培養は、通常の培地を用いて行 えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄 養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を 添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースゃシュ 一クロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用さ れる。窒素源としては、アンモニゥム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母 エキス、ペプトン、コーンスティープリカ一などが用いられる。無機塩類としてはリン酸 塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素な どが用いられる。
[0045] 培養は温度範囲 25°Cから 40°Cで行える力 25°Cから 37°Cが特に好ましい。また、 pHは 4から 8で培養できるが 5から 7. 5が好ましい。また、回分式、連続式のいずれ の培養方法でもよい。
[0046] 必要に応じてイソプロピル 1 チォー β—D ガラタトサイド（IPTG)、ラタトース 等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。 [0047] 3.還元アミノ化反応
次に、還元アミノ化反応によるケト酸からの L アミノ酸の製造方法について説明す る。還元アミノ化反応では、ケト酸と前述のアミノ酸脱水素酵素、及び、補酵素再生能 を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行な
5。
[0048] また、本発明にお!/、て使用するアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する 酵素は、それぞれの活性を有する微生物を培養して生産したものを用いてもよいし、 あるいはそれぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産した ものを使用してもよく、さらに複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培 養して生産したものを使用してもよい。
[0049] 本発明にお!/、て、生産されたアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵 素は、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用 いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾 燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物等で目的の酵素活性 を有して!/、るものを意味する。
[0050] 更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化 酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法 、物理的吸着法、包括法などで行い得る。
[0051] 上記還元アミノ化反応に NAD等の補酵素を添加することにより、反応の効率が向 上することが期待できる。 NAD等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ま しく (ま 0. 000001当量以上、 2当量以下、より好ましく (ま 0. 00001当量以上、 0. 1当 量以下、さらに好ましくは 0. 0001当量以上、 0. 01当量以下である。補酵素添加量 の上限は特に制限されないが、経済性の点から、通常は 2当量以下、好ましくは 0. 1 当量以下、より好ましくは 0. 01当量以下である。
[0052] さらに、前項 1.で挙げた反応の生産性を低下させる低純度のケト酸を基質とした場 合、 NAD等の補酵素を 2回以上に分けて添加する（分割添加）ことにより、全量を反 応開始時に添加（一括添加）した場合に比べて、反応の生産性を向上させることが可 能である（実施例 1、及び比較例 1を参照）。反応の生産性が向上する例としては、生 成する L アミノ酸の収率が向上する、反応時間が短縮できる事等が挙げられる。上 記のような低純度のケト酸を基質として使用し、補酵素を反応開始時に一括添加する 場合も、補酵素を多量に添加すれば、反応の生産性を向上させることが可能である 1S 分割添加を行うことにより補酵素の総添加量を削減することが可能である。
[0053] 補酵素を分割添加する場合、反応開始時に添加する補酵素の量としては、反応を 通じての総添加量の 4分の 3以下であることが好ましぐより好ましくは 3分の 2以下、さ らに好ましくは 2分の 1以下、特に好ましくは 3分の 1以下、 4分の 1以下である。
[0054] また、補酵素を分割添加する場合における一回の添加量としては、反応を通じての 総添加量の 3分の 2以下であることが好ましぐより好ましくは 2分の 1以下、さらに好ま しくは 3分の 1以下、特に好ましくは 4分の 1以下である。
[0055] さらに補酵素を分割添加する場合における、補酵素の添加回数は 2回以上が好ま しぐより好ましくは 3回以上であり、さらに好ましくは 4回以上である。また、補酵素は 反応中に連続的に添加することも可能である。
[0056] 上述のような補酵素の分割添加による反応の生産性向上効果は、基質の純度が 9 5%以下の場合に有効であり、 90%以下の場合により有効であり、 85%以下の場合 に特に有効である。
[0057] 上記還元アミノ化反応の基質であるケト酸の仕込み濃度は 0. l % (W/v)以上、 90 % (w/v)以下、好ましくは 1 % (w/v)以上、 60% (w/v)以下で溶解または懸濁し た状態で反応を行い、反応温度は 10°C以上、 80°C以下、好ましくは 20°C以上、 60 °C以下の適当な温度で調節し保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。
[0058] 上記反応の pHは、 4以上、 12以下で行うのが好ましぐさらに好ましくは pH6以上 、 11以下である。 pHの調整は酸、又は塩基を添加することで行うことができる。
[0059] 本反応の基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加して もよい。上記還元アミノ化反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
[0060] 本発明の還元アミノ化反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも 可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機 溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸ェチル 、酢酸ブチル、トルエン、クロ口ホルム、 n へキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体 との二相系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、 界面活性剤、金属などを添加することもできる。
[0061] 上記のような還元アミノ化反応により生成した L アミノ酸の単離は、常套分離方法 、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それ らの組み合わせにより分離、精製すること力 Sできる。
実施例
[0062] 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限 定されるものではない。
[0063] (比 アミノ によろ L tert ロイシンの 成, (補 ま一 #^加)
後述する参考例 4に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素 酵素活性を有する形質転換体を、滅菌した培地 A (トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1 . 0%、塩化ナトリウム 0. 5%、アンピシリン 0. 01 %、脱イオン水に溶解、滅菌前 pH7 . 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、 33°Cで 48時間、振とうして 好気的に培養した。
[0064] 得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水に懸濁して、菌体濃 縮液を得た。
[0065] 純度 83. 2%のトリメチノレピノレビン酸 96. 2mgに、上記菌体濃縮液、及びトリメチル ピルビン酸の 1. 4モル当量のギ酸アンモニゥムを添加し、さらに 5Mアンモニア水を 添加して pHを 8. 0に調整した後、脱イオン水を添加して 2mlになるよう反応液を調 製した。この反応液に NADをトリメチルピルビン酸の 0. 0009モル当量となるよう添 加して、 30°Cで攪拌し、 21. 5時間反応を行なった。
[0066] 残存したトリメチルピルビン酸、及び生成した L tert 口イシンの収率'光学純度 を高速液体クロマトグラフィー（HPLC)を用いて分析したところ、トリメチルピルビン酸 の残存率は 18. 8mol%、 L— tert ロイシンの収率は 81. lmol%、 L— tert ロイ シンの光学純度は 99%e. e.以上であった。
[0067] 高純度のトリメチルピルビン酸を使用した場合 (参考例 1)に比べて L tert 口イシ ンの収率は低下し、トリメチルピルビン酸の残存率は増加した。
[0068] (トリメチルピルビン酸 HPLC分析条件） カラム： COSMOSIL 5C18 -AR(4. 6mm X 250mm、ナカライテスタ社製）、移 動相： 10mMリン酸カリウム緩衝液（pH2. 0) /ァセトニトリル = 95/5、流速： lml/ 分、カラム温度： 40°C、検出： 210nm。
[0069] (L tert 口イシン HPLC分析条件）
カラム： SUMICHIRAL OA— 5000 (4. 6mm X 250mm、住化分析センター社 製）、移動相： 2mM硫酸銅水溶液/メタノール = 95/5、流速： lml/分、カラム温 度： 35°C、検出： 254nm。
[0070] (実施例 1)還元アミノ化反応による L tert 口イシンの合成 (補酵素分割添カロ）
比較例 1で使用した純度 83. 2%のトリメチルピルビン酸 96. 2mgに、比較例 1と同 量のロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の菌体 濃縮液、及びトリメチルピルビン酸の 1 · 4モル当量のギ酸アンモニゥムを添加し、さら に 5Mアンモニア水を添加して pHを 8. 0に調整した後、脱イオン水を添加して 2mlに なるよう反応液を調製した。この反応液に NADをトリメチルピルビン酸の 0. 0003モ ル当量となるよう添加して、 30°Cで攪拌した。
[0071] 反応開始から 3時間目、及び 6時間目にそれぞれ NADを基質の 0. 0003モル当 量添加して 21. 5時間目まで反応を行なった。
[0072] 残存したトリメチルピルビン酸、及び生成した L tert 口イシンの収率'光学純度 を比較例 1と同様の方法で分析したところ、トリメチルピルビン酸の残存率は 0.4mol %、 L— tert 口イシンの収率は 104. 3mol%、 L— tert 口イシンの光学純度は 99 %e. e.以上であった。
[0073] 補酵素を一括添加した場合（比較例 1)に比べて L tert 口イシンの収率向上、ト リメチルピルビン酸の残存率の減少が認められた。
[0074] (参考例 1)還元アミノ化反応による L tert 口イシンの合成
純度 98. 5%のトリメチルピルビン酸 81. 2mgに、比較例 1と同量のロイシン脱水素 酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の菌体濃縮液、及びトリメ チルピルビン酸の 1. 4モル当量のギ酸アンモニゥムを添加し、さらに 5Mアンモニア 水を添加して pHを 8. 0に調整した後、脱イオン水を添加して 2mlになるよう反応液を 調製した。 [0075] この反応液に NADを基質の 0 · 0009モノレ当量となるよう添カロして、 30°Cで攪拌し て 22時間目まで反応を行なった。
[0076] 比較例 1と同様の方法で分析したところ、トリメチルピルビン酸は消失し、 L - tert - ロイシンが変換率 96 · 4mol%、光学純度 99 % e . e .以上で生成していた。
[0077] ( 2)ギ,脱フ k ?舌†生を する ^云！^本の 種
チォバシラス エスピー（Thiobacillus s ) KNK65MA株（FERM BP— 7671 )の ゲノムを铸型に、 DNAプライマー（Primer— 1：配列表の配列番号 1、及び、 Primer 2：配列表の配列番号 2)を用いて PCRを行なった。
[0078] PCRは、铸型 DNAl OOngに PyrobestDNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製） 1 . 2 5U (0. 25 1)、 l O X Pyrobest Bufferll (タカラバイオ社製） 5 1、 2. 5mM各 dN TP溶液 4 20 Μプライマー水溶液各 2 H 1を添加し、さらに滅菌水を加えて総 量が 50 になるように調製した反応液を作製し、熱変性（96°C、 30秒）、ァユーリン グ（50°C、 30秒）、伸長反応（72°C、 90秒）を 25サイクル繰り返した後、 4°Cまで冷却 することにより行なった。
[0079] PCRにより得られた DNA断片を制限酵素 Ndelと EcoRIで切断し、同酵素で切断 したベクタープラスミド pUCNT (国際公開第 WO94/03613号パンフレットの明細 書の記載に基づいて当業者が製造可能）と T4 DNAリガーゼを用いて結合すること で、ギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。
[0080] 得られたプラスミドをェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB 101のコンビテントセノレ と混合し形質転換を行なうことで、ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種 した。
[0081] 得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37°Cで 24 時間、振とうして好気的に培養した。
[0082] 得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep
Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ギ酸脱水素酵素を大量に発現 できるように設計されたプラスミドを回収した。
[0083] (参考例 3)ロイシン脱水素酵素活性を有する形晳転換体の育種
バチルス スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC3341株のゲノムを铸型に、 D NAプライマー（Primer— 3 :配列表の配列番号 3、及び、 Primer— 4：配列表の配 列番号 4)を用いて PCRを行なった。 PCRの条件は参考例 2と同様にして行なった。
[0084] PCRにより得られた DNA断片を制限酵素 EcoRIと Saclで切断し、同酵素で切断 したベクタープラスミド pUCT (pUCNT (国際公開第 WO94/03613号パンフレット の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）の Ndel認識配列を一塩基置換に より破壊したプラスミドベクター）と T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、口イシ ン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。
[0085] 得られたプラスミドをェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセノレ と混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育 種した。
[0086] 得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37°Cで 24 時間、振とうして好気的に培養した。
[0087] 得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep
Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素を大量に 発現できるように設計されたプラスミドを回収した。
[0088] (参 4) Pイシン kま ま 及ぴギ kま ま 》 すろ开 ¾云橼 体の音稀
参考例 3で得られたロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたブラ スミドを制限酵素 EcoRIと Pstlで切断し、ロイシン脱水素酵素遺伝子を含む DNA断 片を TaKaRaRECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて回収した。
[0089] 同様に、参考例 2で得られたギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計された プラスミドをギ酸脱水素酵素遺伝子の下流の EcoRI、 Pstl部位で切断した DNA断 片と、上記ロイシン脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片を T4 DNAリガーゼを用い て結合することにより、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を大量に発現できる ように設計されたプラスミドを取得した。
[0090] 得られたプラスミドをェシエリヒア コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセノレ と混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活 性を有する形質転換体を育種した。

Claims

請求の範囲
般式 (1)
Figure imgf000016_0001
(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ!/、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して!/、てもよ!/、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素 再生能を有する酵素を作用させて、一般式 (2)：
[化 2]
NH2
RZ 、C02H ( 2 )
(式中、 Rは前記と同じ）で表される L アミノ酸に変換する反応において、補酵素を 2 回以上に分割して反応に添加することを特徴とする L アミノ酸の製造方法。
[2] ケト酸の純度が 95%以下であることを特徴とする請求項 1に記載の製造方法。
[3] 反応開始時における補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の 4分の 3以下 であることを特徴とする請求項 1、又は 2に記載の製造方法。
[4] 1回の補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の 2分の 1以下であることを特 徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載の製造方法。
[5] 補酵素を連続的に添加することを特徴とする請求項 1から 4のいずれかに記載の製 造方法。
[6] 補酵素が NADである請求項 1から 5の!/、ずれかに記載の製造方法。
[7] L アミノ酸が L tert ロイシン、又は L— 4—メチルロイシンである請求項 1から 6 のレ、ずれかに記載の製造方法。
[8] アミノ酸脱水素酵素がロイシン脱水素酵素、又はフエ二ルァラニン脱水素酵素であ る請求項 1から 7のいずれかに記載の製造方法。
[9] 補酵素再生能を有する酵素がギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である 請求項 1から 8の!/、ずれかに記載の製造方法。
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